Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) ialah tumbuhan kekacang yang digunakan untuk pengeluaran makanan dan pembaikan tanah.Pengembangan global NLL sebagai tanaman telah menarik banyak kulat patogen, termasuk antraknosa lupin, yang menyebabkan penyakit antraknosa yang dahsyat.Dua alel, Lanr1 dan AnMan, yang memberikan peningkatan rintangan, telah digunakan dalam pembiakan NLL, tetapi mekanisme molekul asas masih tidak diketahui.Dalam kajian ini, penanda Lanr1 dan AnMan digunakan untuk menyaring sampel NLL Eropah.Ujian vaksin dalam persekitaran terkawal mengesahkan keberkesanan kedua-dua penderma yang tahan.Pemprofilan ekspresi gen pembezaan dilakukan pada garis tahan wakil dan mudah terdedah.Rintangan anthracnose dikaitkan dengan ekspresi berlebihan istilah ontologi gen "GO:0006952 Response Pertahanan", "GO:0055114 Proses Redoks", dan "GO:0015979 Fotosintesis".Di samping itu, baris Lanr1(83A:476) menunjukkan pemprograman semula transkrip yang ketara dengan pantas selepas inokulasi, manakala baris lain menunjukkan kelewatan dalam tindak balas ini kira-kira 42 jam.Tindak balas pertahanan dikaitkan dengan gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR dan NBS-LRR, 10 protein yang terlibat dalam patogenesis, protein pemindahan lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, protein dinding sel yang kaya dengan glisin, dan gen dari laluan reaktif oksigen.Tindak balas awal terhadap 83A:476, termasuk penindasan berhati-hati terhadap gen yang dikaitkan dengan fotosintesis, bertepatan dengan perlindungan yang berjaya semasa fasa pertumbuhan vegetatif biologi kulat, menunjukkan bahawa efektor mencetuskan imuniti.Reaksi Mandeloop diperlahankan, begitu juga dengan seretan mendatar keseluruhan.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) ialah bijirin berprotein tinggi yang berasal dari wilayah Mediterranean barat1,2.Ia kini ditanam sebagai tanaman makanan untuk haiwan dan manusia.Ia juga dianggap baja hijau dalam sistem penggiliran tanaman kerana penetapan nitrogen oleh bakteria penetapan nitrogen simbiotik dan peningkatan keseluruhan struktur tanah.NLL telah melalui proses domestikasi yang pesat pada abad yang lalu dan masih berada di bawah tekanan pembiakan yang tinggi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Dengan penanaman NLL yang meluas, berturut-turut kulat patogen membangunkan ceruk pertanian baharu dan menyebabkan penyakit baru yang memusnahkan tanaman. Yang paling luar biasa bagi petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknosa, disebabkan oleh kulat patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling luar biasa bagi petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknosa, disebabkan oleh kulat patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памогенгринберский , Feiler & Hagedorn13. Paling ketara kepada petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknosa yang disebabkan oleh kulat patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真tric菌病原真tric炭疽病的出现，它是由病原真tric菌&pinenbergi nigeri引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌lu。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогебрикомто приклемтор Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling menarik perhatian petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknosa yang disebabkan oleh kulat patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan terawal penyakit ini datang dari Brazil dan Amerika Syarikat, dengan gejala tipikal muncul pada tahun 1912 dan 1929 masing-masing.Walau bagaimanapun, selepas kira-kira 30 tahun, patogen telah ditetapkan sebagai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Morfologi Sasaran. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .dan H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。dan H. Schlenk, .Fenotaip penyakit awal yang dilakukan pada pertengahan abad ke-20 menunjukkan beberapa rintangan dalam aksesi NLL dan lupin kuning (L. luteus L.), tetapi semua aksesi lupin putih (L. albus L.) yang diuji adalah sangat terdedah15,16.Kajian telah menunjukkan bahawa perkembangan antraknosa dikaitkan dengan peningkatan pemendakan (kelembapan udara) dan suhu (dalam julat 12-28°C), yang membawa kepada pelanggaran rintangan pada suhu yang lebih tinggi17, 18. Malah, masa yang diperlukan untuk konidia bercambah dan penyakit itu bermula , adalah empat kali lebih pendek pada 24°C (12 jam) pada keadaan lembapan tinggi (4 jam) 12°C.Oleh itu, pemanasan global yang berterusan telah membawa kepada penyebaran antraknosa.Walau bagaimanapun, penyakit ini diperhatikan di Perancis (1982) dan Ukraine (1983) sebagai petanda ancaman yang akan berlaku, tetapi nampaknya diabaikan oleh industri lupin pada masa itu20,21.Beberapa tahun kemudian, penyakit yang memusnahkan ini merebak ke seluruh dunia dan turut menjejaskan negara pengeluar lupin utama seperti Australia, Poland dan Jerman22,23,24.Berikutan wabak antraknosa pada pertengahan 1990-an, pemeriksaan yang meluas menghasilkan pengenalpastian beberapa penderma tahan dalam sampel NLL19.Rintangan NLL terhadap antraknosa dikawal oleh dua alel dominan berasingan yang terdapat dalam sumber plasma nutfah yang berbeza: Lanr1 dalam kultivar Tanjil dan Wonga dan AnMan dalam kultivar.Mandalay 25, 26. Alel-alel ini melengkapkan penanda molekul yang menyokong pemilihan plasma nutfah tahan dalam program pembiakan25,26,27,28,29,30.Barisan pembiakan tahan 83A:476 yang membawa alel Lanr1 telah dipalangkan dengan garis liar yang mudah terdedah P27255 untuk mendapatkan populasi RIL yang mengasingkan bagi rintangan antraknosa, yang memungkinkan untuk menetapkan lokus Lanr1 kepada kromosom NLL-1131, 32, 33. Penjajaran daripada rangka kerja pemetaan flansik, penandaan NLL. mendedahkan lokasi ketiga-tiga alel pada kromosom yang sama (NLL-11), tetapi dalam kedudukan yang berbeza29,34,35.Walau bagaimanapun, disebabkan bilangan RIL yang kecil dan jarak genetik yang besar antara penanda dan alel yang sepadan, tiada kesimpulan yang boleh dipercayai boleh dibuat tentang gen asasnya.Sebaliknya, penggunaan genetik terbalik dalam lupin adalah sukar kerana potensi penjanaan semulanya yang sangat rendah, yang menjadikan manipulasi genetik menyusahkan37.
Perkembangan germplasma ternakan yang membawa alel yang dikehendaki dalam keadaan homozigot, seperti 83A: 476 (Lanr1) dan Mandelup (AnMan), telah membuka pintu untuk mengkaji rintangan antraknosa dalam menghadapi kehadiran gabungan alel yang bertentangan dalam populasi liar.Kemungkinan mekanisme molekul.Bandingkan tindak balas pertahanan yang dijana oleh genotip tertentu.Kajian ini menilai tindak balas transkrip awal NLL terhadap vaksinasi C. lupini.Pertama, panel germplasma NLL Eropah yang mengandungi 215 baris telah disaring menggunakan penanda molekul yang menandakan alel Lanr1 dan AnMan.Fenotaip anthracnose kemudiannya dilakukan pada 50 baris NLL, sebelum ini dipilih untuk penanda molekul, di bawah keadaan terkawal.Berdasarkan eksperimen ini, empat baris yang berbeza dalam rintangan antraknosa dan komposisi alel Lanr1/AnMan telah dipilih untuk pemprofilan ekspresi gen pertahanan pembezaan menggunakan dua pendekatan pelengkap: penjujukan RNA throughput tinggi dan kuantifikasi PCR masa nyata.
