Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Il-bijopsija likwida (LB) hija kunċett li qed jikseb popolarità malajr fil-qasam bijomediku.Il-kunċett huwa prinċipalment ibbażat fuq l-iskoperta ta 'frammenti ta' DNA extraċellulari li jiċċirkola (ccfDNA), li huma prinċipalment rilaxxati bħala frammenti żgħar wara l-mewt taċ-ċelluli f'diversi tessuti.Proporzjon żgħir ta' dawn il-frammenti joriġinaw minn tessuti jew organiżmi barranin (barranin).Fix-xogħol attwali, applikajna dan il-kunċett għall-maskli, speċi sentinella magħrufa għall-kapaċità għolja ta’ filtrazzjoni tal-ilma baħar.Aħna nużaw il-kapaċità tal-maskli li jaġixxu bħala filtri naturali biex jaqbdu frammenti tad-DNA ambjentali minn varjetà ta 'sorsi biex nipprovdu informazzjoni dwar il-bijodiversità tal-ekosistemi kostali tal-baħar.Ir-riżultati tagħna juru li l-emolinfa tal-mussel fih frammenti tad-DNA li jvarjaw ħafna fid-daqs, minn 1 sa 5 kb.Is-sekwenzjar Shotgun wera li numru kbir ta 'frammenti tad-DNA huma ta' oriġini mikrobjali barranija.Fosthom, sibna frammenti tad-DNA minn batterji, archaea, u viruses, inklużi viruses magħrufa li jinfettaw varjetà ta 'hosts li komunement jinstabu fl-ekosistemi tal-baħar kostali.Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett ta 'LB applikat għall-maskli jirrappreżenta sors ta' għarfien għani iżda għadu mhux esplorat dwar id-diversità tal-mikrobi fl-ekosistemi kostali tal-baħar.
L-impatt tat-tibdil fil-klima (CC) fuq il-bijodiversità tal-ekosistemi tal-baħar huwa qasam ta’ riċerka li qed jikber malajr.It-tisħin globali mhux biss jikkawża stress fiżjoloġiku importanti, iżda jimbotta wkoll il-limiti evoluzzjonarji tal-istabbiltà termali tal-organiżmi tal-baħar, li jaffettwa l-ħabitat ta 'numru ta' speċi, u jġiegħelhom ifittxu kundizzjonijiet aktar favorevoli [1, 2].Minbarra li jaffettwa l-bijodiversità tal-metazoans, CC tfixkel il-bilanċ delikat tal-interazzjonijiet host-mikrobali.Din id-disbatterjożi mikrobjali toħloq theddida serja għall-ekosistemi tal-baħar peress li tagħmel l-organiżmi tal-baħar aktar suxxettibbli għal patoġeni infettivi [3, 4].Huwa maħsub li l-SS għandhom rwol importanti fl-imwiet tal-massa, li hija problema serja għall-ġestjoni tal-ekosistemi tal-baħar globali [5, 6].Din hija kwistjoni importanti minħabba l-impatti ekonomiċi, ekoloġiċi u nutrittivi ta' ħafna speċi tal-baħar.Dan hu veru speċjalment għall-bivalvi li jgħixu fir-reġjuni polari, fejn l-effetti tas-CK huma aktar immedjati u severi [6, 7].Fil-fatt, bivalvi bħal Mytilus spp.jintużaw ħafna biex jimmonitorjaw l-effetti tas-CC fuq l-ekosistemi tal-baħar.Mhux ta 'b'xejn, numru relattivament kbir ta' bijomarkaturi ġew żviluppati biex jimmonitorjaw is-saħħa tagħhom, ħafna drabi bl-użu ta 'approċċ fuq żewġ saffi li jinvolvi bijomarkaturi funzjonali bbażati fuq attività enżimatika jew funzjonijiet ċellulari bħall-vijabbiltà taċ-ċelluli u l-attività fagoċitika [8].Dawn il-metodi jinkludu wkoll il-kejl tal-konċentrazzjoni ta 'indikaturi speċifiċi tal-pressjoni li jakkumulaw fit-tessuti rotob wara l-assorbiment ta' ammonti kbar ta 'ilma baħar.Madankollu, il-kapaċità ta 'filtrazzjoni għolja u s-sistema ċirkolatorja semi-miftuħa tal-bivalvi jipprovdu opportunità biex jiġu żviluppati bijomarkaturi tal-emolymph ġodda bl-użu tal-kunċett ta' bijopsija likwida (LB), approċċ sempliċi u minimament invażiv għall-ġestjoni tal-pazjent.kampjuni tad-demm [9, 10].Għalkemm jistgħu jinstabu diversi tipi ta 'molekuli li jiċċirkolaw fil-LB uman, dan il-kunċett huwa bbażat primarjament fuq analiżi ta' sekwenzar tad-DNA ta 'frammenti ta' DNA extraċellulari li jiċċirkolaw (ccfDNA) fil-plażma.Fil-fatt, il-preżenza ta 'DNA li jiċċirkola fil-plażma umana ilha magħrufa minn nofs is-seklu 20 [11], iżda huwa biss f'dawn l-aħħar snin li l-miġja ta' metodi ta 'sekwenzjar ta' produzzjoni għolja wasslet għal dijanjosi klinika bbażata fuq ccfDNA.Il-preżenza ta 'dawn il-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw hija parzjalment dovuta għar-rilaxx passiv ta' DNA ġenomika (nukleari u mitokondrijali) wara l-mewt taċ-ċelluli. F'individwi b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta 'ccfDNA hija normalment baxxa (<10 ng/mL) iżda tista' tiżdied b'5-10 darbiet f'pazjenti li jbatu minn diversi patoloġiji jew soġġetti għal stress, li jirriżulta fi ħsara fit-tessuti. F'individwi b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta 'ccfDNA hija normalment baxxa (<10 ng/mL) iżda tista' tiżdied b'5-10 darbiet f'pazjenti li jbatu minn diversi patoloġiji jew soġġetti għal stress, li jirriżulta fi ħsara fit-tessuti. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. F'nies b'saħħithom, il-konċentrazzjoni ta 'cccDNA hija normalment baxxa (<10 ng/mL), iżda tista' tiżdied b'5-10 darbiet f'pazjenti b'diversi patoloġiji jew taħt stress li jwassal għal ħsara fit-tessuti.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或病理或承常较低（<10 ng/mL）加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 病理 或 扅 理 或 扏 手增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелича ны пи 10 нг/мл с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Il-konċentrazzjonijiet ta 'ccfDNA huma ġeneralment baxxi (<10 ng/ml) f'individwi b'saħħithom, iżda jistgħu jiżdiedu 5-10 darbiet f'pazjenti b'diversi patoloġiji jew stress, li jirriżultaw fi ħsara fit-tessuti.Id-daqs tal-frammenti ccfDNA jvarja ħafna, iżda ġeneralment ivarja minn 150 sa 200 bp.[12].Analiżi ta 'ccfDNA awto-derivat, jiġifieri, ccfDNA minn ċelluli ospitanti normali jew trasformati, tista' tintuża biex tiskopri bidliet ġenetiċi u epiġenetiċi preżenti fil-ġenoma nukleari u/jew mitokondrijali, u b'hekk tgħin lill-kliniċi jagħżlu terapiji speċifiċi mmirati lejn molekulari [13] .Madankollu, ccfDNA jista 'jinkiseb minn sorsi barranin bħal ccfDNA minn ċelluli tal-fetu waqt it-tqala jew minn organi trapjantati [14,15,16,17].ccfDNA huwa wkoll sors importanti ta 'informazzjoni għall-iskoperta tal-preżenza ta' aċidi nuklejċi ta 'aġent infettiv (barrani), li jippermetti skoperta mhux invażiva ta' infezzjonijiet mifruxa mhux identifikati minn kulturi tad-demm, tevita bijopsija invażiva ta 'tessut infettat [18].Studji reċenti tabilħaqq wrew li d-demm uman fih sors rikk ta 'informazzjoni li jista' jintuża biex jiġu identifikati patoġeni virali u batterjali, u li madwar 1% tal-ccfDNA misjub fil-plażma umana huwa ta 'oriġini barranija [19].Dawn l-istudji juru li l-bijodiversità tal-mikrobijoma li jiċċirkola ta' organiżmu tista' tiġi vvalutata bl-użu ta' analiżi ccfDNA.Madankollu, sa ftit ilu, dan il-kunċett kien użat esklussivament fil-bnedmin u, sa ċertu punt, f'vertebrati oħra [20, 21].
