Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Hemm bżonn ta 'sistema in vitro affidabbli li tista' tirriproduċi b'mod preċiż l-ambjent fiżjoloġiku tal-qalb għall-ittestjar tad-droga.Id-disponibbiltà limitata tas-sistemi tal-kultura tat-tessut tal-qalb tal-bniedem wasslet għal interpretazzjonijiet mhux preċiżi tal-effetti tal-mediċina kardijaka.Hawnhekk, żviluppajna mudell tal-kultura tat-tessut kardijaku (CTCM) li jistimula b'mod elettromekkaniku slices tal-qalb u jgħaddi minn medda fiżjoloġika matul il-fażijiet sistoliċi u dijastoliċi taċ-ċiklu tal-qalb.Wara 12-il jum ta 'kultura, dan l-approċċ tejjeb parzjalment il-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tal-qalb, iżda ma ppreservax bis-sħiħ l-integrità strutturali tagħhom.Għalhekk, wara screening ta 'molekula żgħira, sibna li ż-żieda ta' 100 nM triiodothyronine (T3) u 1 μM dexamethasone (Dex) mal-medja tagħna żammet il-mikrostruttura tas-sezzjonijiet għal 12-il jum.Flimkien mat-trattament T3/Dex, is-sistema CTCM żammet profili traskrizzjoni, vijabbiltà, attività metabolika, u integrità strutturali fl-istess livell bħat-tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum.Barra minn hekk, tiġbid eċċessiv ta 'tessut kardijaku fil-kultura jinduċi sinjalazzjoni kardijaka ipertrofika, li tipprovdi evidenza għall-kapaċità ta' CTCM li jimita kundizzjonijiet ipertrofiċi indotti minn stretch kardijaku.Bħala konklużjoni, CTCM jista 'jimmudella l-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-qalb fil-kultura fuq perjodi twal ta' żmien, li jippermetti screening affidabbli tad-droga.
Qabel ir-riċerka klinika, huma meħtieġa sistemi in vitro affidabbli li jistgħu jirriproduċu b'mod preċiż l-ambjent fiżjoloġiku tal-qalb tal-bniedem.Sistemi bħal dawn għandhom jimitaw il-medda mekkanika mibdula, ir-rata tal-qalb, u l-proprjetajiet elettrofiżjoloġiċi.Mudelli tal-annimali huma komunement użati bħala pjattaforma ta 'screening għall-fiżjoloġija tal-qalb b'affidabilità limitata biex jirriflettu l-effetti tad-drogi fil-qalb tal-bniedem1,2.Fl-aħħar mill-aħħar, il-Mudell Esperimentali tal-Kultura tat-Tessut Kardijaku Ideal (CTCM) huwa mudell li huwa sensittiv ħafna u speċifiku għal diversi interventi terapewtiċi u farmakoloġiċi, li jirriproduċi b'mod preċiż il-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-qalb tal-bniedem3.In-nuqqas ta' sistema bħal din jillimita l-iskoperta ta' trattamenti ġodda għall-insuffiċjenza tal-qalb4,5 u wasslet għal kardjotossiċità tad-droga bħala raġuni ewlenija għall-ħruġ mis-suq6.
Matul l-aħħar għaxar snin, tmien mediċini mhux kardjovaskulari ġew irtirati mill-użu kliniku minħabba li jikkawżaw titwil tal-intervall QT li jwassal għal arritmiji ventrikulari u mewt f'daqqa7.Għalhekk, hemm ħtieġa dejjem tikber għal strateġiji ta 'screening prekliniku affidabbli biex jiġu vvalutati l-effikaċja u t-tossiċità kardjovaskulari.L-użu reċenti ta 'kardjomijoċiti derivati ​​minn ċelloli staminali pluripotenti indotti mill-bniedem (hiPS-CM) fl-iskrinjar tad-droga u l-ittestjar tat-tossiċità jipprovdi soluzzjoni parzjali għal din il-problema.Madankollu, in-natura immatura ta 'hiPS-CMs u n-nuqqas ta' kumplessità multiċellulari tat-tessut kardijaku huma limitazzjonijiet ewlenin ta 'dan il-metodu.Studji reċenti wrew li din il-limitazzjoni tista 'tiġi megħluba parzjalment bl-użu ta' hiPS-CM bikrija biex jiffurmaw hydrogels tat-tessut kardijaku ftit wara l-bidu ta 'kontrazzjonijiet spontanji u tiżdied gradwalment l-istimulazzjoni elettrika maż-żmien.Madankollu, dawn il-mikrotessuti hiPS-CM m'għandhomx il-proprjetajiet elettrofiżjoloġiċi u kontrattili maturi tal-mijokardju adult.Barra minn hekk, it-tessut kardijaku uman għandu struttura aktar kumplessa, li tikkonsisti f'taħlita eteroġenja ta 'tipi ta' ċelluli differenti, inklużi ċelloli endoteljali, newroni, u fibroblasti stromali, interkonnessi minn settijiet speċifiċi ta 'proteini matriċi extraċellulari.Din l-eteroġeneità tal-popolazzjonijiet mhux kardjojoċiti11,12,13 fil-qalb tal-mammiferi adulti hija ostaklu ewlieni għall-immudellar tat-tessut kardijaku bl-użu ta 'tipi ta' ċelluli individwali.Dawn il-limitazzjonijiet ewlenin jenfasizzaw l-importanza li jiġu żviluppati metodi għall-kultivazzjoni ta 'tessut mijokardijaku intatt taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi.
Sezzjonijiet irqaq ikkultivati ​​(300 µm) tal-qalb tal-bniedem urew li huma mudell promettenti ta' mijokardju uman intatt.Dan il-metodu jipprovdi aċċess għal sistema multiċellulari 3D kompluta simili għat-tessut tal-qalb tal-bniedem.Madankollu, sal-2019, l-użu ta 'sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​kien limitat mis-sopravivenza tal-kultura qasira (24 siegħa).Dan huwa dovut għal numru ta 'fatturi inkluż in-nuqqas ta' stretch fiżiku-mekkaniku, l-interface arja-likwidu, u l-użu ta 'midja sempliċi li ma jappoġġjawx il-ħtiġijiet tat-tessut kardijaku.Fl-2019, bosta gruppi ta 'riċerka wrew li l-inkorporazzjoni ta' fatturi mekkaniċi fis-sistemi tal-kultura tat-tessut tal-qalb tista 'testendi l-ħajja tal-kultura, ittejjeb l-espressjoni tal-qalb, u timita l-patoloġija tal-qalb.Żewġ studji eleganti 17 u 18 juru li t-tagħbija mekkanika uniaxial għandha effett pożittiv fuq il-fenotip tal-qalb waqt il-kultura.Madankollu, dawn l-istudji ma użawx it-tagħbija dinamika fiżiko-mekkanika tridimensjonali taċ-ċiklu tal-qalb, peress li sezzjonijiet tal-qalb kienu mgħobbija jew b'forzi ta 'tensjoni isometriċi 17 jew tagħbija auxotonic lineari 18 .Dawn il-metodi ta 'tiġbid tat-tessuti rriżultaw fis-soppressjoni ta' ħafna ġeni kardijaċi jew l-espressjoni żejda ta 'ġeni assoċjati ma' reazzjonijiet ta 'tiġbid anormali.Notevolment, Pitoulis et al.19 żviluppat banju dinamiku tal-kultura tal-porzjon tal-qalb għar-rikostruzzjoni taċ-ċiklu tal-qalb bl-użu ta 'feedback tat-transducer tal-forza u drives tat-tensjoni.Għalkemm din is-sistema tippermetti mudellar aktar preċiż taċ-ċiklu tal-qalb in vitro, il-kumplessità u l-fluss baxx tal-metodu jillimitaw l-applikazzjoni ta 'din is-sistema.Il-laboratorju tagħna reċentement żviluppa sistema ta 'kultura simplifikata bl-użu ta' stimulazzjoni elettrika u mezz ottimizzat biex iżżomm il-vijabbiltà ta 'sezzjonijiet ta' tessut tal-qalb tal-ħnieżer u tal-bniedem sa 6 ijiem20,21.
Fil-manuskritt attwali, niddeskrivu mudell tal-kultura tat-tessut kardijaku (CTCM) bl-użu ta 'sezzjonijiet tal-qalb tal-ħnieżer li jinkorpora indikazzjonijiet umorali biex jirrikapitulaw il-fiżjoloġija tal-qalb tridimensjonali u distensjoni patofiżjoloġika matul iċ-ċiklu tal-qalb.Dan is-CTCM jista 'jżid l-eżattezza tat-tbassir tal-mediċina pre-klinika għal livell li qatt ma ntlaħaq qabel billi jipprovdi sistema kardijaka kost-effettiva, ta' nofs it-throughput li timita l-fiżjoloġija/patofiżjoloġija tal-qalb tal-mammiferi għall-ittestjar tad-droga pre-klinika.
Sinjali mekkaniċi emodinamiċi għandhom rwol kritiku fiż-żamma tal-funzjoni tal-kardjomijoċiti in vitro 22,23,24.Fil-manuskritt attwali, żviluppajna CTCM (Figura 1a) li jista’ jimita l-ambjent kardijaku tal-adulti billi jinduċi stimulazzjoni kemm elettrika kif ukoll mekkanika fi frekwenzi fiżjoloġiċi (1.2 Hz, 72 taħbita kull minuta).Biex tevita stretch eċċessiv tat-tessut waqt id-dijastole, intuża apparat ta 'stampar 3D biex iżid id-daqs tat-tessut b'25% (Fig. 1b).Pacing elettriku indott mis-sistema C-PACE kien ikkalkolat biex jibda 100 ms qabel is-sistole bl-użu ta 'sistema ta' akkwist tad-dejta biex tirriproduċi bis-sħiħ iċ-ċiklu tal-qalb.Is-sistema tal-kultura tat-tessuti tuża attwatur pnewmatiku programmabbli (LB Engineering, il-Ġermanja) biex tespandi ċiklikament membrana tas-silikonju flessibbli biex tikkawża espansjoni tal-flieli tal-qalb fil-kamra ta 'fuq.Is-sistema kienet imqabbda ma 'linja ta' l-arja esterna permezz ta 'transducer tal-pressjoni, li għamilha possibbli li taġġusta b'mod preċiż il-pressjoni (± 1 mmHg) u l-ħin (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Waħħal is-sezzjoni tat-tessut maċ-ċirku ta’ appoġġ ta’ 7 mm, muri bil-blu, ġewwa l-kamra tal-kultura tal-apparat.Il-kamra tal-kultura hija separata mill-kamra tal-arja b'membrana rqiqa tas-silikonju flessibbli.Poġġi siegla bejn kull kamra biex tevita tnixxijiet.L-għatu tal-apparat fih elettrodi tal-grafita li jipprovdu stimulazzjoni elettrika.b Rappreżentazzjoni skematika tal-apparat tat-tessut kbir, ċirku gwida u ċirku ta 'appoġġ.Is-sezzjonijiet tat-tessut (kannella) jitqiegħdu fuq l-apparat ta 'daqs kbir biċ-ċirku gwida mqiegħed fil-kanal fuq it-tarf ta' barra tal-apparat.Billi tuża l-gwida, poġġi bir-reqqa ċ-ċirku ta 'appoġġ miksi b'adeżiv akriliku tat-tessut fuq is-sezzjoni tat-tessut kardijaku.c Grafika li turi l-ħin tal-istimulazzjoni elettrika bħala funzjoni tal-pressjoni tal-kamra tal-arja kkontrollata minn attwatur pnewmatiku programmabbli (PPD).Intuża apparat ta 'akkwist tad-dejta biex jissinkronizza l-istimulazzjoni elettrika bl-użu ta' sensuri tal-pressjoni.Meta l-pressjoni fil-kamra tal-kultura tilħaq il-limitu stabbilit, jintbagħat sinjal tal-polz lis-C-PACE-EM biex tiskatta stimulazzjoni elettrika.d Immaġni ta' erba' CTCMs imqiegħda fuq xkaffa ta' l-inkubatur.Erba 'apparati huma konnessi ma' PPD wieħed permezz ta 'ċirkwit pnewmatiku, u sensuri tal-pressjoni huma mdaħħla fil-valv emostatiku biex jimmonitorjaw il-pressjoni fiċ-ċirkwit pnewmatiku.Kull apparat fih sitt sezzjonijiet tat-tessut.
