Xi suġġetti għas-soluzzjoni tal-problemi tal-LC qatt ma huma skaduti, peress li hemm kwistjonijiet fil-prattika tal-LC, anke meta t-teknoloġija tal-istrumenti titjieb maż-żmien. Hemm ħafna modi li bihom il-problemi jistgħu jinqalgħu f'sistema LC u jispiċċaw f'forma ta 'quċċata fqira. Meta jinqalgħu kwistjonijiet relatati mal-forma tal-quċċata, lista qasira ta' kawżi possibbli għal dawn ir-riżultati tgħin biex tissimplifika l-esperjenza tagħna ta 'soluzzjoni tal-problemi.
Kien pjaċevoli nikteb din il-kolonna “LC Troubleshooting” u taħseb dwar suġġetti kull xahar, għax xi suġġetti qatt ma jispiċċaw barra. Iffukajt diversi LC Troubleshooting sezzjonijiet fuq tendenzi kontemporanji li jaffettwaw il-kromatografija likwida (LC) (per eżempju, it-tqabbil relattiv tal-fehim tagħna tal-effett tal-pressjoni fuq iż-żamma [2] New Advances) L-interpretazzjoni tagħna tar-riżultati tal-LC u kif issolvi l-problemi bi strumenti LC moderni. issolvi l-problemi — elementi li huma tajbin għal kwalunkwe troubleshooter huma essenzjali, irrispettivament mill-età tas-sistema li qed nużaw. Is-suġġett ewlieni ta 'din is-serje huwa rilevanti ħafna għall-famuża "LC Troubleshooting Guide" tal-ħajt chart tal-LCGC (4) mdendlin f'ħafna laboratorji. dawn il-kwistjonijiet kollha fid-dettall f'artikolu wieħed, għalhekk f'dan l-ewwel pagament fuq is-suġġett, ser niffoka fuq xi wħud minn dawk li nara l-aktar spiss. Nispera li l-utenti LC żgħażagħ u xjuħ isibu xi suġġerimenti u tfakkiriet utli dwar dan is-suġġett importanti.
Insib lili nnifsi dejjem aktar inwieġeb mistoqsijiet dwar is-soluzzjoni tal-problemi b’“xi ħaġa possibbli”. Din ir-risposta tista’ tidher faċli meta nikkunsidra osservazzjonijiet li huma diffiċli biex jiġu interpretati, iżda spiss insibha xierqa.
Pass ewlieni fi kwalunkwe eżerċizzju ta’ soluzzjoni tal-problemi - iżda wieħed li naħseb li huwa sottovalutat - huwa li tagħraf li hemm problema li trid tiġi solvuta. Li tagħraf li hemm problema spiss ifisser li nagħrfu li dak li jiġri mill-għodda huwa differenti mill-aspettattivi tagħna, li huma ffurmati mit-teorija, l-għarfien empiriku, u l-esperjenza (5). , fluffy, lead edge, tailing, eċċ.), iżda wkoll għall-wisa '.L-aspettattivi tagħna għall-forma tal-quċċata attwali huma sempliċi.It-teorija (6) tappoġġja tajjeb l-aspettattiva tal-ktieb li, f'ħafna każijiet, il-qċaċet kromatografiċi għandhom ikunu simmetriċi u jikkonformaw mal-forma ta 'distribuzzjoni Gaussjana, kif muri fil-Figura 1a.Dak li nistennew minn din il-kwistjoni tal-quċċata fil-futur se niddiskutu forma aktar kumplessa. fil-Figura 1 juru xi wħud mill-possibbiltajiet l-oħra li jistgħu jiġu osservati—fi kliem ieħor, xi wħud mill-modi kif l-affarijiet jistgħu jmorru ħażin. Fil-bqija ta 'dan il-pagament, aħna ser nqattgħu ħin niddiskutu xi eżempji speċifiċi ta' sitwazzjonijiet li jistgħu jwasslu għal dawn it-tipi ta 'forom.
Xi drabi l-qċaċet ma jiġu osservati xejn fil-kromatogramma fejn huma mistennija li jiġu elużi.Iċ-ċart tal-ħajt ta 'hawn fuq tindika li n-nuqqas ta' quċċata (jekk wieħed jassumi li l-kampjun fil-fatt ikun fih l-analite fil-mira f'konċentrazzjoni li għandha tagħmel ir-rispons tad-ditekter biżżejjed biex taraha 'l fuq mill-istorbju) hija normalment relatata ma' xi kwistjoni ta 'strument jew kundizzjonijiet ta' fażi mobbli mhux korretti (jekk osservati).qċaċet, ġeneralment “dgħajfa wisq”). Lista qasira ta’ problemi potenzjali u soluzzjonijiet f’din il-kategorija tista’ tinstab fit-Tabella I.
Kif imsemmi hawn fuq, il-kwistjoni ta 'kemm peak twessigħ għandu jkun ittollerat qabel ma tagħti attenzjoni u nipprova nirranġa hija suġġett kumpless li ser niddiskuti f'artiklu futur.