Fid-dokument preżenti, nużaw il-potenzjal LB biex janalizzaw il-ccfDNA ta 'Aulacomya atra, speċi tan-Nofsinhar li tinstab komunement fil-Gżejjer Kerguelen subantartiċi, grupp ta' gżejjer fuq plateau kbir li ffurmat 35 miljun sena ilu.eruzzjoni vulkanika.Bl-użu ta 'sistema sperimentali in vitro, sibna li frammenti tad-DNA fl-ilma baħar jittieħdu malajr mill-maskli u jidħlu fil-kompartiment tal-emolymph.Is-sekwenzjar Shotgun wera li l-emolymph ccfDNA tal-mussel fih frammenti tad-DNA ta 'oriġini tiegħu stess u mhux awto, inklużi batterji simbjotiċi u frammenti tad-DNA minn bijomi tipiċi ta' ekosistemi kostali tal-baħar vulkaniċi kesħin.Hemolymph ccfDNA fih ukoll sekwenzi virali derivati ​​minn viruses b'meded ta' ospitanti differenti.Sibna wkoll frammenti tad-DNA minn annimali multiċellulari bħal ħut tal-għadam, anemoni tal-baħar, alka u insetti.Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett LB jista 'jiġi applikat b'suċċess għall-invertebrati tal-baħar biex jiġġenera repertorju ġenomic għani fl-ekosistemi tal-baħar.
Adulti (55-70 mm tul) Mytilus platensis (M. platensis) u Aulacomya atra (A. atra) inġabru mix-xtut tal-blat intertidal ta 'Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E .).Gżejjer Kerguelen f'Diċembru 2018. Maskli oħra blu adulti (Mytilus spp.) Inkisbu minn fornitur kummerċjali (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) u tqiegħdu f'tank effervexxenti b'temperatura kkontrollata (4°C) li kien fih 10–20 L ta' salmura artifiċjali 32‰.(melħ tal-baħar artifiċjali Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Għal kull esperiment, tkejlu t-tul u l-piż tal-qxur individwali.
Protokoll ta' aċċess miftuħ b'xejn għal dan il-programm huwa disponibbli onlajn (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Fil-qosor, l-emolymph LB inġabret mill-muskoli abductor kif deskritt [22].L-emolymph ġie ċċarat permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'1200 × g għal 3 minuti, is-supernatant ġie ffriżat (-20 ° C) sakemm jintuża.Għall-iżolament u l-purifikazzjoni ta 'cfDNA, kampjuni (1.5-2.0 ml) ġew imdewweb u pproċessati bl-użu tal-kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.ccfDNA kien maħżun f'-80°C sa aktar analiżi.F'xi esperimenti, ccfDNA ġie iżolat u purifikat bl-użu tal-QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Id-DNA purifikat ġie kkwantifikat bl-użu ta' assay PicoGreen standard.Id-distribuzzjoni tal-framment tal-ccfDNA iżolat ġiet analizzata permezz ta 'elettroforeżi kapillari bl-użu ta' bioanalizzatur Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) bl-użu ta 'Kit tad-DNA ta' Sensittività Għolja.L-assaġġ sar bl-użu ta' 1 µl tal-kampjun ta' ccfDNA skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Għas-sekwenzjar ta 'frammenti ta' hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) ħejja libreriji ta 'shotgun bl-użu tal-kit Illumina DNA Mix tal-kit Illumina MiSeq PE75.Intuża adapter standard (BioO).Fajls tad-dejta mhux maħduma huma disponibbli mill-Arkivju tal-Qari tas-Sekwenza NCBI (SRR8924808 u SRR8924809).Il-kwalità bażika tal-qari ġiet evalwata bl-użu ta' FastQC [23].Trimmomatic [24] intuża għall-adapters tal-qtugħ u qari ta' kwalità fqira.Il-qari ta 'shotgun bi truf paired kienu FLASH magħquda f'qari singolu itwal b'koinċidenza minima ta' 20 bp biex jiġu evitati tlaqqigħ ħażin [25]. Qari magħquda ġew annotati b'BLASTN bl-użu ta 'database ta' Tassonomija NCBI bivalvi (valur e < 1e-3 u 90% omoloġija), u l-masking ta 'sekwenzi ta' kumplessità baxxa sar permezz ta 'TRAB [26]. Qari magħquda ġew annotati b'BLASTN bl-użu ta 'database ta' Tassonomija NCBI bivalvi (valur e < 1e-3 u 90% omoloġija), u l-masking ta 'sekwenzi ta' kumplessità baxxa sar permezz ta 'TRAB [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло но сложной слологии пользованием TRAB [26]. Qari miġbura ġew annotati ma 'BLASTN bl-użu tad-database ta' tassonomija bivalvi NCBI (valur e < 1e-3 u 90% omoloġija), u maskra ta 'sekwenza ta' kumplessità baxxa twettqet bl-użu ta 'TRAB [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数并的诌数诌数＿）低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 并 读数 Ａ ， 读数 ） ） 用 用 用 注释复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой сономичесанкой сономической Объединенные чтения были аннотированы с помощью тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей нислокож низнокобы с использованием TRAB [26]. Qari miġbura ġew annotati b'BLASTN bl-użu tad-database tassonomika bivalvi NCBI (valur e <1e-3 u 90% omoloġija), u l-masking ta 'sekwenza ta' kumplessità baxxa twettaq bl-użu ta 'TRAB [26].Qari kienu maqsuma f'żewġ gruppi: relatati ma 'sekwenzi bivalvi (hawnhekk imsejħa self-reads) u mhux relatati (non-self-reads).Żewġ gruppi ġew immuntati separatament bl-użu ta 'MEGAHIT biex jiġġeneraw kontigs [27].Sadanittant, id-distribuzzjoni tassonomika tal-qari tal-mikrobijoma aljeni ġiet ikklassifikata bl-użu ta 'Kraken2 [28] u rappreżentata grafikament minn pie chart Krona fuq Galaxy [29, 30].L-aħjar kmers ġie determinat li jkun kmers-59 mill-esperimenti preliminari tagħna. L-awtokontigs imbagħad ġew identifikati permezz ta 'allinjament ma' BLASTN (database NCBI bivalvi, valur e < 1e-10 u 60% omoloġija) għal annotazzjoni finali. L-awtokontigs imbagħad ġew identifikati permezz ta 'allinjament ma' BLASTN (database NCBI bivalvi, valur e < 1e-10 u 60% omoloġija) għal annotazzjoni finali. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN BI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. L-awto-kontigs imbagħad ġew identifikati billi tqabbel ma' BLASTN (database bivalvi NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija) għall-annotazzjoni finali.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识对齐来识堫褐性识廿褛识廫过与BLASTN最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сончательной аннотации путем сончательной х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). L-awto-kontigs imbagħad ġew identifikati għall-annotazzjoni finali billi tqabbel ma' BLASTN (database bivalvi NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija). B'mod parallel, kontigs tal-grupp nonself ġew annotati b'BLASTN (database nt NCBI, valur e < 1e-10 u 60% omoloġija). B'mod parallel, kontigs tal-grupp nonself ġew annotati b'BLASTN (database nt NCBI, valur e < 1e-10 u 60% omoloġija). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных 10, 10 гомология 60%). B'mod parallel, kontigs ta 'gruppi barranin ġew annotati ma' BLASTN (database NT NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASBINC ачение e <1e-10 и гомология 60%). B'mod parallel, kontigs ta 'grupp mhux awtonomu ġew annotati ma' BLASTN (database nt NCBI, valur e <1e-10 u 60% omoloġija). BLASTX sar ukoll fuq nonself contigs bl-użu tad-databases tal-proteini nru u RefSeq NCBI (valur e < 1e-10 u 60% omoloġija). BLASTX sar ukoll fuq nonself contigs bl-użu tad-databases tal-proteini nru u RefSeq NCBI (valur e < 1e-10 u 60% omoloġija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных бель на беле на 10 и гомология 60%). BLASTX sar ukoll fuq kontigs mhux awtonomi bl-użu tad-databases tal-proteini nru u RefSeq NCBI (valur e < 1e-10 u 60% omoloġija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怺 性 60%。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怺 性 60%。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безных безни NC ч 1-и Ref. гомология 60%). BLASTX sar ukoll fuq kontigs mhux awtonomi bl-użu tad-databases tal-proteini nru u RefSeq NCBI (valur e <1e-10 u 60% omoloġija).Il-gruppi BLASTN u BLASTX ta 'kontigs mhux awtonomi jirrappreżentaw il-kontigs finali (ara l-fajl Supplimentari).
