Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Pendarahan yang tidak terkawal adalah salah satu punca utama kematian.Mencapai hemostasis pantas memastikan kemandirian subjek sebagai pertolongan cemas semasa pertempuran, kemalangan jalan raya, dan operasi pengurangan kematian.Perancah komposit bertetulang gentian nano (NFRCS) yang diperoleh daripada komposisi pembentuk filem (HFFC) hemostatik ringkas sebagai fasa berterusan boleh mencetus dan meningkatkan hemostasis.Pembangunan NFRCS adalah berdasarkan reka bentuk sayap pepatung.Struktur sayap pepatung terdiri daripada sayap melintang dan membujur, dan membran sayap disambungkan antara satu sama lain untuk mengekalkan integriti struktur mikro.HFFC menyalut seragam permukaan gentian dengan filem ketebalan nanometer dan menyambung ketebalan kapas teragih rawak (Ct) (fasa tersebar) untuk membentuk struktur nanopori.Gabungan fasa berterusan dan tersebar mengurangkan kos produk sebanyak sepuluh kali ganda berbanding produk yang tersedia secara komersial.NFRCS (tampon atau gelang) yang diubah suai boleh digunakan dalam pelbagai aplikasi bioperubatan.Kajian in vivo telah membuat kesimpulan bahawa Cp NFRCS yang dibangunkan mencetus dan meningkatkan proses pembekuan di tapak permohonan.NFRCS boleh memodulasi persekitaran mikro dan bertindak pada peringkat selular kerana struktur nanoporousnya menghasilkan penyembuhan luka yang lebih baik dalam model luka eksisi.
Pendarahan yang tidak terkawal semasa pertempuran, intraoperatif dan situasi kecemasan boleh menimbulkan ancaman serius kepada nyawa yang cedera1.Keadaan ini seterusnya membawa kepada peningkatan keseluruhan rintangan vaskular periferi, yang membawa kepada kejutan hemoragik.Langkah-langkah yang sesuai untuk mengawal pendarahan semasa dan selepas pembedahan dianggap berpotensi mengancam nyawa2,3.Kerosakan pada saluran besar membawa kepada kehilangan darah yang besar, mengakibatkan kadar kematian ≤ 50% dalam pertempuran dan 31% semasa pembedahan1.Kehilangan darah yang besar membawa kepada penurunan jumlah badan, yang mengurangkan output jantung.Peningkatan jumlah rintangan vaskular periferi dan gangguan peredaran mikro yang progresif membawa kepada hipoksia dalam organ sokongan hayat.Kejutan hemoragik mungkin berlaku jika keadaan berterusan tanpa campur tangan yang berkesan1,4,5.Komplikasi lain termasuk perkembangan hipotermia dan asidosis metabolik, serta gangguan pembekuan yang menghalang proses pembekuan.Kejutan hemoragik yang teruk dikaitkan dengan risiko kematian yang lebih tinggi6,7,8.Dalam renjatan gred III (progresif), pemindahan darah adalah penting untuk kelangsungan hidup pesakit semasa morbiditi dan mortaliti intraoperatif dan selepas pembedahan.Untuk mengatasi semua situasi yang mengancam nyawa di atas, kami telah membangunkan perancah komposit bertetulang gentian nanoporous (NFRCS) yang menggunakan kepekatan polimer minimum (0.5%) menggunakan gabungan polimer hemostatik larut air.
Dengan penggunaan tetulang gentian, produk kos efektif boleh dibangunkan.Gentian yang disusun secara rawak menyerupai struktur sayap pepatung, diimbangi oleh jalur mendatar dan menegak pada sayap.Urat melintang dan membujur sayap berkomunikasi dengan membran sayap (Rajah 1).NFRCS terdiri daripada Ct bertetulang sebagai sistem perancah dengan kekuatan fizikal dan mekanikal yang lebih baik (Rajah 1).Disebabkan oleh kemampuan dan ketukangan, pakar bedah lebih suka menggunakan tolok benang kapas (Ct) semasa operasi dan pembalut. Oleh itu, memandangkan pelbagai faedahnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberi dalam peningkatan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10. Oleh itu, memandangkan pelbagai faedahnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberi dalam peningkatan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы целлюлозые (преимущества) ой активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Oleh itu, memandangkan banyak faedahnya, termasuk> 90% selulosa kristal (terlibat dalam peningkatan aktiviti hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性）， NF 活性佉， NF0架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Oleh itu, memandangkan banyak faedahnya, termasuk lebih daripada 90% selulosa kristal (membantu meningkatkan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai perancah untuk NFRCS9,10.Ct disalut secara cetek (pembentukan filem tebal nano diperhatikan) dan saling berkaitan dengan komposisi pembentuk filem hemostatik (HFFC).HFFC bertindak seperti matrigel, memegang Ct yang diletakkan secara rawak bersama-sama.Reka bentuk yang dibangunkan menghantar tekanan dalam fasa tersebar (gentian pengukuhan).Sukar untuk mendapatkan struktur nanoporous dengan kekuatan mekanikal yang baik menggunakan kepekatan polimer yang minimum.Di samping itu, tidak mudah untuk menyesuaikan acuan yang berbeza untuk aplikasi bioperubatan yang berbeza.
Rajah menunjukkan rajah reka bentuk NFRCS berdasarkan struktur sayap pepatung (A).Imej ini menunjukkan analogi perbandingan struktur sayap pepatung (urat bersilang dan membujur sayap saling bersambung) dan fotomikrograf keratan rentas Cp NFRCS (B).Perwakilan skematik NFRCS.
