Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-brawżer li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew itfi l-mod ta' kompatibilità f'Internet Explorer).Sadattant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Il-morfoġenesi tal-imsaren tal-bniedem tistabbilixxi karatteristiċi kripto-villus ta 'mikroarkitettura epiteljali 3D u organizzazzjoni spazjali. Din l-istruttura unika hija meħtieġa biex iżżomm l-omeostażi tal-imsaren billi tipproteġi n-niċċa taċ-ċelloli staminali fil-kripta bażali minn antiġeni mikrobjali eżoġeni u l-metaboliti tagħhom. L-istrutturi epiteljali D huma kruċjali għall-kostruzzjoni ta 'mudelli tal-imsaren in vitro. Notevolment, l-imsaren mimetiku organiku fuq ċippa jista' jinduċi morfoġenesi 3D spontanja tal-epitelju intestinali b'funzjonijiet fiżjoloġiċi u bijomekkaniċi mtejba. Hawnhekk, nipprovdu protokoll riproduċibbli biex jinduċi b'mod robust morfoġenesi intestinali fl-imsaren. , kultura ta 'Caco-2 jew ċelluli epiteljali organoid intestinali f'ambjenti konvenzjonali kif ukoll fuq pjattaforma mikrofluwidi, induzzjoni ta' morfoġenesi 3D, u karatterizzazzjoni ta 'epitelja 3D stabbilita bl-użu ta' modalitajiet ta 'immaġini multipli .Dan il-protokoll jikseb riġenerazzjoni ta' mikroarkitettura tal-musrana funzjonali billi tikkontrolla fluss ta 'fluwidu basolaterali għal 5 d. jeħtieġu inġinerija jew manipulazzjoni taċ-ċelluli kumplessi, li jistgħu jissuperaw tekniki eżistenti oħra. Aħna nipprevedu li l-protokoll propost tagħna jista 'jkollu implikazzjonijiet wesgħin għall-komunità tar-riċerka bijomedika, li jipprovdi metodu biex jirriġenera saffi epiteljali intestinali 3D in vitro għal applikazzjonijiet bijomediċi, kliniċi u farmaċewtiċi.
L-esperimenti juru li ċ-ċelloli epiteljali Caco-2 intestinali kkultivati ​​f'apparati mikrofluwidi b'żewġ saffi1,2,3,4,5 jew 6,7 jistgħu jgħaddu minn morfoġenesi 3D spontanja in vitro mingħajr fehim ċar tal-mekkaniżmu sottostanti. morfoġenesi in vitro, li ntweriet minn Caco-2 u organoids intestinali derivati ​​mill-pazjent.Ċelloli epiteljali ġew ivvalidati. F'dan l-istudju, aħna speċifikament iffukaw fuq il-produzzjoni taċ-ċelluli u d-distribuzzjoni tal-konċentrazzjoni ta 'antagonist Wnt qawwi, Dickkopf-1 (DKK-1), f'apparat mikrofluwidi imsaren fuq ċippa u modifikat li fihom inserzjonijiet Transwell, imsejħa "Hybrid Chip". -proteina relatata 1, jew Soggy-1) għall-imsaren fuq iċ-ċippa jinibixxi l-morfoġenesi jew ifixkel is-saff epiteljali 3D prestrutturat, li jissuġġerixxi li l-istress antagonistiku matul il-kultura huwa responsabbli għall-morfoġenesi intestinali in vitro.Għalhekk, approċċ prattiku biex tinkiseb morfoġenesi robusta fil-livell epiteljali żżomm il-livell ta 'paragun attiv b'mod minimu billi tneħħi l-livell ta' komparazzjoni b'mod minimu. (eż., fi pjattaformi gut-on-a-chip jew hybrid-on-a-chip) jew diffużjoni .Medju basolaterali (eż., minn inserzjonijiet Transwell f'ġibjuni basolaterali kbar fil-bjar).
F'dan il-protokoll, aħna nipprovdu metodu dettaljat għall-fabbrikazzjoni ta 'mikrodevices gut-on-a-chip u ċipep ibridi Transwell-insertable (passi 1-5) għall-kultivazzjoni ta' ċelluli epiteljali intestinali fuq membrani porużi bbażati fuq polydimethylsiloxane (PDMS) (passi 6A, 7A, 8, 9) jew membrani tal-poliester indotti ta 'Transwell , 6B , 7B , 6B indotti morfoġenesi in vitro (pass 10). Aħna wkoll identifikajna karatteristiċi ċellulari u molekulari indikattivi ta 'istoġenesi speċifiċi għat-tessuti u differenzjazzjoni ċellulari dipendenti fuq in-nisel bl-applikazzjoni ta' modalitajiet ta 'immaġini multipli (passi 11-24). Aħna ninduċu morfoġenesi bl-użu ta' ċelluli epiteljali intestinali umani, bħal Caco-2 jew organoids intestinali, f'żewġ formati ta 'kultura, modifiki tal-wiċċ ta' bijokimiċi u dettalji tekniċi intestinali. tal-mikroambjent bijomekkaniku.in vitro.Biex tinduċi morfoġenesi 3D minn saffi epiteljali 2D, neħħejna l-antagonisti tal-morfoġenu fiż-żewġ forom kkultivati ​​billi niċċirkola l-medju fil-kompartiment basolaterali tal-kultura. -kulturi, infezzjoni ta 'patoġenu, korriment infjammatorju, disfunzjoni tal-barriera epiteljali, u terapiji bbażati fuq probijotiċi Eżempju.influwenzi.
