Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Il-bijopsija likwida (LB) hija kunċett li qed jikseb popolarità malajr fil-qasam bijomediku. Il-kunċett huwa prinċipalment ibbażat fuq l-iskoperta ta' frammenti ta' DNA extraċellulari li jiċċirkola (ccfDNA), li huma prinċipalment rilaxxati bħala frammenti żgħar wara l-mewt taċ-ċelluli f'diversi tessuti. Proporzjon żgħir ta' dawn il-frammenti joriġina minn tessuti jew organiżmi barranin (barranin). Fix-xogħol attwali, applikajna dan il-kunċett għall-maskli, speċi sentinella magħrufa għall-kapaċità għolja ta' filtrazzjoni tal-ilma baħar tagħhom. Aħna nużaw il-kapaċità tal-maskli li jaġixxu bħala filtri naturali biex jaqbdu frammenti ta' DNA ambjentali minn varjetà ta' sorsi biex jipprovdu informazzjoni dwar il-bijodiversità tal-ekosistemi kostali tal-baħar. Ir-riżultati tagħna juru li l-emolimfa tal-maskli fiha frammenti ta' DNA li jvarjaw ħafna fid-daqs, minn 1 sa 5 kb. Is-sekwenzar bl-isparar wera li numru kbir ta' frammenti ta' DNA huma ta' oriġini mikrobjali barranija. Fost dawn, sibna frammenti ta' DNA minn batterji, arkea, u viruses, inklużi viruses magħrufa li jinfettaw varjetà ta' ospiti li jinstabu komunement fl-ekosistemi kostali tal-baħar. Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett ta' LB applikat għall-maskli jirrappreżenta sors ta' għarfien rikk iżda għadu mhux esplorat dwar id-diversità mikrobjali fl-ekosistemi kostali tal-baħar.
L-impatt tat-tibdil fil-klima (CC) fuq il-bijodiversità tal-ekosistemi tal-baħar huwa qasam ta’ riċerka li qed jikber b’rata mgħaġġla. It-tisħin globali mhux biss jikkawża stress fiżjoloġiku importanti, iżda jimbotta wkoll il-limiti evoluzzjonarji tal-istabbiltà termali tal-organiżmi tal-baħar, u jaffettwa l-ħabitat ta’ numru ta’ speċi, u jġegħelhom ifittxu kundizzjonijiet aktar favorevoli [1, 2]. Minbarra li jaffettwa l-bijodiversità tal-metażoani, is-CC ifixkel il-bilanċ delikat tal-interazzjonijiet bejn l-ospitant u l-mikrobi. Din id-disbatterjożi mikrobjali toħloq theddida serja għall-ekosistemi tal-baħar peress li tagħmel l-organiżmi tal-baħar aktar suxxettibbli għal patoġeni infettivi [3, 4]. Huwa maħsub li l-SS għandhom rwol importanti fl-imwiet tal-massa, li hija problema serja għall-ġestjoni tal-ekosistemi tal-baħar globali [5, 6]. Din hija kwistjoni importanti minħabba l-impatti ekonomiċi, ekoloġiċi u nutrizzjonali ta’ ħafna speċi tal-baħar. Dan huwa speċjalment minnu għall-bivalvi li jgħixu fir-reġjuni polari, fejn l-effetti tas-CK huma aktar immedjati u severi [6, 7]. Fil-fatt, bivalvi bħal Mytilus spp. jintużaw ħafna biex jimmonitorjaw l-effetti tas-CC fuq l-ekosistemi tal-baħar. Mhux ta’ b’xejn li numru relattivament kbir ta’ bijomarkaturi ġew żviluppati biex jimmonitorjaw saħħithom, ħafna drabi bl-użu ta’ approċċ b’żewġ livelli li jinvolvi bijomarkaturi funzjonali bbażati fuq attività enżimatika jew funzjonijiet ċellulari bħall-vijabbiltà taċ-ċelluli u l-attività fagoċitika [8]. Dawn il-metodi jinkludu wkoll il-kejl tal-konċentrazzjoni ta’ indikaturi speċifiċi tal-pressjoni li jakkumulaw fit-tessuti rotob wara l-assorbiment ta’ ammonti kbar ta’ ilma baħar. Madankollu, il-kapaċità għolja ta’ filtrazzjoni u s-sistema ċirkolatorja semi-miftuħa tal-bivalvi jipprovdu opportunità biex jiġu żviluppati bijomarkaturi ġodda tal-emolimfa bl-użu tal-kunċett ta’ bijopsija likwida (LB), approċċ sempliċi u minimament invażiv għall-immaniġġjar tal-pazjenti. kampjuni tad-demm [9, 10]. Għalkemm diversi tipi ta’ molekuli li jiċċirkolaw jistgħu jinstabu fl-LB uman, dan il-kunċett huwa primarjament ibbażat fuq l-analiżi tas-sekwenzar tad-DNA ta’ frammenti ta’ DNA extraċellulari li jiċċirkolaw (ccfDNA) fil-plażma. Fil-fatt, il-preżenza ta’ DNA li jiċċirkola fil-plażma umana ilha magħrufa minn nofs is-seklu 20 [11], iżda huwa biss f’dawn l-aħħar snin li l-miġja ta’ metodi ta’ sekwenzar b’rendiment għoli wasslet għal dijanjosi klinika bbażata fuq is-ccfDNA. Il-preżenza ta' dawn il-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw hija parzjalment dovuta għar-rilaxx passiv tad-DNA ġenomika (nukleari u mitokondrijali) wara l-mewt taċ-ċelluli. F'individwi b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta' ccfDNA normalment tkun baxxa (<10 ng/mL) iżda tista' tiżdied b'5–10 darbiet f'pazjenti li jbatu minn diversi patoloġiji jew soġġetti għal stress, li tirriżulta fi ħsara fit-tessut. F'individwi b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta' ccfDNA normalment tkun baxxa (<10 ng/mL) iżda tista' tiżdied b'5–10 darbiet f'pazjenti li jbatu minn diversi patoloġiji jew soġġetti għal stress, li tirriżulta fi ħsara fit-tessut. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатьсу в 5–10 в больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. F'nies b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta' cccDNA normalment tkun baxxa (<10 ng/mL), iżda tista' tiżdied b'5–10 darbiet f'pazjenti b'diversi patoloġiji jew taħt stress li jwassal għal ħsara fit-tessuti.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滄炣致滍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 扅理 或 手忣 手中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны быть увеличены ны 10 у здоровых людей пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Il-konċentrazzjonijiet ta' ccfDNA ġeneralment ikunu baxxi (<10 ng/ml) f'individwi b'saħħithom, iżda jistgħu jiżdiedu b'5-10 darbiet f'pazjenti b'diversi patoloġiji jew stress, u dan jirriżulta fi ħsara fit-tessuti.Id-daqs tal-frammenti tas-ccfDNA jvarja ħafna, iżda ġeneralment ivarja minn 150 sa 200 bp. [12]. L-analiżi tas-ccfDNA derivat minnu nnifsu, jiġifieri, ccfDNA minn ċelloli ospitanti normali jew trasformati, tista' tintuża biex tiskopri bidliet ġenetiċi u epiġenetiċi preżenti fil-ġenoma nukleari u/jew mitokondrijali, u b'hekk tgħin lill-kliniċisti jagħżlu terapiji speċifiċi mmirati molekularment [13]. Madankollu, is-ccfDNA jista' jinkiseb minn sorsi barranin bħal ccfDNA minn ċelloli tal-fetu waqt it-tqala jew minn organi trapjantati [14,15,16,17]. Is-ccfDNA huwa wkoll sors importanti ta' informazzjoni biex tiskopri l-preżenza ta' aċidi nuklejċi ta' aġent infettiv (barrani), li jippermetti skoperta mhux invażiva ta' infezzjonijiet mifruxa mhux identifikati minn kulturi tad-demm, u b'hekk tiġi evitata bijopsija invażiva ta' tessut infettat [18]. Studji reċenti tabilħaqq urew li d-demm uman fih sors rikk ta' informazzjoni li jista' jintuża biex jiġu identifikati patoġeni virali u batteriċi, u li madwar 1% tas-ccfDNA misjub fil-plażma umana huwa ta' oriġini barranija [19]. Dawn l-istudji juru li l-bijodiversità tal-mikrobijoma li jiċċirkola ta' organiżmu tista' tiġi vvalutata bl-użu tal-analiżi tas-ccfDNA. Madankollu, sa ftit ilu, dan il-kunċett kien jintuża esklussivament fil-bnedmin u, sa ċertu punt, f'vertebrati oħra [20, 21].