Bl-użu ta 'attwatur pnewmatiku wieħed, stajna nikkontrollaw 4 apparati CTCM, li kull wieħed minnhom jista' jżomm 6 sezzjonijiet tat-tessuti (Fig. 1d).Fis-CTCM, il-pressjoni tal-arja fil-kamra tal-arja tiġi kkonvertita fi pressjoni sinkronika fil-kamra tal-fluwidu u tinduċi espansjoni fiżjoloġika tal-porzjon tal-qalb (Figura 2a u Movie Supplimentari 1).Evalwazzjoni tal-medda tat-tessuti f'80 mm Hg.Art.wera tiġbid ta 'sezzjonijiet tat-tessut b'25% (Fig. 2b).Din il-medda perċentwali ntwera li tikkorrispondi għal tul ta 'sarkomer fiżjoloġiku ta' 2.2–2.3 µm għal contractility tas-sezzjoni kardijaka normali17,19,25.Il-moviment tat-tessuti ġie vvalutat bl-użu ta 'settings tal-kameras tad-dwana (Figura 1 Supplimentari).L-amplitudni u l-veloċità tal-moviment tat-tessut (Fig. 2c, d) kienu jikkorrispondu għal stretch matul iċ-ċiklu tal-qalb u l-ħin matul is-sistole u d-dijastole (Fig. 2b).Stretch u veloċità tat-tessut kardijaku waqt il-kontrazzjoni u r-rilassament baqgħu kostanti għal 12-il jum fil-kultura (Fig. 2f).Biex nevalwaw l-effett tal-istimulazzjoni elettrika fuq il-kuntrattilità waqt il-kultura, żviluppajna metodu biex niddeterminaw deformità attiva bl-użu ta 'algoritmu ta' dell (Figura Supplimentari 2a, b) u stajna niddistingwu bejn deformitajiet bi u mingħajr stimulazzjoni elettrika.L-istess sezzjoni tal-qalb (Fig. 2f).Fir-reġjun mobbli tal-qatgħa (R6-9), il-vultaġġ waqt l-istimulazzjoni elettrika kien 20% ogħla milli fin-nuqqas ta 'stimulazzjoni elettrika, li jindika l-kontribut ta' stimulazzjoni elettrika għall-funzjoni kontrattili.
Traċċi rappreżentattivi tal-pressjoni tal-kamra tal-arja, pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u kejl tal-moviment tat-tessut jikkonfermaw li l-pressjoni tal-kamra tbiddel il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u tikkawża moviment korrispondenti tal-porzjon tat-tessut.b Traċċi rappreżentattivi tal-medda fil-mija (blu) tas-sezzjonijiet tat-tessuti li jikkorrispondu għall-medda fil-mija (oranġjo).c Il-moviment imkejjel tal-porzjon tal-qalb huwa konsistenti mal-veloċità mkejla tal-moviment.(d) Trajettorji rappreżentattivi ta 'moviment ċikliku (linja blu) u veloċità (linja oranġjo bit-tikek) f'porzjon tal-qalb.e Kwantifikazzjoni tal-ħin taċ-ċiklu (n = 19 slices għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), ħin ta 'kontrazzjoni (n = 19 slices għal kull grupp), ħin ta' rilassament (n = 19 slices għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), moviment tat-tessut (n = 25 ).slices)/grupp minn ħnieżer differenti), l-ogħla veloċità sistolika (n = 24(D0), 25(D12) flieli/grupp minn ħnieżer differenti) u l-ogħla rata ta’ rilassament (n=24(D0), 25(D12) slices/grupp minn ħnieżer differenti).It-test t ta' Student b'żewġ denbu ma wera l-ebda differenza sinifikanti fl-ebda parametru.f Traċċi rappreżentattivi ta 'analiżi tar-razza ta' sezzjonijiet tat-tessuti bi stimulazzjoni elettrika (aħmar) u mingħajr (blu), għaxar żoni reġjonali ta 'sezzjonijiet tat-tessuti mill-istess sezzjoni.Il-pannelli tal-qiegħ juru l-kwantifikazzjoni tad-differenza perċentwali fir-razza f'sezzjonijiet tat-tessut bi u mingħajr stimulazzjoni elettrika f'għaxar żoni minn sezzjonijiet differenti. (n = 8 slices/grupp minn ħnieżer differenti, It-test t tal-Istudenti b'żewġ denbu jitwettaq; ****p < 0.0001, **p < 0.01, * p < 0.05). (n = 8 slices/grupp minn ħnieżer differenti, It-test t tal-Istudenti b'żewġ denbu jitwettaq; ****p < 0.0001, **p < 0.01, * p < 0.05). (n = 8 срезов / гру iktar р разных свиней, проводитrun двустороронorja t-t-к к к к к к к кt (n = 8 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test t ta' Student b'żewġ denbu; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01,0, *p <0,01,0). (n = 8 sezzjonijiet/grupp, minn ħnieżer differenti, test t tal-Istudent b'żewġ denbu; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Fis-sistema tal-kultura tal-qalb bijomimetika statika preċedenti tagħna [20, 21], żammejna l-vijabbiltà, il-funzjoni u l-integrità strutturali tal-qatgħat tal-qalb għal 6 ijiem billi applikajna stimulazzjoni elettrika u ottimizzaw il-kompożizzjoni medja.Madankollu, wara 10 ijiem, dawn iċ-ċifri naqsu drastikament.Se nirreferu għal sezzjonijiet ikkultivati ​​fis-sistema ta 'kultura bijomimetika statika preċedenti tagħna 20, 21 kundizzjonijiet ta' kontroll (Ctrl) u se nużaw il-mezz ottimizzat qabel tagħna bħala kundizzjonijiet MC u kultura taħt stimulazzjoni mekkanika u elettrika simultanja (CTCM).imsejħa .L-ewwel, iddeterminajna li l-istimulazzjoni mekkanika mingħajr stimulazzjoni elettrika ma kinitx biżżejjed biex iżżomm il-vijabbiltà tat-tessuti għal ġranet 6 (Fig. Supplimentari 3a, b).Interessanti, bl-introduzzjoni ta 'stimulazzjoni fiżjo-mekkanika u elettrika bl-użu ta' STCM, il-vijabbiltà ta 'taqsimiet tal-qalb ta' 12-il jum baqgħet l-istess bħal f'sezzjonijiet tal-qalb friski taħt kundizzjonijiet MS, iżda mhux taħt kundizzjonijiet Ctrl, kif muri mill-analiżi MTT (Fig. 1).3a).Dan jissuġġerixxi li l-istimulazzjoni mekkanika u s-simulazzjoni taċ-ċiklu kardijaku jistgħu jżommu s-sezzjonijiet tat-tessut vijabbli għad-doppju ta' żmien irrapportat fis-sistema ta 'kultura statika preċedenti tagħna.Madankollu, valutazzjoni tal-integrità strutturali ta 'sezzjonijiet tat-tessuti permezz ta' immunotikkettjar ta 'troponin T kardijaku u connexin 43 wriet li l-espressjoni ta' connexin 43 kienet ogħla b'mod sinifikanti fit-tessuti MC f'jum 12 milli fil-kontrolli fl-istess jum.Madankollu, l-espressjoni uniformi tal-connexin 43 u l-formazzjoni tad-diska Z ma nżammux bis-sħiħ (Fig. 3b).Aħna nużaw qafas ta 'intelliġenza artifiċjali (AI) biex nikkwantifikaw l-integrità strutturali tat-tessut26, pipeline ta' tagħlim profond ibbażat fuq immaġini bbażat fuq troponin-T u tbajja ta 'connexin43 biex awtomatikament tikkwantifika l-integrità strutturali u l-fluworexxenza ta' flieli tal-qalb f'termini ta 'saħħa tal-lokalizzazzjoni.Dan il-metodu juża Netwerk Neurali Konvoluzzjonali (CNN) u qafas ta 'tagħlim fil-fond biex jikkwantifika b'mod affidabbli l-integrità strutturali tat-tessut kardijaku b'mod awtomatizzat u imparzjali, kif deskritt fir-referenza.26. It-tessut MC wera xebh strutturali mtejjeb għal jum 0 meta mqabbel ma 'sezzjonijiet ta' kontroll statiku.Barra minn hekk, it-tbajja tat-trikromju ta 'Masson wriet perċentwal ferm aktar baxx ta' fibrożi taħt kundizzjonijiet ta 'MS meta mqabbla ma' kundizzjonijiet ta 'kontroll fil-jum 12 tal-kultura (Fig. 3c).Filwaqt li CTCM żied il-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tat-tessut tal-qalb f'jum 12 għal livell simili għal dak tat-tessut tal-qalb frisk, ma tejbitx b'mod sinifikanti l-integrità strutturali tas-sezzjonijiet tal-qalb.