Il-protokoll tagħna jista’ jkun utli għal firxa wiesgħa ta’ xjenzati fir-riċerka bażika (eż., bijoloġija mukoża intestinali, bijoloġija taċ-ċelluli staminali u bijoloġija tal-iżvilupp) u applikata (eż. testijiet prekliniċi tad-droga, immudellar tal-mard, inġinerija tat-tessuti, u gastroenteroloġija) impatt wiesa’. s jistudjaw id-dinamika tas-sinjalar taċ-ċelluli waqt l-iżvilupp intestinali, ir-riġenerazzjoni jew l-omeostasi .Barra minn hekk, il-protokoll tagħna huwa utli għall-interrogazzjoni ta 'infezzjoni taħt diversi aġenti infettivi bħal Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 jew Vibrio cholerae.Udjenzi tal-patoloġija tal-mard u l-patoġenesi huma wkoll utli. L-użu ta 'sistema ta' mikrofiżjoloġija tal-imsaren fuq iċ-ċippa jista 'jippermetti ko-kultura lonġitudinali 10 u valutazzjoni sussegwenti tad-difiża tal-host, risponsi immuni u tiswija ta' korriment relatat mal-patoġenu fil-passaġġ gastrointestinali (GI) 11. jew sindromu tal-musrana irritabbli jista 'jiġi simulat meta saffi epiteljali intestinali 3D huma ppreparati bl-użu ta' saffi epiteljali intestinali 3D tal-pazjent , dan il-mard jinkludi atrofija villous, tqassir tal-kripta, ħsara mukosali, jew barriera epiteljali indebolita. tipi, bħal ċelluli mononukleari tad-demm periferali tal-pazjent (PBMCs), għal mudelli li fihom mikroarkitetturi 3D tal-villus-kripto intestinali.ċelluli immuni speċifiċi għat-tessut, 5.
Peress li l-mikrostruttura epiteljali 3D tista 'tiġi ffissata u viżwalizzata mingħajr il-proċess ta' sezzjoni, it-telespettaturi li jaħdmu fuq traskriptomika spazjali u immaġini b'riżoluzzjoni għolja jew super-riżoluzzjoni jistgħu jkunu interessati fl-immappjar tagħna tad-dinamika spazjotemporali ta 'ġeni u proteini fuq niċeċ epiteljali.Interessat fit-teknoloġija. Rispons għal stimuli mikrobjali jew immuni. Barra minn hekk, crosstalk lonġitudinali tal-mikrobijoma ospitanti 10, 14 li jikkoordinaw l-omeostażi tal-musrana jistgħu jiġu stabbiliti fis-saff tal-mukuża intestinali 3D billi jiġu kkultivati ​​diversi speċi mikrobjali, komunitajiet mikrobjali jew mikrobijota fekali, speċjalment fil-musrana fuq a-chip.fil-pjattaforma.Dan l-approċċ huwa partikolarment attraenti għall-udjenzi li jistudjaw l-immunoloġija tal-mukuża, il-gastroenteroloġija, il-mikrobijoma tal-bniedem, il-kulturomika u l-mikrobijoloġija klinika li jfittxu li jikkultivaw mikrobijota tal-musrana mhux kultivata qabel fil-laboratorju. il-protokoll jista' wkoll jinxtered lil dawk li qed jiżviluppaw pjattaformi ta' screening jew validazzjoni farmaċewtiċi, bijomediċi jew ta' produzzjoni għolja għall-industrija tal-ikel. metodu tal-morfoġenesi jista 'jiġi aċċellerat u potenzjalment adottat minn bosta laboratorji ta' riċerka, industrija jew gvern u aġenziji regolatorji biex jifhmu r-riprogrammazzjoni ċellulari ta 'morfoġenesi tal-musrana in vitro fil-livell traskriptomiku biex jiġu ttestjati mediċini jew bijoterapewtiċi.
Numru limitat ta 'mudelli sperimentali rilevanti għall-bniedem intużaw biex jistudjaw il-morfoġenesi epiteljali intestinali, prinċipalment minħabba n-nuqqas ta' protokolli implimentati biex jinduċu morfoġenesi 3D in vitro. Dawn il-mudelli huma wkoll limitati ħafna fil-kapaċità tagħhom li jiġu ttestjati b'mod skalabbli f'diversi modi. Għalhekk, il-protokoll tagħna għar-riġenerazzjoni ta' strutturi tat-tessuti 3D in vitro jaqbeż il-mudelli tal-annimali in vivo kif ukoll mudelli ta 'kultura taċ-ċelluli 2D statiċi tradizzjonali oħra. stimoli mukosali jew immuni. Saffi epiteljali 3D jistgħu jipprovdu spazju biex jistudjaw kif iċ-ċelluli mikrobjali jikkompetu biex jiffurmaw niċeċ spazjali u evoluzzjoni ekoloġika b'reazzjoni għal fatturi ospitanti (eż., saffi ta' mukus ta 'ġewwa versus ta' barra, sekrezzjoni ta 'IgA u peptidi antimikrobiċi). eż., aċidi grassi b'katina qasira) li jsawru organizzazzjoni ċellulari u niċeċ taċ-ċelloli staminali fil-kriptos bażali. Dawn il-karatteristiċi jistgħu jintwerew biss meta saffi epiteljali 3D jiġu stabbiliti in vitro.
Minbarra l-metodu tagħna ta 'ħolqien ta' strutturi epiteljali intestinali 3D, hemm diversi metodi in vitro. Il-kultura organoid intestinali hija teknika avvanzata ta 'inġinerija tat-tessuti bbażata fuq il-kultivazzjoni ta' ċelluli staminali intestinali taħt kundizzjonijiet morfoġeni speċifiċi23,24,25.Madankollu, l-użu ta 'mudelli organoid 3D għal analiżi tat-trasport jew ospitanti-mikrojde huwa spiss fi ħdan l-intestinali co-cultured organoid li jospitahom għalhekk, l-introduzzjoni ta 'komponenti luminali bħal ċelloli mikrobjali jew antiġeni eżoġeni hija limitata.Aċċess għal lumens organoid jista 'jitjieb bl-użu ta' mikroinjettur, 26, 27 iżda dan il-metodu huwa invażiv u intensiv tax-xogħol u jeħtieġ għarfien speċjalizzat biex twettaq.
