Grazzi talli żort Nature.com. Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Juri karużell ta’ tliet slides f’daqqa. Uża l-buttuni Preċedenti u Li Jmiss biex timxi minn tliet slides kull darba, jew uża l-buttuni tas-slider fl-aħħar biex timxi minn tliet slides kull darba.
Partiċelli tas-silika porużi ġew ippreparati bil-metodu sol-gel b'xi modifiki biex jinkisbu partiċelli b'pori wesgħin. Dawn il-partiċelli ġew derivatizzati b'N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) u styrene permezz ta' polimerizzazzjoni ta' trasferiment ta' katina inversa-frammentazzjoni (RAFT) biex jipproduċu poliamidi interkalati b'N-phenylmaleimide. Fażi stazzjonarja tal-styrene (PMP). Kolonni tal-istainless steel b'dijametru dejqa (dijametru intern ta' 100 × 1.8 mm) ġew ippakkjati b'ippakkjar ta' taħlita. Il-prestazzjoni kromatografika tal-kolonna PMP ġiet evalwata biex tissepara taħlita ta' peptidi sintetiċi li jikkonsistu f'ħames peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) u idrolizzat triptiku tal-albumina tas-serum uman (HAS). Taħt kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni, in-numru teoretiku ta' pjanċi b'taħlita ta' peptidi laħaq 280,000 pjanċa/m². Meta tqabbel il-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna żviluppata mal-kolonna kummerċjali Ascentis Express RP-Amide, ġie osservat li l-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP kienet superjuri għall-kolonna kummerċjali f'termini ta' effiċjenza u riżoluzzjoni tas-separazzjoni.
L-industrija bijofarmaċewtika saret suq globali li qed jespandi b'żieda sinifikanti fis-sehem tas-suq f'dawn l-aħħar snin. Bit-tkabbir splussiv tal-industrija bijofarmaċewtika1,2,3 hemm bżonn kbir għall-analiżi tal-peptidi u l-proteini. Minbarra l-peptid fil-mira, diversi impuritajiet jiffurmaw waqt is-sintesi tal-peptidi, għalhekk hija meħtieġa purifikazzjoni kromatografika biex tinkiseb il-purità mixtieqa tal-peptid. L-analiżi u l-karatterizzazzjoni tal-proteini fil-fluwidi tal-ġisem, fit-tessuti u fiċ-ċelloli hija kompitu estremament ta' sfida minħabba n-numru kbir ta' speċi potenzjalment skoperti preżenti f'kampjun wieħed. Għalkemm l-ispettrometrija tal-massa hija għodda effettiva għas-sekwenzar tal-peptidi u l-proteini, jekk kampjuni bħal dawn jiġu introdotti direttament fl-ispettrometru tal-massa, is-separazzjoni ma tkunx sodisfaċenti. Din il-problema tista' tissolva billi titwettaq kromatografija likwida (LC) qabel l-analiżi MS, li tnaqqas l-ammont ta' analiti li jidħlu fl-ispettrometru tal-massa f'ħin partikolari4,5,6. Barra minn hekk, l-analiti jistgħu jikkonċentraw f'reġjun dejjaq waqt is-separazzjoni tal-fażi likwida, u b'hekk jikkonċentraw dawn l-analiti u jżidu s-sensittività tad-detezzjoni MS. Il-kromatografija likwida (LC) avvanzat b'mod sinifikanti matul l-aħħar għaxar snin u saret metodu użat ħafna għall-analiżi proteomika7,8,9,10.
Il-kromatografija likwida b'fażi inversa (RP-LC) tintuża ħafna biex tippurifika u tissepara taħlitiet ta' peptidi bl-użu ta' silika modifikata bl-ottadeċil (ODS) bħala l-fażi stazzjonarja11,12,13. Madankollu, minħabba l-istruttura kumplessa u n-natura anfoterika tagħhom,14,15 il-fażijiet stazzjonarji RP ma jistgħux jipprovdu separazzjoni sodisfaċenti ta' peptidi u proteini. Għalhekk, l-analiżi ta' peptidi u proteini bi frammenti polari u mhux polari teħtieġ fażijiet stazzjonarji ddisinjati apposta biex jinteraġixxu u jżommu dawn l-analiti16. Il-kromatografija mħallta, li toffri interazzjonijiet multimodali, tista' tkun alternattiva għall-RP-LC għas-separazzjoni ta' peptidi, proteini, u taħlitiet kumplessi oħra. Diversi fażijiet stazzjonarji tat-tip imħallat ġew ippreparati u kolonni mimlija b'dawn il-fażijiet stazzjonarji ntużaw biex jisseparaw peptidi u proteini17,18,19,20,21. Minħabba l-preżenza ta' gruppi polari u mhux polari, fażijiet stazzjonarji ta' mod imħallat (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalazzjoni polari/RPLC) huma adattati għas-separazzjoni ta' peptidi u proteini22,23,24,25,26,27,28. , fażijiet stazzjonarji interkalati polari bi gruppi polari marbuta b'mod kovalenti juru kapaċitajiet tajbin ta' separazzjoni u selettività unika għal analiti polari u mhux polari għaliex is-separazzjoni tiddependi fuq l-interazzjoni bejn l-analit u l-fażi stazzjonarja Interazzjonijiet multimodali 29,30,31,32. Riċentement, Zhang et al. 30 kisbu fażijiet stazzjonarji terminati bil-behenyl ta' poliamini u separaw b'suċċess idrokarburi, antidipressanti, flavonojdi, nukleosidi, estroġeni, u xi analiti oħra. Il-materjal stazzjonarju inkorporat polari għandu kemm gruppi polari kif ukoll mhux polari, għalhekk jista' jintuża biex jissepara peptidi u proteini f'partijiet idrofobiċi u idrofiliċi. Kolonni polari inline (eż., kolonni C18 b'amide inline) huma disponibbli taħt l-isem kummerċjali Ascentis Express RP-Amide columns, iżda dawn il-kolonni ntużaw biss għall-analiżi tal-amina 33.