Grafika tal-bar turi kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà MTT ta' slices tal-qalb friski (D0) jew kultura tal-qalb slices għal 12-il jum jew f'kultura statika (D12 Ctrl) jew f'CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl/D12 MC, grupp wieħed minn A## tests/gruppi differenti) 0.0001 meta mqabbla ma 'D0 u **p <0.01 meta mqabbla ma' D12 Ctrl). a Bar graph turi kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà MTT ta 'slices tal-qalb friski (D0) jew tal-kultura tal-qalb slices għal 12-il jum jew f'kultura statika (D12 Ctrl) jew f'CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl , grupp wieħed differenti minn test NOVA) < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).l-istogramma turi l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà ta 'sezzjonijiet tal-qalb frisk MTT (D0) jew kultura ta' sezzjonijiet tal-qalb għal 12-il jum jew f'kultura statika (kontroll D12) jew CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刿刿燉爇切爇)戏刿牄爇爇爇爇)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测#0 测#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刪琇心脏刌切琇心脏刌戇琇牍䉍，的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ，** 〔 相比，istogramma li turi l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà MTT f'taqsimiet tal-qalb friski (D0) jew sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​għal 12-il jum f'kultura statika (kontroll D12) jew CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12)), 12 (D12 MC) sezzjonijiet/grupp minn test ANOVA f'direzzjoni waħda differenti,;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0, **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl).b Troponin-T (aħdar), connexin 43 (aħmar) u DAPI (blu) f’sezzjonijiet tal-qalb iżolati friski (D0) jew sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi (Ctrl) jew kundizzjonijiet CTCM (MC) għal 12-il jum) ta’ immaġini immunofluworexxenti rappreżentattivi (skala vojta = 100 µm). Kwantifikazzjoni tal-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices / grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda titwettaq; ####p <0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u ****p < 0.0001 C imqabbel ma' D). Kwantifikazzjoni tal-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices / grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda jitwettaq; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u ****p < 0.001 C meta mqabbel ma' D001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n) , (D12), (D12), (D1) , (D1) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni ta 'l-integrità strutturali tat-tessut kardijaku permezz ta' intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezzjonijiet / gruppi minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda mwettqa; ####p <0.0001 vs ma D0 u ****p < 0.0001 C meta mqabbla ma 'D).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) flieli/grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, one-way test ANOVA <1 䛔 䛔#0#0p0; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, one-way test ANOVA 0 人###0 曔. ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткант (D12), (D12), =77нl (D12), (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. с D12 Ctrl). Intelliġenza artifiċjali biex tikkwantifika l-integrità strutturali tat-tessut kardijaku (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezzjonijiet / grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda; ####p<0.0001 vs .D0 Għal paragun ****p < 0.0001 C imqabbel ma 'D). c Immaġini rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-tebgħa trikromju ta 'Masson (Skala bare = 500 µm) (n = 10 slices/grupp kull wieħed minn ħanżir differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda jitwettaq; ####p <0.0001 meta mqabbel ma' D0 u .***01 <pparagunat ma' D0 u ). c Immaġini rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-tebgħa trikromju ta 'Masson (Skala bare = 500 µm) (n = 10 slices / grupp kull wieħed minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda jitwettaq; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0.10. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окличественная оценка (справа) срезов сердца, окрамы нца сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свинстон свитстой, вестонтой ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immaġini rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bi tbajja' trikromju ta' Masson (skala mhux miksija = 500 µm) (n = 10 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda mwettqa; #### p <0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u ***2p <0.100pparagunat ma' D0. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尺（ （ （裸尺） （ （裸尺）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 与D0 相比 与D0 相比，D***1，．***0，，，，４；p2 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度尺尺壺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 浛#0#0 浛#0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, окрамы сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод протова факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl). c Immaġini rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni (lemin) ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bi tbajja' trikromju ta' Masson (vojt = 500 µm) (n = 10 sezzjonijiet/grupp, kull wieħed minn ħanżir differenti, ittestjat b'analiżi one-way ta 'varjanza ;### # p < 0.0001 meta mqabbel ma' D0, *** 0 p < 0.0.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Aħna ipoteżijna li billi żżid molekuli żgħar mal-mezz tal-kultura, l-integrità tal-kardjomijoċiti tista 'titjieb u l-iżvilupp tal-fibrożi jitnaqqas waqt il-kultura CTCM.Għalhekk skrijnajna għal molekuli żgħar bl-użu tal-kulturi ta 'kontroll statiku tagħna20,21 minħabba n-numru żgħir ta' fatturi ta 'konfużjoni.Dexamethasone (Dex), trijodothyronine (T3), u SB431542 (SB) ġew magħżula għal dan l-iskrin.Dawn il-molekuli żgħar preċedentement intużaw f'kulturi hiPSC-CM biex jinduċu l-maturazzjoni tal-kardjomijoċiti billi jżidu t-tul tas-sarcomere, it-tubuli T, u l-veloċità tal-konduzzjoni.Barra minn hekk, kemm Dex (glukokortikojde) kif ukoll SB huma magħrufa li jrażżnu l-infjammazzjoni29,30.Għalhekk, aħna ttestjajna jekk l-inklużjoni ta 'wieħed jew kombinazzjoni ta' dawn il-molekuli żgħar ittejjeb l-integrità strutturali tas-sezzjonijiet tal-qalb.Għall-iskrining inizjali, id-doża ta 'kull kompost intgħażlet abbażi tal-konċentrazzjonijiet komunement użati f'mudelli ta' kultura taċ-ċelluli (1 μM Dex27, 100 nM T327, u 2.5 μM SB31).Wara 12-il jum ta 'kultura, il-kombinazzjoni ta' T3 u Dex irriżulta f'integrità strutturali ottimali tal-kardjomijoċiti u remodeling fibruż minimu (Figuri Supplimentari 4 u 5).Barra minn hekk, l-użu ta 'doppju jew doppju ta' dawn il-konċentrazzjonijiet ta 'T3 u Dex ipproduċa effetti ta' ħsara meta mqabbla ma 'konċentrazzjonijiet normali (Fig. Supplimentari 6a, b).
Wara l-iskrining inizjali, wettaqna paragun minn ras għal ras ta 'kundizzjonijiet ta' kultura 4 (Figura 4a): Ctrl: sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​fil-kultura statika deskritta qabel tagħna bl-użu tal-mezz ottimizzat tagħna;20.21 TD: T3 u Ctrl s Miżjud Dex nhar l-Erbgħa;MC: sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​f'CTCM bl-użu tal-mezz ottimizzat qabel tagħna;u MT: CTCM b'T3 u Dex miżjuda mal-mezz.Wara 12-il jum ta 'kultivazzjoni, il-vijabbiltà tat-tessuti MS u MT baqgħet l-istess bħal f'tessuti friski evalwati b'assaġġ MTT (Fig. 4b).Interessanti, iż-żieda ta 'T3 u Dex għal kulturi transwell (TD) ma rriżultatx f'titjib sinifikanti fil-vijabbiltà meta mqabbla mal-kundizzjonijiet Ctrl, li jindika rwol importanti ta' stimulazzjoni mekkanika fiż-żamma tal-vijabbiltà tas-sezzjonijiet tal-qalb.
dijagramma tad-disinn sperimentali li turi l-erba' kundizzjonijiet tal-kultura użati biex jiġu evalwati l-effetti ta 'stimulazzjoni mekkanika u supplimentazzjoni T3/Dex fuq medju għal 12-il jum. b Bar graph turi kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma’ slices tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), 12 (D12 MC/grupp) minn test wieħed differenti. 0.0001, ###p < 0.001 meta mqabbel ma 'D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Bar graph turi kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma’ slices tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), 12 (D12 MC/grupp) minn test wieħed differenti. 0.0001, ###p < 0.001 meta mqabbel ma 'D0 u **p < 0.01 meta mqabbel ma' D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (D2, D18 = D1), D18 = D1, D18 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Il-bar graph turi l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà fi 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (kontroll, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma’ sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MT), 12 (D12 MC) sezzjonijiet / grupp differenti ta’ test A#0; 1, ###p < 0.001 vs D0 u **p < 0.01 meta mqabbla ma 'D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18(D150)D1、T12)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，，，D##p 01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнению сравирования ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторо,#0носторо,#0носторо,#0носторо; p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogramma li turi l-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (kontroll, TD, MC u MT) meta mqabbla ma’ sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD u D12 MT), minn ħnieżer differenti 12 (D12 MC) sezzjonijiet/grupp, test ANOVA f’direzzjoni waħda, test ANOVA f’direzzjoni waħda<; #.##0.<0. **p<0.01 vs kontroll D12). c Bar graph turi l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma’ slices tal-qalb friski (D0) (n = 6 slices/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f’direzzjoni waħda jitwettaq; ###p <0.001, meta mqabbel ma’ D0.001, meta mqabbel ma’ D0. c Bar graph turi l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura fl-4 kundizzjonijiet tal-kultura kollha (Ctrl, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma’ slices tal-qalb friski (D0) (n = 6 slices/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f’direzzjoni waħda jitwettaq; ###p <0.001, meta mqabbel ma’ D0.001, meta mqabbel ma’ D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после куль вста куль вта овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 правнению свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению Cdr D0 и ***p < 0,001 по сравнению). c L-istogramma turi kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju 12-il jum wara l-kultura taħt l-4 kundizzjonijiet kollha tal-kultura (kontroll, TD, MC u MT) meta mqabbla ma’ sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) (n = 6 sezzjonijiet/grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f’direzzjoni waħda mwettqa; ###p <0.001 meta mqabbel ma’ D0 u ***p <Ctrl 0.102. c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 ， 与D0 ， ， ， 0*** l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片片 新鲜后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ，试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послет виле послея виль 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (пра сравнению со свежими срезами сердца (D0) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по снию по D012). c Istogramma li turi l-kwantifikazzjoni tal-fluss tal-glukożju fi 12-il jum wara l-kultura għall-kundizzjonijiet kollha tal-kultura (kontroll, TD, MC, u MT) meta mqabbla ma 'taqsimiet tal-qalb friski (D0) (n = 6 sezzjonijiet/grupp, minn ħnieżer differenti, unilaterali Twettqu testijiet ANOVA, ###p <0.001 meta mqabbla ma' D0, 10.10p <D0.d Plottijiet ta 'analiżi tar-razza ta' tessuti friski (blu), jum 12 MC (aħdar), u jum 12 MT (aħmar) f'għaxar punti ta 'sezzjoni tat-tessut reġjonali (n = 4 slices / grupp, test ANOVA f'direzzjoni waħda; ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn il-gruppi).e Plott tal-vulkan li juri ġeni espressi b'mod differenzjat f'sezzjonijiet tal-qalb friski (D0) meta mqabbla ma' sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi (Ctrl) jew taħt kundizzjonijiet MT (MT) għal 10-12-il jum.f Mappa tas-sħana tal-ġeni tas-sarcomere għal sezzjonijiet tal-qalb ikkultivati ​​taħt kull waħda mill-kundizzjonijiet tal-kultura.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Id-dipendenza metabolika fuq il-bidla mill-ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi għal glycolysis hija karatteristika tad-dedifferenzjazzjoni tal-kardjomijoċiti.Kardjomijoċiti immaturi jużaw primarjament il-glukożju għall-produzzjoni ta 'ATP u għandhom mitokondrija ipoplastika bi ftit cristae5,32.L-analiżi tal-użu tal-glukosju wrew li taħt kundizzjonijiet MC u MT, l-utilizzazzjoni tal-glukosju kienet simili għal dik fit-tessuti ta 'jum 0 (Figura 4c).Madankollu, kampjuni Ctrl wrew żieda sinifikanti fl-utilizzazzjoni tal-glukosju meta mqabbla ma 'tessut frisk.Dan jindika li l-kombinazzjoni ta 'CTCM u T3/Dex ittejjeb il-vijabbiltà tat-tessuti u tippreserva l-fenotip metaboliku ta' sezzjonijiet tal-qalb kkultivati ​​ta '12-il jum.Barra minn hekk, l-analiżi tar-razza wriet li l-livelli tar-razza baqgħu l-istess bħal fit-tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum taħt kundizzjonijiet MT u MS (Fig. 4d).
