Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Terdapat keperluan untuk sistem in vitro yang boleh dipercayai yang boleh menghasilkan semula dengan tepat persekitaran fisiologi jantung untuk ujian dadah.Ketersediaan terhad sistem kultur tisu jantung manusia telah membawa kepada tafsiran yang tidak tepat mengenai kesan ubat jantung.Di sini, kami telah membangunkan model kultur tisu jantung (CTCM) yang secara elektromekanik merangsang hirisan jantung dan menjalani regangan fisiologi semasa fasa sistolik dan diastolik kitaran jantung.Selepas 12 hari budaya, pendekatan ini sebahagiannya meningkatkan daya maju bahagian jantung, tetapi tidak mengekalkan integriti strukturnya sepenuhnya.Oleh itu, selepas pemeriksaan molekul kecil, kami mendapati bahawa penambahan 100 nM triiodothyronine (T3) dan 1 μM dexamethasone (Dex) ke medium kami mengekalkan struktur mikro bahagian selama 12 hari.Dalam kombinasi dengan rawatan T3/Dex, sistem CTCM mengekalkan profil transkrip, daya maju, aktiviti metabolik dan integriti struktur pada tahap yang sama dengan tisu jantung segar selama 12 hari.Di samping itu, regangan tisu jantung yang berlebihan dalam budaya mendorong isyarat jantung hipertropik, memberikan bukti untuk keupayaan CTCM meniru keadaan hipertropik yang disebabkan oleh regangan jantung.Kesimpulannya, CTCM boleh memodelkan fisiologi dan patofisiologi jantung dalam budaya dalam jangka masa yang panjang, membolehkan pemeriksaan dadah yang boleh dipercayai.
Sebelum penyelidikan klinikal, sistem in vitro yang boleh dipercayai diperlukan yang boleh menghasilkan semula persekitaran fisiologi jantung manusia dengan tepat.Sistem sedemikian harus meniru regangan mekanikal, kadar denyutan jantung, dan sifat elektrofisiologi yang diubah.Model haiwan biasanya digunakan sebagai platform pemeriksaan untuk fisiologi jantung dengan kebolehpercayaan yang terhad dalam mencerminkan kesan ubat dalam jantung manusia1,2.Akhirnya, Model Eksperimen Kultur Tisu Jantung Ideal (CTCM) ialah model yang sangat sensitif dan khusus untuk pelbagai intervensi terapeutik dan farmakologi, menghasilkan semula fisiologi dan patofisiologi jantung manusia dengan tepat3.Ketiadaan sistem sedemikian mengehadkan penemuan rawatan baru untuk kegagalan jantung4,5 dan telah membawa kepada kardiotoksikan dadah sebagai sebab utama untuk keluar dari pasaran6.
Sepanjang dekad yang lalu, lapan ubat bukan kardiovaskular telah ditarik balik daripada penggunaan klinikal kerana ia menyebabkan pemanjangan selang QT yang membawa kepada aritmia ventrikel dan kematian mengejut7.Oleh itu, terdapat keperluan yang semakin meningkat untuk strategi pemeriksaan praklinikal yang boleh dipercayai untuk menilai keberkesanan dan ketoksikan kardiovaskular.Penggunaan baru-baru ini kardiomiosit yang berasal dari sel stem pluripotent manusia (hiPS-CM) dalam pemeriksaan dadah dan ujian ketoksikan menyediakan penyelesaian separa kepada masalah ini.Walau bagaimanapun, sifat hiPS-CM yang tidak matang dan kekurangan kerumitan multiselular tisu jantung adalah batasan utama kaedah ini.Kajian terkini menunjukkan bahawa had ini boleh diatasi sebahagiannya dengan menggunakan hiPS-CM awal untuk membentuk hidrogel tisu jantung sejurus selepas bermulanya kontraksi spontan dan secara beransur-ansur meningkatkan rangsangan elektrik dari semasa ke semasa.Walau bagaimanapun, mikrotisu hiPS-CM ini tidak mempunyai sifat elektrofisiologi dan kontraktil matang miokardium dewasa.Di samping itu, tisu jantung manusia mempunyai struktur yang lebih kompleks, yang terdiri daripada campuran heterogen pelbagai jenis sel, termasuk sel endothelial, neuron, dan fibroblas stromal, yang saling berkaitan oleh set khusus protein matriks ekstraselular.Heterogenitas populasi bukan kardiomiosit11,12,13 dalam jantung mamalia dewasa ini merupakan penghalang utama untuk memodelkan tisu jantung menggunakan jenis sel individu.Batasan utama ini menekankan kepentingan membangunkan kaedah untuk mengkultur tisu miokardium yang utuh di bawah keadaan fisiologi dan patologi.
Bahagian nipis (300 µm) jantung manusia yang dikultur telah terbukti sebagai model yang menjanjikan bagi miokardium manusia yang utuh.Kaedah ini menyediakan akses kepada sistem multiselular 3D lengkap yang serupa dengan tisu jantung manusia.Walau bagaimanapun, sehingga 2019, penggunaan bahagian jantung berbudaya dihadkan oleh kemandirian budaya yang singkat (24 jam).Ini disebabkan oleh beberapa faktor termasuk kekurangan regangan fizikal-mekanikal, antara muka cecair udara, dan penggunaan media ringkas yang tidak menyokong keperluan tisu jantung.Pada 2019, beberapa kumpulan penyelidikan menunjukkan bahawa menggabungkan faktor mekanikal ke dalam sistem kultur tisu jantung boleh memanjangkan hayat kultur, meningkatkan ekspresi jantung dan meniru patologi jantung.Dua kajian elegan 17 dan 18 menunjukkan bahawa beban mekanikal uniaksial mempunyai kesan positif ke atas fenotip jantung semasa kultur.Walau bagaimanapun, kajian ini tidak menggunakan bebanan fiziko-mekanikal tiga dimensi dinamik kitaran jantung, kerana bahagian jantung telah dimuatkan dengan sama ada daya tegangan isometrik 17 atau beban auxotonik linear 18 .Kaedah regangan tisu ini mengakibatkan penindasan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang dikaitkan dengan tindak balas regangan yang tidak normal.Terutama, Pitoulis et al.19 membangunkan mandian budaya hirisan jantung dinamik untuk pembinaan semula kitaran jantung menggunakan maklum balas transduser daya dan pemacu ketegangan.Walaupun sistem ini membenarkan pemodelan kitaran jantung in vitro yang lebih tepat, kerumitan dan daya pemprosesan rendah kaedah mengehadkan penggunaan sistem ini.Makmal kami baru-baru ini telah membangunkan sistem kultur dipermudahkan menggunakan rangsangan elektrik dan medium yang dioptimumkan untuk mengekalkan daya maju bahagian tisu jantung babi dan jantung manusia sehingga 6 hari20,21.
Dalam manuskrip semasa, kami menerangkan model kultur tisu jantung (CTCM) menggunakan bahagian jantung babi yang menggabungkan isyarat humoral untuk menyusun semula fisiologi jantung tiga dimensi dan distensi patofisiologi semasa kitaran jantung.CTCM ini boleh meningkatkan ketepatan ramalan ubat pra-klinikal ke tahap yang tidak pernah dicapai sebelum ini dengan menyediakan sistem jantung tahap sederhana kos efektif yang meniru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia untuk ujian ubat pra-klinikal.
Isyarat mekanikal hemodinamik memainkan peranan penting dalam mengekalkan fungsi kardiomiosit secara in vitro 22,23,24.Dalam manuskrip semasa, kami telah membangunkan CTCM (Rajah 1a) yang boleh meniru persekitaran jantung dewasa dengan mendorong rangsangan elektrik dan mekanikal pada frekuensi fisiologi (1.2 Hz, 72 denyutan seminit).Untuk mengelakkan regangan tisu yang berlebihan semasa diastole, peranti pencetakan 3D digunakan untuk meningkatkan saiz tisu sebanyak 25% (Rajah 1b).Rentak elektrik yang disebabkan oleh sistem C-PACE telah ditetapkan masa untuk bermula 100 ms sebelum sistol menggunakan sistem pemerolehan data untuk menghasilkan semula sepenuhnya kitaran jantung.Sistem kultur tisu menggunakan penggerak pneumatik boleh atur cara (LB Engineering, Jerman) untuk mengembangkan membran silikon fleksibel secara kitaran untuk menyebabkan pengembangan hirisan jantung di ruang atas.Sistem ini disambungkan ke saluran udara luaran melalui transduser tekanan, yang memungkinkan untuk melaraskan tekanan (± 1 mmHg) dan masa (± 1 ms) dengan tepat (Rajah 1c).