Approċċi oħra użati minn diversi gruppi ta 'riċerka jutilizzaw scaffolds idroġel 3D prestrutturati biex jimitaw l-istruttura epiteljali tal-musrana billi jikkultivaw ċelluli intestinali umani iżolati fuq il-wiċċ tal-ġel. ing a proporzjon ta 'aspett għoli struttura epiteljali u crosstalk stroma-epiteljali billi tinkludi ċelluli stromali fl-scaffold.However, in-natura ta' scaffolds prestrutturati jistgħu jipprevjenu l-wiri tal-proċess morfoġenetiku spontanju innifsu. Dawn il-mudelli wkoll ma jipprovdux fluss luminali dinamiku jew interstizjali, nieqsa mill-fluwidu shear stress li ċelluli intestinali ħtieġa scaffold ta 'studju reċenti li jiksbu scaffold morphogenesiological reċenti. pjattaforma mikrofluwidi u strutturi epiteljali intestinali disinjati li jużaw tekniki ta 'inċiżjoni bil-lejżer. Organojdi intestinali tal-ġurdien isegwu mudelli nċiżi biex jiffurmaw strutturi tubulari intestinali, u l-fluss tal-fluwidu intraluminali jista' jiġi rikapitulat permezz ta 'modulu mikrofluwidi. tic processes.Minkejja l-fabbrikazzjoni kumplessa ta 'segmenti tal-musrana differenti fit-tubu, dan il-mudell nieqes ukoll fluss ta' fluwidu luminali u deformazzjoni mekkanika. Barra minn hekk, l-operabbiltà tal-mudell tista 'tkun limitata, speċjalment wara li l-proċess ta' bioprinting ikun komplut, kundizzjonijiet sperimentali perturbanti jew interazzjonijiet minn ċellula għal ċellula. tmenti, u ħolqien mill-ġdid ta 'mikroambjenti bijoloġiċi kumplessi ta' modularità. Għalhekk, il-protokoll tagħna ta 'morfoġenesi 3D in vitro jista' jipprovdi approċċ komplementari biex jingħelbu l-isfidi tal-metodi eżistenti.
Il-protokoll tagħna huwa kompletament iffukat fuq il-morfoġenesi epiteljali 3D, b'ċelluli epiteljali biss fil-kultura u l-ebda tip ieħor ta 'ċelluli tal-madwar bħal ċelluli mesenkimali, ċelluli endoteljali, u ċelluli immuni. on-a-chip u hybrid-on-a-chip jippermettilna li jirrikreaw is-saff epiteljali 3D ondulat, kumplessitajiet bijoloġiċi addizzjonali bħal interazzjonijiet epiteljali-mesenkimali33,34, depożitu ta 'Matriċi extraċellulari (ECM) 35 u, fil-mudell tagħna, karatteristiċi kripto-villus li jwasslu ċelluli staminali niċeċ fil-basal fibros. chyme għandhom rwol ewlieni fil-produzzjoni tal-proteini ECM u r-regolamentazzjoni tal-morfoġenesi intestinali in vivo35,37,38.Iż-żieda ta 'ċelloli mesenkimali mal-mudell tagħna tejbet il-proċess morfoġenetiku u l-effiċjenza tat-twaħħil taċ-ċelluli. jistgħu jiġu konnessi bejn mudelli tat-tessuti huma prerekwiżit meta mudelli tat-tessuti huma ddisinjati biex juru interazzjonijiet multi-organi. Għalhekk, ċelloli endoteljali jista 'jkollhom bżonn jiġu inklużi biex jimmudellaw karatteristiċi fiżjoloġiċi aktar preċiżi b'riżoluzzjoni fil-livell tal-organi. Ċelloli immuni derivati ​​mill-pazjent huma wkoll essenzjali għall-wiri ta' risponsi immuni intrinsiċi, preżentazzjoni ta 'antiġeni, kuntest ta' addattament tal-immunità transinali u kuntest immunitarju ta 'tessuti speċifiċi. mard.
L-użu ta 'ċipep ibridi huwa aktar sempliċi minn gut-on-a-chip minħabba li s-setup tal-apparat huwa aktar sempliċi u l-użu ta' inserzjonijiet Transwell jippermetti kultura skalabbli ta 'epitelju tal-musrana. Madankollu, inserzjonijiet Transwell disponibbli kummerċjalment b'membrani tal-poliester mhumiex elastiċi u ma jistgħux jissimulaw movimenti simili peristaltiċi. arly, il-proprjetajiet statiċi fil-kompartiment apikali rarament jippermettu ko-kultura batterjali fit-tul f'ċipep ibridi. Filwaqt li nistgħu ninduċu 3D morfoġenesi f'inserzjonijiet Transwell meta nużaw ċipep ibridi, in-nuqqas ta 'bijomekkaniċi fiżjoloġikament rilevanti u fluss ta' fluwidu apikali jistgħu jillimitaw il-fattibbiltà ta 'pjattaformi ta' ċippa ibrida għal applikazzjonijiet potenzjali.
Rikostruzzjonijiet fuq skala sħiħa tal-assi tal-kripta-villus tal-bniedem fil-kulturi tal-musrana fuq ċippa u ibridi fuq ċippa ma ġewx stabbiliti għal kollox. Peress li l-morfoġenesi tibda minn monosaff epiteljali, il-mikroarkitetturi 3D mhux bilfors jipprovdu xebh morfoloġiku mal-kriptos in vivo. il-kripta u r-reġjuni villous ma kinux demarkati b'mod ċar. Għalkemm kanali ta 'fuq ogħla fuq iċ-ċippa jwasslu għal żieda fl-għoli tal-epitelju mikroinġinerija, l-għoli massimu għadu limitat għal ~ 300-400 µm.
Mil-lat tal-immaġini, immaġini ta 'super-riżoluzzjoni in situ ta' mikroarkitetturi 3D jistgħu jkunu limitati għall-imsaren fuq ċippa, peress li d-distanza tax-xogħol meħtieġa mill-lenti oġġettiva sas-saff epiteljali hija ta 'l-ordni ta' ftit millimetri. Biex tingħeleb din il-problema, jista 'jkun meħtieġ objettiv bogħod. mikrofabbrikazzjoni tal-imsaren fuq ċippa tinvolvi adeżjoni permanenti bejn kull saff, huwa estremament ta 'sfida li tiftaħ jew tneħħi s-saff ta' fuq biex teżamina l-istruttura tal-wiċċ tas-saff epiteljali.Per eżempju, bl-użu ta 'mikroskopju elettroniku tal-iskannjar (SEM).