F'dan id-dokument, nużaw il-potenzjal LB biex nanalizzaw is-ccfDNA ta' Aulacomya atra, speċi tan-nofsinhar li tinstab komunement fil-Gżejjer Kerguelen subantartiċi, grupp ta' gżejjer fuq plateau kbir li ffurma 35 miljun sena ilu wara eruzzjoni vulkanika. Bl-użu ta' sistema sperimentali in vitro, sibna li frammenti tad-DNA fl-ilma baħar jiġu assorbiti malajr mill-maskli u jidħlu fil-kompartiment tal-emolimfa. Is-sekwenzar bl-isparar wera li s-ccfDNA tal-emolimfa tal-maskli fih frammenti tad-DNA ta' oriġini tiegħu stess u mhux awtonoma, inklużi batterji simbijotiċi u frammenti tad-DNA minn bijomi tipiċi ta' ekosistemi kostali tal-baħar vulkaniċi kesħin. Is-ccfDNA tal-emolimfa fih ukoll sekwenzi virali derivati ​​minn viruses b'firxiet ta' ospitanti differenti. Sibna wkoll frammenti tad-DNA minn annimali multiċellulari bħal ħut bl-għadam, anemoni tal-baħar, alka u insetti. Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett LB jista' jiġi applikat b'suċċess għal invertebrati tal-baħar biex jiġġenera repertorju ġenomiku rikk fl-ekosistemi tal-baħar.
L-adulti (55-70 mm twal) Mytilus platensis (M. platensis) u Aulacomya atra (A. atra) inġabru mix-xtut tal-blat intertidali ta' Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Il-Gżejjer Kerguelen f'Diċembru 2018. Maskli blu adulti oħra (Mytilus spp.) inkisbu mingħand fornitur kummerċjali (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) u tqiegħdu f'tank arjat b'temperatura kkontrollata (4°C) li fih 10–20 L ta' ilma mielaħ artifiċjali ta' 32‰ (melħ tal-baħar artifiċjali Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Għal kull esperiment, tkejlu t-tul u l-piż tal-qxur individwali.
Protokoll ta' aċċess miftuħ u bla ħlas għal dan il-programm huwa disponibbli online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Fil-qosor, l-emolimfa LB inġabret mill-muskoli abductor kif deskritt [22]. L-emolimfa ġiet iċċarata permezz ta' ċentrifugazzjoni b'1200×g għal 3 minuti, is-supernatant ġie ffriżat (-20°C) sakemm intuża. Għall-iżolament u l-purifikazzjoni tas-cfDNA, kampjuni (1.5-2.0 ml) ġew imdewba u pproċessati bl-użu tal-kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Is-ccfDNA nħażen f'-80°C sakemm issir aktar analiżi. F'xi esperimenti, is-ccfDNA ġie iżolat u ppurifikat bl-użu tal-QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Id-DNA purifikat ġie kwantifikat bl-użu ta' assay standard PicoGreen. Id-distribuzzjoni tal-frammenti tas-ccfDNA iżolat ġiet analizzata permezz ta' elettroforesi kapillari bl-użu ta' bijoanalizzatur Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) bl-użu ta' Kit tad-DNA ta' Sensittività Għolja. L-analiżi saret bl-użu ta' 1 µl tal-kampjun tas-ccfDNA skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Għas-sekwenzar tal-frammenti tas-ccfDNA tal-emolimfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) ħejja libreriji shotgun bl-użu tal-kit Illumina DNA Mix tal-kit Illumina MiSeq PE75. Intuża adapter standard (BioO). Fajls tad-dejta mhux ipproċessata huma disponibbli mill-NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 u SRR8924809). Il-kwalità bażika tal-qari ġiet ivvalutata bl-użu ta' FastQC [23]. Trimmomatic [24] intuża għall-ikklippjar tal-adapters u qari ta' kwalità fqira. Qari shotgun b'truf imqabbdin ingħaqdu FLASH f'qari wieħed itwal b'koinċidenza minima ta' 20 bp biex jiġu evitati żbalji fl-apparenza [25]. Il-qari magħqud ġie annotat b'BLASTN bl-użu ta' database tat-Tassonomija NCBI bivalvi (valur e < 1e−3 u 90% omoloġija), u l-masking ta' sekwenzi ta' kumplessità baxxa twettaq bl-użu ta' DUST [26]. Il-qari magħqud ġie annotat b'BLASTN bl-użu ta' database tat-Tassonomija NCBI bivalvi (valur e < 1e−3 u 90% omoloġija), u l-masking ta' sekwenzi ta' kumplessità baxxa twettaq bl-użu ta' DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных танных таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ноистель сложности было выполнено с использованием TRAB [26]. Il-qari miġbur ġie annotat b'BLASTN bl-użu tad-database tat-tassonomija tal-bivalvi tal-NCBI (valur e < 1e-3 u 90% omoloġija), u l-masking tas-sekwenza ta' kumplessità baxxa twettaq bl-użu ta' DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌啰数诌数＿）进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 Ｈ 注释 合并 读数 Ｈ 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой бханкой Объединенные чтения были аннотированы с помощью двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй нои сложности было выполнено с использованием TRAB [26]. Il-qari miġbur ġie annotat b'BLASTN bl-użu tad-database tassonomika tal-bivalvi tal-NCBI (valur e <1e-3 u omoloġija ta' 90%), u l-masking tas-sekwenza ta' kumplessità baxxa twettaq bl-użu ta' DUST [26].Il-qari ġie maqsum f'żewġ gruppi: relatati ma' sekwenzi bivalvi (hawn imsejħa awto-qari) u mhux relatati (mhux awto-qari). Żewġ gruppi ġew immuntati separatament bl-użu ta' MEGAHIT biex jiġġeneraw contigs [27]. Sadanittant, id-distribuzzjoni tassonomika tal-qari tal-mikrobijomi aljeni ġiet ikklassifikata bl-użu ta' Kraken2 [28] u rappreżentata grafikament minn Krona pie chart fuq Galaxy [29, 30]. L-kmers ottimali ġew determinati li huma kmers-59 mill-esperimenti preliminari tagħna. Imbagħad ġew identifikati self contigs permezz ta' allinjament ma' BLASTN (database NCBI tal-bivalvi, valur e < 1e−10 u 60% omoloġija) għal annotazzjoni finali. Imbagħad ġew identifikati self contigs permezz ta' allinjament ma' BLASTN (database NCBI tal-bivalvi, valur e < 1e−10 u 60% omoloġija) għal annotazzjoni finali. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (BLASTN моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. L-awto-contigs imbagħad ġew identifikati billi tqabblu ma' BLASTN (database tal-bivalvi NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija) għall-annotazzjoni finali.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сослапенст данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Imbagħad ġew identifikati l-awto-contigs għall-annotazzjoni finali billi tqabblu ma' BLASTN (database tal-bivalvi NCBI, valur e <1e-10 u omoloġija ta' 60%). B'mod parallel, il-contigs tal-grupp mhux awtonomu ġew annotati b'BLASTN (database nt NCBI, valur e < 1e−10 u omoloġija ta' 60%). B'mod parallel, il-contigs tal-grupp mhux awtonomu ġew annotati b'BLASTN (database nt NCBI, valur e < 1e−10 u omoloġija ta' 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данннач, e <1e-10 и гомология 60%). B'mod parallel, il-contigs tal-gruppi barranin ġew annotati b'BLASTN (database NT NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью ныщью BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). B'mod parallel, il-contigs tal-grupp mhux awtonomu ġew annotati b'BLASTN (database nt NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija). BLASTX twettaq ukoll fuq nonself contigs bl-użu tad-databases tal-proteini nr u RefSeq NCBI (valur e < 1e−10 u 60% omoloġija). BLASTX twettaq ukoll fuq nonself contigs bl-użu tad-databases tal-proteini nr u RefSeq NCBI (valur e < 1e−10 u 60% omoloġija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq nr. e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX twettaq ukoll fuq contigs mhux awto-eżekuttivi bl-użu tad-databases tal-proteini nr u RefSeq NCBI (valur e < 1e-10 u 60% omoloġija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怺 性 60%。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怺 性 60%。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC nr BI (Ref. <1e-10 и гомология 60%). BLASTX twettaq ukoll fuq contigs mhux awto-eżekuttivi bl-użu tad-databases tal-proteini nr u RefSeq NCBI (valur e <1e-10 u 60% omoloġija).Il-pools BLASTN u BLASTX ta' non-self-contigs jirrappreżentaw il-contigs finali (ara l-fajl Supplimentari).
