Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Hemm bżonn ta' sistema in vitro affidabbli li tista' tirriproduċi b'mod preċiż l-ambjent fiżjoloġiku tal-qalb għall-ittestjar tad-drogi. Id-disponibbiltà limitata ta' sistemi ta' kultura ta' tessuti tal-qalb umani wasslet għal interpretazzjonijiet mhux preċiżi tal-effetti tad-drogi kardijaċi. Hawnhekk, żviluppajna mudell ta' kultura ta' tessuti kardijaċi (CTCM) li jistimula elettromekkanikament sezzjonijiet tal-qalb u jgħaddi minn tiġbid fiżjoloġiku matul il-fażijiet sistoliċi u dijastoliċi taċ-ċiklu kardijaku. Wara 12-il jum ta' kultura, dan l-approċċ tejjeb parzjalment il-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tal-qalb, iżda ma ppreservax kompletament l-integrità strutturali tagħhom. Għalhekk, wara skrinjar ta' molekuli żgħar, sibna li ż-żieda ta' 100 nM triiodothyronine (T3) u 1 μM dexamethasone (Dex) mal-mezz tagħna żammet il-mikrostruttura tas-sezzjonijiet għal 12-il jum. Flimkien mat-trattament T3/Dex, is-sistema CTCM żammet il-profili traskrizzjonali, il-vijabbiltà, l-attività metabolika, u l-integrità strutturali fl-istess livell bħat-tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum. Barra minn hekk, it-tiġbid eċċessiv tat-tessut kardijaku fil-kultura jikkaġuna sinjalazzjoni kardijaka ipertrofika, u dan jipprovdi evidenza għall-abbiltà tas-CTCM li jimita kundizzjonijiet ipertrofiċi kkaġunati mit-tiġbid kardijaku. Bħala konklużjoni, is-CTCM jista' jimmudella l-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-qalb fil-kultura fuq perjodi twal ta' żmien, u b'hekk jippermetti skrining affidabbli tal-mediċini.
Qabel ir-riċerka klinika, huma meħtieġa sistemi in vitro affidabbli li jistgħu jirriproduċu b'mod preċiż l-ambjent fiżjoloġiku tal-qalb tal-bniedem. Sistemi bħal dawn għandhom jimitaw proprjetajiet mekkaniċi mibdula, rata tal-qalb, u elettrofiżjoloġiċi. Il-mudelli tal-annimali huma komunement użati bħala pjattaforma ta' skrinjar għall-fiżjoloġija kardijaka b'affidabbiltà limitata fir-riflessjoni tal-effetti tad-drogi fil-qalb tal-bniedem1,2. Fl-aħħar mill-aħħar, il-Mudell Sperimentali Ideali tal-Kultura tat-Tessut Kardijaku (CTCM) huwa mudell li huwa sensittiv ħafna u speċifiku għal diversi interventi terapewtiċi u farmakoloġiċi, li jirriproduċi b'mod preċiż il-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-qalb tal-bniedem3. In-nuqqas ta' sistema bħal din jillimita l-iskoperta ta' trattamenti ġodda għall-insuffiċjenza tal-qalb4,5 u wassal għal kardjotossiċità tad-drogi bħala raġuni ewlenija għall-ħruġ mis-suq6.
Matul l-aħħar għaxar snin, tmien mediċini mhux kardjovaskulari ġew irtirati mill-użu kliniku minħabba li jikkawżaw titwil tal-intervall QT li jwassal għal arritmiji ventrikulari u mewt f'daqqa7. Għalhekk, hemm ħtieġa dejjem tikber għal strateġiji ta' skrinjar prekliniku affidabbli biex jiġu vvalutati l-effikaċja u t-tossiċità kardjovaskulari. L-użu reċenti ta' kardjomijoċiti derivati ​​minn ċelluli staminali pluripotenti indotti mill-bniedem (hiPS-CM) fl-iskrinjar tal-mediċini u l-ittestjar tat-tossiċità jipprovdi soluzzjoni parzjali għal din il-problema. Madankollu, in-natura immatura tal-hiPS-CMs u n-nuqqas ta' kumplessità multiċellulari tat-tessut kardijaku huma limitazzjonijiet ewlenin ta' dan il-metodu. Studji reċenti wrew li din il-limitazzjoni tista' tingħeleb parzjalment bl-użu ta' hiPS-CM bikrija biex jiffurmaw idroġels tat-tessut kardijaku ftit wara l-bidu ta' kontrazzjonijiet spontanei u tiżdied gradwalment l-istimulazzjoni elettrika maż-żmien. Madankollu, dawn il-mikrotessuti tal-hiPS-CM m'għandhomx il-proprjetajiet elettrofiżjoloġiċi u kontrattili maturi tal-mijokardju adult. Barra minn hekk, it-tessut kardijaku uman għandu struttura aktar kumplessa, li tikkonsisti minn taħlita eteroġenja ta' tipi differenti ta' ċelluli, inklużi ċelluli endoteljali, newroni, u fibroblasti stromali, interkonnessi minn settijiet speċifiċi ta' proteini tal-matriċi extraċellulari. Din l-eteroġeneità ta' popolazzjonijiet mhux kardjomijoċiti11,12,13 fil-qalb tal-mammiferi adulti hija ostaklu ewlieni għall-immudellar tat-tessut kardijaku bl-użu ta' tipi individwali ta' ċelluli. Dawn il-limitazzjonijiet ewlenin jenfasizzaw l-importanza tal-iżvilupp ta' metodi għall-kultivazzjoni ta' tessut mijokardijaku intatt taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi.
Sezzjonijiet irqaq ikkultivati ​​(300 µm) tal-qalb tal-bniedem urew li huma mudell promettenti ta' mijokardju uman intatt. Dan il-metodu jipprovdi aċċess għal sistema multiċellulari 3D kompluta simili għat-tessut tal-qalb tal-bniedem. Madankollu, sal-2019, l-użu ta' sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​kien limitat mis-sopravivenza qasira tal-kultura (24 siegħa). Dan huwa dovut għal numru ta' fatturi inkluż in-nuqqas ta' tiġbid fiżiku-mekkaniku, l-interfaċċja arja-likwidu, u l-użu ta' mezzi sempliċi li ma jappoġġjawx il-ħtiġijiet tat-tessut kardijaku. Fl-2019, diversi gruppi ta' riċerka wrew li l-inkorporazzjoni ta' fatturi mekkaniċi f'sistemi ta' kultura ta' tessuti kardijaċi tista' testendi l-ħajja tal-kultura, ittejjeb l-espressjoni kardijaka, u timita l-patoloġija kardijaka. Żewġ studji eleganti 17 u 18 juru li t-tagħbija mekkanika unjassjali għandha effett pożittiv fuq il-fenotip kardijaku waqt il-kultura. Madankollu, dawn l-istudji ma użawx it-tagħbija fiżiko-mekkanika dinamika tridimensjonali taċ-ċiklu kardijaku, peress li s-sezzjonijiet tal-qalb kienu mgħobbija jew b'forzi tensili iżometriċi 17 jew b'tagħbija awżotonika lineari 18. Dawn il-metodi ta’ tiġbid tat-tessuti rriżultaw fis-soppressjoni ta’ ħafna ġeni kardijaċi jew fl-espressjoni żejda ta’ ġeni assoċjati ma’ risponsi anormali ta’ tiġbid. Ta’ min jinnota li Pitoulis et al. 19 żviluppaw banju dinamiku ta’ kultura ta’ porzjonijiet tal-qalb għar-rikostruzzjoni taċ-ċiklu kardijaku bl-użu ta’ feedback tat-transducer tal-forza u sewqan tat-tensjoni. Għalkemm din is-sistema tippermetti mmudellar taċ-ċiklu kardijaku in vitro aktar preċiż, il-kumplessità u r-rendiment baxx tal-metodu jillimitaw l-applikazzjoni ta’ din is-sistema. Il-laboratorju tagħna dan l-aħħar żviluppa sistema ta’ kultura simplifikata bl-użu ta’ stimulazzjoni elettrika u mezz ottimizzat biex iżomm il-vijabbiltà ta’ sezzjonijiet ta’ tessut tal-qalb tal-ħnieżer u tal-bniedem sa 6 ijiem 20,21.
Fil-manuskritt attwali, niddeskrivu mudell ta' kultura ta' tessut kardijaku (CTCM) bl-użu ta' sezzjonijiet tal-qalb tal-ħnieżer li jinkorpora indikazzjonijiet umorali biex jirrikapitula l-fiżjoloġija kardijaka tridimensjonali u d-distensjoni patofiżjoloġika matul iċ-ċiklu kardijaku. Dan is-CTCM jista' jżid l-eżattezza tat-tbassir prekliniku tal-mediċini għal livell li qatt ma ntlaħaq qabel billi jipprovdi sistema kardijaka kosteffettiva u ta' produzzjoni medja li timita l-fiżjoloġija/patofiżjoloġija tal-qalb tal-mammiferi għall-ittestjar prekliniku tal-mediċini.
