Xi suġġetti dwar is-soluzzjoni tal-problemi tal-LC qatt ma jkunu skaduti, peress li jkun hemm kwistjonijiet fil-prattika tal-LC, anke hekk kif it-teknoloġija tal-istrumenti titjieb maż-żmien. Hemm ħafna modi kif jistgħu jinqalgħu problemi f'sistema LC u jispiċċaw f'forma ħażina tal-quċċata. Meta jinqalgħu kwistjonijiet relatati mal-forma tal-quċċata, lista qasira ta' kawżi possibbli għal dawn ir-riżultati tgħin biex tissimplifika l-esperjenza tagħna għas-soluzzjoni tal-problemi.
Kien pjaċevoli li nikteb din il-kolonna “LC Solutioning” u naħseb dwar suġġetti kull xahar, għax xi suġġetti qatt ma joħorġu mill-moda. Filwaqt li fil-qasam tar-riċerka tal-kromatografija ċerti suġġetti jew ideat isiru skaduti hekk kif jiġu sostitwiti b'ideat ġodda u aħjar, fil-qasam tas-soluzzjoni tal-problemi, minn mindu deher l-ewwel artiklu dwar is-soluzzjoni tal-problemi f'dan il-ġurnal (il-LC Journal dak iż-żmien) peress li xi suġġetti għadhom rilevanti) fl-1983(1). Matul l-aħħar ftit snin, iffokajt diversi taqsimiet dwar is-soluzzjoni tal-problemi tal-LC fuq xejriet kontemporanji li jaffettwaw il-kromatografija likwida (LC) (pereżempju, it-tqabbil relattiv tal-fehim tagħna tal-effett tal-pressjoni fuq iż-żamma [2] Avvanzi Ġodda) L-interpretazzjoni tagħna tar-riżultati tal-LC u kif issolvi l-problemi bi strumenti LC moderni. Fil-parti ta' dan ix-xahar, qed inkompli s-serje tiegħi (3), li bdiet f'Diċembru 2021, li ffokat fuq xi wħud mis-suġġetti tal-“ħajja u l-mewt” tas-soluzzjoni tal-problemi tal-LC - elementi li huma tajbin għal kwalunkwe persuna li ssolvi l-problemi huma essenzjali, irrispettivament mill-età tas-sistema li qed nużaw. Is-suġġett ewlieni ta' din is-serje huwa rilevanti ħafna għaċ-ċart tal-ħajt famuża “LC Solutioning Guide” tal-LCGC (4) mdendlin f'ħafna laboratorji. Għat-tielet parti ta' din is-sensiela, għażilt li niffoka fuq kwistjonijiet relatati mal-forma tal-quċċata jew il-karatteristiċi tal-quċċata. Inkredibbilment, iċ-ċart tal-ħajt telenka 44 kawża potenzjali differenti ta' forma ħażina tal-quċċata! Ma nistgħux nikkunsidraw dawn il-kwistjonijiet kollha fid-dettall f'artiklu wieħed, għalhekk f'din l-ewwel parti dwar is-suġġett, se niffoka fuq xi wħud minn dawk li nara l-aktar spiss. Nittama li l-utenti żgħar u kbar tal-LC isibu xi pariri u tfakkiriet utli dwar dan is-suġġett importanti.
Qed insib ruħi dejjem aktar inwieġeb mistoqsijiet dwar is-soluzzjoni tal-problemi b’“kollox huwa possibbli”. Din it-tweġiba tista’ tidher faċli meta nikkunsidraw osservazzjonijiet li huma diffiċli biex jiġu interpretati, iżda spiss insibha xierqa. B’ħafna kawżi possibbli ta’ forma ħażina tal-qċaċet, huwa importanti li wieħed iżomm moħħu miftuħ meta jikkunsidra x’tista’ tkun il-problema, u li jkun jista’ jipprijoritizza l-kawżi potenzjali biex jibda l-isforzi tagħna għas-soluzzjoni tal-problemi, billi niffokaw fuq dawk il-possibbiltajiet l-aktar komuni, dan il-punt huwa importanti ħafna.