Penyaringan set plasma nutfah NLL (N = 215) dengan penanda Lanr1 (Anseq3 dan Anseq4) dan AnMan (Anseq4) dan AnMan (AnManM1) menunjukkan bahawa hanya satu baris (95726, berhampiran Salamanca-b) menguatkan alel "rintangan" untuk semua penanda , manakala "kehadiran 8 kesesuaian 3" yang boleh diterima (5 ~ 5 yang boleh diterima) .5%) baris.Tiga belas baris menghasilkan dua alel "tahan" penanda Lanr1, dan 8 baris menghasilkan alel "tahan" Lanr1.penanda.Alel "rintangan" penanda AnMan (Jadual Tambahan S1).Dua baris adalah heterozigot untuk penanda Anseq3 dan satu heterozigot untuk penanda AnManM1.42 baris (19.5%) membawa fasa bertentangan alel Anseq3 dan Anseq4, menunjukkan frekuensi tinggi penggabungan antara kedua-dua lokus ini.Fenotip anthracnose di bawah keadaan terkawal (Jadual Tambahan S2) mendedahkan kebolehubahan dalam rintangan genotip yang diuji, yang ditunjukkan dalam keterukan anthracnose.Perbezaan dalam skor min adalah antara 1.8 (tahan sederhana) hingga 6.9 (terdedah) dan perbezaan berat tumbuhan berjulat dari 0.62 (terdedah) hingga 4.45 g (tertahan). Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan dalam dua replikasi eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P <0.0001) serta antara kedua-dua parameter ini (- 0.59 dan - 0.77, P < 0.00). Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan dalam dua replikasi eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P <0.0001) serta antara kedua-dua parameter ini (- 0.59 dan - 0.77, P <0.77, P <0.77). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0.51 для тля, 0,51 для бля бля 0017 dan 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 dan -0,77, Р < 0,0001)). Korelasi yang ketara didapati antara nilai yang diperhatikan dalam dua ulangan eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P <0.0001), serta antara kedua-dua parameter ini (- 0.59 dan -0.77, P < 0.0001)).在两次重复实验中观察到的之间存在显着相关性（疾病严重程度评分之间存在显着相关性（疾病严重程度评分万0，00.00，P0.量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 了 评 1 度 了， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 .– 0.59 . 9 和- 0.77，P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести ва,1 тяжести , 1 P 0л , 1 P , 0 , 0 0 сса растения 0,61, P <0,0001), dan между этими двумя параметрами (-0,59 dan -0,0001) 0,77, P <0,0001. Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan dalam pendua (skor keterukan penyakit 0.51, P = 0.00017 dan berat tumbuhan 0.61, P <0.0001) dan antara kedua-dua parameter ini (-0.59 dan -0.0001) 0.77, P<0.0001 ).Gejala biasa yang dilihat pada tumbuhan yang mudah terdedah termasuk kekusutan dan berpusing pada batang yang menyerupai struktur "haluan gembala", diikuti dengan luka bujur dengan sporozoit oren/merah jambu (Tambahan Rajah 1).Aksesi Australia yang membawa gen Lanr1 (83A:476 dan Tanjil) dan AnMan (Mandelup) adalah tahan sederhana, 0.0331 dan 0.0036).Sesetengah garisan yang turut membawa alel Lanr1 dan/atau AnMan "tahan" menunjukkan simptom penyakit.
Menariknya, beberapa baris NLL yang tidak mempunyai sebarang alel penanda "tahan" mendedahkan tahap rintangan antraknosa yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P <0.0001 untuk kedua-dua parameter), Bojar (nilai P <0.0001 untuk skor dan 0.001 untuk nilai B9-5) dan Populasi untuk berat 0.001 B9. skor dan tidak signifikan untuk berat). Menariknya, beberapa baris NLL yang tidak mempunyai sebarang alel penanda "tahan" mendedahkan tahap rintangan antraknosa yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P <0.0001 untuk kedua-dua parameter), Bojar (nilai P <0.0001 untuk skor dan 0.001 untuk nilai B9-5) dan Populasi untuk berat 0.001 B9. skor dan tidak signifikan untuk berat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокний котустраного у (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обои обои (х параме) (х парам) оценки и 0,001 для массы растения) dan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо длыя массы). Menariknya, beberapa garisan NLL yang tidak mempunyai sebarang alel penanda 'tahan' menunjukkan tahap rintangan yang tinggi terhadap antraknosa (setanding dengan atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0.0001 untuk kedua-dua parameter ), Bojar (nilai P < 0.0001 untuk penilaian dan 0.0001 untuk nilai berat tumbuhan dan 0.0001 untuk berat tumbuhan 0.04/0.9b) untuk penilaian dan tidak signifikan untuk berat).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗中性病抗一中文型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，得分为0.0001，里礍片B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Adalah menarik bahawa sesetengah sistem NLL yang tidak mempunyai sebarang penanda "antigenik" menunjukkan rintangan mendatar yang tinggi (bersamaan dengan gen Lanr1 atau AnMan atau lebih tinggi), seperti Boregine (kedua-dua parameter P <0.0001), Bojar (nilai P < 0.0001, berat tumbuhan 0.001) dan nilai terikan B-549/79b (P < 1.000). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уротрикичать внимые или выше, чем у генотипов Lanr1 atau AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P 0,001, рам) популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Menariknya, beberapa garisan NLL yang tidak mempunyai sebarang alel penanda 'rintangan' menunjukkan tahap rintangan antraknosa yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P untuk kedua-dua parameter <0.0001), Bojar (nilai-P < 0.0001, berat tumbuhan 0.00.0.9) dan populasi <0.0.0.9. berat tidak ketara).Fenomena ini mencadangkan kemungkinan sumber genetik baru rintangan, menjelaskan kekurangan korelasi yang diperhatikan antara genotip penanda dan fenotip penyakit (nilai P dari ~0.42 hingga ~0.98).Oleh itu, ujian Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahawa data tentang rintangan antraknosa adalah lebih kurang diedarkan secara normal untuk skor (nilai P 0.25 dan 0.11) dan jisim tumbuhan (nilai P 0.47 dan 0.55), mencadangkan saya membuat hipotesis bahawa lebih banyak alel daripada Lanr1 dan AnMan terlibat.
Berdasarkan keputusan saringan rintangan antraknosa, 4 baris telah dipilih untuk analisis transkrip: 83A: 476, Boregine, Mandelup, dan Populasi 22660. Garisan ini telah diuji semula untuk rintangan antraks dalam eksperimen inokulasi dengan penjujukan RNA, dengan syarat ia adalah sama seperti dalam ujian sebelumnya.Nilai skor adalah seperti berikut: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) dan populasi 22660 (6.11 ± 1.29 ).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 mencapai purata 40.5 pasang Mread setiap sampel (29.7 hingga 54.4 Mreads) (Jadual Tambahan S3).Skor penjajaran dalam jujukan rujukan adalah antara 75.5% hingga 88.6%.Purata korelasi data kiraan baca antara varian eksperimen antara replika biologi adalah antara 0.812 hingga 0.997 (min 0.959). Daripada 35, 170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen yang lain dinyatakan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas < 5). Daripada 35, 170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen yang lain dinyatakan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессиронвались на музировались е среднее <5). Daripada 35, 170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan baki 4785 gen dinyatakan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略可以忽略不埡。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсубю бесплатно значение <5). Daripada 35, 170 gen yang dianalisis, 2917 tidak dinyatakan dan baki 4785 gen mempunyai ekspresi yang boleh diabaikan (min asas <5).Oleh itu, bilangan gen yang dianggap dinyatakan (min asas ≥ 5) semasa eksperimen ialah 27, 468 (78.1%) (Jadual Tambahan S4).