Sinjali mekkaniċi emodinamiċi għandhom rwol kritiku fiż-żamma tal-funzjoni tal-kardjomijoċiti in vitro 22,23,24. Fil-manuskritt attwali, żviluppajna CTCM (Figura 1a) li jista' jimita l-ambjent kardijaku adult billi jinduċi kemm stimulazzjoni elettrika kif ukoll mekkanika fi frekwenzi fiżjoloġiċi (1.2 Hz, 72 taħbita kull minuta). Biex jiġi evitat tiġbid eċċessiv tat-tessut waqt id-dijastole, intuża apparat tal-istampar 3D biex jiżdied id-daqs tat-tessut b'25% (Fig. 1b). Il-pacing elettriku indott mis-sistema C-PACE ġie skedat biex jibda 100 ms qabel is-sistole bl-użu ta' sistema ta' akkwist tad-dejta biex tirriproduċi bis-sħiħ iċ-ċiklu kardijaku. Is-sistema tal-kultura tat-tessuti tuża attwatur pnewmatiku programmabbli (LB Engineering, il-Ġermanja) biex tespandi ċiklikament membrana flessibbli tas-silikon biex tikkawża espansjoni tal-flieli tal-qalb fil-kompartiment ta' fuq. Is-sistema kienet imqabbda ma' linja tal-arja esterna permezz ta' transducer tal-pressjoni, li għamilha possibbli li l-pressjoni (± 1 mmHg) u l-ħin (± 1 ms) jiġu aġġustati b'mod preċiż (Fig. 1c).
a Waħħal is-sezzjoni tat-tessut maċ-ċirku ta' appoġġ ta' 7 mm, muri bil-blu, ġewwa l-kompartiment tal-kultura tal-apparat. Il-kompartiment tal-kultura huwa separat mill-kompartiment tal-arja permezz ta' membrana rqiqa tas-silikon flessibbli. Poġġi gasket bejn kull kompartiment biex tevita t-tnixxijiet. L-għatu tal-apparat fih elettrodi tal-grafita li jipprovdu stimulazzjoni elettrika. b Rappreżentazzjoni skematika tal-apparat kbir tat-tessut, iċ-ċirku gwida u ċ-ċirku ta' appoġġ. Is-sezzjonijiet tat-tessut (kannella) jitqiegħdu fuq l-apparat kbir biċ-ċirku gwida mqiegħed fil-kanal fuq it-tarf ta' barra tal-apparat. Bl-użu tal-gwida, poġġi bir-reqqa ċ-ċirku ta' appoġġ miksi b'kolla akrilika tat-tessut fuq is-sezzjoni tat-tessut kardijaku. c Graff li juri l-ħin tal-istimulazzjoni elettrika bħala funzjoni tal-pressjoni tal-kompartiment tal-arja kkontrollata minn attwatur pnewmatiku programmabbli (PPD). Apparat tal-akkwist tad-dejta ntuża biex jissinkronizza l-istimulazzjoni elettrika bl-użu ta' sensuri tal-pressjoni. Meta l-pressjoni fil-kompartiment tal-kultura tilħaq il-limitu stabbilit, sinjal tal-polz jintbagħat lis-C-PACE-EM biex jattiva l-istimulazzjoni elettrika. d Immaġni ta' erba' CTCMs imqiegħda fuq xkaffa tal-inkubatur. Erba' apparati huma konnessi ma' PPD wieħed permezz ta' ċirkwit pnewmatiku, u sensuri tal-pressjoni huma mdaħħla fil-valv emostatiku biex jimmonitorjaw il-pressjoni fiċ-ċirkwit pnewmatiku. Kull apparat fih sitt sezzjonijiet ta' tessut.
Bl-użu ta' attwatur pnewmatiku wieħed, stajna nikkontrollaw 4 apparati CTCM, li kull wieħed minnhom seta' jżomm 6 sezzjonijiet ta' tessut (Fig. 1d). Fis-CTCM, il-pressjoni tal-arja fil-kamra tal-arja tiġi kkonvertita għal pressjoni sinkronika fil-kamra tal-fluwidu u tinduċi espansjoni fiżjoloġika tal-porzjon tal-qalb (Figura 2a u Film Supplimentari 1). Evalwazzjoni tat-tiġbid tat-tessut f'80 mm Hg. Art. uriet tiġbid tas-sezzjonijiet tat-tessut b'25% (Fig. 2b). Dan il-perċentwal ta' tiġbid intwera li jikkorrispondi għal tul fiżjoloġiku tas-sarkomeru ta' 2.2–2.3 µm għal kontrattilità normali tas-sezzjoni kardijaka17,19,25. Il-moviment tat-tessut ġie vvalutat bl-użu ta' settings tad-dwana tal-kamera (Figura Supplimentari 1). L-amplitudni u l-veloċità tal-moviment tat-tessut (Fig. 2c, d) korrispondew għat-tiġbid matul iċ-ċiklu kardijaku u l-ħin matul is-sistole u d-dijastole (Fig. 2b). It-tiġbid u l-veloċità tat-tessut kardijaku matul il-kontrazzjoni u r-rilassament baqgħu kostanti għal 12-il jum fil-kultura (Fig. 2f). Biex nevalwaw l-effett tal-istimulazzjoni elettrika fuq il-kontrazzjoni waqt il-kultura, żviluppajna metodu biex niddeterminaw id-deformità attiva bl-użu ta' algoritmu ta' dell (Fig. Supplimentari 2a,b) u stajna niddistingwu bejn deformitajiet bi u mingħajr stimulazzjoni elettrika. L-istess sezzjoni tal-qalb (Fig. 2f). Fir-reġjun mobbli tal-qasma (R6-9), il-vultaġġ waqt l-istimulazzjoni elettrika kien 20% ogħla milli fin-nuqqas ta' stimulazzjoni elettrika, li jindika l-kontribut tal-istimulazzjoni elettrika għall-funzjoni kontrazzjoni.
Traċċi rappreżentattivi tal-pressjoni tal-kamra tal-arja, il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u l-kejl tal-moviment tat-tessut jikkonfermaw li l-pressjoni tal-kamra tbiddel il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u tikkawża moviment korrispondenti tal-porzjon tat-tessut. b Traċċi rappreżentattivi tal-perċentwal ta' tiġbid (blu) tas-sezzjonijiet tat-tessut li jikkorrispondu għall-perċentwal ta' tiġbid (oranġjo). c Il-moviment imkejjel tal-porzjon kardijaku huwa konsistenti mal-veloċità mkejla tal-moviment. (d) Trajettorji rappreżentattivi tal-moviment ċikliku (linja blu) u l-veloċità (linja bit-tikek oranġjo) f'porzjon tal-qalb. e Kwantifikazzjoni tal-ħin taċ-ċiklu (n = 19-il porzjon għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), ħin ta' kontrazzjoni (n = 19-il porzjon għal kull grupp), ħin ta' rilassament (n = 19-il porzjon għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), moviment tat-tessut (n = 25 ). porzjonijiet)/grupp minn ħnieżer differenti), veloċità sistolika massima (n = 24(D0), 25(D12) porzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti) u rata ta' rilassament massima (n=24(D0), 25(D12) porzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti). It-test-t ta' Student b'żewġ dnub ma wera l-ebda differenza sinifikanti f'xi parametru. Traċċi rappreżentattivi tal-analiżi tat-tensjoni ta' sezzjonijiet tat-tessut bi stimulazzjoni elettrika (ħamra) u mingħajrha (blu), għaxar żoni reġjonali ta' sezzjonijiet tat-tessut mill-istess sezzjoni. Il-pannelli tal-qiegħ juru l-kwantifikazzjoni tad-differenza perċentwali fit-tensjoni f'sezzjonijiet tat-tessut bi u mingħajrha stimulazzjoni elettrika f'għaxar żoni minn sezzjonijiet differenti. (n = 8 flieli/grupp minn ħnieżer differenti, isir it-test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 flieli/grupp minn ħnieżer differenti, isir it-test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов / гру iktar р разных свиней, проводитrun двустороронorja l-t-к к к к к к к к к к к к к к к к к 0.051, ** p <0,01, * p <0.05). (n = 8 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01,0,5). (n = 8 sezzjonijiet/grupp, minn ħnieżer differenti, test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Fis-sistema preċedenti tagħna ta' kultura ta' flieli tal-qalb bijomimetiċi statiċi [20, 21], żammejna l-vijabbiltà, il-funzjoni, u l-integrità strutturali tal-flieli tal-qalb għal 6 ijiem billi applikajna stimulazzjoni elettrika u ottimizzajna l-kompożizzjoni tal-mezz. Madankollu, wara 10 ijiem, dawn iċ-ċifri naqsu drastikament. Se nirreferu għas-sezzjonijiet ikkultivati ​​fis-sistema preċedenti tagħna ta' kultura bijomimetika statika 20, 21 kundizzjonijiet ta' kontroll (Ctrl) u se nużaw il-mezz ottimizzat qabel tagħna bħala kundizzjonijiet MC u kultura taħt stimulazzjoni mekkanika u elettrika simultanja (CTCM). imsejħa . L-ewwel, iddeterminajna li l-istimulazzjoni mekkanika mingħajr stimulazzjoni elettrika ma kinitx biżżejjed biex iżżomm il-vijabbiltà tat-tessut għal 6 ijiem (Fig. Supplimentari 3a,b). Interessanti, bl-introduzzjoni ta' stimulazzjoni fiżjo-mekkanika u elettrika bl-użu ta' STCM, il-vijabbiltà ta' sezzjonijiet tal-qalb ta' 12-il jum baqgħet l-istess bħal f'sezzjonijiet tal-qalb friski taħt kundizzjonijiet MS, iżda mhux taħt kundizzjonijiet Ctrl, kif muri mill-analiżi MTT (Fig. 1). 3a). Dan jissuġġerixxi li l-istimulazzjoni mekkanika u s-simulazzjoni taċ-ċiklu kardijaku jistgħu jżommu s-sezzjonijiet tat-tessut vijabbli għal darbtejn aktar milli rrappurtat fis-sistema preċedenti tagħna ta' kultura statika. Madankollu, il-valutazzjoni tal-integrità strutturali tas-sezzjonijiet tat-tessut permezz tal-immunotikkettar tat-troponina T kardijaka u l-konnexina 43 uriet li l-espressjoni tal-konnexina 43 kienet sinifikament ogħla fit-tessuti MC fil-jum 12 milli fil-kontrolli fl-istess jum. Madankollu, l-espressjoni uniformi tal-konnexina 43 u l-formazzjoni tad-diska Z ma nżammewx kompletament (Fig. 3b). Aħna nużaw qafas ta' intelliġenza artifiċjali (AI) biex nikkwantifikaw l-integrità strutturali tat-tessut26, pipeline ta' tagħlim profond ibbażat fuq l-immaġni bbażat fuq it-tbajja' tat-troponina-T u l-konnexina43 biex nikkwantifikaw awtomatikament l-integrità strutturali u l-fluworexxenza tal-flieli tal-qalb f'termini ta' saħħa tal-lokalizzazzjoni. Dan il-metodu juża Netwerk Newrali Konvoluzzjonali (CNN) u qafas ta' tagħlim profond biex jikkwantifika b'mod affidabbli l-integrità strutturali tat-tessut kardijaku b'mod awtomatizzat u imparzjali, kif deskritt fir-referenza. 26. It-tessut MC wera similarità strutturali mtejba għall-jum 0 meta mqabbel mas-sezzjonijiet ta' kontroll statiku. Barra minn hekk, it-tbajja' tat-trikromu ta' Masson żvelat perċentwal sinifikament aktar baxx ta' fibrożi taħt kundizzjonijiet MS meta mqabbla mal-kundizzjonijiet ta' kontroll fil-jum 12 tal-kultura (Fig. 3c). Filwaqt li s-CTCM żied il-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tat-tessut tal-qalb fil-jum 12 għal livell simili għal dak tat-tessut tal-qalb frisk, ma tejjibx b'mod sinifikanti l-integrità strutturali tas-sezzjonijiet tal-qalb.