Il-primers użati għall-PCR huma elenkati fit-Tabella S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) intużat biex jamplifika l-ġeni fil-mira ccfDNA.Intużaw il-kundizzjonijiet ta 'reazzjoni li ġejjin: denaturazzjoni f'95 °C għal 3 minuti, 95 °C għal minuta, issettja temperatura ta' ttemprar għal minuta, titwil f'72 °C għal minuta, 35 ċiklu, u finalment 72 °C fi żmien 10 minuti..Il-prodotti tal-PCR ġew separati b'elettroforesi f'ġels tal-agarose (1.5%) li fihom SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) f'95 V.
Il-maskli (Mytilus spp.) ġew akklimatizzati f'500 ml ilma baħar ossiġenat (32 PSU) għal 24 siegħa f'4°C.Plasmid DNA li kien fih inserzjoni li tikkodifika s-sekwenza umana tal-galectin-7 cDNA (numru ta 'adeżjoni NCBI L07769) ġie miżjud mal-kunjett f'konċentrazzjoni finali ta' 190 μg/μl.Maskli inkubati taħt l-istess kundizzjonijiet mingħajr żieda tad-DNA kienu l-kontroll.It-tielet tank tal-kontroll kien fih DNA mingħajr mussels.Biex tissorvelja l-kwalità tad-DNA fl-ilma baħar, ittieħdu kampjuni tal-ilma baħar (20 μl; tliet ripetizzjonijiet) minn kull tank fil-ħin indikat.Għat-traċċabilità tad-DNA tal-plasmid, il-maskli LB inħasdu fil-ħinijiet indikati u ġew analizzati b'qPCR u ddPCR.Minħabba l-kontenut għoli ta 'melħ ta' l-ilma baħar, l-alikwoti ġew dilwiti f'ilma ta 'kwalità PCR (1:10) qabel l-analiżi PCR kollha.
Digital droplet PCR (ddPCR) twettqet bl-użu tal-protokoll BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Uża l-profil tat-temperatura biex tiddetermina t-temperatura ottima (Tabella S1).Qtar ġew iġġenerati bl-użu ta 'ġeneratur tal-qatra QX200 (BioRad).ddPCR twettqet kif ġej: 95 ° C għal 5 min, 50 ċiklu ta '95 ° C għal 30 s u temperatura ta' ittemprar partikolari għal 1 min u 72 ° C għal 30 s, 4 ° C għal 5 min u 90 ° C fi żmien 5 minuti.In-numru ta' qtar u reazzjonijiet pożittivi (numru ta' kopji/µl) ġew imkejla bl-użu ta' qtar QX200 (BioRad).Kampjuni b'inqas minn 10,000 qtar ġew irrifjutati.Il-kontroll tal-mudell ma sarx kull darba li ddPCR tħaddem.
qPCR twettqet bl-użu ta 'Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Awstralja) u primers speċifiċi LGALS7.Il-PCR kwantitattivi kollha saru f'20 µl bl-użu ta' QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR inbeda b'inkubazzjoni ta' 15-il minuta f'95°C segwita minn 40 ċiklu f'95°C għal 10 sekondi u f'60°C għal 60 sekonda b'ġbir wieħed tad-dejta.Il-kurvi tat-tidwib ġew iġġenerati bl-użu ta 'kejl suċċessiv f'95 ° C għal 5 s, 65 ° C għal 60 s, u 97 ° C fl-aħħar tal-qPCR.Kull qPCR twettqet fi tliet kopji, ħlief għall-kampjuni ta' kontroll.
Peress li l-maskli huma magħrufa għar-rata għolja ta 'filtrazzjoni tagħhom, l-ewwel investigajna jekk jistgħux jiffiltraw u jżommu frammenti tad-DNA preżenti fl-ilma baħar.Konna interessati wkoll jekk dawn il-frammenti jakkumulawx fis-sistema limfatika semi-miftuħa tagħhom.Aħna solvejna din il-kwistjoni b'mod sperimentali billi ntraċċaw id-destin ta 'frammenti tad-DNA solubbli miżjuda mat-tankijiet tal-maskli blu.Biex niffaċilitaw it-traċċar tal-frammenti tad-DNA, użajna DNA plasmid barrani (mhux awto) li kien fih il-ġene uman galectin-7.ddPCR traċċi frammenti tad-DNA tal-plasmid fl-ilma baħar u l-maskli.Ir-riżultati tagħna juru li jekk l-ammont ta 'frammenti tad-DNA fl-ilma baħar baqa' relattivament kostanti matul iż-żmien (sa 7 ijiem) fin-nuqqas ta 'maskli, allura fil-preżenza tal-maskli dan il-livell kważi kompletament sparixxa fi żmien 8 sigħat (Fig. 1a, b).Frammenti ta 'DNA eżoġenu nstabu faċilment fi żmien 15 min fil-fluwidu intravalvulari u hemolymph (Fig. 1c).Dawn il-frammenti xorta jistgħu jiġu skoperti sa 4 sigħat wara l-espożizzjoni.Din l-attività ta' filtrazzjoni fir-rigward ta' frammenti tad-DNA hija komparabbli mal-attività ta' filtrazzjoni ta' batterji u alka [31].Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-maskli jistgħu jiffiltraw u jakkumulaw DNA barrani fil-kompartimenti tal-fluwidu tagħhom.