Fl-istudju attwali, ġiet ippreparata fażi stazzjonarja ta' embedding polari (N-phenylmaleimide, embedding polystyrene) u evalwata għas-separazzjoni tal-peptidi u l-qsim tat-tryptic HSA. L-istrateġija li ġejja ntużat biex tipprepara l-fażi stazzjonarja. Partiċelli tas-silika poruża ġew ippreparati skont il-proċeduri deskritti fil-pubblikazzjonijiet preċedenti tagħna, b'xi bidliet fl-iskemi ta' preparazzjoni 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Il-proporzjonijiet tal-urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS u aċidu aċetiku akweju ġew aġġustati biex jinkisbu partiċelli tas-silika b'daqsijiet kbar tal-pori. It-tieni, ġie sintetizzat ligand ġdid ta' phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate u l-partiċelli tas-silika derivatizzati tiegħu ntużaw biex jippreparaw fażijiet stazzjonarji polari inkorporati. Il-fażi stazzjonarja miksuba ġiet ippakkjata f'kolonna tal-istainless steel (dijametru intern 100 × 1.8 mm) skont skema ta' ppakkjar ottimizzata. L-ippakkjar tal-kolonna huwa megħjun minn vibrazzjoni mekkanika biex tiżgura saff uniformi fil-kolonna. Il-kolonna ppakkjata ġiet evalwata għas-separazzjoni ta' taħlita ta' peptidi li tikkonsisti f'ħames peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide) u idrolisati triptiċi ta' albumina tas-serum uman (HSA). Ġie osservat li t-taħlita tal-peptidi u d-diġest triptiku tal-HSA sseparaw b'riżoluzzjoni u effiċjenza tajba. L-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP ġiet imqabbla ma' dik tal-kolonna Ascentis Express RP-Amide. Ġie osservat li l-peptidi u l-proteini għandhom riżoluzzjoni tajba u effiċjenza għolja ta' separazzjoni fuq il-kolonna PMP, u l-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP hija ogħla minn dik tal-kolonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), urea, aċidu aċetiku, trimetossiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsina, albumina tas-serum uman (HSA), klorur tal-ammonju, urea, eżametilmetakrilojldisilażan (HMDS), klorur tal-metakrilojl (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossidu tal-benżojl (BPO), aċetonitril (ACN) għall-HPLC, metanol, 2-propanol u aċetun. Kumpanija Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, l-Istati Uniti tal-Amerika).
Taħlita ta' urea (8 g), polietilen glikol (8 g) u 8 ml ta' aċidu aċetiku 0.01 N. tħawdet għal 10 minuti, u 24 ml ta' TMOS ġew miżjuda magħha taħt tkessiħ bis-silġ. It-taħlita ta' reazzjoni ssaħħan f'40°C għal 6 sigħat u mbagħad f'120°C għal 8 sigħat f'awtoklav tal-istainless steel. L-ilma tferra' u r-residwu tnixxef f'70°C għal 12-il siegħa. Il-blokki rotob imnixxfa ġew mitħunin bla xkiel u kalċinati f'forn f'550°C għal 12-il siegħa. Tliet lottijiet ġew ippreparati u kkaratterizzati biex tiġi ttestjata r-riproduċibbiltà tad-daqsijiet tal-partiċelli, id-daqs tal-pori u l-erja tal-wiċċ.
Grupp polari u fażi stazzjonarja għal ktajjen tal-polistirene. Il-proċedura ta' preparazzjoni hija deskritta hawn taħt.
N-phenylmaleimide (200 mg) u methyl vinyl isocyanate (100 mg) ġew maħlula f'toluene anidru, u mbagħad 0.1 ml ta' 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ġie miżjud mal-flixkun tar-reazzjoni biex jinkiseb kopolimeru ta' phenylmaleimide u methyl vinyl isocyanate (PMCP). ) It-taħlita ġiet saħħna f'60°C għal 3 sigħat, iffiltrata u mnixxfa f'forn f'40°C għal 3 sigħat.