Pass ewlieni fi kwalunkwe eżerċizzju ta' soluzzjoni ta' problemi — iżda wieħed li naħseb li huwa sottovalutat — huwa li nirrikonoxxu li hemm problema li teħtieġ soluzzjoni. Li nirrikonoxxu li hemm problema spiss ifisser li nirrikonoxxu li dak li jiġri lill-għodda huwa differenti mill-aspettattivi tagħna, li huma ffurmati mit-teorija, l-għarfien empiriku, u l-esperjenza (5). Il-"forma tal-quċċata" msemmija hawnhekk fil-fatt tirreferi mhux biss għall-forma tal-quċċata (simmetrika, asimmetrika, lixxa, ratba, tarf ta' quddiem, denb, eċċ.), iżda wkoll għall-wisa'. L-aspettattivi tagħna għall-forma attwali tal-quċċata huma sempliċi. It-teorija (6) tappoġġja sew l-aspettattiva tat-test li, fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, il-qċaċet kromatografiċi għandhom ikunu simmetriċi u jikkonformaw mal-forma ta' distribuzzjoni Gaussjana, kif muri fil-Figura 1a. Dak li nistennew mill-wisa' tal-qċaċet hija kwistjoni aktar kumplessa, u se niddiskutu dan is-suġġett f'artiklu futur. Il-forom l-oħra tal-qċaċet fil-Figura 1 juru xi wħud mill-possibbiltajiet l-oħra li jistgħu jiġu osservati — fi kliem ieħor, xi wħud mill-modi kif l-affarijiet jistgħu jmorru ħażin. Fil-bqija ta' din il-parti, se nqattgħu ħin niddiskutu xi eżempji speċifiċi ta' sitwazzjonijiet li jistgħu jwasslu għal dawn tipi ta’ forom.
Xi kultant il-qċaċet ma jiġux osservati fil-kromatogramma fejn huwa mistenni li jiġu elużi. Iċ-ċart tal-ħajt ta’ hawn fuq tindika li n-nuqqas ta’ qċaċet (jekk wieħed jassumi li l-kampjun fil-fatt fih l-analit fil-mira f’konċentrazzjoni li għandha tagħmel ir-rispons tad-ditekter suffiċjenti biex jarah ’il fuq mill-istorbju) ġeneralment ikun relatat ma’ xi problema bl-istrument jew kundizzjonijiet mhux korretti tal-fażi mobbli (jekk jiġu osservati). qċaċet, ġeneralment “dgħajfa” wisq. Lista qasira ta’ problemi potenzjali u soluzzjonijiet f’din il-kategorija tista’ tinstab fit-Tabella I.
Kif imsemmi hawn fuq, il-kwistjoni ta' kemm għandu jiġi tollerat it-twessigħ tal-qċaċet qabel ma tingħata attenzjoni u tipprova tirranġah hija suġġett kumpless li se niddiskuti f'artiklu futur. L-esperjenza tiegħi hija li t-twessigħ sinifikanti tal-qċaċet ħafna drabi jkun akkumpanjat minn bidla sinifikanti fil-forma tal-qċaċet, u t-tqattigħ tal-qċaċet huwa aktar komuni milli qabel il-qċaċet jew it-tqattigħ. Madankollu, il-qċaċet nominalment simmetriċi jitwessgħu wkoll, li jista' jkun ikkawżat minn ftit raġunijiet differenti:
Kull waħda minn dawn il-kwistjonijiet ġiet diskussa fid-dettall f'ħarġiet preċedenti ta' Troubleshooting LC, u l-qarrejja interessati f'dawn is-suġġetti jistgħu jirreferu għal dawn l-artikoli preċedenti għal informazzjoni dwar il-kawżi ewlenin u s-soluzzjonijiet potenzjali għal dawn il-kwistjonijiet. Aktar dettalji.
Id-denb tal-quċċata, il-front tal-quċċata, u t-tqattigħ jistgħu kollha jkunu kkawżati minn fenomeni kimiċi jew fiżiċi, u l-lista ta’ soluzzjonijiet potenzjali għal dawn il-problemi tvarja ħafna, skont jekk inkunux qed nittrattaw problema kimika jew fiżika. Spiss, billi tqabbel il-quċċata differenti fi kromatogramma, tista’ ssib indikazzjonijiet importanti dwar liema hu l-ħati. Jekk il-quċċata kollha fi kromatogramma juru forom simili, il-kawża x’aktarx mhix fiżika. Jekk quċċata waħda biss jew ftit quċċata huma affettwati, iżda l-bqija jidhru tajbin, il-kawża x’aktarx hija kimika.