Dari titik masa pertama, semua garisan NLL bertindak balas kepada inokulasi C. lupini (tekanan Col-08) dengan memprogram semula transkrip (Jadual 1), walau bagaimanapun, perbezaan ketara diperhatikan antara garisan.Oleh itu, garis rintangan 83A:476 (membawa gen Lanr1) menunjukkan pengaturcaraan semula transkrip yang ketara pada titik masa pertama (6 hpi) dengan peningkatan 31-69 kali ganda dalam bilangan gen atas dan bawah yang terpencil berbanding dengan titik masa lain pada titik masa ini.Di samping itu, puncak ini berumur pendek, kerana ekspresi hanya beberapa gen kekal berubah dengan ketara pada titik masa kedua (12 hpi).Menariknya, Boregine, yang juga menunjukkan tahap rintangan yang tinggi dalam ujian rasuah, tidak menjalani pengaturcaraan semula transkrip secara besar-besaran semasa eksperimen.Walau bagaimanapun, bilangan gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) adalah sama untuk Boregine dan 83A: 476 pada 12 HPI.Kedua-dua Mandelup dan populasi 22660 menunjukkan puncak DEG pada titik masa terakhir (48 l/s), menunjukkan kelewatan relatif dalam tindak balas pertahanan.
Oleh kerana 83A: 476 menjalani pengaturcaraan semula transkrip secara besar-besaran sebagai tindak balas kepada C. lupini pada 6 HPI berbanding dengan semua baris lain, ~ 91% daripada DEG yang diperhatikan pada masa ini adalah khusus keturunan (Rajah 1).Walau bagaimanapun, terdapat beberapa pertindihan dalam tindak balas awal antara baris kajian, kerana 68.5%, 50.9%, dan 52.6% DEG di Boregine, Mandelup, dan populasi 22660, masing-masing bertindih dengan yang terdapat dalam 83A:476 pada masa tertentu.Walau bagaimanapun, DEG ini menyumbang hanya sebahagian kecil (0.97–1.70%) daripada semua DEG yang dikesan pada masa ini menggunakan 83A:476.Di samping itu, 11 DEG dari semua baris adalah koheren pada masa ini (Jadual Tambahan S4-S6), termasuk komponen umum tindak balas pertahanan tumbuhan: protein pemindahan lipid (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), dua protein yang boleh diinduksi tekanan seperti SAM22 (TanjilG_322) (TanjilG_3225) protein asas. 32352), dan dua protein dinding sel struktur yang kaya dengan glisin (TanjilG_19701 dan TanjilG_19702).Terdapat juga pertindihan yang agak tinggi dalam tindak balas transkrip antara 83A:476 dan Boregine pada 24 HPI (jumlah 16-38% DEG) dan antara Mandelup dan Populasi 22660 pada 48 HPI (jumlah 14-20% DEG).
Gambar rajah Venn menunjukkan bilangan gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) dalam garisan lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan Colletotrichum lupini (terikan Col-08 yang diperolehi daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, 1999).Garisan NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan) dan populasi 22660 (sangat terdedah).Singkatan hpi adalah berjam-jam selepas vaksinasi.Nilai sifar telah dialih keluar untuk memudahkan graf.
Set gen yang terlalu tertekan pada 6 hpi dianalisis untuk kehadiran domain gen R kanonik (Jadual Tambahan S7).Kajian ini mendedahkan induksi transkrip gen rintangan penyakit klasik dengan domain NBS-LRR hanya pada 83A: 476.Set ini terdiri daripada satu gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, dan tanjilg_16162), dan Four NBS-16jilg2 (Tanjilg_16162) dan Four NBS-LR16jilg2 ) serta Empat NBS-Lrr (tanjilg_16162) dan Empat NBS-LRR (TANJILG_16162).Kesemua gen ini mempunyai domain kanonik yang disusun dalam urutan terpelihara.Sebagai tambahan kepada gen domain NBS-LRR, beberapa kinase RLL diaktifkan pada 6 hpi, iaitu satu di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 dan TanjilG_19877) dan dalam populasi 22660 (TanjilG_09014 dan TanjilG_103)
Gen dengan ekspresi yang diubah dengan ketara sebagai tindak balas kepada inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) tertakluk kepada analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Jadual Tambahan S8). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili adalah "GO: 0006952 tindak balas pertahanan" yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (garis × masa) dengan keertian yang tinggi (nilai P <0.001) (Rajah 2). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili adalah "GO: 0006952 tindak balas pertahanan" yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (garis × masa) dengan keertian yang tinggi (nilai P <0.001) (Rajah 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответской» 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili adalah 'GO:0006952 tindak balas pertahanan', yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (masa × keturunan) dengan kepentingan tinggi (nilai P <0.001) (Rajah 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时闐（时闐（中中一一一一一一一一上具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Istilah proses biologi yang paling mewakili ialah "GO:0006952 tindak balas pertahanan", yang terdapat dalam 6 daripada 16 kombinasi (时间×线), dengan keertian tinggi (nilai P < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», котов1блый 6 поского процесса был «GO: 0006952 Defence Response», котов1блый 6 циля ий (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologi yang paling kerap digambarkan ialah 'GO:0006952 Defence Response', yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (garisan masa ×) dengan keertian tinggi (nilai P <0.001) (Rajah 2).Istilah ini diwakili secara berlebihan pada dua titik masa dalam 83A: 476 dan Boregine (6 dan 24 hpi) dan pada satu titik masa di Mandelup dan Populasi 22660 (masing-masing 12 dan 6 hpi).Ini adalah hasil yang dijangka, menyerlahkan tindak balas antikulat garis tahan.Di samping itu, 83A:476 bertindak balas kepada C. lupini dengan mendorong gen yang berkaitan dengan letusan oksidatif dengan pantas yang diwakili oleh istilah "GO:0055114 proses redoks", menunjukkan tindak balas pertahanan khusus, manakala Boregine mendedahkan tindak balas pertahanan khusus, berkaitan dengan istilah 'GO'.:0006950 Tindak balas tekanan”.Populasi 22660 mengaktifkan tindak balas rintangan mendatar yang melibatkan metabolit sekunder, menyerlahkan bilangan istilah yang berlebihan "GO:0016104 Proses biosintesis triterpena" dan "GO:0006722 Proses metabolisme triterpena" (kedua-dua istilah tergolong dalam set gen yang sama ), dengan mengambil kira hasil analisis tindak balas kestabilan Ma006 Bondel22 GO. Selain itu, tindak balas awal 83A:476 (6 hpi) dan tindak balas tertunda Mandelup dan Populasi 22660 termasuk istilah GO:0015979 'fotosintesis' dan proses biologi lain yang berkaitan.
Istilah ontologi gen bioproses yang dipilih dalam anotasi gen yang dinyatakan secara berbeza semasa tindak balas transkrip lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan lupin antraks (strain Col-08 yang diperoleh daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, pada tahun 1999) adalah sangat dibesar-besarkan.Garis NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot) dan populasi 22660 (terdedah).
Oleh kerana kajian ini bertujuan untuk mengenal pasti gen yang menyumbang kepada rintangan antraknosa, gen yang diberikan kepada istilah GO "GO: 0006952 Respons defensif" dan "GO: 0055114 Proses redoks" dianalisis dengan pemotongan kerana garis dasar bermakna ≥ 30 dengan sekurang-kurangnya satu baris.× titik dalam masa menggabungkan nilai log2 yang signifikan secara statistik (perubahan kali ganda).Bilangan gen yang memenuhi kriteria ini ialah 65 untuk GO:0006952 dan 524 untuk GO:0055114.
