Nature.com मा जानुभएकोमा धन्यवाद।तपाईँले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सुझाव दिन्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
मानव पेट मोर्फोजेनेसिसले थ्रीडी एपिथेलियल माइक्रोआर्किटेक्चर र स्थानिय संगठनको क्रिप्ट-भिलस विशेषताहरू स्थापना गर्दछ। यो अनौठो संरचना बेसल क्रिप्टमा स्टेम सेल निचलाई एक्सोजेनस माइक्रोबियल एन्टिजेन्स र तिनीहरूको मेटाबोलाइटहरूबाट जोगाएर पेट होमियोस्टेसिस कायम राख्न आवश्यक छ। साथै, आन्द्राको विभिन्न प्रकारका म्युरोबियल कोशिकाहरूको सुरक्षा गर्दछ। आन्द्राको म्यूकोसल सतहमा बाधा। त्यसकारण, इन भिट्रो गट मोडेलहरूको निर्माणको लागि थ्रीडी एपिथेलियल संरचनाहरू पुन: निर्माण गर्नु महत्त्वपूर्ण छ। विशेष गरी, जैविक मिमेटिक पेट-अन-ए-चिपले आन्द्राको सहज थ्रीडी मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न सक्छ। माइक्रोफ्लुइडिक चिपमा साथै ट्रान्सवेल इम्बेडेड हाइब्रिड चिपमा पेटमा आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसलाई बलियो रूपमा उत्प्रेरित गर्न प्रजनन योग्य प्रोटोकल। हामी यन्त्र निर्माणका लागि विस्तृत विधिहरू, Caco-2 को कल्चरिंग वा आंत्रको अर्गानोइड एपिथेलियल कोशिकाहरूमा कन्भेन्टिक फ्लुइडको प्लेटफर्मको रूपमा कन्भेन्टिफोड्यू 3 को रूपमा वर्णन गर्छौं। धेरै इमेजिङ मोडालिटीहरू प्रयोग गरेर स्थापित 3D एपिथेलियाको विशेषता हो। यो प्रोटोकलले 5 d को लागि बेसोलेटरल फ्लुइड फ्लोलाई नियन्त्रण गरेर कार्यात्मक पेट माइक्रोआर्किटेक्चरको पुनरुत्थान प्राप्त गर्दछ। हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस विधिले शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक कतरनी तनाव र मेकानिकल गतिलाई रोजगार दिन्छ, जुन हाम्रो विद्यमान इन्जिन वा अन्य जटिल इन्जिनलाई आवश्यक पर्दैन। प्रस्तावित प्रोटोकलले बायोमेडिकल अनुसन्धान समुदायको लागि व्यापक प्रभाव पार्न सक्छ, बायोमेडिकल, क्लिनिकल, र औषधि अनुप्रयोगहरूको लागि भिट्रोमा 3D आंत्र उपकला तहहरू पुन: उत्पन्न गर्ने विधि प्रदान गर्दछ।
प्रयोगहरूले देखाउँछन् कि पेट-अन-ए-चिप1,2,3,4,5 वा बाईलेयर माइक्रोफ्लुइडिक यन्त्रहरू 6,7 मा संवर्धित आन्द्राको एपिथेलियल Caco-2 कोशिकाहरूले अन्तर्निहित संयन्त्रको स्पष्ट समझ बिना भिट्रोमा सहज 3D मोर्फोजेनेसिस पार गर्न सक्छन्। s आवश्यक छ र भिट्रोमा 3D एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिस प्रेरित गर्न पर्याप्त छ, जुन Caco-2 र रोगी-व्युत्पन्न आंतोंका अर्गानोइडहरू द्वारा प्रदर्शन गरिएको छ।एपिथेलियल कोशिकाहरू प्रमाणित गरियो। यस अध्ययनमा, हामीले विशेष रूपमा शक्तिशाली Wnt विरोधी, Dickkopf-1 (DKK-1) को सेल उत्पादन र एकाग्रता वितरणमा ध्यान केन्द्रित गर्‍यौं, पेट-अन-ए-चिप र परिमार्जित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणहरू जसमा ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू छन्, जसलाई "हाइब्रिड डेमोनट चिप्सको एक्सएनयूएमएक्स" भनिन्छ। -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) on-chip gut मा morphogenesis inhibits or prestructured 3D epithelial लेयरमा बाधा पुर्‍याउँछ, सुझाव दिन्छ कि संस्कृतिको समयमा विरोधी तनाव आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसको लागि जिम्मेवार छ। एलियल इन्टरफेस भनेको सक्रिय फ्लसिङ (जस्तै, गट-अन-ए-चिप वा हाइब्रिड-अन-ए-चिप प्लेटफर्महरूमा) वा डिफ्युजनद्वारा बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टमा Wnt विरोधीहरूको स्तर हटाउन वा न्यूनतम रूपमा कायम राख्नु हो। बेसोलेटरल मिडिया (जस्तै, ट्रान्सवेलबाट ठूला बेसोलेटरल इन्सर्ट इन्सर्टहरू)।
यस प्रोटोकलमा, हामी पोलीडिमेथिलसिलोक्सेन (PDMS) मा आन्द्राको उपकला कोशिकाहरू कल्चर गर्नको लागि गट-अन-ए-चिप माइक्रो उपकरणहरू र ट्रान्सवेल-इनसर्ट गर्न मिल्ने हाइब्रिड चिप्स (चरण 1-5) बनाउनको लागि विस्तृत विधि प्रदान गर्दछौं--आधारित झरझरा झिल्लीहरू (चरणहरू 6A, 6A, membestran, 7)। 6B, 7B, 8, 9) र induced 3D morphogenesis in vitro (चरण 10)। हामीले टिस्यु-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस र वंश-निर्भर सेलुलर भिन्नताको संकेत गर्ने सेलुलर र आणविक सुविधाहरू पनि पहिचान गर्‍यौं धेरै इमेजिङ मोडालिटीहरू लागू गरेर (चरण 11-24, मानवीय कोशिकाहरू प्रयोग गरेर। 2 वा आन्द्राको अर्गानोइडहरू, प्राविधिक विवरणहरू सहितको दुई संस्कृति ढाँचाहरूमा छिद्रयुक्त झिल्लीको सतह परिमार्जन, 2D मोनोलेयरहरूको सिर्जना, र आंतोंको बायोकेमिकल र बायोमेकानिकल microenvironment.in vitro को पुनरुत्पादन। 2D बाट 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्नका लागि, हामी दुवै epithlayists epithonel epithonel epitheliers द्वारा हटाइयो। संस्कृतिको बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टमा माध्यम। अन्तमा, हामी पुन: उत्पन्न हुने थ्रीडी एपिथेलियल तहको उपयोगिताको प्रतिनिधित्व प्रदान गर्दछौं जुन मोर्फोजेन-निर्भर उपकला वृद्धि, अनुदैर्ध्य होस्ट-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतिहरू, रोगजनक संक्रमण, इन्फ्लेमेटरी इन्जुरी र एपीथेलियोटिक एपीथेलियल लेयरको प्रयोग गर्न सकिन्छ। प्रभाव पार्छ।