NFRC dibangunkan menggunakan HFFC sebagai fasa berterusan untuk menangani batasan di atas.HFFC terdiri daripada pelbagai polimer hemostatik pembentuk filem termasuk kitosan (sebagai polimer hemostatik utama) dengan metilselulosa (MC), hidroksipropil metilselulosa (HPMC 50 cp) dan polivinil alkohol (PVA)) (125 kDa) sebagai polimer sokongan yang menggalakkan pembentukan trombus.pembentukan.Penambahan polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) meningkatkan kapasiti penyerapan lembapan NFRCS.Polietilena glikol 400 (PEG 400) telah ditambah untuk menambah baik penghubung silang polimer dalam adunan polimer terikat.Tiga komposisi hemostatik HFFC berbeza (Cm HFFC, Ch HFFC dan Cp HFFC), iaitu kitosan dengan MC (Cm), kitosan dengan HPMC (Ch), dan kitosan dengan PVA (Cp), telah digunakan pada Ct.Pelbagai kajian pencirian in vitro dan in vivo telah mengesahkan aktiviti hemostatik dan penyembuhan luka NFRCS.Bahan komposit yang ditawarkan oleh NFRCS boleh digunakan untuk menyesuaikan pelbagai bentuk perancah untuk memenuhi keperluan khusus.
Di samping itu, NFRCS boleh diubah suai sebagai pembalut atau gulungan untuk menutup seluruh kawasan kecederaan pada bahagian bawah dan bahagian badan yang lain.Khusus untuk kecederaan anggota tempur, reka bentuk NFRCS yang direka boleh ditukar kepada separuh lengan atau kaki penuh (Tambahan Rajah S11).NFRCS boleh dibuat menjadi gelang tangan dengan gam tisu, yang boleh digunakan untuk menghentikan pendarahan akibat kecederaan pergelangan tangan membunuh diri yang teruk.Matlamat utama kami adalah untuk membangunkan NFRCS dengan polimer serendah mungkin yang boleh dihantar kepada populasi yang besar (di bawah garis kemiskinan) dan yang boleh diletakkan dalam peti pertolongan cemas.Reka bentuk yang ringkas, cekap dan menjimatkan, NFRCS memberi manfaat kepada komuniti tempatan dan boleh memberi impak global.
Kitosan (berat molekul 80 kDa) dan amaranth dibeli dari Merck, India.Hydroxypropyl methylcellulose 50 Cp, polyethylene glycol 400 and methylcellulose telah dibeli daripada Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polivinil alkohol (berat molekul 125 kDa) (87-90% terhidrolisis) telah dibeli daripada Bahan Kimia Nasional, Gujerat.Polyvinylpyrrolidine K30 dibeli dari Molychem, Mumbai, swab steril dibeli dari Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, dengan air Milli Q (sistem penulenan air Direct-Q3, Merck, India) sebagai pembawa.
NFRCS telah dibangunkan menggunakan kaedah lyophilization11,12.Semua komposisi HFFC (Jadual 1) disediakan menggunakan pengacau mekanikal.Sediakan larutan 0.5% kitosan menggunakan 1% asid asetik dalam air dengan mengacau berterusan pada 800 rpm pada pengacau mekanikal.Berat tepat polimer yang dimuatkan yang ditunjukkan dalam Jadual 1 telah ditambah ke dalam larutan kitosan dan dikacau sehingga larutan polimer jernih diperolehi.PVP K30 dan PEG 400 telah ditambah kepada campuran yang terhasil dalam jumlah yang ditunjukkan dalam Jadual 1, dan kacau diteruskan sehingga larutan polimer likat jernih diperolehi.Mandian larutan polimer yang terhasil telah disonikasi selama 60 minit untuk mengeluarkan gelembung udara yang terperangkap daripada campuran polimer.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S1 (b), Ct diagihkan sama rata dalam setiap telaga plat 6-telaga (acuan) ditambah dengan 5 ml HFFC.
Plat enam telaga telah disonikasi selama 60 minit untuk mencapai pembasahan seragam dan pengedaran HFFC dalam rangkaian Ct.Kemudian bekukan plat enam telaga pada -20°C selama 8-12 jam.Plat beku telah diliofilkan selama 48 jam untuk mendapatkan pelbagai formulasi NFRCS.Prosedur yang sama digunakan untuk menghasilkan bentuk dan struktur yang berbeza, seperti tampon atau tampon silinder, atau sebarang bentuk lain untuk aplikasi yang berbeza.
Kitosan yang ditimbang dengan tepat (80 kDa) (3%) dilarutkan dalam 1% asid asetik menggunakan pengacau magnet.Kepada larutan kitosan yang terhasil ditambah 1% PEG 400 dan dikacau selama 30 minit.Tuangkan larutan yang terhasil ke dalam bekas persegi atau segi empat tepat dan bekukan pada -80°C selama 12 jam.Sampel beku telah diliofilkan selama 48 jam untuk mendapatkan Cs13 berliang.
NFRCS yang dibangunkan telah tertakluk kepada eksperimen menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Jepun) untuk mengesahkan keserasian kimia kitosan dengan polimer lain14,15.Spektrum FTIR (lebar julat spektrum dari 400 hingga 4000 cm-1) semua sampel yang diuji diperolehi dengan melakukan 32 imbasan.