83A:476 mendedahkan dua puncak DEG beranotasi dengan istilah GO:0006952, yang pertama pada 6 gen setiap inci (64 gen, peraturan naik dan turun) dan yang kedua pada 24 gen setiap inci (15 gen, peraturan naik sahaja).Boregine juga menunjukkan bahawa GO:0006952 memuncak pada titik masa yang sama, tetapi dengan kurang DEG (11 dan 8) dan pengaktifan keutamaan.Mandeloop menunjukkan dua puncak GO: 0006952 pada 12 dan 48 HPI, kedua-duanya membawa 12 gen (yang pertama dengan gen pengaktifan, dan yang kedua dengan hanya gen menindas), manakala populasi 22660 pada 6 HPI (13 gen) mempunyai dominasi puncak peningkatan yang lebih besar.peraturan.Perlu diingatkan bahawa 96.4% daripada GO: 0006952 DEG dalam puncak ini mempunyai jenis tindak balas yang sama (naik atau turun), menunjukkan pertindihan yang ketara dalam tindak balas pertahanan walaupun terdapat perbezaan dalam bilangan gen yang terlibat.Kumpulan jujukan terbesar yang berkaitan dengan istilah GO:0006952 mengekodkan Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (seperti SAM22), yang tergolong dalam klad protein kelas 10 berkaitan patogenesis (PR-10) dan lateks protein teras.protein yang serupa (seperti MLP) protein (Rajah 3).Kedua-dua kumpulan berbeza dalam sifat ekspresi dan arah tindak balas.Pengekodan gen protein seperti SAM22 menunjukkan induksi yang konsisten dan ketara pada titik masa awal (6 atau 12 hpi) dan secara amnya tidak bertindak balas pada akhir eksperimen (48 hpi), manakala protein seperti MLP menunjukkan koordinasi pada 6 hpi.hpi.83A:476 dan Mandelup pada 48 hp/in, hampir semua titik data lain tidak bertindak balas.Di samping itu, perbezaan dalam profil ekspresi gen protein seperti SAM22 mengikuti kebolehubahan yang diperhatikan dalam rintangan antraknosa, kerana lebih banyak garisan tahan mempunyai lebih banyak titik masa dengan ketara mendorong gen ini daripada gen yang lebih mudah terdedah.Satu lagi gen PR-10 seperti LlR18A/B menunjukkan corak ekspresi yang sangat serupa dengan gen protein seperti SAM22.
Komponen utama istilah proses biologi "GO:0006952 Defence Response" dan corak ekspresi gen calon alel Lanr1 dan AnMan telah dikenal pasti.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan kali ganda) antara yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama.Garis lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (terdedah).
Di samping itu, profil ekspresi gen calon RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dan AnMan (TanjilG_12861) telah dinilai (Rajah 3).Gen TanjilG_05042 menunjukkan tindak balas yang ketara (pengaktifan) pada 83A:476 hanya pada titik masa pertama (6 hpi), manakala TanjilG_12861 adalah signifikan dalam Mandeloop hanya pada dua titik masa: 6 hpi (peraturan turun) dan 24 hpi (6 hpi).Dengan.).boleh laras) ).
Gen yang paling tertekan dalam istilah "proses redoks" GO:0055114 ialah gen yang mengekod protein sitokrom P450 dan peroksidase (Rajah 4).Bagi sampel yang diasingkan daripada 83A:476 pada 6 HPI, nilai log2 maksimum atau minimum (perubahan kali ganda) (untuk 86.6% gen) secara amnya diperhatikan antara tumbuhan yang diinokulasi dan kawalan, menonjolkan tindak balas tinggi genotip ini terhadap jantina yang diinokulasi.83A:476 menunjukkan GO yang paling ketara: 0055114 DEG pada 6 hpi (503 gen), manakala garisan selebihnya pada 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; dan Populasi 22660, 78 gen)).Dalam kebanyakan gen keluarga GO: 0055114, dua jenis tindak balas terhadap vaksinasi (pengaktifan dan perencatan) diperhatikan.Menariknya, sehingga 97.6% daripada DEG yang dikenal pasti untuk istilah GO: 0055114 dalam Mandelupe pada 48 hp Pemerhatian ini menunjukkan bahawa, walaupun skala yang jauh lebih kecil (iaitu, bilangan gen redoks yang bermutasi, 85 berbanding 503), corak tindak balas transkrip tertunda bagi mandeloup 6 adalah serupa dengan 8 mandeloup awal: 6.Dalam Boregine dan Populasi 22660, penumpuan ini masing-masing lebih rendah pada 51.6% dan 75.6%.
Corak ekspresi komponen utama istilah proses biologi "GO:0055114 Proses redoks" telah didedahkan.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan kali ganda) antara yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama.Garis lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (terdedah).
83A:476 Tindak balas transkriptik terhadap inokulasi dengan C. lupini (tekanan Col-08) juga termasuk pembungkaman terkoordinasi gen yang dikaitkan dengan istilah GO:0015979 "fotosintesis" dan proses biologi lain yang berkaitan (Rajah 5).Set GO:0015979 DEG ini mengandungi 105 gen yang ditindas dengan ketara pada 6 hpi pada 83A:476.Dalam subset ini, 37 gen juga dikurangkan dalam Mandelup pada 48 HPI dan 35 pada titik masa yang sama dalam populasi 22660, termasuk 19 DEG yang biasa untuk kedua-dua genotip.Tiada DEG yang berkaitan dengan istilah GO: 0015979 telah diaktifkan dengan ketara dalam sebarang kombinasi (baris x masa).
Corak ekspresi komponen utama istilah proses biologi "GO:0015979 Fotosintesis" telah didedahkan.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan kali ganda) antara yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama.Garis lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (terdedah).
Berdasarkan keputusan analisis ekspresi pembezaan dan mungkin terlibat dalam tindak balas pertahanan terhadap kulat patogen, set tujuh gen ini dipilih untuk kuantifikasi profil ekspresi oleh PCR masa nyata (Jadual Tambahan S9).
Gen protein putative TanjilG_10657 telah diinduksi dengan ketara dalam semua garisan dan titik masa yang dikaji berbanding tumbuhan kawalan (meniru) (Jadual Tambahan S10, S11).Di samping itu, profil ekspresi TanjilG_10657 menunjukkan arah aliran yang semakin meningkat sepanjang percubaan untuk semua baris.Populasi 22660 menunjukkan sensitiviti tertinggi TanjilG_10657 kepada inokulasi dengan pengaktifan 114 kali ganda dan tahap ekspresi relatif tertinggi (4.4 ± 0.4) pada 24 HPI (Rajah 6a).Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 juga menunjukkan pengaktifan merentasi semua garisan dan titik masa, dengan kepentingan statistik pada kebanyakan titik data (Rajah 6b).Sama seperti TanjilG_10657, tahap ekspresi relatif tertinggi TanjilG_27015 diperhatikan dalam 22660 populasi yang diinokulasi pada 24 HPI (19.5 ± 2.4).Gen asid endochitinase TanjilG_04706 dikawal dengan ketara dalam semua baris dan pada semua titik masa kecuali Boregine 6 hpi (Rajah 6c).Ia didorong dengan kuat pada titik masa pertama (6 HPI) pada 83A:476 (sebanyak 10.5 kali) dan meningkat secara sederhana dalam talian lain (sebanyak 6.6-7.5 kali).Semasa eksperimen, ungkapan TanjilG_04706 kekal pada tahap yang sama dalam 83A:476 dan Boregine, manakala dalam Mandelup dan Populasi 22660 ia meningkat dengan ketara, mencapai nilai yang agak tinggi (5.9 ± 1.5 dan 6.2 ± 1.5, masing-masing).Gen seperti endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 menunjukkan pengaktifan tinggi pada dua titik masa pertama (6 dan 12 hpi) dalam semua baris kecuali populasi 22660 (Rajah 6d).Tahap ekspresi relatif tertinggi TanjilG_23384 diperhatikan pada titik masa kedua (12 hpi) dalam Mandelup (2.7 ± 0.3) dan 83A:476 (1.5 ± 0.1).Pada 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 agak rendah dalam semua baris yang dikaji (dari 0.04 ± 0.009 hingga 0.44 ± 0.12).