Kull waħda minn dawn il-kwistjonijiet ġiet diskussa fid-dettall fi kwistjonijiet preċedenti ta 'Tubleshooting LC, u l-qarrejja interessati f'dawn is-suġġetti jistgħu jirreferu għal dawn l-artikoli preċedenti għal informazzjoni dwar il-kawżi ewlenin u soluzzjonijiet potenzjali għal dawn il-kwistjonijiet.Iktar dettalji.
Peak tailing, peak fronting, u qsim kollha jistgħu jiġu kkawżati minn fenomeni kimiċi jew fiżiċi, u l-lista ta 'soluzzjonijiet potenzjali għal dawn il-problemi tvarja ħafna, skond jekk aħniex qed nittrattaw ma' problema kimika jew fiżika. Ħafna drabi, billi tqabbel il-qċaċet differenti fi kromatogramma, tista 'ssib ħjiel importanti dwar liema hija l-ħati. quċċata waħda biss jew ftit huma affettwati, iżda l-bqija jidhru sew, il-kawża hija x'aktarx kimika.
Il-kawżi kimiċi tal-peak tailing huma kumplessi wisq biex jiddiskutu fil-qosor hawn. Il-qarrej interessat huwa riferut għall-ħarġa reċenti ta '"LC Troubleshooting" għal diskussjoni aktar fil-fond (10).Madankollu, ħaġa faċli li tipprova hija li tnaqqas il-massa tal-analite injettat u tara jekk il-forma tal-quċċata titjiebx. ingaġġ ta’ mases żgħar ta’ analiti, jew il-kundizzjonijiet kromatografiċi għandhom jinbidlu sabiex ikunu jistgħu jinkisbu forom ta’ quċċata tajba anke b’mases akbar injettati.
Hemm ukoll ħafna raġunijiet fiżiċi potenzjali għal peak tailing. Qarrejja interessati f'diskussjoni dettaljata tal-possibbiltajiet huma riferuti għal ħarġa reċenti oħra ta '"LC Troubleshooting" (11). Waħda mill-kawżi fiżiċi aktar komuni ta' peak tailing hija konnessjoni fqira f'punt bejn l-injettur u d-ditekter (12). ma kienx użat qabel, u installat linja ta 'injezzjoni ta' volum żgħir b'ferrule li kienet iffurmata fuq kapillari ta 'l-istainless steel.Wara xi esperimenti inizjali ta' soluzzjoni tal-problemi, aħna ndunaw li l-fond tal-port fl-istator tal-valv ta 'l-injezzjoni kien ħafna aktar profond milli konna mdorrijin, li jirriżulta f'volum mejjet kbir fil-qiegħ tal-port. il-volum mejjet fil-qiegħ tal-port.
Peak fronts bħal dawk murija fil-Figura 1e jistgħu wkoll ikunu kkawżati minn problemi fiżiċi jew kimiċi. Kawża fiżika komuni tax-xifer ta 'quddiem hija li s-sodda tal-partiċelli tal-kolonna mhix ippakkjata sew, jew li l-partiċelli jkunu rorganizzaw mill-ġdid matul iż-żmien. kundizzjonijiet ta’ ritenzjoni “lineari”. Taħt kundizzjonijiet ideali (lineari), l-ammont ta’ analit miżmum mill-fażi stazzjonarja (għalhekk, il-fattur ta’ ritenzjoni) huwa relatat b’mod lineari mal-konċentrazzjoni tal-analite fil-kolonna. B’mod kromatografiku, dan ifisser li hekk kif il-massa tal-analite injettata fil-kolonna tiżdied, il-quċċata ssir ogħla, iżda mhux usa’. r bħala aktar massa hija injettata.Barra minn hekk, forom mhux lineari jiddeterminaw il-forma ta 'qċaċet kromatografiċi, li jirriżultaw fi truf ta' quddiem jew ta 'wara.Bħal ma' tagħbija żejda tal-massa li tikkawża peak tailing (10), peak leader ikkawżat minn żamma mhux lineari tista 'wkoll tiġi djanjostikata billi titnaqqas il-massa analita injettata. trid tinbidel biex timminimizza din l-imġieba.
Xi drabi aħna nosservaw dak li jidher li huwa quċċata "qasma", kif muri fil-Figura 1f. L-ewwel pass biex tissolva din il-problema huwa li jiġi ddeterminat jekk il-forma tal-quċċata hijiex dovuta għal ko-eluzzjoni parzjali (jiġifieri, il-preżenza ta 'żewġ komposti distinti iżda li elużjoni mill-qrib). t” qċaċet huma relatati mal-Prestazzjoni fiżika m'għandha x'taqsam xejn mal-kolonna nnifisha.Spiss, l-iktar ħjiel importanti għal din id-deċiżjoni hija jekk il-qċaċet kollha fil-kromatogramma jurux forom maqsuma, jew wieħed jew tnejn biss.Jekk huwa wieħed jew tnejn biss, probabbilment hija kwistjoni ta 'ko-eluzzjoni;jekk il-qċaċet kollha huma maqsuma, probabbilment hija kwistjoni fiżika, x'aktarx relatata mal-kolonna nnifisha.