Kadar penyerapan darah (BAR) untuk semua formulasi dinilai menggunakan kaedah yang diterangkan oleh Chen et al.16 dengan sedikit pengubahsuaian.NFRK yang dibangunkan dari semua komposisi telah dikeringkan dalam ketuhar vakum pada suhu 105°C semalaman untuk mengeluarkan sisa pelarut.30 mg NFRCS (berat sampel awal – W0) dan 30 mg Ct (kawalan positif) diletakkan dalam hidangan berasingan yang mengandungi pracampuran 3.8% natrium sitrat.Pada selang masa yang telah ditetapkan, iaitu 5, 10, 20, 30, 40 dan 60 saat, NFRCS telah dikeluarkan dan permukaannya dibersihkan daripada darah yang tidak diserap dengan meletakkan sampel pada Ct selama 30 saat.Berat akhir darah yang diserap oleh NFRCS 16 telah dipertimbangkan (W1) pada setiap titik masa.Kira peratusan BAR menggunakan formula berikut:
Masa pembekuan darah (BCT) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Wang et al.17 .Masa yang diperlukan untuk darah keseluruhan (darah tikus pracampuran dengan 3.8% natrium sitrat) untuk membeku dengan kehadiran NFRCS dikira sebagai BCT sampel ujian.Pelbagai komponen NFRCS (30 mg) dimasukkan ke dalam botol penutup skru 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C.Darah (0.5 ml) telah ditambah ke dalam vial dan 0.3 ml 0.2 M CaCl2 telah ditambah untuk mengaktifkan pembekuan darah.Akhir sekali, terbalikkan vial setiap 15 saat (sehingga 180°) sehingga bekuan yang kukuh terbentuk.BCT sampel dianggarkan dengan bilangan tabir lilit17,18.Berdasarkan BCT, dua komposisi optimum daripada NFRCS Cm, Ch dan Cp telah dipilih untuk kajian pencirian selanjutnya.
BCT komposisi Ch NFRCS dan Cp NFRCS ditentukan dengan melaksanakan kaedah yang diterangkan oleh Li et al.19 .Letakkan 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs (kawalan positif) ke dalam cawan Petri yang berasingan (37 °C).Darah yang mengandungi 3.8% natrium sitrat dicampur dengan 0.2 M CaCl2 dalam nisbah isipadu 10:1 untuk memulakan proses pembekuan darah.20 µl campuran darah tikus CaCl2 0.2 M disapu pada permukaan sampel dan dimasukkan ke dalam bekas Petri kosong.Kawalan adalah darah dituangkan ke dalam cawan Petri kosong tanpa Ct.Pada selang masa tetap 0, 3, dan 5 minit, hentikan pembekuan dengan menambah 10 ml air ternyahiion (DI) ke dalam sampel yang mengandungi hidangan tanpa mengganggu bekuan.Eritrosit yang tidak terkoagulasi (eritrosit) menjalani hemolisis dengan kehadiran air ternyahion dan membebaskan hemoglobin.Hemoglobin pada titik masa yang berbeza (HA(t)) diukur pada 540 nm (λmax hemoglobin) menggunakan spektrofotometer UV-Vis.Penyerapan mutlak hemoglobin (AH(0)) dalam 0 min 20 µl darah dalam 10 ml air ternyahion telah diambil sebagai piawai rujukan.Pengambilan hemoglobin relatif (RHA) darah beku dikira daripada nisbah HA(t)/HA(0) menggunakan kumpulan darah yang sama.
Menggunakan penganalisis tekstur (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sifat pelekat NFRK pada tisu yang rosak telah ditentukan.Tekan hidangan silinder bahagian bawah terbuka pada bahagian dalam kulit babi (tanpa lapisan lemak).Sampel (Ch NFRCS dan Cp NFRCS) telah digunakan melalui kanula ke dalam acuan silinder untuk mencipta lekatan pada kulit babi.Selepas pengeraman 3 minit pada suhu bilik (RT) (25° C.), kekuatan pelekat NFRCS direkodkan pada kadar malar 0.5 mm/saat.
Ciri utama pengedap pembedahan adalah untuk meningkatkan pembekuan darah sambil mengurangkan kehilangan darah.Pembekuan tanpa kehilangan dalam NFRCS dinilai menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan sedikit pengubahsuaian 19 .Buat tiub microcentrifuge (2 ml) (diameter dalam 10 mm) dengan lubang 8 × 5 mm2 pada satu sisi tiub centrifuge (mewakili luka terbuka).NFRCS digunakan untuk menutup bukaan dan pita digunakan untuk mengelak tepi luar.Tambah 20 µl 0.2 M CaCl2 ke dalam tiub microcentrifuge yang mengandungi pracampuran natrium sitrat 3.8%.Selepas 10 minit, tiub microcentrifuge dikeluarkan dari pinggan dan peningkatan jisim hidangan ditentukan disebabkan oleh aliran keluar darah dari NFRK (n = 3).Kehilangan darah Ch NFRCS dan Cp NFRCS dibandingkan dengan Cs.
Integriti basah NFRCS ditentukan berdasarkan kaedah yang diterangkan oleh Mishra dan Chaudhary21 dengan pengubahsuaian kecil.Letakkan NFRCS dalam kelalang Erlenmeyer 100 ml dengan 50 ml air dan pusingkan selama 60 s tanpa membentuk bahagian atas.Pemeriksaan visual dan keutamaan sampel untuk integriti fizikal berdasarkan pengumpulan.