Graff bil-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tal-MTT ta' flieli friski tal-qalb (D0) jew kultura ta' flieli tal-qalb għal 12-il jum jew f'kultura statika (D12 Ctrl) jew f'CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA b'mod wieħed; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). Graff bil-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tal-MTT ta' flieli friski tal-qalb (D0) jew kultura ta' flieli tal-qalb għal 12-il jum jew f'kultura statika (D12 Ctrl) jew f'CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA b'mod wieħed; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).L-istogramma turi l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tas-sezzjonijiet friski tal-qalb MTT (D0) jew kultura tas-sezzjonijiet tal-qalb għal 12-il jum jew f'kultura statika (kontroll D12) jew CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12). ) ), 12 (D12 MC) sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D12 MC)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组衑切片/组葌啛啛迏化)测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D12 MC) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <，CtrlD12相比，**p。)istogramma li turi l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tal-MTT f'sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) jew sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​għal 12-il jum f'kultura statika (kontroll D12) jew CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12)), 12 (D12 MC) sezzjoni/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA b'direzzjoni waħda;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0, **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).b Troponin-T (aħdar), connexin 43 (aħmar) u DAPI (blu) f'sezzjonijiet tal-qalb iżolati friski (D0) jew sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi (Ctrl) jew kundizzjonijiet CTCM (MC) għal 12-il jum) ta' immaġini rappreżentattivi ta' immunofluorexxenza (skala vojta = 100 µm). Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb permezz ta' intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) flieli/grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb permezz ta' intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) flieli/grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D12), C577 (D12), C577 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сра всне сра в сне сра; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut kardijaku permezz ta' intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezzjonijiet/gruppi minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda mwettaq; ####p < 0.0001 vs. ma' D0 u ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) flieli/grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, one-way test ANOVA <1 人 0##0p0 ;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) flieli/grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda <0###0p0;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткант (D10), =77нl (D12), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Intelliġenza artifiċjali biex tikkwantifika l-integrità strutturali tat-tessut kardijaku (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezzjonijiet/grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, test ANOVA one-way; ####p<0.0001 vs .D0 Għal paragun ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c Immaġnijiet rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) għal flieli tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trikromu ta' Masson (Skala vojta = 500 µm) (n = 10 flieli/grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c Immaġnijiet rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) għal flieli tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trikromu ta' Masson (Skala vojta = 500 µm) (n = 10 flieli/grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, онкраше трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разныней,свиным красителем Массона выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Immaġnijiet rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trikromu ta' Masson (skala mhux miksija = 500 µm) (n = 10 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda mwettaq; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺） （裸尺）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 与D0 相比 ，D1*** ，D1 ， ，1相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 向 吋### 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, онкраш трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой,вигой друппа протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ċ Immaġnijiet rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trikromu ta' Masson (vojt = 500 µm) (n = 10 sezzjonijiet/grupp, kull waħda minn ħanżir differenti, ittestjati b'analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda;### # p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0, ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Aħna ipoteżizzajna li billi nżidu molekuli żgħar mal-mezz tal-kultura, l-integrità tal-kardjomijoċiti tista' titjieb u l-iżvilupp tal-fibrożi jitnaqqas waqt il-kultura CTCM. Għalhekk skrinjajna għal molekuli żgħar bl-użu tal-kulturi ta' kontroll statiku tagħna20,21 minħabba n-numru żgħir ta' fatturi konfużi. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), u SB431542 (SB) intgħażlu għal dan l-iskrinjar. Dawn il-molekuli żgħar intużaw qabel f'kulturi hiPSC-CM biex jinduċu l-maturazzjoni tal-kardjomijoċiti billi jżidu t-tul tas-sarkomere, it-tubuli T, u l-veloċità tal-konduzzjoni. Barra minn hekk, kemm Dex (glukokortikojde) kif ukoll SB huma magħrufa li jrażżnu l-infjammazzjoni29,30. Għalhekk, ittestjajna jekk l-inklużjoni ta' waħda jew kombinazzjoni ta' dawn il-molekuli żgħar ittejjebx l-integrità strutturali tas-sezzjonijiet tal-qalb. Għall-iskrinjar inizjali, id-doża ta' kull kompost intgħażlet abbażi tal-konċentrazzjonijiet komunement użati fil-mudelli tal-kultura taċ-ċelluli (1 μM Dex27, 100 nM T327, u 2.5 μM SB31). Wara 12-il jum ta' kultura, il-kombinazzjoni ta' T3 u Dex irriżultat f'integrità strutturali ottimali tal-kardjomijoċiti u rimodelljar fibruż minimu (Figuri Supplimentari 4 u 5). Barra minn hekk, l-użu ta' doppji jew doppji ta' dawn il-konċentrazzjonijiet ta' T3 u Dex ipproduċa effetti detrimentali meta mqabbla ma' konċentrazzjonijiet normali (Fig. Supplimentari 6a,b).
Wara l-iskrinjar inizjali, wettaqna paragun dirett ta' 4 kundizzjonijiet ta' kultura (Figura 4a): Ctrl: sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​fil-kultura statika deskritta qabel bl-użu tal-mezz ottimizzat tagħna; 20.21 TD: T3 u Ctrl s Miżjuda Dex nhar l-Erbgħa; MC: sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​f'CTCM bl-użu tal-mezz ottimizzat qabel; u MT: CTCM b'T3 u Dex miżjuda mal-mezz. Wara 12-il jum ta' kultivazzjoni, il-vijabbiltà tat-tessuti MS u MT baqgħet l-istess bħal fit-tessuti friski vvalutati bl-assaġġ MTT (Fig. 4b). Interessanti, iż-żieda ta' T3 u Dex mal-kulturi transwell (TD) ma rriżultatx f'titjib sinifikanti fil-vijabbiltà meta mqabbla mal-kundizzjonijiet Ctrl, li jindika rwol importanti tal-istimulazzjoni mekkanika fiż-żamma tal-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tal-qalb.
Dijagramma ta' disinn sperimentali li turi l-erba' kundizzjonijiet ta' kultura użati biex jiġu evalwati l-effetti tal-istimulazzjoni mekkanika u s-supplimentazzjoni ta' T3/Dex fuq il-mezz għal 12-il jum. b Il-graff tal-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma' flieli friski tal-qalb (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), 12 (D12 MC) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 meta mqabbel ma' D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Il-graff bil-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma' flieli friski tal-qalb (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), 12 (D12 MC) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 meta mqabbel ma' D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послево кулрьта кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами серодц1 (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Il-graff tal-bar juri l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (kontroll, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MT), 12 (D12 MC) sezzjoni/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA one-way; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、D12、D12、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##01p < 0.0.0#01，相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнению сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#той <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogramma li turi l-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (kontroll, TD, MC u MT) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), minn ħnieżer differenti 12 (D12 MC) sezzjoni/grupp, test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kontroll D12). c Il-graff bil-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbel ma' flieli friski tal-qalb (D0) (n = 6 flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ###p < 0.001, meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c Il-graff bil-vireg juri l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbel ma' flieli friski tal-qalb (D0) (n = 6 flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ###p < 0.001, meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвта кульвта 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0воп/срению) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L-istogramma turi l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura taħt l-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (kontroll, TD, MC u MT) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 6 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda mwettaq; ###p < 0.001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯厹％）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.0不相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片片扇培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послет вило потока глюкозы через всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). ċ Istogramma li turi l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura għall-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (kontroll, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 6 sezzjonijiet/grupp, minn ħnieżer differenti, testijiet ANOVA unilaterali fejn twettqu, ###p < 0.001 meta mqabbel ma' D0, ***p < 0.001 meta mqabbel ma' D12 (kontroll).d Plotts tal-analiżi tar-razza ta' tessuti friski (blu), jum 12 MC (aħdar), u jum 12 MT (aħmar) f'għaxar punti ta' sezzjoni tat-tessut reġjonali (n = 4 flieli/grupp, test ANOVA one-way; ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn il-gruppi). e Plott tal-vulkan li juri ġeni espressi b'mod differenzjali f'sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi (Ctrl) jew taħt kundizzjonijiet MT (MT) għal 10-12-il jum. f Mappa tas-sħana tal-ġeni tas-sarkomeri għal sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​taħt kull waħda mill-kundizzjonijiet tal-kultura. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Id-dipendenza metabolika fuq il-bidla mill-ossidazzjoni tal-aċidi grassi għall-glikoliżi hija karatteristika ewlenija tad-dedifferenzjazzjoni tal-kardjomijoċiti. Il-kardjomijoċiti immaturi primarjament jużaw il-glukożju għall-produzzjoni tal-ATP u għandhom mitokondrija ipoplastika bi ftit kristae5,32. Analiżi tal-użu tal-glukożju wrew li taħt kundizzjonijiet MC u MT, l-użu tal-glukożju kien simili għal dak fit-tessuti tal-jum 0 (Figura 4c). Madankollu, il-kampjuni Ctrl urew żieda sinifikanti fl-użu tal-glukożju meta mqabbel mat-tessut frisk. Dan jindika li l-kombinazzjoni ta' CTCM u T3/Dex ittejjeb il-vijabbiltà tat-tessuti u tippreserva l-fenotip metaboliku ta' sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​ta' 12-il jum. Barra minn hekk, l-analiżi tar-razza wriet li l-livelli tar-razza baqgħu l-istess bħal fit-tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum taħt kundizzjonijiet MT u MS (Fig. 4d).
Biex nanalizzaw l-impatt ġenerali ta' CTCM u T3/Dex fuq il-pajsaġġ traskrizzjonali globali tat-tessut tal-porzjon kardijaku, wettaqna RNAseq fuq porzjonijiet kardijaċi mill-erba' kundizzjonijiet ta' kultura differenti kollha (Data Supplimentari 1). Interessanti, is-sezzjonijiet MT urew similarità traskrizzjonali għolja mat-tessut tal-qalb frisk, b'16 biss espressi b'mod differenzjali minn 13,642 ġene. Madankollu, kif wrejna qabel, il-porzjonijiet Ctrl urew 1229 ġene espressi b'mod differenzjali wara 10–12-il jum fil-kultura (Fig. 4e). Din id-dejta ġiet ikkonfermata minn qRT-PCR tal-ġeni tal-qalb u tal-fibroblasti (Fig. Supplimentari 7a-c). Interessanti, is-sezzjonijiet Ctrl urew tnaqqis fil-ġeni kardijaċi u taċ-ċiklu taċ-ċelluli u attivazzjoni ta' programmi ta' ġeni infjammatorji. Din id-dejta tissuġġerixxi li d-dedifferenzjazzjoni, li normalment isseħħ wara kultura fit-tul, hija kompletament attenwata taħt kundizzjonijiet MT (Fig. Supplimentari 8a,b). Studju bir-reqqa tal-ġeni tas-sarkomeri wera li taħt kundizzjonijiet MT biss jiġu ppreservati l-ġeni li jikkodifikaw is-sarkomeru (Fig. 4f) u l-kanal tal-joni (Fig. Supplimentari 9), u jipproteġuhom mis-soppressjoni taħt kundizzjonijiet Ctrl, TD, u MC. Din id-dejta turi li b'kombinazzjoni ta' stimulazzjoni mekkanika u umorali (T3/Dex), it-traskrittoma tal-porzjon tal-qalb tista' tibqa' simili għal porzjonijiet friski tal-qalb wara 12-il jum fil-kultura.