Qċaċet maqsuma relatati mal-proprjetajiet fiżiċi tal-kolonna nnifisha huma ġeneralment dovuti għal frits ta 'dħul jew ħruġ parzjalment imblukkati, jew riorganizzazzjoni ta' partiċelli fil-kolonna, li jippermettu li l-fażi mobbli tiċċirkola aktar malajr mill-fażi mobbli f'ċerti żoni tal-formazzjoni tal-kanal tal-kolonna .f'reġjuni oħra (11).Frit misdud parzjalment jista 'xi kultant jiġi kklerjat billi jitreġġa' lura l-fluss permezz tal-kolonna;madankollu, fl-esperjenza tiegħi, din ġeneralment tkun soluzzjoni għal żmien qasir aktar milli fit-tul.Dan huwa spiss fatali b'kolonni moderni jekk il-partiċelli jerġgħu jingħaqdu fi ħdan il-kolonna.F'dan il-punt, huwa aħjar li tissostitwixxi l-kolonna u tkompli.
Il-quċċata fil-Figura 1g, ukoll minn eżempju reċenti fil-laboratorju tiegħi stess, normalment jindika li s-sinjal huwa tant għoli li laħaq it-tarf għoli tal-firxa tar-rispons. Għal ditekters ta 'assorbiment ottiku (UV-vis f'dan il-każ), meta l-konċentrazzjoni tal-analite hija għolja ħafna, l-analite jassorbi l-biċċa l-kbira tad-dawl li jgħaddi miċ-ċellula tal-fluss tad-ditekter, u jħalli ftit li xejn dawl minn dawn il-kundizzjonijiet jiġu skoperti minn sorsi elettriċi varji. ta 'ħoss, bħal dawl mitluf u "kurrent skur", li jagħmel is-sinjal "fuzzy" ħafna fid-dehra u indipendenti mill-konċentrazzjoni tal-analite.Meta jiġri dan, il-problema ta 'spiss tista' tiġi solvuta faċilment billi jitnaqqas il-volum tal-injezzjoni tal-analite — jitnaqqas il-volum tal-injezzjoni, jiġi dilwit il-kampjun, jew it-tnejn.
Fl-iskola tal-kromatografija, nużaw is-sinjal tad-ditekter (jiġifieri, l-assi y fil-kromatogramma) bħala indikatur tal-konċentrazzjoni tal-analite fil-kampjun. Allura jidher stramb li tara kromatogramma b'sinjal taħt iż-żero, peress li l-interpretazzjoni sempliċi hija li dan jindika konċentrazzjoni tal-analite negattiva - li ovvjament mhix fiżikament possibbli.
F'dan il-każ, quċċata negattiva sempliċement tfisser li l-molekuli li joħorġu mill-kolonna jassorbu inqas dawl mill-fażi mobbli nnifisha immedjatament qabel u wara l-quċċata. qċaċet biex tipprepara kurva ta 'kalibrazzjoni u tikseb informazzjoni kwantitattiva preċiża, għalhekk m'hemm l-ebda raġuni fundamentali biex tevitahom per se (dan il-metodu xi drabi jissejjaħ "skoperta UV indiretta") (13).Madankollu, jekk irridu verament nevitaw qċaċet negattivi għal kollox, fil-każ ta 'skoperta ta' assorbiment, l-aħjar soluzzjoni hija li tuża skoperta differenti ta 'detection wavelength sabiex jassorbu l-fażi mobbli ta' dawl sabiex jassorbu aktar il-fażi mobbli. milli analiti.
Qċaċet negattivi jistgħu jidhru wkoll meta tuża indiċi rifrattiv (RI) skoperta meta l-indiċi rifrattiv ta 'komponenti minbarra l-analite fil-kampjun, bħall-matriċi tas-solvent, huwa differenti mill-indiċi refrattiv tal-fażi mobbli. il-fażi mobbli.
Fit-tielet parti dwar is-suġġett bażiku tas-soluzzjoni tal-problemi tal-LC, iddiskutejt sitwazzjonijiet li fihom il-forma tal-quċċata osservata tvarja mill-forma tal-quċċata mistennija jew normali. Is-soluzzjoni tal-problemi effettiva ta 'dawn il-problemi tibda b'għarfien tal-forom tal-quċċata mistennija (ibbażat fuq it-teorija jew esperjenza preċedenti b'metodi eżistenti), għalhekk devjazzjonijiet minn dawn l-aspettattivi huma ovvji. ir-raġunijiet li nara l-aktar spiss.Li tkun taf dawn id-dettalji tipprovdi post tajjeb biex tibda ssolvi l-problemi, iżda ma jaqbadx il-possibbiltajiet kollha.Il-qarrejja interessati f'lista aktar fil-fond ta 'kawżi u soluzzjonijiet jistgħu jirreferu għat-tabella tal-ħajt "LC Troubleshooting Guide" tal-LCGC.
(4) LCGC "LC Troubleshooting Guide" ħajt chart.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiżi tad-Data u Ipproċessar tas-Sinjal fil-Kromatografija (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF u Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.