Biex tanalizza l-impatt ġenerali ta 'CTCM u T3/Dex fuq il-pajsaġġ traskrizzjoni globali tat-tessut tal-porzjon tal-qalb, wettaqna RNAseq fuq flieli tal-qalb mill-erba' kundizzjonijiet tal-kultura differenti kollha (Data Supplimentari 1).Interessanti, it-taqsimiet MT wrew xebh traskrizzjonali għoli ma 'tessut tal-qalb frisk, b'16 biss espressi b'mod differenzjali minn 13,642 ġene.Madankollu, kif urejna qabel, slices Ctrl murija 1229 ġeni espressi b'mod differenzjali wara 10-12-il jum fil-kultura (Fig. 4e).Din id-dejta ġiet ikkonfermata minn qRT-PCR ta 'ġeni tal-qalb u tal-fibroblast (Fig. Supplimentari 7a-c).Interessanti, is-sezzjonijiet Ctrl wrew downregulation tal-ġeni taċ-ċiklu tal-qalb u taċ-ċelluli u attivazzjoni ta 'programmi ta' ġeni infjammatorji.Din id-dejta tissuġġerixxi li d-didifferenzazzjoni, li normalment isseħħ wara kultura fit-tul, hija kompletament attenwata taħt kundizzjonijiet MT (Fig. Supplimentari 8a, b).Studju bir-reqqa tal-ġeni tas-sarcomere wera li taħt kundizzjonijiet MT biss huma l-ġeni li jikkodifikaw is-sarcomere (Fig. 4f) u l-kanal tal-joni (Fig. 9 Supplimentari) ippreservati, u jipproteġuhom mis-soppressjoni taħt kundizzjonijiet Ctrl, TD u MC.Din id-dejta turi li b'kombinazzjoni ta 'stimulazzjoni mekkanika u umorali (T3/Dex), it-transcriptome tal-porzjon tal-qalb jista' jibqa 'similar għal flieli tal-qalb frisk wara 12-il jum fil-kultura.
Dawn is-sejbiet tat-traskrizzjoni huma sostnuti mill-fatt li l-integrità strutturali tal-kardjomijoċiti fis-sezzjonijiet tal-qalb hija l-aħjar ippreservata taħt kundizzjonijiet MT għal 12-il jum, kif muri minn connexin 43 intatt u lokalizzat (Fig. 5a).Barra minn hekk, il-fibrożi f'sezzjonijiet tal-qalb taħt kundizzjonijiet MT tnaqqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma 'Ctrl u simili għal sezzjonijiet tal-qalb friski (Fig. 5b).Din id-dejta turi li l-kombinazzjoni ta 'stimulazzjoni mekkanika u trattament T3/Dex tippreserva b'mod effettiv l-istruttura tal-qalb fis-sezzjonijiet tal-qalb fil-kultura.
a Immaġini rappreżentattivi ta’ immunofluworexxenza ta’ troponin-T (aħdar), connexin 43 (aħmar), u DAPI (blu) f’sezzjonijiet tal-qalb iżolati friski (D0) jew ikkultivati ​​għal 12-il jum fl-erba’ kundizzjonijiet kollha tal-kultura tas-sezzjonijiet tal-qalb (bar tal-iskala = 100 µm).). Kwantifikazzjoni tal-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) slices / grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda jitwettaq; ####p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u * 5 p < 0.0.0. trl). Kwantifikazzjoni tal-intelliġenza artifiċjali tal-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) flieli / grupp minn ħnieżer differenti, test ANOVA f'direzzjoni waħda jitwettaq; #### p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u * 5 p < 0.0.0. trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инт1 (Dr 1) 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0 пи,с 0 0 p < 0, с 0 0 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kwantifikazzjoni ta 'l-integrità strutturali tat-tessut tal-qalb bl-użu ta' intelliġenza artifiċjali (n = 7 (D0 u D12 ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) sezzjonijiet / grupp minn ħnieżer differenti, test ta 'ANOVA wieħed imwettaq; ##### P <0.0001 meta mqabbel ma' D0 u * p <0.05 jew **** P <0.0001 imqabbel ma 'D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 和 和 和 D12 Ctrl）工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p 或****p < 0.00001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.00001 或****p < 0.0001炯对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 mc （ 和 d12 ） 绺 mc）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相戯0 中0p < 0.05 相 戯0 且 0.相比）。Kwantifikazzjoni tal-integrità strutturali tat-tessut kardijaku bl-użu ta 'intelliġenza artifiċjali f'ħnieżer differenti (n = 7 (D0 u D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC u D12 MT) sezzjonijiet/grupp) b'test ANOVA one-way;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D0 u *p < 0.05 jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma' D12 Ctrl). b Immaġini rappreżentattivi u kwantifikazzjoni għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-tebgħa trikroma ta 'Masson (Bar ta' skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MC), 9 (D12 MT) slices/grupp minn ħnieżer differenti, one-way test ANOVA ##0 imwettaq <***0#0p0; < 0.001, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D12 Ctrl). b Immaġini rappreżentattivi u kwantifikazzjoni għal flieli tal-qalb imtebbgħin bit-tebgħa trikroma ta 'Masson (Bar ta' skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, u D12 MC), 9 (D12 MT) slices/grupp minn ħnieżer differenti, one-way test ANOVA ##0 imwettaq <***0#0p0; < 0.001, jew ****p < 0.0001 meta mqabbel ma 'D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разнод разнот разноя сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Immaġini rappreżentattivi u kwantifikazzjoni ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebba' bit-tebgħa trikromju ta' Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD u D12 MC), 9 (D12 MT) sezzjonijiet / grupp minn ħnieżer differenti, wettqu ANOVA one-way <; #0##0.p01 <; #0.##0. ****p < 0.0001 vs D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm））（D12010）（D12010（D12010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 分析； 个 析； 中 析； 01 且 析； 0 0 0 0 0. 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（ d10 （10 （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 片 切片 爇片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 分析， 片 切片/组，进行单因素方差分析， 析， 析， 0. < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / груспи,#0; 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immaġini rappreżentattivi u kwantifikazzjoni ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bit-trikromju ta' Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD u D12 MC), 9 (D12 MT) sezzjonijiet minn ħnieżer/grupp differenti, metodu wieħed ANOVA; ####0, 1 pparagunat għal < 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0.0001 meta mqabbla ma 'D12 Ctrl).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Fl-aħħarnett, il-kapaċità tas-CTCM li jimita l-ipertrofija tal-qalb ġiet evalwata billi żżid il-medda tat-tessut tal-qalb.Fis-CTCM, l-ogħla pressjoni tal-kamra tal-arja żdiedet minn 80 mmHg għal 80 mmHg.Art.(stira normali) sa 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Dan jikkorrispondi għal żieda ta '32% fil-medda (Fig. 6b), li qabel kienet murija bħala l-medda perċentwali korrispondenti meħtieġa għas-sezzjonijiet tal-qalb biex jiksbu tul tas-sarcomere simili għal dak li jidher fl-ipertrofija.Stretch u veloċità tat-tessut kardijaku waqt il-kontrazzjoni u r-rilassament baqgħu kostanti matul sitt ijiem ta 'kultura (Fig. 6c).It-tessut tal-qalb minn kundizzjonijiet MT kien soġġett għal kundizzjonijiet ta 'tiġbid normali (MT (Normal)) jew ta' tensjoni żejda (MT (OS)) għal sitt ijiem.Diġà wara erbat ijiem fil-kultura, il-bijomarkatur ipertrofiku NT-ProBNP kien elevat b'mod sinifikanti fil-medju taħt kundizzjonijiet MT (OS) meta mqabbel mal-kundizzjonijiet MT (normali) (Fig. 7a).Barra minn hekk, wara sitt ijiem ta 'kultura, id-daqs taċ-ċellula f'MT (OS) (Fig. 7b) żdied b'mod sinifikanti meta mqabbel ma' sezzjonijiet tal-qalb MT (normali).Barra minn hekk, it-traslokazzjoni nukleari NFATC4 żdiedet b'mod sinifikanti f'tessuti stirati żżejjed (Fig. 7c).Dawn ir-riżultati juru l-iżvilupp progressiv ta 'remodeling patoloġiku wara iperdistensjoni u jappoġġaw il-kunċett li l-apparat CTCM jista' jintuża bħala pjattaforma biex tistudja s-sinjalar tal-ipertrofija tal-qalb ikkaġunata minn stretch.