Profil ekspresi gen terpilih (ag) didedahkan oleh PCR kuantitatif.Nombor 6, 12 dan 24 mewakili jam selepas vaksinasi.Gen LanDExH7 dan LanTUB6 digunakan untuk normalisasi dan LanTUB6 digunakan untuk penentukuran antara siri.Bar ralat mewakili sisihan piawai berdasarkan tiga replika biologi, setiap satunya ialah purata tiga replika teknikal. Kepentingan statistik perbezaan dalam tahap ekspresi antara inokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari medan lupin di Wierzenica, Poland) dan tumbuhan kawalan (inokulasi olok-olok) ditandakan di atas titik data (* nilai P < 0.05, ** nilai P ≤ 0.01, *** nilai P ≤ 0.01, *** P0.01). Kepentingan statistik perbezaan dalam tahap ekspresi antara inokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari medan lupin di Wierzenica, Poland) dan tumbuhan kawalan (inokulasi olok-olok) ditandakan di atas titik data (* nilai P < 0.05, ** nilai P ≤ 0.01, *** nilai P ≤ 0.01, *** P0.01). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля 1999 г. женице, Польша) dan контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P, **, значение P < 0,005 P < 0,05 P ≤ 0,001). Perbezaan ketara secara statistik dalam tahap ekspresi antara inokulasi (Colletotrichum lupini, terikan Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari medan lupin di Wierzhenice, Poland) dan tumbuhan kawalan (diinokulasi palsu) dicatatkan di atas titik data (*nilai P < 0.05, **nilai P ≤ 0.01, ≤ 0. ***P-0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种義行差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秉 （接秗差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученнлий спо, полученный спод Польша, в 1999 г.) dan контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* P, ** ч0,ние х (* P, ** ч0,ние 5 ***P-значение ≤ 0,001). Perbezaan ketara secara statistik dalam tahap ekspresi antara yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, terikan Col-08, diperoleh daripada ladang lupin di Verzhenice, Poland, pada tahun 1999) dan tumbuhan kawalan (diinokulasi palsu) dicatatkan di atas titik data (*nilai P < 0.05 , **nilai P ≤ 0.01 , ≤ 0-1, ***P-1).Garisan NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui) dan populasi 22660 (terdedah).
Gen calon TanjilG_05042 di lokus Lanr1 menunjukkan corak ekspresi yang sangat berbeza daripada profil yang diperoleh daripada kajian RNA-seq (Rajah 6e).Pengaktifan gen ini yang ketara diperhatikan di Mandelup dan populasi 22660 (sehingga 39.7 dan 11.7 kali, masing-masing), menghasilkan tahap ekspresi yang agak tinggi (sehingga 1.4 ± 0.14 dan 7.2 ± 1.3, masing-masing).83A: 476 juga mendedahkan beberapa pengawalseliaan gen TanjilG_05042 (sehingga 3.8 kali ganda), bagaimanapun, tahap ekspresi relatif yang dicapai (0.044 ± 0.002) adalah lebih daripada 30 kali ganda lebih rendah daripada yang diperhatikan di Mandelup dan populasi 22660.dianalisis oleh qPCR menunjukkan perbezaan ketara dalam tahap ekspresi antara genotip dalam varian yang divaksin olok-olok (kawalan), mencapai perbezaan 58 kali ganda antara populasi 22660 dan 83A:476, serta antara populasi 22660 dan 22660. Perbezaan dua kali ganda dicapai antara Boregine dan Mandalup.
Gen calon di lokus AnMan, TanjilG_12861, telah diaktifkan sebagai tindak balas kepada vaksinasi dalam 83A: 476 dan Mandelup, adalah neutral dalam populasi 22660, dan telah dikurangkan dalam Boregine (Rajah 6f).Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 adalah yang tertinggi dalam inokulasi 83A: 476 (0.14±0.01).Gen protein kejutan haba kelas I 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 menunjukkan tahap ekspresi relatif yang lebih rendah dalam semua strain dan titik masa yang dikaji (Rajah 6g).Nilai tertinggi diperhatikan pada 24 HPI dalam populasi 22660 (0.14 ± 0.02, peningkatan lapan kali ganda sebagai tindak balas kepada vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Rajah 7) menunjukkan korelasi yang tinggi antara TanjilG_10657 dan empat gen lain: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), dan TanjilG6_0.Keputusan sedemikian mungkin menunjukkan peraturan bersama gen ini semasa tindak balas pertahanan.Gen TanjilG_12861 dan TanjilG_23384 menunjukkan profil ekspresi yang berbeza dengan nilai pekali korelasi Pearson yang lebih rendah (dari 0.08 hingga 0.43 dan -0.19 hingga 0.28, masing-masing) berbanding dengan gen lain.
Korelasi antara profil ekspresi gen dikesan menggunakan PCR kuantitatif.Garis lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan sederhana, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), dan Populasi 22660 (terdedah).Tiga titik masa telah dikira (6, 12 dan 24 jam selepas inokulasi), termasuk inokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperolehi daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, pada tahun 1999) dan tumbuhan kawalan (sham-inoculated).Skala menunjukkan nilai pekali korelasi Pearson.
Berdasarkan data yang diperoleh pada 6 kuasa kuda setiap inci, WGCNA telah dilakukan pada 9981 DEG yang dikenal pasti dengan membandingkan loji yang diinokulasi dan kawalan untuk memberi tumpuan kepada tindak balas pertahanan awal (Jadual Tambahan S12).Dua puluh dua modul gen (kelompok) ditemui dengan profil ekspresi berkorelasi (positif atau negatif) antara genotip dan varian eksperimen. Secara purata, tahap ekspresi gen menurun mengikut urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (dalam kedua-dua varian, bagaimanapun, aliran ini lebih kuat dalam loji kawalan). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun mengikut urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (dalam kedua-dua varian, bagaimanapun, aliran ini lebih kuat dalam loji kawalan). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, обнтанакиеньдь, обнытако, бел контрольных растений). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dalam kedua-dua varian, bagaimanapun, aliran ini lebih kuat dalam loji kawalan).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 的顺序下降（然而，在两种变住照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 翜 在 种 中中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта теня тенд рольных растений). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun dalam siri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (namun, dalam kedua-dua varian, aliran ini lebih kuat dalam loji kawalan).Vaksinasi menyebabkan penyeliaan ekspresi gen, terutamanya dalam modul 18, 19, 14, 6 dan 1 (dalam susunan kesan menurun), peraturan negatif (cth modul 9 dan 20) atau dengan kesan neutral (cth modul 11, 22, 8 dan 13).Analisis Pengayaan GO (Jadual Tambahan S13) mendedahkan "GO: 0006952 Responses Protective" untuk modul yang disuntik (18) dengan pengaktifan maksimum, termasuk gen yang dianalisis oleh qPCR (tanjilg_04706, tanjilg_2384, tanjilg .Penumpu modul 18 (Rajah 8) dikenal pasti sebagai gen TanjilG_26536 yang mengekod protein LlR18B seperti PR-10, dan penumpu modul 9 dikenal pasti sebagai gen TanjilG_28955 yang mengekodkan protein PsbQ fotosistem II.Gen rintangan antraknosa calon Lanr1, TanjilG_05042, ditemui dalam modul 22 (Rajah 9) dan dikaitkan dengan istilah "GO: 0044260 Proses metabolik makromolekul selular" dan "GO: 0006355 Peraturan transkrip, templat DNA" yang membawa hab TanjilG_01212.gen mengekodkan faktor transkripsi tekanan haba A-4a (HSFA4a).
Analisis rangkaian berwajaran bagi ekspresi bersama gen modul dengan istilah proses biologi yang diwakili secara berlebihan "GO: 0006952 Respons pertahanan".Ligasi dipermudahkan untuk menyerlahkan empat gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015).
Analisis rangkaian berwajaran bagi ekspresi bersama gen bagi modul dengan istilah proses biologi yang diwakili secara berlebihan "GO: 0006355: Peraturan transkrip, templat DNA" dan membawa gen rintangan antraknosa calon Lanr1 TanjilG_05042.Ligasi dipermudahkan untuk mengasingkan gen TanjilG_05042 dan gen TanjilG_01212 pusat.