a Pasang bahagian tisu pada gelang sokongan 7 mm, ditunjukkan dalam warna biru, di dalam ruang kultur peranti.Ruang budaya dipisahkan dari ruang udara oleh membran silikon fleksibel nipis.Letakkan gasket di antara setiap ruang untuk mengelakkan kebocoran.Tudung peranti mengandungi elektrod grafit yang memberikan rangsangan elektrik.b Perwakilan skematik peranti tisu besar, cincin panduan dan cincin sokongan.Bahagian tisu (coklat) diletakkan pada peranti bersaiz besar dengan cincin panduan diletakkan di dalam alur di pinggir luar peranti.Menggunakan panduan, letakkan cincin sokongan yang disalut dengan pelekat akrilik tisu dengan berhati-hati pada bahagian tisu jantung.c Graf menunjukkan masa rangsangan elektrik sebagai fungsi tekanan ruang udara dikawal oleh penggerak pneumatik boleh atur cara (PPD).Peranti pemerolehan data telah digunakan untuk menyegerakkan rangsangan elektrik menggunakan penderia tekanan.Apabila tekanan dalam ruang kultur mencapai ambang yang ditetapkan, isyarat nadi dihantar ke C-PACE-EM untuk mencetuskan rangsangan elektrik.d Imej empat CTCM diletakkan di atas rak inkubator.Empat peranti disambungkan kepada satu PPD melalui litar pneumatik, dan penderia tekanan dimasukkan ke dalam injap hemostatik untuk memantau tekanan dalam litar pneumatik.Setiap peranti mengandungi enam bahagian tisu.
Menggunakan penggerak pneumatik tunggal, kami dapat mengawal 4 peranti CTCM, setiap satunya boleh memuatkan 6 bahagian tisu (Rajah 1d).Dalam CTCM, tekanan udara dalam ruang udara ditukar kepada tekanan segerak dalam ruang bendalir dan mendorong pengembangan fisiologi kepingan jantung (Rajah 2a dan Filem Tambahan 1).Penilaian regangan tisu pada 80 mm Hg.Seni.menunjukkan regangan bahagian tisu sebanyak 25% (Rajah 2b).Regangan peratusan ini telah ditunjukkan sepadan dengan panjang sarkomer fisiologi 2.2-2.3 µm untuk kontraktiliti bahagian jantung normal17,19,25.Pergerakan tisu dinilai menggunakan tetapan kamera tersuai (Tambahan Rajah 1).Amplitud dan halaju pergerakan tisu (Rajah 2c, d) sepadan dengan regangan semasa kitaran jantung dan masa semasa sistol dan diastole (Rajah 2b).Regangan dan halaju tisu jantung semasa penguncupan dan kelonggaran kekal malar selama 12 hari dalam kultur (Rajah 2f).Untuk menilai kesan rangsangan elektrik pada kontraktiliti semasa kultur, kami membangunkan kaedah untuk menentukan kecacatan aktif menggunakan algoritma teduhan (Tambahan Rajah 2a, b) dan dapat membezakan antara kecacatan dengan dan tanpa rangsangan elektrik.Bahagian jantung yang sama (Rajah 2f).Di kawasan alih pemotongan (R6-9), voltan semasa rangsangan elektrik adalah 20% lebih tinggi daripada ketiadaan rangsangan elektrik, yang menunjukkan sumbangan rangsangan elektrik kepada fungsi kontraktil.
Kesan yang mewakili tekanan ruang udara, tekanan ruang bendalir, dan ukuran pergerakan tisu mengesahkan bahawa tekanan ruang mengubah tekanan ruang bendalir, menyebabkan pergerakan hirisan tisu yang sepadan.b Kesan mewakili peratus regangan (biru) bahagian tisu sepadan dengan peratus regangan (oren).c Gerakan yang diukur bagi hirisan jantung adalah konsisten dengan kelajuan gerakan yang diukur.(d) Trajektori perwakilan gerakan kitaran (garis biru) dan halaju (garis putus-putus oren) dalam sekeping jantung.e Kuantifikasi masa kitaran (n = 19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa pengecutan (n = 19 keping setiap kumpulan), masa kelonggaran (n = 19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), pergerakan tisu (n = 25 ).hirisan)/kumpulan daripada babi yang berbeza), halaju sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza) dan kadar kelonggaran puncak (n=24(D0), 25(D12) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza).Ujian-t Pelajar dua ekor menunjukkan tiada perbezaan yang signifikan dalam mana-mana parameter.f Analisis terikan perwakilan kesan bahagian tisu dengan (merah) dan tanpa rangsangan elektrik (biru), sepuluh kawasan serantau bahagian tisu dari bahagian yang sama.Panel bawah menunjukkan kuantifikasi perbezaan peratusan dalam ketegangan dalam bahagian tisu dengan dan tanpa rangsangan elektrik di sepuluh kawasan dari bahagian yang berbeza. (n = 8 keping/kumpulan daripada khinzir berbeza, Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 keping/kumpulan daripada khinzir berbeza, Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian-t Pelajar dua ekor; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, daripada разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bahagian/kumpulan, daripada khinzir yang berbeza, ujian-t Pelajar dua ekor; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Dalam sistem kultur hirisan jantung biomimetik statik kami sebelum ini [20, 21], kami mengekalkan daya maju, fungsi, dan integriti struktur hirisan jantung selama 6 hari dengan menggunakan rangsangan elektrik dan mengoptimumkan komposisi sederhana.Walau bagaimanapun, selepas 10 hari, angka ini menurun dengan ketara.Kami akan merujuk kepada bahagian yang dikultur dalam sistem kultur biomimetik statik kami sebelum ini 20, 21 keadaan kawalan (Ctrl) dan kami akan menggunakan medium kami yang dioptimumkan sebelum ini sebagai keadaan dan budaya MC di bawah rangsangan mekanikal dan elektrik serentak (CTCM).dipanggil .Pertama, kami menentukan bahawa rangsangan mekanikal tanpa rangsangan elektrik tidak mencukupi untuk mengekalkan daya maju tisu selama 6 hari (Tambahan Rajah 3a, b).Menariknya, dengan pengenalan rangsangan fisio-mekanikal dan elektrik menggunakan STCM, daya maju bahagian jantung 12 hari kekal sama seperti bahagian jantung segar di bawah keadaan MS, tetapi tidak di bawah keadaan Ctrl, seperti yang ditunjukkan oleh analisis MTT (Rajah 1).3a).Ini menunjukkan bahawa rangsangan mekanikal dan simulasi kitaran jantung boleh memastikan bahagian tisu berdaya maju dua kali lebih lama seperti yang dilaporkan dalam sistem kultur statik kami sebelum ini.Walau bagaimanapun, penilaian integriti struktur bahagian tisu dengan immunolabeling troponin jantung T dan connexin 43 menunjukkan bahawa ekspresi connexin 43 adalah lebih tinggi dalam tisu MC pada hari ke-12 berbanding kawalan pada hari yang sama.Walau bagaimanapun, ekspresi connexin 43 seragam dan pembentukan cakera Z tidak dikekalkan sepenuhnya (Rajah 3b).Kami menggunakan rangka kerja kecerdasan buatan (AI) untuk mengukur integriti struktur tisu26, saluran paip pembelajaran mendalam berasaskan imej berdasarkan pewarnaan troponin-T dan connexin43 untuk mengukur integriti struktur dan pendarfluor hirisan jantung secara automatik dari segi kekuatan penyetempatan.Kaedah ini menggunakan Rangkaian Neural Convolutional (CNN) dan rangka kerja pembelajaran mendalam untuk mengukur integriti struktur tisu jantung dengan pasti dengan cara yang automatik dan tidak berat sebelah, seperti yang diterangkan dalam rujukan.26. Tisu MC menunjukkan persamaan struktur yang lebih baik pada hari 0 berbanding bahagian kawalan statik.Di samping itu, pewarnaan trichrome Masson mendedahkan peratusan fibrosis yang jauh lebih rendah di bawah keadaan MS berbanding dengan keadaan kawalan pada hari ke-12 kultur (Rajah 3c).Walaupun CTCM meningkatkan daya maju bahagian tisu jantung pada hari ke-12 ke tahap yang serupa dengan tisu jantung segar, ia tidak meningkatkan integriti struktur bahagian jantung dengan ketara.