Il-kawżi kimiċi tat-telf tal-qċaċet huma kumplessi wisq biex jiġu diskussi fil-qosor hawnhekk. Il-qarrej interessat huwa riferut għall-ħarġa reċenti ta' "LC Troubleshooting" għal diskussjoni aktar fil-fond (10). Madankollu, ħaġa faċli li wieħed jipprova hija li jnaqqas il-massa tal-analit injettat u jara jekk il-forma tal-qċaċet titjiebx. Jekk iva, allura dan huwa indikazzjoni tajba li l-problema hija "tagħbija żejda tal-massa". F'dan il-każ, il-metodu għandu jkun limitat għall-injezzjoni ta' mases żgħar ta' analiti, jew il-kundizzjonijiet kromatografiċi għandhom jinbidlu sabiex forom tajbin tal-qċaċet ikunu jistgħu jinkisbu anke b'mases akbar injettati.
Hemm ukoll ħafna raġunijiet fiżiċi potenzjali għad-denb tal-quċċata. Qarrejja interessati f'diskussjoni dettaljata tal-possibbiltajiet huma riferuti għal ħarġa reċenti oħra ta' "LC Soluzzjoni ta' Problemi" (11). Waħda mill-kawżi fiżiċi aktar komuni tad-denb tal-quċċata hija konnessjoni fqira f'punt bejn l-injettur u d-ditekter (12). Eżempju estrem huwa muri fil-Figura 1d, miksub fil-laboratorju tiegħi ftit ġimgħat ilu. F'dan il-każ, bnejna sistema b'valv ta' injezzjoni ġdid li ma konniex użajna qabel, u installajna linja ta' injezzjoni ta' volum żgħir b'ferrule li kienet ġiet iffurmata fuq kapillari tal-istainless steel. Wara xi esperimenti inizjali għas-soluzzjoni tal-problemi, indunajna li l-fond tal-port fl-istator tal-valv ta' injezzjoni kien ħafna aktar fond milli konna mdorrijin bih, li rriżulta f'volum mejjet kbir fil-qiegħ tal-port. Din il-problema tissolva faċilment billi nissostitwixxu l-linja ta' injezzjoni b'tubu ieħor, nistgħu naġġustaw il-ferrule għall-pożizzjoni xierqa biex neliminaw il-volum mejjet fil-qiegħ tal-port.
Fronti tal-qċaċet bħal dawk murija fil-Figura 1e jistgħu wkoll ikunu kkawżati minn problemi fiżiċi jew kimiċi. Kawża fiżika komuni tat-tarf ta' quddiem hija li s-sodda tal-partiċelli tal-kolonna mhix ippakkjata sew, jew li l-partiċelli jkunu ġew riorganizzati maż-żmien. Bħal fil-każ tat-tailing tal-qċaċet ikkawżat minn dan il-fenomenu fiżiku, l-aħjar mod biex dan jiġi rranġat huwa li l-kolonna tiġi sostitwita u tibqa' għaddej. Fundamentalment, il-forom tal-qċaċet tat-tarf ta' quddiem b'oriġini kimika spiss jinqalgħu minn dak li nsejħu kundizzjonijiet ta' żamma "mhux lineari". Taħt kundizzjonijiet ideali (lineari), l-ammont ta' analit miżmum mill-fażi stazzjonarja (għalhekk, il-fattur ta' żamma) huwa relatat b'mod lineari mal-konċentrazzjoni tal-analit fil-kolonna. Kromatografikament, dan ifisser li hekk kif il-massa tal-analit injettata fil-kolonna tiżdied, il-qċaċet issir itwal, iżda mhux usa'. Din ir-relazzjoni tinkiser meta l-imġiba taż-żamma tkun mhux lineari, u l-qċaċet mhux biss isiru itwal iżda wkoll usa' hekk kif tiġi injettata aktar massa. Barra minn hekk, forom mhux lineari jiddeterminaw il-forma tal-qċaċet kromatografiċi, li jirriżultaw fi truf ta' quddiem jew ta' wara. Bħal fil-każ ta' tagħbija żejda tal-massa li tikkawża t-tailing tal-qċaċet (10), il-qċaċet It-tarf ewlieni kkawżat minn żamma mhux lineari jista' jiġi djanjostikat ukoll billi titnaqqas il-massa tal-analit injettat. Jekk il-forma tal-quċċata titjieb, il-metodu jrid jiġi modifikat biex ma jaqbiżx il-kwalità tal-injezzjoni li tikkawża t-tarf ewlieni, jew il-kundizzjonijiet kromatografiċi jridu jinbidlu biex jiġi minimizzat dan l-imġiba.