L-idrofobiċità tal-PDMS kienet fattur li jillimita fi studji bbażati fuq mikrofluwidi li jittrattaw molekuli żgħar idrofobiċi, peress li l-PDMS jista' jassorbi b'mod mhux speċifiku tali molekuli idrofobiċi. Alternattivi għal PDMS jistgħu jiġu kkunsidrati ma' materjali polimeriċi oħra. molekuli fobiċi.
Fl-aħħarnett, il-metodu tagħna ma ġiex ikkaratterizzat tajjeb f'termini li jipprovdi screening b'rendiment għoli jew pjattaforma sperimentali faċli għall-utent "one-size-fits-all". Il-protokoll attwali jeħtieġ pompa tas-siringa għal kull mikroapparat, li jieħu spazju f'inkubatur tas-CO2 u jipprevjeni esperimenti fuq skala kbira. li jippermettu riforniment kontinwu u tneħħija tal-midja basolaterali).
Biex jinduċi 3D morphogenesis tal-epitelju intestinali tal-bniedem in vitro, użajna apparat intestinali ċippa mikrofluwidi li fih żewġ mikrokanali paralleli u membrana elastika poruża bejniethom biex tinħoloq interface lumen-kapillari. Aħna nuru wkoll l-użu ta 'apparat mikrofluwidi b'kanal wieħed (ċippa ibrida) li jipprovdi fluss basolaterali kontinwu taħt diversi pjattaformi intestinali polarizzati, transwellogenes inserzjoni transwellogenes tal-bniedem. ċelluli epiteljali jistgħu jintwerew billi tiġi applikata manipulazzjoni direzzjonali tal-fluss biex jitneħħew l-antagonisti tal-morfoġenu mill-kompartiment basolaterali.kaxxi 2-5), (iii) kultura ta 'ċelluli epiteljali intestinali fuq ċipep intestinali jew ċipep ibridi (passi 6-9), (iv) induzzjoni ta' morfoġenesi 3D in vitro (pass 10) u (v) ) biex tikkaratterizza l-mikrostruttura epiteljali 3D (passi 11-24). morfoġenesi thelial għal kontrolli spazjali, temporali, kondizzjonali, jew proċedurali.
Aħna użajna żewġ pjattaformi ta’ kultura differenti: gut-on-a-chip b’kanali dritti jew kanali konvoluti mhux lineari, jew ċipep ibridi li fihom inserzjonijiet Transwell (TW) f’apparat mikrofluwidu, iffabbrikat kif deskritt f’Kaxxa 1, u pass 1 -5 "Device Fabrication" turi l-passi ewlenin biex issir ċippa waħda jew ċippa waħda jew ċippa ibrida. ) u l-proċedura tal-kultura użata f'dan il-protokoll "Morġenesi in vitro" turi l-passi ġenerali li fihom Caco-2 jew ċelluli epiteljali derivati ​​minn organoid huma kkultivati ​​fuq ċippa intestinali jew fuq inserzjonijiet Transwell ta 'ċippa ibrida, segwita minn induzzjoni ta' morfoġenesi 3D u l-formazzjoni ta 'struttura epiteljali karatterizzata. fil-karatterizzazzjoni tad-divrenzjar taċ-ċelluli, studji tal-fiżjoloġija tal-musrana, twaqqif ta 'ekosistemi tal-mikrobijoma ospitanti, u mudellar tal-mard. Immaġini ta' immunofluworexxenza f'"Differenzjazzjoni taċ-ċelluli" li juru nuklei, F-actin u MUC2 espressi fis-saff epiteljali 3D Caco-2 iġġenerat fuq iċ-ċippa tal-musrana. Il-fiżjoloġija turi mukus prodott bit-tbajja' ta' residwi ta' aċidu sialic u N-acetylglucosamine bl-użu ta' agglutinin fluworexxenti tar-raħs tal-qamħ. ċelluli lial.Il-pannell tal-lemin juri l-lokalizzazzjoni ta 'GFP E. coli ko-kultivati ​​ma' ċelluli epiteljali 3D Caco-2, segwit minn tbajja ta 'immunofluworexxenza b'F-actin (aħmar) u nuklei (blu). L-immudellar tal-mard juri musrana b'saħħitha versus leaky f'ċipep ta' infjammazzjoni tal-musrana taħt sfida ta 'l-infjammazzjoni tal-musrana taħt, physiogenlys, batterji lipoaċidi u L-isfida lipoloġika (eż. ċelluli (eż., PBMC;aħdar).Iċ-ċelloli Caco-2 ġew ikkultivati ​​biex jistabbilixxu saff epiteljali 3D.Bar tal-iskala, 50 µm.Immaġini fir-ringiela t'isfel: "Differenzjazzjoni taċ-ċelloli" adattata b'permess mir-referenza.2.Oxford University Press;Riprodotta bil-permess minn Ref.5.NAS;“Ko-Kultura Ospitanti-Mikrobi” adattata bil-permess minn ref.3.NAS;"Disease Modeling" adattat b'permess minn referenza.5.NAS.