Kekuatan mengikat HFFC ke Ct dikaji menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil.Integriti salutan permukaan dinilai dengan mendedahkan NFRK kepada gelombang akustik (rangsangan luar) dengan kehadiran air milliQ (Ct).NFRCS Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang dibangunkan telah diletakkan di dalam bikar yang diisi dengan air dan disonikasi masing-masing selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 30 minit.Selepas pengeringan, perbezaan peratusan antara berat awal dan akhir NFRCS digunakan untuk mengira peratus kehilangan bahan (HFFC).In vitro BCT seterusnya menyokong kekuatan mengikat atau kehilangan bahan permukaan.Kecekapan pengikatan HFFC pada Ct memberikan pembekuan darah dan salutan elastik pada permukaan Ct22.
Kehomogenan NFRCS yang dibangunkan ditentukan oleh BCT sampel (30 mg) yang diambil dari lokasi umum NFRCS yang dipilih secara rawak.Ikuti prosedur BCT yang dinyatakan sebelum ini untuk menentukan pematuhan NFRCS.Kedekatan antara kelima-lima sampel memastikan liputan permukaan seragam dan pemendapan HFFC dalam jaringan Ct.
Kawasan hubungan darah nominal (NBCA) ditentukan seperti yang dilaporkan sebelum ini dengan beberapa pengubahsuaian.Membekukan darah dengan mengapit 20 µl darah di antara dua permukaan Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs.Selepas 1 jam, kedua-dua bahagian stent dipisahkan dan diukur secara manual kawasan bekuan.Nilai purata tiga ulangan dianggap NBCA NFRCS19.
Analisis Dynamic Vapor Sorption (DVS) digunakan untuk menilai keberkesanan NFRCS untuk menyerap air dari persekitaran luaran atau dari tapak kecederaan yang bertanggungjawab untuk memulakan pembekuan.DVS menilai atau merekodkan pengambilan dan kehilangan wap dalam sampel secara gravimetrik menggunakan keseimbangan ultra-sensitif dengan resolusi jisim ±0.1 µg.Tekanan wap separa (kelembapan relatif) dijana oleh pengawal aliran jisim elektronik di sekeliling sampel dengan mencampurkan gas pembawa tepu dan kering. Mengikut garis panduan Farmakope Eropah, berdasarkan peratusan pengambilan lembapan oleh sampel, sampel dikategorikan kepada 4 kategori (0–0.012% w/w− bukan higroskopik, 0.2–2% w/w sedikit higroskopik, 2–15% sederhana higroskopik) 2, dan > higroskopik sederhana. Mengikut garis panduan Farmakope Eropah, berdasarkan peratusan pengambilan lembapan oleh sampel, sampel dikategorikan kepada 4 kategori (0–0.012% b/b− tidak higroskopik, 0.2–2% b/b sedikit higroskopik, 2–15 % sederhana higroskopik) 2, dan > 15% sangat higroskopik.Selaras dengan cadangan Farmakope Eropah, bergantung kepada peratusan penyerapan lembapan oleh sampel, sampel dibahagikan kepada 4 kategori (0–0.012% b/b – tidak higroskopik, 0.2–2% b/b sedikit higroskopik, 2– lima belas %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % sederhana higroskopik dan > 15% sangat higroskopik)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w.012% w/w/w- 湁%倐【面轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 W./w 0-0性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Selaras dengan cadangan Farmakope Eropah, sampel dibahagikan kepada 4 kelas bergantung kepada peratusan kelembapan yang diserap oleh sampel (0-0.012% mengikut berat - tidak higroskopik, 0.2-2% mengikut berat sedikit higroskopik, 2-15% mengikut berat).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % sederhana higroskopik, > 15% sangat higroskopik) 23.Kecekapan higroskopik NFCS X NFCS dan TsN NFCS ditentukan pada penganalisis DVS TA TGA Q5000 SA.Semasa proses ini, masa larian, kelembapan relatif (RH), dan berat sampel masa nyata pada 25°C24 diperolehi.Kandungan lembapan dikira dengan analisis jisim NFRCS yang tepat menggunakan persamaan berikut:
MC ialah kelembapan NFRCS.m1 - berat kering NSAID.m2 ialah jisim NFRCS masa nyata pada RH tertentu.
Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas mengosongkan sampel pada 25 ° C selama 10 jam (< 7 × 10-3 Torr). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas mengosongkan sampel pada 25 ° C selama 10 jam (< 7 × 10-3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после после опорожнраиц опорожнрае опорожнента е 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas sampel dikosongkan pada 25 ° C selama 10 jam (< 7 × 10-3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом подованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом поросленио после те 1 0 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas sampel dikosongkan selama 10 jam pada 25°C (< 7 x 10-3 torr).Jumlah luas permukaan, isipadu liang dan saiz liang NFRCS ditentukan dengan Quantachrome dari NOVA 1000e, Austria menggunakan perisian RS 232.