Dawn is-sejbiet traskrizzjonali huma appoġġjati mill-fatt li l-integrità strutturali tal-kardjomijoċiti fis-sezzjonijiet tal-qalb hija ppreservata l-aħjar taħt kundizzjonijiet MT għal 12-il jum, kif muri mill-konnexin 43 intatt u lokalizzat (Fig. 5a). Barra minn hekk, il-fibrożi fis-sezzjonijiet tal-qalb taħt kundizzjonijiet MT tnaqqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' Ctrl u simili għas-sezzjonijiet tal-qalb friski (Fig. 5b). Din id-dejta turi li l-kombinazzjoni ta' stimulazzjoni mekkanika u trattament T3/Dex tippreserva b'mod effettiv l-istruttura kardijaka fis-sezzjonijiet tal-qalb fil-kultura.
Immaġnijiet rappreżentattivi ta' immunofluworexxenza ta' troponin-T (aħdar), connexin 43 (aħmar), u DAPI (blu) f'sezzjonijiet tal-qalb iżolati friski (D0) jew ikkultivati ​​għal 12-il jum fl-erba' kundizzjonijiet kollha ta' kultura tas-sezzjoni tal-qalb (skala bar = 100 µm). Kwantifikazzjoni bl-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u *p < 0.05, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni bl-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u *p < 0.05, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инта00 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA <1 #п.#0; сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb bl-użu tal-intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA one-way imwettaq; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u *p < 0.05 jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p ，比5 缉 <（0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 （mc （mc ）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 和*p ，或**** p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut kardijaku bl-użu tal-intelliġenza artifiċjali fi ħnieżer differenti (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) sezzjonijiet/grupp) b'test ANOVA f'direzzjoni waħda;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u *p < 0.05 jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Immaġnijiet rappreżentattivi u kwantifikazzjoni għal flieli tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trichrome ta' Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MC), 9 (D12 MT) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Immaġnijiet rappreżentattivi u kwantifikazzjoni għal flieli tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trichrome ta' Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MC), 9 (D12 MT) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, jitwettaq test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0 u ***p < 0.001, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных траственная Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу срезов/групай зони хпай выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immaġnijiet rappreżentattivi u kwantifikazzjoni ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin biż-żebgħa tat-trichrome ta' Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD u D12 MC), 9 (D12 MT) sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, imwettqa ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p < 0.0001 vs. D0 u ***p < 0.001 jew ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同猪的9 个（D12 MT)与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µmd d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < ， 0.00 旎< 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных тросомных тросо (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных сразных свинедпы / свинедпы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Immaġnijiet rappreżentattivi u kwantifikazzjoni ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bit-trikromu ta' Masson (skala tal-iskala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD u D12 MC), 9 (D12 MT) sezzjonijiet minn ħnieżer/grupp differenti, metodu ANOVA wieħed; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0, ***p < 0.001 jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Fl-aħħar nett, il-kapaċità tas-CTCM li timita l-ipertrofija kardijaka ġiet ivvalutata billi żdiedet it-tiġbid tat-tessut kardijaku. Fis-CTCM, il-pressjoni massima tal-kamra tal-arja żdiedet minn 80 mmHg għal 80 mmHg. Art. (tiġbid normali) sa 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Dan jikkorrispondi għal żieda ta' 32% fit-tiġbid (Fig. 6b), li qabel intwera bħala l-perċentwal korrispondenti tat-tiġbid meħtieġ biex is-sezzjonijiet tal-qalb jiksbu tul tas-sarkomeru simili għal dak li jidher fl-ipertrofija. It-tiġbid u l-veloċità tat-tessut kardijaku waqt il-kontrazzjoni u r-rilassament baqgħu kostanti matul sitt ijiem ta' kultura (Fig. 6c). It-tessut kardijaku minn kundizzjonijiet MT kien soġġett għal tiġbid normali (MT (Normali)) jew kundizzjonijiet ta' tiġbid żejjed (MT (OS)) għal sitt ijiem. Diġà wara erbat ijiem fil-kultura, il-bijomarkatur ipertrofiku NT-ProBNP kien elevat b'mod sinifikanti fil-mezz taħt kundizzjonijiet MT (OS) meta mqabbel mal-kundizzjonijiet MT (normali) (Fig. 7a). Barra minn hekk, wara sitt ijiem ta' kultivazzjoni, id-daqs taċ-ċellula fl-MT (OS) (Fig. 7b) żdied b'mod sinifikanti meta mqabbel mas-sezzjonijiet tal-qalb MT (normali). Barra minn hekk, it-traslokazzjoni nukleari tal-NFATC4 żdiedet b'mod sinifikanti fit-tessuti mġebbda żżejjed (Fig. 7c). Dawn ir-riżultati juru l-iżvilupp progressiv tar-rimudellar patoloġiku wara iperdistensjoni u jappoġġjaw il-kunċett li l-apparat CTCM jista' jintuża bħala pjattaforma biex jiġi studjat is-sinjalar tal-ipertrofija kardijaka indotta mill-ġbid.
Traċċi rappreżentattivi tal-pressjoni tal-kamra tal-arja, il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u l-kejl tal-moviment tat-tessut jikkonfermaw li l-pressjoni tal-kamra tbiddel il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u tikkawża moviment korrispondenti tal-porzjon tat-tessut. b Kurvi rappreżentattivi tal-perċentwal ta' tiġbid u r-rata ta' tiġbid għal sezzjonijiet ta' tessut normalment imġebbda (oranġjo) u mġebbda żżejjed (blu). c Graff bil-vireg li juri l-ħin taċ-ċiklu (n = 19-il porzjon għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), il-ħin tal-kontrazzjoni (n = 18-19-il porzjon għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), il-ħin ta' rilassament (n = 19-il porzjon għal kull grupp, minn ħnieżer differenti)), l-amplitudni tal-moviment tat-tessut (n = 14-il porzjon/grupp, minn ħnieżer differenti), il-veloċità sistolika massima (n = 14-il porzjon/grupp, minn ħnieżer differenti) u r-rata ta' rilassament massima (n = 14 (D0), 15 (D6)) sezzjonijiet/gruppi) minn ħnieżer differenti), it-test t ta' Student b'żewġ dnub ma wera l-ebda differenza sinifikanti f'xi parametru, li jindika li dawn il-parametri baqgħu kostanti matul 6 ijiem ta' kultura b'vultaġġ żejjed. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Kwantifikazzjoni bil-grafika tal-bar tal-konċentrazzjoni ta' NT-ProBNP f'mezzi ta' kultura minn flieli tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' tiġbid normali MT (Norm) jew tiġbid żejjed (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4 MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, Titwettaq ANOVA b'żewġ direzzjonijiet; **p < 0.01 meta mqabbel mat-tiġbid normali). Kwantifikazzjoni bil-grafika tal-konċentrazzjoni ta' NT-ProBNP f'mezzi ta' kultura minn flieli tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' tiġbid normali MT (Norm) jew tiġbid żejjed (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4 MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, Titwettaq ANOVA b'żewġ direzzjonijiet; **p < 0.01 meta mqabbel ma' tiġbid normali).Istogramma kwantitattiva tal-konċentrazzjoni ta' NT-ProBNP f'mezz ta' kultura minn flieli tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' tiġbid normali ta' MT (norm) jew tiġbid żejjed (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4).MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, titwettaq analiżi tal-varjanza b'żewġ fatturi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 meta mqabbel ma' tiġbid normali). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01） a Kwantifikazzjoni tal-konċentrazzjoni ta' NT-ProBNP fi slices tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet MT ta' stretch normali (Norm) jew overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) minn differenti猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** meta mqabbel ma 'tiġbid normali, p < 0.01).Kwantifikazzjoni tal-istogramma tal-konċentrazzjonijiet ta' NT-ProBNP fi flieli tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' tiġbid normali tal-MT (norm) jew tiġbid żejjed (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) u D4 MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, analiżi tal-varjanza f'żewġ direzzjonijiet;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 meta mqabbel ma' tiġbid normali). b Immaġnijiet rappreżentattivi għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-troponin-T u WGA (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċellula/grupp minn 10 flieli differenti minn ħnieżer differenti, Twettaq test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p < 0.0001 meta mqabbel mat-tiġbid normali). b Immaġnijiet rappreżentattivi għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-troponin-T u WGA (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċellula/grupp minn 10 flieli differenti minn ħnieżer differenti, Twettaq test-t ta' Student b'żewġ dnub; ****p < 0.0001 meta mqabbel mat-tiġbid normali). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнсова определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезох срезой, 369 (D6 MTNorm) два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Immaġnijiet rappreżentattivi ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bit-troponin-T u l-AZP (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċellula/grupp minn 10 sezzjonijiet differenti minn ħnieżer differenti, twettaq it-test t ta' Student b'żewġ dnub; ****p < 0.0001 meta mqabbel mar-razza normali). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表倧左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表倧30（倏（（） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）. b Stampi rappreżentattivi ta' flieli tal-qalb imtebbgħin b'calcarein-T u WGA (xellug) u d-daqs taċ-ċellula (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 minn 10 flieli differenti (D6 MTNorm)) Ċelluli/ċelluli, test t ta' referenza; meta mqabbel ma' tiġbid normali, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (сленсова) ичнсова оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; tneħħija). b Immaġnijiet rappreżentattivi ta' sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bit-troponin-T u l-AZP (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċellula (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) minn 10 sezzjonijiet differenti minn ħnieżer differenti) Ċelluli/grupp, kriterju b'żewġ dnub t ta' Student; ****p < 0.0001 meta mqabbel mar-razza normali). c Immaġnijiet rappreżentattivi għall-jum 0 u l-jum 6 ta' porzjonijiet tal-qalb MTOS immunotikkettati għal troponin-T u NFATC4 u kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni ta' NFATC4 għan-nuklei tas-CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) porzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, Twettaq test-t ta' Student b'żewġ dnub; *p < 0.05). c Immaġnijiet rappreżentattivi għall-jum 0 u l-jum 6 ta' porzjonijiet tal-qalb MTOS immunotikkettati għal troponin-T u NFATC4 u kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni ta' NFATC4 għan-nuklei tas-CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) porzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, Twettaq test-t ta' Student b'żewġ dnub; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тро-пон, и на-ТТи количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезурапу/знтрухпузнок свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Immaġnijiet rappreżentattivi għal sezzjonijiet tal-qalb f'0 u 6 ijiem MTOS, immunotikkettati għal troponin-T u NFATC4, u kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni ta' NFATC4 fin-nukleu ta' ċelloli kavernużi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti) wettqu t-test ta' Student b'żewġ dnub; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（D06 = M4 (D0) 、（D06切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Immaġini rappreżentattivi ta 'kalcanin-T u NFATC4 immunotikkettjar 第0天和第6天MTOS flieli tal-qalb, u NFATC4 minn NFATC4 易位至CM nukleu taċ-ċelluli 的kwantità 化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тром-поТи тром поТ 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/груста пыней t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Immaġnijiet rappreżentattivi ta' flieli tal-qalb MTOS fil-jum 0 u 6 għall-immunotikkettar tat-troponin-T u NFATC4 u l-kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni tal-NFATC4 fin-nukleu ta' CM minn ħnieżer differenti (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) flieli/grupp, kriterju t b'żewġ dnub ta' Student; *p < 0.05).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Ir-riċerka kardjovaskulari translazzjonali teħtieġ mudelli ċellulari li jirriproduċu b'mod preċiż l-ambjent kardijaku. F'dan l-istudju, ġie żviluppat u kkaratterizzat apparat CTCM li jista' jistimula sezzjonijiet ultrarqaq tal-qalb. Is-sistema CTCM tinkludi stimulazzjoni elettromekkanika sinkronizzata fiżjoloġikament u arrikkiment ta' fluwidi T3 u Dex. Meta sezzjonijiet tal-qalb tal-ħnieżer ġew esposti għal dawn il-fatturi, il-vijabbiltà, l-integrità strutturali, l-attività metabolika, u l-espressjoni traskrizzjonali tagħhom baqgħu l-istess bħal fit-tessut tal-qalb frisk wara 12-il jum ta' kultura. Barra minn hekk, it-tiġbid eċċessiv tat-tessut kardijaku jista' jikkawża ipertrofija tal-qalb ikkawżata minn iperestensjoni. B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jappoġġjaw ir-rwol kritiku tal-kundizzjonijiet fiżjoloġiċi tal-kultura fiż-żamma ta' fenotip kardijaku normali u jipprovdu pjattaforma għall-iskrinjar tad-drogi.