Il-primers użati għall-PCR huma elenkati fit-Tabella S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) intużat biex tamplifika l-ġeni fil-mira tas-ccfDNA. Intużaw il-kundizzjonijiet ta' reazzjoni li ġejjin: denaturazzjoni f'95°C għal 3 minuti, 95°C għal minuta, temperatura ta' annealing issettjata għal minuta, elongazzjoni f'72°C għal minuta, 35 ċiklu, u finalment 72°C fi żmien 10 minuti. Il-prodotti tal-PCR ġew separati permezz ta' elettroforesi f'ġellijiet tal-agarose (1.5%) li fihom SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) f'95 V.
Il-maskli (Mytilus spp.) ġew akklimatizzati f'500 ml ilma baħar ossiġenat (32 PSU) għal 24 siegħa f'4°C. Id-DNA tal-plażmidi li fih inserzjoni li tikkodifika s-sekwenza tas-cDNA tal-galectin-7 umana (numru ta' aċċessjoni NCBI L07769) ġiet miżjuda mal-kunjett f'konċentrazzjoni finali ta' 190 μg/μl. Il-maskli inkubati taħt l-istess kundizzjonijiet mingħajr iż-żieda tad-DNA kienu l-kontroll. It-tielet tank ta' kontroll kien fih DNA mingħajr maskli. Biex tiġi mmonitorjata l-kwalità tad-DNA fl-ilma baħar, ittieħdu kampjuni tal-ilma baħar (20 μl; tliet repetizzjonijiet) minn kull tank fil-ħin indikat. Għat-traċċabilità tad-DNA tal-plażmidi, il-maskli LB inġabru fil-ħinijiet indikati u ġew analizzati permezz ta' qPCR u ddPCR. Minħabba l-kontenut għoli ta' melħ fl-ilma baħar, l-alikwoti ġew dilwiti f'ilma ta' kwalità PCR (1:10) qabel l-assaġġi kollha tal-PCR.
Il-PCR diġitali bil-qtar (ddPCR) twettqet bl-użu tal-protokoll BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Uża l-profil tat-temperatura biex tiddetermina t-temperatura ottima (Tabella S1). Il-qtar ġew iġġenerati bl-użu ta' ġeneratur tal-qtar QX200 (BioRad). Id-ddPCR twettqet kif ġej: 95°C għal 5 minuti, 50 ċiklu ta' 95°C għal 30 s u temperatura ta' annealing mogħtija għal minuta u 72°C għal 30 s, 4°C għal 5 minuti u 90°C fi żmien 5 minuti. In-numru ta' qtar u r-reazzjonijiet pożittivi (numru ta' kopji/µl) tkejlu bl-użu ta' qarrej tal-qtar QX200 (BioRad). Kampjuni b'inqas minn 10,000 qtar ġew miċħuda. Il-kontroll tal-mudell ma twettaqx kull darba li tħaddem id-ddPCR.
Il-qPCR twettaq bl-użu ta' Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, l-Awstralja) u primers speċifiċi għal LGALS7. Il-PCRs kwantitativi kollha twettqu f'20 µl bl-użu tal-QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Il-qPCR inbeda b'inkubazzjoni ta' 15-il minuta f'95°C segwita minn 40 ċiklu f'95°C għal 10 sekondi u f'60°C għal 60 sekonda b'ġbir wieħed ta' dejta. Il-kurvi tat-tidwib ġew iġġenerati bl-użu ta' kejl suċċessiv f'95°C għal 5 s, 65°C għal 60 s, u 97°C fl-aħħar tal-qPCR. Kull qPCR twettaq fi tliet kopji, ħlief għall-kampjuni ta' kontroll.
Peress li l-maskli huma magħrufa għar-rata għolja ta' filtrazzjoni tagħhom, l-ewwel investigajna jekk jistgħux jiffiltraw u jżommu frammenti tad-DNA preżenti fl-ilma baħar. Konna interessati wkoll dwar jekk dawn il-frammenti jakkumulawx fis-sistema limfatika semi-miftuħa tagħhom. Irriżolvejna din il-kwistjoni b'mod sperimentali billi ttraċċajna d-destin tal-frammenti tad-DNA solubbli miżjuda mat-tankijiet tal-maskli blu. Biex niffaċilitaw it-traċċar tal-frammenti tad-DNA, użajna DNA plażmidiku barrani (mhux awto) li fih il-ġene uman galectin-7. Id-ddPCR jittraċċa frammenti tad-DNA plażmidiku fl-ilma baħar u l-maskli. Ir-riżultati tagħna juru li jekk l-ammont ta' frammenti tad-DNA fl-ilma baħar baqa' relattivament kostanti maż-żmien (sa 7 ijiem) fin-nuqqas ta' maskli, allura fil-preżenza ta' maskli dan il-livell kważi sparixxa kompletament fi żmien 8 sigħat (Fig. 1a,b). Frammenti ta' DNA eżoġenu ġew skoperti faċilment fi żmien 15-il minuta fil-fluwidu intravalvulari u l-emolimfa (Fig. 1c). Dawn il-frammenti xorta setgħu jiġu skoperti sa 4 sigħat wara l-espożizzjoni. Din l-attività ta' filtrazzjoni fir-rigward tal-frammenti tad-DNA hija komparabbli mal-attività ta' filtrazzjoni tal-batterji u l-alka [31]. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-maskli jistgħu jiffiltraw u jakkumulaw DNA barrani fil-kompartimenti fluwidi tagħhom.