Saringan rintangan antraknosa yang dikumpul di Australia menunjukkan bahawa kebanyakan kultivar yang dikeluarkan awal terdedah;Kalya, Coromup dan Mandelup telah digambarkan sebagai tahan sederhana, manakala Wonga, Tanjil dan 83A:476 telah digambarkan sebagai tahan sangat26,27,31.mempunyai alel rintangan yang sama, Lanr1 ditetapkan, dan Coromup dan Mandelup mempunyai alel berbeza, ditetapkan AnMan10, 26, 39, manakala Kalya menghantar alel berbeza., Lanr2.Pemeriksaan untuk rintangan antraknosa di Jerman menghasilkan pengenalpastian garis tahan Bo7212 dengan alel calon selain Lanr1, yang ditetapkan LanrBo36.
Kajian kami mendedahkan kekerapan yang sangat rendah (kira-kira 6%) daripada alel Lanr1 dalam plasma nutfah yang diuji.Pemerhatian ini konsisten dengan hasil pemeriksaan plasma nutfah Eropah Timur menggunakan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan bahawa alel Lanr1 hanya terdapat dalam dua baris Belarusia.Ini menunjukkan bahawa alel Lanr1 belum digunakan secara meluas oleh program pembiakan tempatan, tidak seperti di Australia, di mana ia merupakan salah satu alel utama untuk pembiakan dibantu penanda.Ini mungkin disebabkan oleh tahap rintangan yang lebih rendah yang disediakan oleh alel Lanr1 dalam keadaan medan Eropah berbanding laporan Australia.Di samping itu, kajian antraknosa di kawasan hujan tinggi di Australia telah menunjukkan bahawa tindak balas rintangan yang dimediasi oleh alel Lanr1 mungkin tidak berkesan dalam keadaan cuaca yang memihak kepada pertumbuhan dan perkembangan pesat patogen19,42.Malah, dalam kajian ini, beberapa gejala antraknosa juga diperhatikan dalam genotip yang membawa alel Lanr1, menunjukkan bahawa rintangan mungkin hilang di bawah keadaan optimum untuk pembangunan C. lupini.Di samping itu, tafsiran positif palsu tentang kehadiran penanda Anseq3 dan Anseq4, yang kira-kira 1 cM dari lokus Lanr1, mungkin 28,30,43 .
Kajian kami menunjukkan bahawa 83A: 476, yang membawa alel Lanr1, bertindak balas kepada inokulasi C. lupini dengan pengaturcaraan semula transkriptom berskala besar pada titik masa yang dianalisis pertama (6 hpi), manakala di Mandelup, yang membawa alel AnMan, tindak balas transkripmik diperhatikan lebih lama kemudian.(dari 24 hingga 48 hp).Variasi temporal dalam tindak balas pertahanan ini dikaitkan dengan perbezaan dalam gejala penyakit, menonjolkan kepentingan pengiktirafan awal patogen untuk tindak balas yang berjaya terhadap rintangan.Untuk menjangkiti tisu tumbuhan, spora antraks mesti melalui beberapa peringkat perkembangan pada permukaan perumah, termasuk percambahan, pembahagian sel, dan pembentukan appressorium.Lampiran ialah struktur infektif yang melekat pada permukaan perumah dan memudahkan penembusan ke dalam tisu perumah.Oleh itu, spora C. gloeosporioides dalam ekstrak kacang menunjukkan pembahagian pertama nukleus selepas 75-90 minit pengeraman, pembentukan tiub kuman selepas 90-120 minit, dan penindasan selepas 4 jam 45 .Mangga C. gloeosporioides menunjukkan lebih daripada 40% percambahan konidial selepas 3 jam pengeraman dan kira-kira 20% pembentukan apresor selepas 4 jam.Gen CAP20 yang berkaitan dengan virulensi C. gloeosporioides menunjukkan aktiviti transkrip dalam konidia pembentuk epifit selepas pengeraman 3.5 jam dalam lilin permukaan alpukat dengan kepekatan tinggi protein CAP20 selepas 4 jam 46 min.Begitu juga, aktiviti gen biosintesis melanin dalam C. trifolii telah diinduksi semasa pengeraman 2 jam diikuti dengan pembentukan apresorium selepas 1 jam.Kajian terhadap tisu daun telah menunjukkan bahawa strawberi yang disuntik dengan C. acutatum mempunyai penindasan pertama pada 8 hpi, manakala tomato yang disuntik dengan C. coccodes mempunyai penindasan pertama pada 4 hpi48,49.sebahagian besarnya konsisten dengan skala masa Colletotrichum spp.proses berjangkit.Tindak balas pertahanan pantas terhadap 83A:476 mencadangkan penglibatan rintangan tumbuhan dan gen imuniti tercetus efektor (ETI) dalam baris ini, manakala tindak balas tertunda Mandelup menyokong hipotesis imuniti tercetus corak molekul mikro (MTI) 50. Tindak balas awal kepada 83A: 476Pertindihan separa antara gen terkawal atas atau bawah dalam tindak balas tertunda juga menyokong konsep ini, kerana ETI sering dianggap sebagai tindak balas MTI yang dipercepat dan dipertingkatkan yang memuncak dalam kematian sel terprogram di tapak jangkitan, yang dikenali sebagai kejutan anaphylactic 51,52 .
Kebanyakan gen yang dikaitkan dengan istilah yang diwakili berlebihan Gene Ontology GO:0006952 "Respons Pertahanan" ialah 11 homolog bagi mesej berpuasa yang disebabkan oleh tekanan 22 protein (serupa dengan SAM22) dan tujuh jenis protein lateks utama (MLP).-seperti protein 31, 34, 43 dan 423 menunjukkan persamaan urutan.Gen seperti SAM22 menunjukkan pengaktifan ketara yang bertahan lebih lama, menunjukkan peningkatan tahap rintangan antraknosa (83A: 476 dan Boregine).Walau bagaimanapun, gen seperti MLP dikurangkan hanya dalam baris yang membawa alel rintangan calon (83A: 476 / Lanr1 pada 6 hpi dan Mandelup / AnMan pada 24 hpi).Perlu diingatkan bahawa semua homolog seperti SAM22 yang dikenal pasti berasal dari gugusan gen yang merangkumi kira-kira 105 kb, manakala gen seperti MLP berasal dari kawasan genom yang berasingan.Pengaktifan terkoordinasi gen seperti SAM22 tersebut juga ditemui dalam kajian terdahulu kami tentang rintangan NLL terhadap inokulasi Diaporthetoxica, menunjukkan bahawa mereka terlibat dalam komponen mendatar tindak balas pertahanan.Kesimpulan ini juga disokong oleh laporan mengenai tindak balas positif gen seperti SAM22 kepada kecederaan atau rawatan dengan asid salisilik, induksi kulat, atau hidrogen peroksida.
Gen seperti MLP telah ditunjukkan untuk bertindak balas terhadap pelbagai tekanan abiotik dan biotik, termasuk jangkitan kulat bakteria, virus dan patogen dalam banyak spesies tumbuhan55.Arah tindak balas kepada interaksi tertentu antara tumbuhan dan patogen adalah daripada meningkat dengan kuat (iaitu, semasa serangan kapas dengan Verticillium dahliae) kepada penurunan dengan ketara (iaitu, selepas jangkitan pokok epal dengan Alternaria spp.)56,57.Penurunan yang ketara bagi gen 423 seperti MLP telah diperhatikan semasa pertahanan alpukat terhadap jangkitan F. niger dan semasa jangkitan pokok epal Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola dan Alternaria alternata adalah patotaip epal58,59.Di samping itu, calli epal yang terlalu mengekspresikan gen 423 seperti MLP mempunyai ekspresi gen yang berkaitan dengan rintangan yang lebih rendah dan lebih mudah terdedah kepada jangkitan kulat59.Berikutan Fusarium oxysporum f, gen 423 seperti MLP juga ditindas dalam plasma nutfah kacang biasa yang tahan.cn.Jangkitan kacang 60.
