Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-brawżer li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew itfi l-mod ta' kompatibilità f'Internet Explorer).Sadattant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Partiċelli porużi tas-silika ġew ippreparati b'metodu sol-gel b'xi modifiki biex jinkisbu partiċelli makroporużi.Dawn il-partiċelli ġew derivatizzati permezz ta 'polimerizzazzjoni ta' trasferiment ta 'katina ta' frammentazzjoni ta 'addizzjoni riversibbli (RAFT) b'N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) u styrene biex tipprepara N-phenylmaleimide intercalation ta' polystyrene stainless steel 10Narrow stationary. mm id) kienu ppakkjati b'ippakkjar ta 'demel likwidu.Separazzjoni tal-kolonna PMP evalwata ta' taħlita ta 'peptidi li tikkonsisti f'ħames peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) kundizzjonijiet kromatografiċi ta' diġestjoni umana u ottimali ta' diġestjoni u HA. L-għadd tal-pjanċa oretical tat-taħlita tal-peptidi huwa għoli daqs 280,000 pjanċi/m². Meta tqabbel il-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna żviluppata mal-kolonna kummerċjali Ascentis Express RP-Amide, ġie osservat li l-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna PMP kienet superjuri għall-kolonna kummerċjali f'termini ta 'effiċjenza u riżoluzzjoni tas-separazzjoni.
F'dawn l-aħħar snin, l-industrija bijofarmaċewtika saret suq globali li qed jespandi b'żieda sostanzjali fis-sehem tas-suq. Bit-tkabbir splussiv tal-industrija bijofarmaċewtika1,2,3, l-analiżi ta 'peptidi u proteini hija mixtieqa ħafna. Minbarra l-peptide fil-mira, diversi impuritajiet huma ġġenerati matul is-sinteżi tal-peptidi, u b'hekk jeħtieġu purifikazzjoni kromatografika tal-purifikazzjoni tal-proteini tal-peptidi u l-purifikazzjoni tal-proteina mixtieqa tal-peptidi u l-purifikazzjoni tal-fluwidi tal-ġisem mixtieqa. hija biċċa xogħol ta' sfida kbira minħabba n-numru kbir ta' speċijiet li jistgħu jinstabu f'kampjun wieħed. Għalkemm l-ispettrometrija tal-massa hija għodda effettiva għas-sekwenzjar tal-peptidi u l-proteini, jekk dawn il-kampjuni jiġu injettati fl-ispettrometru tal-massa f'pass wieħed, is-separazzjoni ma tkunx ideali. 5,6.Barra minn hekk, matul is-separazzjoni tal-fażi likwida, l-analiti jistgħu jiġu ffukati f'reġjuni dojoq, u b'hekk jikkonċentraw dawn l-analiti u jtejbu s-sensittività tal-iskoperta tal-MS. Il-kromatografija tal-likwidu (LC) avvanzat b'mod sinifikanti matul l-aħħar għaxar snin u saret teknika popolari fl-analiżi proteomika7,8,9,10.
Il-kromatografija likwida b'fażi maqluba (RP-LC) tintuża ħafna għall-purifikazzjoni u s-separazzjoni ta 'taħlitiet ta' peptidi bl-użu tas-silika modifikata b'octadecyl (ODS) bħala l-fażi stazzjonarja11,12,13.Madankollu, il-fażijiet stazzjonarji RP ma jipprovdux separazzjoni sodisfaċenti ta 'peptidi u proteini minħabba l-istruttura kumplessa tagħhom u l-fażi kumplessa tagħhom tan-natura amphiphilic huma ddisinjati b'mod speċjali biex janalizzaw il-peptidi amphiphilic 14,15, fażi speċjali. es u proteini b'moeties polari u mhux polari biex jinteraġixxu ma' u jżommu dawn l-analiti16.Kromatografija b'modalità mħallta, li tipprovdi interazzjonijiet multimodali, tista' tkun alternattiva għal RP-LC għas-separazzjoni ta' peptidi, proteini, u taħlitiet kumplessi oħra. 21.Mixed-mode stazzjonarji fażijiet (WAX / RPLC, HILIC / RPLC, polari interkalazzjoni / RPLC) huma adattati għal separazzjonijiet ta 'peptidi u proteini minħabba l-preżenza ta' kemm gruppi polari u mhux polari 22,23,24,25,26,27,28 .Similarly, polari intercalating fażi selettiva polarità kovalenti u polari fażi selettiva kovalenti grupp mhux polari selettiva r analiti, peress li s-separazzjoni tiddependi fuq l-interazzjoni bejn l-analite u l-fażi stazzjonarja.Interazzjonijiet multimodali 29, 30, 31, 32.Riċentement, Zhang et al.30 ipprepara fażi stazzjonarja ta 'poliamina terminata b'dodecyl u idrokarburi separati b'suċċess, antidipressanti, flavonoids, nukleosidi, estroġeni, u diversi analiti oħra. 8 kolonni) huma kummerċjalment disponibbli taħt l-isem kummerċjali Ascentis Express RP-Amide kolonni, iżda dawn il-kolonni jintużaw għall-analiżi tal-amine 33 biss.