Konċentrazzjonijiet relattivi tad-DNA tal-plażmidu fl-ilma baħar fil-preżenza (A) jew in-nuqqas (B) tal-maskli, imkejla b'ddPCR.F'A, ir-riżultati huma espressi bħala perċentwali, bil-fruntieri tal-kaxxi jirrappreżentaw il-75 u l-25 perċentili.Il-kurva logaritmika mwaħħla tidher bl-aħmar, u ż-żona sfumata bil-griż tirrappreżenta l-intervall ta' kunfidenza ta' 95%.F'B, il-linja ħamra tirrappreżenta l-medja u l-linja blu tirrappreżenta l-intervall ta' kunfidenza ta' 95% għall-konċentrazzjoni.C Akkumulazzjoni tad-DNA tal-plasmid fl-emolymph u l-fluwidu valvulari tal-maskli f'ħinijiet differenti wara ż-żieda tad-DNA tal-plasmid.Ir-riżultati huma ppreżentati bħala kopji assoluti misjuba/mL (±SE).
Sussegwentement, investigajna l-oriġini ta 'ccfDNA fil-maskli miġbura minn sodod tal-maskli fuq il-Gżejjer Kerguelen, grupp remot ta' gżejjer b'influwenza antropoġenika limitata.Għal dan il-għan, cccDNA mill-emolymphs tal-mussel ġie iżolat u ppurifikat b'metodi komunement użati biex jippurifika cccDNA uman [32, 33].Aħna sibna li l-konċentrazzjonijiet medji ta 'emolymph ccfDNA fil-maskli huma fil-mikrogrammi baxxi għal kull ml ta' medda ta 'emolymph (ara Tabella S2, Informazzjoni Supplimentari).Din il-firxa ta 'konċentrazzjonijiet hija ħafna akbar minn nies b'saħħithom (nanogrammi baxxi għal kull millilitru), iżda f'każijiet rari, f'pazjenti bil-kanċer, il-livell ta' ccfDNA jista 'jilħaq diversi mikrogrammi għal kull millilitru [34, 35].Analiżi tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-emolymph ccfDNA wriet li dawn il-frammenti jvarjaw ħafna fid-daqs, li jvarjaw minn 1000 bp sa 1000 bp.sa 5000 bp (Fig. 2).Riżultati simili nkisbu bl-użu tal-QIAamp Investigator Kit ibbażat fuq is-silika, metodu użat komunement fix-xjenza forensika biex jiġi iżolat u purifikat malajr DNA ġenomika minn kampjuni ta 'DNA ta' konċentrazzjoni baxxa, inkluż ccfDNA [36].
Elettroforegramma ccfDNA rappreżentattiva ta 'emolymph mussell.Estratt b'NucleoSnap Plasma Kit (fuq) u QIAamp DNA Investigator Kit.B Plott tal-vjolin li juri d-distribuzzjoni tal-konċentrazzjonijiet ta' hemolymph ccfDNA (±SE) fil-maskli.Il-linji suwed u ħomor jirrappreżentaw il-medjan u l-ewwel u t-tielet kwartili, rispettivament.
Madwar 1% ta 'ccfDNA fil-bnedmin u l-primati għandu sors barrani [21, 37].Minħabba s-sistema ċirkolatorja semi-miftuħa ta 'bivalvi, ilma baħar rikk fil-mikrobi, u d-distribuzzjoni tad-daqs ta' ccfDNA tal-molluski, aħna ipoteżijna li l-emolymph ccfDNA tal-mussel jista 'jkun fih ġabra rikka u diversa ta' DNA mikrobjali.Biex nittestjaw din l-ipoteżi, aħna sekwenzajna hemolymph ccfDNA minn kampjuni ta 'Aulacomya atra miġbura mill-Gżejjer Kerguelen, li wasslu għal aktar minn 10 miljun qari, li 97.6% minnhom għaddew mill-kontroll tal-kwalità.Il-qari mbagħad ġie kklassifikat skont sorsi awto u mhux awtoma bl-użu tad-databases bivalvi BLASTN u NCBI (Fig. S1, Informazzjoni Supplimentari).
Fil-bnedmin, kemm DNA nukleari kif ukoll mitokondrijali jistgħu jiġu rilaxxati fid-demm [38].Madankollu, fl-istudju preżenti, ma kienx possibbli li tiġi deskritta fid-dettall id-DNA ġenomika nukleari tal-maskli, peress li l-ġenoma A. atra ma ġiex sekwenzat jew deskritt.Madankollu, stajna nidentifikaw numru ta 'frammenti ta' ccfDNA ta 'oriġini tagħna stess bl-użu tal-librerija tal-bivalvi (Fig. S2, Informazzjoni Supplimentari).Aħna kkonfermajna wkoll il-preżenza ta 'frammenti tad-DNA ta' l-oriġini tagħna stess permezz ta 'amplifikazzjoni PCR diretta ta' dawk il-ġeni A. atra li kienu sekwenzati (Fig. 3).Bl-istess mod, peress li l-ġenoma mitokondrijali ta 'A. atra huwa disponibbli f'databases pubbliċi, wieħed jista' jsib evidenza għall-preżenza ta 'frammenti mitokondrijali ccfDNA fl-emolymph ta' A. atra.Il-preżenza ta 'frammenti tad-DNA mitokondrijali ġiet ikkonfermata permezz ta' amplifikazzjoni tal-PCR (Fig. 3).
Diversi ġeni mitokondrijali kienu preżenti fl-emolymph ta 'A. atra (tikek ħomor - numru tal-istokk: SRX5705969) u M. platensis (tikek blu - numru tal-istokk: SRX5705968) amplifikati b'PCR.Figura adattata minn Breton et al., 2011 B Amplifikazzjoni tas-supernatant tal-emolymph minn A. atra Maħżuna fuq karta FTA.Uża punch ta' 3 mm biex iżżid direttament mat-tubu tal-PCR li jkun fih it-taħlita tal-PCR.