graf Bar menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT bagi hirisan jantung segar (D0) atau kultur hirisan jantung selama 12 hari sama ada dalam kultur statik (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan dilakukan; D12 MC) berbanding dengan ujian AN##0 yang berbeza, dan <1 cara untuk babi AN##0; **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). graf Bar menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT bagi hirisan jantung segar (D0) atau kultur hirisan jantung selama 12 hari sama ada dalam kultur statik (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan dilakukan sehala (D12 MC); ujian/kumpulan OVA daripada ##0, <0##0, ANOVA yang berbeza daripada babi yang berbeza. dan **p <0.01 berbanding D12 Ctrl).histogram menunjukkan kuantifikasi daya maju bahagian jantung segar MTT (D0) atau budaya bahagian jantung selama 12 hari dalam sama ada budaya statik (kawalan D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kawalan D12). ) ), 12 (D12 MC) bahagian/kumpulan dilakukan satu hala AN babi, aOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切幇片(D12 MC)幇12.相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 猇(D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 猇(D12)片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT dalam bahagian jantung segar (D0) atau bahagian jantung yang dikultur selama 12 hari dalam kultur statik (kawalan D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kawalan D12)), 12 (D12 MC) bahagian/kumpulan daripada ujian ANOVA sehala;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 berbanding D0, **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl).b Troponin-T (hijau), connexin 43 (merah) dan DAPI (biru) dalam bahagian jantung yang baru diasingkan (D0) atau bahagian jantung yang dikultur di bawah keadaan statik (Ctrl) atau keadaan CTCM (MC) selama 12 hari) imej imunofluoresensi wakil (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тппни искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl рут), MC5 (D12) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 dan ****p < 0,0001 по сравнению Ctrlс D12). Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung oleh kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding dengan D0 dan ****p < 0.0001 berbanding D0.0001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala;##p01 盎0##p < 玸0##p01 盎0##p < 0.****p 001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala;##00 生0.0.000 < 0.0. 001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) MC (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 lwn. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Kecerdasan buatan untuk mengukur integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bahagian/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala; ####p<0.0001 lwn.D0 Sebagai perbandingan ****p < 0.0001 Ctrl berbanding D). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding dengan D0 dan ***p1 < 0.000). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Skala terdedah = 500 µm) (n = 10 hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan ***ptr < 0.001 berbanding D0 dan ***p < 0.0). c Репрезентативные изображения (слева) dan количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красМласбста ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 D поюсравн < 0,0001 D поюсравн нию с D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) bahagian jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (skala tidak bersalut = 500 µm) (n = 10 bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; #### p < 0 .0001 berbanding dengan D0 dan ***p < 0.001 berbanding dengan D1.001 p < 0.021). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度= 5片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 Ctrl 缛D1. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 庰 裸尺度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测诏 单向 Anova <测##01；0##**0；0.##** p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) dan количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным красител50старк мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсио;## 0 сионсио;#0нлио нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantiti (kanan) bahagian jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bahagian/kumpulan, setiap satu daripada babi yang berbeza, diuji dengan analisis varians sehala ;### # p < 0.0001 berbanding D0, ***ptr < 0.1).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Kami membuat hipotesis bahawa dengan menambahkan molekul kecil ke medium kultur, integriti kardiomiosit boleh dipertingkatkan dan perkembangan fibrosis dikurangkan semasa kultur CTCM.Oleh itu, kami menyaring untuk molekul kecil menggunakan budaya kawalan statik kami20,21 disebabkan oleh bilangan faktor yang mengelirukan yang kecil.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), dan SB431542 (SB) telah dipilih untuk skrin ini.Molekul kecil ini sebelum ini telah digunakan dalam kultur hiPSC-CM untuk mendorong pematangan kardiomiosit dengan meningkatkan panjang sarkomer, T-tubul, dan halaju konduksi.Di samping itu, kedua-dua Dex (glukokortikoid) dan SB diketahui dapat menyekat keradangan29,30.Oleh itu, kami menguji sama ada kemasukan satu atau gabungan molekul kecil ini akan meningkatkan integriti struktur bahagian jantung.Untuk pemeriksaan awal, dos setiap sebatian dipilih berdasarkan kepekatan yang biasa digunakan dalam model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, dan 2.5 μM SB31).Selepas 12 hari kultur, gabungan T3 dan Dex menghasilkan integriti struktur kardiomiosit yang optimum dan pembentukan semula gentian yang minimum (Rajah Tambahan 4 dan 5).Di samping itu, penggunaan dua kali ganda atau dua kali ganda kepekatan T3 dan Dex ini menghasilkan kesan yang memudaratkan berbanding kepekatan biasa (Tambahan Rajah 6a, b).
Selepas saringan awal, kami melakukan perbandingan kepala ke kepala bagi 4 keadaan kultur (Rajah 4a): Ctrl: bahagian jantung yang dikultur dalam budaya statik yang diterangkan sebelum ini menggunakan medium kami yang dioptimumkan;20.21 TD: T3 dan Ctrl s Added Dex pada hari Rabu;MC: bahagian jantung yang dikultur dalam CTCM menggunakan medium kami yang dioptimumkan sebelum ini;dan MT: CTCM dengan T3 dan Dex ditambah pada medium.Selepas 12 hari penanaman, daya maju tisu MS dan MT kekal sama seperti dalam tisu segar yang dinilai oleh ujian MTT (Rajah 4b).Menariknya, penambahan T3 dan Dex kepada kultur transwell (TD) tidak menghasilkan peningkatan yang ketara dalam daya maju berbanding keadaan Ctrl, menunjukkan peranan penting rangsangan mekanikal dalam mengekalkan daya maju bahagian jantung.
gambarajah reka bentuk eksperimen yang menggambarkan empat keadaan kultur yang digunakan untuk menilai kesan rangsangan mekanikal dan suplemen T3/Dex pada medium selama 12 hari. b Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju 12 hari selepas budaya dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC, MC dan MT) berbanding hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan <12 MC, ###0, ###0, ujian/kumpulan sehala OVA,##0, ###0, AN##0, ###, dijalankan dari babi yang berbeza p < 0.001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). b Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju 12 hari selepas budaya dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC, MC dan MT) berbanding hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan <12 MC, ###0, ###0, ujian/kumpulan sehala OVA,##0, ###0, AN##0, ###, dijalankan dari babi yang berbeza p < 0.001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселохникрот 4 роль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) товин й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 dan **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju pada 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC, dan MT) berbanding bahagian jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC, MC, dan MT) bahagian/kumpulan sehala (D12 MC), ##0 OVA, ##0, ##0, ##0 babi yang berbeza; p < 0.001 lwn D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5)、 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与比称 与 D0 ， D0 与 与 D0. ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (сердими сердими (сердирования (контроль, TD, MC и MT)) по сравнению со свежими (сердими сердими (сердими серди) (сердими сердими (сердими) (сердими сердими) (сердими сердими (сердин) = 10 DIRI 12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), dari разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ####p <0,001 спон внению с контролем D12). b Histogram menunjukkan kesemua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC dan MT) berbanding bahagian/kumpulan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), daripada bahagian/kumpulan babi 12 (D12 MC) yang berbeza, ujian ANOVA sehala; ####p<0.0.0, ####p<0.0. 1 lwn. kawalan D12). c Graf bar menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 6 keping/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ###p < 0.001, berbanding D0 dan ***p < 0.021 berbanding D1 Ctrl). c Graf bar menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 6 keping/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ###p < 0.001, berbanding D0 dan ***p < 0.021 berbanding D1 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всеховльлухникротирования ь, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностостолннин 1, одностотялнин 0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur di bawah kesemua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC dan MT) berbanding bahagian jantung segar (D0) (n = 6 bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan ; ###p < 0.001 berbanding D0 dan ***p < 0.001 Ctrl berbanding D1). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 的吹埅通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p1 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执曌行向0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования дло4 вселькования нтроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, тероднинстростро; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa pada 12 hari selepas kultur untuk kesemua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC, dan MT) berbanding bahagian jantung segar (D0) (n = 6 bahagian/kumpulan, daripada babi yang berbeza, unilateral Adakah ujian ANOVA telah dilakukan, ###p <0.001 berbanding D0, ***p <0.001 berbanding D0, ***p <0.001).d Plot analisis terikan tisu segar (biru), hari 12 MC (hijau), dan hari 12 MT (merah) pada sepuluh titik bahagian tisu serantau (n = 4 keping/kumpulan, ujian ANOVA sehala; tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kumpulan).e Plot gunung berapi menunjukkan gen yang dinyatakan secara berbeza dalam bahagian jantung segar (D0) berbanding bahagian jantung yang dikultur dalam keadaan statik (Ctrl) atau di bawah keadaan MT (MT) selama 10-12 hari.f Peta haba gen sarkomer untuk bahagian jantung yang dibiakkan di bawah setiap keadaan kultur.Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Kebergantungan metabolik pada peralihan daripada pengoksidaan asid lemak kepada glikolisis adalah ciri dediferensiasi kardiomiosit.Kardiomiosit yang tidak matang terutamanya menggunakan glukosa untuk pengeluaran ATP dan mempunyai mitokondria hipoplastik dengan sedikit cristae5,32.Analisis penggunaan glukosa menunjukkan bahawa dalam keadaan MC dan MT, penggunaan glukosa adalah serupa dengan tisu hari 0 (Rajah 4c).Walau bagaimanapun, sampel Ctrl menunjukkan peningkatan ketara dalam penggunaan glukosa berbanding dengan tisu segar.Ini menunjukkan bahawa gabungan CTCM dan T3/Dex meningkatkan daya maju tisu dan mengekalkan fenotip metabolik bahagian jantung berbudaya 12 hari.Di samping itu, analisis terikan menunjukkan bahawa tahap terikan kekal sama seperti dalam tisu jantung segar selama 12 hari di bawah keadaan MT dan MS (Rajah 4d).