Sediakan 5% RBC (salinan sebagai pelarut) daripada darah keseluruhan.Kemudian pindahkan aliquot HFFC (0.25 ml) ke plat 96-telaga dan 5% jisim RBC (0.1 ml).Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 40 minit.Campuran sel darah merah dan serum dianggap sebagai kawalan positif, dan campuran garam dan sel darah merah sebagai kawalan negatif.Hemaglutinasi ditentukan mengikut skala Stajitzky.Skala yang dicadangkan adalah seperti berikut: + + + + agregat berbutir padat;+ + + pad bawah licin dengan tepi melengkung;+ + pad bawah licin dengan tepi koyak;+ cincin merah sempit di sekeliling tepi pad licin;– (negatif) butang merah diskret 12 di tengah perigi bawah.
Hemocompatibility NFRCS dikaji mengikut kaedah International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Kaedah gravimetrik yang diterangkan oleh Singh et al.Pengubahsuaian kecil telah dibuat untuk menilai pembentukan trombus dengan kehadiran atau pada permukaan NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS diinkubasi dalam salin buffer fosfat (PBS) selama 24 jam pada 37 ° C.Selepas 24 jam, PBS dikeluarkan dan NFRCS dirawat dengan 2 ml darah yang mengandungi 3.8% natrium sitrat.Pada permukaan NFRCS, tambahkan 0.04 ml 0.1 M CaCl2 kepada sampel yang diinkubasi.Selepas 45 minit, 5 ml air suling ditambah untuk menghentikan pembekuan.Darah beku pada permukaan NFRK dirawat dengan larutan formaldehid 36-38%.Gumpalan yang diikat dengan formaldehid dikeringkan dan ditimbang.Peratusan trombosis dianggarkan dengan mengira berat gelas tanpa darah dan sampel (kawalan negatif) dan kaca dengan darah (kawalan positif).
Sebagai pengesahan awal, sampel telah divisualisasikan di bawah mikroskop optik untuk memahami keupayaan salutan permukaan HFFC, Ct saling bersambung, dan rangkaian Ct untuk membentuk liang.Bahagian nipis Ch dan Cp dari NFRCS telah dipangkas dengan bilah pisau bedah.Bahagian yang terhasil diletakkan pada slaid kaca, ditutup dengan penutup, dan tepinya dipasang dengan gam.Slaid yang disediakan telah dilihat di bawah mikroskop optik dan gambar diambil pada pembesaran yang berbeza.
Pemendapan polimer dalam rangkaian Ct telah divisualisasikan menggunakan mikroskop pendarfluor berdasarkan kaedah yang diterangkan oleh Rice et al.29. Komposisi HFFC yang digunakan untuk perumusan dicampur dengan pewarna pendarfluor (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disediakan mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini. Komposisi HFFC yang digunakan untuk perumusan dicampur dengan pewarna pendarfluor (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disediakan mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini.Komposisi HFFC yang digunakan untuk perumusan dicampur dengan pewarna pendarfluor (amaranth) dan NFRCS (Ch dan Cp) diperoleh mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制 NFCh & Ch。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制 NFCh & Ch。Komposisi HFFC yang digunakan dalam formulasi telah dicampur dengan pewarna pendarfluor (Amaranth) dan menerima NFRCS (Ch dan Cp), seperti yang dinyatakan sebelum ini.Bahagian nipis NFRK dipotong daripada sampel yang diperoleh, diletakkan di atas slaid kaca, dan ditutup dengan slip penutup.Perhatikan slaid yang disediakan di bawah mikroskop pendarfluor menggunakan penapis hijau (310-380 nm).Imej diambil pada pembesaran 4x untuk memahami hubungan Ct dan pemendapan polimer berlebihan dalam rangkaian Ct.
Topografi permukaan NFRCS Ch dan Cp ditentukan menggunakan mikroskop daya atom (AFM) dengan julur TESP ultra-tajam dalam mod mengetuk: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Kekasaran permukaan ditentukan oleh akar min kuasa dua (RMS) menggunakan perisian (Pemproses Imej Probe Mengimbas).Pelbagai lokasi NFRCS telah dipaparkan pada imej 3D untuk menyemak keseragaman permukaan.Sisihan piawai skor untuk kawasan tertentu ditakrifkan sebagai kekasaran permukaan.Persamaan RMS digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan NFRCS31.
Kajian berasaskan FESEM dilakukan menggunakan FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, untuk memahami morfologi permukaan Ch NFRCS dan Cp NFRCS, yang menunjukkan BCT yang lebih baik daripada Cm NFRCS.Kajian FESEM telah dilakukan mengikut kaedah yang diterangkan oleh Zhao et al.32 dengan pengubahsuaian kecil.NFRCS 20 hingga 30 mg Ch NFRCS dan Cp NFRCS telah dicampurkan dengan 20 µl 3.8% natrium sitrat yang dicampurkan dengan darah tikus.20 μl 0.2 M CaCl2 telah ditambah kepada sampel yang dirawat darah untuk memulakan pembekuan dan sampel diinkubasi pada suhu bilik selama 10 minit.Di samping itu, lebihan eritrosit dikeluarkan dari permukaan NFRCS dengan membilas dengan garam.
Sampel seterusnya dirawat dengan glutaraldehid 0.1% dan kemudian dikeringkan dalam ketuhar udara panas pada suhu 37°C untuk menghilangkan lembapan.Sampel kering disalut dan dianalisis 32 .Imej lain yang diperoleh semasa analisis adalah pembentukan bekuan pada permukaan gentian kapas individu, pemendapan polimer antara Ct, morfologi (bentuk) eritrosit, integriti bekuan, dan morfologi eritrosit dengan kehadiran NFRCS.Kawasan NFRCS yang tidak dirawat dan kawasan NFRCS yang dirawat Ch dan Cp yang diinkubasi dengan darah telah diimbas untuk ion unsur (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, zink, kuprum dan selenium)33.Bandingkan peratusan ion unsur antara sampel yang dirawat dan tidak dirawat untuk memahami pengumpulan ion unsur semasa pembentukan bekuan dan kehomogenan bekuan.