Kemm imsaren fuq ċippa kif ukoll ċipep ibridi ġew iffabbrikati bl-użu ta 'repliki PDMS li ġew demolded minn forom tas-silikon permezz ta' litografija artab1,44 u disinji b'SU-8. Id-disinn tal-mikrokanali f'kull ċippa huwa determinat billi titqies l-idrodinamika bħal shear stress u pressjoni idrodinamika1,4,12.The oriġinali gut-on-a-chip designd (imsaren fuq ċippa oriġinali 1,4,12). , evolviet f'musrana kumplessa fuq ċippa (Dejta Estiża Fig. 1b) li tinkludi par mikrokanali mgħawġa biex jinduċu Żieda fil-ħin ta 'residenza tal-fluwidu, mudelli ta' fluss mhux lineari, u deformazzjoni multiassjali ta 'ċelluli kkultivati ​​(Fig. 2a-f) 12.Meta aktar kumplessi bijomekkaniċi tal-musrana għażlu li l-imsaren kumplessi jkunu rrikreati, għandna bżonn li l-intestini kumplessi jkunu rikreati. voluted Gut-Chip wkoll jinduċi bil-qawwa 3D morphogenesis fi żmien simili bi grad simili ta 'tkabbir epiteljali meta mqabbla mal-Gut-Chip oriġinali, irrispettivament mit-tip ta' ċelluli kkultivati.2a). Biex tiffabbrika l-imsaren fuq ċippa, is-saff ta 'fuq PDMS ippreparat kien sekwenzjali magħqud ma' film PDMS poruż u mbagħad allinjat mas-saff PDMS t'isfel permezz ta 'twaħħil irriversibbli permezz ta' trattament tal-korona (Fig. 2b-f). Biex jiġu fabbrikati ċipep, repliki PDMS vulkanizzati ġew magħquda ma 'slajds tal-ħġieġ li jistgħu jinħolqu slajds tal-ħġieġ li jistgħu jinħolqu slajds tal-ħġieġ. Dejta Estiża Fig. 2) .Il-proċess ta 'twaħħil jitwettaq billi jiġu trattati l-uċuħ tar-replika PDMS u l-ħġieġ bi plażma ta' ossiġnu jew trattament tal-korona.
a, Illustrazzjoni skematika tal-preparazzjoni ta 'partijiet PDMS minn forom tas-silikon disinji SU-8. Is-soluzzjoni PDMS mhux vulkanizzata tferragħ fuq moffa tas-silikon (xellug), vulkanizzat f'60 °C (nofs) u demolded (lemin).Il-PDMS demolded kien maqtugħ f'biċċiet u mnaddaf għal aktar użu. d, Serje ta' ritratti tal-komponenti PDMS ta 'fuq u t'isfel u l-apparat intestinali immuntat fuq iċ-ċippa.e, Skematika tal-allinjament tal-komponenti PDMS ta' fuq, tal-membrana u t'isfel.Kull saff huwa marbut b'mod irriversibbli permezz ta 'trattament ta' plażma jew korona. kultura taċ-ċelluli idic.L-imsaren fabbrikat fuq ċippa immuntata b'tubu tas-silikonju u siringa tpoġġiet fuq coverslip.L-apparat taċ-ċippa tqiegħed fuq l-għatu ta 'dixx Petri ta' 150 mm għall-ipproċessar.Il-binder jintuża biex jagħlaq it-tubu tas-silikon. ed fiċ-ċippa ibrida biex jinduċi l-morfoġenesi intestinali 3D. Il-medju jiġi mxerred permezz ta’ mikrokanali taħt is-saff taċ-ċelluli stabbilit fuq l-inserzjoni ta’ Transwell.Scale bar, 1 cm.h Stampat mill-ġdid b’permess minn referenza.4.Elsevier.
F'dan il-protokoll, il-linja taċ-ċelluli Caco-2 u l-organoids intestinali ntużaw bħala sorsi epiteljali (Fig. 3a). Iż-żewġ tipi ta 'ċelluli ġew kultivati ​​b'mod indipendenti (Kaxxa 2 u Kaxxa 5) u użati biex iżerrgħu l-mikrokanali miksija bl-ECM ta' imsaren fuq iċ-ċippa jew inserzjonijiet Transwell. 50) fi fliexken T huma maħsuda biex jippreparaw sospensjonijiet ta 'ċelluli dissoċjati permezz ta' fluwidu trypsinization (kaxxa 2).Organoids intestinali umani minn bijopsiji intestinali jew resezzjonijiet kirurġiċi kienu kkultivati ​​f'kopli ta 'scaffold Matrigel fi pjanċi 24-well biex jappoġġjaw il-mikroambjent strutturali. ġie supplimentat kull jum ieħor sakemm l-organoids kibru għal ~500 µm fid-dijametru. Organojdi mkabbra kompletament huma maħsuda u dissoċjati f'ċelloli singoli għaż-żrigħ fuq imsaren jew inserzjonijiet Transwell fuq ċippa (Kaxxa 5). leżjoni kontra żona mhux leża) u post gastrointestinali fil-passaġġ (eż., duwodenu, jejunum, ileum, cecum, kolon, jew rektum). Aħna nipprovdu protokoll ottimizzat f'Kaxxa 5 għall-kultivazzjoni ta 'organoids tal-kolon (kolojdi) li tipikament jeħtieġu konċentrazzjonijiet ogħla ta' morfoġeni minn organoids intestinali żgħar.