Untuk menganalisis kesan keseluruhan CTCM dan T3 / Dex pada landskap transkrip global tisu hirisan jantung, kami melakukan RNAseq pada hirisan jantung daripada keempat-empat keadaan budaya yang berbeza (Data Tambahan 1).Menariknya, bahagian MT menunjukkan persamaan transkrip yang tinggi dengan tisu jantung segar, dengan hanya 16 dinyatakan secara berbeza daripada 13, 642 gen.Walau bagaimanapun, seperti yang kami tunjukkan sebelum ini, kepingan Ctrl memaparkan 1229 gen yang dinyatakan secara berbeza selepas 10-12 hari dalam kultur (Rajah 4e).Data ini telah disahkan oleh qRT-PCR gen jantung dan fibroblast (Tambahan Rajah 7a-c).Menariknya, bahagian Ctrl menunjukkan penurunan regulasi gen kitaran jantung dan sel dan pengaktifan program gen keradangan.Data ini mencadangkan bahawa penyahbezaan, yang biasanya berlaku selepas pengkulturan jangka panjang, dilemahkan sepenuhnya di bawah keadaan MT (Tambahan Rajah 8a, b).Kajian teliti gen sarkomer menunjukkan bahawa hanya di bawah keadaan MT sahaja gen yang mengekod sarkomer (Rajah 4f) dan saluran ion (Tambahan Rajah 9) dipelihara, melindunginya daripada penindasan di bawah keadaan Ctrl, TD, dan MC.Data ini menunjukkan bahawa dengan gabungan rangsangan mekanikal dan humoral (T3/Dex), transkriptom hirisan jantung boleh kekal serupa dengan hirisan jantung segar selepas 12 hari dalam kultur.
Penemuan transkrip ini disokong oleh fakta bahawa integriti struktur kardiomiosit dalam bahagian jantung paling baik dipelihara di bawah keadaan MT selama 12 hari, seperti yang ditunjukkan oleh connexin 43 yang utuh dan setempat (Rajah 5a).Di samping itu, fibrosis dalam bahagian jantung di bawah keadaan MT telah berkurangan dengan ketara berbanding Ctrl dan serupa dengan bahagian jantung segar (Rajah 5b).Data ini menunjukkan bahawa gabungan rangsangan mekanikal dan rawatan T3/Dex berkesan memelihara struktur jantung di bahagian jantung dalam budaya.
Imej imunofluoresensi perwakilan troponin-T (hijau), connexin 43 (merah), dan DAPI (biru) dalam bahagian jantung yang baru diasingkan (D0) atau dikultur selama 12 hari dalam semua empat keadaan kultur bahagian jantung (bar skala = 100 µm).). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.00tr < 0.05, atau D0 dan *p < 0.005, atau D0. Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) hirisan/kumpulan daripada khinzir yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.00tr <0.05, atau D0 dan *p < 0.00tr <1. Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 MCTD), D12 MCTD (D0 2 D15) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 2 Ctrl). Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung menggunakan kecerdasan buatan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p <0.00 tr < 0.05 atau ****p < 0.05.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人和廇女片/廇囌猉智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缛毀。 D12 Ctr.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 癄和 d1量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p 0.Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung menggunakan kecerdasan buatan dalam babi yang berbeza (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bahagian/kumpulan) dengan ujian ANOVA sehala;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.05 atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) hirisan/kumpulan daripada khinzir yang berbeza, ujian ANOVA sehala <0##0 <0; ***0 dijalankan dengan ##0##0; ***0. 1, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) hirisan/kumpulan daripada khinzir yang berbeza, ujian ANOVA sehala <0##0 <0; ***0 dijalankan dengan ##0##0; ***0. 1, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения dan количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона) (массона) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест01 ,##0 расский тест ANOVA 0,##0; ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi bahagian jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) bahagian/kumpulan daripada khinzir yang berbeza, dilakukan <10p.****0 dan ##00 ANOVA sehala; ##0. p < 0.0001 lwn D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 2、D1D D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##****##p < 0.0001 与，p**0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 B 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 量化 (比例 尺 尺 尺 尺 = 500 μm) (n = 10 (d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc)切片/组, 进行 单 因素 方 差 分析 ； #### p <0.0001 与 d0 相比, *** p <0.001, 或 **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比)。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (масштабная = лим50) 2 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравне, ию 0 ли <1p 0,000 *** ли сравне, ию **** по сравнению с D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi bahagian jantung yang diwarnai dengan trichrome Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) bahagian daripada babi/kumpulan yang berbeza, satu kaedah ANOVA; ##0****p <0.0. .0001 berbanding D12 Ctrl).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Akhirnya, keupayaan CTCM untuk meniru hipertrofi jantung dinilai dengan meningkatkan regangan tisu jantung.Dalam CTCM, tekanan ruang udara puncak meningkat daripada 80 mmHg kepada 80 mmHg.Seni.(regangan normal) sehingga 140 mmHg Art.(Gamb. 6a).Ini sepadan dengan peningkatan 32% dalam regangan (Rajah 6b), yang sebelum ini ditunjukkan sebagai peratusan regangan sepadan yang diperlukan untuk bahagian jantung mencapai panjang sarkomer yang serupa dengan yang dilihat dalam hipertrofi.Regangan dan halaju tisu jantung semasa penguncupan dan kelonggaran kekal malar selama enam hari kultur (Rajah 6c).Tisu jantung daripada keadaan MT telah mengalami regangan normal (MT (Normal)) atau keadaan regangan berlebihan (MT (OS)) selama enam hari.Sudah selepas empat hari dalam kultur, biomarker hipertropik NT-ProBNP telah meningkat dengan ketara dalam medium di bawah keadaan MT (OS) berbanding keadaan MT (normal) (Rajah 7a).Di samping itu, selepas enam hari pengkulturan, saiz sel dalam MT (OS) (Rajah 7b) meningkat dengan ketara berbanding bahagian jantung MT (normal).Di samping itu, translokasi nuklear NFATC4 telah meningkat dengan ketara dalam tisu yang terlalu regangan (Rajah 7c).Keputusan ini menunjukkan perkembangan progresif pembentukan semula patologi selepas hiperdistensi dan menyokong konsep bahawa peranti CTCM boleh digunakan sebagai platform untuk mengkaji isyarat hipertrofi jantung akibat regangan.