Xi kultant nosservaw dak li jidher li hu quċċata "maqsuma", kif muri fil-Figura 1f. L-ewwel pass biex tissolva din il-problema huwa li jiġi determinat jekk il-forma tal-quċċata hijiex dovuta għal ko-elużjoni parzjali (jiġifieri, il-preżenza ta' żewġ komposti distinti iżda li jeluwixxu mill-qrib). Jekk fil-fatt hemm żewġ analiti differenti li jeluwixxu qrib xulxin, allura hija kwistjoni li tittejjeb ir-riżoluzzjoni tagħhom (pereżempju, billi tiżdied is-selettività, iż-żamma, jew l-għadd tal-pjanċi), u l-qċaċet "maqsuma" apparenti huma relatati mal-prestazzjoni fiżika. Il-prestazzjoni m'għandha x'taqsam xejn mal-kolonna nnifisha. Ħafna drabi, l-aktar ħjiel importanti għal din id-deċiżjoni huwa jekk il-qċaċet kollha fil-kromatogramma jurux forom maqsuma, jew waħda jew tnejn biss. Jekk hija waħda jew tnejn biss, probabbilment hija kwistjoni ta' ko-elużjoni; jekk il-qċaċet kollha huma maqsuma, probabbilment hija kwistjoni fiżika, x'aktarx relatata mal-kolonna nnifisha.
Il-qċaċet maqsuma relatati mal-proprjetajiet fiżiċi tal-kolonna nnifisha ġeneralment ikunu dovuti għal frits tad-dħul jew tal-ħruġ parzjalment imblukkati, jew riorganizzazzjoni tal-partiċelli fil-kolonna, li jippermettu li l-fażi mobbli tiċċirkola aktar malajr mill-fażi mobbli f'ċerti żoni tal-formazzjoni tal-kanal tal-kolonna f'reġjuni oħra (11). Frit parzjalment imblukkat xi kultant jista' jitnaddaf billi jitreġġa' lura l-fluss mill-kolonna; madankollu, fl-esperjenza tiegħi, din ġeneralment hija soluzzjoni għal żmien qasir aktar milli fit-tul. Dan ħafna drabi jkun fatali bil-kolonni moderni jekk il-partiċelli jerġgħu jingħaqdu fil-kolonna. F'dan il-punt, l-aħjar li l-kolonna tiġi sostitwita u tkompli.
Il-quċċata fil-Figura 1g, ukoll minn każ reċenti fil-laboratorju tiegħi stess, ġeneralment tindika li s-sinjal huwa tant għoli li laħaq it-tarf għoli tal-medda ta' rispons. Għal ditekters tal-assorbenza ottika (UV-vis f'dan il-każ), meta l-konċentrazzjoni tal-analit tkun għolja ħafna, l-analit jassorbi l-biċċa l-kbira tad-dawl li jgħaddi miċ-ċellula tal-fluss tad-ditekter, u jħalli ftit li xejn dawl x'jinstab. Taħt dawn il-kundizzjonijiet, is-sinjal elettriku mill-fotoditekter huwa influwenzat ħafna minn diversi sorsi ta' storbju, bħal dawl mitluf u "kurrent skur", li jagħmel is-sinjal "imċajpar" ħafna fid-dehra u indipendenti mill-konċentrazzjoni tal-analit. Meta jiġri dan, il-problema spiss tista' tiġi solvuta faċilment billi jitnaqqas il-volum tal-injezzjoni tal-analit—tnaqqis tal-volum tal-injezzjoni, dilwizzjoni tal-kampjun, jew it-tnejn.