Konċentrazzjonijiet relattivi ta' DNA plasmidiku fl-ilma baħar fil-preżenza (A) jew fin-nuqqas (B) ta' maskli, imkejla permezz ta' ddPCR. F'A, ir-riżultati huma espressi bħala perċentwali, bit-truf tal-kaxxi jirrappreżentaw il-75 u l-25 perċentil. Il-kurva logaritmika mwaħħla hija murija bl-aħmar, u ż-żona griża tirrappreżenta l-intervall ta' kunfidenza ta' 95%. F'B, il-linja ħamra tirrappreżenta l-medja u l-linja blu tirrappreżenta l-intervall ta' kunfidenza ta' 95% għall-konċentrazzjoni. C Akkumulazzjoni ta' DNA plasmidiku fl-emolimfa u l-fluwidu valvulari tal-maskli f'ħinijiet differenti wara ż-żieda ta' DNA plasmidiku. Ir-riżultati huma ppreżentati bħala kopji assoluti skoperti/mL (±SE).
Sussegwentement, investigajna l-oriġini tas-ccfDNA fil-maskli miġbura minn sodod tal-maskli fil-Gżejjer Kerguelen, grupp remot ta' gżejjer b'influwenza antropoġenika limitata. Għal dan il-għan, is-cccDNA mill-emolimfi tal-maskli ġie iżolat u ppurifikat b'metodi komunement użati biex jippurifikaw is-cccDNA uman [32, 33]. Sibna li l-konċentrazzjonijiet medji ta' ccfDNA tal-emolimfa fil-maskli huma fil-medda baxxa ta' mikrogrammi għal kull ml ta' emolimfa (ara t-Tabella S2, Informazzjoni Supplimentari). Din il-medda ta' konċentrazzjonijiet hija ħafna akbar milli f'nies b'saħħithom (nanogrammi baxxi għal kull millilitru), iżda f'każijiet rari, f'pazjenti bil-kanċer, il-livell ta' ccfDNA jista' jilħaq diversi mikrogrammi għal kull millilitru [34, 35]. Analiżi tad-distribuzzjoni tad-daqs tas-ccfDNA tal-emolimfa wriet li dawn il-frammenti jvarjaw ħafna fid-daqs, minn 1000 bp sa 1000 bp. sa 5000 bp (Fig. 2). Riżultati simili nkisbu bl-użu tal-QIAamp Investigator Kit ibbażat fuq is-silika, metodu komunement użat fix-xjenza forensika biex jiżola u jippurifika malajr id-DNA ġenomiku minn kampjuni ta' DNA b'konċentrazzjoni baxxa, inkluż is-ccfDNA [36].
Elettroforegramma rappreżentattiva tas-ccfDNA tal-emolimfa tal-maskli. Estratta bin-NucleoSnap Plasma Kit (fuq) u l-QIAamp DNA Investigator Kit. Plott B Vjolin li juri d-distribuzzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-ccfDNA tal-emolimfa (±SE) fil-maskli. Il-linji suwed u ħomor jirrappreżentaw il-medjan u l-ewwel u t-tielet kwartili, rispettivament.
Madwar 1% tas-ccfDNA fil-bnedmin u l-primati għandu sors barrani [21, 37]. Minħabba s-sistema ċirkolatorja semi-miftuħa tal-bivalvi, l-ilma baħar rikk fil-mikrobi, u d-distribuzzjoni tad-daqs tas-ccfDNA tal-maskli, ipoteżizzajna li s-ccfDNA tal-emolimfa tal-maskli jista' jkun fih ġabra rikka u diversa ta' DNA mikrobjali. Biex nittestjaw din l-ipoteżi, sekwenzajna s-ccfDNA tal-emolimfa minn kampjuni ta' Aulacomya atra miġbura mill-Gżejjer Kerguelen, li taw aktar minn 10 miljun qari, li 97.6% minnhom għaddew mill-kontroll tal-kwalità. Il-qari mbagħad ġie kklassifikat skont sorsi awtonomi u mhux awtonomi bl-użu tad-databases tal-bivalvi BLASTN u NCBI (Fig. S1, Informazzjoni Supplimentari).
Fil-bnedmin, kemm id-DNA nukleari kif ukoll dak mitokondrijali jistgħu jiġu rilaxxati fid-demm [38]. Madankollu, fl-istudju preżenti, ma kienx possibbli li jiġi deskritt fid-dettall id-DNA ġenomiku nukleari tal-maskli, peress li l-ġenoma ta' A. atra ma ġiex sekwenzat jew deskritt. Madankollu, stajna nidentifikaw numru ta' frammenti ta' ccfDNA tal-oriġini tagħna stess bl-użu tal-librerija tal-bivalvi (Fig. S2, Informazzjoni Supplimentari). Ikkonfermajna wkoll il-preżenza ta' frammenti ta' DNA tal-oriġini tagħna stess permezz ta' amplifikazzjoni diretta bil-PCR ta' dawk il-ġeni ta' A. atra li ġew sekwenzati (Fig. 3). Bl-istess mod, peress li l-ġenoma mitokondrijali ta' A. atra huwa disponibbli f'databases pubbliċi, wieħed jista' jsib evidenza għall-preżenza ta' frammenti ta' ccfDNA mitokondrijali fl-emolimfa ta' A. atra. Il-preżenza ta' frammenti ta' DNA mitokondrijali ġiet ikkonfermata permezz ta' amplifikazzjoni bil-PCR (Fig. 3).
Diversi ġeni mitokondrijali kienu preżenti fl-emolimfa ta' A. atra (tikek ħomor – numru tal-istokk: SRX5705969) u M. platensis (tikek blu – numru tal-istokk: SRX5705968) amplifikati permezz ta' PCR. Figura adattata minn Breton et al., 2011 B Amplifikazzjoni tas-supernatant tal-emolimfa minn A. atra Maħżun fuq karta FTA. Uża punch ta' 3 mm biex iżżid direttament mat-tubu tal-PCR li fih it-taħlita tal-PCR.