Partiċelli tas-silika mnixxfa (2 g) ġew imxerrda f'toluene niexef (100 ml), imħawda u sonikati għal 10 minuti fi flask b'qiegħ tond ta' 500 ml. PMCP (10 mg) ġie maħlul fit-toluene u miżjud qatra qatra mal-flask tar-reazzjoni permezz ta' lembut taż-żieda. It-taħlita ġiet imsaħħan f'100°C għal 8 sigħat, iffiltrata, maħsula bl-aċetun u mnixxfa f'60°C għal 3 sigħat. Imbagħad, il-partiċelli tas-silika assoċjati ma' PMCP (100 g) ġew maħlula f'toluene (200 ml), u 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) ġie miżjud magħhom fil-preżenza ta' 100 μl ta' dibutyltin dilaurate bħala katalist. It-taħlita ġiet imħawda f'50°C għal 8 sigħat, iffiltrata u mnixxfa f'50°C għal 3 sigħat.
Styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0.5 ml) u partiċelli tas-silika mwaħħla ma' TEMPO-PMCP (1.5 g) ġew imxerrda fit-toluene u mnaddfa bin-nitroġenu. Il-polimerizzazzjoni tal-styrene twettqet f'100°C għal 12-il siegħa. Il-prodott li rriżulta nħasel bil-metanol u tnixxef matul il-lejl f'60°C. L-iskema ġenerali tar-reazzjoni hija murija fil-fig. wieħed.
Il-kampjuni tneħħew mill-gass f'temperatura ta' 393 K għal siegħa sakemm inkisbet pressjoni residwa ta' inqas minn 10–3 Torr. L-ammont ta' N2 assorbit fi pressjoni relattiva P/P0 = 0.99 intuża biex jiġi ddeterminat il-volum totali tal-pori. Il-morfoloġija tal-partiċelli tas-silika pura u marbuta mal-ligand ġiet eżaminata bl-użu ta' mikroskopju elettroniku tal-iskannjar (Hitachi High Technologies, Tokyo, il-Ġappun). Kampjuni niexfa (silika pura u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand) tqiegħdu fuq vireg tal-aluminju bl-użu ta' tejp tal-karbonju. Id-deheb ġie depożitat fuq il-kampjun bl-użu ta' apparat ta' sputtering Q150T, u saff Au ta' 5 nm ħxuna ġie depożitat fuq il-kampjun. Dan itejjeb l-effiċjenza tal-proċess ta' vultaġġ baxx u jipprovdi bexx fin kiesaħ. L-analiżi elementali twettqet bl-użu ta' analizzatur tal-kompożizzjoni elementali Flash EA1112 Thermo Electron (Waltham, MA, USA). Intuża analizzatur tad-daqs tal-partiċelli Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 biex tinkiseb id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli. Partiċelli tas-silika mhux miksija u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand (5 mg kull waħda) ġew imxerrda f'5 ml ta' isopropanol, sonikati għal 10 minuti, aġitati għal 5 minuti, u mqiegħda fuq bank ottiku Mastersizer. L-analiżi termogravimetrika titwettaq b'rata ta' 5 °C kull minuta fil-medda ta' temperatura minn 30 sa 800 °C.
Kolonni tal-azzar inossidabbli b'dijametru dojoq miksija bil-fibra tal-ħġieġ b'dimensjonijiet (ID 100 × 1.8 mm) ġew ippakkjati bil-metodu tal-mili tat-taħlita bl-istess proċedura bħal fir-referenza 31. Kolonna tal-azzar inossidabbli (miksija bil-ħġieġ, ID 100 × 1.8 mm) u żbokk li fih frit ta' 1 µm ġew imqabbda ma' magna tal-ippakkjar tat-taħlita (Alltech Deerfield, IL, USA). Ipprepara sospensjoni tal-fażi stazzjonarja billi tissospendi 150 mg tal-fażi stazzjonarja f'1.2 ml ta' metanol u titmagħha f'kolonna ta' riżervwar. Il-metanol intuża bħala s-solvent tat-taħlita u s-solvent ta' kontroll. Ippakkja l-kolonna billi tapplika sekwenza ta' pressjoni ta' 100 MP għal 10 minuti, 80 MP għal 15-il minuta, u 60 MP għal 30 minuta. Il-proċess tal-ippakkjar uża żewġ vibraturi tal-kolonna tal-kromatografija tal-gass (Alltech, Deerfield, IL, USA) għall-vibrazzjoni mekkanika biex jiżgura ippakkjar uniformi tal-kolonna. Agħlaq l-ippakkjar tat-taħlita u erħi l-pressjoni bil-mod biex tevita ħsara lis-sekwenza. Il-kolonna ġiet skonnettjata miż-żennuna tat-taħlita u twaħħil ieħor mad-daħla u twaħħal mas-sistema LC biex jiġi ttestjat l-operat tagħha.