Traċċi rappreżentattivi tal-pressjoni tal-kamra tal-arja, pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u kejl tal-moviment tat-tessut jikkonfermaw li l-pressjoni tal-kamra tbiddel il-pressjoni tal-kamra tal-fluwidu, u tikkawża moviment korrispondenti tal-porzjon tat-tessut.b Perċentwal ta' stretch rappreżentattiv u kurvi tar-rata ta' stretch għal sezzjonijiet tat-tessuti normalment imġebbda (oranġjo) u mġebbda żżejjed (blu).c Bar graph li turi l-ħin taċ-ċiklu (n = 19 slices kull grupp, minn ħnieżer differenti), ħin tal-kontrazzjoni (n = 18-19 slices għal kull grupp, minn ħnieżer differenti), ħin ta’ rilassament (n = 19 slices għal kull grupp, minn ħnieżer differenti) ), amplitudni tal-moviment tat-tessut (n = 14 slices / grupp), peak = 14 slices / grupp, veloċità differenti minn ħnieżer differenti) u l-ogħla rata ta 'rilassament (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sezzjonijiet / gruppi) minn ħnieżer differenti), it-test t ta' Student b'żewġ denbu ma wera l-ebda differenza sinifikanti fl-ebda parametru, li jindika li dawn il-parametri baqgħu kostanti matul 6 ijiem ta 'kultura b'vultaġġ żejjed.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
a Bar graph kwantifikazzjoni tal-konċentrazzjoni NT-ProBNP fil-midja tal-kultura minn slices tal-qalb ikkultivati ​​taħt MT stretch normali (Norm) jew overstretching (OS) kundizzjonijiet (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4 MTOS) slices / grupp minn ħnieżer differenti, Two-way ANOVA hija mwettqa < 0 normali;.**1p. Kwantifikazzjoni tal-grafika tal-bar tal-konċentrazzjoni NT-ProBNP fil-midja tal-kultura minn flieli tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet MT ta 'stretch normali (Norm) jew overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4 MTOS) flieli/grupp minn ħnieżer differenti, ANOVA f'żewġ direzzjonijiet titwettaq < 0.01p normali;Istogramma kwantitattiva ta 'konċentrazzjoni NT-ProBNP fil-medju tal-kultura minn flieli tal-qalb kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' stretch MT normali (norma) jew overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, u D4).MTOS) flieli / grupp minn ħnieżer differenti, titwettaq analiżi ta 'varjanza b'żewġ fatturi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 meta mqabbel ma 'stretch normali). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡培培养的心拉伸(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分枎方差分析；丣丯攛攸析，来自不同猪的切片/组，进行双向方差分枎； 0.01）。 a Kwantifikazzjoni ta' konċentrazzjoni ta' NT-ProBNP fi slices tal-qalb ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet MT ta' stretch normali (Norm) jew ta' overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) minn differenti imqabbla ma 'tiġbid normali, p <0.01).istogramma Kwantifikazzjoni ta 'konċentrazzjonijiet NT-ProBNP fi flieli tal-qalb kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet ta' stretch MT normali (norma) jew overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) u D4 MTOS) slices/grupp minn ħnieżer differenti, analiżi f'żewġ direzzjonijiet tal-varjanza;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 meta mqabbel ma 'stretch normali). b Immaġini rappreżentattivi għal slices tal-qalb imtebbgħin bi troponin-T u WGA (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċelluli / grupp minn 10 slices differenti minn ħnieżer differenti, T-test Student t b'żewġ denbu jsir; ****0 p < 0 meta mqabbel ma '0 stretch normali). b Immaġini rappreżentattivi għal slices tal-qalb imtebbgħin bi troponin-T u WGA (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċelluli / grupp minn 10 slices differenti minn ħnieżer differenti, T-test Student t b'żewġ denbu jitwettaq; ****0 p <10 normali. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) пичлентативные ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезов от срезов от ворезов от вория тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Immaġini rappreżentattivi ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bi troponin-T u AZP (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ċelluli / grupp minn 10 sezzjonijiet differenti minn ħnieżer differenti, t-test ta' Student b'żewġ denbu twettaq; ****p < 0 normali meta mqabbel ma '0. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性左）和细胞大小量化（右) ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369 （D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生t ，学生t 棸丛丛棸丛丛漉，****p <0.0001）。 b Immaġini rappreżentattivi ta 'flieli tal-qalb imtebba' b'calcarein-T u WGA (xellug) u daqs taċ-ċelluli (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 minn 10 slices differenti (D6 MTNorm)) Ċelloli/组，两方法有尾学compared ma' testing normali. ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава и слестова) размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Крунет пи, Курнеток критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Immaġini rappreżentattivi ta 'sezzjonijiet tal-qalb imtebbgħin bi troponin-T u AZP (xellug) u kwantifikazzjoni tad-daqs taċ-ċellula (lemin) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) minn 10 sezzjonijiet differenti minn ħnieżer differenti) Ċelloli/grupp, kriterju b'żewġ denbu Student's t;****p < 0.0001 meta mqabbel ma 'strain normali). c Immaġini rappreżentattivi għal jum 0 u jum 6 flieli tal-qalb MTOS immunolabeled għal troponin-T u NFATC4 u kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni ta 'NFATC4 għan-nuklei ta' CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / grupp minn ħnieżer differenti, Two-tailed Student t-test hija mwettqa.0;05). c Immaġini rappreżentattivi għal flieli tal-qalb MTOS jum 0 u jum 6 immunolatikkettjati għal troponin-T u NFATC4 u kwantifikazzjoni tat-traslokazzjoni ta 'NFATC4 għan-nuklei ta' CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / grupp minn ħnieżer differenti, * test t-t tal-Istudent b'żewġ denbu. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тро-пон и тро-пон и трозентативные изображения для срезов сердца енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу овсов/группу оны нырта озных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Immaġini rappreżentattivi għal sezzjonijiet tal-qalb f'0 u 6 ijiem MTOS, immunotikkettati għal troponin-T u NFATC4, u kwantifikazzjoni ta 'traslokazzjoni NFATC4 fin-nukleu ta' ċelluli cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / grupp minn ħnieżer differenti) imwettqa b'żewġ denbu;*p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏的廣表怏囪帨怏囌标记的第0 天和第6 天MTOS的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 05锟t 05锟t 0. c Immaġini rappreżentattivi ta 'kalcanin-T u NFATC4 immunolatikkettjar 第0天和第6天MTOS flieli tal-qalb, u NFATC4 minn NFATC4 易位至CM nukleu taċ-ċelluli differenti的kwantità化 (n = 4 (D0), 3 (D6天和第6天天MTOS,)学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тромуномаркировки тромуномаркировки тром поТи тром поТи тром 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статх тры юдента; *p < 0,05). c Immaġini rappreżentattivi ta 'flieli tal-qalb MTOS fil-jum 0 u 6 għall-immunotikkettar ta' troponin-T u NFATC4 u kwantifikazzjoni ta 'traslokazzjoni NFATC4 fin-nukleu ta' CM minn ħnieżer differenti (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / grupp, two-tailed t -criterion < Student's.;05).Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.
Ir-riċerka kardjovaskulari translazzjonali teħtieġ mudelli ċellulari li jirriproduċu b'mod preċiż l-ambjent kardijaku.F'dan l-istudju, ġie żviluppat u kkaratterizzat apparat CTCM li jista 'jistimula sezzjonijiet ultrarqiqa tal-qalb.Is-sistema CTCM tinkludi stimulazzjoni elettromekkanika sinkronizzata fiżjoloġikament u arrikkiment tal-fluwidu T3 u Dex.Meta sezzjonijiet tal-qalb tal-ħnieżer kienu esposti għal dawn il-fatturi, il-vijabbiltà, l-integrità strutturali, l-attività metabolika u l-espressjoni tat-traskrizzjoni tagħhom baqgħu l-istess bħal fit-tessut tal-qalb frisk wara 12-il jum ta 'kultura.Barra minn hekk, tiġbid eċċessiv tat-tessut kardijaku jista 'jikkawża ipertrofija tal-qalb ikkawżata minn iperestensjoni.B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jappoġġjaw ir-rwol kritiku tal-kundizzjonijiet tal-kultura fiżjoloġika fiż-żamma ta 'fenotip kardijaku normali u jipprovdu pjattaforma għall-iskrinjar tad-droga.
Ħafna fatturi jikkontribwixxu biex jinħoloq ambjent ottimali għall-funzjonament u s-sopravivenza tal-kardjomijoċiti.L-aktar ovvji ta 'dawn il-fatturi huma relatati ma' (1) interazzjonijiet interċellulari, (2) stimulazzjoni elettromekkanika, (3) fatturi umorali, u (4) sottostrati metaboliċi.L-interazzjonijiet fiżjoloġiċi minn ċellula għal ċellula jeħtieġu netwerks kumplessi tridimensjonali ta’ tipi multipli ta’ ċelluli appoġġjati minn matriċi extraċellulari.Interazzjonijiet ċellulari kumplessi bħal dawn huma diffiċli biex jinbnew mill-ġdid in vitro permezz ta 'kokultura ta' tipi ta 'ċelluli individwali, iżda jistgħu jinkisbu faċilment bl-użu tan-natura organotipika tas-sezzjonijiet tal-qalb.
Stretch mekkaniku u stimulazzjoni elettrika tal-kardjomijoċiti huma kritiċi għaż-żamma tal-fenotip tal-qalb33,34,35.Filwaqt li l-istimulazzjoni mekkanika ntużat ħafna għall-kondizzjonament u l-maturazzjoni tal-hiPSC-CM, bosta studji eleganti reċentement ippruvaw stimulazzjoni mekkanika ta 'flieli tal-qalb fil-kultura bl-użu ta' tagħbija uniaxial.Dawn l-istudji juru li t-tagħbija mekkanika uniaxial 2D għandha effett pożittiv fuq il-fenotip tal-qalb waqt il-kultura.F'dawn l-istudji, sezzjonijiet tal-qalb kienu jew mgħobbija b'forzi ta 'tensjoni isometriċi17, tagħbija auxotonic lineari18, jew iċ-ċiklu kardijaku ġie rikrejat bl-użu ta' feedback tat-transducer tal-forza u drives tat-tensjoni.Madankollu, dawn il-metodi jużaw stretch uniaxial tat-tessut mingħajr ottimizzazzjoni ambjentali, li jirriżulta fit-trażżin ta 'ħafna ġeni kardijaċi jew espressjoni żejda ta' ġeni assoċjati ma 'reazzjonijiet ta' stretch anormali.Is-CTCM deskritt hawn jipprovdi stimolu elettromekkaniku 3D li jimita ċ-ċiklu kardijaku naturali f'termini ta 'ħin taċ-ċiklu u stretch fiżjoloġiku (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, u 72 taħbita kull minuta).Għalkemm din l-istimulazzjoni mekkanika tridimensjonali waħedha mhix biżżejjed biex iżżomm l-integrità tat-tessut, taħlita ta 'stimulazzjoni umorali u mekkanika li tuża T3/Dex hija meħtieġa biex iżżomm b'mod adegwat il-vijabbiltà, il-funzjoni u l-integrità tat-tessut.
Fatturi umorali għandhom rwol importanti fil-modulazzjoni tal-fenotip tal-qalb adult.Dan kien enfasizzat fi studji HiPS-CM li fihom T3 u Dex ġew miżjuda mal-midja tal-kultura biex titħaffef il-maturazzjoni taċ-ċelluli.T3 jista' jinfluwenza t-trasport ta' aċidi amminiċi, zokkor u kalċju tul il-membrani taċ-ċelluli36.Barra minn hekk, T3 jippromwovi l-espressjoni MHC-α u t-tnaqqis ta 'MHC-β, jippromwovi l-formazzjoni ta' myofibrils twitch veloċi f'kardjomijoċiti maturi meta mqabbla ma 'myofibrils twitch bil-mod f'CM fetali.Defiċjenza ta' T3 f'pazjenti b'ipotirojde tirriżulta fit-telf ta' meded mijofibrillari u rata mnaqqsa ta' żvilupp tat-ton37.Dex jaġixxi fuq riċetturi tal-glukokortikojdi u ntwera li jżid il-kuntrattilità mijokardijaka f'qlub perfused iżolati;38 dan it-titjib huwa maħsub li huwa relatat mal-effett fuq id-dħul immexxi minn depożiti tal-kalċju (SOCE) 39,40.Barra minn hekk, Dex jeħel mar-riċetturi tiegħu, u jikkawża rispons intraċellulari wiesa 'li jrażżan il-funzjoni immuni u l-infjammazzjoni30.
Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-istimulazzjoni fiżika mekkanika (MS) tejbet il-prestazzjoni ġenerali tal-kultura meta mqabbla ma 'Ctrl, iżda naqset milli żżomm il-vijabbiltà, l-integrità strutturali u l-espressjoni kardijaka fuq 12-il jum fil-kultura.Meta mqabbel ma 'Ctrl, iż-żieda ta' T3 u Dex ma 'kulturi CTCM (MT) tejbet il-vijabbiltà u żammet profili ta' traskrizzjoni simili, integrità strutturali u attività metabolika b'tessut tal-qalb frisk għal 12-il jum.Barra minn hekk, billi tikkontrolla l-grad ta 'medda tat-tessuti, inħoloq mudell ta' ipertrofija kardijaka kkaġunata minn iperestensjoni bl-użu ta 'STCM, li juri l-versatilità tas-sistema STCM.Għandu jiġi nnutat li għalkemm ir-rimodelazzjoni tal-qalb u l-fibrożi normalment jinvolvu organi intatti li ċ-ċelloli li jiċċirkolaw tagħhom jistgħu jipprovdu ċ-ċitokini xierqa kif ukoll fagoċitosi u fatturi oħra ta 'rimodellar, sezzjonijiet tal-qalb xorta jistgħu jimitaw il-proċess fibrotiku b'reazzjoni għal stress u trawma.f'myofibroblasts.Dan ġie evalwat qabel f'dan il-mudell tal-porzjon tal-qalb.Għandu jiġi nnutat li l-parametri CTCM jistgħu jiġu modulati billi jinbidlu l-amplitudni u l-frekwenza tal-pressjoni/elettriku biex jissimulaw ħafna kundizzjonijiet bħal takikardija, bradikardija, u appoġġ ċirkolatorju mekkaniku (qalb mekkanika mhux mgħobbija).Dan jagħmel is-sistema throughput medju għall-ittestjar tad-droga.Il-kapaċità tas-CTCM li timmudella l-ipertrofija tal-qalb indotta minn sforz żejjed twitti t-triq għall-ittestjar ta 'din is-sistema għal terapija personalizzata.Bħala konklużjoni, l-istudju preżenti juri li stretch mekkaniku u stimulazzjoni umorali huma kritiċi għaż-żamma tal-kultura ta 'sezzjonijiet tat-tessut kardijaku.
Għalkemm id-dejta ppreżentata hawn tissuġġerixxi li CTCM hija pjattaforma promettenti ħafna għall-immudellar ta 'mijokardju intatt, dan il-metodu ta' kultura għandu xi limitazzjonijiet.Il-limitazzjoni ewlenija tal-kultura CTCM hija li timponi tensjonijiet mekkaniċi dinamiċi kontinwi fuq il-flieli, li tipprekludi l-abbiltà li tissorvelja b'mod attiv il-kontrazzjonijiet tal-qatgħat tal-qalb matul kull ċiklu.Barra minn hekk, minħabba d-daqs żgħir tas-sezzjonijiet tal-qalb (7 mm), il-kapaċità li tiġi evalwata l-funzjoni sistolika barra mis-sistemi tal-kultura li jużaw sensuri tal-forza tradizzjonali hija limitata.Fil-manuskritt attwali, aħna parzjalment negħlbu din il-limitazzjoni billi nevalwaw il-vultaġġ ottiku bħala indikatur tal-funzjoni kontrattili.Madankollu, din il-limitazzjoni se teħtieġ aktar xogħol u tista 'tiġi indirizzata fil-futur billi jiġu introdotti metodi għall-monitoraġġ ottiku tal-funzjoni tal-qatgħat tal-qalb fil-kultura, bħall-immappjar ottiku bl-użu ta' żebgħat sensittivi għall-kalċju u l-vultaġġ.Limitazzjoni oħra tas-CTCM hija li l-mudell tax-xogħol ma jimmanipulax stress fiżjoloġiku (preload u afterload).F'CTCM, pressjoni ġiet indotta f'direzzjonijiet opposti biex tirriproduċi medda fiżjoloġika ta '25% fid-dijastole (stretch sħiħ) u s-sistole (tul ta' kontrazzjoni waqt stimulazzjoni elettrika) f'tessuti kbar ħafna.Din il-limitazzjoni għandha titneħħa f'disinji futuri ta 'CTCM permezz ta' pressjoni adegwata fuq it-tessut tal-qalb miż-żewġ naħat u billi jiġu applikati r-relazzjonijiet eżatti ta 'pressjoni-volum li jseħħu fil-kmamar tal-qalb.
Ir-remodeling ikkaġunat mill-overstretch irrappurtat f'dan il-manuskritt huwa limitat biex jimita sinjali hypertrophic hyperstretch.Għalhekk, dan il-mudell jista 'jgħin fl-istudju ta' sinjalazzjoni ipertrofika indotta minn stretch mingħajr il-ħtieġa ta 'fatturi umorali jew newrali (li ma jeżistux f'din is-sistema).Hemm bżonn ta 'aktar studji biex tiżdied il-multipliċità ta' CTCM, pereżempju, ko-kultivazzjoni ma 'ċelloli immuni, fatturi umorali tal-plażma li jiċċirkolaw, u innervazzjoni meta ko-kultura ma' ċelloli newronali se jtejjeb il-possibbiltajiet ta 'immudellar ta' mard b'CTCM.
F'dan l-istudju ntużaw tlettax-il ħanżir.Il-proċeduri kollha tal-annimali twettqu skont il-linji gwida istituzzjonali u ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università ta 'Louisville.L-arkata aortika ġiet ikklampjata u l-qalb ġiet imxerrda b'1 L ta 'kardjopleġija sterili (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL eparina, pH sa 7.4); il-qlub ġew ippreservati f'soluzzjoni kardjoplegika kiesħa bis-silġ sakemm ittrasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ li ġeneralment ikun <10 min. il-qlub ġew ippreservati f'soluzzjoni kardjoplegika kiesħa bis-silġ sakemm ittrasportati lejn il-laboratorju fuq is-silġ li ġeneralment ikun <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на лчдию на лчби на ет <10 мин. qlub kienu maħżuna f'soluzzjoni cardioplegic kiesħa bis-silġ sakemm it-trasport lejn il-laboratorju fuq is-silġ, li normalment jieħu <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Żomm il-qlub fuq kardjopleġija tas-silġ sakemm ittrasporta lejn il-laboratorju fuq is-silġ, ġeneralment <10 min.
L-apparat CTCM ġie żviluppat fis-softwer SolidWorks tad-disinn assistit mill-kompjuter (CAD).Il-kmamar tal-kultura, id-diviżuri u l-kmamar tal-arja huma magħmula minn plastik akriliku ċar CNC.Iċ-ċirku ta 'back-up b'dijametru ta' 7mm huwa magħmul minn polyethylene ta 'densità għolja (HDPE) fiċ-ċentru u għandu kanal o-ring biex jakkomoda l-o-ring tas-silikonju użat biex jissiġilla l-midja taħt.Membrana rqiqa tas-silika tifred il-kamra tal-kultura mill-pjanċa tas-separazzjoni.Il-membrana tas-silikonju hija maqtugħa bil-lejżer minn folja tas-silikonju ħoxna ta '0.02″ u għandha ebusija ta' 35A.Is-siegli tas-silikonju tal-qiegħ u ta 'fuq huma maqtugħin bil-lejżer minn folja tas-silikonju ħoxna ta' 1/16″ u għandhom ebusija ta '50A.Viti ta 'l-istainless steel 316L u ġewż tal-ġwienaħ huma użati għall-irbit tal-blokka u l-ħolqien ta' siġill mitbuq.
Bord ta 'ċirkwit stampat iddedikat (PCB) huwa ddisinjat biex jiġi integrat mas-sistema C-PACE-EM.Is-sokits tal-konnettur tal-magna Svizzera fuq il-PCB huma konnessi ma 'elettrodi tal-grafita permezz ta' wajers tar-ram miksi bil-fidda u viti tal-bronż 0-60 invitati fl-elettrodi.Il-bord taċ-ċirkwit stampat jitqiegħed fil-qoxra tal-printer 3D.
L-apparat CTCM huwa kkontrollat ​​minn attwatur pnewmatiku programmabbli (PPD) li joħloq pressjoni ċirkolatorja kkontrollata simili għal ċiklu kardijaku.Hekk kif tiżdied il-pressjoni ġewwa l-kamra tal-arja, il-membrana tas-silikonju flessibbli tespandi 'l fuq, u ġġiegħel il-medju taħt is-sit tat-tessut.Iż-żona tat-tessut imbagħad tiġi mġebbda b'din it-tkeċċija tal-fluwidu, li timita l-espansjoni fiżjoloġika tal-qalb waqt id-dijastole.Fil-quċċata tar-rilassament, l-istimulazzjoni elettrika ġiet applikata permezz ta 'elettrodi tal-grafita, li naqqsu l-pressjoni fil-kamra tal-arja u kkawżaw kontrazzjoni tas-sezzjonijiet tat-tessut.Ġewwa l-pajp hemm valv emostatiku b'sensor tal-pressjoni biex tiskopri l-pressjoni fis-sistema tal-arja.Il-pressjoni sensata mis-sensor tal-pressjoni hija applikata għal kollettur tad-dejta konness mal-laptop.Dan jippermetti monitoraġġ kontinwu tal-pressjoni ġewwa l-kamra tal-gass.Meta ntlaħqet il-pressjoni massima tal-kamra (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), l-apparat tal-akkwist tad-dejta ġie ordnat jibgħat sinjal lis-sistema C-PACE-EM biex jiġġenera sinjal ta 'vultaġġ bifażiku għal 2 ms, issettjat għal 4 V.
Inkisbu sezzjonijiet tal-qalb u twettqu l-kundizzjonijiet tal-kultura f'6 bjar kif ġej: Ittrasferixxi l-qlub maħsuda mill-bastiment tat-trasferiment għal trej li fih kardjopleġija kiesħa (4° C.).Il-ventrikolu tax-xellug kien iżolat b'xafra sterili u maqtugħ f'biċċiet ta '1-2 cm3.Dawn il-blokki tat-tessuti ġew imwaħħla ma 'appoġġi tat-tessuti b'adeżiv tat-tessuti u mqiegħda f'banju tat-tessuti tal-mikrotomu li jivvibra li fih is-soluzzjoni ta' Tyrode u kontinwament ossiġenati (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), (6 mM. ), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M soluzzjoni), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M soluzzjoni), sa 1 L ddH2O).Il-mikrotomu li jivvibra kien issettjat biex jaqta 'flieli ħoxnin ta' 300 µm bi frekwenza ta '80 Hz, amplitudni ta' vibrazzjoni orizzontali ta '2 mm, u rata bil-quddiem ta' 0.03 mm/s.Il-banju tat-tessuti kien imdawwar bis-silġ biex iżżomm is-soluzzjoni friska u t-temperatura nżammet f'4°C.Ittrasferixxi sezzjonijiet tat-tessut mill-banju tal-mikrotomu għal banju ta' inkubazzjoni li jkun fih soluzzjoni ta' Tyrode ossiġenata kontinwament fuq is-silġ sakemm jinkisbu biżżejjed sezzjonijiet għal pjanċa ta' kultura waħda.Għal kulturi transwell, sezzjonijiet tat-tessut ġew imwaħħla ma 'supports tal-polyurethane sterili ta' 6 mm wiesa 'u mqiegħda f'6 ml ta' medju ottimizzat (199 medium, 1x suppliment ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline u 2X antibijotiku-antifungali).Stimulazzjoni elettrika (10 V, frekwenza 1.2 Hz) ġiet applikata għas-sezzjonijiet tat-tessuti permezz tas-C-Pace.Għal kundizzjonijiet TD, T3 u Dex friski ġew miżjuda f'100 nM u 1 μM f'kull bidla fil-medju.Il-medju huwa saturat bl-ossiġnu qabel is-sostituzzjoni 3 darbiet kuljum.Sezzjonijiet tat-tessuti ġew ikkultivati ​​f'inkubatur f'37 ° C u 5% CO2.