Kesan yang mewakili tekanan ruang udara, tekanan ruang bendalir, dan ukuran pergerakan tisu mengesahkan bahawa tekanan ruang mengubah tekanan ruang bendalir, menyebabkan pergerakan hirisan tisu yang sepadan.b Mewakili peratusan regangan dan lengkung kadar regangan untuk bahagian tisu yang biasa diregangkan (oren) dan berlebihan (biru).c Graf bar menunjukkan masa kitaran (n = 19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa pengecutan (n = 18-19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa kelonggaran (n = 19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza) ), amplitud pergerakan tisu (n = 14 keping/kumpulan, daripada babi yang berbeza), ketulan kemuncak (n = 19 keping setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza) ), amplitud pergerakan tisu (n = 14 keping/kumpulan, daripada babi yang berbeza), ketulan kemuncak (n = 1 kumpulan babi) n = 14 (D0), 15 (D6) ) bahagian/kumpulan) daripada khinzir yang berbeza), ujian-t Pelajar dua ekor menunjukkan tiada perbezaan yang ketara dalam mana-mana parameter, menunjukkan bahawa parameter ini kekal malar selama 6 hari kultur dengan voltan lampau.Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
graf Bar kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam media kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan biasa (Norm) MT atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ANOVA dua hala dilakukan; **p <0.01 graf Bar kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam media kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan biasa (Norm) MT atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ANOVA dua hala dilakukan; **p < 0.01.Histogram kuantitatif kepekatan NT-ProBNP dalam medium kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan MT biasa (norma) atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4).MTOS) hirisan /kumpulan daripada babi yang berbeza, analisis dua faktor varians dilakukan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 berbanding regangan biasa). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的培养基中NT-ProBNP 浓度的浓度的2 Norm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正伛**与正伯不与正丯，0与正伯与与正丯。 a Kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan normal (Norm) atau overstretch (OS) MT (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) daripada 猪的切片/组，可以幌双 yang berbeza dengan regangan normal; , p < 0.01).histogram Kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam hirisan jantung yang dikultur dalam keadaan regangan MT biasa (norma) atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dan D4 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, analisis varians dua hala;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 berbanding regangan biasa). b Imej perwakilan untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 hirisan berbeza daripada babi berbeza, Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; ****p < 0.0001 berbanding regangan biasa). b Imej perwakilan untuk hirisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 hirisan berbeza daripada babi berbeza, Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; ****p < 0.0001 berbanding regangan biasa). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) dan количественного опленикрадца (слева) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой хвостовой срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** ; сравнению с нормальным растяжением). b Imej perwakilan bahagian jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 bahagian berbeza daripada babi yang berbeza, ujian-t Pelajar dua ekor telah dilakukan; ****p <0.0001 berbanding ketegangan biasa). b.自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉正0；与曉正0. ）. b Imej perwakilan hirisan jantung yang diwarnai dengan calcarein-T dan WGA (kiri) dan saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 daripada 10 hirisan berbeza (D6 MTNorm)) Sel/组，两方法有尾学生pred ujian；0 ，0 compatred normal；0). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) dan количественная оцленная оцленка (слева) dan количественная оцленка разменка 30 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента , ****0p Стьюдента ****0; льным растяжением). b Imej perwakilan bahagian jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) daripada 10 bahagian berbeza daripada babi yang berbeza) Sel/kumpulan, kriteria dua ekor t Pelajar;****p <0.0001 berbanding terikan biasa). c Imej perwakilan untuk hari 0 dan hari 6 hirisan jantung MTOS yang diimunolabelkan untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 kepada nukleus CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; *p < 0.05). c Imej perwakilan untuk hari 0 dan hari 6 hirisan jantung MTOS yang diimunolabelkan untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 kepada nukleus CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza , Ujian t Pelajar dua ekor dilakukan; *p <0.0. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 dan 6 hari MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т dan NFATC4, dan NFATC4, dan NFATC4, dan NFATC4, dan NFATC4, dan NFATC4, dan NFATC4. FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустонюнид * несторонний двустонюд . c Imej perwakilan untuk bahagian jantung pada 0 dan 6 hari MTOS, immunolabeled untuk troponin-T dan NFATC4, dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus sel gua (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza) melakukan ujian t Pelajar dua ekor;*p < 0.05). c.易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 。 c Imej perwakilan imunolabeling calcanin-T dan NFATC4 第0天和第6天MTOS hirisan jantung, dan NFATC4 daripada nukleus sel NFATC4 易位至CM yang berbeza 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 制 缗 制 制 制 制 制生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS dalam 0 dan 6 hari untuk иммуномаркировки трононином-Т и NFATC4 dan NFATC4 стольсяцнч FATC4 в ядра CM daripada разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imej perwakilan hirisan jantung MTOS pada hari 0 dan 6 untuk immunolabeling troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus CM daripada babi yang berbeza (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan, dua ekor t -kriteria Pelajar; *p <0.05).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Penyelidikan kardiovaskular translasi memerlukan model selular yang menghasilkan semula persekitaran jantung dengan tepat.Dalam kajian ini, peranti CTCM telah dibangunkan dan dicirikan yang boleh merangsang bahagian ultrathin jantung.Sistem CTCM termasuk rangsangan elektromekanikal yang disegerakkan secara fisiologi dan pengayaan cecair T3 dan Dex.Apabila bahagian jantung babi terdedah kepada faktor-faktor ini, daya maju, integriti struktur, aktiviti metabolik, dan ekspresi transkripnya kekal sama seperti dalam tisu jantung segar selepas 12 hari kultur.Di samping itu, regangan tisu jantung yang berlebihan boleh menyebabkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi.Secara keseluruhan, keputusan ini menyokong peranan kritikal keadaan budaya fisiologi dalam mengekalkan fenotip jantung normal dan menyediakan platform untuk pemeriksaan dadah.
Banyak faktor menyumbang kepada mewujudkan persekitaran yang optimum untuk fungsi dan kemandirian kardiomiosit.Faktor yang paling jelas adalah berkaitan dengan (1) interaksi antara sel, (2) rangsangan elektromekanikal, (3) faktor humoral, dan (4) substrat metabolik.Interaksi sel-ke-sel fisiologi memerlukan rangkaian tiga dimensi kompleks pelbagai jenis sel yang disokong oleh matriks ekstraselular.Interaksi selular yang kompleks sedemikian sukar untuk dibina semula secara in vitro dengan kultur bersama jenis sel individu, tetapi boleh dicapai dengan mudah menggunakan sifat organotip bahagian jantung.
Regangan mekanikal dan rangsangan elektrik kardiomiosit adalah penting untuk mengekalkan fenotip jantung33,34,35.Walaupun rangsangan mekanikal telah digunakan secara meluas untuk penyaman dan pematangan hiPSC-CM, beberapa kajian elegan baru-baru ini telah mencuba rangsangan mekanikal bagi hirisan jantung dalam kultur menggunakan pemuatan uniaxial.Kajian ini menunjukkan bahawa beban mekanikal uniaksial 2D mempunyai kesan positif ke atas fenotip jantung semasa kultur.Dalam kajian ini, bahagian jantung sama ada dimuatkan dengan daya tegangan isometrik17, pembebanan auksotonik linear18, atau kitaran jantung dicipta semula menggunakan maklum balas transduser daya dan pemacu ketegangan.Walau bagaimanapun, kaedah ini menggunakan regangan tisu uniaksial tanpa pengoptimuman alam sekitar, mengakibatkan penindasan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang dikaitkan dengan tindak balas regangan yang tidak normal.CTCM yang diterangkan di sini menyediakan rangsangan elektromekanikal 3D yang meniru kitaran jantung semula jadi dari segi masa kitaran dan regangan fisiologi (25% regangan, 40% sistol, 60% diastole dan 72 denyutan seminit).Walaupun rangsangan mekanikal tiga dimensi ini sahaja tidak mencukupi untuk mengekalkan integriti tisu, gabungan rangsangan humoral dan mekanikal menggunakan T3/Dex diperlukan untuk mengekalkan daya maju, fungsi dan integriti tisu dengan secukupnya.
Faktor humor memainkan peranan penting dalam memodulasi fenotip jantung dewasa.Ini diserlahkan dalam kajian HiPS-CM di mana T3 dan Dex telah ditambahkan pada media kultur untuk mempercepatkan pematangan sel.T3 boleh mempengaruhi pengangkutan asid amino, gula dan kalsium merentasi membran sel36.Di samping itu, T3 menggalakkan ekspresi MHC-α dan MHC-β downregulation, menggalakkan pembentukan myofibril berkedut cepat dalam kardiomiosit matang berbanding myofibril berkedut perlahan dalam CM janin.Kekurangan T3 dalam pesakit hipotiroid mengakibatkan kehilangan jalur myofibrillar dan pengurangan kadar perkembangan nada37.Dex bertindak pada reseptor glukokortikoid dan telah ditunjukkan untuk meningkatkan pengecutan miokardium dalam jantung perfusi terpencil;38 peningkatan ini difikirkan berkaitan dengan kesan ke atas kemasukan dipacu deposit kalsium (SOCE) 39,40.Di samping itu, Dex mengikat kepada reseptornya, menyebabkan tindak balas intrasel yang luas yang menyekat fungsi imun dan keradangan30.
