Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
एकै पटकमा तीनवटा स्लाइडहरूको क्यारोसेल प्रदर्शन गर्दछ।अघिल्लो र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस् एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि, वा अन्तमा स्लाइडर बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस् एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि।
रगत-मस्तिष्क अवरोध र रगत-मस्तिष्क अवरोधले बायोथेराप्यूटिक एजेन्टहरूलाई केन्द्रीय स्नायु प्रणालीमा आफ्नो लक्ष्यमा पुग्नबाट रोक्छ, जसले गर्दा न्यूरोलोजिकल रोगहरूको प्रभावकारी उपचारमा बाधा पुग्छ।Vivo मा उपन्यास मस्तिष्क ट्रान्सपोर्टरहरू पत्ता लगाउन, हामीले T7 फेज पेप्टाइड पुस्तकालय प्रस्तुत गर्‍यौं र मुसाहरूको क्यान्युलेटेड सचेत ठूलो पूल मोडेल प्रयोग गरेर क्रमशः रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) सङ्कलन गर्‍यौं।विशिष्ट फेज क्लोनहरू चयनको चार राउन्ड पछि CSF मा अत्यधिक समृद्ध थिए।व्यक्तिगत उम्मेद्वार पेप्टाइड्सको परीक्षणले CSF मा 1000-गुना भन्दा बढी संवर्धन प्रकट गर्यो।मस्तिष्कमा पेप्टाइड-मध्यस्थता डेलिभरीको बायोएक्टिभिटी पहिचान गरिएको उपन्यास ट्रान्जिट पेप्टाइडसँग जोडिएको BACE1 पेप्टाइड अवरोधक प्रयोग गरेर सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा एमाइलोइड-β को स्तरमा 40% कमीले पुष्टि भयो।यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि भिभो फेज चयन विधिहरूद्वारा पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू चिकित्सकीय प्रभावको साथ मस्तिष्कमा म्याक्रोमोलेक्युलहरूको प्रणालीगत वितरणको लागि उपयोगी वाहनहरू हुन सक्छन्।
केन्द्रीय स्नायु प्रणाली (CNS) लक्षित थेरापी अनुसन्धानले मस्तिष्कमा सक्रिय औषधि वितरण गर्ने संयन्त्रहरू पत्ता लगाउन कम प्रयासको साथ, CNS-लक्ष्यीकरण गुणहरू प्रदर्शन गर्ने अनुकूलित औषधि र एजेन्टहरू पहिचान गर्नमा मुख्यतया ध्यान केन्द्रित गरेको छ।यो अब परिवर्तन हुन थालेको छ किनकि औषधि वितरण, विशेष गरी ठूला अणुहरू, आधुनिक न्यूरोसाइन्स औषधि विकासको अभिन्न अंग हो।रगत-मस्तिष्क अवरोध (BBB) ​​र रगत-मस्तिष्क अवरोध (BCBB) १ सम्मिलित सेरेब्रोभास्कुलर अवरोध प्रणालीद्वारा केन्द्रीय स्नायु प्रणालीको वातावरण राम्रोसँग सुरक्षित छ, यसले मस्तिष्कमा औषधिहरू पुर्‍याउन चुनौतीपूर्ण बनाउँछ।यो अनुमान गरिएको छ कि लगभग सबै ठूला अणु औषधिहरू र 98% भन्दा बढी साना अणु औषधिहरू मस्तिष्कबाट हटाइन्छ।यसैले CNS 4,5 लाई चिकित्सीय औषधिहरूको कुशल र विशिष्ट डेलिभरी प्रदान गर्ने नयाँ मस्तिष्क यातायात प्रणालीहरू पहिचान गर्न धेरै महत्त्वपूर्ण छ।जे होस्, BBB र BCSFB ले औषधि वितरणको लागि उत्कृष्ट अवसर पनि प्रस्तुत गर्दछ किनकि तिनीहरूले मस्तिष्कको सबै संरचनाहरू प्रवेश गर्छन् र यसको व्यापक भास्कुलेटर मार्फत प्रवेश गर्छन्।यसैले, मस्तिष्कमा डेलिभरीको गैर-आक्रामक विधिहरू प्रयोग गर्ने हालको प्रयासहरू धेरै हदसम्म अन्तर्जात BBB6 रिसेप्टर प्रयोग गरेर रिसेप्टर-मध्यस्थ यातायात (PMT) को संयन्त्रमा आधारित छन्।ट्रान्सफरिन रिसेप्टर मार्ग 7,8 को प्रयोग गरेर हालैका प्रमुख प्रगतिहरूको बावजुद, सुधारिएको गुणहरूसँग नयाँ डेलिभरी प्रणालीहरूको थप विकास आवश्यक छ।यस अन्तको लागि, हाम्रो लक्ष्य CSF यातायात मध्यस्थता गर्न सक्षम पेप्टाइडहरू पहिचान गर्नु थियो, किनकि तिनीहरू सिद्धान्तमा CNS मा म्याक्रोमोलिक्युलहरू डेलिभर गर्न वा नयाँ रिसेप्टर मार्गहरू खोल्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।