a, Fluss tax-xogħol għall-induzzjoni tal-morfoġenesi tal-musrana fiċ-ċippa tal-musrana. L-epitelju intestinali uman u l-organoids intestinali tal-Caco-2 jintużaw f'dan il-protokoll biex juru l-morfoġenesi 3D. Iċ-ċelloli epiteljali iżolati ġew miżrugħa fl-apparat ippreparat tal-musrana fuq ċippa (preparazzjoni taċ-ċippa). Il-fluss iku (AP) jinbeda u jinżamm għall-ewwel jumejn (fluss, AP, D0-D2). Il-fluss bażolaterali (BL) jinbeda wkoll flimkien ma’ movimenti ta’ tiġbid ċikliċi (stretch, fluss, AP u BL) meta jiġi ffurmat monosaff 2D komplut. Morfoġenesi 3D intestinali seħħet b’mod spontanju wara 5 ijiem ta’ kultura rappreżentattiva tal-mikrofluwidi, D 5 ġranet ta’ kultura rappreżentattiva tal-mikrofluwidiċi D 5 rappreżentattivi. kull pass sperimentali jew punt tal-ħin (bar graph, 100 µm). Erba’ dijagrammi skematiki li juru l-kaskati korrispondenti tal-morfoġenesi tal-musrana (fuq il-lemin). saff (lemin).c, Veduta frontali orizzontali ta 'Caco-2 3D stabbiliti, claudin (ZO-1, aħmar) u membrani tal-fruntiera tal-pinzell kontinwu ttikkettjati F-actin (aħdar) u nuklei (blu) Immunofluworexxenza viżwalizzazzjoni confocal ta' ċelluli epiteljali fuq ċipep intestinali.Vleġeġ li tipponta lejn il-pjan ta 'kultura tan-nofs skematiċi jindikaw il-post ta' pjan ta 'kultura fokali tan-nofs. d fuq ċippa miksuba permezz ta 'mikroskopija ta' kuntrast tal-fażi fil-ġranet 3, 7, 9, 11, u 13.L-inset (fuq il-lemin) turi l-ingrandiment għoli tal-immaġni pprovduta.e, fotomikrografu DIC ta 'epitelju 3D organoid stabbilit fl-imsaren fuq porzjon meħud fil-jum 7.f, Markers ta' immunofluworexxenza overlaid għal immaġini ta 'staminali GR5;maġenta), ċelluli goblet (MUC2; aħdar), F-actin (griż) u nuklei (cyan) imkabbra fuq ċipep imsaren għal 3 ijiem, rispettivament (Xellug) u 13-il jum (nofs) organoids fuq is-saff epiteljali. id epitelju stabbilit fl-imsaren fuq ċippa billi tbajja’ l-membrana tal-plażma b’żebgħa CellMask (lemin) fit-13-il jum tal-kultura.Istrixxa tal-iskala hija 50 μm sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor.b Stampat mill-ġdid b’permess minn referenza.2.Oxford University Press;c Adattat bil-permess minn Reference.2.Oxford University Press;e u f adattati b’permess b’referenza.12 Taħt Creative Commons License CC BY 4.0.
Fl-imsaren fuq ċippa, huwa meħtieġ li timmodifika l-wiċċ idrofobiku tal-membrana poruża PDMS għal kisi ECM b'suċċess. F'dan il-protokoll, napplikaw żewġ metodi differenti biex timmodifika l-idrofobiċità tal-membrani PDMS. Kultura idic ta 'epitelju organoid teħtieġ funzjonalizzazzjoni tal-wiċċ ibbażata fuq kimiċi biex tinkiseb depożizzjoni effiċjenti ta' proteini ECM billi tapplika b'mod sekwenzjali polyethyleneimine (PEI) u glutaraldehyde għal mikrokanali PDMS. il-medju fil-mikrokanal ta 'fuq sakemm iċ-ċelloli jiffurmaw monosaff sħiħ, filwaqt li l-mikrokanal t'isfel iżomm kundizzjonijiet statiċi.Dan il-metodu ottimizzat għall-attivazzjoni tal-wiċċ u l-kisi tal-ECM jippermetti t-twaħħil tal-epitelju organoid biex jinduċi 3D morphogenesis fuq il-wiċċ PDMS.
Il-kulturi Transwell jeħtieġu wkoll kisi ECM qabel iż-żrigħ taċ-ċelluli;madankollu, il-kulturi Transwell ma jeħtiġux passi kumplessi ta 'pretrattament biex jattivaw il-wiċċ ta' inserzjonijiet porużi. Għal tkabbir ta 'ċelluli Caco-2 fuq inserzjonijiet Transwell, kisi ECM fuq inserts porużi jaċċellera t-twaħħil ta' ċelluli Caco-2 dissoċjati (<1 siegħa) u formazzjoni ta 'barriera ta' junction stretta (<1-2 ijiem). wiċċ tal-membrana (<3 h) u miżmum sakemm l-organoids jiffurmaw monosaff komplut b'integrità ta 'barriera .Il-kulturi Transwell jitwettqu fi pjanċi ta' 24 bir mingħajr l-użu ta 'ċipep ibridi.
Il-morfoġenesi 3D in vitro tista’ tinbeda billi tiġi applikata fluss ta’ fluwidu għall-aspett basolaterali ta’ saff epiteljali stabbilit.Fl-imsaren fuq ċippa, il-morfoġenesi epiteljali bdiet meta l-medju kien imxerred fil-mikrokanali ta’ fuq u t’isfel (Fig. 3a). nutrijenti u serum maċ-ċelluli marbuta fuq membrani porużi u jiġġeneraw stress shear luminali, aħna tipikament napplikaw fluss doppju fl-imsaren fuq ċippa.Fi ċipep ibridi, inserzjonijiet Transwell li fihom monosaffi epiteljali ġew imdaħħla fiċ-ċipep ibridi. Imbagħad, il-medju ġie applikat taħt in-naħa basolaterali tal-inserzjoni Transwell poruża permezz tal-mikrokanal.