Minħabba l-kontenut mikrobjali abbundanti fl-ilma baħar, inizjalment iffukajna fuq il-karatterizzazzjoni tas-sekwenzi tad-DNA mikrobjali fl-emolymph.Biex nagħmlu dan, nużaw żewġ strateġiji differenti.L-ewwel strateġija użat Kraken2, programm ta 'klassifikazzjoni tas-sekwenza bbażat fuq algoritmi li jista' jidentifika sekwenzi mikrobjali bi preċiżjoni komparabbli ma 'BLAST u għodod oħra [28].Aktar minn 6719 jaqra ġew determinati li huma ta 'oriġini batterjali, filwaqt li 124 u 64 kienu minn archaea u viruses, rispettivament (Fig. 4).Il-frammenti tad-DNA batterjali l-aktar abbundanti kienu Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), u Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Din id-distribuzzjoni hija konsistenti ma 'studji preċedenti tal-mikrobijoma tal-molluski blu tal-baħar [39, 40].Gammaproteobacteria kienu l-klassi ewlenija ta 'Proteobacteria (44%), inklużi ħafna Vibronales (Fig. 4b).Il-metodu ddPCR ikkonferma l-preżenza ta 'frammenti tad-DNA Vibrio fil-ccfDNA ta' A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Biex tikseb aktar informazzjoni dwar l-oriġini batterjali ta 'ccfDNA, ittieħed approċċ addizzjonali (Fig. S2, Informazzjoni Supplimentari). F'dan il-każ, jaqra li jikkoinċidu ġew assemblati bħala qari paired-end u ġew ikklassifikati bħala ta 'oriġini awto (bivalvi) jew nonself bl-użu ta' BLASTN u valur e ta '1e-3 u cutoff b'omoloġija > 90%. F'dan il-każ, jaqra li jikkoinċidu ġew assemblati bħala qari paired-end u ġew ikklassifikati bħala ta 'oriġini awto (bivalvi) jew nonself bl-użu ta' BLASTN u valur e ta '1e-3 u cutoff b'omoloġija > 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN e и 1-3сначе и 1-3сина с гомологией> 90%. F'dan il-każ, qari li jikkoinċidu nġabru bħala qari paired-ended u ġew ikklassifikati bħala indiġeni (bivalvi) jew mhux oriġinali bl-użu ta 'BLASTN u valur e ta' 1e-3 u cutoff b'omoloġija > 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢倭值成末戼数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 用 3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и классирфи собраны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зна1 знач происхождению мологии> 90%. F'dan il-każ, il-qari li jikkoinċidu nġabru bħala qari pared-ended u kklassifikati bħala proprji (bivalvi) jew mhux oriġinali bl-użu ta 'e BLASTN u valuri 1e-3 u limitu ta' omoloġija > 90%.Peress li l-ġenoma A. atra għadu ma ġiex sekwenzat, użajna l-istrateġija tal-assemblaġġ de novo tal-assemblatur MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Total ta' 147,188 kontig ġew identifikati bħala dipendenti (bivalvi) ta' oriġini.Dawn il-kontigs imbagħad ġew sploduti b'valuri-e ta '1e-10 bl-użu ta' BLASTN u BLASTX.Din l-istrateġija ppermettietna nidentifikaw 482 framment mhux bivalvi preżenti f'A. atra ccfDNA.Aktar minn nofs (57%) ta 'dawn il-frammenti tad-DNA nkisbu minn batterji, prinċipalment minn simbjoti tal-garġi, inklużi simbjoti sulfotrophic, u minn simbjoti tal-garġi Solemya velum (Fig. 5).
Abbundanza relattiva fil-livell tat-tip.B Diversità mikrobjali ta' żewġ phyla prinċipali (Firmicutes u Proteobacteria).Amplifikazzjoni rappreżentattiva ta' ddPCR C Vibrio spp.A. Frammenti tal-ġene 16S rRNA (blu) fi tliet atra hemolymphs.
Ġew analizzati total ta’ 482 kontig miġbura.Profil ġenerali tad-distribuzzjoni tassonomika ta' annotazzjonijiet kontig metaġenomika (prokarjoti u ewkarjoti).B Distribuzzjoni dettaljata ta' frammenti ta' DNA batterjali identifikati minn BLASTN u BLASTX.
L-analiżi Kraken2 wriet ukoll li l-ccfDNA tal-molluski kien fih frammenti tad-DNA archaeal, inklużi frammenti tad-DNA ta 'Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), u Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Il-preżenza ta’ frammenti tad-DNA derivati ​​minn Euryarchaeota u Crenarchaeota, li qabel kienu misjuba fil-komunità mikrobjali tal-maskli ta’ Kalifornja, m’għandhiex tkun sorpriża [42].Għalkemm Euryarchaeota ħafna drabi hija assoċjata ma 'kundizzjonijiet estremi, issa huwa rikonoxxut li kemm Euryarchaeota kif ukoll Crenarcheota huma fost l-aktar prokarjoti komuni fl-ambjent krijoġeniku tal-baħar [43, 44].Il-preżenza ta’ mikro-organiżmi metanoġeniċi fil-maskli mhix sorprendenti, minħabba rapporti reċenti ta’ tnixxijiet estensivi ta’ metanu minn tnixxijiet tal-qiegħ fuq il-Plateau ta’ Kerguelen [45] u l-produzzjoni possibbli ta’ metanu mikrobjali osservati barra mill-kosta tal-Gżejjer Kerguelen [46].
L-attenzjoni tagħna mbagħad inbidel għall-qari mill-viruses tad-DNA.Sa fejn nafu, dan huwa l-ewwel studju mhux fil-mira tal-kontenut tal-virus tal-maskli.Kif mistenni, sibna frammenti tad-DNA ta 'batterjofaġi (Caudovirales) (Fig. 6b).Madankollu, l-aktar DNA virali komuni ġej minn phylum ta 'nucleocytoviruses, magħruf ukoll bħala l-virus nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), li għandu l-akbar ġenoma ta' kwalunkwe virus.Fi ħdan dan il-phylum, il-biċċa l-kbira tas-sekwenzi tad-DNA jappartjenu għall-familji Mimimidoviridae (58%) u Poxviridae (21%), li l-ospiti naturali tagħhom jinkludu vertebrati u artropodi, filwaqt li proporzjon żgħir ta 'dawn is-sekwenzi tad-DNA jappartjenu għal alka viroloġika magħrufa.Jinfetta l-alka ewkarjotika tal-baħar.Is-sekwenzi nkisbu wkoll mill-virus Pandora, il-virus ġgant bl-akbar daqs tal-ġenoma ta 'kwalunkwe ġeneri virali magħrufa.Interessanti, il-firxa ta 'hosts magħrufa li huma infettati bil-virus, kif iddeterminat mis-sekwenzjar tal-emolymph ccfDNA, kienet relattivament kbira (Figura S3, Informazzjoni Supplimentari).Jinkludi viruses li jinfettaw insetti bħal Baculoviridae u Iridoviridae, kif ukoll viruses li jinfettaw ameba, alka u vertebrati.Sibna wkoll sekwenzi li jaqblu mal-ġenoma tal-Pithovirus sibericum.Pitoviruses (magħrufa wkoll bħala "viruses zombie") ġew iżolati għall-ewwel darba minn permafrost ta' 30,000 sena fis-Siberja [47].Għalhekk, ir-riżultati tagħna huma konsistenti mar-rapporti preċedenti li juru li mhux l-ispeċi moderni kollha ta 'dawn il-viruses huma estinti [48] u li dawn il-viruses jistgħu jkunu preżenti f'ekosistemi tal-baħar subartiċi remoti.
Fl-aħħarnett, ittestjajna biex naraw jekk nistgħux insibu frammenti tad-DNA minn annimali multiċellulari oħra.Total ta' 482 kontig barrani ġew identifikati minn BLASTN u BLASTX bil-libreriji nt, nr u RefSeq (ġenomika u proteina).Ir-riżultati tagħna juru li fost il-frammenti barranin ta 'ccfDNA ta' annimali multiċellulari tippredomina d-DNA tal-għadam tal-għadam (Fig. 5).Instabu wkoll frammenti tad-DNA minn insetti u speċi oħra.Parti relattivament kbira tal-frammenti tad-DNA ma ġietx identifikata, possibbilment minħabba s-sottorappreżentazzjoni ta' numru kbir ta' speċi tal-baħar f'databases ġenomiċi meta mqabbla ma' speċijiet terrestri [49].
Fid-dokument preżenti, napplikaw il-kunċett LB għall-maskli, billi nargumentaw li s-sekwenzjar tal-isparatura tal-hemolymph ccfDNA jista 'jipprovdi ħarsa lejn il-kompożizzjoni tal-ekosistemi kostali tal-baħar.B'mod partikolari, sibna li 1) l-emolymph tal-mussel fih konċentrazzjonijiet relattivament għoljin (livelli ta 'mikrogrammi) ta' frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw relattivament kbar (~ 1-5 kb);2) dawn il-frammenti tad-DNA huma kemm indipendenti kif ukoll mhux indipendenti 3) Fost is-sorsi barranin ta 'dawn il-frammenti tad-DNA, sibna DNA batterjali, arkeali u virali, kif ukoll DNA ta' annimali multiċellulari oħra;4) L-akkumulazzjoni ta 'dawn il-frammenti barranin ta' ccfDNA fl-emolymph isseħħ malajr u tikkontribwixxi għall-attività interna ta 'filtrazzjoni tal-maskli.Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li l-kunċett ta 'LB, li s'issa ġie applikat prinċipalment fil-qasam tal-bijomediċina, jikkodifika sors ta' għarfien għani iżda mhux esplorat li jista 'jintuża biex tifhem aħjar l-interazzjoni bejn l-ispeċi sentinella u l-ambjent tagħhom.