Ħafna fatturi jikkontribwixxu għall-ħolqien ta' ambjent ottimali għall-funzjonament u s-sopravivenza tal-kardjomijoċiti. L-aktar fatturi ovvji minn dawn huma relatati ma' (1) interazzjonijiet interċellulari, (2) stimulazzjoni elettromekkanika, (3) fatturi umorali, u (4) sottostrati metaboliċi. Interazzjonijiet fiżjoloġiċi bejn iċ-ċelloli jeħtieġu netwerks tridimensjonali kumplessi ta' tipi multipli ta' ċelloli appoġġjati minn matriċi extraċellulari. Interazzjonijiet ċellulari kumplessi bħal dawn huma diffiċli biex jiġu rikostruwiti in vitro permezz ta' ko-kultura ta' tipi individwali ta' ċelloli, iżda jistgħu jinkisbu faċilment bl-użu tan-natura organotipika tas-sezzjonijiet tal-qalb.
L-istimulazzjoni mekkanika u l-istimulazzjoni elettrika tal-kardjomijoċiti huma kritiċi biex jinżamm il-fenotip kardijaku33,34,35. Filwaqt li l-istimulazzjoni mekkanika ntużat ħafna għall-kondizzjonament u l-maturazzjoni tal-hiPSC-CM, diversi studji eleganti reċentement ippruvaw stimulazzjoni mekkanika ta' flieli tal-qalb f'kultura bl-użu ta' tagħbija unjassjali. Dawn l-istudji juru li t-tagħbija mekkanika unjassjali 2D għandha effett pożittiv fuq il-fenotip tal-qalb waqt il-kultura. F'dawn l-istudji, sezzjonijiet tal-qalb jew ġew mgħobbija b'forzi tensili iżometriċi17, tagħbija awżotonika lineari18, jew iċ-ċiklu kardijaku ġie rikreat bl-użu ta' feedback tat-transducer tal-forza u sewqan tat-tensjoni. Madankollu, dawn il-metodi jużaw stimulazzjoni tat-tessut unjassjali mingħajr ottimizzazzjoni ambjentali, li tirriżulta fis-soppressjoni ta' ħafna ġeni kardijaċi jew espressjoni żejda ta' ġeni assoċjati ma' risponsi anormali ta' stimulazzjoni. Is-CTCM deskritt hawn jipprovdi stimulu elettromekkaniku 3D li jimita ċ-ċiklu kardijaku naturali f'termini ta' ħin taċ-ċiklu u stimulazzjoni fiżjoloġika (25% stimulazzjoni, 40% sistole, 60% dijastole, u 72 taħbita kull minuta). Għalkemm din l-istimulazzjoni mekkanika tridimensjonali waħedha mhijiex biżżejjed biex tinżamm l-integrità tat-tessut, hija meħtieġa taħlita ta' stimulazzjoni umorali u mekkanika bl-użu ta' T3/Dex biex tinżamm b'mod adegwat il-vijabbiltà, il-funzjoni u l-integrità tat-tessut.
Fatturi umorali għandhom rwol importanti fil-modulazzjoni tal-fenotip tal-qalb adulta. Dan ġie enfasizzat fi studji HiPS-CM fejn T3 u Dex ġew miżjuda mal-mezzi tal-kultura biex iħaffu l-maturazzjoni taċ-ċelluli. T3 jista' jinfluwenza t-trasport ta' aċidi amminiċi, zokkor u kalċju minn ġo membrani taċ-ċelluli36. Barra minn hekk, T3 jippromwovi l-espressjoni ta' MHC-α u t-tnaqqis fir-regolazzjoni ta' MHC-β, u jippromwovi l-formazzjoni ta' mijofibrilli ta' kontrazzjoni mgħaġġla f'kardjomijoċiti maturi meta mqabbla ma' mijofibrilli ta' kontrazzjoni bil-mod f'CM tal-fetu. Nuqqas ta' T3 f'pazjenti b'ipotirojde jirriżulta fit-telf ta' faxex mijofibrillari u rata mnaqqsa ta' żvilupp tat-ton37. Dex jaġixxi fuq riċetturi glukokortikojdi u ntwera li jżid il-kontrazzjoni mijokardijaka f'qlub perfużi iżolati;38 dan it-titjib huwa maħsub li huwa relatat mal-effett fuq id-dħul immexxi mid-depożitu tal-kalċju (SOCE)39,40. Barra minn hekk, Dex jingħaqad mar-riċetturi tiegħu, u jikkawża rispons intraċellulari wiesa' li jrażżan il-funzjoni immuni u l-infjammazzjoni30.
Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-istimulazzjoni mekkanika fiżika (MS) tejbet il-prestazzjoni ġenerali tal-kultura meta mqabbla ma' Ctrl, iżda ma rnexxilhiex iżżomm il-vijabbiltà, l-integrità strutturali, u l-espressjoni kardijaka fuq 12-il jum fil-kultura. Meta mqabbla ma' Ctrl, iż-żieda ta' T3 u Dex mal-kulturi CTCM (MT) tejbet il-vijabbiltà u żammet profili ta' traskrizzjoni simili, integrità strutturali, u attività metabolika b'tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum. Barra minn hekk, billi kkontrollaw il-grad ta' tiġbid tat-tessut, inħoloq mudell ta' ipertrofija kardijaka indotta minn iperestensjoni bl-użu ta' STCM, li juri l-versatilità tas-sistema STCM. Għandu jiġi nnutat li għalkemm ir-rimudellar kardijaku u l-fibrożi ġeneralment jinvolvu organi intatti li ċ-ċelloli li jiċċirkolaw tagħhom jistgħu jipprovdu ċ-ċitokini xierqa kif ukoll fagoċitożi u fatturi oħra ta' rimudellar, sezzjonijiet tal-qalb xorta jistgħu jimitaw il-proċess fibrotiku b'reazzjoni għall-istress u t-trawma f'mijofibroblasti. Dan ġie evalwat qabel f'dan il-mudell ta' porzjon kardijaku. Għandu jiġi nnutat li l-parametri CTCM jistgħu jiġu modulati billi tinbidel il-pressjoni/amplitudni elettrika u l-frekwenza biex jiġu simulati ħafna kundizzjonijiet bħal takikardija, bradikardija, u appoġġ ċirkolatorju mekkaniku (qalb mekkanika mingħajr tagħbija). Dan jagħmel is-sistema b'rendiment medju għall-ittestjar tad-drogi. Il-kapaċità tas-CTCM li timmudella l-ipertrofija kardijaka indotta minn sforz żejjed twitti t-triq għall-ittestjar ta' din is-sistema għal terapija personalizzata. Bħala konklużjoni, l-istudju preżenti juri li l-istimulazzjoni mekkanika u l-istimulazzjoni umorali huma kritiċi għaż-żamma tal-kultura ta' sezzjonijiet tat-tessut kardijaku.