Ahli keluarga PR-10 lain yang dikenal pasti dalam kajian RNA-seq kami ialah gen LlR18A dan LlR18B sebagai tindak balas kepada pengawalseliaan, serta gen yang dikawal (1 gen) atau dikurangkan (3 gen) untuk protein pemindahan lipid DIR1..Di samping itu, WGCNA menyerlahkan gen LlR18B sebagai hab dalam modul ini, yang sangat terdedah kepada vaksinasi dan membawa beberapa gen tindak balas perlindungan.Gen LlR18A dan LlR18B telah diinduksi dalam daun lupin kuning sebagai tindak balas kepada bakteria patogen, dan juga dalam batang NLL selepas inokulasi D. toksika, manakala homolog beras gen ini, RSOsPR10, telah didorong dengan cepat oleh jangkitan kulat yang mungkin terlibat dalam laluan isyarat bukan asid jasmonik DIdesRiciprotein 62, gen transpor lipid 62, gen 62, gen isyarat bukan lipid. yang diperlukan untuk permulaan rintangan diperoleh sistemik (SAR).Dengan perkembangan tindak balas perlindungan, protein DIR1 diangkut dari fokus jangkitan melalui phloem untuk mendorong SAR dalam organ yang jauh.Menariknya, gen TanjilG_02313 DIR1 telah diinduksi dengan ketara pada titik kali pertama dalam baris 84A:476 dan Populasi 22660, tetapi rintangan antraknosa berjaya dibangunkan hanya dalam baris 84A:476.Ini mungkin menunjukkan beberapa subfungsi gen DIR1 dalam NLL, kerana baki tiga homolog bertindak balas kepada inokulasi hanya dalam baris 83A: 476 pada 6 hpi, dan tindak balas ini diarahkan ke bawah.
Dalam kajian kami, komponen paling biasa yang sepadan dengan proses biologi yang dipanggil "GO: 0055114 proses Redoks" ialah protein sitokrom P450, peroksidase, asid linoleik 9S-/13S-lipoxygenase, dan 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Selain itu, WGCNA kami mentakrifkan homolog HSFA4a sebagai hab yang membawa modul seperti calon gen rintangan Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a ialah komponen peraturan transkripsi nuklear yang bergantung kepada redoks dalam tumbuhan.
Protein sitokrom P450 ialah oksidoreduktase yang memangkinkan tindak balas hidroksilasi yang bergantung kepada NADPH dan/atau O2 dalam metabolisme primer dan sekunder, termasuk metabolisme xenobiotik, serta hormon, asid lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer, dan biosintesis sebatian pelindung 69. Dalam kajian P40d sitokrom2 kami, kebolehubahan dalam loji 502 telah dikurangkan. perubahan lipatan) kepada 5.7 disebabkan oleh sejumlah besar homolog yang diubah (37) dan perbezaan dalam corak tindak balas antara gen tertentu, mencerminkan semakan ke atas..Menggunakan hanya data RNA-seq untuk menjelaskan fungsi biologi yang diduga gen NLL dalam superfamili protein yang besar itu akan menjadi sangat spekulatif.Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan bahawa beberapa gen sitokrom P450 dikaitkan dengan peningkatan rintangan kepada kulat atau bakteria patogen, termasuk sumbangan kepada tindak balas alahan69,70,71.
Peroksidase Kelas III ialah enzim tumbuhan pelbagai fungsi yang terlibat dalam pelbagai proses metabolik semasa pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan, serta sebagai tindak balas kepada tekanan persekitaran seperti kemasinan, kemarau, intensiti cahaya yang tinggi, dan serangan patogen72.Peroksidase terlibat dalam interaksi beberapa spesies tumbuhan dengan Anthracis, termasuk Stylosanthes humilis dan C. gloeosporioides, Lens culinaris dan C. truncatum, Phaseolus vulgaris dan C. lindemuthianum, Cucumis sativus dan C. lagenarium73,74,75,76.Tindak balas sangat cepat, kadang-kadang walaupun pada 4 HPI, sebelum kulat menembusi tisu tumbuhan73.Gen peroksidase juga bertindak balas terhadap inokulasi NLL D. toksika.Sebagai tambahan kepada fungsi biasa mereka untuk mengawal letupan oksidatif atau menghapuskan tekanan oksidatif, peroksidase boleh mengganggu pertumbuhan patogen dengan mewujudkan halangan fizikal berdasarkan pengukuhan dinding sel semasa lignifikasi, subunit atau penyambung silang sebatian tertentu.Fungsi ini boleh dikaitkan dalam silico kepada gen TanjilG_03329 yang mengekodkan anion peroksidase pembentuk lignin yang diduga yang dikawal dengan ketara dalam kajian kami dalam garis tahan 83A: 476 pada 6 HPI, tetapi tidak dalam strain dan titik masa lain yang tidak bertindak balas.
9S-/13S-lipoxygenase asid linoleik ialah langkah pertama dalam laluan oksidatif biosintesis lipid78.Produk laluan ini mempunyai pelbagai fungsi dalam pertahanan tumbuhan, termasuk pengukuhan dinding sel melalui pembentukan deposit callose dan pektin, dan pengawalan tekanan oksidatif melalui penghasilan spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83.Dalam kajian ini, ungkapan asid linoleik 9S-/13S-lipoxygenase telah diubah dalam semua strain, tetapi dalam populasi yang mudah terdedah 22660, regulasi berlaku pada titik masa yang berbeza, manakala dalam strain yang membawa Lanr1 tahan dan alel AnMan, ia menekankan kepelbagaian tindak balas pelindung anthratypes ini dalam lapisan pelindung anthralipinx.
Homolog 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) telah dikawal dengan ketara (9 gen) atau dikurangkan (2 gen) apabila diinokulasi dengan lupin.Dengan dua pengecualian, semua respons ini berlaku pada 6 hp.pada 83A:476.Tindak balas enzimatik yang dimediasi oleh protein ACO adalah langkah mengehadkan kadar dalam pengeluaran etilena dan oleh itu sangat dikawal84.Etilena ialah hormon tumbuhan yang memainkan pelbagai peranan dalam mengawal perkembangan tumbuhan dan tindak balas terhadap keadaan tekanan abiotik dan biotik.Induksi transkripsi ACO dan pengaktifan laluan isyarat etilena terlibat dalam meningkatkan ketahanan beras terhadap kulat hemibiotropik oryzae oryzae dengan mengawal pengeluaran spesies oksigen reaktif dan fitoaleksin.Proses jangkitan daun yang hampir sama ditemui di antara M. oryzae dan C. lupini88,89, berlatarbelakangkan regulasi ketara homolog ACO dalam baris 83A:476 yang dilaporkan dalam kajian ini, mengalihkan kemungkinan memberikan rintangan kepada NLL anthracnose Ethylene sebagai langkah utama isyarat dalam laluan molekul .
Dalam kajian ini, penindasan berskala besar banyak gen yang dikaitkan dengan fotosintesis diperhatikan pada 6 hpi dalam 83A: 476 dan pada 48 hpi di Mandeloop dan populasi 22660.Tahap dan perkembangan perubahan ini adalah berkadar dengan tahap.Rintangan antraknosa diperhatikan dalam eksperimen ini.Baru-baru ini, penindasan kuat dan awal transkrip berkaitan fotosintesis telah dilaporkan dalam beberapa model interaksi tumbuhan-patogen, termasuk bakteria patogen dan kulat.Tergesa-gesa (daripada 2 HPI dalam beberapa interaksi) dan penindasan global gen yang dikaitkan dengan fotosintesis sebagai tindak balas kepada jangkitan boleh mencetuskan imuniti tumbuhan berdasarkan penyebaran spesies oksigen reaktif dan interaksi mereka dengan laluan asid salisilik untuk menengahi tindak balas alahan 90,94.