हाम्रो प्रोटोकल आधारभूत (जस्तै, आन्द्रा म्यूकोसल जीवविज्ञान, स्टेम सेल जीवविज्ञान, र विकासात्मक जीवविज्ञान) र लागू अनुसन्धान (जस्तै, पूर्व क्लिनिकल औषधि परीक्षण, रोग मोडेलिङ, टिस्यु इन्जिनियरिङ, र ग्यास्ट्रोएन्टेरोलजी) मा वैज्ञानिकहरूको विस्तृत दायराका लागि उपयोगी हुन सक्छ। इन्टिस्टिनल एपिथेलियम इन भिट्रोमा, हामी हाम्रो प्राविधिक रणनीतिलाई आन्द्राको विकास, पुनर्जनन वा होमियोस्टेसिसको समयमा सेल सिग्नलिङको गतिशीलता अध्ययन गर्ने दर्शकहरूमा फैलाउन सकिन्छ भन्ने परिकल्पना गर्छौं। यसको अतिरिक्त, हाम्रो प्रोटोकल विभिन्न संक्रामक एजेन्टहरू जस्तै Norovirus 8, क्लोरोनोभाइरस 2 (Severe-Severe-Corravirus-2) को संक्रामक एजेन्टहरू अन्तर्गत संक्रमण सोधपुछ गर्न उपयोगी छ। ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 वा Vibrio cholerae।रोग रोगविज्ञान र रोगजननका श्रोताहरू पनि उपयोगी छन्। एक अन-चिप पेट माइक्रोफिजियोलोजी प्रणालीको प्रयोगले अनुदैर्ध्य सह-संस्कृति 10 र त्यसपछि होस्ट डिफेन्स, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू र ग्यास्ट्रोइंटेस्टाइनल (GI) ट्र्याक्टमा रोगजनक-सम्बन्धित चोटको मरम्मतको मूल्याङ्कनलाई अनुमति दिन सक्छ। s रोग, अल्सरेटिभ कोलाइटिस, पाउचाइटिस, वा इरिटेबल बोवेल सिन्ड्रोमलाई सिमुलेट गर्न सकिन्छ जब बिरामीको थ्रीडी आंत्र एपिथेलियल तहहरू प्रयोग गरेर तयार गरिन्छ, यी रोगहरूमा विलस एट्रोफी, क्रिप्ट छोटो, म्यूकोसल क्षति, वा स्टेन्डेरिथ-ब्यार्डेरिथ-ब्यार्डेरिथमा समावेश हुन्छ। oids12,13. रोगको वातावरणको उच्च जटिलतालाई राम्रोसँग मोडेल गर्न, पाठकहरूले 3D intestinal villus-crypt microarchitectures भएको मोडेलहरूमा रोग-सम्बन्धित कोशिका प्रकारहरू, जस्तै रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेलहरू (PBMCs) थप्न विचार गर्न सक्छन्।तन्तु-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाहरू, 5।
थ्रीडी एपिथेलियल माइक्रोस्ट्रक्चरलाई सेक्शनिङ प्रक्रिया बिना नै फिक्स र भिजुअलाइज गर्न सकिन्छ, स्पेसियल ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र उच्च-रिजोल्युसन वा सुपर-रिजोल्युसन इमेजिङमा काम गर्ने दर्शकहरूले एपिथेलियल निचहरूमा जीन र प्रोटीनहरूको स्पेशियोटेम्पोरल गतिशीलताको म्यापिङमा रुचि राख्न सक्छन्।टेक्नोलोजीमा रुचि। माइक्रोबियल वा प्रतिरक्षा उत्तेजनाको प्रतिक्रिया। यसबाहेक, अनुदैर्ध्य होस्ट-माइक्रोबायोम क्रसस्टाल्क 10, 14 जसले आन्द्रा होमियोस्टेसिसलाई समन्वय गर्दछ 3D आंत्रको म्यूकोसल तहमा विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातिहरू, माइक्रोबियल कम्युनिटीहरू, विशेष गरी माइक्रोबियल कम्युनिटीहरूमा सह-संवर्धन गरेर स्थापना गर्न सकिन्छ।प्लेटफर्ममा। यो दृष्टिकोण म्यूकोसल इम्युनोलोजी, ग्यास्ट्रोएन्टेरोलजी, मानव माइक्रोबायोम, कल्चरोमिक्स र क्लिनिकल माइक्रोबायोलोजी अध्ययन गर्ने दर्शकहरूका लागि विशेष रूपमा आकर्षक छ जसले प्रयोगशालामा पहिलेको असंस्कृत आन्द्रा माइक्रोबायोटा खेती गर्न खोज्छ। यदि हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस प्रोटोकललाई मल्टिभेल 49 मा स्केलेबल कल्चरमा अनुकूलन गर्न सकिन्छ। tes जसले लगातार बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टहरू भर्दछ, प्रोटोकललाई औषधि, बायोमेडिकल वा उच्च-थ्रुपुट स्क्रिनिङ वा खाद्य उद्योगको लागि प्रमाणीकरण प्लेटफर्महरू विकास गर्नेहरूलाई पनि फैलाउन सकिन्छ। सिद्धान्तको प्रमाणको रूपमा, हामीले भर्खरै मल्टिप्लेक्स उच्च-थ्रुपुट प्रणालीको सम्भाव्यता प्रदर्शन गर्यौं। -ए-चिप उत्पादनहरू व्यवसायीकरण गरिएको छ16,17,18।यसैले, हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस विधिको प्रमाणीकरणलाई द्रुत र सम्भावित रूपमा धेरै अनुसन्धान प्रयोगशालाहरू, उद्योग वा सरकार र नियामक निकायहरूले अपनाउन सकिन्छ जुन इन भिट्रो गट मोर्फोजेनेसिसको सेलुलर पुन: प्रोग्रामिंग बुझ्नको लागि ट्रान्सक्रिप्टोमिक वा ट्रान्सक्रिप्टोमिक्सको रूपमा ड्रग्सको ट्रान्सक्रिप्टोमिक्सको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। थ्रीडी गट सरोगेटहरू प्रयोग गर्दै वा आन्द्रा मोर्फोजेनेसिस प्रक्रियाको पुन: उत्पादनशीलता मूल्याङ्कन गर्न अनुकूलन वा व्यावसायिक अंग-अन-ए-चिप मोडेलहरू प्रयोग गर्दै।
मानव-प्रासंगिक प्रयोगात्मक मोडेलहरूको सीमित संख्या आन्दोलनको अध्ययन गर्न प्रयोग गरिएको छ। सक्षम, र सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा, मानवीय जनसंख्याको क्षेत्रका साथै विनियोजबल तरीकाले पत्ता लगाइएको छ कि समझौताले गर्दा 3D एपिडल संरचनाहरूमा पनि यसले विनियोजनीको स्थानान्तरणको लागि अनुमति दिईएको छ। विभिन्न Mucosal वा प्रतिरोफ उत्तेजकहरु को जवाफ मा क्रिप्ट-भियरिस अक्ष मा कोषहरु को लागी एक ठाउँ प्रदान गर्न सक्छ (Egner Bulus Oritlobial Mesphallogaby को लागी हामीलाई बुझ्न सक्छ पेट माइक्रोबट संरचनाहरु को वर्गीकरण र सिंन्जिस्टिस्टेलीले माइक्रोबियल मेब्राल एसिडहरू (उदाहरणका लागि शब्रो-चेत एसिडहरू) उत्पादन गर्दछ जुन बेसल क्राइजका स्टेपल तहहरूको स्थापना हुन्छ।
थ्रीडी आन्द्राको उपकला संरचनाहरू सिर्जना गर्ने हाम्रो विधिको अतिरिक्त, त्यहाँ धेरै इन भिट्रो विधिहरू छन्। आन्द्रा अर्गानोइड कल्चर एक अत्याधुनिक टिस्यु इन्जिनियरिङ प्रविधि हो जुन विशिष्ट मोर्फोजेन अवस्थाहरूमा आन्द्राको स्टेम कोशिकाहरूको खेतीमा आधारित हुन्छ। यद्यपि, प्रायः थ्रीडी-ओर्गेनोइड कल्चरको प्रयोग थ्रीडी वा को-होस्ट मोडेलको को-होस्टको प्रयोग हो। चुनौतीपूर्ण किनभने आन्द्राको लुमेन अर्गानोइड भित्र बन्द छ र त्यसैले, माइक्रोबियल कोशिकाहरू वा एक्सोजेनस एन्टिजेन्स जस्ता लुमिनल घटकहरूको परिचय सीमित छ।microinjector,26,27 को प्रयोग गरेर organoid lumens मा पहुँच सुधार गर्न सकिन्छ तर यो विधि आक्रामक र श्रम-गहन हो र प्रदर्शन गर्न विशेष ज्ञान चाहिन्छ। यसबाहेक, स्थिर परिस्थितिहरूमा हाइड्रोजेल मचानहरूमा राखिएका परम्परागत अर्गानोइड संस्कृतिहरूले vivo biomechanics मा सही रूपमा सक्रिय प्रतिबिम्बित गर्दैन।