Ketebalan salutan permukaan Cp HFFC pada permukaan Ct ditentukan menggunakan FESEM.Keratan rentas Cp NFRCS dipotong dari rangka kerja dan disalut sputter.Sampel salutan sputter yang terhasil telah diperhatikan oleh FESEM dan ketebalan salutan permukaan diukur 34 , 35 , 36 .
Mikro-CT sinar-X menyediakan pengimejan tidak merosakkan 3D resolusi tinggi dan membolehkan anda mengkaji susunan struktur dalaman NFRK.Mikro-CT menggunakan pancaran sinar-X yang melalui sampel untuk merekodkan pekali pengecilan linear tempatan bagi sinar-X dalam sampel, yang membantu mendapatkan maklumat morfologi.Lokasi dalaman Ct dalam Cp NFRCS dan Cp NFRCS yang dirawat darah telah diperiksa oleh mikro-CT untuk memahami kecekapan penyerapan dan pembekuan darah dengan kehadiran NFRCS37,38,39.Struktur 3D sampel Cp NFRCS yang dirawat dengan darah dan tidak dirawat telah dibina semula menggunakan mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Jerman).Menggunakan perisian VG STUDIO-MAX versi 2.2, beberapa imej X-ray telah diambil dari sudut yang berbeza (sebaik-baiknya liputan 360°) untuk membangunkan imej 3D untuk NFRCS.Data unjuran yang dikumpul telah dibina semula menjadi imej volumetrik 3D menggunakan perisian 3D ScanIP Academic mudah yang sepadan.
Di samping itu, untuk memahami pengedaran bekuan, 20 µl darah sitrat pracampuran dan 20 µl 0.2 M CaCl2 telah ditambah kepada NFRCS untuk memulakan pembekuan darah.Sampel yang telah disediakan dibiarkan mengeras.Permukaan NFRK dirawat dengan glutaraldehid 0.5% dan dikeringkan dalam ketuhar udara panas pada suhu 30–40°C selama 30 minit.Gumpalan darah yang terbentuk pada NFRCS telah diimbas, dibina semula, dan imej 3D bekuan darah telah divisualisasikan.
Ujian antibakteria telah dilakukan pada Cp NFRCS (terbaik berbanding dengan Ch NFRCS) menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil.Aktiviti antibakteria Cp NFRCS dan Cp HFFC ditentukan menggunakan tiga mikroorganisma ujian yang berbeza [S.aureus (bakteria gram-positif), E.coli (bakteria gram-negatif) dan Candida putih (C.albicans)] yang tumbuh pada agar dalam piring Petri dalam inkubator.Inokulasi secara seragam 50 ml ampaian kultur bakteria yang dicairkan pada kepekatan 105-106 CFU ml-1 ke dalam medium agar.Tuangkan medium ke dalam cawan Petri dan biarkan ia padat.Telaga dibuat pada permukaan plat agar untuk diisi dengan HFFC (3 telaga untuk HFFC dan 1 untuk kawalan negatif).Tambahkan 200 µl HFFC kepada 3 telaga dan 200 µl pH 7.4 PBS ke telaga ke-4.Di bahagian lain cawan petri, letakkan cakera NFRCS Cp 12 mm pada agar-agar yang dipadatkan dan lembapkan dengan PBS (pH 7.4).Ciprofloxacin, ampicillin dan tablet fluconazole dianggap sebagai piawai rujukan untuk Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Candida albicans.Ukur zon perencatan secara manual dan ambil imej digital zon perencatan.
Selepas kelulusan etika institusi, kajian itu dijalankan di Kolej Pendidikan dan Penyelidikan Perubatan Kasturba di Manipal, Karnataka, di selatan India.Protokol percubaan TEG in vitro telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi Kolej Perubatan Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subjek telah diambil daripada penderma darah sukarela (berumur 18 hingga 55) dari bank darah hospital.Di samping itu, borang persetujuan termaklum diperoleh daripada sukarelawan untuk pengumpulan sampel darah.TEG asli (N-TEG) ​​​​digunakan untuk mengkaji kesan rumusan Cp HFFC ke atas darah keseluruhan pracampuran dengan natrium sitrat.N-TEG diiktiraf secara meluas untuk peranannya dalam resusitasi titik penjagaan, yang menimbulkan masalah kepada doktor kerana potensi kelewatan keputusan yang ketara secara klinikal (ujian pembekuan rutin).Analisis N-TEG dilakukan menggunakan darah keseluruhan.Persetujuan termaklum dan sejarah perubatan terperinci diperoleh daripada semua peserta.Kajian itu tidak termasuk peserta yang mengalami komplikasi hemostatik atau trombotik seperti kehamilan/selepas bersalin atau penyakit hati.Subjek yang mengambil ubat yang menjejaskan lata pembekuan juga dikecualikan daripada kajian.Ujian makmal asas (hemoglobin, masa protrombin, tromboplastin diaktifkan dan kiraan platelet) dilakukan ke atas semua peserta mengikut prosedur standard.N-TEG menentukan kelikatan bekuan darah, struktur bekuan awal, interaksi zarah, pengukuhan bekuan, dan lisis bekuan.Analisis N-TEG menyediakan data grafik dan berangka mengenai kesan kolektif beberapa elemen selular dan plasma.Analisis N-TEG dilakukan pada dua volum berbeza Cp HFFC (10 µl dan 50 µl).Akibatnya, 1 ml darah keseluruhan dengan asid sitrik ditambah kepada 10 μl Cp HFFC.Tambah 1 ml (Cp HFFC + darah bersitrat), 340 µl darah campuran kepada 20 µl 0.2 M CaCl2 yang mengandungi hidangan TEG.Selepas itu, hidangan TEG dimuatkan ke dalam TEG® 5000, AS untuk mengukur R, K, sudut alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% sampel darah dengan kehadiran Cp HFFC41.