Keputusan kami menunjukkan bahawa rangsangan mekanikal fizikal (MS) meningkatkan prestasi budaya keseluruhan berbanding Ctrl, tetapi gagal mengekalkan daya maju, integriti struktur dan ekspresi jantung selama 12 hari dalam budaya.Berbanding dengan Ctrl, penambahan T3 dan Dex kepada budaya CTCM (MT) meningkatkan daya maju dan mengekalkan profil transkripsi yang serupa, integriti struktur dan aktiviti metabolik dengan tisu jantung segar selama 12 hari.Di samping itu, dengan mengawal tahap regangan tisu, model hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi telah dicipta menggunakan STCM, menggambarkan kepelbagaian sistem STCM.Perlu diingat bahawa walaupun pengubahsuaian jantung dan fibrosis biasanya melibatkan organ yang utuh yang sel-sel beredarnya dapat memberikan sitokin yang sesuai serta fagositosis dan faktor pembentukan semula yang lain, bahagian jantung masih boleh meniru proses fibrotik sebagai tindak balas kepada tekanan dan trauma.ke dalam myofibroblast.Ini telah dinilai sebelum ini dalam model hirisan jantung ini.Perlu diingatkan bahawa parameter CTCM boleh dimodulasi dengan menukar amplitud tekanan/elektrik dan frekuensi untuk mensimulasikan banyak keadaan seperti takikardia, bradikardia, dan sokongan peredaran mekanikal (jantung tanpa beban mekanikal).Ini menjadikan sistem sebagai pemprosesan sederhana untuk ujian dadah.Keupayaan CTCM untuk memodelkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh tenaga yang berlebihan membuka jalan untuk menguji sistem ini untuk terapi yang diperibadikan.Kesimpulannya, kajian ini menunjukkan bahawa regangan mekanikal dan rangsangan humoral adalah penting untuk mengekalkan budaya bahagian tisu jantung.
Walaupun data yang dibentangkan di sini mencadangkan bahawa CTCM adalah platform yang sangat menjanjikan untuk memodelkan miokardium utuh, kaedah kultur ini mempunyai beberapa batasan.Batasan utama kultur CTCM ialah ia mengenakan tekanan mekanikal dinamik berterusan pada kepingan, yang menghalang keupayaan untuk memantau pengecutan hirisan jantung secara aktif semasa setiap kitaran.Di samping itu, disebabkan saiz bahagian jantung yang kecil (7 mm), keupayaan untuk menilai fungsi sistolik di luar sistem kultur menggunakan penderia daya tradisional adalah terhad.Dalam manuskrip semasa, kami sebahagiannya mengatasi had ini dengan menilai voltan optik sebagai penunjuk fungsi kontraktil.Walau bagaimanapun, had ini memerlukan kerja lanjut dan mungkin ditangani pada masa hadapan dengan memperkenalkan kaedah untuk pemantauan optik fungsi hirisan jantung dalam budaya, seperti pemetaan optik menggunakan kalsium dan pewarna sensitif voltan.Satu lagi had CTCM ialah model kerja tidak memanipulasi tekanan fisiologi (pramuat dan beban selepas).Dalam CTCM, tekanan diinduksi dalam arah yang bertentangan untuk menghasilkan semula 25% regangan fisiologi dalam diastole (regangan penuh) dan sistole (panjang penguncupan semasa rangsangan elektrik) dalam tisu yang sangat besar.Had ini harus dikeluarkan dalam reka bentuk CTCM akan datang dengan tekanan yang mencukupi pada tisu jantung dari kedua-dua belah dan dengan menggunakan hubungan tekanan-isipadu yang tepat yang berlaku di dalam bilik jantung.
Pengubahsuaian akibat regangan berlebihan yang dilaporkan dalam manuskrip ini terhad kepada meniru isyarat hiperstretch hipertrofik.Oleh itu, model ini boleh membantu dalam kajian isyarat hipertropik yang disebabkan oleh regangan tanpa memerlukan faktor humoral atau saraf (yang tidak wujud dalam sistem ini).Kajian lanjut diperlukan untuk meningkatkan kepelbagaian CTCM, contohnya, kultur bersama dengan sel imun, faktor humoral plasma yang beredar, dan pemuliharaan apabila kultur bersama dengan sel neuron akan meningkatkan kemungkinan pemodelan penyakit dengan CTCM.
Tiga belas ekor babi telah digunakan dalam kajian ini.Semua prosedur haiwan telah dilakukan mengikut garis panduan institusi dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Louisville.Gerbang aorta telah diapit dan jantung telah diserap dengan 1 L cardioplegia steril (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH sehingga 7.4); jantung telah dipelihara dalam larutan kardioplegik sejuk ais sehingga diangkut ke makmal di atas ais yang biasanya <10 min. jantung telah dipelihara dalam larutan kardioplegik sejuk ais sehingga diangkut ke makmal di atas ais yang biasanya <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <. jantung disimpan dalam larutan kardioplegik sejuk ais sehingga diangkut ke makmal di atas ais, yang biasanya mengambil masa <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 minit. Simpan jantung pada kardioplegia ais sehingga diangkut ke makmal di atas ais, biasanya <10 min.
Peranti CTCM telah dibangunkan dalam perisian reka bentuk bantuan komputer (CAD) SolidWorks.Ruang budaya, pembahagi dan ruang udara diperbuat daripada plastik akrilik jernih CNC.Cincin sandaran berdiameter 7mm diperbuat daripada polietilena berketumpatan tinggi (HDPE) di tengah dan mempunyai alur gelang-o untuk menampung cincin-o silikon yang digunakan untuk mengelak media di bawahnya.Membran silika nipis memisahkan ruang kultur daripada plat pemisah.Membran silikon adalah potongan laser daripada kepingan silikon tebal 0.02″ dan mempunyai kekerasan 35A.Gasket silikon bawah dan atas adalah potongan laser daripada kepingan silikon tebal 1/16″ dan mempunyai kekerasan 50A.Skru keluli tahan karat 316L dan kacang sayap digunakan untuk mengikat blok dan mencipta pengedap kedap udara.
Papan litar bercetak khusus (PCB) direka untuk disepadukan dengan sistem C-PACE-EM.Soket penyambung mesin swiss pada PCB disambungkan kepada elektrod grafit dengan wayar kuprum bersalut perak dan skru gangsa 0-60 yang diskrukan ke dalam elektrod.Papan litar bercetak diletakkan di dalam penutup pencetak 3D.
Peranti CTCM dikawal oleh penggerak pneumatik boleh atur cara (PPD) yang mencipta tekanan peredaran darah terkawal serupa dengan kitaran jantung.Apabila tekanan di dalam ruang udara meningkat, membran silikon fleksibel mengembang ke atas, memaksa medium di bawah tapak tisu.Kawasan tisu kemudiannya akan diregangkan oleh pembuangan cecair ini, meniru pengembangan fisiologi jantung semasa diastole.Pada puncak kelonggaran, rangsangan elektrik digunakan melalui elektrod grafit, yang mengurangkan tekanan dalam ruang udara dan menyebabkan pengecutan bahagian tisu.Di dalam paip terdapat injap hemostatik dengan sensor tekanan untuk mengesan tekanan dalam sistem udara.Tekanan yang dirasai oleh penderia tekanan digunakan pada pengumpul data yang disambungkan ke komputer riba.Ini membolehkan pemantauan berterusan tekanan di dalam ruang gas.Apabila tekanan ruang maksimum dicapai (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), peranti pemerolehan data telah diarahkan untuk menghantar isyarat kepada sistem C-PACE-EM untuk menjana isyarat voltan dwifasa selama 2 ms, ditetapkan kepada 4 V.