धेरै अनुसन्धान समूहहरू द्वारा नियोजित अन्य दृष्टिकोणहरूले जेल सतहमा पृथक मानव आन्द्रा कोशिकाहरू संवर्धन गरेर पेटको उपकला संरचनाको नक्कल गर्न पूर्वसंरचित 3D हाइड्रोजेल स्काफोल्डहरू प्रयोग गर्दछ। थ्रीडी-प्रिन्टेड, माइक्रो-मिल्ड, वा लिथोग्राफिक रूपमा निर्मित सेलहरू प्रयोग गरेर हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरू फेब्रिकेट गर्नुहोस्। शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक मोर्फोजेन ढाँचाको साथ भिट्रो, स्क्याफोल्डमा स्ट्रोमल सेलहरू समावेश गरेर उच्च पक्ष अनुपात एपिथेलियल संरचना र स्ट्रोमा-एपिथेलियल क्रसस्टक स्थापना गर्दै। यद्यपि, पूर्वसंरचित मचानहरूको प्रकृतिले स्वतःस्फूर्त मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाको प्रदर्शनलाई रोक्न सक्छ। यी मोडेलहरूले अन्तरप्रवाह वा फ्लूको कमी प्रदान गर्दैनन्। आन्द्रा कोशिकाहरूले मोर्फोजेनेसिसबाट गुज्रन र शारीरिक कार्य हासिल गर्न आवश्यक छ भन्ने कुरामा जोड दिन्छ।अर्को हालैको अध्ययनले माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफर्ममा हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरू प्रयोग गरेको छ र लेजर-इचिङ प्रविधिहरू प्रयोग गरी आन्द्राको उपकला संरचनाहरू प्रयोग गरेको छ। माउसको आन्द्राको अर्गानोइडहरूले आन्द्राको ढाँचा बन्नको लागि नक्काशी गरिएको ढाँचाहरू पछ्याउन सक्छ। ics मोड्युल।यद्यपि, यो मोडेलले न त सहज मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाहरू प्रदर्शन गर्छ न त आन्द्रा मेकानोबायोलॉजिकल चालहरू समावेश गर्दछ। एउटै समूहको 3D प्रिन्टिङ प्रविधिहरूले सहज मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाहरूका साथ लघु पेट ट्यूबहरू सिर्जना गर्न सक्षम थिए। विभिन्न आन्द्राको मोडेल भित्रको जटिल बनावटको बावजुद पनि, यस मोडेलमा लुमिनिफ्रोमको अभाव छ। थप रूपमा, मोडेल अपरेटिबिलिटी सीमित हुन सक्छ, विशेष गरी बायोप्रिन्टिङ प्रक्रिया पूरा भएपछि, प्रयोगात्मक अवस्थाहरू वा सेल-टु-सेल अन्तरक्रियाहरूलाई बाधा पुर्‍याउने। यसको सट्टा, हाम्रो प्रस्तावित प्रोटोकलले सहज आन्द्रा मोर्फोजेनेसिस, शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक कतरनी तनाव, बायोमेकानिक्स जसले पेटको गतिशीलताको नक्कल गर्दछ, जटिल माइक्रोसॉलोजिकल र ब्याक्रिएपको जटिलताको पहुँच प्रदान गर्दछ। मोडुलरिटीको वातावरण। त्यसकारण, हाम्रो इन भिट्रो थ्रीडी मोर्फोजेनेसिस प्रोटोकलले अवस्थित विधिहरूको चुनौतीहरूलाई पार गर्न पूरक दृष्टिकोण प्रदान गर्न सक्छ।
हाम्रो प्रोटोकल पूर्णतया थ्रीडी एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिसमा केन्द्रित छ, संस्कृतिमा मात्र एपिथेलियल कोशिकाहरू र अन्य कुनै प्रकारका वरपरका कोशिकाहरू छैनन् जस्तै मेसेन्काइमल कोशिकाहरू, एन्डोथेलियल कोशिकाहरू, र प्रतिरक्षा कोशिकाहरू। पहिले नै वर्णन गरिएझैं, हाम्रो प्रोटोकलको मूल भाग हो। medium.जबकि हाम्रो पेट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड-अन-ए-चिपको बलियो मोडुलरिटीले हामीलाई अनडुलेटिंग थ्रीडी एपिथेलियल लेयर पुन: सिर्जना गर्न अनुमति दिन्छ, अतिरिक्त जैविक जटिलताहरू जस्तै एपिथेलियल-मेसेन्चाइमल अन्तरक्रियाहरू33,34, बाह्य कोशिका म्याट्रिक्स (ECM) र जम्मा गर्ने मोडेलहरू, क्रिप्टो-सेलमा जम्मा हुने संरचनाहरू। बेसल क्रिप्टहरूमा निचहरू थप विचार गर्न बाँकी छ। मेसेन्काइममा स्ट्रोमल कोशिकाहरू (जस्तै, फाइब्रोब्लास्टहरू) ईसीएम प्रोटिनको उत्पादन र भिवो 35,37,38 मा आन्द्रा मोर्फोजेनेसिसको नियमनमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। हाम्रो मोडेलमा मेसेन्काइमल कोशिकाहरू थप्दा मोर्फोजेनेटिक लेयर, क्याप्सेलिलेयस एट्याचमेन्ट प्रक्रियाहरू र क्याप्सेलिथिक प्रक्रियाहरू बढाउँछन्। ) आन्द्राको सूक्ष्म वातावरणमा आणविक यातायात 39 र प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती 40 को नियमनमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। यसबाहेक, टिस्यु मोडेलहरू बीच जोड्न सकिने भास्कुलेटर कम्पोनेन्टहरू एक पूर्वशर्त हो जब टिस्यु मोडेलहरू बहु-अंग अन्तरक्रियाहरू प्रदर्शन गर्न डिजाइन गरिन्छ। त्यसैले कोशिकाहरू समावेश गर्नका लागि थप विशेषताहरू समावेश गर्न सकिन्छ। रेजोलुसन। रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाहरू पनि आन्द्राको रोगको नक्कल गर्ने सन्दर्भमा जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू, एन्टिजेन प्रस्तुति, जन्मजात अनुकूली प्रतिरक्षा क्रसस्टक, र टिश्यु-विशेष प्रतिरक्षा प्रदर्शन गर्न आवश्यक छन्।
हाइब्रिड चिप्सको प्रयोग gut-on-a-chip भन्दा धेरै सरल छ किनभने यन्त्र सेटअप सरल छ र Transwell Inserts को प्रयोगले gut epithelium को स्केलेबल कल्चरको लागि अनुमति दिन्छ। यद्यपि, व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध पलिएस्टर झिल्लीहरू भएका Transwell Inserts लोचदार हुँदैनन् र peristaltic-like thersart path of transartical moves, ट्रान्स्वेलको अधिक स्थानमा अनुकरण गर्न सक्दैन। d चिप एपिकल साइडमा कुनै कतरनी तनाव बिना स्थिर रह्यो। स्पष्ट रूपमा, एपिकल कम्पार्टमेन्टमा स्थिर गुणहरूले हाइब्रिड चिप्समा दीर्घकालीन ब्याक्टेरियल सह-संस्कृतिलाई विरलै सक्षम पार्छ। जबकि हामीले ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा थ्रीडी मोर्फोजेनेसिसलाई बलियो रूपमा प्रेरित गर्न सक्छौं। आईडी प्रवाहले सम्भावित अनुप्रयोगहरूको लागि हाइब्रिड चिप प्लेटफर्महरूको सम्भाव्यतालाई सीमित गर्न सक्छ।
गुट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड-अन-ए-चिप संस्कृतिहरूमा मानव क्रिप्ट-भिलस अक्षको पूर्ण-स्तरीय पुनर्निर्माण पूर्ण रूपमा स्थापित भएको छैन। मोर्फोजेनेसिस एपिथेलियल मोनोलेयरबाट सुरु भएको हुनाले, थ्रीडी माइक्रोआर्किटेक्चरहरूले आवश्यक रूपमा क्रोप्टोलोजिकल आबादीको नजिकको मोर्फोलोजिकल समानता प्रदान गर्दैन। माइक्रोइन्जिनियर गरिएको थ्रीडी एपिथेलियममा बेसल क्रिप्ट डोमेन, क्रिप्ट र विलस क्षेत्रहरू स्पष्ट रूपमा सीमाङ्कन गरिएको थिएन। यद्यपि चिपमा माथिल्लो माथिल्लो च्यानलहरूले माइक्रोइन्जिनियर गरिएको एपिथेलियमको उचाइ बढाउँछ, अधिकतम उचाइ अझै पनि ~ 300-400 मा सीमित छ। es क्रमशः ~135 µm र ~ 400 µm छ, र सानो आन्द्रा भिल्लीको उचाइ ~ 600 µm41 छ।