Minħabba l-kontenut mikrobjali abbundanti fl-ilma baħar, inizjalment iffukajna fuq il-karatterizzazzjoni tas-sekwenzi tad-DNA mikrobjali fl-emolimfa. Biex nagħmlu dan, użajna żewġ strateġiji differenti. L-ewwel strateġija użat Kraken2, programm ta' klassifikazzjoni ta' sekwenzi bbażat fuq algoritmi li jista' jidentifika sekwenzi mikrobjali b'eżattezza komparabbli ma' BLAST u għodod oħra [28]. Aktar minn 6719 qari ġew determinati li huma ta' oriġini batterjali, filwaqt li 124 u 64 kienu minn archaea u viruses, rispettivament (Fig. 4). L-aktar frammenti abbundanti tad-DNA batterjali kienu Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), u Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Din id-distribuzzjoni hija konsistenti ma' studji preċedenti tal-mikrobijoma tal-maskli blu tal-baħar [39, 40]. Il-gammaproteobacteria kienu l-klassi ewlenija ta' Proteobacteria (44%), inklużi ħafna Vibrionales (Fig. 4b). Il-metodu ddPCR ikkonferma l-preżenza ta' frammenti tad-DNA ta' Vibrio fis-ccfDNA tal-emolymph ta' A. atra (Fig. 4c) [41]. Biex tinkiseb aktar informazzjoni dwar l-oriġini batterjali tas-ccfDNA, ittieħed approċċ addizzjonali (Fig. S2, Informazzjoni Supplimentari). F'dan il-każ, il-qari li kien jikkoinċidi ġie mmuntat bħala qari b'tarf imqabbel u ġie kklassifikat bħala ta' oriġini awtonoma (bivalvi) jew mhux awtonoma bl-użu ta' BLASTN u valur e ta' 1e−3 u limitu b'omoloġija ta' >90%. F'dan il-każ, il-qari li kien jikkoinċidi ġie mmuntat bħala qari b'tarf imqabbel u ġie kklassifikat bħala ta' oriġini awtonoma (bivalvi) jew mhux awtonoma bl-użu ta' BLASTN u valur e ta' 1e−3 u limitu b'omoloġija ta' >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование мользованием зованием зованием зование м зованием BLAS-1 отсечения с гомологией> 90%. F'dan il-każ, qari li jikkoinċidi nġabar bħala qari b'tarf imqabbad u ġie kklassifikat bħala nattiv (bivalvi) jew mhux oriġinali bl-użu ta' BLASTN u valur e ta' 1e-3 u limitu ta' qtugħ b'omoloġija ta' >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 用 用 的 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и класнико класны собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использований e BLAS 1e-3 и порога гомологии> 90%. F'dan il-każ, qari li jikkoinċidi nġabar bħala qari b'tarf imqabbad u ġie kklassifikat bħala proprju (bivalvi) jew mhux oriġinali bl-użu tal-valuri e BLASTN u 1e-3 u limitu ta' omoloġija >90%.Peress li l-ġenoma ta' A. atra għadu ma ġiex sekwenzat, użajna l-istrateġija ta' assemblaġġ de novo tal-assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Total ta' 147,188 contig ġew identifikati bħala dipendenti (bivalvi) tal-oriġini. Dawn il-contigs imbagħad ġew sploduti b'valuri-e ta' 1e-10 bl-użu ta' BLASTN u BLASTX. Din l-istrateġija ppermettietna nidentifikaw 482 framment mhux bivalvi preżenti fis-ccfDNA ta' A. atra. Aktar minn nofs (57%) ta' dawn il-frammenti tad-DNA nkisbu minn batterji, prinċipalment minn simbjonti tal-garġi, inklużi simbjonti sulfotrofiċi, u minn simbjonti tal-garġi Solemya velum (Fig. 5).
Abbundanza relattiva fil-livell tat-tip. B Diversità mikrobjali ta' żewġ fila ewlenin (Firmicutes u Proteobacteria). Amplifikazzjoni rappreżentattiva ta' ddPCR C Vibrio spp. A. Frammenti tal-ġene 16S rRNA (blu) fi tliet emolimfi atra.
Ġew analizzati total ta' 482 contig miġbura. Profil ġenerali tad-distribuzzjoni tassonomika tal-annotazzjonijiet tal-contig metaġenomiċi (prokarioti u ewkarjoti). B Distribuzzjoni dettaljata tal-frammenti tad-DNA batterika identifikati minn BLASTN u BLASTX.
L-analiżi ta' Kraken2 uriet ukoll li s-ccfDNA tal-maskli kien fih frammenti tad-DNA arkeali, inklużi frammenti tad-DNA ta' Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), u Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Il-preżenza ta' frammenti tad-DNA derivati ​​minn Euryarchaeota u Crenarchaeota, li qabel kienu jinstabu fil-komunità mikrobjali tal-maskli Kalifornjani, m'għandhiex tkun ta' sorpriża [42]. Għalkemm Euryarchaeota ħafna drabi hija assoċjata ma' kundizzjonijiet estremi, issa huwa rikonoxxut li kemm Euryarchaeota kif ukoll Crenarcheota huma fost l-aktar prokarjoti komuni fl-ambjent krijoġeniku tal-baħar [43, 44]. Il-preżenza ta' mikro-organiżmi metanoġeniċi fil-maskli mhijiex sorprendenti, minħabba rapporti reċenti ta' tnixxijiet estensivi tal-metanu minn tnixxijiet tal-qiegħ fuq il-Plateau ta' Kerguelen [45] u produzzjoni possibbli ta' metanu mikrobjali osservata 'l barra mill-kosta tal-Gżejjer Kerguelen [46].
L-attenzjoni tagħna mbagħad marret għal qari minn viruses tad-DNA. Sa fejn nafu aħna, dan huwa l-ewwel studju barra mill-mira tal-kontenut tal-virus tal-maskli. Kif mistenni, sibna frammenti tad-DNA ta' batterjofaġi (Caudovirales) (Fig. 6b). Madankollu, l-aktar DNA virali komuni ġej minn filu ta' nukleoċitoviruses, magħruf ukoll bħala l-virus tad-DNA kbir ċitoplasmiku nukleari (NCLDV), li għandu l-akbar ġenoma minn kwalunkwe virus. F'dan il-filu, il-biċċa l-kbira tas-sekwenzi tad-DNA jappartjenu għall-familji Mimimidoviridae (58%) u Poxviridae (21%), li l-ospiti naturali tagħhom jinkludu vertebrati u artropodi, filwaqt li proporzjon żgħir ta' dawn is-sekwenzi tad-DNA jappartjenu għal algi virologiċi magħrufa. Jinfetta algi ewkarjotiċi tal-baħar. Is-sekwenzi nkisbu wkoll mill-virus Pandora, il-virus ġgant bl-akbar daqs ta' ġenoma minn kwalunkwe ġeneru virali magħruf. Interessanti, il-firxa ta' ospiti magħrufa li huma infettati bil-virus, kif determinat mis-sekwenzar tas-ccfDNA tal-emolimfa, kienet relattivament kbira (Figura S3, Informazzjoni Supplimentari). Dan jinkludi viruses li jinfettaw insetti bħal Baculoviridae u Iridoviridae, kif ukoll viruses li jinfettaw l-ameba, l-alka u l-vertebrati. Sibna wkoll sekwenzi li jaqblu mal-ġenoma tal-Pithovirus sibericum. Il-pitoviruses (magħrufa wkoll bħala "viruses zombie") ġew iżolati għall-ewwel darba minn permafrost ta' 30,000 sena fis-Siberja [47]. Għalhekk, ir-riżultati tagħna huma konsistenti ma' rapporti preċedenti li juru li mhux l-ispeċi moderni kollha ta' dawn il-viruses huma estinti [48] u li dawn il-viruses jistgħu jkunu preżenti f'ekosistemi marini subartiċi remoti.
Fl-aħħar nett, ittestjajna biex naraw jekk nistgħux insibu frammenti tad-DNA minn annimali multiċellulari oħra. Total ta’ 482 kontig barrani ġew identifikati permezz ta’ BLASTN u BLASTX bil-libreriji nt, nr u RefSeq (ġenomiċi u proteini). Ir-riżultati tagħna juru li fost il-frammenti barranin ta’ ccfDNA ta’ annimali multiċellulari, id-DNA ta’ għadam tal-għadam jippredomina (Fig. 5). Instabu wkoll frammenti tad-DNA minn insetti u speċi oħra. Parti relattivament kbira mill-frammenti tad-DNA ma ġietx identifikata, possibbilment minħabba n-nuqqas ta’ rappreżentanza ta’ numru kbir ta’ speċi tal-baħar f’databases ġenomiċi meta mqabbla ma’ speċi terrestri [49].
F’dan id-dokument, napplikaw il-kunċett LB għall-maskli, fejn nargumentaw li s-sekwenzar tas-ccfDNA tal-emolimfa jista’ jipprovdi għarfien dwar il-kompożizzjoni tal-ekosistemi kostali tal-baħar. B’mod partikolari, sibna li 1) l-emolimfa tal-maskli fiha konċentrazzjonijiet relattivament għoljin (livelli ta’ mikrogrammi) ta’ frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw relattivament kbar (~1-5 kb); 2) dawn il-frammenti tad-DNA huma kemm indipendenti kif ukoll mhux indipendenti 3) Fost is-sorsi barranin ta’ dawn il-frammenti tad-DNA, sibna DNA batterjali, arkeali u virali, kif ukoll DNA ta’ annimali multiċellulari oħra; 4) L-akkumulazzjoni ta’ dawn il-frammenti tas-ccfDNA barranin fl-emolimfa sseħħ malajr u tikkontribwixxi għall-attività ta’ filtrazzjoni interna tal-maskli. Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett ta’ LB, li s’issa ġie applikat prinċipalment fil-qasam tal-bijomediċina, jikkodifika sors ta’ għarfien rikk iżda mhux esplorat li jista’ jintuża biex wieħed jifhem aħjar l-interazzjoni bejn l-ispeċi sentinella u l-ambjent tagħhom.