Kesimpulannya, mekanisme tindak balas pertahanan yang dicadangkan untuk keturunan paling tahan (83A: 476) termasuk pengecaman patogen pantas oleh gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dan asid salisilik dan isyarat etilena yang dimediasi tindak balas alahan, diikuti dengan penubuhan SAR jarak jauh.tindakan disokong oleh protein DIR-1.Perlu diingat bahawa tempoh biotropik untuk jangkitan C. lupini adalah sangat singkat (kira-kira 2 hari), diikuti oleh pertumbuhan nekrotik95.Peralihan antara peringkat ini mungkin dikaitkan dengan nekrosis dan ekspresi protein yang boleh diinduksi etilena yang bertindak sebagai pencetus tindak balas hipersensitiviti dalam tumbuhan perumah.Oleh itu, tetingkap masa untuk berjaya menangkap C. lupini pada peringkat biotropik adalah sangat sempit.Pengaturcaraan semula gen yang dikaitkan dengan redoks dan fotosintesis yang diperhatikan dalam 83A: 476 pada 6 hpi adalah konsisten dengan perkembangan hifa kulat dan menandakan perkembangan tindak balas perlindungan yang berjaya pada peringkat biotropik.Tindak balas transkriptik Mandelup dan populasi 22660 mungkin terlalu tertangguh untuk menangkap kulat sebelum beralih kepada pertumbuhan nekrotik, bagaimanapun, Mandelup mungkin lebih berkesan daripada populasi 22660 kerana peraturan protein PR-10 yang agak cepat menggalakkan rintangan mendatar.
ETI, didorong oleh gen R kanonik, nampaknya merupakan mekanisme biasa untuk ketahanan kacang terhadap antraknosa.Oleh itu, dalam model legum Medicago truncatula, rintangan terhadap antraknosa diberikan oleh gen RCT1, ahli kelas gen tumbuhan R TIR-NBS-LRR97.Gen ini juga memberikan rintangan antraknosa spektrum luas dalam alfalfa apabila dipindahkan ke tumbuhan yang mudah terdedah.Dalam kacang biasa (P. vulgaris), lebih daripada dua dozen gen rintangan antraknosa telah dikenal pasti setakat ini.Sesetengah gen ini ditemui di kawasan yang tidak mempunyai sebarang gen R kanonik, namun banyak lagi yang terletak di tepi kromosom yang membawa gugusan gen NBS-LRR, termasuk TIR-NBS-LRRs99.Kajian SSR seluruh genom juga mengesahkan persatuan gen NBS-LRR dengan rintangan antraknosa dalam kacang biasa.Gen R kanonik juga ditemui di rantau genomik yang membawa lokus rintangan antraknosa utama dalam lupin putih 101.
Kerja kami menunjukkan bahawa tindak balas rintangan segera, diaktifkan pada peringkat awal jangkitan tumbuhan (sebaik-baiknya tidak lewat daripada 12 hpi), secara berkesan melindungi lupin berdaun sempit daripada antraknosa yang disebabkan oleh kulat patogen Collelotrichum lupini.Menggunakan penjujukan throughput tinggi, kami menunjukkan profil ekspresi pembezaan gen rintangan antraknosa dalam tumbuhan NLL yang dimediasi oleh gen rintangan Lanr1 dan AnMan.Pertahanan yang berjaya melibatkan reka bentuk gen dengan teliti untuk protein yang terlibat dalam redoks, fotosintesis, dan patogenesis dalam beberapa jam selepas sentuhan pertama tumbuhan dengan patogen.Tindak balas perlindungan yang serupa, tetapi tertangguh dalam masa, adalah kurang berkesan dalam melindungi tumbuhan daripada penyakit.Rintangan antraks yang dimediasi oleh gen Lanr1 menyerupai tindak balas pantas biasa gen R (imuniti yang dicetuskan oleh kesan), manakala gen AnMan kemungkinan besar memberikan tindak balas mendatar (imuniti yang dicetuskan oleh corak molekul yang berkaitan dengan mikrob), memberikan tahap kemampanan yang sederhana.
215 garisan NLL yang digunakan untuk menyaring penanda antraknosa terdiri daripada 74 kultivar, 60 garisan yang diperoleh melalui persilangan atau pembiakan, 5 mutan, dan 76 germplasma liar atau asli.Talian itu datang dari 17 negara, terutamanya dari Poland (58), Sepanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Itali (5) dan barisan lain.dari 10 negara.Set ini juga termasuk garis tahan rujukan: 83A:476, Tanjil, Wonga yang membawa alel Lanr1, dan Mandelup yang membawa alel AnMan.Garisan itu diperoleh daripada Pangkalan Data Sumber Genetik Lupin Eropah yang diselenggarakan oleh Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poland (Jadual Tambahan S1).
Tumbuhan ditanam dalam keadaan terkawal (fototempoh 16 jam, suhu 25°C pada waktu siang dan 18°C ​​pada waktu malam).Dua replika biologi telah dianalisis.DNA telah diasingkan daripada daun berusia tiga minggu menggunakan Kit Mini Tumbuhan DNeasy (Qiagen, Hilden, Jerman) mengikut protokol.Kualiti dan kepekatan DNA terpencil dinilai dengan kaedah spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat).Penanda AnManM1 yang menandakan gen rintangan antraknosa AnMan (berasal daripada cv. Mandelup) dan penanda Anseq3 dan Anseq4 yang mengapit gen Lanr1 (berasal daripada cv. Tanjil) telah dianalisis 11,26,28.Homozigot untuk alel tahan telah dijaringkan sebagai "1", mudah terdedah - sebagai "0", dan heterozigot - sebagai 0.5.
Berdasarkan keputusan saringan untuk penanda AnManM1, AnSeq3 dan AnSeq4 dan ketersediaan benih untuk eksperimen susulan akhir, 50 garisan NLL telah dipilih untuk fenotaip rintangan antraknosa.Analisis dilakukan secara pendua dalam rumah hijau dikawal komputer dengan tempoh foto 14 jam dengan julat suhu 22°C pada waktu siang dan 19°C pada waktu malam.Biji benih dicakar (memotong kulit benih pada bahagian bertentangan embrio dengan bilah yang tajam) sebelum disemai untuk mengelakkan dorman benih akibat lapisan benih terlalu keras dan memastikan percambahan seragam.Tumbuhan ditanam dalam pasu (11 × 11 × 21 cm) dengan tanah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland).Inokulasi telah dijalankan dengan strain Colletotrichum lupini Col-08, ditanam pada tahun 1999 daripada batang tumbuhan lupin berdaun sempit yang ditanam di ladang di Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Dapatkan kawasan.Pengasingan telah dibiakkan dalam medium SNA pada 20° C. di bawah cahaya hitam selama 21 hari untuk mendorong sporulasi.Empat minggu selepas menyemai, apabila tumbuhan telah mencapai peringkat 4-6 daun, inokulasi dilakukan dengan menyembur dengan ampaian konidia pada kepekatan 0.5 x 106 konidia per ml.Selepas inokulasi, tumbuhan disimpan dalam gelap selama 24 jam pada kelembapan kira-kira 98% dan suhu 25°C untuk memudahkan percambahan konidia dan proses jangkitan.Tumbuhan itu kemudiannya ditanam di bawah fototempoh 14 jam pada 22°C siang/19°C malam dan 70% kelembapan.Skor penyakit dibuat 22 hari selepas inokulasi dan berkisar antara 0 (kebal) hingga 9 (sangat mudah terdedah) bergantung kepada kehadiran atau ketiadaan lesi nekrotik pada batang dan daun.Di samping itu, selepas pemarkahan, berat tumbuhan diukur.Hubungan antara genotip penanda dan fenotip penyakit dikira sebagai korelasi urutan dua titik (ketiadaan penanda heterozigot dalam set garisan untuk analisis fenotip rintangan antraknosa).