Nature.com သို့လာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသောဘရောက်ဆာဗားရှင်းသည် CSS အတွက် အကန့်အသတ်ဖြင့် ပံ့ပိုးမှုရှိပါသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာတစ်ခု (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ရန်) အကြံပြုပါသည်။ ထိုအချိန်တွင် ဆက်လက်ပံ့ပိုးကူညီမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဆိုက်ကိုပြသပါမည်။
လူ့အူတွင်း ဇီဝကမ္မဖြစ်စဉ်သည် 3D epithelial microarchitecture နှင့် spatial organization ၏ crypt-villus အင်္ဂါရပ်များကို ဖော်ထုတ်ပေးပါသည်။ ထို့အပြင်၊ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဆဲလ်များနှင့် ကွဲပြားသော mucuse နှင့် ၎င်းတို့၏ ဇီဝဖြစ်ပျက်မှုဆိုင်ရာ ကွဲပြားသော ဆဲလ်များ၏ လုပ်ဆောင်မှုကို ကာကွယ်ခြင်းဖြင့် အူတွင်းရှိ ပင်မဆဲလ်များကို ထိန်းသိမ်းထားရန် ဤထူးခြားသော ဖွဲ့စည်းပုံ လိုအပ်ပါသည်။ အူလမ်းကြောင်း၏ mucosal မျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ အတားအဆီး။ ထို့ကြောင့်၊ 3D epithelial တည်ဆောက်ပုံများကို ပြန်လည်ဖန်တီးခြင်းသည် in vitro gut model များတည်ဆောက်မှုအတွက် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ အထူးသဖြင့် အော်ဂဲနစ် mimetic gut-on-a-chip သည် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelium ၏ အလိုအလျောက် 3D morphogenesis ကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည်။ Microfluidic ချစ်ပ်တစ်ခုအပြင် Transwell မြှုပ်သွင်းထားသော စပ်စပ်ချစ်ပ်တစ်ခုရှိ အူအတွင်းရှိ အူတွင်း ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှုကို အားကောင်းစေပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် စက်ပစ္စည်းထုတ်လုပ်ခြင်း၊ Caco-2 သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဇီဝရုပ်ကြွင်းဆဲလ်များကို မွေးမြူခြင်းအတွက် သမားရိုးကျဆက်တင်များအပြင် microfluidic ပလပ်ဖောင်း 3 ၏ ဗီဇပုံသဏ္ဍာန်ကို အသုံးပြု၍ သမရိုးကျဆက်တင်များတွင် အူတွင်းဇီဝရုပ်ကြွင်းဆဲလ်များကို မွေးမြူခြင်းအတွက် အသေးစိတ်နည်းလမ်းများကို ဖော်ပြထားပါသည်။ မျိုးစုံသော ပုံရိပ်ဖော်နည်းများ .ဤပရိုတိုကောသည် 5 d တွင် basolateral အရည်စီးဆင်းမှုကို ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့် functional gut microarchitecture ၏ ပြန်လည်ရှင်သန်ခြင်းကို ရရှိစေပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro morphogenesis method သည် ဇီဝကမ္မဗေဒအရ ဆက်စပ်နေသော ဖိအားနှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုပ်ရှားမှုကို အသုံးပြုထားပြီး ရှုပ်ထွေးသော ဆဲလ်အင်ဂျင်နီယာ သို့မဟုတ် ခြယ်လှယ်မှု မလိုအပ်ပါ၊ ၎င်းသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ လက်ရှိ colplication များအတွက် မျှော်မှန်းထားသည် ဇီဝဆေးပညာ၊ ဆေးဘက်ဆိုင်ရာနှင့် ဆေးဝါးဆိုင်ရာအသုံးချမှုများအတွက် 3D အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial အလွှာများကို vitro တွင် ပြန်လည်ထုတ်ပေးသည့်နည်းလမ်းကို ပံ့ပိုးပေးသော ဇီဝဆေးသုတေသနအသိုင်းအဝိုင်း။
gut-on-a-chip1,2,3,4,5 သို့မဟုတ် bilayer microfluidic devices6,7 တွင် မွေးမြူထားသော အူအတွင်းပိုင်း epithelial Caco-2 ဆဲလ်များသည် အလိုအလျောက် 3D morphogenesis ကို ဗီတိုအတွင်း သရုပ်ပြနိုင်သည် ။ အခြေခံယန္တရားကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း နားလည်မှုမရှိဘဲ မကြာသေးမီက လေ့လာချက်တွင်၊ Caco-2 နှင့် လူနာမှရရှိသော အူလမ်းကြောင်း organoids တို့မှ သရုပ်ပြထားသည့် 3D epithelial morphogenesis in vitro ဖြစ်ပေါ်စေရန် လိုအပ်ပြီး လုံလောက်ပါသည်။ Epithelial ဆဲလ်များကို သက်သေပြခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပြင်းထန်သော Wnt ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သော Dickkopf-1 (DKK-1) ၏ ဆဲလ်ထုတ်လုပ်မှုနှင့် အာရုံစူးစိုက်မှု ဖြန့်ဖြူးခြင်းအပေါ် အထူးအာရုံစိုက်ခဲ့ပြီး Dickkopf-1 (DKK-1) ၏ အူလမ်းကြောင်း-တစ်ချပ်နှင့် Transwell ထည့်သွင်းမှုများပါရှိသော ပြုပြင်ထားသော မိုက်ခရိုဖလူးဒစ်ကိရိယာများတွင် ” Hybrid Chip” ဟုခေါ်သည့် Dickkopf-1 ၏ ထပ်တိုးမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြပါသည်။ repressor 1၊ ပရိုတိန်းနှင့်ဆက်စပ်သော ပရိုတင်း 1 သို့မဟုတ် Soggy-1) သည် on-chip gut တွင် လျှို့ဝှက်ထားသော morphogenesis ကို ဟန့်တားသည် သို့မဟုတ် ပြင်ဆင်ထားသော 3D epithelial အလွှာကို နှောင့်ယှက်သည်၊ ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း ဆန့်ကျင်ဘက်စိတ်ဖိစီးမှုသည် vitro in vitro တွင်ရှိသော ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှုအတွက် တာဝန်ရှိသည်ဟု အကြံပြုပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ epimorbust ကိုအောင်မြင်ရန် လက်တွေ့ကျသောချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည် တက်ကြွစွာဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် (ဥပမာ၊ gut-on-a-chip သို့မဟုတ် hybrid-on-a-chip ပလပ်ဖောင်းများတွင်) သို့မဟုတ် ပျံ့နှံ့မှု .Basolateral media (ဥပမာ Transwell မှ ကြီးမားသော basolateral reservoirs များအတွင်းသို့ တွင်းများထည့်သွင်းခြင်း) ဖြင့် Basolateral compartment အတွင်းရှိ Wnt ဆန့်ကျင်ဘက်အဆင့်ကို အနည်းဆုံး ထိန်းသိမ်းပါ။
ဤပရိုတိုကောတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (step 6A, 7A, 8,B of 7B, အဆင့် 6, Transwell အမြှေးပါးများ ၏ 6) (step 6A, 7A, 7B ၏ 7B ပေါင်းထည့်ခြင်း) (step 6A, 7A, 9B of 7B) (steps 6A, 7A, 9B of 7B) (steps 6A, 7A, 9B) ၏ အူလမ်းကြောင်းအမြှေးပါးများကို အူလမ်းကြောင်းပေါ်ရှိ microdevices များထုတ်လုပ်ခြင်းအတွက် ဤပရိုတိုကောတွင် အသေးစိတ်နည်းလမ်းကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။ 8, 9) နှင့် induced 3D morphogenesis (အဆင့် 10)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် တစ်ရှူး-သီးသန့် histogenesis နှင့် မျိုးရိုးအလိုက် ဆယ်လူလာကွဲပြားမှုကို ညွှန်ပြသော 3D morphogenesis (အဆင့် 10) ဖြစ်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသား intest-intest သို့မဟုတ် Calicointest ကဲ့သို့သော epithelial ဆဲလ်များကို အသုံးပြု၍ morphogenesis သို့မဟုတ် Calicointest ကဲ့သို့သော epithelial 2 ကိုအသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆဲလ်များအတွင်း၌ ဆဲလ်များကဲ့သို့ morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ အညစ်အကြေးများကို မျက်နှာပြင်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်း၊ 2D monolayers များဖန်တီးခြင်းနှင့် အူလမ်းကြောင်းဇီဝဓာတုနှင့် biomechanical microenvironment.in vitro မျိုးပွားခြင်းအပါအဝင် နည်းပညာအသေးစိတ်အချက်များပါရှိသော ယဉ်ကျေးမှုဖော်မတ်နှစ်ခုဖြင့် 2D epithelial monolayers များမှ 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယဉ်ကျေးမှုအလယ်အလတ်ပုံစံရှိသော monolayers နှစ်ခုလုံးသို့ morphogen ဆန့်ကျင်ဘက်သို့ ထွက်ခွာသွားပါသည်။ ယဉ်ကျေးမှု။နောက်ဆုံးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် morphogen-မှီခိုသော epithelial ကြီးထွားမှု၊ ရှည်လျားသော host-microbiome co-cultures၊ ရောဂါပိုးကူးစက်မှု၊ ရောင်ရမ်းမှုဒဏ်ရာ၊ epithelial barrier ကမောက်ကမဖြစ်မှုနှင့် probiotic-based ကုထုံးများအတွက် နမူနာအဖြစ်အသုံးပြုနိုင်သော ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သော 3D epithelial အလွှာ၏ အသုံးဝင်မှုကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။ ဥပမာ။
ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကောသည် အခြေခံ (ဥပမာ၊ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဇီဝဗေဒ၊ ပင်မဆဲလ်ဇီဝဗေဒနှင့် ဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာ ဇီဝဗေဒ) နှင့် အသုံးချသုတေသနပြုခြင်း (ဥပမာ၊ ဆေးဝါးစမ်းသပ်ခြင်း၊ ရောဂါပုံစံပုံစံ၊ တစ်ရှူးအင်ဂျင်နီယာနှင့် အစာအိမ်ရောဂါဗေဒ) ကျယ်ပြန့်သောအကျိုးသက်ရောက်မှုများ။ ကျွန်ုပ်တို့၏ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းနှင့် မျိုးဗီဇဆိုင်ရာ ခိုင်မာအားကောင်းမှု 3 ကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ protocol သည် ကျယ်ပြန့်သောအကျိုးသက်ရောက်မှုဖြစ်သည်။ epithelium in vitro တွင် ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းပညာဆိုင်ရာနည်းဗျူဟာသည် အူလမ်းကြောင်းဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၊ အသစ်ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခြင်း သို့မဟုတ် homeostasis ကာလအတွင်း ဆဲလ်အချက်ပြခြင်းဆိုင်ရာ ဒိုင်နနမစ်များကို လေ့လာသည့်ပရိသတ်များထံ ဖြန့်ဝေပေးနိုင်မည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယူဆပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကောသည် Norovirus 8၊ Severe Acute Respiratory Syndrome CoV-2)၊ SARSicmuridium difficium di coronavirus ၊ 9 သို့မဟုတ် Vibrio cholerae ။ ရောဂါဗေဒနှင့် ရောဂါဖြစ်ပွားမှုဆိုင်ရာ ပရိသတ်များသည်လည်း အသုံးဝင်ပါသည်။ On-chip gut microphysiology system ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် longitudinal co-culture 10 ကို ခွင့်ပြုနိုင်ပြီး နောက်ဆက်တွဲအကဲဖြတ်ခြင်း၏ host defense၊ immune responses နှင့် pathogen-related damage repair in the gastrointestinal (GI) tract 11 .Other GI's နှင့်ဆက်စပ်သော ယိုစိမ့်သောရောဂါများ၊ လူနာ၏ 3D အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial အလွှာများကို အသုံးပြု၍ 3D အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ အလွှာများကို ပြင်ဆင်သောအခါတွင် ulcerative colitis၊ pouchitis၊ သို့မဟုတ် irritable bowel syndrome ကို အတုယူနိုင်သည်၊ ဤရောဂါများတွင် villous atrophy၊ crypt shortening, mucosal damage, or impaired epithelial barrier.Biopsy-information or in impaired epithelial barrier. organoids12,13.ရောဂါပတ်ဝန်းကျင်၏ ပိုမိုရှုပ်ထွေးမှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ စံနမူနာပြုရန်၊ စာဖတ်သူများသည် 3D အူလမ်းကြောင်း villus-crypt microarchitectures များပါရှိသော 3D အူလမ်းကြောင်း villus-crypt မိုက်ခရိုဗိသုကာများပါရှိသော မော်ဒယ်များတွင် လူနာအရံသွေး mononuclear cells (PBMCs) ကဲ့သို့သော ရောဂါဆိုင်ရာ ဆဲလ်အမျိုးအစားများဖြစ်သည့် ရောဂါဆိုင်ရာ ဆဲလ်အမျိုးအစားများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်ပါသည်။ တစ်သျှူး သီးသန့် ခုခံအားဆဲလ်များ၊ ၅။
3D epithelial microstructure ကို အပိုင်းခွဲခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်မပါဘဲ ပုံသေပုံဖော်နိုင်သောကြောင့်၊ spatial transcriptomics နှင့် high-resolution သို့မဟုတ် super-resolution imaging တွင်လုပ်ဆောင်နေသောကြည့်ရှုသူများသည် epithelial niches များရှိ မျိုးဗီဇများနှင့် ပရိုတင်းများ၏ spatiotemporal dynamics များကို မြေပုံဆွဲခြင်းတွင် စိတ်ဝင်စားပေမည်။ နည်းပညာကို စိတ်ဝင်စားသည်။ အဏုဇီဝ သို့မဟုတ် ကိုယ်ခံအား လှုံ့ဆော်မှုကို တုံ့ပြန်ခြင်း။ ထို့အပြင်၊ အူလမ်းကြောင်းရှိ ဇီဝဖြစ်ပျက်မှုကို ညှိနှိုင်းပေးသည့် အရှည်လိုက် အူလမ်းကြောင်းရှိ မိုက်ခရိုဘိုင်တစ်ချောင်းဆုံ 10၊ 14 ကို 3D အူလမ်းကြောင်းအတွင်းရှိ အကျိအချွဲအလွှာတွင် အဏုဇီဝမျိုးစိတ်များ၊ အဏုဇီဝအသိုက်အဝန်းများ သို့မဟုတ် fecal microbiota-Giopon- အထူးသဖြင့် အူလမ်းကြောင်းအတွင်းရှိ အမြှေးပါးအလွှာတွင် တည်ထောင်နိုင်သည်။ ပလပ်ဖောင်းတွင်။ဤချဉ်းကပ်မှုသည် mucosal immunology၊ အစာအိမ်နှင့်အူလမ်းကြောင်းဗေဒ၊ လူ့ microbiome၊ culturomics နှင့် clinical microbiology တို့ကိုလေ့လာနေသောပရိသတ်များအတွက် အထူးဆွဲဆောင်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် ယခင်က မယဉ်ကျေးသောအူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ microbiota ကိုမွေးမြူရန်ရှာဖွေနေပါသည်။ အကယ်၍ ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro morphogenesis protocol သည် scalable culture4 အမျိုးအစားများ 3 8 တွင် 2 ၊ 4 ကဲ့သို့သော multi-6 အမျိုးအစားများကို ပေါင်းထည့်နိုင်သည်။ basolateral compartments များကို စဉ်ဆက်မပြတ် ဖြည့်ဆည်းပေးသော ပန်းကန်ပြားများ၊ ပရိုတိုကောကို စားသောက်ကုန်လုပ်ငန်းအတွက် ဆေးဝါး၊ ဇီဝဆေး သို့မဟုတ် မြင့်မားသော ဖောက်ပြန်စစ်ဆေးခြင်း သို့မဟုတ် မှန်ကန်ကြောင်း စစ်ဆေးခြင်း ပလပ်ဖောင်းများကို တီထွင်ထုတ်လုပ်ထားသူများထံလည်း ဖြန့်ကျက်နိုင်ပါသည်။ အထောက်အထား-မူရင်းအရ၊ မကြာသေးမီက ကျွန်ုပ်တို့သည် multiplex high-throughput morphogenesis စနစ်အတွက် ပန်းကန်ပြားပုံစံ 2s organ-on-a-chip ထုတ်ကုန်များကို စီးပွားဖြစ်ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး 16,17,18. ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro morphogenesis နည်းလမ်း၏ တရားဝင်မှုကို အရှိန်မြှင့်နိုင်ပြီး သုတေသနဓာတ်ခွဲခန်းများ၊ စက်မှုလုပ်ငန်း သို့မဟုတ် အစိုးရနှင့် စည်းမျဉ်းဆိုင်ရာ အေဂျင်စီများစွာမှ ဆဲလ်လူလာပြန်လည်ပရိုဂရမ်ပြုလုပ်ခြင်းကို နားလည်ရန် ဗိုက်ထရိုအူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ morphogenesis ကို ကုသရန်အတွက် ဆေးဝါးများ သို့မဟုတ် သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးဆိုင်ရာ ဇီဝကုသခြင်းအဆင့်တွင် ဆေးဝါးများ သို့မဟုတ် ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာစမ်းသပ်မှုအဆင့်တွင် ဆေးဝါးများပါဝင်သည် 3D gut surrogates ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခြင်း သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်း morphogenesis ဖြစ်စဉ်၏ မျိုးပွားနိုင်မှုကို အကဲဖြတ်ရန် စိတ်ကြိုက် သို့မဟုတ် စီးပွားဖြစ် အင်္ဂါ-on-a-chip မော်ဒယ်များကို အသုံးပြုခြင်း။
အဓိကအားဖြင့် 3D morphogenesis in vitrogenesis ဖြစ်ပေါ်စေရန် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial morphogenesis ကိုလေ့လာရန် လူနှင့်သက်ဆိုင်သည့် စမ်းသပ်ပုံစံများကို အကန့်အသတ်ဖြင့်အသုံးပြုထားသည်။ အမှန်မှာ၊ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ morphogenesis နှင့်ပတ်သက်သော လက်ရှိအသိပညာအများစုသည် တိရစ္ဆာန်လေ့လာမှုများ (ဥပမာ၊ zebrafish20၊ mice21H) ပေါ်တွင်အခြေခံ၍ ကုန်ကျစရိတ်များသော်လည်း၊ ၎င်းတို့မှာ 22. ကျင့်ဝတ်အရ မေးခွန်းထုတ်စရာဖြစ်ပြီး အရေးအကြီးဆုံးမှာ၊ လူ့ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုလုပ်ငန်းစဉ်များကို တိကျစွာမဆုံးဖြတ်ပါနှင့်။ ဤမော်ဒယ်များသည် နည်းလမ်းပေါင်းစုံဖြင့် စမ်းသပ်နိုင်သည့်စွမ်းရည်မှာလည်း အလွန်အကန့်အသတ်ရှိပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ပရိုတိုကောသည် vivo တိရိစ္ဆာန်မော်ဒယ်များအပြင် အခြားသော ရိုးရာအငြိမ် 2D ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုမော်ဒယ်များတွင် 3D အသွင်သဏ္ဍာန်ကို ပြန်လည်ထုတ်ပေးရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကောကို ယခင်ကထက် သာလွန်ကောင်းမွန်စေပါသည်။ အမျိုးမျိုးသော mucosal သို့မဟုတ် immune stimuli ကိုတုံ့ပြန်ရန်အတွက် crypt-villus ဝင်ရိုးရှိ ကွဲပြားသောဆဲလ်များ၏ spatial localization ကိုစစ်ဆေးပါ။3D epithelial အလွှာများသည် microbial cells များသည် spatial niches များဖွဲ့စည်းပုံနှင့် host Factors များကိုတုံ့ပြန်ရာတွင် ဂေဟဗေဒဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်များ (ဥပမာ၊ အတွင်းပိုင်းနှင့် လျှို့ဝှက်ချွဲA ၏ အပြင်ဘက်ရှိ ချွဲများနှင့် IrogA ၏ အပြင်ဘက်လျှို့ဝှက်ချက်၊ Irog A ၏ အတွင်းပိုင်းနှင့် လျှို့ဝှက်အချွဲအလွှာများ၊ peptides)။ထို့ပြင်၊ 3D epithelial morphology သည် အူ microbiota သည် ၎င်း၏အသိုင်းအဝိုင်းများကို မည်သို့တည်ဆောက်ပုံနှင့် microbial metabolites (ဥပမာ- ကွင်းဆက်အတိုကောက်ဖက်တီးအက်ဆစ်) ကို ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ပေးသည့် ဆဲလ်လူလာအဖွဲ့အစည်းနှင့် basal vipcrypts ရှိ ပင်မဆဲလ် niches များကို နားလည်နိုင်စေပါသည်။ ဤအင်္ဂါရပ်များကို သရုပ်ပြသည့်အခါတွင်သာ အလွှာ ၃ ခုကို ဖော်ထုတ်နိုင်ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ 3D အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial တည်ဆောက်ပုံများအပြင်၊ ဗီတိုသုံးနည်းလမ်းများစွာလည်း ရှိပါသည်။အူလမ်းကြောင်း organoid ယဉ်ကျေးမှုသည် တိကျသော morphogen အခြေအနေများအောက်တွင် 23,24,25 အထိ အူလမ်းကြောင်းဆဲလ်များ စိုက်ပျိုးခြင်းအပေါ် အခြေခံ၍ အူလမ်းကြောင်း organoid ယဉ်ကျေးမှုသည် ခေတ်မီသော အနုပညာမြောက်သော တစ်သျှူးအင်ဂျင်နီယာနည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည်။ သို့သော်လည်း၊ မကြာခဏဆိုသလို သယ်ယူပို့ဆောင်ခြင်း သို့မဟုတ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများအတွက် 3D organoid-culrobis များကို အသုံးပြုခြင်းကြောင့်၊ အူလမ်းကြောင်း lumen ကို organoid အတွင်းတွင် ဖုံးအုပ်ထားပြီး ထို့ကြောင့် microbial cells သို့မဟုတ် exogenous antigens ကဲ့သို့သော luminal အစိတ်အပိုင်းများကို မိတ်ဆက်ခြင်းကို ကန့်သတ်ထားသည်။ microinjector၊26,27 ကိုအသုံးပြု၍ organoid lumens သို့ဝင်ရောက်မှုကို မြှင့်တင်နိုင်သော်လည်း ဤနည်းလမ်းသည် ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်ပြီး လုပ်သားအမြောက်အမြားရှိပြီး လုပ်ဆောင်ရန် အထူးပြုအသိပညာလိုအပ်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ တည်ငြိမ်သောအခြေအနေအောက်တွင် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ငြမ်းများတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော ရိုးရာ organoid ယဉ်ကျေးမှုများသည် vivo biomechanics တွင် တိကျစွာအကျိုးသက်ရောက်မှုမရှိပါ။
သုတေသနအဖွဲ့များစွာမှ အသုံးပြုသည့် အခြားချဉ်းကပ်နည်းများသည် 3D-ပုံနှိပ်၊ မိုက်ခရို-ကြိတ်ခွဲမှု သို့မဟုတ် ပုံသဏ္ဍာန်ပြုလုပ်ထားသော မှိုဆဲလ်များကို ပြုစုပျိုးထောင်ခြင်းဖြင့် အစာအိမ်အတွင်းပိုင်းဖွဲ့စည်းပုံကို တုပရန် 3D ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ် ငြမ်းများကို အသုံးပြုသည်။ ဤနည်းလမ်းသည် ကိုယ်တိုင်ပြုလုပ်ထားသော မှိုဆဲလ်များကို 3D ပုံနှိပ်ခြင်း၊ မိုက်ခရိုကြိတ်ခွဲခြင်း သို့မဟုတ် အနုနည်းဖြင့်ပြုလုပ်ထားသော မှိုများဖြင့် ပြုလုပ်ထားခြင်းဖြစ်ပါသည်။ Scaffold အတွင်းရှိ stromal cells များပါဝင်ခြင်းဖြင့် မြင့်မားသောရှုထောင့်အချိုးအစား၊ epithelial တည်ဆောက်ပုံနှင့် stroma-epithelial crosstalk ကိုဖွဲ့စည်း၍ ဇီဝကမ္မဗေဒအရသက်ဆိုင်သော morphogen gradients များဖြစ်သည်။သို့သော်၊ ပြင်ဆင်ထားသော scaffolds ၏သဘောသဘာဝသည် အလိုအလျောက် morphogenetic ဖြစ်စဉ်ကိုပြသခြင်းကို တားဆီးနိုင်သည်။ ဤပုံစံများသည် အလင်းရောင်မရှိခြင်း၊ အူဆဲလ်များသည် ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲခြင်းနှင့် ဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်ချက်ကို ရရှိရန် လိုအပ်ပါသည်။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုတွင် အခြားလေ့လာမှုတစ်ခုသည် microfluidic platform တွင် hydrogel scaffolds များကိုအသုံးပြုပြီး အူလမ်းကြောင်းအတွင်းပိုင်းပုံသဏ္ဍာန်ပုံစံဖြင့် လေဆာပုံသွင်းခြင်းနည်းပညာများကို အသုံးပြုထားသည်။ Mouse အူလမ်းကြောင်းအတွင်းရှိ organoids များသည် အူလမ်းကြောင်းပြွန်ဖွဲ့စည်းပုံများဖန်တီးရန် ထွင်းထုထားသောပုံစံများကို လိုက်နာဆောင်ရွက်ကာ၊ ဤ microfluidic fluidever များကို အသုံးပြု၍ intraluminalapuidic စီးဆင်းမှုပုံစံများကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ မော်ဒယ်တွင် အလိုအလျောက် morphogenetic ဖြစ်စဉ်များကို မပြသထားသည့်အပြင် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ လှုပ်ရှားမှုများ မပါဝင်ပါ။ တူညီသောအုပ်စုမှ 3D ပုံနှိပ်ခြင်းနည်းပညာများသည် အလိုအလျောက် morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်များဖြင့် သေးငယ်သော အစာအိမ်ပြွန်များကို ဖန်တီးနိုင်ခဲ့သည်။ ပြွန်အတွင်း မတူညီသော အူအစိတ်အပိုင်းများကို ရှုပ်ထွေးစွာ ဖန်တီးထားသော်လည်း၊ ဤမော်ဒယ်လ်သည် အလင်းဝင်ပေါက်ထွက်ရှိမှု နည်းပါးပြီး အလင်းဝင်ပေါက်ထွက်ရှိမှု နည်းပါးနိုင်ပါသည်။ အထူးသဖြင့် ဇီဝပရင့်ထုတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ပြီးမြောက်ပြီးနောက်၊ စမ်းသပ်ဆဲအခြေအနေများ သို့မဟုတ် ဆဲလ်တစ်ခုမှဆဲလ်အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပါသည်။ ယင်းအစား၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အဆိုပြုထားသောပရိုတိုကောသည် အလိုအလျောက်အူလမ်းကြောင်းပုံစံပြောင်းလဲခြင်း၊ ဇီဝကမ္မဗေဒအရသက်ဆိုင်သော shear stress၊ အူလှုပ်ရှားမှုကိုတုပသော biomechanics၊ လွတ်လပ်သော apical နှင့် basolateral compartments များ၏ ရှုပ်ထွေးမှုများ၊ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာအကန့်များ၏ ရှုပ်ထွေးမှုများ၊ in vitro 3D morphogenesis protocol သည် ရှိပြီးသားနည်းလမ်းများ၏ စိန်ခေါ်မှုများကို ကျော်လွှားရန် ဖြည့်စွက်ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခု ပံ့ပိုးပေးနိုင်ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကောသည် ယဉ်ကျေးမှုရှိ epithelial ဆဲလ်များသာရှိပြီး mesenchymal ဆဲလ်များ၊ endothelial ဆဲလ်များနှင့် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များကဲ့သို့သော အခြားပတ်ဝန်းကျင်ဆဲလ်အမျိုးအစားများမရှိသည့် 3D epithelial morphogenesis ပေါ်တွင် လုံးလုံးလျားလျားအာရုံစိုက်ထားသည်။ ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကော၏အဓိကအချက်မှာ epithelial morphogenesis ၏အစပြုခြင်းဖြစ်သည်။ လျှို့ဝှက်ဘေးထွက်ရှိ morphogen ၏အလယ်အလတ်ဘေးထွက်ပစ္စည်းများကို ဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ gut-on-a-chip နှင့် hybrid-on-a-chip တို့၏ ခိုင်ခံ့သောပုံစံသည် ကျွန်ုပ်တို့အား undulating 3D epithelial အလွှာ၊ ထပ်ဆင့်ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာရှုပ်ထွေးမှုများဖြစ်သည့် epithelial-mesenchymal interactions33,34၊ extracellular Matrix (ECM) deposition 35 နှင့် ကျွန်ုပ်တို့၏မော်ဒယ်လ်တွင် လျှို့ဝှက်ကုဒ်များပါရှိသော nivil bass စံပြတွင်၊ ထပ်မံထည့်သွင်းစဉ်းစားရန်ကျန်နေသေးသည်။ mesenchyme ရှိ Stromal ဆဲလ်များ (ဥပမာ- fibroblasts) များသည် vivo35,37,38 ရှိ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ morphogenesis ၏ စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းများတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ပုံစံတွင် mesenchymal ဆဲလ်များ ထပ်လောင်းခြင်းသည် morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်နှင့် ဆဲလ်ပူးတွဲမှုထိရောက်မှုကို မြှင့်တင်ပေးပါသည်။ အဆိုပါ endothelial အလွှာ (သို့) lymphill ထိန်းညှိခြင်းတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပါသည်။ transport39 နှင့် immune cell recruitment40 in in the gut microenvironment. ထို့အပြင်၊ တစ်ရှူးမော်ဒယ်များကြားတွင် ချိတ်ဆက်နိုင်သော သွေးကြောအစိတ်အပိုင်းများသည် ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါများစွာ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို သရုပ်ပြရန် တစ်ရှူးပုံစံများကို ဒီဇိုင်းထုတ်သောအခါတွင် မဖြစ်မနေလိုအပ်ပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ endothelial ဆဲလ်များကို ပိုမိုတိကျသော ဇီဝကမ္မအင်္ဂါရပ်များကို ပုံဖော်ရန်အတွက် လိုအပ်ပါသည်။ အူလမ်းကြောင်းရောဂါကို တုပသည့်အခြေအနေတွင် အန်တီဂျင်တင်ပြမှု၊ မွေးရာပါ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေသော ကိုယ်ခံအား crosstalk နှင့် တစ်ရှူးများဆိုင်ရာ သီးသန့်ကိုယ်ခံစွမ်းအား။