Fl-istudju attwali, fażi stazzjonarja inkorporata polari (polistirene inkorporat N-phenylmaleimide) ġiet ippreparata u evalwata għas-separazzjoni ta 'peptidi u diġesti tat-tripsin ta' HSA. Il-fażi stazzjonarja ġiet ippreparata bl-użu tal-istrateġija li ġejja. ġie aġġustat biex jipprepara partiċelli tas-silika b'daqs kbir ta 'pori. It-tieni, ligand ġdid, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, ġie sintetizzat u użat biex derivatize partiċelli tas-silika biex jippreparaw fażi stazzjonarja inkorporata polari. d fi ħdan il-kolonna.Evalwa s-separazzjoni tal-kolonna ppakkjata ta 'taħlitiet ta' peptidi li jikkonsistu f'ħames peptidi;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) u Trypsin digest of human serum albumin (HAS) -Kolonna Amide. Kemm il-peptidi kif ukoll il-proteini ġew osservati li kienu solvuti tajjeb u effiċjenti fuq il-kolonna PMP, li kienet aktar effiċjenti mill-kolonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Aċidu Aċetiku, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin tas-Serum Uman (HSA), Ammonju Klorur, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), (MC4), Perossidu tal-Methacryloyl (MC), Perossidu tal-Methakriloil (MC), Sty-TEMP-Bendroxy,HP,HP,HP,HP. Grad Acetonitrile (ACN), Metanol, 2-Propanol, u Aċetun Mixtri minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Taħlita ta 'urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), u 8 mL ta' aċidu aċetiku 0.01 N tħawwad għal 10 minuti, u mbagħad 24 mL ta 'TMOS ġew miżjuda magħha taħt kondizzjonijiet kiesaħ silġ. It-taħlita ta' reazzjoni kienet imsaħħan f'40 ° C għal 6 sigħat u mbagħad f'120 ° C għal 6 sigħat u mbagħad f'120 ° C. ed f'70 ° C għal 12-il siegħa. Il-massa ratba mnixxfa kienet mitħun bla xkiel f'forn u kkalċinat f'550 ° C għal 12-il siegħa. Tliet lottijiet ġew ippreparati u kkaratterizzati biex jeżaminaw ir-riproduċibilità fid-daqs tal-partiċelli, id-daqs tal-pori u l-erja tal-wiċċ.
Permezz ta 'modifika tal-wiċċ ta' partiċelli tas-silika b'ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) pre-sintetizzat segwit minn polimerizzazzjoni radjali bi styrene, ġie ppreparat kompost li fih grupp polari.Fażi stazzjonarja għall-aggregati u l-ktajjen tal-polistirene. Il-proċess tal-preparazzjoni huwa deskritt hawn taħt.
N-phenylmaleimide (200 mg) u methyl vinyl isocyanate (100 mg) ġew maħlul f'toluene niexef, u 0.1 mL ta '2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ġie miżjud mal-garafina tar-reazzjoni biex jipprepara phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate. f'forn f'40°C għal 3 sigħat.
Partiċelli mnixxfa tas-silika (2 g) ġew imxerrda f'toluene niexef (100 mL), imħawwad u ivvibrati f'kunjett tal-qiegħ tond ta' 500 mL għal 10 min. 0 ° C għal 3 sigħat. Imbagħad, partiċelli tas-silika magħqudin mal-PMCP (100 g) ġew maħlula f'toluene (200 ml) u 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) ġie miżjud fil-preżenza ta '100 µL ta' dilaurat ta 'dibutyltin bħala katalizzatur. It-taħlita tħawwad f'50 ° C għal sigħat 50 ° C u ffiltrata għal 30 ° C għal 30 ° C.
Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), u partiċelli tas-silika mehmuża TEMPO-PMCP (1.5 g) ġew imxerrda f'toluene u mnaddfa bin-nitroġenu.Il-polimerizzazzjoni ta 'styrene twettqet f'100 ° C għal 12-il siegħa.