Bahagian jantung diperolehi dan keadaan kultur dalam 6 telaga dilakukan seperti berikut: Pindahkan hati yang dituai dari bekas pemindahan ke dulang yang mengandungi kardioplegia sejuk (4° C.).Ventrikel kiri diasingkan dengan pisau steril dan dipotong menjadi kepingan 1-2 cm3.Blok tisu ini dilekatkan pada penyokong tisu dengan pelekat tisu dan diletakkan di dalam tab mandi tisu mikrotom bergetar yang mengandungi larutan Tyrode dan dioksigenkan secara berterusan (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.407 M) , 6 mM KCl (0.407 M) (0.447 M) PES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml larutan 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml larutan 1 M), sehingga 1 L ddH2O).Mikrotom bergetar ditetapkan untuk memotong kepingan setebal 300 µm pada frekuensi 80 Hz, amplitud getaran mendatar 2 mm, dan kadar pendahuluan 0.03 mm/s.Mandian tisu dikelilingi oleh ais untuk memastikan larutan sejuk dan suhu dikekalkan pada 4°C.Pindahkan bahagian tisu dari mandi mikrotom ke tab mandi inkubasi yang mengandungi larutan Tyrode beroksigen berterusan di atas ais sehingga bahagian yang mencukupi diperoleh untuk satu plat kultur.Untuk kultur transwell, bahagian tisu dilekatkan pada sokongan poliuretana lebar 6 mm steril dan diletakkan dalam 6 ml medium yang dioptimumkan (199 medium, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali dan 2X antibiotik-antikulat ).Rangsangan elektrik (10 V, frekuensi 1.2 Hz) telah digunakan pada bahagian tisu melalui C-Pace.Untuk keadaan TD, T3 dan Dex segar ditambah pada 100 nM dan 1 μM pada setiap perubahan sederhana.Medium tepu dengan oksigen sebelum diganti 3 kali sehari.Bahagian tisu dibiakkan dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk kultur CTCM, bahagian tisu diletakkan pada pencetak 3D yang dibuat khas dalam hidangan Petri yang mengandungi penyelesaian Tyrode yang diubah suai.Peranti ini direka untuk meningkatkan saiz kepingan jantung sebanyak 25% daripada kawasan cincin sokongan.Ini dilakukan supaya bahagian jantung tidak meregang selepas dipindahkan dari larutan Tyrode ke medium dan semasa diastole.Menggunakan gam histoakrilik, bahagian setebal 300 µm diikat pada gelang sokongan berdiameter 7 mm.Selepas melekatkan bahagian tisu pada gelang sokongan, potong bahagian tisu yang berlebihan dan letakkan bahagian tisu yang dipasang kembali ke dalam tab mandi larutan Tyrode di atas ais (4°C) sehingga bahagian yang mencukupi telah disediakan untuk satu peranti.Jumlah masa pemprosesan untuk semua peranti tidak boleh melebihi 2 jam.Selepas 6 bahagian tisu dipasang pada gelang sokongannya, peranti CTCM telah dipasang.Ruang kultur CTCM telah diisi terlebih dahulu dengan medium pra-oksigen 21 ml.Pindahkan bahagian tisu ke ruang kultur dan keluarkan dengan teliti sebarang buih udara dengan pipet.Bahagian tisu kemudian dibimbing ke dalam lubang dan perlahan-lahan ditekan ke tempatnya.Akhir sekali, letakkan penutup elektrod pada peranti dan pindahkan peranti ke inkubator.Kemudian sambungkan CTCM ke tiub udara dan sistem C-PACE-EM.Penggerak pneumatik terbuka dan injap udara membuka CTCM.Sistem C-PACE-EM telah dikonfigurasikan untuk menyampaikan 4 V pada 1.2 Hz semasa pacing dwifasa selama 2 ms.Medium ditukar dua kali sehari dan elektrod ditukar sekali sehari untuk mengelakkan pengumpulan grafit pada elektrod.Jika perlu, bahagian tisu boleh dikeluarkan dari telaga kultur mereka untuk mengeluarkan sebarang buih udara yang mungkin jatuh di bawahnya.Untuk keadaan rawatan MT, T3/Dex ditambah segar dengan setiap perubahan sederhana dengan 100 nM T3 dan 1 μM Dex.Peranti CTCM telah dibiakkan dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk mendapatkan trajektori terbentang hirisan jantung, sistem kamera khas telah dibangunkan.Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepun) telah digunakan dengan kanta makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Visualisasi dilakukan pada suhu bilik selepas menggantikan medium dengan medium segar.Kamera diletakkan pada sudut 51° dan video dirakam pada 30 bingkai sesaat.Pertama, perisian sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) digunakan dengan Image-J untuk mengukur pergerakan hirisan jantung.Topeng telah dicipta menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) untuk mentakrifkan kawasan yang menarik untuk berdegup hirisan jantung untuk mengelakkan bunyi.Topeng bersegmen secara manual digunakan pada semua imej dalam jujukan bingkai dan kemudian dihantar ke pemalam MUSCLEMOTION.Pergerakan Otot menggunakan purata keamatan piksel dalam setiap bingkai untuk mengukur pergerakannya berbanding bingkai rujukan.Data telah direkodkan, ditapis dan digunakan untuk mengukur masa kitaran dan menilai regangan tisu semasa kitaran jantung.Video yang dirakam telah diproses selepas menggunakan penapis digital fasa sifar pesanan pertama.Untuk mengukur regangan tisu (puncak ke puncak), analisis puncak ke puncak dilakukan untuk membezakan antara puncak dan palung dalam isyarat yang direkodkan.Selain itu, detrending dilakukan menggunakan polinomial tertib ke-6 untuk menghapuskan hanyutan isyarat.Kod program telah dibangunkan dalam MATLAB untuk menentukan pergerakan tisu global, masa kitaran, masa kelonggaran dan masa penguncupan (Kod Program Tambahan 44).
Untuk analisis terikan, menggunakan video yang sama yang dibuat untuk penilaian regangan mekanikal, kami mula-mula mengesan dua imej yang mewakili puncak gerakan (titik pergerakan tertinggi (atas) dan terendah (bawah)) mengikut perisian MUSCLEMOTION.Kami kemudian membahagikan kawasan tisu dan menggunakan satu bentuk algoritma teduhan pada tisu bersegmen (Tambahan Rajah 2a).Tisu bersegmen kemudiannya dibahagikan kepada sepuluh subpermukaan, dan tegasan pada setiap permukaan dikira menggunakan persamaan berikut: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, di mana Sup dan Sdown ialah jarak bentuk dari bayang-bayang atas dan bawah fabrik, masing-masing (Tambahan Rajah .2b).
Bahagian jantung telah ditetapkan dalam 4% paraformaldehid selama 48 jam.Tisu tetap telah dehidrasi dalam 10% dan 20% sukrosa selama 1 jam, kemudian dalam 30% sukrosa semalaman.Bahagian-bahagian itu kemudiannya dibenamkan dalam sebatian suhu pemotongan optimum (kompaun OCT) dan secara beransur-ansur dibekukan dalam mandian ais isopentana/kering.Simpan blok benam OCT pada -80 °C sehingga diasingkan.Slaid disediakan sebagai bahagian dengan ketebalan 8 μm.
Untuk mengeluarkan OCT daripada bahagian jantung, panaskan slaid pada blok pemanas pada 95 °C selama 5 minit.Tambah 1 ml PBS pada setiap slaid dan eramkan selama 30 minit pada suhu bilik, kemudian meresap bahagian dengan menetapkan 0.1% Triton-X dalam PBS selama 15 minit pada suhu bilik.Untuk mengelakkan antibodi bukan spesifik daripada mengikat sampel, tambah 1 ml larutan BSA 3% ke dalam slaid dan inkubasi selama 1 jam pada suhu bilik.BSA kemudiannya dikeluarkan dan slaid dibasuh dengan PBS.Tandakan setiap sampel dengan pensel.Antibodi utama (dicairkan 1:200 dalam 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) telah ditambah selama 90 minit, kemudian antibodi sekunder 1 Fluida (20SA) yang dicairkan (%20SA) terhadap 1Alexa 1 (%20SA) Thermo Scientific; #A16079), melawan arnab Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) selama 90 minit tambahan Dicuci 3 kali dengan PBS Untuk membezakan pewarnaan sasaran dari latar belakang, kami hanya menggunakan antibodi sekunder sebagai kawalan. Akhirnya, noda nuklear DAPI telah ditambah dan pelapis najis (Vector shield) diletakkan di dalam perisai pengilat (Vector shield). pembesaran) dan mikroskop Keyence dengan pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pada 5 μg/ml dalam PBS telah digunakan untuk pewarnaan WGA dan digunakan pada bahagian tetap selama 30 minit pada suhu bilik.Slaid kemudiannya dibasuh dengan PBS dan Sudan hitam telah ditambah pada setiap slaid dan diinkubasi selama 30 minit.Slaid kemudiannya dibasuh dengan PBS dan medium pemasukan vectashield telah ditambah.Slaid telah divisualisasikan pada mikroskop Keyence pada pembesaran 40x.
OCT telah dikeluarkan daripada sampel seperti yang diterangkan di atas.Selepas mengeluarkan OCT, rendamkan slaid dalam larutan Bouin semalaman.Slaid kemudiannya dibilas dengan air suling selama 1 jam dan kemudian dimasukkan ke dalam larutan fuchsin asid aloe Bibrich selama 10 minit.Kemudian slaid dibasuh dengan air suling dan diletakkan dalam larutan 5% phosphomolybdenum/5% asid fosfotungstik selama 10 minit.Tanpa membilas, pindahkan slaid terus ke dalam larutan biru aniline selama 15 minit.Kemudian slaid dibasuh dengan air suling dan diletakkan dalam larutan asid asetik 1% selama 2 minit.Slaid dikeringkan dalam etanol 200 N dan dipindahkan ke xilena.Slaid berwarna telah divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan objektif 10x.Peratusan kawasan fibrosis dikira menggunakan perisian Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nombor katalog V13154, mengikut protokol pengilang dengan beberapa pengubahsuaian.Khususnya, pukulan pembedahan dengan diameter 6 mm digunakan untuk memastikan saiz tisu seragam semasa analisis MTT.Tisu disalut secara individu ke dalam telaga plat 12 telaga yang mengandungi substrat MTT mengikut protokol pengeluar.Bahagian tersebut diinkubasi pada suhu 37° C. selama 3 jam dan tisu hidup memetabolismekan substrat MTT untuk membentuk sebatian formazan ungu.Gantikan larutan MTT dengan 1 ml DMSO dan eramkan pada suhu 37 °C selama 15 minit untuk mengekstrak formazan ungu dari bahagian jantung.Sampel telah dicairkan 1:10 dalam DMSO dalam plat bawah jernih 96-telaga dan keamatan warna ungu diukur pada 570 nm menggunakan pembaca plat Cytation (BioTek).Bacaan telah dinormalkan mengikut berat setiap kepingan jantung.