စပ်ဆက်ချစ်ပ်များအသုံးပြုခြင်းသည် စက်ပစ္စည်းစနစ်ထည့်သွင်းမှုပိုမိုရိုးရှင်းသောကြောင့်ဖြစ်ပြီး Transwell ထည့်သွင်းမှုများအသုံးပြုခြင်းသည် အစာအိမ်အတွင်းပိုင်းရှိ အရွယ်အစားရှိ ယဉ်ကျေးမှုကိုရရှိစေပါသည်။ သို့သော်၊ စီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင်သော Transwell ထည့်သွင်းမှုများသည် polyester အမြှေးပါးများနှင့်အတူ ပျော့ပျောင်းမှုမရှိသည့်အပြင် peristaltic-like လှုပ်ရှားမှုများကို တုပ၍မရနိုင်ပါ။ ထို့အပြင် Transwell ထည့်သွင်းမှုတွင် ထည့်သွင်းထားသော ချစ်ပ်ကို apical ပေါင်းစပ်ထည့်သွင်းမှုတွင် ကျန်ရှိနေပါသည်။ apical side တွင် shear stress မရှိပါ။ apical compartment ရှိ static properties သည် hybrid chips များတွင် ရေရှည်ဘက်တီးရီးယားများ ပေါင်းစပ်ယဉ်ကျေးမှုကို ရရှိနိုင်ခဲပါသည်။ Transwell ထည့်သွင်းမှုများတွင် 3D morphogenesis ကို ခိုင်ခိုင်မာမာ ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သော်လည်း စပ်စပ်ချစ်ပ်များကို အသုံးပြုသောအခါတွင် ဇီဝကမ္မဗေဒအရ သက်ဆိုင်သော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ချစ်ပ်ပြားများ ပြတ်လပ်သွားနိုင်သည်။ အလားအလာရှိသော applications များ။
gut-on-a-chip နှင့် hybrid-on-a-chip ယဉ်ကျေးမှုများရှိ human crypt-villus ဝင်ရိုး၏ အတိုင်းအတာအပြည့် ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုများကို အပြည့်အဝ မတည်ဆောက်ရသေးပါ။ morphogenesis သည် epithelial monolayer မှအစပြုသောကြောင့်၊ 3D microarchitectures များသည် အသွင်သဏ္ဍာန်တူသော crypt များပြုလုပ်ထားသော vivo သက်ရှိများအတွင်း crypt များပြုလုပ်ထားသော လူဦးရေအတွက် အသွင်သဏ္ဍာန်တူရန် မလိုအပ်ပါ။ microengineered 3D epithelium ရှိ ဒိုမိန်း၊ crypt နှင့် villous ဒေသများကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ပိုင်းခြား၍မရပါ။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ မြင့်မားသော လမ်းကြောင်းများသည် microengineered epithelium ၏ အမြင့်သို့ တိုးလာသော်လည်း အမြင့်ဆုံး အမြင့်မှာ ~300–400 µm တွင် ကန့်သတ်ထားဆဲဖြစ်သည်။ လူ့အူလမ်းကြောင်း၏ အမှန်တကယ် အနက်သည် သေးငယ်ပြီး 4 µm ~ 3mtest ဖြစ်သည်၊ အသီးသီး၊ အူသိမ်အူမကြီး၏ အမြင့်မှာ ~ 600 µm41 ဖြစ်သည်။
ပုံရိပ်ရှုထောင့်မှကြည့်လျှင် 3D မိုက်ခရိုဗိသုကာများ၏ ပုံရိပ်ဖော်ပုံသည် ရည်မှန်းချက်မှန်ဘီလူးမှ epithelial အလွှာဆီသို့ လိုအပ်သော အလုပ်လုပ်သည့်အကွာအဝေးသည် မီလီမီတာအနည်းငယ်မျှသာရှိသောကြောင့် ဤပြဿနာကို ကျော်လွှားရန်အတွက် အဝေးမှ ရည်မှန်းချက်တစ်ခု လိုအပ်နိုင်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ပါးလွှာသောအစိတ်အပိုင်းများကို ပြင်ဆင်မှုပြုလုပ်ရန်အတွက် ပါးလွှာသောအစိတ်အပိုင်းများကို ရင့်ကျက်မှုဖြစ်စေရန် လိုအပ်ပါသည်။ PDMS.ထို့ပြင်၊ ချစ်ပ်တစ်ခုပေါ်ရှိ အစာအိမ်၏ အလွှာအလိုက် အလွှာတစ်ခုချင်းစီ၏ ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှုတွင် အလွှာတစ်ခုစီကြားတွင် အမြဲတမ်း ကပ်ငြိနေသောကြောင့် အပေါ်လွှာကို ဖွင့်ရန် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားရန်မှာ အလွန်ခက်ခဲပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ စကင်န်ဖတ်ထားသော အီလက်ထရွန်အဏုကြည့်မှန်ဘီလူး (SEM) ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် အပေါ်လွှာကို ဖွင့်ရန် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားရန် အလွန်ခက်ခဲပါသည်။
PDMS ၏ hydrophobicity သည် hydrophobic သေးငယ်သော မော်လီကျူးများနှင့် ပတ်သက်သည့် microfluidic အခြေပြု လေ့လာမှုများတွင် ကန့်သတ်ချက်တစ်ခု ဖြစ်နေပါသည်။ PDMS သည် ထိုကဲ့သို့သော hydrophobic မော်လီကျူးများကို အတိအကျမစုပ်ယူနိုင်သောကြောင့် PDMS ၏ အခြားရွေးချယ်စရာများကို အခြားပေါ်လီမာပစ္စည်းများဖြင့် ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်ပါသည်။ တနည်းအားဖြင့်၊ PDMS ၏ မျက်နှာပြင်ကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်း (ဥပမာ- polyethene သို့မဟုတ် lipophilic ပစ္စည်းများ) 423ylphit (ဥပမာ၊ polyethene သို့မဟုတ် lipophilic ပစ္စည်းများ) ဖြင့် အုပ်ထားသော ) hydrophobic မော်လီကျူးများ၏ စုပ်ယူမှုကို လျှော့ချရန် စဉ်းစားနိုင်သည်။
နောက်ဆုံးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းသည် မြင့်မားသောစမ်းသပ်စစ်ဆေးခြင်း သို့မဟုတ် "တစ်အရွယ်အစား-ကိုက်ညီ-အားလုံး" အသုံးပြုရအဆင်ပြေသော စမ်းသပ်မှုပလပ်ဖောင်းကို ပေးအပ်ခြင်းနှင့်ပတ်သက်၍ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းကို ကောင်းမွန်စွာသွင်ပြင်လက္ခဏာမပေါ်သေးပါ။ လက်ရှိပရိုတိုကောသည် CO2 incubator တွင် နေရာယူကာ ကြီးမားသောစမ်းသပ်မှုများကို တားဆီးပေးသည့်နည်းလမ်းမှာ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းကို ကောင်းစွာသတ်မှတ်ထားခြင်းမရှိပေ။ ဤကန့်သတ်ချက်သည် ဆန်းသစ်သောပုံစံ 2 မျိုးတွင် ချဲ့ထွင်နိုင်မှု (ဥပမာ- ယဉ်ကျေးမှုပုံစံ 2) တွင် သိသိသာသာတိုးတက်ကောင်းမွန်နိုင်သည်။ 96- well, သို့မဟုတ် 384-well porous inserts များ စဉ်ဆက်မပြတ် ဖြည့်စွက်ခြင်းနှင့် basolateral media များကို ဖယ်ရှားခြင်း)။
လူ၏အူလမ်းကြောင်းအတွင်းပိုင်း epithelium ၏ 3D ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အပြိုင်မိုက်ခရိုချန်နယ်နှစ်ခုနှင့် elastic porous အမြှေးပါးပါဝင်သော microfluidic ချစ်ပ်ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ lumen-capillary interface ကိုဖန်တီးရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် စဉ်ဆက်မပြတ်စီးဆင်းနေသော baslith pool-polylar များကို ထောက်ပံ့ပေးသော single-channel microfluidic စက် (hybrid ချစ်ပ်ပြား) ပါဝင်သော အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာကိရိယာကို အသုံးပြုခြင်းကိုလည်း သရုပ်ပြပါသည်။ Transwell ထည့်သွင်းမှုများ။ပလက်ဖောင်းနှစ်ခုစလုံးတွင်၊ လူ့အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial ဆဲလ်အမျိုးမျိုး၏ morphogenesis သည် morphogen antagonists များကို basolateral compartment မှဖယ်ရှားရန် morphogen antagonists များကိုဖယ်ရှားရန် လမ်းကြောင်းပြောင်းစီးဆင်းမှုကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် morphogenesis ကို သရုပ်ပြနိုင်သည်။ စမ်းသပ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်း (ပုံ 1) တစ်ခုလုံးတွင် အပိုင်းငါးပိုင်းပါရှိသည်- (i) microfabrication၊ gutable chip b 1-1 (Transwell)၊ (ii) အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဆဲလ်များ (Caco-2 ဆဲလ်များ) သို့မဟုတ် လူ့အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ organoids များ ပြင်ဆင်မှု၊ သေတ္တာ 2-5)၊ (iii) အူချစ်ပ်များ သို့မဟုတ် စပ်စပ်ချစ်ပ်များပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဆဲလ်များ၏ ယဉ်ကျေးမှုယဉ်ကျေးမှု (အဆင့် 6-9)၊ (iv) 3D morphogenesis in vitro (အဆင့် 10) နှင့် (v) ) 3D epithelial microstructure (အဆင့် 11-24) ကို ထိန်းချုပ်ရန်အတွက် ပိုမိုသင့်လျော်သော အုပ်စုကို အောက်တွင်ဖော်ပြထားပါသည်။ epithelial morphogenesis ကို spatial, temporal, conditional, or procedural controls တို့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် in vitro morphogenesis ၏ ထိရောက်မှုကို အတည်ပြုသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသော ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ ပလပ်ဖောင်းနှစ်ခုကို အသုံးပြုထားသည်- ဖြောင့်ချန်နယ်များ သို့မဟုတ် လိုင်းမညီသော လိုင်းများပါရှိသော အူလမ်းကြောင်းများရှိသော ချစ်ပ်များ သို့မဟုတ် Transwell (TW) ထည့်သွင်းသည့် မိုက်ခရိုဖလူးဒစ်ကိရိယာတွင် ထည့်သွင်းထားသည့် စပ်မျိုးချစ်ပ်များကို Box 1 တွင် ဖော်ပြထားပြီး အဆင့် 1-5 တွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း တီထွင်ဖန်တီးထားသည်။”Device Fabrication” တွင် ဖော်ပြထားသည့် တစ်ခုတည်းသောချစ်ပ်တစ်ခု သို့မဟုတ် ဆဲလ်တစ်ခုဖြစ်သည့် Epulture ချစ်ပ်များကို လူသားဆဲလ်တစ်ခုပြုလုပ်ရန် အဓိကအဆင့်များကို ပြသထားသည်။ အရင်းအမြစ် (Caco-2 သို့မဟုတ် လူ့အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ organoids) နှင့် ဤပရိုတိုကောတွင်အသုံးပြုသည့် ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာလုပ်ငန်းစဉ်။”In vitro morphogenesis” သည် Caco-2 သို့မဟုတ် organoid မှရရှိသော epithelial ဆဲလ်များကို အူချပ်ပြားပေါ်တွင် မွေးမြူခြင်း သို့မဟုတ် စပ်ဆက်ချစ်ပ်တစ်ခု၏ Transwell ထည့်သွင်းမှုများတွင် ပေါင်းစပ်ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် 3D နံပါတ်ပုံး၏ အသွင်သဏ္ဍာန်ဆိုင်ရာ ပရိုဂရမ် သို့မဟုတ် နံပါတ်ပုံသဏ္ဍာန်ဆိုင်ရာ ပရိုဂရမ်နှင့် နံပါတ်ပုံသဏ္ဍာန်ဆိုင်ရာ ပရိုဂရမ်၏ နောက်ဆက်တွဲတွင် ဖော်ပြသည်။ မြှားတစ်ခုစီ၏အောက်တွင်ပြသထားသည်။အပလီကေးရှင်းသည် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial အလွှာများကို မည်ကဲ့သို့အသုံးပြုရမည်ကို ဥပမာပေးသည်၊ ဥပမာအားဖြင့်၊ ဆဲလ်ကွဲပြားခြင်းလက္ခဏာရပ်၊ အူဇီဝကမ္မဗေဒလေ့လာမှုများ၊ လက်ခံနိုင်လောက်သောအဏုဇီဝဂေဟစနစ်များတည်ထောင်ခြင်းနှင့် ရောဂါပုံစံပုံစံပြုလုပ်ခြင်း။ နျူကလိယ၊ F-actin နှင့် Caeco-23 တွင်ဖော်ပြထားသော "ဆဲလ်ကွဲပြားခြင်း" တွင်ဖော်ပြထားသော "ဆဲလ်ကွဲပြားခြင်း" တွင် Immunofluorescence ပုံများ အူချောင်းချပ်။MUC2 အချက်ပြခြင်းတွင် လိပ်ခေါင်းဆဲလ်များနှင့် အကျိအချွဲမျက်နှာပြင်များမှ လျှို့ဝှက်ထားသော ချွဲများရှိပါသည်။ Gut Physiology တွင် ရောင်ရမ်းနေသော အလင်းရောင်ပုံများသည် sialic acid နှင့် N-acetylglucosamine အကြွင်းအကျန်များကို အသုံးပြု၍ fluorescent wheat germ agglutinin ကိုအသုံးပြု၍ အထပ်လိုက်ပုံနှစ်ခုကို "Host-Microbe" ကိုကိုယ်စားပြု Co-microbe တွင် အထပ်ထပ်ရှိသော ပုံနှစ်ခုကို ပြသသည် ချပ်ပြားတစ်ခုပေါ်ရှိ အစာအိမ်။ ဘယ်ဘက်အကန့်သည် သေးငယ်သော အင်ဂျင်နီယာ 3D Caco-2 epithelial ဆဲလ်များဖြင့် အစိမ်းရောင်ချောင်းပရိုတင်း (GFP) ကိုဖော်ပြသည့် E. coli ၏ တွဲဖက်ယဉ်ကျေးမှုကို ပြသသည်။ ညာဘက်အကန့်တွင် 3D Caco-2 နှင့် တွဲဖက်မွေးမြူထားသော GFP E. coli ၏ တည်နေရာပြမှုကို ပြသထားပြီး၊ ၎င်းနောက်တွင် Fluluorescence (Immunofluorescence) (အနုဓာတ်) ပါ၀င်သော ဆဲလ်များ။ မော်ဒယ်လုပ်ခြင်းသည် ကျန်းမာသောနှင့် ယိုစိမ့်နေသော အူများကို သရုပ်ဖော်သည့် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ စိန်ခေါ်မှုအောက်တွင် ဘက်တီးရီးယား အန်တီဂျင်များ (ဥပမာ၊ lipopolysaccharide၊ LPS) နှင့် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များ (ဥပမာ၊ PBMC၊ အစိမ်းရောင်)။ Caco-2 ဆဲလ်များကို 3D အရေပြားအလွှာတစ်ခု တည်ဆောက်ရန် မွေးမြူထားသည်။ စကေးဘား၊ “ခွင့်ပြုချက် 50 µm” အောက်ခြေတွင် ဆဲလ်များကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ from reference.၂။ အောက်စဖို့ဒ် တက္ကသိုလ် စာနယ်ဇင်း၊ Ref.5 မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ထုတ်ဝေသည်။ NAS; ref.3 မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားသော “Host-Microbe Co-Culture” NAS; ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်သော “ရောဂါပုံစံပြခြင်း”။ NAS
gut-on-chip နှင့် hybrid ချစ်ပ်နှစ်ခုလုံးကို ဆီလီကွန်မှိုမှိုထုတ်ထားသော PDMS ပုံစံတူများကို အသုံးပြု၍ ဖန်တီးထားပြီး SU-8 ဖြင့် ပုံစံချထားသည်။ ချစ်ပ်တစ်ခုစီရှိ microchannels ၏ ဒီဇိုင်းသည် shear stress နှင့် hydrodynamic pressure1,4,12.The original gut-on designed. ပေါင်းစပ်ထားသော မျဉ်းပြိုင်ဖြောင့်မိုက်ခရိုချန်နယ်များ၊ ရှုပ်ထွေးသောအူလမ်းကြောင်း-တစ်ချပ်သို့ တိုးလာသည် (Extended Data Fig. 1b) သည် အရည်နေထိုင်ချိန်ကို တိုးမြင့်လာစေရန်အတွက် ကွေးကွေးမိုက်ခရိုချန်နယ်တစ်စုံပါဝင်သည့် ရှုပ်ထွေးသော gut-on-a-chip အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲလာပါသည်။ 12 gut-on-a-chips များကို ရွေးချယ်နိုင်ပါသည်။ ရှုပ်ထွေးနေသော gut-Chip သည် အလားတူအချိန်ဘောင်တွင် 3D morphogenesis ကို ပြင်းပြင်းထန်ထန် ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြထားပါသည်။ ထို့ကြောင့် မူလ Gut-Chip နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ရှုပ်ထွေးသော 3D morphogenesis တွင် ထပ်တူထပ်မျှသော ဒီဇိုင်းပုံစံနှင့် မျဉ်းကြောင်းပြောင်းနိုင်သော PD နှင့် ထပ်တူထပ်မျှသော အသွင်အပြင်များကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ SU-8 ပုံစံများဖြင့် ဆီလီကွန်မှိုများပေါ်တွင် ကုသထားသော (ပုံ. 2a)။ ချစ်ပ်ပေါ်တွင် အူကို ဖန်တီးရန်၊ ပြင်ဆင်ထားသော အပေါ်ပိုင်း PDMS အလွှာကို အပေါက်များသော PDMS ဖလင်တစ်ခုနှင့် ဆက်တိုက် ချိတ်ဆက်ထားပြီး အောက်ပိုင်း PDMS အလွှာနှင့် ပေါင်းစပ်၍ corona ကုသခြင်း (ပုံ) ကို အသုံးပြု၍ ပြန်၍မရသော ချည်နှောင်မှုဖြင့် အောက်ပိုင်း PDMS အလွှာနှင့် ညှိထားသည်။ Transwell ထည့်သွင်းမှုများကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေနိုင်သော single-channel microfluidic ကိရိယာများဖန်တီးရန်အတွက် ဖန်စလိုက်များနှင့် ချိတ်တွဲထားသည် (ပုံ။ 2h နှင့် Extended Data Fig. 2)။ PDMS ပုံစံတူနှင့် ဖန်၏မျက်နှာပြင်များကို အောက်ဆီဂျင်ပလာစမာ သို့မဟုတ် ကိုရိုနာပိုးသတ်ဆေးဖြင့် ကုသခြင်းဖြင့် နှောင်ဖွဲ့ထားပါသည်။ microfabricated tube 3D ကို ပိုးသတ်ပြီးနောက် ကိရိယာကို တပ်ဆင်ရန်အတွက် ဆီလီကွန်ဗီဇကို အဆင်သင့်ဖြစ်စေခဲ့သည်။ အူလမ်းကြောင်း epithelium (ပုံ 2g)။
က၊ SU-8 ပုံစံစီလီကွန်မှိုများမှ PDMS အစိတ်အပိုင်းများ ပြင်ဆင်မှုပုံဥပမာ။ မကုသရသေးသော PDMS ဖြေရှင်းချက်အား ဆီလီကွန်မှိုတစ်ခု (ဘယ်ဘက်) တွင် လောင်းချပြီး 60°C (အလယ်) တွင် ကုသပြီး (ညာဖက်တွင်) ဖယ်ရှား၍ ဖယ်ရှားထားသော PDMS ကို အပိုင်းပိုင်းဖြတ်ပြီး သန့်စင်လိုက်ပါသည်။b၊ အပေါ်ပိုင်းပြင်ဆင်ရန်အတွက် အသုံးပြုထားသည့် မှိုဓာတ်ပုံ၊ silic မှိုဓာတ်ပုံ။ PDMS porous membrane.d ကို ဖန်တီးရာတွင် အသုံးပြုသည့် ဆီလီကွန်မှို၊ အပေါ်နှင့် အောက် PDMS အစိတ်အပိုင်းများ၏ ဓာတ်ပုံများ အတွဲလိုက်နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော on-chip အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ device.e၊ အပေါ်၊ အမြှေးပါးနှင့် အောက်ပိုင်း PDMS အစိတ်အပိုင်းများကို ချိန်ညှိခြင်း၏ ဇယားကွက်ဖြစ်သည်။ အလွှာတစ်ခုစီကို ပလာစမာ သို့မဟုတ် ကော်ရိုနာတက်စတိုနာဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ကိရိယာဖြင့် ပေါင်းစပ်၍မရပါ။f၊ ပေါင်းတင်ထားသော ရှုပ်ထွေးနေသော မိုက်ခရိုချန်နယ်များနှင့် လေဟာနယ်အခန်းများ။g၊ microfluidic ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုအတွက် အူလမ်းကြောင်း-တစ်ချပ်ကို တပ်ဆင်ခြင်း။ ဆီလီကွန်ပြွန်နှင့် ဆေးထိုးပြွန်ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ချစ်ပ်ပြားပေါ်ရှိ အူကို အဖုံးစလစ်ပေါ်တွင် ထားရှိထားပါသည်။ ချစ်ပ်ကိရိယာကို 150 မီလီမီတာ Petri ပန်းကန်၏ အဖုံးပေါ်တွင် ထားရှိထားပါသည်။ စီမံဆောင်ရွက်ရန်အတွက် လျှပ်တစ်ပြွန်၏ ပူသောဆီးလီကွန်ပိုက်များကို အသုံးပြုပါသည်။ မျိုးစပ်ချစ်ပ်များကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ခြင်းနှင့် 3D morphogenesis။ Transwell ထည့်သွင်းမှုများကို အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelial ဆဲလ်များ၏ ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ 2D monolayers များအတွက် သီးခြားပြင်ဆင်ထားသော ပေါင်းစပ်ထည့်သွင်းမှုများကို အူလမ်းကြောင်း 3D morphogenesis ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် ပေါင်းစပ်ထားသောချစ်ပ်များကို ထည့်သွင်းထားပါသည်။ ၎င်းအား အလယ်အလတ်ကို ရည်ညွှန်းပြီး မိုက်ခရိုချန်နယ်များမှတစ်ဆင့် ပျံ့နှံ့သွားပါသည်။ Reprint ပေါ်တွင်တည်ဆောက်ထားသော Sc. 1 စင်တီမီတာ၊ Transwell တွင်ထည့်သွင်းထားသည်။ Elsevier