Il-kampjuni ġew degassed f'393 K għal siegħa biex tinkiseb pressjoni residwa ta 'inqas minn 10-3 Torr. L-ammont ta' N2 adsorbit fi pressjoni relattiva ta 'P/P0 = 0.99 intuża biex jiddetermina l-volum totali tal-pori. partiċelli tas-silika magħqudin) tqiegħdu fuq kolonna ta 'l-aluminju bl-użu ta' tejp tal-karbonju li jwaħħal. Id-deheb ġie miksi fuq il-kampjuni bl-użu ta 'sputter coater Q150T, u saff Au 5 nm ġie depożitat fuq il-kampjuni. Dan itejjeb l-effiċjenza tal-proċess billi juża vultaġġi baxxi u jipprovdi qamħ fin, sputtering kiesaħ. n (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 analizzatur tad-daqs tal-partiċelli ntuża biex tinkiseb id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli. firxa ta 'temperatura ta' 30 sa 800 °C.
Kolonni ta 'l-istainless steel miksija bil-ħġieġ ta' dimensjonijiet (100 × 1.8 mm id) ġew ippakkjati bl-użu tal-metodu ta 'ppakkjar tad-demel likwidu, bl-applikazzjoni tal-istess proċedura użata f'Ref.31.Kolonna tal-azzar li ma jissaddadx (inforra bil-ħġieġ, 100 × 1.8 mm id) b'fitting tal-ħruġ li fih frit ta' 1 µm kienet imqabbda ma' pakkjatur tad-demel likwidu (Alltech Deerfield, IL, USA). is-solvent tal-propulsjoni.Imla l-kolonna sekwenzjali billi tapplika pressjonijiet ta '100 MP għal 10 minuti, 80 MP għal 15-il minuta, u 60 MP għal 30 minuta. Matul l-ippakkjar, vibrazzjoni mekkanika ġiet applikata b'żewġ shakers tal-kolonna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) biex tiżgura l-ippakkjar uniformi tal-kolonna. mill-unità tal-ippakkjar tad-demel likwidu u qabbad fitting ieħor mad-daħla u mas-sistema LC biex tivverifika l-prestazzjoni tagħha.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Ġappun), injettur (Valco (USA) C14 W.05) b'linja ta 'injezzjoni ta' 50nL, degasser tal-membrana (Shimadzu DGU-14A), tieqa kapillari UV-VIS ġiet mibnija Detector speċjali ta 'apparat µLC (UV-2075) u mikrokolonni miksija bil-ħġieġ biex jimminimizzaw l-effett ta' konnessjoni extra ta 'kolonna. imballaġġ, kapillari (50 μm id 365 u kapillari ta 'unjoni li jnaqqas (50 μm) ġew installati fl-iżbokk ta' 1/16 "tal-unjoni li jnaqqas. Il-ġbir tad-dejta u l-ipproċessar kromatografiku saru bl-użu ta 'softwer Multichro 2000. Monitoraġġ f'254 nm Analytes ġew ittestjati għal assorbiment ta' UV. MA8.
Albumina mis-serum uman, trab lajofilizzat, ≥ 96% (elettroforesi tal-ġel tal-agarose) 3 mg imħallat ma' tripsina (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), u 0.2 M bikarbonat tal-ammonju (1 mL). Is-soluzzjoni tħawwad għal 10 minuti u żammet f'ilma 7 sigħat, 10 ° C, imbagħad imkessaħ f'temperatura ta' 6 ° C. % TFA. Iffiltra s-soluzzjoni u aħżen taħt l-4 °C.
Is-separazzjoni ta' taħlitiet ta' peptidi u HSA trypsin digests ġew evalwati separatament fuq kolonni PMP. Iċċekkja s-separazzjoni tat-taħlita peptide u trypsin digest ta 'HSA mill-kolonna PMP u qabbel ir-riżultati mal-kolonna Ascentis Express RP-Amide. In-numru teoretiku tal-pjanċa huwa kkalkulat kif ġej:
Immaġini SEM ta 'partiċelli tas-silika vojta u partiċelli tas-silika magħquda b'ligand huma murija fil-FIG.2 .SEM immaġini ta 'partiċelli tas-silika vojta (A, B) juru li, b'kuntrast ma' studji preċedenti tagħna, dawn il-partiċelli huma sferiċi li fihom il-partiċelli huma tawwalija jew għandhom simmetrija irregolari.