Minbarra l-primati, l-iżolament ta’ ccfDNA ġie rrappurtat fil-mammiferi, inklużi ġrieden, klieb, qtates u żwiemel [50, 51, 52].Madankollu, sa fejn nafu tagħna, l-istudju tagħna huwa l-ewwel li jirrapporta l-iskoperta u s-sekwenzjar ta 'ccfDNA fi speċi tal-baħar b'sistema ta' ċirkolazzjoni miftuħa.Din il-karatteristika anatomika u l-kapaċità ta 'filtrazzjoni tal-maskli jistgħu, għall-inqas parzjalment, jispjegaw il-karatteristiċi tad-daqs differenti tal-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw meta mqabbla ma' speċi oħra.Fil-bnedmin, il-biċċa l-kbira tal-frammenti tad-DNA li jiċċirkolaw fid-demm huma frammenti żgħar li jvarjaw fid-daqs minn 150 sa 200 bp.b'quċċata massima ta' 167 bp [34, 53].Porzjon żgħir iżda sinifikanti ta 'frammenti tad-DNA huma bejn 300 u 500 bp fid-daqs, u madwar 5% huma itwal minn 900 bp.[54].Ir-raġuni għal din id-distribuzzjoni tad-daqs hija li s-sors ewlieni ta 'ccfDNA fil-plażma jseħħ bħala riżultat ta' mewt taċ-ċelluli, jew minħabba mewt taċ-ċelluli jew minħabba nekrożi ta 'ċelluli ematopojetiċi li jiċċirkolaw f'individwi b'saħħithom jew minħabba apoptożi ta' ċelluli tat-tumur f'pazjenti bil-kanċer (magħrufa bħala DNA li jiċċirkola tumur)., ctDNA).Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-emolymph ccfDNA li sibna fil-maskli varjat minn 1000 sa 5000 bp, li jissuġġerixxi li l-ccfDNA tal-mussel għandu oriġini differenti.Din hija ipoteżi loġika, peress li l-maskli għandhom sistema vaskulari semi-miftuħa u jgħixu f'ambjenti akkwatiċi tal-baħar li fihom konċentrazzjonijiet għoljin ta 'DNA ġenomika mikrobjali.Fil-fatt, l-esperimenti tal-laboratorju tagħna bl-użu tad-DNA eżoġenu wrew li l-maskli jakkumulaw frammenti tad-DNA fl-ilma baħar, tal-inqas wara ftit sigħat huma degradati wara l-assorbiment ċellulari u/jew rilaxxati u/jew maħżuna f’diversi organizzazzjonijiet.Minħabba r-rarità taċ-ċelloli (kemm prokarjotiċi kif ukoll ewkarjotiċi), l-użu ta 'kompartimenti intravalvulari se jnaqqas l-ammont ta' ccfDNA minn sorsi awtonomi kif ukoll minn sorsi barranin.Meta wieħed iqis l-importanza tal-immunità intrinsika tal-bivalvi u n-numru kbir ta 'fagoċiti li jiċċirkolaw, aħna ipoteżijna wkoll li anke ccfDNA barrani huwa arrikkit f'fagoċiti li jiċċirkolaw li jakkumulaw DNA barrani mal-inġestjoni ta' mikro-organiżmi u/jew debris ċellulari.Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna juru li l-emolymph ccfDNA bivalvi huwa repożitorju uniku ta 'informazzjoni molekulari u jsaħħaħ l-istatus tagħhom bħala speċi sentinella.
Id-dejta tagħna tindika li s-sekwenzjar u l-analiżi tal-frammenti tal-emolymph ccfDNA derivati ​​minn batterji jistgħu jipprovdu informazzjoni ewlenija dwar il-flora batterjali ospitanti u l-batterji preżenti fl-ekosistema tal-baħar tal-madwar.It-tekniki ta' sekwenzar tal-isparatura wrew sekwenzi tal-batterja commensal A. atra gill li kieku ntużaw metodi konvenzjonali ta' identifikazzjoni 16S rRNA, parzjalment minħabba bias ta' librerija ta' referenza.Fil-fatt, l-użu tagħna tad-dejta LB miġbura minn M. platensis fl-istess saff tal-maskli f'Kerguelen wera li l-kompożizzjoni ta 'simbjonti batterjali assoċjati mal-garġi kienet l-istess għaż-żewġ speċi tal-maskli (Fig. S4, Informazzjoni Supplimentari).Dan ix-xebh ta 'żewġ mussels ġenetikament differenti jista' jirrifletti l-kompożizzjoni ta 'komunitajiet batterjali fid-depożiti kesħin, sulfurous, u vulkaniċi ta' Kerguelen [55, 56, 57, 58].Livelli ogħla ta’ mikro-organiżmi li jnaqqsu l-kubrit ġew deskritti tajjeb meta jinġabru l-maskli minn żoni kostali bijoturbati [59], bħall-kosta ta’ Port-au-France.Possibbiltà oħra hija li l-flora tal-maskli kommensali tista 'tiġi affettwata minn trażmissjoni orizzontali [60, 61].Hemm bżonn ta 'aktar riċerka biex tiddetermina l-korrelazzjoni bejn l-ambjent tal-baħar, il-wiċċ tal-qiegħ tal-baħar, u l-kompożizzjoni ta' batterji simbjotiċi fil-maskli.Dawn l-istudji għadhom għaddejjin bħalissa.
It-tul u l-konċentrazzjoni tal-emolymph ccfDNA, il-faċilità ta 'purifikazzjoni tiegħu, u l-kwalità għolja biex jippermettu sekwenzar rapidu ta' shotgun huma wħud mill-ħafna vantaġġi tal-użu tal-ccfDNA tal-molluski biex tevalwa l-bijodiversità fl-ekosistemi kostali tal-baħar.Dan l-approċċ huwa speċjalment effettiv biex jikkaratterizza komunitajiet virali (viromes) f'ekosistema partikolari [62, 63].B'differenza mill-batterji, l-arkeja, u l-ewkarjoti, il-ġenomi virali ma fihomx ġeni kkonservati filoġenetikament bħal sekwenzi 16S.Ir-riżultati tagħna jindikaw li bijopsiji likwidi minn speċi indikaturi bħall-maskli jistgħu jintużaw biex jidentifikaw numri relattivament kbar ta 'frammenti tal-virus ccfDNA magħrufa li jinfettaw hosts li tipikament jgħixu fl-ekosistemi tal-baħar kostali.Dan jinkludi viruses magħrufa li jinfettaw protozoa, artropodi, insetti, pjanti, u viruses batterjali (eż., batterjofaġi).Instabet distribuzzjoni simili meta eżaminajna l-vrome hemolymph ccfDNA tal-maskli blu (M. platensis) miġbura fl-istess saff tal-maskli f'Kerguelen (Tabella S2, Informazzjoni Supplimentari).Is-sekwenzjar Shotgun ta 'ccfDNA huwa tabilħaqq approċċ ġdid li qed jikseb momentum fl-istudju tal-virome tal-bnedmin jew speċi oħra [21, 37, 64].Dan l-approċċ huwa partikolarment utli għall-istudju tal-viruses tad-DNA double-stranded, peress li l-ebda ġene wieħed ma huwa kkonservat fost il-viruses tad-DNA double-stranded kollha, li jirrappreżenta l-aktar klassi diversa u wiesgħa ta 'viruses f'Baltimore [65].Għalkemm ħafna minn dawn il-viruses jibqgħu mhux klassifikati u jistgħu jinkludu viruses minn parti kompletament mhux magħrufa tad-dinja virali [66], sibna li l-viromi u l-firxiet ospitanti tal-maskli A. atra u M. platensis jaqgħu bejn iż-żewġ speċi.bl-istess mod (ara l-figura S3, informazzjoni addizzjonali).Dan ix-xebh mhuwiex sorprendenti, peress li jista 'jirrifletti nuqqas ta' selettività fl-assorbiment tad-DNA preżenti fl-ambjent.Studji futuri li jużaw RNA purifikat huma attwalment meħtieġa biex jikkaratterizzaw il-viroma RNA.