ဤပရိုတိုကောတွင် Caco-2 ဆဲလ်လိုင်းနှင့် အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ organoids များကို epithelial ရင်းမြစ်များ (ပုံ. 3a) အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆဲလ်အမျိုးအစားနှစ်မျိုးလုံးကို သီးခြားလွတ်လပ်စွာ မွေးမြူထားသည် (Box 2 နှင့် Box 5) နှင့် on-chip အူလမ်းကြောင်း သို့မဟုတ် Transwell ထည့်သွင်းမှုများ၏ ECM-coated microchannels များကို မျိုးစေ့ချရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆဲလ်များ ရောထွေးသွားသည့်အခါ (> 95% တွင်)၊ trypsinization fluid (box 2) ဖြင့် ဆက်စပ်နေသော ဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းများကို ပြင်ဆင်ရန်အတွက် T-flasks အတွင်းရှိ Caco-2 ဆဲလ်များ (အခန်း 10 နှင့် 50 ကြား) ကို ရိတ်သိမ်းပြီးဖြစ်သည်။ Box 3 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း morphogens (ဥပမာ Wnt၊ R-spondin နှင့် Noggin) နှင့် organoids များသည် အချင်း ~500 µm အထိကြီးထွားလာသည်အထိ တစ်ရက်ခြား ဖြည့်စွက်၍ ကြီးထွားလာသော organoids များကို ရိတ်သိမ်းပြီး ဆဲလ်တစ်ခုတည်းအဖြစ် ခွဲထုတ်လိုက်သည် ။ type12,13 (ဥပမာ ulcerative colitis၊ Crohn's disease၊ အူမကြီးကင်ဆာ၊ သို့မဟုတ် ပုံမှန်အလှူရှင်)၊ lesion site (ဥပမာ- lesion versus non-lesioned area) နှင့် tract in gastrointestinal location (ဥပမာ- duodenum၊ jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum) 5 ကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပေးပါသည်။ အူသိမ်အူလမ်းကြောင်း organoids များထက် morphogens များ ပိုမိုပါဝင်မှု ပိုမိုလိုအပ်သော (coloids)။
a၊ အူမကြီးအတွင်းရှိ အူမကြီးဆဲလ်များကို ထုတ်ပေးရန်အတွက် အလုပ်အသွားအလာကို 3D morphogenesis သရုပ်ပြရန်အတွက် ဤပရိုတိုကောတွင် Caco-2 လူ၏အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ epithelium နှင့် အူတွင်း organoids များကို အသုံးပြုပါသည်။ (PDatta ဆဲလ်များကိုမြင်ရပြီး သီးခြားခွဲထုတ်ထားသောဆဲလ်များကို ပြင်ဆင်ထားသော gut-on-a-chip စက်ပစ္စည်း (chip ပြင်ဆင်မှု) ကိုမြင်ရသည်)။ နေ့ 0 (D0) တွင် ပေါက်နေသော အမြှေးပါး (apical) (AP) စီးဆင်းမှုကို အစပြုပြီး ပထမ 2 ရက် (စီးဆင်းမှု၊ AP၊ D0-D2) တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ Basolateral (BL) စီးဆင်းမှုကို 2D monolayer အပြီးသတ် 2D monolayer ပေါ်ပေါက်လာသောအခါတွင် စက်ဝိုင်းပုံဆန့်သောလှုပ်ရှားမှုများ (stretch, flow, AP နှင့် BL) တို့နှင့်အတူ စတင်ပါသည်။ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ မျိုးဗီဇ 3D ၏ morphofly 5 ရက်အကြာတွင် ဖြစ်ပေါ်သော အမိုက်စားအဆီများ (morphogenesis၊ D5)။ အဆင့်ဆန့်ကျင်ဘက်ပုံများသည် စမ်းသပ်အဆင့် သို့မဟုတ် အချိန်မှတ်တစ်ခုစီတွင် Caco-2 ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်စားပြုပုံသဏ္ဍာန်ကိုပြသသည် (ဘားဂရပ်၊ 100 µm)။ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ အကျိအချွဲလေးခုကို သရုပ်ဖော်သည့် ဇယားကွက်လေးခုသည် (ညာဘက်ထိပ်)။ မျက်နှာပြင်၏ FluidEM ၏ လမ်းကြောင်းကိုပြသသည့် မျဉ်းတန်းလေးများ။ 3D Caco-2 epithelium (ဘယ်ဘက်)။ ချဲ့ထားသော ဧရိယာ (အဖြူရောင်အကွက်အကွက်များ) ကို မီးမောင်းထိုးပြထားသည့် အပေါက်သည် 3D Caco-2 အလွှာ (ညာဘက်) ရှိ 3D Caco-2 အလွှာ (ညာဘက်) ပေါ်ရှိ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ထားသော မိုက်ခရိုဗီလီကို ပြသသည်။c၊ တည်ထောင်ထားသော Caco-2 3D ၏ အလျားလိုက် မြင်ကွင်း၊ claudin (ZO-1၊ အနီရောင်) နှင့် Immunocle တံဆိပ်တပ်ထားသော အဆက်မပြတ်စုတ်တံ (fluoriblen) (F-actein) အူချစ်ပ်များပေါ်ရှိ epithelial ဆဲလ်များ၏ ဖော်မြူလာများကို ပုံဖော်ခြင်း။ အလယ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို ညွှန်ပြသော မြှားများသည် confocal view.d တစ်ခုစီအတွက် focal plane ၏တည်နေရာကို ညွှန်ပြသည်၊ ရက် 3၊ 7၊ 9၊ 11၊ နှင့် 13 တွင် ပံ့ပိုးထားသော ချစ်ပ်ပေါ်တွင် ပုံဖော်ထားသော organoids များ၏ ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများ၏ အချိန်ကာလလမ်းကြောင်းကို ပြသည် 7.f တွင် ရိုက်ယူထားသော အူလမ်းကြောင်းရှိ organoid 3D epithelium ၏ ဓာတ်ပုံ၊ ပင်မဆဲလ်များ (LGR5; ပန်းခရမ်းရောင်)၊ goblet cells (MUC2; အစိမ်းရောင်)၊ F-actin (မီးခိုးရောင်) နှင့် nuclei (စိမ်းပြာရောင်) တို့သည် အူချောင်းကြော်များပေါ်တွင် (၃)ရက်ကြာ စိုက်ပျိုးထားသော အမှတ်အသားများကို ပြသသော ဓါတ်ပုံများ epithelial အလွှာပေါ်ရှိ Extended Data Figure 3 ကိုလည်း ကြည့်ပါ။ MUC2 အချက်ပြခြင်းမရှိဘဲ LGR5 အချက်ပြခြင်းကို မီးမောင်းထိုးပြသည့် တိုးချဲ့ဒေတာပုံ 3 ကိုကြည့်ပါ။ ဖလိုရက်စတန်းပုံများသည် 3D organoid epithelium (ညာဘက်) ၏ အူလမ်းကြောင်းအတွင်းရှိ 3D organoid epithelium ကို CellMask ဆိုးဆေးဖြင့် စွန်းထင်းစေခြင်းဖြင့် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ ပလာစမာအမြှေးပါးကို အခြား 3 bar မှ 1 μal နှင့် 1 µ ယဉ်ကျေးမှုမရှိပေ။ stated.b ရည်ညွှန်းချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ပုံနှိပ်သည်။၂။ အောက်စဖို့ဒ် တက္ကသိုလ် စာနယ်ဇင်း၊ c Reference.2 မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်။ အောက်စဖို့ဒ် တက္ကသိုလ် စာနယ်ဇင်း၊ e နှင့် f ကို ကိုးကား၍ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။12 Creative Commons လိုင်စင် CC BY 4.0 အောက်တွင်။
ချစ်ပ်တစ်ခုပေါ်ရှိ အစာအိမ်အတွင်း၊ အောင်မြင်သော ECM အပေါ်ယံပိုင်းအတွက် PDMS အပေါက်များရှိသော အမြှေးပါး၏ hydrophobic မျက်နှာပြင်ကို မွမ်းမံပြင်ဆင်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤပရိုတိုကောတွင်၊ PDMS အမြှေးပါးများ၏ hydrophobicity ကိုမွမ်းမံရန်အတွက် မတူညီသောနည်းလမ်းနှစ်ခုကို အသုံးပြုထားပါသည်။ Caco-2 ဆဲလ်များကို မွေးမြူရန်အတွက်၊ UV/ozone ကုသမှုဖြင့် မျက်နှာပြင်ကို တက်ကြွစေသော Ca နှင့် ECM ၏ hydrophobicity ကို လျှော့ချရန် Caco-2 ဆဲလ်များ၏ မျက်နှာပြင်ကို ပေါင်းစပ်ထားရုံဖြင့် လုံလောက်ပါသည်။ PDMS အမြှေးပါး။သို့သော်၊ organoid epithelium ၏ microfluidic ယဉ်ကျေးမှုသည် polyethyleneimine (PEI) နှင့် glutaraldehyde ကို PDMS မိုက်ခရိုချန်နယ်များသို့ စဉ်ဆက်မပြတ် အသုံးချခြင်းဖြင့် မျက်နှာပြင်ပြုပြင်မွမ်းမံပြီးနောက် ECM ပရိုတိန်းများကို ဖုံးအုပ်ရန် ECM ပရိုတင်းများကို ထိရောက်စွာ အပ်နှံရန် လိုအပ်ပါသည်။ epithelium။ဆဲလ်များကို ချိတ်ဆက်ပြီးနောက်၊ microfluidic ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုသည် ဆဲလ်များကို ပြီးပြည့်စုံသော monolayer အဖြစ်ဖွဲ့စည်းသည်အထိ အလယ်အလတ်ကို မိုက်ခရိုချန်နယ်သို့သာ ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် စတင်ကာ အောက်ပိုင်း မိုက်ခရိုချန်နယ်သည် တည်ငြိမ်သောအခြေအနေများကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ မျက်နှာပြင်အသက်သွင်းခြင်းနှင့် ECM အပေါ်ယံပိုင်းအတွက် အကောင်းဆုံးပြင်ဆင်ထားသော ဤနည်းလမ်းသည် မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။