इमेजिङ दृष्टिकोणबाट, थ्रीडी माइक्रोआर्किटेक्चरको सिटु सुपर-रिजोल्युसन इमेजिङ चिपको पेटमा सीमित हुन सक्छ, किनकि वस्तुनिष्ठ लेन्सबाट एपिथेलियल तहसम्मको आवश्यक कार्य दूरी केही मिलिमिटरको क्रममा हुन्छ। यस समस्यालाई पार गर्न, टाढाको उद्देश्य आवश्यक हुन सक्छ। यसबाहेक, उच्च खण्डहरू बनाउनको लागि उच्च खण्डहरू तयार गर्न आवश्यक छ। PDMS को। यसबाहेक, चिपमा पेटको लेयर-दर-लेयर माइक्रोफ्याब्रिकेशनले प्रत्येक तहको बीचमा स्थायी आसंजन समावेश गरेको हुनाले, एपिथेलियल तहको सतह संरचनाको जाँच गर्न माथिल्लो तह खोल्न वा हटाउन निकै चुनौतीपूर्ण हुन्छ। उदाहरणका लागि, स्क्यानिङ इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (SEM) प्रयोग गरेर।
PDMS को हाइड्रोफोबिसिटी हाइड्रोफोबिक साना अणुहरूसँग काम गर्ने माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित अध्ययनहरूमा सीमित कारक भएको छ, किनकि PDMS ले त्यस्ता हाइड्रोफोबिक अणुहरूलाई गैर-विशिष्ट रूपमा सोख्न सक्छ। PDMS को विकल्पहरू अन्य पोलिमेरिक सामग्रीहरूसँग विचार गर्न सकिन्छ। वैकल्पिक रूपमा, PDMS, सतह परिमार्जन (PDMS) को सतह परिमार्जन (PDMS) ene glycol) 43) हाइड्रोफोबिक अणुहरूको सोखन कम गर्न विचार गर्न सकिन्छ।
अन्तमा, हाम्रो विधिलाई उच्च-थ्रुपुट स्क्रिनिङ वा "एक-आकार-फिट-सबै" प्रयोगकर्ता-अनुकूल प्रयोगात्मक प्लेटफर्म प्रदान गर्ने सन्दर्भमा राम्रोसँग चित्रण गरिएको छैन। हालको प्रोटोकललाई प्रति माइक्रोडिभाइसमा सिरिन्ज पम्प चाहिन्छ, जसले CO2 इन्क्युबेटरमा ठाउँ लिन्छ र ठूला-ठूला प्रयोगहरूलाई रोक्छ। यो सीमिततामा उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्न सकिन्छ। , वा 384-राम्रो पोरस इन्सर्टहरू जसले निरन्तर पुनःपूर्ति र बेसोलेटरल मिडिया हटाउन अनुमति दिन्छ)।
भिट्रोमा मानव आन्द्राको एपिथेलियमको थ्रीडी मोर्फोजेनेसिस प्रेरित गर्न, हामीले लुमेन-केपिलरी इन्टरफेस सिर्जना गर्न दुईवटा समानान्तर माइक्रोच्यानलहरू र बीचमा एउटा लोचदार झरझरा झिल्ली भएको माइक्रोफ्लुइडिक चिप आन्द्राको यन्त्र प्रयोग गर्यौं। हामीले एकल-च्यानल माइक्रोफ्लुइड यन्त्रको प्रयोग पनि प्रदर्शन गर्छौं जसले लगातार माइक्रोफ्लुइड यन्त्रहरू प्रदान गर्दछ। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा बढेको ध्रुवीकृत उपकला तहहरू। दुवै प्लेटफर्महरूमा, विभिन्न मानव आंतोंको उपकला कोशिकाहरूको मोर्फोजेनेसिस बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टबाट मोर्फोजेन विरोधीहरूलाई हटाउन प्रवाहको दिशात्मक हेरफेर लागू गरेर प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। सम्पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चित्र 1) मा पाँचवटा माइक्रोवेल भागहरू हुन्छन्। चिप (चरण 1-5; बक्स 1), (ii) आंत्र उपकला कोशिकाहरू (Caco-2 कोशिकाहरू) वा मानव आन्द्राको अर्गानोइड्सको तयारी;बक्सहरू 2-5), (iii) आंत्र चिप्स वा हाइब्रिड चिप्स (चरण 6-9), (iv) 3D मोर्फोजेनेसिस इन भिट्रो (चरण 10) र (v) ) को प्रेरण 3D एपिथेलियल को विशेषताहरु मा आंत्र एपिथेलियल कोशिकाहरु को संस्कृति (iii) 3D एपिथेलियल नियन्त्रण को लागी उपयुक्त माईक्रोस्ट्रक्चर (1) तलको उपयुक्त समूह 1-2-4 को नियन्त्रण। स्थानिक, अस्थायी, सशर्त, वा प्रक्रियागत नियन्त्रणहरूमा एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिसको तुलना गरेर इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिसको प्रभावकारिता प्रमाणित गर्न डिजाइन गरिएको थियो।
हामीले दुई फरक कल्चर प्लेटफर्महरू प्रयोग गर्यौं: स्ट्रेट च्यानलहरू वा ननलाइनर कन्भोल्युटेड च्यानलहरू भएको गट-अन-ए-चिपहरू, वा माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणमा ट्रान्सवेल (TW) सम्मिलित हाइब्रिड चिपहरू, बक्स 1 मा वर्णन गरिए अनुसार बनाइएको, र चरण 1 -5। "उपकरण निर्माण" ले एकल ह्युपिचाइपि चाइपि म्यानको मुख्य चरणहरू देखाउँछ। lial Cells" ले यस प्रोटोकलमा प्रयोग गरिएको कोशिकाको स्रोत (Caco-2 वा मानव आन्द्राको अर्गानोइड्स) र संस्कृति प्रक्रियाको व्याख्या गर्दछ। "इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस" ले समग्र चरणहरू देखाउँछ जसमा Caco-2 वा अर्गानोइड-व्युत्पन्न एपिथेलियल कोशिकाहरू आन्द्राको चिपमा वा ट्रान्सवेल इन्सर्टेड इन्सर्टेड अफ मोरफोजेनद्वारा संकलित हुन्छन्। विशेषतायुक्त उपकला संरचनाको गठन। कार्यक्रम चरण नम्बर वा बाकस नम्बर प्रत्येक बाणको तल प्रदर्शित हुन्छ। अनुप्रयोगले कसरी स्थापित आंत्र उपकला तहहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ भन्ने उदाहरणहरू प्रदान गर्दछ, उदाहरणका लागि, कोशिका विभेदन विशेषतामा, आन्द्राको फिजियोलोजी अध्ययन, होस्ट-माइक्रोबायोम इकोसिस्टमको स्थापना, र रोग मोडेलिङमा "Flue-Modeling"। actin र MUC2 पेट चिप मा उत्पन्न 3D Caco-2 एपिथेलियल लेयर मा व्यक्त। MUC2 सिग्नलिंग गोब्लेट कोशिकाहरु र म्यूकोसल सतहहरु बाट स्रावित म्यूक मा उपस्थित छ। पेट फिजियोलोजी मा फ्लोरोसेन्ट छविहरु को सियालिक एसिड र N-acegluglusentyglucosentyglu stening द्वारा उत्पादित म्यूक देखाउँछ। in. "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृतिहरू" मा दुई ओभरल्यापिंग छविहरूले एक चिपमा पेटमा प्रतिनिधि होस्ट-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतिहरू देखाउँछन्। बायाँ प्यानलले माइक्रोइन्जिनियर गरिएको 3D Caco-2 को साथमा हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) व्यक्त गर्ने E. coli को सह-संस्कृति देखाउँदछ। 