Protokol kajian in vivo telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi (IAEC), Sekolah Perubatan Kasturba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Semua eksperimen haiwan telah dilakukan mengikut cadangan Jawatankuasa Kawalan dan Penyeliaan Eksperimen Haiwan (CPCSEA).Semua kajian NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) dilakukan pada tikus Wistar betina (berat 200 hingga 250 g).Semua haiwan telah disesuaikan pada suhu 24-26°C, haiwan itu mempunyai akses percuma kepada makanan dan air biasa secara ad libitum.Semua haiwan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan yang berbeza, setiap kumpulan terdiri daripada tiga haiwan.Semua kajian dilakukan mengikut Kajian Haiwan: Laporan Eksperimen In Vivo 43 .Sebelum kajian, haiwan telah dibius dengan pentadbiran intraperitoneal (ip) campuran 20-50 mg ketamin (setiap 1 kg berat badan) dan 2-10 mg xylazine (setiap 1 kg berat badan).Selepas kajian, isipadu pendarahan dikira dengan menilai perbezaan antara berat awal dan berat akhir sampel, nilai purata yang diperoleh daripada tiga ujian diambil sebagai isipadu pendarahan sampel.
Model amputasi ekor tikus telah dilaksanakan untuk memahami potensi NFRCS untuk memodulasi pendarahan dalam trauma, pertempuran, atau kemalangan jalan raya (model kecederaan).Potong 50% ekor dengan bilah pisau bedah dan letakkan di udara selama 15 saat untuk memastikan pendarahan normal.Selain itu, sampel ujian diletakkan pada ekor tikus dengan menggunakan tekanan (Ct, Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS).Pendarahan dan PCT dilaporkan untuk spesimen ujian (n = 3)17,45.
Keberkesanan kawalan tekanan NFRCS dalam pertempuran telah disiasat pada model arteri femoral cetek.Arteri femoralis terdedah, tertusuk dengan trocar 24G, dan berdarah dalam masa 15 saat.Selepas pendarahan yang tidak terkawal diperhatikan, spesimen ujian diletakkan di tapak tusukan dengan tekanan dikenakan.Sejurus selepas penggunaan sampel ujian, masa pembekuan direkodkan dan kecekapan hemostatik diperhatikan selama 5 minit seterusnya.Prosedur yang sama diulang dengan Cs dan Ct46.
Dowling et al.47 mencadangkan model kecederaan hati untuk menilai potensi hemostatik bahan hemostatik dalam konteks pendarahan intraoperatif.BCT direkodkan untuk sampel Ct (kawalan negatif), rangka kerja Cs (kawalan positif), sampel Ch NFRCS, dan sampel Cp NFRCS.Vena cava suprahepatik tikus didedahkan dengan melakukan laparotomi median.Selepas itu, bahagian distal lobus kiri dipotong dengan gunting.Buat hirisan pada hati dengan pisau bedah dan biarkan ia berdarah selama beberapa saat.Sampel ujian Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang ditimbang dengan tepat diletakkan pada permukaan yang rosak tanpa sebarang tekanan positif dan BCT direkodkan.Kumpulan kawalan (Ct) kemudiannya mengenakan tekanan diikuti oleh Cs 30 s47 tanpa mematahkan kecederaan.
Ujian penyembuhan luka in vivo dilakukan menggunakan model luka eksisi untuk menilai sifat penyembuhan luka NFRCS berasaskan polimer yang dibangunkan.Model luka eksisi telah dipilih dan dilakukan mengikut kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil19,32,48.Semua haiwan telah dibius seperti yang diterangkan sebelum ini.Gunakan penebuk biopsi (12 mm) untuk membuat hirisan dalam bulatan pada kulit belakang.Tapak luka yang disediakan telah dibalut dengan Cs (kawalan positif), Ct (menyedari bahawa pad kapas mengganggu penyembuhan), Ch NFRCS dan Cp NFRCS (kumpulan eksperimen) dan kawalan negatif tanpa sebarang rawatan.Pada setiap hari kajian, kawasan luka diukur dalam semua tikus.Gunakan kamera digital untuk mengambil gambar kawasan luka dan memakai pembalut baru.Peratusan penutupan luka diukur dengan formula berikut:
Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik dikeluarkan ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) dan dikaji dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trichrome Masson. Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik dikeluarkan ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) dan dikaji dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trichrome Masson.Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) telah dipotong dan diperiksa dengan pewarnaan dengan hematoxylin-eosin dan trichrome Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，H&E丛肌，进色肌，进色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，H&E糵肤，羛肤，翛所肌，翛所肤，翛肌，翛是Tikus dalam kumpulan terbaik ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) telah dikeluarkan untuk pewarnaan hematoxylin-eosin dan pewarnaan trichrome Masson berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian.Prosedur pewarnaan yang dilaksanakan telah dijalankan mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini49,50.Secara ringkas, selepas penetapan dalam 10% formalin, sampel telah dehidrasi menggunakan satu siri alkohol gred.Gunakan mikrotom untuk mendapatkan bahagian nipis (5 µm tebal) tisu yang dipotong.Bahagian kawalan siri nipis dan Cp NFRCS telah dirawat dengan hematoxylin dan eosin untuk mengkaji perubahan histopatologi.Pewarnaan trichrome Masson digunakan untuk mengesan pembentukan fibril kolagen.Keputusan yang diperolehi dikaji secara membuta tuli oleh ahli patologi.