Transwell ယဉ်ကျေးမှုများသည် ဆဲလ်အစေ့မစေ့မီ ECM coating လိုအပ်ပါသည်။ သို့သော်လည်း Transwell ယဉ်ကျေးမှုများသည် အပေါက်များရှိသော ထည့်သွင်းမှုများ၏မျက်နှာပြင်ကိုအသက်သွင်းရန်အတွက် ရှုပ်ထွေးသောကြိုတင်ပြင်ဆင်မှုအဆင့်များမလိုအပ်ပါ။ Transwell ထည့်သွင်းမှုများတွင် Caco-2 ဆဲလ်များကြီးထွားလာသည့်အတွက်၊ အပေါက်များပေါ်ရှိ ECM အပေါ်ယံအလွှာများပေါ်တွင် ကွဲနေသော Caco-2 ဆဲလ်များ၏ပူးတွဲမှုကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည် (<1 နာရီ) နှင့် တင်းကျပ်သောလမ်းဆုံအတားအဆီးများဖွဲ့စည်းခြင်း (<1-2 ရက်အတွင်း) ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာထည့်သွင်းမှုများကို Transwell တွင်မြင်ရသည် အမြှေးပါးမျက်နှာပြင် (<3 နာရီ) တွင် တွဲလျက် ပေါင်းထည့်မှုများကို organoids များသည် အတားအဆီး ခိုင်မာမှုရှိသော ပြီးပြည့်စုံသော monolayer တစ်ခုအဖြစ် ထိန်းသိမ်းထားသည်။Transwell ယဉ်ကျေးမှုများကို ပေါင်းစပ်ချစ်ပ်များ အသုံးမပြုဘဲ 24- well plates တွင် လုပ်ဆောင်သည်။
In vitro 3D morphogenesis သည် တည်ထားသော epithelial အလွှာ၏ basolateral အသွင်အပြင်သို့ အရည်စီးဆင်းမှုကို အသုံးချခြင်းဖြင့် အစပြုနိုင်သည်။ ချစ်ပ်တစ်ခုပေါ်ရှိ အစာအိမ်တွင်၊ ကြားခံအား အထက်နှင့်အောက် မိုက်ခရိုချန်နယ်များသို့ ပျံ့နှံ့သွားသောအခါ (ပုံ. 3a) တွင် ပျံ့နှံ့သွားသောအခါတွင် စတင်နိုင်သည်)။ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ အဆက်မပြတ်အဆီပြန်သွင်းခြင်းအတွက် အရေးကြီးသည် ဦးတည်ချက်ဖြင့် လျှို့ဝှက်ထားသော morphogen inhibitors။ ပေါက်ရောက်သော အမြှေးပါးများပေါ်တွင် ချည်နှောင်ထားသော ဆဲလ်များအတွက် အာဟာရဓာတ်နှင့် သွေးရည်ကြည်ကို လုံလောက်စွာ ဖြည့်ဆည်းပေးပြီး အလင်းဝင်ပေါက်ဖိစီးမှုကို ထုတ်ပေးရန်အတွက်၊ ပုံမှန်အားဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့သည် အူအတွင်းနှစ်ခုကို ချပ်ပြားတစ်ခုပေါ်တွင် အသုံးပြုပါသည်။ စပ်စပ်ချစ်ပ်များတွင်၊ epithelial monolayers ပါရှိသော Transwell ထည့်သွင်းမှုများကို hybrid ချစ်ပ်ပြားများထဲသို့ ထည့်သွင်းထားသည်။ ထို့နောက်၊ Transporous ချန်နယ်၏အလယ်အလတ်ကို baso အောက်တွင် ထည့်သွင်းပေးပါသည်။ ယဉ်ကျေးမှုပလက်ဖောင်းနှစ်ခုလုံးတွင် basolateral စီးဆင်းမှုစတင်ပြီးနောက် 3-5 ရက်အကြာတွင် morphogenesis ဖြစ်ပွားသည်။
Phase contrast microscopy၊ differential interference contrast (DIC) microscopy၊ SEM သို့မဟုတ် immunofluorescence confocal microscopy (ပုံ 3 နှင့် 4) အပါအဝင် အမျိုးမျိုးသော ပုံရိပ်ဖော်နည်းများကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်ပါသည်။ 3D epithelial အလွှာများ၏ အပေါက်များ။ PDMS နှင့် polyester ရုပ်ရှင်များ၏ အလင်းဝင်ပေါက်ကြောင့်၊ gut-on-a-chip နှင့် hybrid ချစ်ပ်ပလပ်ဖောင်းနှစ်ခုလုံးသည် စက်ကို အပိုင်းခွဲခြင်း သို့မဟုတ် ဖြုတ်ထုတ်ရန်မလိုအပ်ဘဲ စက်၏ပုံသဏ္ဍာန်တွင် အချိန်နှင့်တပြေးညီ ပေးစွမ်းနိုင်ပါသည်။ immunofluorescence ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်သောအခါ (ပုံမှန်အားဖြင့် ဆဲလ် 3 ခု၊ 1 ပုံများ) 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) နှင့် နောက်တွင် Triton X-100 နှင့် 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA) ၊ ဆဲလ်အမျိုးအစားပေါ် မူတည်၍ ကွဲပြားသော fixatives၊ permeabilizers နှင့် blocking agents များကို အသုံးပြုနိုင်သည်။ Primary antibodies များသည် ဆဲလ်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော ဆဲလ်အမျိုးအစားများ သို့မဟုတ် အမျိုးအစားအလိုက် အသားပေးဖော်ပြခြင်းအတွက် အဓိကကျသော ပဋိပစ္စည်းများကို အမျိုးအစားအလိုက် ခွဲခြားထားသော ဆဲလ်များအဖြစ် အသားပေးဖော်ပြသည်။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိနေရာ၊ နောက်တွင် နျူကလိယ (ဥပမာ၊ 4′၊6-diamidino-2-phenylene) indole၊ DAPI) သို့မဟုတ် F-actin (ဥပမာ၊ ဖါလိုဒီဒင်ဟု တံဆိပ်တပ်ထားသော ချောင်းဆိုးဆေး) နှင့်အတူ နျူကလိယ (ဥပမာ- 4′၊6-diamidino-2-phenylene) indole၊ DAPI) သို့မဟုတ် F-actin (ဥပမာ၊ ဖါလိုဒီဒင်ဟု တံဆိပ်တပ်ထားသည့် fluorescently တံဆိပ်တပ်ထားသော))။ ဖလအိုရီစတက်ကို အခြေခံသည့် တိုက်ရိုက်ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကိုလည်း “FiC” နှင့် ကွဲပြားသော ချွဲများကို ရှာဖွေဖော်ထုတ်နိုင်သည် ဇီဝကမ္မဗေဒ”)၊ အဏုဇီဝဆဲလ်များ၏ ကျပန်းကိုလိုနီပြုခြင်း (ပုံ။ 1၊ “Host-microbe တွဲဖက်ယဉ်ကျေးမှု”)၊ ခုခံအားဆဲလ်များစုဆောင်းခြင်း (ပုံ။ 1၊ 'ရောဂါပုံစံရေးဆွဲခြင်း') သို့မဟုတ် 3D epithelial morphology ၏အသွင်အပြင်များ (ပုံ. 3c,f နှင့် 4b,cut ပေါ်ရှိ အမိုက်စားအလွှာမှ အပေါ်ပိုင်းအထိ ခွဲထုတ်ခြင်း)။ ref. တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အလွှာသည် ပုံ 2 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ 3D epithelial morphology နှင့် apical brush border ရှိ microvilli တို့ကို SEM (ပုံ. 3b) မှမြင်ယောင်နိုင်သည် (ပုံ. 3b)။ GD အလွှာ၏ quantitative PCR5 သို့မဟုတ် single-cell RNA sequencing တွင် ဤဆဲလ်များ၏ အရေအတွက် PCR5 သို့မဟုတ် single-cell RNA ဆင့်ပွားမှုကို လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် ကွဲပြားခြင်းအမှတ်အသားများ၏ဖော်ပြမှုကို အကဲဖြတ်နိုင်ပါသည်။ ချစ်ပ်များ သို့မဟုတ် မျိုးစပ်ချစ်ပ်များကို trypsinization ဖြင့် ရိတ်သိမ်းပြီးနောက် မော်လီကျူး သို့မဟုတ် မျိုးရိုးဗီဇခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးပြုသည်။
a၊ မျိုးစပ်ချစ်ပ်တစ်ခုရှိ အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် အလုပ်အသွားအလာကို ပေါင်းစပ်ထားသော ချစ်ပ်ပြားတစ်ခုတွင် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ Caco-2 နှင့် အူလမ်းကြောင်း organoids များကို ဤပရိုတိုကောတွင် အသုံးပြုပြီး ပေါင်းစပ်ထားသော ချစ်ပ်ပလပ်ဖောင်းတွင် 3D morphogenesis ကိုသရုပ်ပြရန်။ ပေါင်းစပ်ထားသော အသားတင်ဆဲလ်များကို ပြင်ဆင်ထားသော Transwell ထည့်သွင်းမှုများ (TW ကြိုတင်ပြင်ဆင်ထားသော အမြှေးပါးများ) တွင် တွဲဆက်ထားသည် (ပုံတွင်ကြည့်ပါ) (အောက်ပါပုံတွင်ကြည့်ပါ)။ ထည့်သွင်းမှုများ၊ ဆဲလ်အားလုံးကို တည်ငြိမ်သောအခြေအနေများ (TW ယဉ်ကျေးမှု) အောက်တွင် မွေးမြူထားပါသည်။ 7 ရက်အကြာတွင်၊ epithelial ဆဲလ်များ၏ 2D monolayer ပါရှိသော Transwell ထည့်သွင်းမှုတစ်ခုအား ပေါင်းစပ်ထားသော ချစ်ပ်တစ်ခုထဲသို့ ပေါင်းစည်းလိုက်သည် စမ်းသပ်အဆင့် သို့မဟုတ် အချိန်မှတ်တစ်ခုစီတွင် ပုံမှန်အလှူရှင် (C103 မျဉ်းကြောင်း) မှ ဆင်းသက်လာခြင်းဖြစ်သည်။ စမ်းသပ်အဆင့် သို့မဟုတ် အချိန်မှတ်တစ်ခုစီတွင် အထက်အလွှာရှိ ဇယားကွက်များက အဆင့်တစ်ဆင့်ချင်းစီအတွက် စမ်းသပ်ဖွဲ့စည်းမှုပုံစံကို သရုပ်ဖော်သည်။ စပ်စပ်ချစ်ပ်များ (ဘယ်ဘက်ပုံသဏ္ဍာန်) သည် 3D ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်၊ အပေါ်မှအောက်သို့ သေးငယ်သောပုံစံနှင့် ညာဘက်အောက်ပိုင်းရှိ ကွဲပြားသော သေးငယ်သောအနေအထားကိုမြင်ရသည့် organoid epithelial ဆဲလ်များ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် သက်ဆိုင်သော အစက်ချမျဉ်းများ)။ ထင်ရှားသောရုပ်ပုံသဏ္ဍာန်လက္ခဏာများကိုပြသခဲ့သည်။F-actin (စိမ်းပြာရောင်)၊ နျူကလိယ (မီးခိုးရောင်)။c၊ static Transwell (TW; static Transwell တွင် မွေးမြူထားသော organoid-derived epithelial cells များ၏ Fluorescence confocal micrographs (3D ထောင့်ချိုး))၊ 2D ဒေါင်လိုက်ဖြတ်ပိုင်းမြင်ကွင်းများ (ညာဘက်အပေါ်ထောင့်တွင်ထည့်သွင်း; “XZ”) သည် 2D နှင့် 3D အင်္ဂါရပ်များကိုပြသသည်။ စကေးဘား၊ 100 µm.c ကိုရည်ညွှန်းချက်မှခွင့်ပြုချက်ဖြင့်ပြန်လည်ပုံနှိပ်ထားသည်။4. Elsevier