Fl-iskola tal-kromatografija, nużaw is-sinjal tad-ditekter (jiġifieri, l-assi y fil-kromatogramma) bħala indikatur tal-konċentrazzjoni tal-analit fil-kampjun. Għalhekk jidher stramb li tara kromatogramma b'sinjal taħt iż-żero, peress li l-interpretazzjoni sempliċi hija li dan jindika konċentrazzjoni negattiva tal-analit – li naturalment mhijiex fiżikament possibbli. Fl-esperjenza tiegħi, il-qċaċet negattivi jiġu osservati l-aktar meta jintużaw ditekters tal-assorbenza ottika (eż., UV-vis).
F'dan il-każ, quċċata negattiva sempliċement tfisser li l-molekuli li joħorġu mill-kolonna jassorbu inqas dawl mill-fażi mobbli nnifisha immedjatament qabel u wara l-quċċata. Dan jista' jseħħ, pereżempju, meta jintużaw wavelengths ta' skoperta relattivament baxxi (<230 nm) u addittivi tal-fażi mobbli li jassorbu l-biċċa l-kbira tad-dawl f'dawn it-wavelengths. Addittivi bħal dawn jistgħu jkunu komponenti tas-solvent tal-fażi mobbli bħal metanol jew komponenti buffer bħal aċetat jew format. Wieħed jista' fil-fatt juża qċaċet negattivi biex jipprepara kurva ta' kalibrazzjoni u jikseb informazzjoni kwantitattiva preċiża, għalhekk m'hemm l-ebda raġuni fundamentali biex jiġu evitati fihom infushom (dan il-metodu xi kultant jissejjaħ "skoperta UV indiretta") (13). Madankollu, jekk verament irridu nevitaw qċaċet negattivi għal kollox, fil-każ ta' skoperta ta' assorbenza, l-aħjar soluzzjoni hija li nużaw wavelength ta' skoperta differenti sabiex l-analit jassorbi aktar mill-fażi mobbli, jew nibdlu l-kompożizzjoni tal-fażi mobbli sabiex Jassorbu inqas dawl mill-analiti.
Qċaċet negattivi jistgħu jidhru wkoll meta tintuża skoperta tal-indiċi refrattiv (RI) meta l-indiċi refrattiv ta' komponenti għajr l-analit fil-kampjun, bħall-matriċi tas-solvent, ikun differenti mill-indiċi refrattiv tal-fażi mobbli. Dan jiġri wkoll bid-detezzjoni UV-vis, iżda dan l-effett għandu t-tendenza li jitnaqqas meta mqabbel mad-detezzjoni RI. Fiż-żewġ każijiet, il-qċaċet negattivi jistgħu jiġu minimizzati billi l-kompożizzjoni tal-matriċi tal-kampjun titqabbel aktar ma' dik tal-fażi mobbli.
Fit-tielet parti dwar is-suġġett bażiku tas-soluzzjoni tal-problemi tal-LC, iddiskutejt sitwazzjonijiet fejn il-forma tal-quċċata osservata hija differenti mill-forma tal-quċċata mistennija jew normali. Is-soluzzjoni effettiva ta' problemi bħal dawn tibda bl-għarfien tal-forom tal-quċċata mistennija (ibbażati fuq it-teorija jew esperjenza preċedenti b'metodi eżistenti), għalhekk id-devjazzjonijiet minn dawn l-aspettattivi huma ovvji. Il-problemi tal-forma tal-quċċata għandhom ħafna kawżi potenzjali differenti (wiesgħa wisq, denb, tarf ta' quddiem, eċċ.). F'din il-parti, niddiskuti fid-dettall xi wħud mir-raġunijiet li nara l-aktar spiss. Li tkun taf dawn id-dettalji jipprovdi post tajjeb fejn tibda s-soluzzjoni tal-problemi, iżda ma jaqbadx il-possibbiltajiet kollha. Qarrejja interessati f'lista aktar dettaljata ta' kawżi u soluzzjonijiet jistgħu jirreferu għaċ-ċart tal-ħajt "Gwida għas-Soluzzjoni tal-Problemi tal-LC" tal-LCGC.
(4) Ċart tal-ħajt “Gwida għas-Soluzzjoni tal-Problemi LC” tal-LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiżi tad-Data u l-Ipproċessar tas-Sinjali fil-Kromatografija (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF u Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.