3D Caco-2 एपिथेलियल कोशिकाहरू, F-actin (रातो) र न्यूक्ली (नीलो) सँग इम्युनोफ्लोरेसेन्स स्टेनिङ पछि। रोग मोडलिङले ब्याक्टेरियल एन्टिजेन्स (उदाहरणार्थ, लिपोपोलिसेग, पीएमसीबी, इम्युन सेल्स, पीएमसीबी) को शारीरिक चुनौती अन्तर्गत पेटको इन्फ्लेमेसन चिप्समा चुहावट भएको आन्द्रालाई स्वस्थ बनाउँछ।हरियो)। Caco-2 कोशिकाहरूलाई 3D एपिथेलियल लेयर स्थापना गर्नको लागि कल्चर गरिएको थियो। स्केल बार, 50 µm। तल्लो पङ्क्तिमा छविहरू: "कोषहरूको भिन्नता" सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।अक्सफोर्ड विश्वविद्यालय प्रेस;Ref.5 बाट अनुमति संग पुन: उत्पादन।NAS;"होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति" ref.3 बाट अनुमति लिएर अनुकूलित।NAS;"रोग मोडलिङ" सन्दर्भको अनुमति संग अनुकूलित।5।NAS।
दुबै पेट-अन-चिप र हाइब्रिड चिपहरू PDMS प्रतिकृतिहरू प्रयोग गरेर बनाइएका थिए जुन सिलिकन मोल्डहरूबाट सफ्ट लिथोग्राफी १,४४ द्वारा भत्काइएको थियो र SU-8 सँग ढाँचामा बनाइएको थियो। प्रत्येक चिपमा माइक्रो च्यानलहरूको डिजाइन हाइड्रोडाइनामिक्सलाई विचार गरेर निर्धारण गरिन्छ (जस्तै शीयर तनाव र हाइड्रोडाइना, ओरिजिनल डिजाइन, 2-1,44-1,44)। डाटा Fig. 1a), जसमा दुई जुक्सटापोज्ड समानान्तर सीधा माइक्रोच्यानलहरू समावेश छन्, जटिल गुट-अन-ए-चिप (विस्तारित डेटा चित्र 1b) मा विकसित भएको छ जसमा बढेको तरल निवास समय, ननलाइनर फ्लो कोशिकाहरू र बहु-रेखीय प्रवाह ढाँचाहरू, (F2F) को बहु-रैखिक प्रवाह ढाँचाहरू, र 1b. थप जटिल पेट बायोमेकानिक्सहरू पुन: निर्माण गर्न आवश्यक छ, जटिल पेट-अन-ए-चिपहरू छनोट गर्न सकिन्छ। हामीले प्रदर्शन गरेका छौं कि कन्भोलुटेड गट-चिपले मूल गुट-चिपको तुलनामा उपकलाको वृद्धिको समान डिग्रीको साथ समान समय फ्रेममा 3D मोर्फोजेनेसिसलाई बलियो रूपमा प्रेरित गर्छ। चिप पेट डिजाइनहरू आदानप्रदान गर्न योग्य छन्। PDMS प्रतिकृतिहरू सिलिकन मोल्डहरूमा SU-8 ढाँचाहरूको साथमा डेमोल्डिंग पछि नकारात्मक सुविधाहरू प्रदान गरियो (चित्र।2a) चिपमा आन्द्रा बनाउनको लागि, तयार गरिएको माथिल्लो PDMS तहलाई क्रमशः झरझरा PDMS फिल्मसँग बाँडिएको थियो र त्यसपछि कोरोना उपचारकर्ता (चित्र 2b–f) को प्रयोग गरेर अपरिवर्तनीय बन्डिङद्वारा तल्लो PDMS तहसँग पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो। हाइब्रिड चिपहरू बनाउनको लागि, माइक्रो-फ्लुडेसलाई एकल गिलासको लागि माइक्रोडीएमएस रिपब्लिक बनाइयो। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू समायोजन गर्न सक्ने idic यन्त्रहरू (चित्र 2h र विस्तारित डेटा चित्र 2)। PDMS प्रतिकृति र गिलासको सतहहरूलाई अक्सिजन प्लाज्मा वा कोरोना उपचार गरेर बन्डिङ प्रक्रिया गरिन्छ। सिलिकॉन सेटअप यन्त्रमा संलग्न माइक्रोफ्याब्रिकेटेड यन्त्रको स्टेरिलाइजेशन पछि सिलिकन सेटअप 3 को डिभाइसमा सेटअप गर्न तयार थियो। हेलियम (चित्र 2g)।
a, SU-8 ढाँचाको सिलिकन मोल्डहरूबाट PDMS भागहरूको तयारीको योजनाबद्ध दृष्टान्त। असुरक्षित PDMS समाधानलाई सिलिकन मोल्ड (बायाँ) मा खन्याइयो, 60 डिग्री सेल्सियस (मध्य) मा निको पारियो र (दायाँ) भत्कियो। भत्काइएको PDMS टुक्राहरूमा काटियो र PDMS लेयरको फोटोग्राफको प्रयोगको लागि थप प्रयोगको लागि, फोटोग्राफको माथिल्लो तहमा सफा गरियो। PDMS झरझरा झिल्ली बनाउन प्रयोग गरिएको सिलिकन मोल्डको, माथिल्लो र तल्लो PDMS कम्पोनेन्टहरू र एसेम्बल गरिएको अन-चिप आन्द्रा उपकरणहरूको तस्विरहरूको एक श्रृंखला। जस्तै, माथिल्लो, झिल्ली, र तल्लो PDMS कम्पोनेन्टहरूको पङ्क्तिबद्धताको योजनाबद्ध। प्रत्येक तहलाई अपरिवर्तनीय रूपमा प्लैमेटिक उपचार वा ढाँचामा सुधार गरिएको छ। सुपरइम्पोज्ड कन्भोल्युटेड माइक्रो च्यानलहरू र भ्याकुम चेम्बरहरू सहितको ut-on-a-chip उपकरण। माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चरको लागि gut-on-a-chip को सेटअप। सिलिकन ट्यूब र सिरिन्जको साथ जम्मा गरिएको चिपमा निर्मित पेटलाई कभरस्लिपमा राखिएको थियो। यन्त्रमा lidrip0 लाई राखिएको थियो। सिलिकन tube.h बन्द गर्न प्रयोग गरिन्छ, हाइब्रिड चिप निर्माणको भिजुअल स्न्यापसटहरू र हाइब्रिड चिप्स प्रयोग गरी 3D मोर्फोजेनेसिस। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू स्वतन्त्र रूपमा आन्द्राको उपकला कोशिकाहरूको 2D मोनोलेयरहरू कल्चरमा तयार पारिएको थियो। Transwell insert मा स्थापित सेल तह मुनि माइक्रो च्यानलहरू मार्फत।स्केल बार, 1 cm.h सन्दर्भबाट अनुमति संग पुन: मुद्रित।4।एल्सेभियर।
यस प्रोटोकलमा, Caco-2 सेल लाइन र आन्द्राको अर्गानोइडहरू एपिथेलियल स्रोतहरू (चित्र 3a) को रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। दुवै प्रकारका कोशिकाहरूलाई स्वतन्त्र रूपमा कल्चर गरिएको थियो (बक्स 2 र बक्स 5) र अन-चिप पेट वा ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूको ECM-लेपित माइक्रो च्यानलहरू बीज गर्न प्रयोग गरियो। (अनुच्छेद 10 र 50 को बीचमा) T-फ्लास्कहरूमा ट्रिप्सिनाइजेसन फ्लुइड (बक्स 2) द्वारा विच्छेदित सेल निलम्बनहरू तयार गर्न कटाई गरिन्छ। आन्द्रा बायोप्सी वा सर्जिकल रिसेक्सनहरूबाट मानव आन्द्राको अर्गानोइडहरू मेट्रिजेल स्क्याफोल्ड डोमहरूमा कल्चर गरिएको थियो 24-वेल सपोर्टिंग माइक्रोनफ्रोनम फोल्डर प्लान्टहरू समावेश गर्दछ। जस्तै Wnt, R-spondin, र Noggin) र बक्स 3 मा वर्णन गरिए अनुसार तयार पारिएको वृद्धि कारकहरू प्रत्येक अर्को दिनमा अर्गानोइडहरू ~ 500 µm व्यासमा वृद्धि नभएसम्म पूरक थिए। पूर्ण रूपमा बढेको अर्गानोइडहरू कटाई गरी एकल कोशिकाहरूमा पृथक गरी आन्द्रामा बीजारोपण गर्न वा ट्रान्सवेलले अघिल्लो रोगको 5 अनुसार रिपोर्ट गर्न सक्छ। type12,13 (जस्तै अल्सरेटिभ कोलाइटिस, क्रोनको रोग, कोलोरेक्टल क्यान्सर, वा सामान्य दाता), घाव साइट (जस्तै, घाव बनाम गैर-घाउ भएको क्षेत्र) र पथरीमा ग्यास्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थान (जस्तै, ड्युओडेनम, जेजुनम, इलियम, सेकम, कोलोन, वा रेक्टम)।हामी एक इनकुलोइड वा प्रोटोकोलोइड प्रदान गर्दछौं। सामान्यतया सानो आन्द्राको अर्गानोइड्स भन्दा मोर्फोजेन्सको उच्च सांद्रता चाहिन्छ।