Minbarra l-primati, l-iżolament tas-ccfDNA ġie rrappurtat fil-mammiferi, inklużi ġrieden, klieb, qtates, u żwiemel [50, 51, 52]. Madankollu, safejn nafu aħna, l-istudju tagħna huwa l-ewwel wieħed li jirrapporta d-detezzjoni u s-sekwenzar tas-ccfDNA fi speċi tal-baħar b'sistema ta' ċirkolazzjoni miftuħa. Din il-karatteristika anatomika u l-abbiltà ta' filtrazzjoni tal-maskli jistgħu, għall-inqas parzjalment, jispjegaw il-karatteristiċi tad-daqs differenti tal-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw meta mqabbla ma' speċi oħra. Fil-bnedmin, il-biċċa l-kbira tal-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw fid-demm huma frammenti żgħar li jvarjaw fid-daqs minn 150 sa 200 bp. b'quċċata massima ta' 167 bp [34, 53]. Porzjon żgħir iżda sinifikanti tal-frammenti tad-DNA huma bejn 300 u 500 bp fid-daqs, u madwar 5% huma itwal minn 900 bp. [54]. Ir-raġuni għal din id-distribuzzjoni tad-daqs hija li s-sors ewlieni ta' ccfDNA fil-plażma jseħħ bħala riżultat tal-mewt taċ-ċelluli, jew minħabba l-mewt taċ-ċelluli jew minħabba n-nekrożi taċ-ċelluli ematopojetiċi li jiċċirkolaw f'individwi b'saħħithom jew minħabba l-apoptożi taċ-ċelluli tat-tumur f'pazjenti bil-kanċer (magħrufa bħala DNA tat-tumur li jiċċirkola). , ctDNA). Id-distribuzzjoni tad-daqs tas-ccfDNA tal-emolimfa li sibna fil-maskli varjat minn 1000 sa 5000 bp, li tissuġġerixxi li s-ccfDNA tal-maskli għandu oriġini differenti. Din hija ipoteżi loġika, peress li l-maskli għandhom sistema vaskulari semi-miftuħa u jgħixu f'ambjenti akkwatiċi tal-baħar li fihom konċentrazzjonijiet għoljin ta' DNA ġenomika mikrobjali. Fil-fatt, l-esperimenti tal-laboratorju tagħna bl-użu ta' DNA eżoġenu wrew li l-maskli jakkumulaw frammenti tad-DNA fl-ilma baħar, għall-inqas wara ftit sigħat jiġu degradati wara l-assorbiment ċellulari u/jew rilaxxati u/jew maħżuna f'diversi organizzazzjonijiet. Minħabba r-rarità taċ-ċelluli (kemm prokarjotiċi kif ukoll ewkarjotiċi), l-użu ta' kompartimenti intravalvulari se jnaqqas l-ammont ta' ccfDNA minn sorsi awto kif ukoll minn sorsi barranin. Meta nqisu l-importanza tal-immunità intrinsika tal-bivalvi u n-numru kbir ta' fagoċiti li jiċċirkolaw, aħna ipoteżizzajna wkoll li anke s-ccfDNA barrani huwa arrikkit f'fagoċiti li jiċċirkolaw li jakkumulaw DNA barrani mal-inġestjoni ta' mikro-organiżmi u/jew debris ċellulari. Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna juru li s-ccfDNA tal-emolimfa tal-bivalvi huwa repożitorju uniku ta' informazzjoni molekulari u jsaħħaħ l-istatus tagħhom bħala speċi sentinella.
Id-dejta tagħna tindika li s-sekwenzar u l-analiżi ta' frammenti ta' ccfDNA tal-emolimfa derivati ​​mill-batterji jistgħu jipprovdu informazzjoni ewlenija dwar il-flora batterika ospitanti u l-batterji preżenti fl-ekosistema marina tal-madwar. Tekniki ta' sekwenzar bl-isparar żvelaw sekwenzi tal-batterji kommensali A. atra gill li kienu jintilfu kieku ntużaw metodi konvenzjonali ta' identifikazzjoni ta' 16S rRNA, parzjalment minħabba preġudizzju tal-librerija ta' referenza. Fil-fatt, l-użu tagħna tad-dejta LB miġbura minn M. platensis fl-istess saff tal-maskli f'Kerguelen wera li l-kompożizzjoni tas-simbijonti batteriċi assoċjati mal-garġi kienet l-istess għaż-żewġ speċi ta' maskli (Fig. S4, Informazzjoni Supplimentari). Din ix-xebh ta' żewġ maskli ġenetikament differenti tista' tirrifletti l-kompożizzjoni tal-komunitajiet batteriċi fid-depożiti kesħin, sulfurużi u vulkaniċi ta' Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Livelli ogħla ta' mikro-organiżmi li jnaqqsu l-kubrit ġew deskritti sew meta jinġabru l-maskli minn żoni kostali bijoturbati [59], bħall-kosta ta' Port-au-France. Possibbiltà oħra hija li l-flora kommensali tal-maskli tista' tiġi affettwata minn trasmissjoni orizzontali [60, 61]. Hija meħtieġa aktar riċerka biex tiġi ddeterminata l-korrelazzjoni bejn l-ambjent tal-baħar, il-wiċċ tal-qiegħ tal-baħar, u l-kompożizzjoni tal-batterji simbijotiċi fil-maskli. Dawn l-istudji bħalissa għaddejjin.
It-tul u l-konċentrazzjoni tas-ccfDNA tal-emolimfa, il-faċilità ta' purifikazzjoni tagħha, u l-kwalità għolja li tippermetti sekwenzar rapidu bl-isparar huma wħud mill-ħafna vantaġġi tal-użu tas-ccfDNA tal-maskli biex tiġi vvalutata l-bijodiversità fl-ekosistemi kostali tal-baħar. Dan l-approċċ huwa effettiv b'mod speċjali għall-karatterizzazzjoni tal-komunitajiet virali (viromijiet) f'ekosistema partikolari [62, 63]. B'differenza mill-batterji, l-arkea, u l-ewkarjoti, il-ġenomi virali ma fihomx ġeni kkonservati filoġenetikament bħal sekwenzi 16S. Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-bijopsiji likwidi minn speċi indikaturi bħall-maskli jistgħu jintużaw biex jidentifikaw numru relattivament kbir ta' frammenti tal-virus tas-ccfDNA magħrufa li jinfettaw ospiti li tipikament jgħixu f'ekosistemi kostali tal-baħar. Dan jinkludi viruses magħrufa li jinfettaw protożoa, artropodi, insetti, pjanti, u viruses batteriċi (eż., batterjofaġi). Instabet distribuzzjoni simili meta eżaminajna l-viroma tas-ccfDNA tal-emolimfa tal-maskli blu (M. platensis) miġbura fl-istess saff tal-maskli f'Kerguelen (Tabella S2, Informazzjoni Supplimentari). Is-sekwenzar bl-użu ta' shotgun tas-ccfDNA huwa tabilħaqq approċċ ġdid li qed jikseb momentum fl-istudju tal-virome tal-bnedmin jew speċi oħra [21, 37, 64]. Dan l-approċċ huwa partikolarment utli għall-istudju tal-viruses tad-DNA b'żewġ linji, peress li l-ebda ġene wieħed mhu kkonservat fost il-viruses kollha tad-DNA b'żewġ linji, u dan jirrappreżenta l-aktar klassi diversa u wiesgħa ta' viruses f'Baltimore [65]. Għalkemm ħafna minn dawn il-viruses jibqgħu mhux klassifikati u jistgħu jinkludu viruses minn parti kompletament mhux magħrufa tad-dinja virali [66], sibna li l-viromes u l-firxiet ospitanti tal-maskli A. atra u M. platensis jaqgħu bejn iż-żewġ speċi. bl-istess mod (ara l-figura S3, informazzjoni addizzjonali). Din ix-xebh mhijiex sorprendenti, peress li tista' tirrifletti nuqqas ta' selettività fl-assorbiment tad-DNA preżenti fl-ambjent. Bħalissa huma meħtieġa studji futuri bl-użu ta' RNA purifikat biex jikkaratterizzaw il-virome tal-RNA.