Kestabilan sampel Cp NFRCS dikaji pada suhu bilik (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) selama 12 bulan51.Cp NFRCS (perubahan warna permukaan dan pertumbuhan mikrob) telah diperiksa dan diuji secara visual untuk rintangan haus lipatan dan BCT mengikut kaedah di atas yang digariskan dalam bahagian Bahan dan Kaedah.
Kebolehskalaan dan kebolehulangan Cp NFRCS telah diperiksa dengan menyediakan Cp NFRCS dengan saiz 15 × 15 cm2.Di samping itu, 30 mg sampel (n = 5) telah dikeluarkan daripada pelbagai pecahan Cp NFRCS dan BCT sampel yang dikaji telah dinilai seperti yang diterangkan sebelum ini dalam bahagian Kaedah.
Kami telah cuba untuk membangunkan pelbagai bentuk dan struktur menggunakan komposisi Cp NFRCS untuk pelbagai aplikasi bioperubatan.Bentuk atau konfigurasi sedemikian termasuk swab kon untuk pendarahan hidung, prosedur pergigian dan swab silinder untuk pendarahan faraj.
Semua set data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai dan dianalisis oleh ANOVA menggunakan Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, Amerika Syarikat) diikuti oleh ujian perbandingan berbilang Bonferroni (* p<0.05).
Semua prosedur yang dilakukan dalam kajian manusia adalah mengikut piawaian Institut dan Majlis Penyelidikan Kebangsaan, serta Deklarasi Helsinki 1964 dan pindaan seterusnya, atau piawaian etika yang serupa.Semua peserta dimaklumkan tentang ciri-ciri kajian dan sifat sukarelanya.Data peserta kekal sulit setelah dikumpulkan.Protokol percubaan TEG in vitro telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi Kolej Perubatan Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Sukarelawan menandatangani persetujuan termaklum untuk mengambil sampel darah.
Semua prosedur yang dilakukan dalam kajian haiwan telah dijalankan mengikut Fakulti Perubatan Kastuba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Semua eksperimen haiwan yang direka bentuk telah dijalankan mengikut garis panduan Jawatankuasa Kawalan dan Penyeliaan Eksperimen Haiwan (CPCSEA).Semua pengarang mengikut garis panduan ARRIVE.
Spektrum FTIR bagi semua NFRCS telah dianalisis dan dibandingkan dengan spektrum kitosan yang ditunjukkan dalam Rajah 2A.Puncak spektrum ciri kitosan (dirakam) pada 3437 cm-1 (regangan OH dan NH, bertindih), 2945 dan 2897 cm-1 (regangan CH), 1660 cm-1 (terikan NH2), 1589 cm-1 (lentur N–H ), 1157 cm-1 (regangan jambatan C–3 cm-1), 1157 cm-1 (regangan jambatan C–3 cm-10), 1060 cm-1 (regangan NH2) (regangan CO, Bo-OH) 52.53.54.Jadual Tambahan S1 menunjukkan nilai spektrum serapan FTIR NFRCS untuk kitosan (pemberita), kitosan tulen, Cm, Ch, dan Cp.Spektrum FTIR bagi semua NFRCS (Cm, Ch dan Cp) menunjukkan jalur serapan ciri yang sama seperti kitosan tulen tanpa sebarang perubahan ketara (Rajah 2A).Keputusan FTIR mengesahkan ketiadaan interaksi kimia atau fizikal antara polimer yang digunakan untuk membangunkan NFRCS, menunjukkan bahawa polimer yang digunakan adalah lengai.
Pencirian in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs.(A) mewakili gabungan spektrum FTIR bagi komposisi kitosan dan Cm NFRCS, Ch NFRCS dan Cp NFRCS di bawah pemampatan.(B) a) Kadar pengambilan darah keseluruhan NFRCS Cm, Ch, Cp, dan Cg (n = 3);Sampel Ct menunjukkan BAR yang lebih tinggi kerana swab kapas mempunyai kecekapan penyerapan yang lebih tinggi;b) Darah selepas penyerapan darah Ilustrasi sampel yang diserap.Perwakilan grafik BCT sampel ujian C (Cp NFRCS mempunyai BCT terbaik (15 s, n = 3)). Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± SD, dan bar ralat mewakili SD, ***p <0.0001. Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± SD, dan bar ralat mewakili SD, ***p <0.0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стално, <0 старнд, ***0 01. Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai, dan bar ralat mewakili sisihan piawai, ***p<0.0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют тнд, <0 сталнот, ***0 01. Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai, bar ralat mewakili sisihan piawai, ***p<0.0001.