Immaġini tal-mikroskopju elettroniku tal-iskannjar ta 'partiċelli tas-silika vojta (A, B) u partiċelli tas-silika magħquda b'ligand (C, D).
Id-distribuzzjonijiet tad-daqs tal-partiċelli ta 'partiċelli tas-silika vojta u partiċelli tas-silika ligand-bonded huma murija fil-Figura 3(A).Il-kurvi tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli bbażati fuq il-volum wrew li d-daqs tal-partiċelli tas-silika żdied wara modifika kimika (Fig. 3A). , Meta mqabbel ma 'studju preċedenti tagħna b'valur ad(0.5) ta' 3.05 μm (partiċelli tas-silika marbuta mal-polystyrene) 34.Dan il-lott kellu distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli idjaq meta mqabbel mal-istudju preċedenti tagħna minħabba l-proporzjonijiet li jvarjaw ta 'PEG, urea, TMOS, u aċidu aċetiku fit-taħlita ta' reazzjoni. studjat qabel.Dan ifisser li l-funzjonalizzazzjoni tal-wiċċ ta 'partiċelli tas-silika bi styrene ddepożitat biss saff tal-polistirene (0.97 µm) fuq il-wiċċ tas-silika, filwaqt li fil-fażi PMP il-ħxuna tas-saff kienet 1.38 µm.
Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli (A) u d-distribuzzjoni tad-daqs tal-pori (B) ta 'partiċelli tas-silika vojta u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand.
Id-daqs tal-pori, il-volum tal-pori u l-erja tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika tal-istudju attwali huma mogħtija fit-Tabella 1 (B). Il-profili PSD ta 'partiċelli tas-silika vojta u partiċelli tas-silika magħqudin mal-ligand huma murija fil-Figura 3 (B). Ir-riżultati huma komparabbli mal-istudju preċedenti tagħna. kif muri fit-Tabella 1 (B), u l-bidla tal-kurva hija murija f'Fig. 3 (B). Bl-istess mod, il-volum tal-pori tal-partiċelli tas-silika naqas minn 0.67 għal 0.58 cm3 / g wara modifika kimika. /g) tal-partiċelli tas-silika naqsu wkoll minn 116 m2/g għal 105 m2/g wara modifika kimika.
Ir-riżultati ta 'analiżi elementali tal-fażi stazzjonarja huma murija fit-Tabella 2.It-tagħbija tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja kurrenti hija 6.35%, li hija aktar baxxa mit-tagħbija tal-karbonju tal-istudju preċedenti tagħna (partiċelli tas-silika magħqudin bil-polistirene, 7.93% 35 u 10.21%, rispettivament) 42. Minħabba li t-tagħbija tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja kurrenti, il-preparazzjoni tal-polarità kurrenti hija b'żieda ma ', biż-żieda ta' fażi stazzjonarja kurrenti, fil-preparazzjoni tal-polarità baxxa. Intużaw nds bħal phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) u 4-hydroxy-TEMPO.Il-piż tan-nitroġenu fil-mija tal-fażi stazzjonarja kurrenti huwa 2.21%, meta mqabbel ma '0.1735 u 0.85% bil-piż ta' nitroġenu fi studji preċedenti, rispettivament. 4) u (5) kienu 2.7% u 2.9%, rispettivament, filwaqt li t-tagħbija tal-karbonju tal-prodott finali (6) kienet 6.35%, kif muri fit-Tabella 2. It-telf ta 'piż ġie ċċekkjat b'fażi stazzjonarja PMP, u l-kurva TGA hija murija f'Figura 4.Il-kurva TGA turi telf ta' piż ta '8.6%, li ma fihx biss C35 fil-qbil. , O, u H.
Il-ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate intgħażel għall-modifika tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika minħabba li għandu gruppi polari phenylmaleimide u vinylisocyanate groups.Vinyl isocyanate gruppi jistgħu jirreaġixxu aktar ma 'styrene permezz ta' polimerizzazzjoni radikali ħajjin. Il-polarità tal-fażi stazzjonarja tista 'tiġi kkontrollata mill-aħjar ammont ta' styrene u l-ħin ta 'reazzjoni ta' polimerizzazzjoni radikali ħielsa. ing tal-fażi stazzjonarja u viċi versa.SPs ippreparati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'styrene għandhom tagħbijiet differenti tal-karbonju. Għal darb'oħra, tagħbija dawn il-fażijiet stazzjonarji f'kolonni tal-istainless steel u ċċekkja l-prestazzjoni kromatografika tagħhom (selettività, riżoluzzjoni, valur N, eċċ.).Ibbażat fuq dawn l-esperimenti, intgħażlet formulazzjoni ottimizzata biex tipprepara l-fażi stazzjonarja PMP u tiżgura ż-żamma tal-polarità anali kkontrollata tajba.