Fl-istudju tagħna, użajna pipeline rigoruż ħafna adattat mix-xogħol ta' Kowarski u l-kollegi [37], li użaw tħassir f'żewġ stadji ta' qari miġbur u contigs qabel u wara l-assemblaġġ ta' ccfDNA nattiv, li rriżulta fi proporzjon għoli ta' qari mhux immappjat. Għalhekk, ma nistgħux neskludu li xi wħud minn dawn il-qari mhux immappjati xorta jistgħu jkollhom l-oriġini tagħhom stess, primarjament għax m'għandniex ġenoma ta' referenza għal din l-ispeċi ta' maskli. Użajna dan il-pipeline ukoll għax konna mħassba dwar il-kimeri bejn qari awto u mhux awto u t-tulijiet tal-qari ġġenerati mill-Illumina MiSeq PE75. Raġuni oħra għall-maġġoranza tal-qari mhux immappjat hija li ħafna mill-mikrobi tal-baħar, speċjalment f'żoni remoti bħal Kerguelen, ma ġewx annotati. Użajna Illumina MiSeq PE75, billi nassumu tulijiet tal-frammenti tas-ccfDNA simili għas-ccfDNA tal-bniedem. Għal studji futuri, minħabba r-riżultati tagħna li juru li s-ccfDNA tal-emolimfa għandu qari itwal mill-bnedmin u/jew il-mammiferi, nirrakkomandaw li tuża pjattaforma ta' sekwenzjar aktar adattata għal frammenti itwal tas-ccfDNA. Din il-prattika se tagħmilha ħafna aktar faċli li jiġu identifikati aktar indikazzjonijiet għal analiżi aktar profonda. Il-kisba tas-sekwenza kompluta tal-ġenoma nukleari ta' A. atra li bħalissa mhijiex disponibbli tiffaċilita wkoll ħafna d-diskriminazzjoni tas-ccfDNA minn sorsi awtonomi u mhux awtonomi. Minħabba li r-riċerka tagħna ffokat fuq il-possibbiltà li jiġi applikat il-kunċett ta' bijopsija likwida għall-maskli, nittamaw li hekk kif dan il-kunċett jintuża fir-riċerka futura, jiġu żviluppati għodod u pipelines ġodda biex jiżdied il-potenzjal ta' dan il-metodu biex jiġi studjat id-diversità mikrobjali tal-maskli fl-ekosistema tal-baħar.
Bħala bijomarkatur kliniku mhux invażiv, livelli elevati ta' ccfDNA fil-plażma umana huma assoċjati ma' diversi mard, ħsara fit-tessuti, u kundizzjonijiet ta' stress [67,68,69]. Din iż-żieda hija assoċjata mar-rilaxx ta' frammenti tad-DNA tal-oriġini tagħha stess wara ħsara fit-tessuti. Indirizzajna din il-kwistjoni bl-użu ta' stress akut tas-sħana, fejn il-maskli ġew esposti għal żmien qasir għal temperatura ta' 30 °C. Wettaqna din l-analiżi fuq tliet tipi differenti ta' maskli fi tliet esperimenti indipendenti. Madankollu, ma sibna l-ebda bidla fil-livelli ta' ccfDNA wara stress akut tas-sħana (ara l-Figura S5, informazzjoni addizzjonali). Din l-iskoperta tista' tispjega, għall-inqas parzjalment, il-fatt li l-maskli għandhom sistema ċirkolatorja semi-miftuħa u jakkumulaw ammonti kbar ta' DNA barrani minħabba l-attività għolja ta' filtrazzjoni tagħhom. Min-naħa l-oħra, il-maskli, bħal ħafna invertebrati, jistgħu jkunu aktar reżistenti għall-ħsara fit-tessuti kkawżata mill-istress, u b'hekk jillimitaw ir-rilaxx ta' ccfDNA fl-emolinfa tagħhom [70, 71].
Sal-lum, l-analiżi tad-DNA tal-bijodiversità fl-ekosistemi akkwatiċi ffokat prinċipalment fuq il-metabarcoding tad-DNA ambjentali (eDNA). Madankollu, dan il-metodu ġeneralment ikun limitat fl-analiżi tal-bijodiversità meta jintużaw primers. L-użu tas-sekwenzar shotgun jevita l-limitazzjonijiet tal-PCR u l-għażla preġudikata tas-settijiet tal-primers. Għalhekk, f'ċertu sens, il-metodu tagħna huwa eqreb lejn il-metodu ta' sekwenzar Shotgun tal-eDNA b'rendiment għoli użat reċentement, li kapaċi jissekwenza direttament DNA frammentat u janalizza kważi l-organiżmi kollha [72, 73]. Madankollu, hemm numru ta' kwistjonijiet fundamentali li jiddistingwu LB mill-metodi standard tal-eDNA. Naturalment, id-differenza ewlenija bejn l-eDNA u l-LB hija l-użu ta' ospiti ta' filtri naturali. L-użu ta' speċi tal-baħar bħal sponoż u bivalvi (Dresseina spp.) bħala filtru naturali għall-istudju tal-eDNA ġie rrappurtat [74, 75]. Madankollu, l-istudju ta' Dreissena uża bijopsiji ta' tessuti li minnhom ġie estratt id-DNA. L-analiżi tas-ccfDNA minn LB ma teħtieġx bijopsija tat-tessut, tagħmir speċjalizzat u xi kultant għali u loġistika assoċjata mal-eDNA jew il-bijopsija tat-tessut. Fil-fatt, dan l-aħħar irrappurtajna li s-ccfDNA minn LB jista' jinħażen u jiġi analizzat bl-appoġġ tal-FTA mingħajr ma tinżamm katina tal-kesħa, li hija sfida ewlenija għar-riċerka f'żoni remoti [76]. L-estrazzjoni tas-ccfDNA minn bijopsiji likwidi hija wkoll sempliċi u tipprovdi DNA ta' kwalità għolja għas-sekwenzar shotgun u l-analiżi tal-PCR. Dan huwa vantaġġ kbir minħabba xi wħud mil-limitazzjonijiet tekniċi assoċjati mal-analiżi tal-eDNA [77]. Is-sempliċità u l-ispiża baxxa tal-metodu ta' teħid ta' kampjuni huma wkoll partikolarment adattati għal programmi ta' monitoraġġ fit-tul. Minbarra l-kapaċità għolja ta' filtrazzjoni tagħhom, karatteristika oħra magħrufa sew tal-bivalvi hija l-kompożizzjoni kimika tal-mukopolisakkaridi tal-mukus tagħhom, li tippromwovi l-assorbiment tal-viruses [78, 79]. Dan jagħmel il-bivalvi filtru naturali ideali għall-karatterizzazzjoni tal-bijodiversità u l-impatt tat-tibdil fil-klima f'ekosistema akkwatika partikolari. Għalkemm il-preżenza ta' frammenti tad-DNA derivati ​​mill-ospitanti tista' titqies bħala limitazzjoni tal-metodu meta mqabbel mal-eDNA, l-ispiża assoċjata mal-fatt li jkollok ccfDNA nattiv bħal dan meta mqabbel mal-eDNA hija simultanjament mifhuma għall-ammont vast ta' informazzjoni disponibbli għal studji dwar is-saħħa tal-ospitanti offset. Dan jinkludi l-preżenza ta' sekwenzi virali integrati fil-ġenoma tal-ospitant ospitanti. Dan huwa speċjalment importanti għall-maskli, minħabba l-preżenza ta' retrovirus lewkemiċi trażmessi orizzontalment