MLC apposta nbena bl-użu ta' pompa LC (10AD Shimadzu, Ġappun), sampler b'linja ta' injezzjoni ta' 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), degasser tal-membrana (Shimadzu DGU-14A), u tieqa kapillari UV-VIS. Apparat ditekter (UV-2075) u mikrokolonna enamelizzata. Uża tubi ta' konnessjoni dojoq ħafna u qosra biex timminimizza l-effett ta' espansjoni addizzjonali tal-kolonna. Wara li timla l-kolonna, installa kapillari (50 µm id 365) fl-iżbokk tal-junction li tnaqqas ta' 1/16″ u installa kapillari (50 µm) tal-junction li tnaqqas. Il-ġbir tad-dejta u l-ipproċessar tal-kromatogramma jitwettqu bl-użu tas-softwer Multichro 2000. F'254 nm, l-assorbenza UV tal-analiti tas-suġġetti ġiet immonitorjata f'0. Id-dejta kromatografika ġiet analizzata bl-użu ta' OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina tas-serum uman, trab lijofilizzat, ≥ 96% (elettroforesi bil-ġel tal-agarose) 3 mg imħallta ma' tripsina (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) u 0.2 M bikarbonat tal-ammonju (1 ml). Is-soluzzjoni tħawdet għal 10 minuti u nżammet f'banju tal-ilma f'37°C għal 6 sigħat, imbagħad ġiet imkessħa b'1 ml ta' 0.1% TFA. Iffiltra s-soluzzjoni u aħżenha taħt l-4°C.
Is-separazzjoni ta' taħlita ta' peptidi u HSA diġerita triptika fuq kolonna PMP ġiet evalwata separatament. Iċċekkja l-idroliżi triptika ta' taħlita ta' peptidi u HSA separati minn kolonna PMP u qabbel ir-riżultati ma' kolonna Ascentis Express RP-Amide. In-numru ta' pjanċi teoretiċi huwa kkalkulat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
Immaġnijiet SEM ta' partiċelli tas-silika pura u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand huma murija fil-Figura 2. Immaġnijiet SEM ta' partiċelli tas-silika pura (A, B) juru forma sferika fejn il-partiċelli huma tawwalin jew għandhom simetrija irregolari meta mqabbla mal-istudji preċedenti tagħna. Il-wiċċ tal-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand (C, D) huwa aktar lixx minn dak tal-partiċelli tas-silika pura, li jista' jkun minħabba l-katini tal-polistirene li jkopru l-wiċċ tal-partiċelli tas-silika.
Mikrografi elettroniċi tal-iskannjar ta' partiċelli tas-silika pura (A, B) u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand (C, D).
Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli tal-partiċelli tas-silika pura u l-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand hija murija fil-Fig. 2. 3(A). Il-kurvi tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli volumetriċi wrew li d-daqs tal-partiċelli tas-silika żdied wara modifika kimika (Fig. 3A). Id-dejta tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli tas-silika mill-istudju attwali u l-istudju preċedenti hija mqabbla fit-Tabella 1(A). Id-daqs volumetriku tal-partiċelli d(0.5) tal-PMP kien ta' 3.36 µm, meta mqabbel mal-valur ad(0.5) ta' 3.05 µm fl-istudju preċedenti tagħna (partiċelli tas-silika marbuta mal-polistirene)34. Minħabba l-bidla fil-proporzjon tal-PEG, l-urea, it-TMOS u l-aċidu aċetiku fit-taħlita tar-reazzjoni, id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli ta' dan il-lott kienet idjaq meta mqabbla mal-istudju preċedenti tagħna. Id-daqs tal-partiċelli tal-fażi PMP huwa kemxejn akbar minn dak tal-fażi tal-partiċelli tas-silika marbuta mal-polistirene li studjajna qabel. Dan ifisser li l-funzjonalizzazzjoni tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika bl-istirene ddepożitat biss saff ta' polistirene (0.97 µm) fuq il-wiċċ tas-silika, filwaqt li fil-fażi PMP il-ħxuna tas-saff kienet ta' 1.38 µm.
Distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli (A) u distribuzzjoni tad-daqs tal-pori (B) ta' partiċelli tas-silika pura u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand.
Id-daqs tal-pori, il-volum tal-pori, u l-erja tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika użati f'dan l-istudju huma murija fit-Tabella 1 (B). Il-profili PSD tal-partiċelli tas-silika pura u l-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand huma murija fil-Figuri 3(B). Ir-riżultati kienu komparabbli mal-istudju preċedenti tagħna34. Id-daqsijiet tal-pori tal-partiċelli tas-silika pura u marbuta mal-ligand kienu 310 Å u 241 Å, rispettivament, li jindika li wara l-modifika kimika, id-daqs tal-pori naqas b'69 ​​Å, kif muri fit-Tabella 1 (B), u l-kurva tal-bidla hija murija fil-Fig. L-erja tal-wiċċ speċifika tal-partiċelli tas-silika fl-istudju attwali hija 116 m2/g, li hija komparabbli mal-istudju preċedenti tagħna (124 m2/g). Kif muri fit-Tabella 1(B), l-erja tal-wiċċ (m2/g) tal-partiċelli tas-silika wara l-modifika kimika naqset ukoll minn 116 m2/g għal 105 m2/g.