Ħames taħlitiet ta 'peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ġew ukoll evalwati bl-użu ta' kolonna PMP bl-użu ta 'fażi mobbli;60/40 (v/v) aċetonitrile/ilma (0.1% TFA) b'rata ta 'fluss ta' 80 μL/min. Taħt kundizzjonijiet ta 'eluzzjoni ottimali, in-numru teoretiku tal-pjanċa (N) għal kull kolonna (100 × 1.8 mm id) huwa 20,000 ± 100 (200,000 ± 100 (200,000 μL/min). grammi huma murija fil-Figura 5A.Analiżi mgħaġġla fuq kolonna PMP b'rata ta 'fluss għolja (700 μL / min), ħames peptidi ġew elużi fi żmien minuta, valuri N kienu tajbin ħafna, 13,500 ± 330 għal kull kolonna (100 × 1.8 mm id), Jikkorrispondi għal 135,000 pjanċi identiċi (Figure 5000 1.8 mm id). .8 mm id) ġew ippakkjati bi tliet lottijiet differenti ta 'fażi stazzjonarja PMP biex tiċċekkja r-riproduċibilità.Il-konċentrazzjoni tal-analite għal kull kolonna ġiet irreġistrata bl-użu tal-kundizzjonijiet ottimali ta' elużjoni u n-numru ta 'pjanċi teoretiċi N u ħin ta' żamma biex tissepara l-istess taħlita tat-test fuq kull kolonna.
Separazzjoni ta 'taħlita ta' peptidi fuq kolonna PMP (B) u kolonna Ascentis Express RP-Amide (A);fażi mobbli 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensjonijiet tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id);analitiku L-ordni ta' elużjoni tal-komposti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) u 5 (leucine) acid enkephalin)).
Kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) ġiet evalwata għas-separazzjoni ta 'diġestjoni tryptic ta' albumina tas-serum uman fil-kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja. kromatogramma (Figura 6), id-diġestjoni HSA ġiet maqsuma fi 17-il quċċata li tikkorrispondi għal 17-il peptide. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta 'kull quċċata fid-diġestjoni HSA ġiet ikkalkulata u l-valuri huma mogħtija fit-Tabella 5.
Diġest tryptic ta 'HSA (100 × 1.8 mm id) ġie separat fuq kolonna PMP;rata tal-fluss (100 µL/min), fażi mobbli 60/40 acetonitrile/ilma b'0.1% TFA.
fejn L hija t-tul tal-kolonna, η hija l-viskożità tal-fażi mobbli, ΔP hija l-pressjoni lura tal-kolonna, u u hija l-veloċità lineari tal-fażi mobbli. l-istudju preċedenti tagħna Ref.34.Il-permeabilità tal-kolonna ppakkjata b'partiċelli superfiċjalment porużi hija: 1.7 × 10-15 għal partiċelli ta '1.3 μm, 3.1 × 10-15 għal partiċelli 1.7 μm, 5.2 × 10-15 u 2.5 × 10-14 . il-permeabilità tal-fażi PMP hija simili għal dik ta 'partiċelli tal-qalba-qoxra ta' 5 μm.
fejn Wx huwa l-piż tal-kolonna ippakkjat bil-kloroform, Wy huwa l-piż tal-kolonna ippakkjat bil-metanol, u ρ hija d-densità tas-solvent.Densitajiet ta 'metanol (ρ = 0.7866) u kloroform (ρ = 1.484). 31 li studjajna qabel kienu 0.63 u 0.55, rispettivament.Dan ifisser li l-preżenza ta 'ligandi ta' l-urea tnaqqas il-permeabilità tal-fażi stazzjonarja.Min-naħa l-oħra, il-porożità totali tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) hija 0.60. fażijiet il-ligandi C18 huma mwaħħla mal-partiċelli tas-silika bħala ktajjen lineari, filwaqt li f'fażijiet stazzjonarji tat-tip tal-polistirene, is-saff tal-polimeru relattivament oħxon huwa ffurmat madwaru.F'esperiment tipiku, il-porożità tal-kolonna hija kkalkulata bħala:
Figura 7A, B turi l-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) u l-kolonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) bl-użu tal-istess kundizzjonijiet ta 'elużjoni (jiġifieri, 60/40 ACN / H2O u 0.1% TFA).) tal-plott van Deemter.Taħlitiet ta’ peptidi magħżula (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ġew ippreparati f’20 µL/ Ir-rata minima tal-fluss għaż-żewġ kolonni hija 800 µL/min. Il-kolonna Express RP-Amide kienet 2.6 µm u 3.9 µm, rispettivament. Il-valuri HETP jindikaw li l-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) hija ħafna aħjar mill-kolonna Ascentis Express RP-Amide disponibbli kummerċjalment (100 × 1.8 mm id). studju.L-effiċjenza ogħla tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) meta mqabbla mal-kolonna Ascentis Express RP-Amide hija bbażata fuq titjib fil-forma tal-partiċelli, id-daqs, u l-proċeduri kumplessi tal-ippakkjar tal-kolonna użati fix-xogħol attwali34.