a, पेटको चिपमा पेट मोर्फोजेनेसिसको इन्डक्सनका लागि कार्यप्रवाह। Caco-2 मानव आन्द्राको एपिथेलियम र आन्द्राको अर्गानोइडहरू यस प्रोटोकलमा 3D मोर्फोजेनेसिस प्रदर्शन गर्न प्रयोग गरिन्छ। पृथक एपिथेलियल कोशिकाहरू तयार गरिएको आन्द्रा-अन-ए-चिप्सेड कोशिकाहरू (एट्याचेड तयारी) मा सीड गरिएको थियो। ) दिन 0 (D0) मा PDMS झरझरा झिल्लीमा, एपिकल (AP) प्रवाह प्रारम्भ गरिन्छ र पहिलो 2 दिन (प्रवाह, AP, D0-D2) को लागि राखिन्छ। बेसोलेटरल (BL) प्रवाह पनि चक्रीय स्ट्रेचिंग गतिहरू (स्ट्रेच, फ्लो, एपी र BLD3 मा पूर्ण हुन्छ) को साथ सुरु हुन्छ। माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर (मोर्फोजेनेसिस, D5) को 5 दिन पछि स्वस्फूर्त रूपमा रातो। फेज कन्ट्रास्ट छविहरूले प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण वा समय बिन्दुमा Caco-2 कोशिकाहरूको प्रतिनिधि मोर्फोलजी देखाउँदछ (पट्टी ग्राफ, 100 µm)। चार योजनाबद्ध रेखाचित्रहरूले दायाँपट्टिको armorphogenes को दायाँ क्यास्केडहरू चित्रण गर्दछ। fluid flow.b, स्थापित 3D Caco-2 एपिथेलियम (बायाँ) को सतह टोपोलोजी देखाउँदै SEM छवि। म्याग्निफाइड क्षेत्र (सेतो ड्यास गरिएको बक्स) लाई हाइलाइट गर्ने इनसेटले 3D Caco-2 तह (दायाँ) मा पुन: उत्पन्न गरिएको माइक्रोभिली देखाउँछ। c, स्थापित Caco-2 labeled र FForizon सीमानाको तेर्सो अगाडिको दृश्य, F1-20000000000000000000000000 मा -एक्टिन (हरियो) र न्यूक्ली (नीलो) इम्युनोफ्लोरेसेन्स कन्फोकल भिजुअलाइजेसन आंत्रको चिप्समा एपिथेलियल कोशिकाहरू। मध्य योजनाबद्ध तर्फ संकेत गर्ने तीरहरूले प्रत्येक कन्फोकल दृश्यको लागि फोकल प्लेनको स्थानलाई संकेत गर्दछ। d, एक चिपमा संवर्धित organoids मा रूपात्मक परिवर्तनहरूको समय पाठ्यक्रम, micro1st दिनहरूमा, conpy1 र 3 मा संवर्धित, micro1st दिनहरू। 13. इनसेट (माथि दायाँ) ले प्रदान गरिएको छविको उच्च म्याग्निफिकेसन देखाउँछ। 7.f दिनमा लिइएको स्लाइसमा पेटमा स्थापित अर्गानोइड 3D एपिथेलियमको DIC फोटोमाइक्रोग्राफ, स्टेम सेलहरूको लागि मार्करहरू देखाउँदै ओभरलेड इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू (LGR5;म्याजेन्टा), गोबलेट सेलहरू (MUC2; हरियो), F-actin (ग्रे) र न्यूक्ली (सियान) 3 दिनको लागि पेट चिप्समा बढेको, क्रमशः (बायाँ) र 13-दिन (मध्य) अर्गानोइडहरू एपिथेलियल तहमा। विस्तारित डाटा चित्र 3 पनि हेर्नुहोस्, जसले LG2 MU को संकेत गर्दैन। कल्चरको १३ दिनमा सेलमास्क डाई (दायाँ) को साथ प्लाज्मा झिल्लीमा दाग लगाएर चिपमा पेटमा स्थापित थ्रीडी अर्गानोइड एपिथेलियमको इथेलियल माइक्रोस्ट्रक्चर (दायाँ)। अन्यथा नभनेसम्म बाहेक स्केल बार ५० μm हुन्छ। b सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुन: छापिएको।अक्सफोर्ड विश्वविद्यालय प्रेस;c सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।2।अक्सफोर्ड विश्वविद्यालय प्रेस;e र f सन्दर्भ द्वारा अनुमति संग अनुकूलित। 12 क्रिएटिभ कमन्स लाइसेन्स CC BY 4.0 अन्तर्गत।
एउटा चिपमा रहेको पेटमा, सफल ECM कोटिंगको लागि PDMS झरझरा झिल्लीको हाइड्रोफोबिक सतह परिमार्जन गर्न आवश्यक छ। यस प्रोटोकलमा, हामीले PDMS झिल्लीको हाइड्रोफोबिसिटी परिमार्जन गर्न दुई फरक तरिकाहरू लागू गर्छौं। Caco-2 कोषहरूको संवर्धनको लागि, PDMS को सतह सक्रियता एक्लै UV/Hydrophob उपचार को सतह सक्रियता थियो। ECM कोट गर्नुहोस् र PDMS झिल्लीमा Caco-2 कोशिकाहरू संलग्न गर्नुहोस्। यद्यपि, अर्गानोइड एपिथेलियमको माइक्रोफ्लुइडिक कल्चरले रासायनिक-आधारित सतह फंक्शनलाइजेसनलाई ECM प्रोटिनहरूको प्रभावकारी भण्डारण प्राप्त गर्नको लागि क्रमशः पोलिथिलेनिमाइन (PEI) र ग्लुटाराल्डिहाइडलाई PDMS मा PDMS माईक्रो च्यानलहरू कभर गरेर ECM प्रोटिनहरू डिपोजिट गरिएको थियो। सतह र त्यसपछि पृथक अर्गानोइड एपिथेलियममा परिचय गराइन्छ। कोशिकाहरू संलग्न भइसकेपछि, माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चरले माथिल्लो माइक्रोच्यानलमा केवल माध्यमलाई परफ्युज गरेर कोशिकाहरूले पूर्ण मोनोलेयर नबन्दासम्म सुरु हुन्छ, जबकि तल्लो माइक्रोच्यानलले स्थिर अवस्था कायम राख्छ। सतह सक्रियताको लागि यो अनुकूलित विधि र ECM कोटिंगले एट्याचमेन्ट वा एपिथेलियममा सक्षम बनाउँछ। PDMS सतह।
ट्रान्सवेल कल्चरहरूलाई सेल रोप्नु अघि ECM कोटिंग चाहिन्छ;यद्यपि, ट्रान्सवेल कल्चरहरूलाई छिद्रपूर्ण इन्सर्टहरूको सतह सक्रिय गर्न जटिल पूर्व-उपचार चरणहरू आवश्यक पर्दैन। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा Caco-2 कोशिकाहरू बढ्नको लागि, झरझरा इन्सर्टहरूमा ECM कोटिंगले पृथक Caco-2 कोशिकाहरूको संलग्नतालाई गति दिन्छ (<1 घण्टा) र टाइट जंक्शन बाधा गठन (<1-2 कल्चर वा ट्रान्सवेल इन्सर्ट्समा, 1-2 दिनहरूमा)। ECM-लेपित इन्सर्टहरू, झिल्ली सतह (<3 h) मा जोडिएको र अर्गानोइडहरूले बाधा अखण्डताको साथ पूर्ण मोनोलेयर नबन्दासम्म कायम राखिन्छ। ट्रान्सवेल कल्चरहरू हाइब्रिड चिप्सको प्रयोग नगरी 24-वेल प्लेटहरूमा प्रदर्शन गरिन्छ।