Għalkemm id-dejta ppreżentata hawnhekk tissuġġerixxi li s-CTCM hija pjattaforma promettenti ħafna għall-immudellar ta' mijokardju intatt, dan il-metodu ta' kultura għandu xi limitazzjonijiet. Il-limitazzjoni ewlenija tal-kultura CTCM hija li timponi stress mekkaniku dinamiku kontinwu fuq il-flieli, li jipprekludi l-abbiltà li jiġu mmonitorjati b'mod attiv il-kontrazzjonijiet tal-flieli kardijaċi matul kull ċiklu. Barra minn hekk, minħabba d-daqs żgħir tas-sezzjonijiet kardijaċi (7 mm), il-abbiltà li tiġi evalwata l-funzjoni sistolika barra mis-sistemi ta' kultura bl-użu ta' sensuri tal-forza tradizzjonali hija limitata. Fil-manuskritt attwali, negħlbu parzjalment din il-limitazzjoni billi nevalwaw il-vultaġġ ottiku bħala indikatur tal-funzjoni kontrattili. Madankollu, din il-limitazzjoni se teħtieġ aktar xogħol u tista' tiġi indirizzata fil-futur billi nintroduċu metodi għall-monitoraġġ ottiku tal-funzjoni tal-flieli tal-qalb fil-kultura, bħal mapep ottiku bl-użu ta' żebgħa sensittivi għall-kalċju u l-vultaġġ. Limitazzjoni oħra tas-CTCM hija li l-mudell tax-xogħol ma jimmanipulax l-istress fiżjoloġiku (preload u afterload). Fis-CTCM, il-pressjoni ġiet indotta f'direzzjonijiet opposti biex tirriproduċi 25% medda fiżjoloġika fid-dijastole (medda sħiħa) u s-sistole (tul tal-kontrazzjoni waqt l-istimulazzjoni elettrika) f'tessuti kbar ħafna. Din il-limitazzjoni għandha titneħħa fid-disinji futuri tas-CTCM permezz ta' pressjoni adegwata fuq it-tessut kardijaku miż-żewġ naħat u billi jiġu applikati r-relazzjonijiet eżatti bejn il-pressjoni u l-volum li jseħħu fil-kompartimenti tal-qalb.
Ir-rimudellar ikkaġunat minn tiġbid żejjed irrappurtat f'dan il-manuskritt huwa limitat għall-imitazzjoni ta' sinjali ta' tiġbid ipertrofiku. Għalhekk, dan il-mudell jista' jgħin fl-istudju tas-sinjalar ipertrofiku indott minn tiġbid mingħajr il-ħtieġa għal fatturi umorali jew newrali (li ma jeżistux f'din is-sistema). Huma meħtieġa aktar studji biex tiżdied il-multipliċità tas-CTCM, pereżempju, il-ko-kultivazzjoni ma' ċelloli immuni, fatturi umorali tal-plażma li jiċċirkolaw, u l-innervazzjoni meta l-ko-kultivazzjoni ma' ċelloli newronali se ttejjeb il-possibbiltajiet tal-immudellar tal-mard bis-CTCM.
Tlettax-il ħanżir intużaw f'dan l-istudju. Il-proċeduri kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida istituzzjonali u ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università ta' Louisville. L-arkata aortika ġiet ikklampjata u l-qalb ġiet perfuża b'1 L ta' kardjopleġija sterili (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL eparina, pH sa 7.4); Il-qlub ġew ippreservati f'soluzzjoni kardjopleġika kiesħa bis-silġ sakemm ġew ittrasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ, li ġeneralment ikun <10 minuti. Il-qlub ġew ippreservati f'soluzzjoni kardjopleġika kiesħa bis-silġ sakemm ġew ittrasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ, li ġeneralment ikun <10 minuti. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчытон на лчытон занимает <10 мин. Il-qlub inħażnu f'soluzzjoni kardjopleġika kiesħa bis-silġ sakemm ġew trasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ, li ġeneralment jieħu <10 minuti.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Żomm il-qlub fuq is-silġ għall-kardjopleġija sakemm jiġu ttrasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ, ġeneralment <10 min.
L-apparat CTCM ġie żviluppat fis-softwer tad-disinn assistit mill-kompjuter (CAD) SolidWorks. Il-kmamar tal-kultura, id-diviżuri u l-kmamar tal-arja huma magħmula minn plastik akriliku trasparenti CNC. Iċ-ċirku ta' appoġġ b'dijametru ta' 7mm huwa magħmul minn polietilen ta' densità għolja (HDPE) fiċ-ċentru u għandu kanal għal o-ring biex jakkomoda l-o-ring tas-silikon użat biex jissiġilla l-midja taħtu. Membrana rqiqa tas-silika tifred il-kamra tal-kultura mill-pjanċa tas-separazzjoni. Il-membrana tas-silikon hija maqtugħa bil-lejżer minn folja tas-silikon ta' 0.02″ ħxuna u għandha ebusija ta' 35A. Il-gaskits tas-silikon ta' isfel u ta' fuq huma maqtugħin bil-lejżer minn folja tas-silikon ta' 1/16″ ħxuna u għandhom ebusija ta' 50A. Viti tal-istainless steel 316L u ġewż tal-ġwienaħ jintużaw biex jitwaħħal il-blokk u jinħoloq siġill li ma jgħaddix arja minnu.
Bord taċ-ċirkwit stampat (PCB) dedikat huwa ddisinjat biex jiġi integrat mas-sistema C-PACE-EM. Is-sokits tal-konnettur tal-magna Żvizzera fuq il-PCB huma konnessi ma' elettrodi tal-grafita permezz ta' wajers tar-ram indurati bil-fidda u viti tal-bronż 0-60 imwaħħla fl-elettrodi. Il-bord taċ-ċirkwit stampat jitqiegħed fil-qoxra tal-istampatur 3D.
L-apparat CTCM huwa kkontrollat ​​minn attwatur pnewmatiku programmabbli (PPD) li joħloq pressjoni ċirkolatorja kkontrollata simili għal ċiklu kardijaku. Hekk kif il-pressjoni ġewwa l-kamra tal-arja tiżdied, il-membrana tas-silikon flessibbli tespandi 'l fuq, u tisforza l-mezz taħt is-sit tat-tessut. Iż-żona tat-tessut imbagħad tiġi mġebbda minn din it-tkeċċija tal-fluwidu, u timita l-espansjoni fiżjoloġika tal-qalb waqt id-dijastole. Fil-quċċata tar-rilassament, ġiet applikata stimulazzjoni elettrika permezz ta' elettrodi tal-grafita, li naqqsu l-pressjoni fil-kamra tal-arja u kkawżaw kontrazzjoni tas-sezzjonijiet tat-tessut. Ġewwa l-pajp hemm valv emostatiku b'sensor tal-pressjoni biex jiskopri l-pressjoni fis-sistema tal-arja. Il-pressjoni li tinħass mis-sensor tal-pressjoni hija applikata għal kollettur tad-dejta konness mal-laptop. Dan jippermetti monitoraġġ kontinwu tal-pressjoni ġewwa l-kamra tal-gass. Meta tintlaħaq il-pressjoni massima tal-kamra (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), l-apparat tal-akkwist tad-dejta ġie ordnat biex jibgħat sinjal lis-sistema C-PACE-EM biex jiġġenera sinjal ta' vultaġġ bifażiku għal 2 ms, issettjat għal 4 V.
Ittieħdu sezzjonijiet tal-qalb u l-kundizzjonijiet tal-kultura f'6 bjar twettqu kif ġej: Ittrasferixxi l-qlub miġbura mill-bastiment tat-trasferiment għal trej li fih kardjopleġija kiesħa (4°C). Il-ventrikolu tax-xellug ġie iżolat b'xafra sterili u maqtugħ f'biċċiet ta' 1-2 cm3. Dawn il-blokki tat-tessut twaħħlu ma' appoġġi tat-tessut b'kolla tat-tessut u tqiegħdu f'banju tat-tessut ta' mikrotomu li jivvibra li fih soluzzjoni ta' Tyrode u ossiġenat kontinwament (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g)), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glukożju (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml soluzzjoni 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml soluzzjoni 1 M), sa 1 L ddH2O). Il-mikrotomu li jivvibra ġie ssettjat biex jaqta’ flieli ħoxnin 300 µm bi frekwenza ta’ 80 Hz, amplitudni ta’ vibrazzjoni orizzontali ta’ 2 mm, u rata ta’ avvanz ta’ 0.03 mm/s. Il-banju tat-tessut kien imdawwar bis-silġ biex is-soluzzjoni tinżamm friska u t-temperatura nżammet f’4°C. Ittrasferixxi s-sezzjonijiet tat-tessut mill-banju tal-mikrotomu għal banju ta’ inkubazzjoni li fih soluzzjoni Tyrode ossiġenata kontinwament fuq is-silġ sakemm jinkisbu biżżejjed sezzjonijiet għal pjanċa ta’ kultura waħda. Għal kulturi transwell, is-sezzjonijiet tat-tessut ġew imwaħħla ma’ appoġġi sterili tal-poliuretan wesgħin 6 mm u mqiegħda f’6 ml ta’ mezz ottimizzat (mezz 199, suppliment ITS 1x, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin u 2X antibijotiku-antifungali). Stimulazzjoni elettrika (10 V, frekwenza 1.2 Hz) ġiet applikata għas-sezzjonijiet tat-tessut permezz tas-C-Pace. Għal kundizzjonijiet TD, T3 u Dex friski ġew miżjuda b’100 nM u 1 μM f’kull bidla tal-mezz. Il-mezz huwa saturat bl-ossiġnu qabel ma jinbidel 3 darbiet kuljum. Is-sezzjonijiet tat-tessut ġew ikkultivati ​​f'inkubatur f'temperatura ta' 37°C u 5% CO2.