Media hirisan jantung digantikan dengan media yang mengandungi 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) untuk ujian penggunaan glukosa seperti yang diterangkan sebelum ini.Selepas 4 jam pengeraman, tambahkan 100 µl medium ke dalam tiub microcentrifuge terbuka yang mengandungi 100 µl HCl 0.2 N.Kemudian tiub itu diletakkan di dalam tiub kilauan yang mengandungi 500 μl dH2O untuk menyejat [3H]2O selama 72 jam pada suhu 37°C.Kemudian keluarkan tiub microcentrifuge dari tiub kilauan dan tambah 10 ml cecair kilauan.Kiraan kilauan dilakukan menggunakan penganalisis kilauan cecair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Penggunaan glukosa kemudiannya dikira dengan mengambil kira aktiviti khusus [5-3H]-glukosa, keseimbangan dan latar belakang yang tidak lengkap, pencairan [5-3H]-kepada glukosa tidak berlabel, dan kecekapan balas kilauan.Data dinormalisasi kepada jisim bahagian jantung.
Selepas homogenisasi tisu dalam Trizol, RNA telah diasingkan daripada bahagian jantung menggunakan Kit Mikro Qiagen miRNeasy #210874 mengikut protokol pengeluar.Penyediaan perpustakaan RNAsec, penjujukan dan analisis data dilakukan seperti berikut:
1 μg RNA setiap sampel digunakan sebagai bahan permulaan untuk penyediaan perpustakaan RNA.Pustaka penjujukan telah dijana menggunakan Kit Persediaan Perpustakaan RNA NEBNext UltraTM untuk Illumina (NEB, USA) berikutan pengesyoran pengeluar dan kod indeks telah ditambahkan pada jujukan atribut untuk setiap sampel.Secara ringkas, mRNA telah disucikan daripada jumlah RNA menggunakan manik magnet yang dilampirkan dengan oligonukleotida poli-T.Pemecahan dijalankan menggunakan kation divalen pada suhu tinggi dalam NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA untaian pertama telah disintesis menggunakan primer heksamer rawak dan transkripase terbalik M-MuLV (RNase H-).cDNA untaian kedua kemudiannya disintesis menggunakan DNA polimerase I dan RNase H. Baki overhang ditukar kepada hujung tumpul oleh aktiviti exonuclease/polimerase.Selepas adenilasi hujung 3′ serpihan DNA, Penyesuai NEBNext dengan struktur gelung jepit rambut dilekatkan padanya untuk menyediakannya untuk penghibridan.Untuk pemilihan serpihan cDNA dengan panjang pilihan 150-200 bp.serpihan perpustakaan telah disucikan menggunakan sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Amerika Syarikat).Kemudian, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) dengan cDNA terpilih saiz yang diikat dengan penyesuai telah digunakan selama 15 minit pada 37°C dan kemudian selama 5 minit pada 95°C sebelum PCR.PCR kemudiannya dilakukan menggunakan polimerase DNA Kesetiaan Tinggi Phusion, primer PCR universal, dan primer Indeks (X).Akhirnya, produk PCR telah dimurnikan (sistem AMPure XP) dan kualiti perpustakaan dinilai pada sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Pustaka cDNA kemudiannya disusun menggunakan penjujukan Novaseq.Fail imej mentah daripada Illumina telah ditukar kepada bacaan mentah menggunakan Panggilan Pangkalan CASAVA.Data mentah disimpan dalam fail format FASTQ(fq) yang mengandungi urutan baca dan kualiti asas yang sepadan.Pilih HISAT2 untuk memadankan bacaan jujukan yang ditapis dengan genom rujukan Sscrofa11.1.Secara umum, HISAT2 menyokong genom dalam sebarang saiz, termasuk genom yang lebih besar daripada 4 bilion asas, dan nilai lalai ditetapkan untuk kebanyakan parameter.Bacaan penyambungan daripada data RNA Seq boleh diselaraskan dengan cekap menggunakan HISAT2, sistem terpantas yang tersedia pada masa ini, dengan ketepatan yang sama atau lebih baik daripada kaedah lain.
Banyaknya transkrip secara langsung mencerminkan tahap ekspresi gen.Tahap ekspresi gen dinilai oleh banyaknya transkrip (kiraan penjujukan) yang dikaitkan dengan genom atau ekson.Bilangan bacaan adalah berkadar dengan tahap ekspresi gen, panjang gen dan kedalaman penjujukan.FPKM (serpihan setiap seribu pasangan asas transkrip yang dijujukan per juta pasangan asas) dikira dan nilai P bagi ungkapan pembezaan ditentukan menggunakan pakej DESeq2.Kami kemudiannya mengira kadar penemuan palsu (FDR) untuk setiap nilai P menggunakan kaedah Benjamini-Hochberg9 berdasarkan fungsi R terbina dalam "p.adjust".
RNA yang diasingkan daripada bahagian jantung telah ditukar kepada cDNA pada kepekatan 200 ng/μl menggunakan campuran SuperScript IV Vilo Master daripada Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).RT-PCR kuantitatif dilakukan menggunakan plat tindak balas telus telus Microamp 384-telaga Biosystems Endura Plate (Thermo, cat. no. 4483319) dan pelekat optik mikroamp (Thermo, cat. no. 4311971).Campuran tindak balas terdiri daripada 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer dan 3.5 µl H2O bercampur setiap telaga.Kitaran qPCR standard telah dijalankan dan nilai CT diukur menggunakan instrumen PCR masa nyata Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul telaga 384; produk # A28135).Primer Taqman dibeli daripada Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss09_Sm01) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) COL1A2 (Ss03375009_u1) COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)
Keluaran media NT-ProBNP dinilai menggunakan kit NT-ProBNP (babi) (No. Cat. MBS2086979, MyBioSource) mengikut protokol pengeluar.Secara ringkas, 250 µl setiap sampel dan piawai telah ditambah dalam pendua kepada setiap telaga.Sejurus selepas menambah sampel, tambah 50 µl Reagen Assay A ke setiap telaga.Goncangkan pinggan perlahan-lahan dan tutup dengan sealant.Kemudian tablet diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam.Kemudian sedut larutan dan basuh telaga 4 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X, mengeram larutan pencuci selama 1-2 minit setiap kali.Kemudian tambah 100 µl Assay Reagent B setiap perigi dan tutup dengan pengedap plat.Tablet digoncang perlahan-lahan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 minit.Sedut larutan dan basuh telaga 5 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X.Tambah 90 µl larutan substrat pada setiap perigi dan tutup plat.Inkubasi plat pada suhu 37°C selama 10-20 minit.Tambahkan 50 µl Stop Solution pada setiap sumur.Plat itu segera diukur menggunakan set pembaca plat Cytation (BioTek) pada 450 nm.
Analisis kuasa dilakukan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan >80% kuasa untuk mengesan perubahan mutlak 10% dalam parameter dengan kadar ralat Jenis I 5%. Analisis kuasa dilakukan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan >80% kuasa untuk mengesan perubahan mutlak 10% dalam parameter dengan kadar ralat Jenis I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis kuasa dilakukan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan >80% kuasa untuk mengesan 10% perubahan parameter mutlak dengan kadar ralat Jenis I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5＇I寎秋。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5＇I寎秋。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаруглежнибность я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis kuasa telah dilakukan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan >80% kuasa untuk mengesan 10% perubahan parameter mutlak dan 5% kadar ralat jenis I.Bahagian tisu dipilih secara rawak sebelum eksperimen.Semua analisis adalah buta keadaan dan sampel dinyahkod hanya selepas semua data dianalisis.Perisian GraphPad Prism (San Diego, CA) telah digunakan untuk melaksanakan semua analisis statistik. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05.Ujian-t Pelajar dua ekor dilakukan ke atas data dengan hanya 2 perbandingan.ANOVA sehala atau dua hala digunakan untuk menentukan kepentingan antara pelbagai kumpulan.Semasa menjalankan ujian post hoc, pembetulan Tukey digunakan untuk mengambil kira beberapa perbandingan.Data RNAsec mempunyai pertimbangan statistik khas apabila mengira FDR dan p.adjust seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak Laporan Penyelidikan Alam yang dipautkan kepada artikel ini.