Fl-istudju tagħna, użajna pipeline rigoruż ħafna adattat mix-xogħol ta 'Kowarski u l-kollegi [37], li użaw tħassir f'żewġ stadji ta' qari u kontigs miġbura qabel u wara l-assemblaġġ ta 'ccfDNA nattiv, li rriżulta fi proporzjon għoli ta' qari mhux mappjati.Għalhekk, ma nistgħux neskludu li xi wħud minn dawn il-qari mhux mappjati jista 'jkollhom l-oriġini tagħhom stess, primarjament minħabba li m'għandniex ġenoma ta' referenza għal din l-ispeċi tal-maskli.Aħna użajna wkoll dan il-pipeline għax konna mħassba dwar il-kimeri bejn il-qari awto u mhux awtonomu u t-tulijiet tal-qari ġġenerati mill-Illumina MiSeq PE75.Raġuni oħra għall-maġġoranza tal-qari mhux magħruf hija li ħafna mill-mikrobi tal-baħar, speċjalment f'żoni remoti bħal Kerguelen, ma ġewx annotati.Aħna użajna Illumina MiSeq PE75, billi nassumu tulijiet ta 'frammenti ta' ccfDNA simili għal ccfDNA uman.Għal studji futuri, minħabba r-riżultati tagħna li juru li hemolymph ccfDNA għandu qari itwal mill-bnedmin u/jew mammiferi, nirrakkomandaw li tuża pjattaforma ta 'sekwenzjar aktar adattata għal frammenti itwal ta' ccfDNA.Din il-prattika tagħmilha ħafna aktar faċli li jiġu identifikati aktar indikazzjonijiet għal analiżi aktar profonda.Il-ksib tas-sekwenza kompluta tal-ġenoma nukleari ta' A. atra attwalment mhux disponibbli tiffaċilita ħafna wkoll id-diskriminazzjoni ta' ccfDNA minn sorsi awto u mhux awto.Minħabba li r-riċerka tagħna ffokat fuq il-possibbiltà li jiġi applikat il-kunċett ta 'bijopsija likwida għall-maskli, nittamaw li peress li dan il-kunċett jintuża f'riċerka futura, jiġu żviluppati għodod u pipelines ġodda biex jiżdied il-potenzjal ta' dan il-metodu biex tistudja d-diversità mikrobjali tal-maskli.ekosistema tal-baħar.
Bħala bijomarkatur kliniku mhux invażiv, livelli elevati ta 'ccfDNA fil-plażma umana huma assoċjati ma' diversi mard, ħsara fit-tessuti u kundizzjonijiet ta 'stress [67,68,69].Din iż-żieda hija assoċjata mar-rilaxx ta 'frammenti tad-DNA tal-oriġini tagħha stess wara ħsara fit-tessut.Aħna indirizzajna din il-kwistjoni bl-użu ta 'stress tas-sħana akut, li fih il-maskli ġew esposti għal żmien qasir għal temperatura ta' 30 °C.Aħna wettaqna din l-analiżi fuq tliet tipi differenti ta 'maskli fi tliet esperimenti indipendenti.Madankollu, ma sibna l-ebda bidla fil-livelli ta 'ccfDNA wara stress akut tas-sħana (ara Figura S5, informazzjoni addizzjonali).Din l-iskoperta tista 'tispjega, għall-inqas parzjalment, il-fatt li l-maskli għandhom sistema ċirkolatorja semi-miftuħa u jakkumulaw ammonti kbar ta' DNA barrani minħabba l-attività għolja ta 'filtrazzjoni tagħhom.Min-naħa l-oħra, il-maskli, bħal ħafna invertebrati, jistgħu jkunu aktar reżistenti għall-ħsara fit-tessut ikkawżata mill-istress, u b'hekk jillimitaw ir-rilaxx ta 'ccfDNA fl-emolymph tagħhom [70, 71].
Sal-lum, l-analiżi tad-DNA tal-bijodiversità fl-ekosistemi akkwatiċi ffukat prinċipalment fuq metabarcoding tad-DNA ambjentali (eDNA).Madankollu, dan il-metodu huwa ġeneralment limitat fl-analiżi tal-bijodiversità meta jintużaw primers.L-użu ta 'sekwenzjar ta' shotgun jevadi l-limitazzjonijiet tal-PCR u l-għażla preġudikata ta 'settijiet ta' primer.Għalhekk, f'ċertu sens, il-metodu tagħna huwa eqreb tal-metodu ta 'sekwenzjar ta' eDNA Shotgun b'rendiment għoli użat reċentement, li huwa kapaċi jagħmel sekwenza diretta tad-DNA frammentata u janalizza kważi l-organiżmi kollha [72, 73].Madankollu, hemm numru ta 'kwistjonijiet fundamentali li jiddistingwu LB minn metodi standard eDNA.Naturalment, id-differenza ewlenija bejn eDNA u LB hija l-użu ta 'ospiti filtri naturali.L-użu ta 'speċi tal-baħar bħal sponoż u bivalvi (Dresseina spp.) Bħala filtru naturali għall-istudju tal-eDNA ġie rrappurtat [74, 75].Madankollu, l-istudju ta' Dreissena uża bijopsiji tat-tessuti li minnhom ġie estratt id-DNA.Analiżi ta 'ccfDNA minn LB ma teħtieġx bijopsija tat-tessuti, tagħmir speċjalizzat u kultant għali u loġistika assoċjati ma' eDNA jew bijopsija tat-tessuti.Fil-fatt, reċentement irrappurtajna li ccfDNA minn LB jista 'jinħażen u jiġi analizzat b'appoġġ FTA mingħajr ma tinżamm katina tal-kesħa, li hija sfida ewlenija għar-riċerka f'żoni remoti [76].L-estrazzjoni ta 'ccfDNA minn bijopsiji likwidi hija wkoll sempliċi u tipprovdi DNA ta' kwalità għolja għal sekwenzar ta 'shotgun u analiżi PCR.Dan huwa vantaġġ kbir minħabba xi wħud mil-limitazzjonijiet tekniċi assoċjati mal-analiżi tal-eDNA [77].Is-sempliċità u l-ispiża baxxa tal-metodu tat-teħid tal-kampjuni huma wkoll partikolarment adattati għal programmi ta 'monitoraġġ fit-tul.Minbarra l-kapaċità għolja ta 'filtrazzjoni tagħhom, karatteristika oħra magħrufa sew tal-bivalvi hija l-kompożizzjoni kimika tal-mucopolysaccharide tal-mukus tagħhom, li tippromwovi l-assorbiment tal-viruses [78, 79].Dan jagħmel il-bivalvi filtru naturali ideali għall-karatterizzazzjoni tal-bijodiversità u l-impatt tat-tibdil fil-klima f'ekosistema akkwatika partikolari.Għalkemm il-preżenza ta 'frammenti tad-DNA derivati ​​mill-ospitanti tista' titqies bħala limitazzjoni tal-metodu meta mqabbla ma 'eDNA, l-ispiża assoċjata ma' li jkollok tali ccfDNA nattiv meta mqabbla ma 'eDNA hija simultanjament tinftiehem għall-ammont kbir ta' informazzjoni disponibbli għal studji tas-saħħa.offset host.Dan jinkludi l-preżenza ta 'sekwenzi virali integrati fil-ġenoma tal-host ospitanti.Dan huwa speċjalment importanti għall-maskli, minħabba l-preżenza ta 'retroviruses lewkemiċi trażmessi orizzontalment fil-bivalvi [80, 81].Vantaġġ ieħor ta 'LB fuq eDNA huwa li jisfrutta l-attività fagoċitika taċ-ċelluli tad-demm li jiċċirkolaw fl-emolymph, li jaħrab mikro-organiżmi (u l-ġenomi tagħhom).Il-fagoċitosi hija l-funzjoni ewlenija taċ-ċelluli tad-demm fil-bivalvi [82].Fl-aħħarnett, il-metodu jieħu vantaġġ mill-kapaċità għolja ta 'filtrazzjoni tal-maskli (medja ta' 1.5 l/h ta 'ilma baħar) u ċirkolazzjoni ta' jumejn, li jżidu t-taħlit ta 'saffi differenti ta' ilma baħar, li jippermettu l-qbid ta 'eDNA eterologu.