Il-karatteristiċi morfoloġiċi ta 'saffi epiteljali 3D mikro-inġinerija jistgħu jiġu analizzati billi jiġu applikati diversi modalitajiet ta' immaġini, inkluż mikroskopija ta 'kuntrast ta' fażi, mikroskopija ta 'kuntrast ta' interferenza differenzjali (DIC), SEM, jew mikroskopija konfokali immunofluworexxenti (Figuri 3 u 4). e għat-trasparenza ottika tal-PDMS u l-films tal-poliester, kemm il-pjattaformi tal-musrana fuq ċippa kif ukoll taċ-ċippa ibrida jistgħu jipprovdu immaġini in situ f'ħin reali mingħajr il-ħtieġa ta 'sezzjoni jew żarmar tal-apparat. Meta twettaq immaġini ta' immunofluworexxenza (Figuri 1, 3c, f u 4b, c), iċ-ċelluli huma tipikament segwiti minn Trivolde / PF (paraformi) -100 u 2% (wt/vol) ) albumina tas-serum tal-bovini (BSA), fl-ordni.Skond it-tip taċ-ċellula, jistgħu jintużaw fissattivi, permeabilizzaturi u aġenti li jimblokkaw differenti. Antikorpi primarji li jimmiraw markaturi taċ-ċelluli jew tar-reġjun dipendenti fuq in-nisel huma użati biex jenfasizzaw ċelluli immobilizzati in situ fuq iċ-ċippa, segwiti minn antikorpi sekondarji li jimmiraw kontra nukleu, midi-4, 2', midiye'. -phenylene) indole, DAPI) jew F-actin (eż., phalloidin immarkat b'mod fluworexxenti).Immaġini ħajjin ibbażati fuq il-fluworexxenza jistgħu jsiru wkoll in situ biex jinstabu l-produzzjoni tal-mukus (Fig.1, "Differenzjazzjoni taċ-ċelluli" u "Fiżjoloġija tal-imsaren"), kolonizzazzjoni każwali ta 'ċelluli mikrobiċi (Fig. 1, "Kokultura tal-mikrobi tal-ospiti"), ir-reklutaġġ ta' ċelluli immuni (Fig. 1, "Modellar tal-Mard") jew il-kontorni tal-morfoloġija epiteljali 3D (Fig. 3c, il-wiċċ u l-immodifikar tal-wiċċ). saff ta 'mikrokanal t'isfel, kif deskritt f'ref.Kif muri f'Fig. 2, il-morfoloġija epiteljali 3D kif ukoll il-microvilli fuq il-fruntiera tal-pinzell apikali jistgħu jiġu viżwalizzati permezz ta 'SEM (Fig. 3b). vestita minn tripsinizzazzjoni u mbagħad użata għal analiżi molekulari jew ġenetika.
a, Fluss tax-xogħol għall-induzzjoni ta 'morfoġenesi intestinali f'ċippa ibrida.Caco-2 u organoids intestinali huma użati f'dan il-protokoll biex juru morfoġenesi 3D f'pjattaforma ta' ċippa ibrida.Ċelloli epiteljali dissoċjati ġew miżrugħa f'inserzjonijiet Transwell ippreparati (preparazzjoni TW; ara l-figura hawn taħt).Ladarba ċ-ċelluli ġew miżrugħa (minn iż-żerriegħa) u twaħħlu f'kundizzjonijiet ta 'membrana transstatika, imwaħħla ma' ċelluli transstatiċi. Kultura W).Wara 7 ijiem, inserzjoni Transwell waħda li fiha monosaff 2D ta 'ċelluli epiteljali ġiet integrata f'ċippa ibrida biex tintroduċi fluss basolaterali (Flow, BL), li finalment wassal għall-ġenerazzjoni ta' saff epiteljali 3D (morfoġenesi). .L-skematiċi fis-saffi ta 'fuq juru l-konfigurazzjoni sperimentali għal kull pass.b, Ċipep ibridi (skematiku tax-xellug) jistgħu jwasslu għal morfogeneżi 3D ta' ċelloli epiteljali organoid b'veduti ta 'mikroskopija konfokali minn fuq għal isfel meħuda f'pożizzjonijiet Z differenti (fuq, nofs, u t'isfel;ara skematika tal-lemin u linji bit-tikek korrispondenti).urew karatteristiċi morfoloġiċi ovvji. rokna tal-lemin ta' fuq; “XZ”) juru wkoll karatteristiċi 2D u 3D.Bar tal-iskala, 100 µm.c Stampat mill-ġdid bil-permess mir-referenza.4.Elsevier.
Il-kontrolli jistgħu jiġu ppreparati billi jiġu kkultivati ​​l-istess ċelluli (Caco-2 jew ċelluli epiteljali organoid intestinali) f'monosaffi bidimensjonali taħt kundizzjonijiet ta 'kultura statika konvenzjonali. Notevolment, it-tnaqqis tan-nutrijenti jista' jirriżulta minħabba l-kapaċità ta 'volum limitat tal-mikrokanali (jiġifieri ~ 4 µL fil-kanal ta' fuq fuq id-disinn oriġinali taċ-ċippa tal-musrana).
Il-proċess tal-litografija ratba għandu jitwettaq f'kamra nadifa. Għal kull saff fuq iċ-ċippa (saffi ta 'fuq u t'isfel u membrani) u ċipep ibridi, intużaw fotomasks differenti u ġew iffabbrikati fuq wejfers tas-silikon separati minħabba li l-għoli tal-mikrokanali kienu differenti. µm.
Poġġi wejfer tas-silikon ta '3 pulzieri f'dixx bl-aċetun.Dawwar bil-mod il-pjanċa għal 30 sekonda, imbagħad nixxef il-wejfer bl-arja. Ittrasferixxi l-wejfer għal pjanċa bl-IPA, imbagħad dawwar il-pjanċa għal 30 s biex tnaddaf.
Soluzzjoni ta 'piranha (taħlita ta' perossidu ta 'l-idroġenu u aċidu sulfuriku ikkonċentrat, 1:3 (vol/vol)) tista' tintuża b'mod fakultattiv biex timmassimizza t-tneħħija ta 'residwi organiċi mill-wiċċ tal-wejfer tas-silikon.
Is-soluzzjoni Piranha hija estremament korrużiva u tiġġenera s-sħana. Prekawzjonijiet ta' sigurtà addizzjonali huma meħtieġa.Għar-rimi tal-iskart, ħalli s-soluzzjoni tiksaħ u ttrasferixxi f'kontenitur tal-iskart nadif u niexef.Uża kontenituri sekondarji u ttikkettja sew il-kontenituri tal-iskart. Jekk jogħġbok segwi l-linji gwida tas-sikurezza tal-faċilità għal proċeduri aktar dettaljati.
Iddeidrat il-wejfers billi tpoġġihom fuq hot plate ta '200 °C għal 10 min.Wara d-deidrazzjoni, il-wejfer tħawwad ħames darbiet fl-arja biex tiksaħ.