Ir-riżultati tal-analiżi elementali tal-fażi stazzjonarja huma ppreżentati fit-Tabella 2. Il-kontenut ta' karbonju tal-fażi stazzjonarja attwali huwa ta' 6.35%, li huwa inqas milli fl-istudju preċedenti tagħna (partiċelli tas-silika assoċjati mal-polistirene, 7.93%35 u 10.21%, rispettivament) 42. Il-kontenut ta' karbonju tal-fażi stazzjonarja attwali huwa muri hawn taħt, peress li xi ligandi polari bħal phenylmaleimide methyl vinyl isocyanate (PCMP) u 4-hydroxy-TEMPO ntużaw flimkien mal-istirene fil-preparazzjoni tal-SP. Il-perċentwal tal-piż tan-nitroġenu fil-fażi stazzjonarja attwali huwa ta' 2.21% meta mqabbel ma' 0.1735 u 0.85% fi studji preċedenti42. Dan ifisser li l-fażi stazzjonarja attwali għandha perċentwal għoli ta' piż ta' nitroġenu minħabba l-phenylmaleimide. Bl-istess mod, il-prodotti (4) u (5) għandhom kontenut ta' karbonju ta' 2.7% u 2.9%, rispettivament, filwaqt li l-prodott finali (6) għandu kontenut ta' karbonju ta' 6.35%, kif muri fit-Tabella 2. Analiżi termogravimetrika (TGA) intużat fuq il-fażi stazzjonarja tal-PMP biex tittestja t-telf fil-piż, u l-kurva TGA hija murija fil-Figura 4. Il-kurva TGA turi telf fil-piż ta' 8.6%, li huwa fi qbil tajjeb mal-kontenut ta' karbonju (6.35%), peress li l-ligandi fihom mhux biss C, iżda wkoll N, O u H.
Il-ligand phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate intgħażel biex jimmodifika l-wiċċ tal-partiċelli tas-silika minħabba l-gruppi polari tiegħu ta' phenylmaleimide u vinylisocyanate. Il-gruppi tal-vinyl isocyanate jistgħu jirreaġixxu aktar mal-istirene permezz ta' polimerizzazzjoni radikali ħajja. It-tieni raġuni hija li tiddaħħal grupp li għandu interazzjonijiet moderati mal-analit u l-ebda interazzjonijiet elettrostatiċi qawwija bejn l-analit u l-fażi stazzjonarja, peress li l-parti fenylmaleimide m'għandhiex ċarġ virtwali f'pH normali. Il-polarità tal-fażi stazzjonarja tista' tiġi kkontrollata mill-ammont ottimali ta' stirene u l-ħin ta' reazzjoni tal-polimerizzazzjoni radikali ħielsa. L-aħħar pass tar-reazzjoni (polimerizzazzjoni radikali ħielsa) huwa kritiku peress li jibdel il-polarità tal-fażi stazzjonarja. Twettqet analiżi elementali biex jiġi vverifikat il-kontenut tal-karbonju f'dawn il-fażijiet stazzjonarji. Ġie osservat li ż-żieda fl-ammont ta' stirene u l-ħin ta' reazzjoni żżid il-kontenut tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja u viċi versa. L-SPs ippreparati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' stirene għandhom tagħbijiet ta' karbonju differenti. Bl-istess mod, dawn il-fażijiet stazzjonarji tqiegħdu fuq kolonni tal-azzar li ma jissaddadx u l-karatteristiċi kromatografiċi tagħhom (selettività, riżoluzzjoni, valur N, eċċ.) ġew iċċekkjati. Abbażi ta' dawn l-esperimenti, intgħażlet kompożizzjoni ottimizzata għall-preparazzjoni tal-fażi stazzjonarja PMP biex tipprovdi polarità kkontrollata u żamma tajba tal-analit.