[83, 84].Għalhekk, l-analiżi ccfDNA tal-maskli hija triq interessanti minħabba l-impatti nutrittivi, ekonomiċi u ambjentali tal-maskli.Simili għall-analiżi ta 'LB miġbura mill-bnedmin, dan il-metodu jiftaħ ukoll il-possibbiltà li jitkejlu bidliet ġenetiċi u epiġenetiċi fid-DNA ospitanti b'reazzjoni għal sustanzi eżoġeni.Pereżempju, it-teknoloġiji tas-sekwenzjar tat-tielet ġenerazzjoni jistgħu jiġu previsti biex iwettqu analiżi tal-metilazzjoni mal-ġenoma kollu f'ccfDNA nattiv bl-użu tas-sekwenzjar tan-nanopori.Dan il-proċess għandu jiġi ffaċilitat mill-fatt li t-tul tal-frammenti tal-ccfDNA tal-mussell huwa idealment kompatibbli ma 'pjattaformi ta' sekwenzar li jinqraw fit-tul li jippermettu analiżi tal-metilazzjoni tad-DNA madwar il-ġenoma kollu minn ġirja waħda ta 'sekwenzjar mingħajr il-ħtieġa ta' trasformazzjonijiet kimiċi.Għalhekk, jista' jipprovdi għarfien siewi dwar il-mekkaniżmi sottostanti li jirregolaw ir-rispons wara l-espożizzjoni għat-tibdil fil-klima jew sustanzi li jniġġsu [87].Madankollu, l-użu ta 'LB mhuwiex mingħajr limitazzjonijiet.M'għandniex xi ngħidu, dan jeħtieġ il-preżenza ta 'speċi indikaturi fl-ekosistema.Kif imsemmi hawn fuq, l-użu ta 'LB biex tivvaluta l-bijodiversità ta' ekosistema partikolari teħtieġ ukoll pipeline bijoinformatiku rigoruż li jqis il-preżenza ta 'frammenti tad-DNA mis-sors.Problema ewlenija oħra hija d-disponibbiltà ta’ ġenomi ta’ referenza għall-ispeċijiet tal-baħar.Huwa ttamat li inizjattivi bħall-Proġett tal-Ġenomi tal-Mammiferi Marittimi u l-proġett Fish10k stabbilit reċentement [88] jiffaċilitaw analiżi bħal din fil-futur.L-applikazzjoni tal-kunċett LB għall-organiżmi li jalimentaw il-filtri tal-baħar hija wkoll kompatibbli mal-aħħar avvanzi fit-teknoloġija tas-sekwenzjar, u tagħmilha adattata tajjeb għall-iżvilupp ta 'bijomarkaturi multi-ohm biex jipprovdu informazzjoni importanti dwar is-saħħa tal-ħabitats tal-baħar b'reazzjoni għall-istress ambjentali.
Id-dejta tas-sekwenzjar tal-ġenoma ġiet iddepożitata fl-Arkivju Aqra tas-Sekwenza NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 taħt Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impatt tat-tibdil fil-klima fuq il-ħajja u l-ekosistemi tal-baħar.Cole Bijoloġija.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Ikkunsidra l-impatti kkombinati tat-tibdil fil-klima u fatturi oħra ta’ stress lokali fuq l-ambjent tal-baħar.ambjent xjentifiku ġenerali.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Xjenza tal-ewwel ta’ Marzu.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. It-tolleranza tas-sħana mnaqqsa taħt kundizzjonijiet ta 'stress tas-sħana ripetittivi tispjega l-mortalità għolja tas-sajf tal-maskli blu.Rapport xjentifiku 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Bidliet reċenti fil-frekwenza, il-kawżi u l-firxa tal-imwiet tal-annimali.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Patoġeni multipli mhux speċifiċi għall-ispeċi setgħu kkawżaw mortalità tal-massa ta' Pinna nobilis.Ħajja.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Impatt potenzjali tat-tibdil fil-klima fuq il-mard żoonotiku tal-Artiku.Int J Saħħa ċirkumpolari.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Il-maskli blu (Mytilus edulis spp.) Bħala organiżmi sinjal fil-monitoraġġ tat-tniġġis kostali: reviżjoni.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrazzjoni ta 'bijopsija likwida fit-trattament tal-kanċer.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maturazzjoni tal-bijopsija likwida: Tippermetti li d-DNA tat-tumur jiċċirkola.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aċidi nukleiċi fil-plażma umana.Minuti tal-laqgħat tas-sussidjarji tas-Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rwol ġdid għal DNA mingħajr ċelluli bħala markatur molekulari għat-trattament tal-kanċer.Kwantifikazzjoni ta 'analiżi bijomolari.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Il-bijopsija likwida tidħol fil-klinika - kwistjonijiet ta 'implimentazzjoni u sfidi futuri.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW u oħrajn.Id-DNA tal-fetu huwa preżenti fil-plażma materna u fis-serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studju tal-kors tat-tqala u l-kumplikazzjonijiet tiegħu bl-użu ta 'RNA extraċellulari li jiċċirkola fid-demm tan-nisa waqt it-tqala.Dopediatrija.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Bijopsija likwida: DNA mingħajr ċelluli tad-donatur jintuża biex jinstabu leżjonijiet alloġeniċi fi tilqim tal-kliewi.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovazzjonijiet fid-dijanjostika prenatali: sekwenzar tal-ġenoma tal-plażma materna.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Sejbien rapidu ta 'patoġenu b'sekwenzjar metaġenomika tal-ġenerazzjoni li jmiss ta' fluwidi tal-ġisem infettati.Nat Mediċina.2021;27:115-24.