(A) plot van Deemter (HETP versus veloċità lineari tal-fażi mobbli) miksub bl-użu ta 'kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) f'60/40 ACN/H2O b'0.1% TFA. b'0.1% TFA.
Fażi stazzjonarja tal-polistirene inkorporata fil-polar ġiet ippreparata u evalwata għas-separazzjoni ta’ taħlitiet ta’ peptidi sintetiċi u diġesti ta’ trypsin ta’ albumina tas-serum uman (HAS) f’kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja. , Sinteżi kkontrollata tal-fażi stazzjonarja, u ippakkjar kumpless tal-kolonna. Minbarra effiċjenza għolja ta 'separazzjoni, pressjoni ta' wara tal-kolonna baxxa b'rati ta 'fluss għoljin hija vantaġġ ieħor ta' din il-fażi stazzjonarja. Kolonni PMP juru riproduċibbiltà tajba u jistgħu jintużaw għall-analiżi ta 'taħlitiet ta' peptidi u diġestjoni tat-tripsin ta 'diversi proteini. Għandna l-ħsieb li nużaw din il-kolonna għas-separazzjoni ta' prodotti naturali, estratti likwidi PMP fil-kolonna bijoattiva tal-pjanti fil-futur. se jiġu evalwati wkoll għas-separazzjoni ta' proteini u antikorpi monoklonali.
Qasam, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Riċerka dwar Sistemi ta' Separazzjoni ta' Peptidi permezz ta' Kromatografija ta' Fażi Maqluba Parti I: Żvilupp ta' Protokoll ta' Karatterizzazzjoni ta' Kolonna.J.Kromatografija.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptidi attivi mtejba ddisinjati għat-trattament ta 'mard infettiv.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Kromatografija.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Kromatografija likwida avvanzata-spettrometrija tal-massa tippermetti l-inkorporazzjoni ta 'metabolomics immirati b'mod wiesa' u proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89-97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp tad-droga.J.Settembru Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi ta 'kromatografija likwida ta' pressjoni ultrahigh għal separazzjonijiet rapidi.J.Settembru Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Applikazzjoni ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja fl-iżvilupp tad-droga.J.Kromatografija.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Idroġels makroporużi monolitiċi ppreparati minn emulsjonijiet ta 'fażi interna għolja taż-żejt fl-ilma għal purifikazzjoni effiċjenti ta' enteroviruses.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika.J.Kromatografija.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Emerging trends in reverse-phase liquid chromatography separations of therapeutic peptides and proteins: theory and applications.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separazzjoni bidimensjonali ta 'peptidi bl-użu ta' sistema RP-RP-HPLC li tuża valuri pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta 'separazzjoni.J.Settembru Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Il-karatteristiċi tat-trasferiment tal-massa u l-prestazzjoni kinetika ta 'kolonni kromatografiċi ta' effiċjenza għolja ppakkjati b'partiċelli C18 sub-2 μm kompletament u superfiċjalment porużi ġew investigati.J.Settembru Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Xejriet riċenti u sfidi analitiċi fl-iżolament, l-identifikazzjoni u l-validazzjoni ta 'peptidi bijoattivi tal-pjanti.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-x (0851).
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Ipproċessar downstream ta 'peptidi terapewtiċi permezz ta' kromatografija likwida preparattiva.Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografija b'mod imħallat u l-applikazzjoni tagħha għal bijopolimeri.J.Kromatografija.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands għall-kromatografija tal-proteini b'mod imħallat: prinċipju, karatterizzazzjoni u disinn.J.Bijoteknoloġija.144(1), 3-11 (2009).