fil-bivalvi [80, 81]. Vantaġġ ieħor tal-LB fuq l-eDNA huwa li jisfrutta l-attività fagoċitika taċ-ċelloli tad-demm li jiċċirkolaw fl-emolimfa, li tħaddan il-mikroorganiżmi (u l-ġenomi tagħhom). Il-fagoċitożi hija l-funzjoni ewlenija taċ-ċelloli tad-demm fil-bivalvi [82]. Fl-aħħar nett, il-metodu jieħu vantaġġ mill-kapaċità għolja ta' filtrazzjoni tal-maskli (medja ta' 1.5 l/siegħa ta' ilma baħar) u ċ-ċirkolazzjoni ta' jumejn, li jżidu t-taħlit ta' saffi differenti ta' ilma baħar, li jippermettu l-qbid ta' eDNA eterologu. [83, 84]. Għalhekk, l-analiżi tas-ccfDNA tal-maskli hija triq interessanti minħabba l-impatti nutrittivi, ekonomiċi u ambjentali tal-maskli. Simili għall-analiżi tal-LB miġbur mill-bnedmin, dan il-metodu jiftaħ ukoll il-possibbiltà li jitkejlu l-bidliet ġenetiċi u epiġenetiċi fid-DNA ospitanti b'reazzjoni għal sustanzi eżoġeni. Pereżempju, jistgħu jiġu previsti teknoloġiji ta' sekwenzjar tat-tielet ġenerazzjoni biex iwettqu analiżi tal-metilazzjoni fil-ġenoma kollu f'ccfDNA nattiv bl-użu ta' sekwenzjar tan-nanopori. Dan il-proċess għandu jiġi ffaċilitat mill-fatt li t-tul tal-frammenti tas-ccfDNA tal-maskli huwa idealment kompatibbli ma' pjattaformi ta' sekwenzjar b'qari twil li jippermettu analiżi tal-metilazzjoni tad-DNA fil-ġenoma kollu minn ġirja waħda ta' sekwenzjar mingħajr il-ħtieġa għal trasformazzjonijiet kimiċi.85,86] Din hija possibbiltà interessanti, peress li ntwera li x-xejriet tal-metilazzjoni tad-DNA jirriflettu rispons għall-istress ambjentali u jippersistu fuq ħafna ġenerazzjonijiet. Għalhekk, jista' jipprovdi għarfien siewi dwar il-mekkaniżmi sottostanti li jirregolaw ir-rispons wara l-espożizzjoni għat-tibdil fil-klima jew għal sustanzi niġġiesa [87]. Madankollu, l-użu tal-LB mhuwiex mingħajr limitazzjonijiet. M'hemmx għalfejn ngħidu, dan jirrikjedi l-preżenza ta' speċi indikaturi fl-ekosistema. Kif imsemmi hawn fuq, l-użu tal-LB biex tiġi vvalutata l-bijodiversità ta' ekosistema partikolari jirrikjedi wkoll pipeline bijoinformatika rigoruża li tqis il-preżenza ta' frammenti tad-DNA mis-sors. Problema ewlenija oħra hija d-disponibbiltà ta' ġenomi ta' referenza għall-ispeċi tal-baħar. Huwa ttamat li inizjattivi bħall-Proġett tal-Ġenomi tal-Mammali Marini u l-proġett Fish10k li twaqqaf reċentement [88] se jiffaċilitaw tali analiżi fil-futur. L-applikazzjoni tal-kunċett LB għal organiżmi tal-baħar li jieklu permezz ta' filtru hija wkoll kompatibbli mal-aħħar avvanzi fit-teknoloġija tas-sekwenzar, u dan jagħmilha adattata sew għall-iżvilupp ta' bijomarkaturi multi-ohm biex jipprovdu informazzjoni importanti dwar is-saħħa tal-ħabitats tal-baħar b'reazzjoni għall-istress ambjentali.
Id-dejta tas-sekwenzar tal-ġenoma ġiet depożitata fl-Arkivju tal-Qari tas-Sekwenza tal-NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 taħt Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ L-impatt tat-tibdil fil-klima fuq il-ħajja tal-baħar u l-ekosistemi. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Ikkunsidra l-impatti kkombinati tat-tibdil fil-klima u stressors lokali oħra fuq l-ambjent tal-baħar. ambjent xjentifiku ġenerali. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Xjenza tal-ewwel ta’ Marzu. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tolleranza mnaqqsa għas-sħana taħt kundizzjonijiet ta' stress tas-sħana ripetittiv tispjega l-mortalità għolja tas-sajf tal-mussels blu. Rapport xjentifiku 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Bidliet riċenti fil-frekwenza, il-kawżi u l-firxa tal-imwiet tal-annimali. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Patoġeni multipli mhux speċifiċi għall-ispeċi setgħu kkawżaw mortalità tal-massa ta' Pinna nobilis. Ħajja. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. L-impatt potenzjali tat-tibdil fil-klima fuq il-mard żoonotiku tal-Artiku. Int J Circumpolar Health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Il-maskli blu (Mytilus edulis spp.) bħala organiżmi sinjalanti fil-monitoraġġ tat-tniġġis kostali: reviżjoni. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrazzjoni tal-bijopsija likwida fit-trattament tal-kanċer. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maturazzjoni tal-bijopsija likwida: Tippermetti li d-DNA tat-tumur jiċċirkola. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aċidi nuklejċi fil-plażma umana. Minuti tal-laqgħat tas-sussidjarji ta' Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rwol ġdid għad-DNA ħieles miċ-ċelloli bħala markatur molekulari għat-trattament tal-kanċer. Kwantifikazzjoni tal-analiżi bijomolari. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Il-bijopsija likwida tidħol fil-klinika – kwistjonijiet ta' implimentazzjoni u sfidi futuri. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW u oħrajn. Id-DNA tal-fetu hija preżenti fil-plażma u s-serum matern. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studju tal-kors tat-tqala u l-kumplikazzjonijiet tagħha bl-użu ta' RNA extraċellulari li jiċċirkola fid-demm tan-nisa waqt it-tqala. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Bijopsija likwida: DNA ħieles miċ-ċelluli tad-donatur jintuża biex jinstabu leżjonijiet alloġeniċi fi trapjant tal-kliewi. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovazzjonijiet fid-dijanjostika prenatali: sekwenzar tal-ġenoma tal-plażma materna. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Sejbien rapidu ta' patoġeni b'sekwenzar metaġenomiku tal-ġenerazzjoni li jmiss ta' fluwidi tal-ġisem infettati. Nat Medicine. 2021;27:115-24.