Ferra ~ 10 g ta 'photoresist SU-8 2100 fuq iċ-ċentru tal-wafer tas-silikon imnaddaf.Uża pinzetta biex tifrex il-fotoreżist b'mod uniformi fuq il-wejfer.Okkażjonalment poġġi l-wejfer fuq hot plate ta' 65°C biex tagħmel il-fotoreżist inqas iwaħħal u aktar faċli biex tinfirex.Tpoġġix il-wejfer direttament fuq il-hot plate.
SU-8 tqassam b'mod uniformi fuq il-wejfer billi tħaddem il-kisi tal-ispin. Ipprogramma rotazzjoni deħlin tas-SU-8 għal 5-10 s biex tippropaga f'500 rpm b'aċċelerazzjoni ta' 100 rpm/s. Issettja l-ispin prinċipali għal disinn ta' ħxuna ta' 200 µm f'1,500 rpm, jew tikseb għoli ta' ħxuna ta' µm 0 0 50 µm yer tal-imsaren fuq iċ-ċippa; ara “Passi kritiċi” hawn taħt) issettjat f’aċċelerazzjoni ta’ 300 rpm/s 30 sekonda f’1,200 rpm.
Il-veloċità ewlenija tal-ispin tista 'tiġi aġġustata skont il-ħxuna fil-mira tal-mudell SU-8 fuq il-wejfer tas-silikon.
Biex jiġu ffabbrikati mudelli SU-8 ta’ għoli ta’ 500 µm għas-saff ta’ fuq tal-imsaren fuq iċ-ċippa, il-kisi tal-ispin u l-passi artab tal-bake ta’ din il-Kaxxa (passi 7 u 8) ġew ripetuti b’mod sekwenzjali (ara l-pass 9) biex jipproduċu żewġ saffi ta’ 250 µm Saff oħxon ta’ SU-8, li jista’ jiġi mgħaqqad b’saffi ta’ espożizzjoni µ0 µ0 µ0 f’saff ta’ µ0 µm2. .
Aħmi artab il-wejfers miksija SU-8 billi tpoġġi bir-reqqa l-wejfers fuq hot plate f'65 °C għal 5 min, imbagħad jaqleb is-setting għal 95 °C u inkuba għal 40 min addizzjonali.
Biex tikseb għoli ta '500 μm tal-mudell SU-8 fil-mikrokanal ta' fuq, irrepeti l-passi 7 u 8 biex tiġġenera żewġ saffi SU-8 ħoxnin ta '250 μm.
Uża l-UV Mask Aligner, wettaq test tal-lampa skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tikkalkula l-ħin tal-espożizzjoni tal-wejfer. (ħin tal-espożizzjoni, ms) = (doża tal-espożizzjoni, mJ/cm2)/(qawwa tal-lampa, mW/cm2).
Wara li tiddetermina l-ħin tal-espożizzjoni, poġġi l-fotomaskra fuq id-detentur tal-maskra tal-aligner tal-maskra UV u poġġi l-fotomaskra fuq il-wejfer miksi SU-8.
Poġġi l-wiċċ stampat tal-fotomask direttament fuq in-naħa miksija SU-8 tal-wejfer tas-silikon biex timminimizza d-dispersjoni tal-UV.
Esponi l-wejfer miksi SU-8 u l-fotomask vertikalment għal 260 mJ/cm2 ta 'dawl UV għall-ħin ta' espożizzjoni predeterminat (ara l-pass 10 ta 'din il-kaxxa).
Wara l-espożizzjoni UV, wejfers tas-silikon miksijin b'SU-8 ġew moħmija f'65 ° C għal 5 min u 95 ° C għal 15 min fuq kull hot plate biex jiffabbrikaw mudelli b'għoli ta '200 μm. Estendi l-ħin ta' wara l-bake f'95 °C sa 30 min biex jiffabbrika mudelli b'għoli ta '500 μm.
L-iżviluppatur jitferra ġo dixx tal-ħġieġ, u l-wejfer moħmi jitqiegħed fid-dixx. Il-volum ta 'żviluppatur Su-8 jista' jvarja skont id-daqs tal-pjanċa tal-ħġieġ. Tagħti żgur li tuża biżżejjed żviluppatur Su-8 biex tneħħi kompletament Su-8.Far.
Laħlaħ il-moffa żviluppata b'~10 mL ta' żviluppatur frisk segwit minn IPA billi sprejja s-soluzzjoni bl-użu ta' pipetta.
Poġġi l-wejfer fi cleaner tal-plażma u esponi għall-plażma tal-ossiġnu (gass atmosferiku, pressjoni fil-mira 1 × 10-5 Torr, qawwa 125 W) għal 1.5 min.
Poġġi l-wejfer f'dessikatur vakwu bi slide tal-ħġieġ ġewwa.Wafers u slides jistgħu jitqiegħdu ħdejn xulxin.Jekk id-dessikatur tal-vakwu huwa maqsum f'diversi saffi bi pjanċa, poġġi l-pjastri fil-kamra t'isfel u l-wejfers fil-kamra ta 'fuq. Waqqa' 100 μL ta 'trichloro(1H, 1H, 100 μL ta' trichloro(1H, 1H, 12) soluzzjoni tal-ħġieġ u applika vakwu għas-silanizzazzjoni.
Ħoll kunjett ta' ċelluli Caco-2 iffriżati f'banju ta' l-ilma ta' 37°C, imbagħad ittrasferixxi ċ-ċelluli maħlula għal flixkun T75 li jkun fih 15 mL ta' medium Caco-2 imsaħħan minn qabel f'37°C.
Biex tgħaddi ċ-ċelloli Caco-2 f'konfluwenza ta '~90%, l-ewwel sħun Caco-2 medium, PBS, u 0.25% trypsin/1 mM EDTA f'banju ta' l-ilma ta '37 ° C.
Aspira l-medium b'aspirazzjoni bil-vakwu. Aħsel iċ-ċelloli darbtejn b'5 mL ta' PBS sħun billi rrepeti l-aspirazzjoni bil-vakwu u żżid PBS frisk.