इन भिट्रो थ्रीडी मोर्फोजेनेसिस स्थापित एपिथेलियल तहको बेसोलेटरल पक्षमा फ्लुइड फ्लो लागू गरेर प्रारम्भ गर्न सकिन्छ। चिपको पेटमा, एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिस सुरु भयो जब माध्यमलाई माथिल्लो र तल्लो माइक्रो च्यानलहरूमा पर्फ्युज गरिएको थियो (चित्र 3a,)। यसलाई पहिले वर्णन गरिएको फ्लूको रूपमा वर्णन गरिएको छ। दिशात्मक स्रावित मोर्फोजेन अवरोधकहरूको निरन्तर हटाउनको लागि डिब्बा। छिद्रयुक्त झिल्लीमा बाँधिएका कोशिकाहरूलाई पर्याप्त पोषक तत्वहरू र सीरम प्रदान गर्न र ल्युमिनल शियर तनाव उत्पन्न गर्न, हामी सामान्यतया एक चिपमा पेटमा दोहोरो प्रवाह लागू गर्छौं। हाइब्रिड चिपहरूमा, ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू मोचिथनहरू समावेश गर्दछ। माइक्रो च्यानल मार्फत झरझरा ट्रान्सवेल इन्सर्टको बेसोलेटरल साइड अन्तर्गत माध्यम लागू गरिएको थियो। दुवै कल्चर प्लेटफर्महरूमा बासोलेटरल प्रवाह सुरु भएको 3-5 दिन पछि आन्द्रा मोर्फोजेनेसिस भयो।
माइक्रोइन्जिनियर गरिएको थ्रीडी एपिथेलियल तहहरूको मोर्फोलॉजिकल विशेषताहरू फेज कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इन्टरफेरेन्स कन्ट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एसईएम, वा इम्युनोफ्लोरेसेन्स कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (फिगर 3 र 4) सहित विभिन्न इमेजिङ मोडालिटीहरू लागू गरेर विश्लेषण गर्न सकिन्छ। थ्रीडी एपिथेलियल तहहरू। PDMS र पोलिएस्टर फिल्महरूको अप्टिकल पारदर्शिताको कारण, दुवै पेट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड चिप प्लेटफर्महरूले यन्त्रको सेक्शनिङ वा डिस्सेम्बलको आवश्यकता बिना सिटु इमेजिङमा वास्तविक-समय प्रदान गर्न सक्छ। इम्युनोफ्लोरेसेन्स इमेजिङ प्रदर्शन गर्दा, f3p, f1, 4 कोशिकाहरू फिक्स हुन्छन्। % (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), त्यसपछि ट्राइटन X-100 र 2% (wt/vol) ) बोवाइन सीरम एल्बमिन (BSA), क्रमशः। सेल प्रकारमा निर्भर गर्दै, विभिन्न फिक्सेटिभहरू, पर्मेबिलाइजरहरू, र ब्लकिङ एजेन्टहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ। प्राथमिक एन्टिबडीहरू कोशिकाहरूलाई लक्षित गर्ने सिटुलाइट वा हाइमोबिल लाईटमा प्रयोग गरिन्छ। माध्यमिक एन्टिबडीहरू द्वारा ed काउन्टरस्टेन डाईको साथमा न्यूक्लियस (उदाहरणका लागि, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) वा F-actin (जस्तै, फ्लोरोसेन्ट रूपमा लेबल गरिएको phalloidin) लाई लक्षित गर्दै। फ्लोरोसेन्स-आधारित लाइभ इमेजिङ पनि उत्पादनमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ (mucus Fig पत्ता लगाउन।1, "सेल भिन्नता" र "गट फिजियोलोजी"), माइक्रोबियल कोशिकाहरूको अनियमित उपनिवेश (चित्र 1, "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति"), प्रतिरक्षा कोशिकाहरूको भर्ती (चित्र। 1, 'डिजिज मोडेलिङ') वा 3D एपिथेलियल र मोडिफाइड 3D को रूपरेखा, Figthelial र modify 4)। तल्लो माइक्रो च्यानल तहबाट माथिल्लो तहलाई छुट्याउनको लागि चिपमा आन्द्रा, रेफमा वर्णन गरिए अनुसार चित्र 2 मा देखाइएको छ, 3D एपिथेलियल मोर्फोलोजी साथै एपिकल ब्रश बोर्डरमा रहेको माइक्रोभिलीलाई SEM (चित्र 3b) द्वारा भिजुअलाइज गर्न सकिन्छ। भिन्नता मार्करहरूको अभिव्यक्ति PCRNA SEQNA SEQNA5 वा एकल केसमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। , पेट चिप्स वा हाइब्रिड चिप्समा हुर्किएका एपिथेलियल कोशिकाहरूको थ्रीडी तहहरू ट्रिप्सिनाइजेसनद्वारा काटिन्छन् र त्यसपछि आणविक वा आनुवंशिक विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिन्छ।
a, हाइब्रिड चिपमा आन्द्रा मोर्फोजेनेसिसको इन्डक्सनका लागि कार्यप्रवाह। हाइब्रिड चिप प्लेटफर्ममा 3D मोर्फोजेनेसिस प्रदर्शन गर्न यस प्रोटोकलमा Caco-2 र intestinal organoids प्रयोग गरिन्छ। डिस्सोसिएटेड एपिथेलियल कोशिकाहरू तयार पारिएकोमा सीड गरिएको थियो (Transwell प्रि-इन्सर्ट गरिएको कोशिकाहरू हेर्नुहोस्)। ट्रान्सवेल इन्सर्टमा पलिएस्टर झिल्लीहरू, सबै कोशिकाहरू स्थिर अवस्था (TW कल्चर) अन्तर्गत संवर्धित थिए। 7 दिन पछि, एपिथेलियल कोशिकाहरूको 2D मोनोलेयर भएको एकल ट्रान्सवेल इन्सर्टलाई हाइब्रिड चिपमा एकीकृत गरी बेसोलेटरल फ्लो (फ्लो, BL) को परिचय गराइयो, जसले अन्ततः माइक्रोमोरोजेन (माइक्रोमोरोजेन) लेयर 3 पीपीथेलियल जेनेरेसनको नेतृत्व गर्यो। प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण वा समय बिन्दुमा सामान्य दाता (C103 रेखा) आरोहण बृहदान्त्रबाट व्युत्पन्न मानव अंगको उपकला कोशिकाहरूको रूपात्मक विशेषताहरू देखाउने ग्राफहरू। माथिल्लो तहहरूमा स्क्यामेटिक्सले प्रत्येक चरणको लागि प्रयोगात्मक कन्फिगरेसनलाई चित्रण गर्दछ।b, हाइब्रिड चिप्स (बायाँ योजनाबद्ध) ले 3D कन्फिगरेन्सको माइक्रो-डाउन कोशिकाहरू खिच्न सक्छ। विभिन्न Z स्थानहरूमा (माथिल्लो, मध्य र तल्लो;सही योजनाबद्ध र सम्बन्धित डटेड लाइनहरू हेर्नुहोस्)।स्पष्ट रूपात्मक विशेषताहरू देखाइयो। F-actin (सियान), न्यूक्लियस (ग्रे) c, स्थैतिक ट्रान्सवेल (TW; सेतो ड्यास बक्स भित्र इनसेट) बनाम हाइब्रिड कम्पोलोजी 3D chipsar 3D (3D angled दृश्य) organoid-व्युत्पन्न एपिथेलियल सेलहरूको फ्लोरोसेन्स कन्फोकल माइक्रोग्राफहरू। क्रमशः। 2D ठाडो क्रस-कट दृश्यहरूको एक जोडी (माथिल्लो दायाँ कुनामा इनसेट; "XZ") ले 2D र 3D सुविधाहरू पनि देखाउँछ। स्केल बार, 100 µm.c सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुन: मुद्रित।4।एल्सेभियर।
परम्परागत स्थिर संस्कृति अवस्थाहरूमा एउटै कोशिकाहरू (Caco-2 वा intestinal organoid epithelial कोशिकाहरू) लाई दुई-आयामी मोनोलेयरहरूमा कल्चर गरेर नियन्त्रणहरू तयार गर्न सकिन्छ। उल्लेखनीय रूपमा, माइक्रो च्यानलहरूको सीमित भोल्युम क्षमताको कारणले पोषक तत्वको कमी हुन सक्छ (जस्तै ~4 µL)। basolateral प्रवाह को आवेदन पछि पनि तुलना गर्न सकिन्छ।
सफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया सफा कोठामा गरिनु पर्छ। चिप (माथिल्लो र तल्लो तह र झिल्ली) र हाइब्रिड चिपहरूमा प्रत्येक तहको लागि, फरक फोटोमास्कहरू प्रयोग गरियो र अलग-अलग सिलिकन वेफर्समा बनाइएको थियो किनभने माइक्रो च्यानलहरूको उचाइ फरक थियो। माथिल्लो र तल्लोको लक्ष्य उचाइहरू g5µ0p0m0p0m0p माइक्रो च्यानलहरूमा छन्। m, क्रमशः। हाइब्रिड चिपको च्यानल लक्ष्य उचाइ 200 µm छ।
एसीटोन भएको डिशमा ३ इन्चको सिलिकन वेफर राख्नुहोस्। प्लेटलाई बिस्तारै ३० सेकेन्डसम्म घुमाउनुहोस्, त्यसपछि वेफरलाई हावामा सुकाउनुहोस्। वेफरलाई IPA भएको प्लेटमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, त्यसपछि प्लेटलाई ३० सेकेन्डसम्म सफा गर्न घुमाउनुहोस्।
पिरान्हा समाधान (हाइड्रोजन पेरोक्साइड र केन्द्रित सल्फ्यूरिक एसिडको मिश्रण, 1:3 (भोल/भोल)) वैकल्पिक रूपमा सिलिकन वेफर सतहबाट जैविक अवशेषहरू हटाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ।
पिरान्हा घोल अत्यन्त संक्षारक हुन्छ र यसले तातो उत्पन्न गर्छ। अतिरिक्त सुरक्षा सावधानीहरू आवश्यक छन्। फोहोर व्यवस्थापनको लागि, समाधानलाई चिसो हुन दिनुहोस् र सफा, सुक्खा फोहोर कन्टेनरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। माध्यमिक कन्टेनरहरू प्रयोग गर्नुहोस् र फोहोर कन्टेनरहरूलाई ठीकसँग लेबल गर्नुहोस्। थप विस्तृत प्रक्रियाहरूको लागि कृपया सुविधाको सुरक्षा दिशानिर्देशहरू पालना गर्नुहोस्।
वेफरहरूलाई 200 डिग्री सेल्सियसको तातो प्लेटमा 10 मिनेटको लागि राखेर डिहाइड्रेट गर्नुहोस्। निर्जलीकरण पछि, वेफरलाई चिसो हुन हावामा पाँच पटक हल्लाइयो।
सफा गरिएको सिलिकन वेफरको केन्द्रमा ~10 ग्राम फोटोरेसिस्ट SU-8 2100 खन्याउनुहोस्। फोटोरेसिस्टलाई वेफरमा समान रूपमा फैलाउन चिमटी प्रयोग गर्नुहोस्। कहिलेकाहीं फोटोरेसिस्टलाई कम टाँसिने र फैलाउन सजिलो बनाउनको लागि वेफरलाई 65 डिग्री सेल्सियसको तातो प्लेटमा राख्नुहोस्। फोटोरेसिस्टलाई सीधा नराख्नुहोस्।
SU-8 लाई स्पिन कोटिंग चलाएर वेफरमा समान रूपमा वितरण गरिएको थियो। 100 rpm/s को एक्सेलेरेशनमा 500 rpm मा प्रचार गर्न 5–10 s को लागि SU-8 को आगमन रोटेशन प्रोग्राम गर्नुहोस्। 200 µm मोटाई ढाँचाको लागि मुख्य स्पिन सेट गर्नुहोस् चिपको पेटको माथिल्लो तहको लागि 500 ​​µm उचाइ; तल "महत्वपूर्ण चरणहरू" हेर्नुहोस्) 1,200 rpm मा 300 rpm/s 30 सेकेन्डको एक्सेलेरेशनमा सेट गरियो।
मुख्य स्पिन गति सिलिकन वेफरमा SU-8 ढाँचाको लक्ष्य मोटाई अनुसार समायोजित गर्न सकिन्छ।
चिपमा पेटको माथिल्लो तहको लागि 500 ​​µm उचाइको SU-8 ढाँचाहरू बनाउनको लागि, यस बाकसको स्पिन कोटिंग र नरम बेक चरणहरू (चरण 7 र 8) क्रमशः दोहोर्याइएको थियो (चरण 9 हेर्नुहोस्) 250 µm को दुई तहहरू उत्पादन गर्न, UV1 को बाक्लो तह र SU-2 लेयरमा यो बाकसको बाक्लो तह जोड्न सकिन्छ। , 500 µm उच्च तह बनाउँदै।
SU-8 लेपित वेफर्सलाई 5 मिनेटको लागि 65 °C मा ध्यानपूर्वक तातो प्लेटमा राखेर नरम बेक गर्नुहोस्, त्यसपछि सेटिङलाई 95 °C मा स्विच गर्नुहोस् र थप 40 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
माथिल्लो माइक्रोच्यानलमा SU-8 ढाँचाको 500 μm उचाइ प्राप्त गर्न, दुई 250 μm बाक्लो SU-8 तहहरू उत्पन्न गर्न चरण 7 र 8 दोहोर्याउनुहोस्।
UV मास्क अलाइनर प्रयोग गरेर, वेफरको एक्सपोजर समय गणना गर्न निर्माताको निर्देशन अनुसार बत्ती परीक्षण गर्नुहोस्।
एक्सपोजर समय निर्धारण गरेपछि, फोटोमास्कलाई UV मास्क एलाइनरको मास्क होल्डरमा राख्नुहोस् र फोटोमास्कलाई SU-8 लेपित वेफरमा राख्नुहोस्।
फोटोमास्कको मुद्रित सतह सिलिकन वेफरको SU-8 लेपित छेउमा सीधै राख्नुहोस् UV फैलावट कम गर्न।
पूर्वनिर्धारित एक्सपोजर समयको लागि SU-8 लेपित वेफर र फोटोमास्कलाई ठाडो रूपमा UV प्रकाशको 260 mJ/cm2 मा खुला गर्नुहोस् (यस बाकसको चरण 10 हेर्नुहोस्)।
UV एक्सपोजर पछि, SU-8-कोटेड सिलिकन वेफर्सहरू 200 μm को उचाइमा ढाँचाहरू बनाउनको लागि प्रत्येक हट प्लेटमा 5 मिनेटको लागि 65°C र 95°C मा 15 मिनेटको लागि बेक गरिएको थियो। 95 °C देखि 30 मिनेटको फ्याब्रिकेट ढाँचामा 200 μm को उचाइको साथ पोस्ट-बेक समय विस्तार गर्नुहोस्।
विकासकर्तालाई गिलासको भाँडोमा खन्याइन्छ, र बेक गरिएको वेफरलाई थालमा राखिन्छ। SU-8 विकासकर्ताको भोल्युम गिलास प्लेटको आकारमा निर्भर गर्दै फरक हुन सक्छ। SU-8 लाई पूर्ण रूपमा खुला नगरिएको SU-8 हटाउनको लागि पर्याप्त SU-8 विकासकर्ता प्रयोग गर्न सुनिश्चित गर्नुहोस्। उदाहरणका लागि, 150 मिमी व्यासको डिश प्रयोग गर्दा। कहिलेकाहीं हल्का घुमाउरो साथ 25 मिनेटको लागि मोल्ड।
विकसित मोल्डलाई ~10 mL ताजा विकासकर्ताले IPA पछि पिपेट प्रयोग गरी घोल स्प्रे गरेर कुल्ला गर्नुहोस्।
वेफरलाई प्लाज्मा क्लिनरमा राख्नुहोस् र १.५ मिनेटको लागि अक्सिजन प्लाज्मा (वायुमण्डलीय ग्यास, लक्ष्य दबाव 1 × 10−5 Torr, पावर 125 W) लाई उजागर गर्नुहोस्।
वेफरलाई भ्याकुम डेसिकेटरमा भित्र एउटा गिलास स्लाइडको साथ राख्नुहोस्। वेफरहरू र स्लाइडहरू छेउछाउमा राख्न सकिन्छ। यदि भ्याकुम डेसिकेटरलाई प्लेटद्वारा धेरै तहहरूमा विभाजन गरिएको छ भने, स्लाइडहरूलाई तल्लो चेम्बरमा र वेफर्सहरूलाई माथिल्लो कक्षमा राख्नुहोस्। 100-H2H, 100H, 100, एचएल2, एचएलट्रिकको ड्रप गर्नुहोस्। fluorooctyl) silane समाधान गिलास स्लाइड मा र silanization को लागी भ्याकुम लागू गर्नुहोस्।
जमेको Caco-2 कोशिकाहरूको शीशीलाई 37°C पानीको बाथमा पगाल्नुहोस्, त्यसपछि 37°C प्रि-वार्म्ड Caco-2 मिडियमको 15 mL भएको T75 फ्लास्कमा पग्लिएको सेलहरूलाई स्थानान्तरण गर्नुहोस्।
~90% संगममा Caco-2 कोषहरू पास गर्न, पहिले तातो Caco-2 मध्यम, PBS, र 0.25% trypsin/1 mM EDTA 37°C पानीको नुहाउने ठाउँमा।
भ्याकुम एस्पिरेसनद्वारा माध्यमलाई एस्पिरेट गर्नुहोस्। भ्याकुम एस्पिरेसन दोहोर्याएर र ताजा पीबीएस थपेर 5 एमएल न्यानो पीबीएसले दुई पटक सेलहरू धुनुहोस्।