Għal kulturi CTCM, sezzjonijiet tat-tessuti tqiegħdu fuq printer 3D magħmul apposta f'dixx Petri li kien fih soluzzjoni ta 'Tyrode modifikata.L-apparat huwa ddisinjat biex iżid id-daqs tal-porzjon tal-qalb b'25% tal-erja taċ-ċirku ta 'appoġġ.Dan isir sabiex is-sezzjonijiet tal-qalb ma jiġġebbedx wara li jiġu trasferiti mis-soluzzjoni ta 'Tyrode għall-medium u waqt id-dijastole.Bl-użu ta 'kolla istoakrilika, sezzjonijiet ta' 300 µm ħxuna ġew imwaħħla fuq ċirku ta 'appoġġ b'dijametru ta' 7 mm.Wara li twaħħal is-sezzjonijiet tat-tessuti maċ-ċirku ta 'appoġġ, aqta' s-sezzjonijiet tat-tessuti żejda u poġġi s-sezzjonijiet tat-tessuti mwaħħla lura fil-banju tas-soluzzjoni Tyrode fuq is-silġ (4°C) sakemm ikunu ġew ippreparati biżżejjed sezzjonijiet għal apparat wieħed.Il-ħin totali tal-ipproċessar għall-apparati kollha m'għandux jaqbeż is-sagħtejn.Wara li 6 sezzjonijiet tat-tessuti ġew imwaħħla maċ-ċrieki ta 'appoġġ tagħhom, l-apparat CTCM ġie mmuntat.Il-kamra tal-kultura CTCM hija mimlija minn qabel b'21 ml medju ossiġenat minn qabel.Ittrasferixxi s-sezzjonijiet tat-tessuti fil-kamra tal-kultura u neħħi bir-reqqa kwalunkwe bżieżaq tal-arja b'pipetta.Is-sezzjoni tat-tessut imbagħad tiġi ggwidata fit-toqba u ppressata bil-mod fil-post.Fl-aħħarnett, poġġi l-għatu tal-elettrodu fuq l-apparat u ttrasferixxi l-apparat għall-inkubatur.Imbagħad qabbad is-CTCM mat-tubu tal-arja u s-sistema C-PACE-EM.L-attwatur pnewmatiku jiftaħ u l-valv ta 'l-arja jiftaħ is-CTCM.Is-sistema C-PACE-EM ġiet ikkonfigurata biex tagħti 4 V f'1.2 Hz waqt pacing bifażiku għal 2 ms.Il-mezz inbidel darbtejn kuljum u l-elettrodi nbidlu darba kuljum biex tiġi evitata l-akkumulazzjoni tal-grafita fuq l-elettrodi.Jekk meħtieġ, sezzjonijiet tat-tessuti jistgħu jitneħħew mill-bjar tal-kultura tagħhom biex ikeċċu kwalunkwe bżieżaq tal-arja li setgħu waqgħu taħthom.Għal kundizzjonijiet ta 'trattament MT, T3/Dex ġie miżjud frisk ma' kull bidla fil-medja b'100 nM T3 u 1 μM Dex.L-apparati CTCM ġew ikkultivati ​​f'inkubatur f'37 ° C u 5% CO2.
Biex tikseb trajettorji mġebbda ta 'flieli tal-qalb, ġiet żviluppata sistema ta' kamera speċjali.Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Ġappun) intużat ma' lenti makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Il-viżwalizzazzjoni saret f'temperatura tal-kamra wara li ssostitwixxa l-medju b'medju frisk.Il-kamera hija pożizzjonata f'angolu ta '51° u l-vidjo huwa rreġistrat bi 30 frejm kull sekonda.L-ewwel, softwer ta 'sors miftuħ (MUSCLEMOTION43) intuża ma' Image-J biex jikkwantifika l-moviment tal-flieli tal-qalb.Il-maskra nħolqot bl-użu ta 'MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) biex tiddefinixxi reġjuni ta' interess għat-taħbit tal-biċċiet tal-qalb biex jiġi evitat l-istorbju.Maskri segmentati manwalment huma applikati għall-immaġini kollha f'sekwenza ta 'qafas u mbagħad mgħoddija lill-plug-in MUSCLEMOTION.Muscle Motion juża l-intensità medja tal-pixels f'kull qafas biex jikkwantifika l-moviment tiegħu relattiv għall-qafas ta 'referenza.Id-dejta ġiet irreġistrata, iffiltrata u użata biex tikkwantifika l-ħin taċ-ċiklu u tevalwa l-medda tat-tessut matul iċ-ċiklu tal-qalb.Il-video rreġistrat ġie pproċessat wara bl-użu ta 'filtru diġitali ta' fażi żero tal-ewwel ordni.Biex tikkwantifika l-medda tat-tessuti (peak-to-peak), saret analiżi minn peak-to-peak biex tiddistingwi bejn il-qċaċet u l-ħwat fis-sinjal irreġistrat.Barra minn hekk, id-detrending jitwettaq bl-użu ta 'polinomju tas-6 ordni biex jiġi eliminat id-drift tas-sinjal.Il-kodiċi tal-programm ġie żviluppat f'MATLAB biex jiddetermina l-moviment globali tat-tessut, il-ħin taċ-ċiklu, il-ħin tar-rilassament u l-ħin tal-kontrazzjoni (Kodiċi Supplimentari tal-Programm 44).
Għall-analiżi tar-razza, bl-użu tal-istess vidjows maħluqa għall-valutazzjoni tal-medda mekkanika, l-ewwel intraċċajna żewġ immaġini li jirrappreżentaw il-qċaċet tal-moviment (l-ogħla (fuq) u l-aktar baxx (aktar baxx) punti ta 'moviment) skont is-softwer MUSCLEMOTION.Imbagħad issegmentajna r-reġjuni tat-tessuti u applikajna forma ta 'algoritmu ta' dell għat-tessut segmentat (Fig. 2a Supplimentari).It-tessut segmentat imbagħad ġie maqsum f'għaxar subsurfaces, u l-istress fuq kull wiċċ ġie kkalkulat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, fejn Sup u Sdown huma d-distanzi tal-forma mid-dellijiet ta 'fuq u ta' isfel tad-drapp, rispettivament (Fig. Supplimentari .2b).
Is-sezzjonijiet tal-qalb ġew iffissati f'4% paraformaldehyde għal 48 siegħa.Tessuti fissi ġew deidrati f'10% u 20% sukrożju għal siegħa, imbagħad fi 30% sukrożju matul il-lejl.Is-sezzjonijiet imbagħad ġew inkorporati f'kompost tat-temperatura ottimali tat-tqattigħ (kompost OCT) u ffriżati gradwalment f'banju isopentane/silġ niexef.Aħżen il-blokki tal-inkorporazzjoni tal-OCT f'-80 °C sakemm tissepara.Slajds ġew ippreparati bħala sezzjonijiet bi ħxuna ta '8 μm.
Biex tneħħi l-OCT mis-sezzjonijiet tal-qalb, saħħan il-pjastri fuq blokka tat-tisħin f'95 °C għal 5 min.Żid 1 ml PBS ma' kull slide u inkuba għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra, imbagħad ħallat it-taqsimiet billi tissettja 0.1% Triton-X f'PBS għal 15-il minuta f'temperatura ambjentali.Biex tevita li l-antikorpi mhux speċifiċi jorbtu mal-kampjun, żid 1 ml ta' 3% soluzzjoni ta' BSA ma' slides u inkuba għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Il-BSA mbagħad tneħħa u l-pjastri ġew maħsula bil-PBS.Immarka kull kampjun b'lapes.Antikorpi primarji (dilwiti 1:200 f'1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) u troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ġew miżjuda fuq 90 minuta, imbagħad sekondarja f'antikorpi 14% BSAdilu kontra 14 BSAdilu (Alexa) (Thermo Scientific; #A16079), kontra l-fenek Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) għal 90 minuta addizzjonali Maħsul 3 darbiet b’PBS Biex niddistingwi t-tbajja’ fil-mira mill-isfond, użajna biss l-antikorp sekondarju bħala kontroll. u mikroskopju Keyence b'ingrandiment ta '40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) f'5 μg/ml f'PBS intuża għat-tbajja' WGA u ġie applikat għal sezzjonijiet fissi għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra.Il-pjastri mbagħad ġew maħsula bil-PBS u l-iswed tas-Sudan ġie miżjud ma 'kull slide u inkubat għal 30 minuta.Il-pjastri mbagħad ġew maħsula bil-PBS u ġie miżjud mezz ta 'inkorporazzjoni ta' vectashield.Slajds ġew viżwalizzati fuq mikroskopju Keyence b'ingrandiment ta '40x.
OCT tneħħa mill-kampjuni kif deskritt hawn fuq.Wara li tneħħi l-OCT, għaddas il-pjastri fis-soluzzjoni ta’ Bouin matul il-lejl.Il-pjastri mbagħad ġew laħlaħ b'ilma distillat għal siegħa u mbagħad imqiegħda f'soluzzjoni ta 'fuchsin ta' Bibrich aloe acid għal 10 minuti.Imbagħad il-pjastri ġew maħsula b'ilma distillat u mqiegħda f'soluzzjoni ta '5% fosfomolibdenu/5% aċidu fosfotungstiku għal 10 minuti.Mingħajr tlaħliħ, ittrasferixxi l-pjastri direttament fis-soluzzjoni blu anilina għal 15-il minuta.Imbagħad il-pjastri ġew maħsula b'ilma distillat u mqiegħda f'soluzzjoni ta 'aċidu aċetiku ta' 1% għal 2 minuti.Slajds ġew imnixxfa f'200 N etanol u trasferiti għal xylene.Slajds mtebbgħin ġew viżwalizzati bl-użu ta 'mikroskopju Keyence b'għan 10x.Il-perċentwal taż-żona tal-fibrożi ġie kkwantifikat bl-użu tas-softwer Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numru tal-katalgu V13154, skont il-protokoll tal-manifattur b'xi modifiki.B'mod partikolari, intuża punch kirurġiku b'dijametru ta '6 mm biex jiżgura daqs uniformi tat-tessut waqt l-analiżi MTT.It-tessuti ġew ibbanjati individwalment fil-bjar ta 'pjanċa ta' 12-il bir li kien fih sottostrat MTT skont il-protokoll tal-manifattur.Is-sezzjonijiet huma inkubati f'37 ° C għal 3 sigħat u t-tessut ħaj jimmetabolizza s-sottostrat MTT biex jifforma kompost formazan vjola.Ibdel is-soluzzjoni MTT b'1 ml DMSO u inkuba f'37 °C għal 15-il minuta biex jiġi estratt formazan vjola minn sezzjonijiet tal-qalb.Il-kampjuni ġew dilwiti 1:10 f'DMSO fi pjanċi tal-qiegħ ċari ta '96 u l-intensità tal-kulur vjola mkejla f'570 nm bl-użu ta' qarrej tal-pjanċa Cytation (BioTek).Il-qari kien normalizzat għall-piż ta 'kull porzjon tal-qalb.