Għall-kulturi CTCM, is-sezzjonijiet tat-tessut tqiegħdu fuq printer 3D magħmul apposta f'dixx Petri li fih soluzzjoni modifikata ta' Tyrode. L-apparat huwa ddisinjat biex iżid id-daqs tal-porzjon tal-qalb b'25% taż-żona taċ-ċirku ta' appoġġ. Dan isir sabiex is-sezzjonijiet tal-qalb ma jiġġebdux wara li jiġu trasferiti mis-soluzzjoni ta' Tyrode għall-mezz u waqt id-dijastole. Bl-użu ta' kolla istoakrilika, sezzjonijiet ta' 300 µm ħxuna ġew iffissati fuq ċirku ta' appoġġ b'dijametru ta' 7 mm. Wara li twaħħal is-sezzjonijiet tat-tessut maċ-ċirku ta' appoġġ, aqta' s-sezzjonijiet żejda tat-tessut u poġġi s-sezzjonijiet tat-tessut imwaħħla lura fil-banju tas-soluzzjoni Tyrode fuq is-silġ (4°C) sakemm ikunu ġew ippreparati biżżejjed sezzjonijiet għal apparat wieħed. Il-ħin totali tal-ipproċessar għall-apparati kollha m'għandux jaqbeż is-sagħtejn. Wara li 6 sezzjonijiet tat-tessut ikunu ġew imwaħħla maċ-ċrieki ta' appoġġ tagħhom, l-apparat CTCM ġie mmuntat. Il-kamra tal-kultura CTCM hija mimlija minn qabel b'21 ml ta' mezz pre-ossiġenat. Ittrasferixxi s-sezzjonijiet tat-tessut għall-kamra tal-kultura u neħħi bir-reqqa kwalunkwe bżieżaq tal-arja b'pipetta. Imbagħad, is-sezzjoni tat-tessut tiġi ggwidata fit-toqba u ppressata bil-mod f'postha. Fl-aħħar, poġġi l-għatu tal-elettrodu fuq l-apparat u ittrasferixxi l-apparat għall-inkubatur. Imbagħad qabbad is-CTCM mat-tubu tal-arja u mas-sistema C-PACE-EM. L-attwatur pnewmatiku jiftaħ u l-valv tal-arja jiftaħ is-CTCM. Is-sistema C-PACE-EM ġiet ikkonfigurata biex twassal 4 V f'1.2 Hz waqt pacing bifażiku għal 2 ms. Il-mezz inbidel darbtejn kuljum u l-elettrodi nbidlu darba kuljum biex tiġi evitata l-akkumulazzjoni tal-grafita fuq l-elettrodi. Jekk meħtieġ, is-sezzjonijiet tat-tessut jistgħu jitneħħew mill-bjar tal-kultura tagħhom biex jitkeċċew kwalunkwe bżieżaq tal-arja li setgħu waqgħu taħthom. Għal kundizzjonijiet ta' trattament MT, T3/Dex ġie miżjud frisk ma' kull bidla tal-mezz b'100 nM T3 u 1 μM Dex. L-apparati CTCM ġew ikkultivati ​​f'inkubatur f'37°C u 5% CO2.
Biex jinkisbu trajettorji mġebbda ta' flieli tal-qalb, ġiet żviluppata sistema ta' kamera speċjali. Intużat kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Ġappun) b'lenti makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Il-viżwalizzazzjoni twettqet f'temperatura tal-kamra wara li l-mezz ġie sostitwit b'mezz frisk. Il-kamera hija pożizzjonata f'angolu ta' 51° u l-vidjo jiġi rreġistrat bi 30 frejm kull sekonda. L-ewwel, intuża softwer open source (MUSCLEMOTION43) ma' Image-J biex jikkwantifika l-moviment tal-flieli tal-qalb. Il-maskra nħolqot bl-użu ta' MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) biex tiddefinixxi reġjuni ta' interess għall-flieli tal-qalb li tħabbat biex jiġi evitat l-istorbju. Maskri segmentati manwalment jiġu applikati għall-immaġini kollha f'sekwenza ta' frejms u mbagħad jiġu mgħoddija lill-plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion juża l-intensità medja tal-pixels f'kull frejm biex jikkwantifika l-moviment tiegħu relattiv għall-frejm ta' referenza. Id-dejta ġiet irreġistrata, iffiltrata u użata biex tikkwantifika l-ħin taċ-ċiklu u tivvaluta l-istirament tat-tessut matul iċ-ċiklu kardijaku. Il-vidjow irreġistrat ġie pproċessat wara l-użu ta' filtru diġitali ta' fażi żero tal-ewwel ordni. Biex tiġi kwantifikata l-medda tat-tessut (minn quċċata għal quċċata), twettqet analiżi minn quċċata għal quċċata biex issir distinzjoni bejn il-qċaċet u l-livelli baxxi fis-sinjal irreġistrat. Barra minn hekk, it-tnaqqis tat-tendenza jsir bl-użu ta' polinomju tas-sitt ordni biex tiġi eliminata d-drift tas-sinjal. Il-kodiċi tal-programm ġie żviluppat f'MATLAB biex jiddetermina l-moviment globali tat-tessut, il-ħin taċ-ċiklu, il-ħin ta' rilassament, u l-ħin ta' kontrazzjoni (Kodiċi Supplimentari tal-Programm 44).
Għall-analiżi tat-tensjoni, bl-użu tal-istess vidjows maħluqa għall-valutazzjoni mekkanika tat-tiġbid, l-ewwel ittraċċajna żewġ immaġini li jirrappreżentaw il-qċaċet tal-moviment (l-ogħla punti (ta' fuq) u l-aktar baxxi (t'isfel) tal-moviment) skont is-softwer MUSCLEMOTION. Imbagħad segmentajna r-reġjuni tat-tessut u applikajna forma ta' algoritmu ta' dell għat-tessut segmentat (Fig. Supplimentari 2a). It-tessut segmentat imbagħad ġie maqsum f'għaxar sottosuperfiċji, u l-istress fuq kull wiċċ ġie kkalkulat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, fejn Sup u Sdown huma d-distanzi tal-forma mid-dellijiet ta' fuq u ta' isfel tad-drapp, rispettivament (Fig. Supplimentari .2b).
Is-sezzjonijiet tal-qalb ġew iffissati f'4% paraformaldehyde għal 48 siegħa. It-tessuti ffissati ġew deidratati f'10% u 20% sukrożju għal siegħa, imbagħad fi 30% sukrożju matul il-lejl. Is-sezzjonijiet imbagħad ġew inkorporati f'kompost b'temperatura ottimali tat-tqattigħ (kompost OCT) u ffriżati gradwalment f'banju ta' isopentan/silġ niexef. Aħżen il-blokki tal-inkorporazzjoni OCT f'-80 °C sakemm jiġu separati. Is-slajds ġew ippreparati bħala sezzjonijiet bi ħxuna ta' 8 μm.
Biex tneħħi l-OCT mit-taqsimiet tal-qalb, saħħan is-slajds fuq blokka tat-tisħin f'95 °C għal 5 minuti. Żid 1 ml PBS ma' kull slajd u inkuba għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra, imbagħad ippenetra s-taqsimiet billi tissettja 0.1% Triton-X fil-PBS għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. Biex tevita li l-antikorpi mhux speċifiċi jintrabtu mal-kampjun, żid 1 ml ta' soluzzjoni ta' 3% BSA mas-slajds u inkuba għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-BSA mbagħad tneħħiet u s-slajds inħaslu bil-PBS. Immarka kull kampjun b'lapes. Antikorpi primarji (dilwiti 1:200 f'1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) u troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ġew miżjuda fuq 90 minuta, imbagħad antikorpi sekondarji (dilwiti 1:200 f'1% BSA) kontra Alexa Fluor 488 tal-ġrieden (Thermo Scientific; #A16079), kontra Alexa Fluor 594 tal-fenek (Thermo Scientific; #T6391) għal 90 minuta oħra. Inħaslu 3 darbiet bil-PBS. Biex niddistingwu t-tebgħa fil-mira mill-isfond, użajna biss l-antikorp sekondarju bħala kontroll. Fl-aħħar, ġiet miżjuda tebgħa nukleari DAPI u s-slajds tqiegħdu f'vectashield (Vector Laboratories) u ġew issiġillati bil-lustrar tad-dwiefer. (ingrandiment -x) u mikroskopju Keyence b'ingrandiment ta' 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) f'5 μg/ml f'PBS intuża għat-tebgħa tal-WGA u ġie applikat għal sezzjonijiet fissi għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra. Is-slajds imbagħad inħaslu bil-PBS u Sudan black ġie miżjud ma' kull slajd u ġie inkubat għal 30 minuta. Is-slajds imbagħad inħaslu bil-PBS u ġie miżjud vectashield embedding medium. Is-slajds ġew viżwalizzati fuq mikroskopju Keyence b'ingrandiment ta' 40x.
L-OCT tneħħa mill-kampjuni kif deskritt hawn fuq. Wara li tneħħi l-OCT, għaddas is-slajds fis-soluzzjoni ta' Bouin matul il-lejl. Is-slajds imbagħad tlaħalħu b'ilma distillat għal siegħa u mbagħad tpoġġew f'soluzzjoni ta' Bibrich aloe acid fuchsin għal 10 minuti. Imbagħad is-slajds inħaslu b'ilma distillat u tpoġġew f'soluzzjoni ta' 5% fosfomolibdenu/5% aċidu fosfotungstiku għal 10 minuti. Mingħajr ma tlaħlaħ, ittrasferixxi s-slajds direttament fis-soluzzjoni tal-anilina blu għal 15-il minuta. Imbagħad is-slajds inħaslu b'ilma distillat u tpoġġew f'soluzzjoni ta' 1% aċidu aċetiku għal 2 minuti. Is-slajds tnixxfu f'200 N etanol u ġew trasferiti għal xylene. Is-slajds imtebbgħin ġew viżwalizzati bl-użu ta' mikroskopju Keyence b'objettiv 10x. Il-perċentwal taż-żona tal-fibrożi ġie kwantifikat bl-użu tas-softwer Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numru tal-katalgu V13154, skont il-protokoll tal-manifattur b'xi modifiki. B'mod partikolari, intuża punch kirurġiku b'dijametru ta' 6 mm biex jiżgura daqs uniformi tat-tessut waqt l-analiżi tal-MTT. It-tessuti tqiegħdu individwalment fil-bjar ta' pjanċa ta' 12-il bjar li fiha sottostrat MTT skont il-protokoll tal-manifattur. Is-sezzjonijiet jiġu inkubati f'temperatura ta' 37°C għal 3 sigħat u t-tessut ħaj jimmetabolizza s-sottostrat MTT biex jifforma kompost formazan vjola. Ibdel is-soluzzjoni MTT b'1 ml DMSO u inkuba f'temperatura ta' 37 °C għal 15-il minuta biex jiġi estratt formazan vjola mis-sezzjonijiet tal-qalb. Il-kampjuni ġew dilwiti 1:10 f'DMSO fi pjanċi b'qiegħ ċar ta' 96 bjar u l-intensità tal-kulur vjola tkejlet f'570 nm bl-użu ta' qarrej tal-pjanċa Cytation (BioTek). Il-qari ġie normalizzat għall-piż ta' kull porzjon tal-qalb.