Il-kolonna PMP ġiet evalwata wkoll għall-analiżi ta' ħames taħlitiet ta' peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) bl-użu tal-kapaċità tal-fażi mobbli. 60/40 (v/v) ACN/ilma (0.1% TFA) b'rata ta' fluss ta' 80 µl/min. Taħt kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni (200,000 pjanċa/m), in-numru ta' pjanċi teoretiċi (N) għal kull kolonna (100 × 1.8 mm) huwa 20,000 ± 100. Il-valuri N għat-tliet kolonni PMP huma murija fit-Tabella 3 u l-kromatogrammi huma murija fil-Figura 5A. Analiżi veloċi b'rata ta' fluss għolja (700 µl/min) fuq kolonna PMP, ħames peptidi elużi fi żmien minuta, valur N eċċellenti ta' 13,500 ± 330 għal kull kolonna (dijametru ta' 100 x 1.8 mm), ekwivalenti għal 135,000 pjanċa/m (Fig. 5B). Tliet kolonni tal-istess daqs (dijametru intern 100 x 1.8 mm) imtlew bi tliet lottijiet differenti ta' fażi stazzjonarja PMP biex tiġi ttestjata r-riproduċibbiltà. L-analiti ġew irreġistrati għal kull kolonna billi ġiet isseparata l-istess taħlita tat-test fuq kull kolonna bl-użu ta' kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni, numru ta' pjanċi teoretiċi N, u ħin ta' żamma. Id-dejta tar-riproduċibbiltà għall-kolonni PMP hija murija fit-Tabella 4. Ir-riproduċibbiltà tal-kolonna PMP kienet korrelata sew ma' valuri %RSD baxxi ħafna kif muri fit-Tabella 3.
Separazzjoni ta' taħlitiet ta' peptidi fuq kolonna PMP (B) u kolonna Ascentis Express RP-Amide (A), fażi mobbli 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensjonijiet tal-kolonna PMP (100 x 1.8 mm id), analiżi Ordni ta' eluzzjoni tal-komposti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) u 5 (enkefalina tal-aċidu lewċiku).
Kolonna PMP (dijametru intern 100 x 1.8 mm) ġiet evalwata għas-separazzjoni tal-idrolizzat triptiku tal-albumina tas-serum uman permezz tal-HPLC. Il-kromatogramma fil-Figura 6 turi li l-kampjuni huma separati sew b'riżoluzzjoni tajba ħafna. Is-soluzzjonijiet tal-HSA ġew analizzati bl-użu ta' rata ta' fluss ta' 100 μl/min, fażi mobbli ta' 70/30 aċetonitrile/ilma u 0.1% TFA. Il-qsim tal-HSA ġie maqsum f'17-il quċċata, kif muri fil-kromatogramma (Fig. 6), li jikkorrispondu għal 17-il peptid. L-effiċjenzi tas-separazzjoni tal-qċaċet individwali mill-idrolizzat tal-HSA ġew ikkalkulati u l-valuri huma murija fit-Tabella 5.
L-idrolisati triptiċi tal-HSA ġew separati fuq kolonna PMP (dijametru intern 100 x 1.8 mm), rata ta' fluss (100 μl/min), fażi mobbli 60/40 aċetonitrile/ilma, u 0.1% TFA.
Fejn L hija t-tul tal-kolonna, η hija l-viskożità tal-fażi mobbli, ΔP hija l-pressjoni ta' wara tal-kolonna, u u hija l-veloċità lineari tal-fażi mobbli. Il-permeabilità tal-kolonna PMP kienet 2.5 × 10–14 m2, ir-rata tal-fluss kienet 25 µl/min, intuża 60/40 v/v. ACN/ilma. Il-permeabilità tal-kolonna PMP (ID 100 × 1.8 mm) kienet simili għal dik tal-istudju preċedenti tagħna Ref.34. Il-permeabilità ta' kolonna mimlija b'partiċelli superfiċjalment porużi hija 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 għal partiċelli ta' 5 µm43. Għalhekk, il-permeabilità tal-fażi PMP hija simili għall-permeabilità tal-partiċelli tal-qalba-qoxra b'daqs ta' 5 μm.
Fejn Wx hija l-massa tal-kolonna mimlija bil-kloroform, Wy hija l-massa tal-kolonna mimlija bil-metanol, u ρ hija d-densità tas-solvent. Id-densità tal-metanol (ρ = 0.7866) u l-kloroform (ρ = 1.484). Il-porożità totali tal-kolonna tal-partiċelli tas-silika-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 u l-kolonna C18-urea31 li studjajna qabel kienet 0.63 u 0.55, rispettivament. Dan ifisser li l-preżenza ta' ligandi tal-urea tnaqqas il-permeabilità tal-fażi stazzjonarja. Min-naħa l-oħra, il-porożità totali tal-kolonna PMP (dijametru intern 100 × 1.8 mm) hija 0.60. Il-kolonni PMP huma inqas permeabbli mill-kolonni ppakkjati b'partiċelli tas-silika marbuta mas-C18 għaliex fil-fażijiet stazzjonarji tat-tip C18 il-ligandi C18 huma mwaħħla mal-partiċelli tas-silika f'ktajjen lineari, filwaqt li fil-fażijiet stazzjonarji tat-tip polistirene jiġi ffurmat polimeru relattivament oħxon madwar il-partiċelli. Saff A. F'esperiment tipiku, il-porożità tal-kolonna hija kkalkulata kif ġej:
Fil-fig. 7A, B juru plottijiet ta' Van Deemter għal kolonna PMP (id 100 x 1.8 mm) u kolonna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) taħt l-istess kundizzjonijiet ta' eluzzjoni, 60/40 ACN/H2O u 0.1% TFA 20 µl/min sa 800 µl/min fuq iż-żewġ kolonni. Il-valuri minimi tal-HETP bir-rata tal-fluss ottimali (80 µl/min) kienu 2.6 µm u 3.9 µm għall-kolonna PMP u l-kolonna Ascentis Express RP-Amide, rispettivament. Il-valuri tal-HETP juru li l-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (100 x 1.8 mm id) hija ħafna ogħla minn dik tal-kolonna Ascentis Express RP-Amide disponibbli kummerċjalment (100 x 1.8 mm id). Il-graff ta' van Deemter fil-Fig. 7(A) juri li t-tnaqqis fil-valur N mhuwiex sinifikament ogħla biż-żieda tal-fluss meta mqabbel mal-istudju preċedenti tagħna. L-effiċjenza ogħla tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (id 100 × 1.8 mm) meta mqabbla mal-kolonna Ascentis Express RP-Amide hija bbażata fuq il-forma u d-daqs imtejba tal-partiċelli u l-proċedura sofistikata tal-ippakkjar tal-kolonna użata fix-xogħol attwali34.