Il-midja tal-porzjon tal-qalb ġiet sostitwita b'midja li fiha 1 μCi/ml [5-3H]-glukosju (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) għall-analiżi tal-użu tal-glukosju kif deskritt qabel.Wara 4 sigħat ta' inkubazzjoni, żid 100 µl ta' medium ma' tubu mikroċentrifugu miftuħ li jkun fih 100 µl ta' 0.2 N HCl.Imbagħad it-tubu tqiegħed f'tubu ta' tpetpet li kien fih 500 μl ta' dH2O biex jevapora [3H]2O għal 72 siegħa f'37°C.Imbagħad neħħi t-tubu tal-mikroċentrifuga mit-tubu ta' tpetpet u żid 10 ml ta' fluwidu ta' tpetpet.L-għadd ta' tpetpett twettqu bl-użu ta' analizzatur ta' tpetpet likwidu Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).L-utilizzazzjoni tal-glukożju mbagħad ġiet ikkalkolata b'kont meħud tal-attività speċifika tal-[5-3H]-glukożju, l-ekwilibriju mhux komplut u l-isfond, id-dilwizzjoni ta '[5-3H]-għal glukożju mhux tikkettat, u l-effiċjenza tal-counter ta' xintillation.Id-dejta hija normalizzata għall-massa ta 'sezzjonijiet tal-qalb.
Wara l-omoġenizzazzjoni tat-tessut fi Trizol, l-RNA ġie iżolat minn sezzjonijiet tal-qalb bl-użu tal-Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 skont il-protokoll tal-manifattur.Il-preparazzjoni tal-librerija RNAsec, is-sekwenzjar u l-analiżi tad-dejta saru kif ġej:
1 μg ta 'RNA għal kull kampjun intuża bħala materjal tal-bidu għall-preparazzjoni tal-librerija RNA.Il-libreriji tas-sekwenzjar ġew iġġenerati bl-użu tal-Kit ta 'Preparazzjoni tal-Librerija NEBNext UltraTM RNA għal Illumina (NEB, USA) wara r-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur, u ġew miżjuda kodiċijiet tal-indiċi mas-sekwenzi tal-attributi għal kull kampjun.Fil-qosor, l-mRNA ġie ppurifikat mill-RNA totali bl-użu ta 'żibeġ manjetiċi mwaħħla ma' oligonukleotidi poly-T.Il-frammentazzjoni titwettaq bl-użu ta' katjoni divalenti f'temperatura għolja f'NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).L-ewwel linja cDNA ġiet sintetizzata bl-użu ta' primers hexamer każwali u M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).It-tieni linja cDNA hija mbagħad sintetizzata bl-użu tad-DNA polymerase I u RNase H. Il-parti li jifdal huma kkonvertiti fi truf ċatti b'attività exonuclease/polymerase.Wara l-adenilazzjoni tat-tarf 3′ tal-framment tad-DNA, Adapter NEBNext bi struttura ta 'linja ta' hairpin huwa mwaħħal miegħu biex jippreparah għall-ibridizzazzjoni.Għall-għażla ta 'frammenti ta' cDNA ta 'tul preferut 150-200 bp.frammenti tal-librerija ġew ippurifikati bl-użu tas-sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Imbagħad, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) b'cDNA magħżula fid-daqs ligated b'adapter intużat għal 15-il minuta f'37 ° C u mbagħad għal 5 minuti f'95 ° C qabel PCR.PCR imbagħad twettaq bl-użu ta ' Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primers PCR universali, u primers ta ' l-Indiċi (X).Fl-aħħarnett, il-prodotti PCR ġew ippurifikati (sistema AMPure XP) u l-kwalità tal-librerija ġiet ivvalutata fuq sistema Agilent Bioanalyzer 2100.Il-librerija tal-cDNA mbagħad ġiet sekwenzata bl-użu ta' sekwencer Novaseq.Fajls tal-immaġni mhux ipproċessati minn Illumina ġew konvertiti għal qari mhux ipproċessati bl-użu ta 'CASAVA Base Calling.Id-dejta mhux ipproċessata tinħażen f'fajls tal-format FASTQ(fq) li fihom sekwenzi qari u kwalitajiet bażi korrispondenti.Agħżel HISAT2 biex tqabbel il-qari ta' sekwenzar iffiltrat mal-ġenoma ta' referenza Sscrofa11.1.B'mod ġenerali, HISAT2 jappoġġja ġenomi ta 'kull daqs, inklużi ġenomi akbar minn 4 biljun bażi, u l-valuri awtomatiċi huma stabbiliti għall-biċċa l-kbira tal-parametri.Splicing qari mid-data RNA Seq jistgħu jiġu allinjati b'mod effiċjenti bl-użu HISAT2, l-aktar sistema mgħaġġla disponibbli bħalissa, bl-istess preċiżjoni jew aħjar minn kwalunkwe metodu ieħor.
L-abbundanza ta 'traskrizzjonijiet tirrifletti direttament il-livell ta' espressjoni tal-ġeni.Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni huma evalwati mill-abbundanza ta' traskrizzjonijiet (għadd ta' sekwenzar) assoċjati mal-ġenoma jew l-esoni.In-numru ta 'qari huwa proporzjonali għal-livelli ta' espressjoni tal-ġeni, it-tul tal-ġeni, u l-fond tas-sekwenzjar.FPKM (frammenti għal kull elf pari bażi ta 'traskrizzjoni sekwenzata għal kull miljun par bażi) ġew ikkalkulati u l-valuri P ta' espressjoni differenzjali ġew determinati bl-użu tal-pakkett DESeq2.Imbagħad ikkalkulajna r-rata ta 'skoperta falza (FDR) għal kull valur P bl-użu tal-metodu Benjamini-Hochberg9 ibbażat fuq il-funzjoni R integrata "p.adjust".
RNA iżolat minn sezzjonijiet tal-qalb ġie kkonvertit għal cDNA f'konċentrazzjoni ta '200 ng/μl bl-użu tat-taħlita SuperScript IV Vilo Master minn Thermo (Thermo, cat. nru 11756050).RT-PCR kwantitattiv sar bl-użu ta 'Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well trasparenti ta' reazzjoni pjanċa (Thermo, cat. Nru. 4483319) u adeżiv ottiku mikroamp (Thermo, cat. Nru. 4311971).It-taħlita ta' reazzjoni kienet tikkonsisti f'taħlita ta' 5 µl Taqman Fast Advanced Master (Thermo, qattus # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer u 3.5 µl H2O mħallta f'kull bir.Twettqu ċikli standard ta’ qPCR u tkejlu l-valuri CT bl-użu ta’ strument Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR f’ħin reali (modulu 384-well; prodott # A28135).Primers Taqman inxtraw minn Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1) GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Il-valur tal-kampjuni kollha ġew innormalizzati għall-ġbir tal-kampjuni CTDH.
Ir-rilaxx tal-midja ta 'NT-ProBNP ġie vvalutat bl-użu tal-kit NT-ProBNP (majjal) (Kat. Nru MBS2086979, MyBioSource) skont il-protokoll tal-manifattur.Fil-qosor, 250 µl ta' kull kampjun u standard ġew miżjuda f'żewġ kopji għal kull bir.Immedjatament wara li żżid il-kampjun, żid 50 µl ta' Reaġent A tal-Assaġġi ma' kull bir.Ħawwad bil-mod il-pjanċa u ssiġilla b'siġillant.Imbagħad il-pilloli ġew inkubati f'37 ° C għal siegħa.Imbagħad aspira s-soluzzjoni u aħsel il-bjar 4 darbiet b'350 µl ta' soluzzjoni tal-ħasil 1X, inkuba s-soluzzjoni tal-ħasil għal 1-2 minuti kull darba.Imbagħad żid 100 µl ta' Assay Reagent B għal kull bir u ssiġilla b'plate sealant.Il-pillola tħawwad bil-mod u inkubata f'37°C għal 30 minuta.Aspira s-soluzzjoni u aħsel il-bjar 5 darbiet bi 350 µl ta' soluzzjoni tal-ħasil 1X.Żid 90 µl ta' soluzzjoni ta' substrat ma' kull bir u ssiġilla l-pjanċa.Inkuba l-pjanċa f'37°C għal 10-20 minuta.Żid 50 µl Soluzzjoni ta' Stop ma' kull bir.Il-pjanċa tkejjel immedjatament bl-użu ta 'qarrej tal-pjanċa Cytation (BioTek) issettjat f'450 nm.
Twettqu analiżi tal-qawwa biex jintgħażlu d-daqsijiet tal-grupp li se jipprovdu> 80% qawwa biex tinstab bidla assoluta ta '10% fil-parametru b'rata ta' żball tat-Tip I ta '5%. Twettqu analiżi tal-qawwa biex jintgħażlu d-daqsijiet tal-grupp li se jipprovdu> 80% qawwa biex tinstab bidla assoluta ta '10% fil-parametru b'rata ta' żball tat-Tip I ta '5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощнос ти10% солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Twettqet analiżi tal-qawwa biex jintgħażlu daqsijiet ta 'grupp li jipprovdu> qawwa ta' 80% biex tiskopri bidla assoluta tal-parametru ta '10% b'rata ta' żball tat-Tip I ta '5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的和5％的炯玥检测参数中10％绝对变化和5％的垯和5％的炯进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的和5％的炯玥检测参数中10％绝对变化和5％的垯和5％的炯 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мобора размера группы, который обеспечил бы > 80% мозмера группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Twettqet analiżi tal-qawwa biex jintgħażel daqs ta 'grupp li jipprovdi> qawwa ta' 80% biex tiskopri bidla fil-parametru assoluta ta '10% u rata ta' żball tat-tip I ta '5%.Sezzjonijiet tat-tessuti ġew magħżula b'mod każwali qabel l-esperiment.L-analiżijiet kollha kienu kondizzjoni blind u l-kampjuni ġew dekodifikati biss wara li d-dejta kollha kienet ġiet analizzata.Is-softwer GraphPad Prism (San Diego, CA) intuża biex iwettaq l-analiżi statistiċi kollha. Għall-istatistika kollha, il-valuri p tqiesu sinifikanti f'valuri <0.05. Għall-istatistika kollha, il-valuri p tqiesu sinifikanti f'valuri <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Għall-istatistika kollha, il-valuri p tqiesu sinifikanti f'valuri <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Għall-istatistika kollha, il-valuri p tqiesu sinifikanti f'valuri <0.05.It-test t ta' Student b'żewġ denbu sar fuq id-dejta b'paraguni 2 biss.ANOVA f'direzzjoni waħda jew f'żewġ direzzjonijiet intużat biex tiddetermina s-sinifikat bejn gruppi multipli.Meta wettqu testijiet post hoc, il-korrezzjoni ta 'Tukey ġiet applikata biex tagħti kont ta' paraguni multipli.Id-dejta RNAsec għandha konsiderazzjonijiet statistiċi speċjali meta tikkalkula FDR u p.adjust kif deskritt fit-taqsima Metodi.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tar-Rapport tar-Riċerka dwar in-Natura marbut ma’ dan l-artikolu.