Il-medja tal-porzjon tal-qalb ġiet sostitwita b'medja li fiha 1 μCi/ml [5-3H]-glukożju (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) għall-assaġġ tal-użu tal-glukożju kif deskritt qabel. Wara 4 sigħat ta' inkubazzjoni, żid 100 µl ta' mezz ma' tubu ta' mikroċentrifuga miftuħ li fih 100 µl ta' 0.2 N HCl. Imbagħad it-tubu tqiegħed f'tubu ta' xintillazzjoni li fih 500 μl ta' dH2O biex jevapora [3H]2O għal 72 siegħa f'37°C. Imbagħad neħħi t-tubu ta' mikroċentrifuga mit-tubu ta' xintillazzjoni u żid 10 ml ta' fluwidu ta' xintillazzjoni. L-għadd ta' xintillazzjoni sar bl-użu ta' analizzatur ta' xintillazzjoni likwidu Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). L-użu tal-glukożju mbagħad ġie kkalkulat billi tqieset l-attività speċifika tal-glukożju [5-3H], l-ekwilibriju mhux komplut u l-isfond, id-dilwizzjoni ta' glukożju [5-3H] għal glukożju mhux immarkat, u l-effiċjenza tal-kontro tax-xintillazzjoni. Id-dejta hija normalizzata għall-massa tas-sezzjonijiet tal-qalb.
Wara l-omoġenizzazzjoni tat-tessut f'Trizol, l-RNA ġie iżolat minn sezzjonijiet tal-qalb bl-użu tal-Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 skont il-protokoll tal-manifattur. Il-preparazzjoni tal-librerija RNAsec, is-sekwenzar u l-analiżi tad-dejta twettqu kif ġej:
Intuża 1 μg ta' RNA għal kull kampjun bħala materjal tal-bidu għat-tħejjija tal-librerija tal-RNA. Il-libreriji tas-sekwenzar ġew iġġenerati bl-użu tal-NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit għal Illumina (NEB, USA) wara r-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur, u l-kodiċijiet tal-indiċi ġew miżjuda mas-sekwenzi tal-attributi għal kull kampjun. Fil-qosor, l-mRNA ġie ppurifikat mill-RNA totali bl-użu ta' żibeġ manjetiċi mwaħħla ma' oligonukleotidi poly-T. Il-frammentazzjoni titwettaq bl-użu ta' katjonijiet divalenti f'temperatura għolja f'NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Is-cDNA tal-ewwel strand ġie sintetizzat bl-użu ta' primers hexamer każwali u M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Is-cDNA tat-tieni strand imbagħad jiġi sintetizzat bl-użu ta' DNA polymerase I u RNase H. L-isporġenzi li jifdal jiġu konvertiti fi truf ċatti permezz tal-attività ta' exonuclease/polymerase. Wara l-adenilazzjoni tat-tarf 3′ tal-framment tad-DNA, Adapter NEBNext bi struttura ta' linja tax-xagħar huwa mwaħħal miegħu biex jippreparah għall-ibridizzazzjoni. Għall-għażla ta' frammenti tas-cDNA ta' tul preferut 150-200 bp. Il-frammenti tal-librerija ġew purifikati bl-użu tas-sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Imbagħad, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) b'cDNA magħżul għad-daqs ligat b'adapter intuża għal 15-il minuta f'37°C u mbagħad għal 5 minuti f'95°C qabel il-PCR. Il-PCR imbagħad twettaq bl-użu tal-Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primers universali tal-PCR, u primers Index (X). Fl-aħħar, il-prodotti tal-PCR ġew purifikati (sistema AMPure XP) u l-kwalità tal-librerija ġiet ivvalutata fuq sistema Agilent Bioanalyzer 2100. Il-librerija tas-cDNA mbagħad ġiet sekwenzata bl-użu ta' sekwenzatur Novaseq. Fajls tal-immaġni mhux ipproċessati minn Illumina ġew konvertiti għal qari mhux ipproċessat bl-użu ta' CASAVA Base Calling. Id-dejta mhux ipproċessata hija maħżuna f'fajls tal-format FASTQ(fq) li fihom sekwenzi ta' qari u kwalitajiet ta' bażi korrispondenti. Agħżel HISAT2 biex tqabbel il-qari tas-sekwenzar iffiltrat mal-ġenoma ta' referenza Sscrofa11.1. B'mod ġenerali, HISAT2 jappoġġja ġenomi ta' kwalunkwe daqs, inklużi ġenomi akbar minn 4 biljun bażi, u l-valuri awtomatiċi huma stabbiliti għall-biċċa l-kbira tal-parametri. Il-qari tat-tqattigħ mid-dejta tal-RNA Seq jista' jiġi allinjat b'mod effiċjenti bl-użu ta' HISAT2, l-aktar sistema mgħaġġla disponibbli bħalissa, bl-istess preċiżjoni jew aħjar minn kwalunkwe metodu ieħor.
L-abbundanza tat-traskrizzjonijiet tirrifletti direttament il-livell ta' espressjoni tal-ġeni. Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni huma vvalutati mill-abbundanza tat-traskrizzjonijiet (għadd tas-sekwenzar) assoċjati mal-ġenoma jew l-exons. In-numru ta' qari huwa proporzjonali għal-livelli ta' espressjoni tal-ġeni, it-tul tal-ġeni, u l-fond tas-sekwenzar. L-FPKM (frammenti għal kull elf par ta' bażijiet ta' traskrizzjoni sekwenzata għal kull miljun par ta' bażijiet) ġew ikkalkulati u l-valuri P tal-espressjoni differenzjali ġew determinati bl-użu tal-pakkett DESeq2. Imbagħad ikkalkulajna r-rata ta' skoperta falza (FDR) għal kull valur P bl-użu tal-metodu Benjamini-Hochberg9 ibbażat fuq il-funzjoni R integrata "p.adjust".
L-RNA iżolat minn sezzjonijiet tal-qalb ġie kkonvertit għal cDNA f'konċentrazzjoni ta' 200 ng/μl bl-użu tat-taħlita SuperScript IV Vilo Master minn Thermo (Thermo, numru tal-kat. 11756050). RT-PCR kwantitattiva twettqet bl-użu ta' pjanċa ta' reazzjoni trasparenti Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, numru tal-kat. 4483319) u kolla ottika microamp (Thermo, numru tal-kat. 4311971). It-taħlita ta' reazzjoni kienet tikkonsisti minn 5 µl ta' taħlita Taqman Fast Advanced Master (Thermo, numru tal-kat. 4444557), 0.5 µl Taqman Primer u 3.5 µl H2O mħallta għal kull bir. Ċikli standard tal-qPCR tmexxew u l-valuri tas-CT tkejlu bl-użu ta' strument Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR f'ħin reali (modulu ta' 384-well; numru tal-prodott A28135). Il-primers Taqman inxtraw minn Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Il-valuri CT tal-kampjuni kollha ġew normalizzati għall-ġene housekeeping GAPDH.
Ir-rilaxx tal-midja ta' NT-ProBNP ġie vvalutat bl-użu tal-kit NT-ProBNP (ħanżir) (Numru tal-Katalogu MBS2086979, MyBioSource) skont il-protokoll tal-manifattur. Fil-qosor, 250 µl ta' kull kampjun u standard ġew miżjuda b'mod doppju ma' kull bir. Immedjatament wara li żżid il-kampjun, żid 50 µl ta' Reaġent tal-Assay A ma' kull bir. Ħawwad bil-mod il-pjanċa u ssiġillaha b'siġillant. Imbagħad il-pilloli ġew inkubati f'temperatura ta' 37°C għal siegħa. Imbagħad aspira s-soluzzjoni u aħsel il-bjar 4 darbiet bi 350 µl ta' soluzzjoni tal-ħasil 1X, billi tinkuba s-soluzzjoni tal-ħasil għal minuta jew tnejn kull darba. Imbagħad żid 100 µl ta' Reaġent tal-Assay B għal kull bir u ssiġillaha b'siġillant tal-pjanċa. Il-pillola tħawdet bil-mod u ġiet inkubata f'temperatura ta' 37°C għal 30 minuta. Aspira s-soluzzjoni u aħsel il-bjar 5 darbiet bi 350 µl ta' soluzzjoni tal-ħasil 1X. Żid 90 µl ta' soluzzjoni tas-sottostrat ma' kull bir u ssiġilla l-pjanċa. Inkuba l-pjanċa f'temperatura ta' 37°C għal 10-20 minuta. Żid 50 µl ta' Soluzzjoni ta' Waqfien ma' kull bir. Il-pjanċa tkejlet immedjatament bl-użu ta' qarrej tal-pjanċa Cytation (BioTek) issettjat għal 450 nm.
Saru analiżijiet tal-qawwa biex jintgħażlu d-daqsijiet tal-gruppi li se jipprovdu >80% qawwa biex jinstabu bidla assoluta ta' 10% fil-parametru b'rata ta' żball tat-Tip I ta' 5%. Saru analiżijiet tal-qawwa biex jintgħażlu d-daqsijiet tal-gruppi li se jipprovdu >80% qawwa biex jinstabu bidla assoluta ta' 10% fil-parametru b'rata ta' żball tat-Tip I ta' 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощносто беспечат 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Twettqet analiżi tal-qawwa biex jintgħażlu daqsijiet tal-gruppi li jipprovdu >80% qawwa biex jidentifikaw bidla assoluta ta' 10% fil-parametri b'rata ta' żball tat-Tip I ta' 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощнло обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Twettqet analiżi tal-qawwa biex tintgħażel daqs ta' grupp li jipprovdi >80% qawwa biex jinstab bidla assoluta ta' 10% fil-parametri u rata ta' żball tat-tip I ta' 5%.Is-sezzjonijiet tat-tessuti ntgħażlu b'mod każwali qabel l-esperiment. L-analiżijiet kollha kienu condition blind u l-kampjuni ġew dekodifikati biss wara li d-dejta kollha ġiet analizzata. Is-softwer GraphPad Prism (San Diego, CA) intuża biex iwettaq l-analiżijiet statistiċi kollha. Għall-istatistika kollha, il-valuri-p tqiesu sinifikanti f'valuri <0.05. Għall-istatistika kollha, il-valuri-p tqiesu sinifikanti f'valuri ta' <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Għall-istatistika kollha, il-valuri-p tqiesu sinifikanti f'valuri ta' <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Għall-istatistika kollha, il-valuri-p tqiesu sinifikanti f'valuri ta' <0.05.Sar test-t ta' Student b'żewġt itruf fuq id-dejta b'żewġ paraguni biss. Intużat ANOVA b'direzzjoni waħda jew b'żewġ direzzjonijiet biex tiġi ddeterminata s-sinifikat bejn gruppi multipli. Meta twettqu testijiet post hoc, ġiet applikata l-korrezzjoni ta' Tukey biex jitqiesu l-paraguni multipli. Id-dejta RNAsec għandha kunsiderazzjonijiet statistiċi speċjali meta tikkalkula l-FDR u l-p.adjust kif deskritt fit-taqsima tal-Metodi.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tar-Rapport tar-Riċerka dwar in-Natura marbut ma' dan l-artiklu.