တူညီသောဆဲလ်များ (Caco-2 သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်းရှိ organoid epithelial ဆဲလ်များ) ကို သမားရိုးကျအငြိမ်ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေများအောက်တွင် နှစ်ဖက်မြင်အလွှာများအဖြစ် မွေးမြူခြင်းဖြင့် ထိန်းချုပ်မှုများကို ပြင်ဆင်နိုင်သည်။ သိသိသာသာ၊ အာဟာရဓာတ်များ လျော့နည်းသွားခြင်းသည် microchannels များ၏ ပမာဏအကန့်အသတ်ရှိခြင်း (ဆိုလိုသည်မှာ မူလအူချပ်ချပ်ဒီဇိုင်း၏ အပေါ်ဆုံးချန်နယ်တွင် ~ 4 µL) ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည် ။ထို့အပြင် အပလီကေးရှင်းမပြီးမီ၊ နှိုင်းယှဥ်ပါ။
ပျော့ပျောင်းသော lithography လုပ်ငန်းစဉ်ကို သန့်ရှင်းသောအခန်းတွင် ပြုလုပ်သင့်သည်။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အလွှာတစ်ခုစီ (အပေါ်နှင့်အောက်အလွှာများနှင့် အမြှေးပါးများ) နှင့် စပ်ဆက်ချစ်ပ်များအတွက် မတူညီသော photomasks များကို သီးခြားစီလီကွန် wafers များတွင် အသုံးပြုပြီး မိုက်ခရိုချန်နယ်များ၏ အမြင့်များသည် ကွဲပြားသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်း၏ မိုက်ခရိုချန်နယ်များ၏ ပစ်မှတ်အမြင့်သည် 500 µm နှင့် 500 µm အသီးသီးရှိသည်။ hybrid ချစ်ပ်သည် 200 µm ဖြစ်သည်။
3-လက်မအရွယ် ဆီလီကွန်ဝေဖာကို acetone ဖြင့် ပန်းကန်တစ်ခုတွင် ထားလိုက်ပါ။ပန်းကန်ပြားကို စက္ကန့် 30 ကြာ အသာအယာ လှုပ်ခါပြီးနောက် wafer ကို လေအခြောက်ခံပါ။ wafer ကို IPA ဖြင့် ပန်းကန်ပြားတစ်ခုသို့ လွှဲပြောင်းပြီးနောက် ပန်းကန်ပြားကို သန့်ရှင်းရန် စက္ကန့် 30 ကြာ မွှေပေးပါ။
piranha ဖြေရှင်းချက် (ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ်နှင့် စုစည်းထားသော ဆာလဖူရစ်အက်ဆစ်၊ 1:3 (vol/vol))) ကို ဆီလီကွန် wafer မျက်နှာပြင်မှ အော်ဂဲနစ်အကြွင်းအကျန်များကို ဖယ်ထုတ်ရန်အတွက် ရွေးချယ်နိုင်သည် ။
Piranha ဖြေရှင်းချက်သည် အလွန်အမင်း အဆိပ်သင့်ပြီး အပူထုတ်ပေးပါသည်။ နောက်ထပ်ဘေးကင်းရေး ကြိုတင်ကာကွယ်မှုများ လိုအပ်ပါသည်။ အမှိုက်စွန့်ပစ်ရန်အတွက်၊ ဖြေရှင်းချက်အား အအေးခံပြီး သန့်ရှင်းခြောက်သွေ့သော အမှိုက်ပုံးသို့ လွှဲပြောင်းခွင့်ပြုပါ။ ဒုတိယကွန်တိန်နာများကို အသုံးပြုကာ အမှိုက်ပုံးများကို စနစ်တကျတံဆိပ်ကပ်ပါ။ ပိုမိုအသေးစိတ်သောလုပ်ငန်းစဉ်များအတွက် စက်ရုံ၏ဘေးကင်းရေးလမ်းညွှန်ချက်များကို လိုက်နာပါ။
wafer များကို 200°C ပူသောပန်းကန်ပေါ်တွင် 10 မိနစ်ကြာထားခြင်းဖြင့် wafer ကို ရေဓာတ်ခန်းခြောက်စေပြီးနောက် အအေးခံရန်အတွက် wafer ကို လေထဲတွင် ငါးကြိမ်လှုပ်ပေးပါ။
photoresist SU-8 2100 ၏ ~10 g ကို သန့်စင်ထားသော ဆီလီကွန် wafer ၏ အလယ်ဗဟိုပေါ်သို့ လောင်းချပါ။ wafer ပေါ်တွင် photoresist အညီအမျှ ပျံ့နှံ့စေရန် ချီဇာများကို အသုံးပြုပါ။ wafer ကို 65°C အပူချိန်ရှိသော ပန်းကန်ပြားပေါ်တွင် ရံဖန်ရံခါ ထားကာ photoresist များ စေးကပ်မှု နည်းပါးစေရန်နှင့် ပြန့်နှံ့ရန် ပိုမိုလွယ်ကူစေရန် အတွက် wafer ကို ပန်းကန်ပြားပေါ်တွင် တိုက်ရိုက် မတင်ပါနှင့်။
SU-8 အား လှည့်ပတ်အပေါ်ယံပိုင်းဖြင့် လှည့်ပတ်ခြင်းဖြင့် wafer ပေါ်တွင် အညီအမျှ ဖြန့်ဝေခဲ့သည်။ SU-8 ၏ လည်ပတ်မှုကို 5-10 စက္ကန့်အတွင်း 500 rpm တွင် အရှိန် 100 rpm/s တွင် ပျံ့နှံ့စေရန်အတွက် ပင်မလှည့်ပတ်မှုကို 200 µm အထူပုံစံ (သို့) 1,500 aµ rpm တွင် အောင်မြင်ရန် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူ၏အပေါ်ပိုင်းအလွှာအတွက် 500 µm အမြင့်ကို အောက်တွင်ဖော်ပြထားသော “အရေးပါသောခြေလှမ်းများ” ကိုကြည့်ပါ) 300 rpm/s 30 seconds တွင် 1,200 rpm တွင် အရှိန်သတ်မှတ်ထားသည်။
ဆီလီကွန် wafer ပေါ်ရှိ SU-8 ပုံစံ၏ ပစ်မှတ်အထူအတိုင်း ပင်မလှည့်ဖျားနှုန်းကို ချိန်ညှိနိုင်သည်။
ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူ၏အပေါ်ပိုင်းအလွှာအတွက် 500 µm အမြင့်ရှိသော SU-8 ပုံစံများကို ဖန်တီးရန်၊ ဤသေတ္တာ၏ လှည့်ပတ်အလွှာနှင့် အပျော့စား မုန့်ဖုတ်အဆင့်များ (အဆင့် 7 နှင့် 8) တို့ကို စဉ်ဆက်မပြတ် ထပ်ခါတလဲလဲ (အဆင့် 9 တွင်ကြည့်ပါ) 250 µm ထူထပ်သော SU-8 အလွှာနှစ်လွှာကို ထုတ်လုပ်ရန်၊ ဤ 0 ex ကို ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် အဆင့် 1 box တွင် ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ဖြင့် ပေါင်းနိုင်သော အလွှာတစ်ခုဖြစ်သည်။ µm မြင့်သည်။
SU-8 coated wafers များကို 65°C တွင်ပူသောပန်းကန်တစ်ခုတွင် 5 မိနစ်ကြာဂရုတစိုက်ထားခြင်းဖြင့် SU-8 coated wafers များကို နူးညံ့စွာဖုတ်ပြီး၊ ထို့နောက် setting ကို 95°C သို့ပြောင်းကာ နောက်ထပ် 40 မိနစ်ကြာ ဖုတ်ပေးပါ။
အထက်မိုက်ခရိုချန်နယ်ရှိ SU-8 ပုံစံ၏ 500 μm အမြင့်ကို ရရှိရန်အတွက် 250 μm ထူသော SU-8 အလွှာနှစ်ခုကို ထုတ်ပေးရန်အတွက် အဆင့် 7 နှင့် 8 ကို ထပ်လုပ်ပါ။
UV Mask Aligner ကို အသုံးပြု၍ wafer ၏ အလင်းဝင်ချိန်ကို တွက်ချက်ရန် ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း ဆီမီးစမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ပါ။(အလင်းဝင်သည့်အချိန်၊ ms) = (ထိတွေ့မှုပမာဏ၊ mJ/cm2)/(မီးအိမ် ပါဝါ၊ mW/cm2)။
ထိတွေ့မှုအချိန်ကို ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက်၊ UV mask aligner ၏ mask ကိုင်ဆောင်သူတွင် photomask ကို တပ်ဆင်ပြီး photomask ကို SU-8 coated wafer ပေါ်တွင် တင်ပါ။
ခရမ်းလွန်ပျံ့လွင့်မှုကို လျှော့ချရန် SU-8 coated side တွင် ပုံနှိပ်ထားသော photomask ၏ မျက်နှာပြင်ကို ဆီလီကွန် wafer တွင် တိုက်ရိုက်ထားပါ။
ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသော ထိတွေ့မှုအချိန်အတွက် SU-8 coated wafer နှင့် photomask ကို UV light ၏ 260 mJ/cm2 သို့ ဒေါင်လိုက် ဖြန့်ထုတ်ပါ (ဤပုံး၏ အဆင့် 10 ကိုကြည့်ပါ)။
ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ထိတွေ့ပြီးနောက်၊ SU-8-coated silicon wafers များကို 5 မိနစ်ကြာအောင် 65°C နှင့် 95°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ ဖုတ်ပြီး 200 μm အမြင့်ရှိသော ပုံစံများကို ဖန်တီးရန်အတွက် ပူနွေးသောပန်းကန်တစ်ခုစီတွင် 15 မိနစ်ခန့် ဖုတ်၍ ဖုတ်ပြီးချိန်ကို 95°C မှ 30 မိနစ်အထိ တိုးမြှင့်လိုက်ပါ။
developer သည် ဖန်ပန်းကန်ထဲသို့ လောင်းထည့်လိုက်ပြီး ဖုတ်ထားသော wafer ကို ပန်းကန်ထဲတွင် ထည့်ထားသည်။ SU-8 developer ၏ ပမာဏသည် ဖန်ပန်းကန် အရွယ်အစားပေါ်မူတည်၍ ကွဲပြားနိုင်ပါသည်။ မထိတွေ့ရသေးသော SU-8 developer ကို လုံလောက်သော SU-8 ကို အသုံးပြုကြောင်း သေချာပါစေ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ အချင်း 150 mm ရှိသော ဖန်ပန်းကန်ကို အသုံးပြုသည့်အခါ 1 L ပမာဏရှိသော မှိုအတွက် ~ 300 mL ကို အသုံးပြုပါ။ 300 mL ကို အသုံးပြုပါ။ ရံဖန်ရံခါ ညင်သာစွာ လှည့်ပတ်ခြင်း။
တီထွင်ထားသောမှိုကို လတ်ဆတ်သော developer ၏ ~10 mL ဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက် IPA ဖြင့် ဖြေရှင်းချက်ကို pipette သုံးပြီး ဖြန်းပေးပါ။
wafer ကို ပလာစမာ သန့်စင်သည့် နေရာတွင် ထားကာ အောက်ဆီဂျင် ပလာစမာ (လေထု ဓာတ်ငွေ့၊ ပစ်မှတ် ဖိအား 1 × 10−5 Torr၊ ပါဝါ 125 W) ကို 1.5 မိနစ် ထားပါ။
wafer ကို အတွင်းပိုင်းရှိ ဖန်ဆလိုက်ဖြင့် ဖန်စလစ်ဖြင့် ထားပေးပါ။ Wafer နှင့် slides များကို ဘေးချင်းကပ်ထားနိုင်ပါသည်။ အကယ်၍ ဖုန်စုပ်စက်ကို ပန်းကန်ပြားတစ်ခုဖြင့် အလွှာများစွာ ခွဲထားပါက၊ အောက်ခန်းတွင် ဆလိုက်များကို ထားကာ အပေါ်ခန်းတွင် wafer များကို ထားပေးပါ။ trichloro 100 μL ၏ trichloro (1H, 1H,2H, 1H) ဖန်ခွက်ပေါ်တွင် ချပေးပါ။ လျှောကျပြီး silanization အတွက် လေဟာနယ်ကို လိမ်းပါ။
37°C ရေချိုးခန်းတွင် အေးခဲထားသော Caco-2 ဆဲလ်ပုလင်းတစ်လုံးကို ရောပြီး ရောထားသော ဆဲလ်များကို 37°C ကြိုတင်ပူနွေးထားသည့် Caco-2 ကြားခံဓာတ် 15 mL ပါရှိသော T75 ဘူးထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။
Caco-2 ဆဲလ်များကို ~ 90% confluency တွင် ဖြတ်ရန်၊ 37°C ရေချိုးခန်းတွင် ပထမဆုံး Caco-2 အလတ်စား၊ PBS နှင့် 0.25% trypsin/1 mM EDTA နွေးနွေးကို ဖြတ်သန်းပါ။
ဖုန်စုပ်စက်ဖြင့် ကြားခံအား စုပ်ထုတ်ပါ။ ဆဲလ်များကို နွေးထွေးသော PBS 5 mL ဖြင့် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောပြီး လတ်ဆတ်သော PBS ကို ထပ်လောင်းပါ။