(A) Plott ta' Van Deemter (HETP kontra l-veloċità lineari tal-fażi mobbli) miksub fuq kolonna PMP (id 100 x 1.8 mm) f'60/40 ACN/H2O b'0.1% TFA. (B) Plott ta' Van Deemter (HETP kontra l-veloċità lineari tal-fażi mobbli) miksub fuq kolonna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) f'60/40 ACN/H2O b'0.1% TFA.
Fażi stazzjonarja polari ta' polistirene interkalat ġiet ippreparata u evalwata għas-separazzjoni ta' taħlita ta' peptidi sintetiċi u idrolizzat triptiku ta' albumina tas-serum uman (HSA) fil-kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja. Il-prestazzjoni kromatografika tal-kolonni PMP għal taħlitiet ta' peptidi hija eċċellenti f'termini ta' effiċjenza u riżoluzzjoni tas-separazzjoni. L-effiċjenza mtejba tas-separazzjoni tal-kolonni PMP hija dovuta għal diversi raġunijiet bħad-daqs tal-partiċelli tas-silika u d-daqs tal-pori, is-sinteżi kkontrollata tal-fażijiet stazzjonarji, u materjali kumplessi tal-ippakkjar tal-kolonni. Minbarra l-effiċjenza għolja tas-separazzjoni, vantaġġ ieħor ta' din il-fażi stazzjonarja huwa l-pressjoni baxxa ta' wara tal-kolonna b'rati ta' fluss għoljin. Il-kolonni PMP huma riproduċibbli ħafna u jistgħu jintużaw biex jiġu analizzati taħlitiet ta' peptidi u diġestjoni triptika ta' diversi proteini. Għandna l-ħsieb li nużaw din il-kolonna għas-separazzjoni ta' komposti bijoattivi minn prodotti naturali, estratti ta' pjanti mediċinali u faqqiegħ fil-kromatografija likwida. Fil-futur, il-kolonni PMP se jiġu evalwati wkoll għas-separazzjoni ta' proteini u antikorpi monoklonali.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigazzjoni dwar sistemi ta' separazzjoni ta' peptidi bil-kromatografija f'fażi inversa parti I: Żvilupp ta' protokoll għall-karatterizzazzjoni tal-kolonni. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigazzjoni dwar sistemi ta' separazzjoni ta' peptidi bil-kromatografija f'fażi inversa parti I: Żvilupp ta' protokoll għall-karatterizzazzjoni tal-kolonni.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., u Petersson, P. Investigazzjoni ta' Sistemi ta' Separazzjoni tal-Peptidi permezz ta' Kromatografija b'Fażi Inversa, Parti I: Żvilupp ta' Protokoll għall-Karatterizzazzjoni tal-Kolonna. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigazzjoni dwar sistemi ta' separazzjoni ta' peptidi bil-kromatografija f'fażi inversa parti I: Żvilupp ta' protokoll għall-karatteristiċi tal-kolonna. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigazzjoni dwar sistemi ta' separazzjoni ta' peptidi bil-kromatografija f'fażi inversa parti I: Żvilupp ta' protokoll għall-karatteristiċi tal-kolonna.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., u Petersson, P. Investigazzjoni ta' Sistemi ta' Separazzjoni tal-Peptidi permezz ta' Kromatografija b'Fażi Inversa, Parti I: Żvilupp ta' Protokoll għall-Karatterizzazzjoni tal-Kolonna.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metodi għall-ħolqien ta' peptidi attivi mtejba għat-trattament ta' mard infettiv. Bijoteknoloġija. Kisbiet 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi terapewtiċi sintetiċi: Xjenza u suq. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi terapewtiċi sintetiċi: Xjenza u suq.Vliege P, Lisowski V, Martinez J u Chreschatyski M. Peptidi terapewtiċi sintetiċi: xjenza u suq.Vliege P, Lisowski V, Martinez J u Khreschatsky M. Peptidi terapewtiċi sintetiċi: xjenza u suq. skoperta ta' drogi. Illum 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografija likwida proteomika avvanzata. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografija likwida proteomika avvanzata.Ara F., Smith RD u Shen Yu. Kromatografija likwida proteomika avvanzata. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kompożizzjoni avvanzata tal-proteini 液相色谱。Ara F., Smith RD u Shen Yu. Kromatografija likwida proteomika avvanzata.J. Kromatografija. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografija likwida avvanzata-spettrometrija tal-massa hija kapaċi tgħaqqad metabolomika u proteomika b'bażi ​​wiesgħa. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp farmaċewtiku. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp farmaċewtiku.Chesnut, SM u Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp farmaċewtiku.Chesnut, SM u Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp tal-mediċini. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni ultra-għolja għal separazzjonijiet veloċi. Wu, N. & Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni ultra-għolja għal separazzjonijiet veloċi.Wu, N. u Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni għolja għal separazzjoni rapida. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspetti bażiċi u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni ultra-għolja għal separazzjoni rapida.Wu, N. u Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni għolja għal separazzjoni rapida.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Użu ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja fl-iżvilupp farmaċewtiku. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Użu ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja fl-iżvilupp farmaċewtiku.Ren, SA u Chelischeff, P. L-użu tal-kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra għolja fl-iżvilupp farmaċewtiku. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA u Chelischeff, P. Applikazzjoni ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja fl-iżvilupp ta' drogi.J. Kromatografija. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Idroġel makroporuż monolitiku derivat minn emulsjoni żejt-fl-ilma b'fażi interna għolja għal purifikazzjoni effiċjenti tal-enterovirus 71. Proġett Kimiku. Ġurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. u Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. u Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika.J. Kromatografija. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Xejriet ġodda fis-separazzjonijiet kromatografiċi likwidi b'fażi inversa ta' peptidi u proteini terapewtiċi: Teorija u applikazzjonijiet. & Guillarme, D. Xejriet ġodda fis-separazzjonijiet kromatografiċi likwidi b'fażi inversa ta' peptidi u proteini terapewtiċi: Teorija u applikazzjonijiet. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жомощью жромадкосогтроних с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Xejriet ġodda fis-separazzjoni ta' peptidi u proteini terapewtiċi permezz ta' kromatografija likwida ta' fażi inversa: teorija u applikazzjonijiet. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.u Guillarmé, D. Xejriet ġodda fis-separazzjoni ta' peptidi u proteini terapewtiċi permezz ta' kromatografija likwida f'fażi inversa: teorija u applikazzjonijiet.J. Pharm. Xjenza Bijomedika. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separazzjoni bidimensjonali ta' peptidi bl-użu tas-sistema RP-RP-HPLC b'pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta' separazzjoni. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separazzjoni bidimensjonali ta' peptidi bl-użu tas-sistema RP-RP-HPLC b'pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta' separazzjoni.Gilar M., Olivova P., Dali AE u Gebler JK Separazzjoni bidimensjonali ta' peptidi bl-użu tas-sistema RP-RP-HPLC b'pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta' separazzjoni.Gilar M., Olivova P., Dali AE u Gebler JK Separazzjoni bidimensjonali ta' peptidi bl-użu ta' valuri ta' pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta' separazzjoni bl-użu tas-sistema RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Investigazzjoni tat-trasferiment tal-massa u l-karatteristiċi kinetiċi ta' kolonni ta' kromatografija ta' prestazzjoni għolja ppakkjati b'partiċelli C18 kompletament porużi u superfiċjalment porużi iżgħar minn 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Xejriet riċenti u sfidi analitiċi fl-iżolament, l-identifikazzjoni, u l-validazzjoni ta' peptidi bijoattivi tal-pjanti. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Pajsaġġ proteomiku tar-renju tal-ħajja. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Trattament ta' wara peptidi terapewtiċi permezz ta' kromatografija likwida preparattiva. Molecules (Basel, l-Iżvizzera) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografija f'modalità mħallta u l-applikazzjonijiet tagħha għall-bijopolimeri. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografija f'modalità mħallta u l-applikazzjonijiet tagħha għall-bijopolimeri.Yang, Yu. u Geng, X. Kromatografija b'modalità mħallta u l-applikazzjoni tagħha għall-bijopolimeri. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografija b'modalità mħallta u l-applikazzjoni tagħha fil-bijopolimeri.Yang, Yu. u Gene, X. Kromatografija b'modalità mħallta u l-applikazzjoni tagħha għall-bijopolimeri.J. Kromatografija. A 1218(49), 8813–8825 (2011).