विशेष गरी, सेरेब्रोभास्कुलर प्रणाली (BBB र BSCFB) को विशिष्ट रिसेप्टरहरू र ट्रान्सपोर्टरहरूले बायोथेराप्यूटिक औषधिहरूको सक्रिय र विशिष्ट डेलिभरीको लागि सम्भावित लक्ष्यको रूपमा सेवा गर्न सक्छन्।सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) choroid plexus (CS) को एक सेक्रेटरी उत्पादन हो र subarachnoid space र ventricular space4 को माध्यम बाट मस्तिष्कको इन्टरस्टिशियल फ्लुइडसँग प्रत्यक्ष सम्पर्कमा हुन्छ।भर्खरै यो देखाइएको छ कि subarachnoid cerebrospinal तरल पदार्थ मस्तिष्क को interstitium मा अत्यधिक फैलिन्छ।हामी यो subarachnoid प्रवाह पथ वा सीधा BBB मार्फत parenchymal स्पेस पहुँच गर्न आशा गर्छौं।यो प्राप्त गर्न, हामीले भिभो फेज चयन रणनीतिमा एक बलियो कार्यान्वयन गर्‍यौं जसले यी दुई फरक मार्गहरू मध्ये कुनै एकद्वारा ढुवानी गरिएका पेप्टाइडहरूलाई आदर्श रूपमा पहिचान गर्दछ।
हामीले अब उच्च पुस्तकालय विविधताको साथ प्रारम्भिक छनोट राउन्डहरू अनुगमन गर्न उच्च थ्रुपुट अनुक्रमण (HTS) सँग जोडिएको CSF नमूनाको साथ भिभो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग विधिमा अनुक्रमिक वर्णन गर्दछौं।रगत प्रदूषणबाट बच्नको लागि स्थायी रूपमा प्रत्यारोपित ठूलो सिस्टरना (CM) क्यानुलाको साथ सचेत मुसाहरूमा स्क्रीनिंग गरिएको थियो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, यो दृष्टिकोणले मस्तिष्क-लक्ष्यीकरण र पेप्टाइड्स दुबै सेरेब्रोभास्कुलर बाधामा यातायात गतिविधिको साथ चयन गर्दछ।हामीले T7 फेजहरू तिनीहरूको सानो आकार (~ 60 nm) 10 को कारण प्रयोग गर्यौं र सुझाव दियौं कि तिनीहरू भेसिकलहरूको यातायातको लागि उपयुक्त छन् जसले एन्डोथेलियल र/वा एपिथेलियल-मेडुला बाधाको ट्रान्ससेलुलर क्रसिङलाई अनुमति दिन्छ।चार राउन्ड प्यानिङ पछि, भिवो CSF संवर्धन र सेरेब्रल माइक्रोवेसेल एसोसिएसनमा बलियो देखाउँदै फेज जनसंख्यालाई अलग गरियो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, हामीले मनपर्ने र रासायनिक रूपमा संश्लेषित उत्तम उम्मेद्वार पेप्टाइडहरू सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा प्रोटीन कार्गो ढुवानी गर्न सक्षम छन् भनेर प्रदर्शन गरेर हाम्रो निष्कर्षहरू पुष्टि गर्न सक्षम भयौं।पहिलो, CNS को फार्माकोडायनामिक प्रभावहरू BACE1 पेप्टाइडको अवरोधकसँग अग्रणी ट्रान्जिट पेप्टाइड संयोजन गरेर स्थापित गरिएको थियो।भिभो फंक्शनल स्क्रिनिङ रणनीतिहरूले प्रभावकारी प्रोटीन कार्गो वाहकहरूको रूपमा उपन्यास मस्तिष्क यातायात पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न सक्छ भन्ने प्रदर्शनको अतिरिक्त, हामी समान कार्यात्मक चयन दृष्टिकोणहरू पनि उपन्यास मस्तिष्क यातायात मार्गहरू पहिचान गर्न महत्त्वपूर्ण हुने आशा गर्छौं।
प्लेक-फर्मिङ इकाइहरू (PFU) को आधारमा, फेज प्याकेजिङ चरण पछि, लगभग 109 को विविधताको साथ अनियमित 12-मेर रैखिक T7 फेज पेप्टाइडहरूको पुस्तकालय डिजाइन र सिर्जना गरिएको थियो (सामग्री र विधिहरू हेर्नुहोस्)।यो नोट गर्न महत्त्वपूर्ण छ कि हामीले vivo panning मा पहिले यो पुस्तकालय सावधानीपूर्वक विश्लेषण गर्यौं।परिमार्जित प्राइमरहरू प्रयोग गरेर फेज लाइब्रेरी नमूनाहरूको PCR एम्प्लीफिकेशनले एचटीएस (पूरक चित्र 1a) मा प्रत्यक्ष रूपमा लागू हुने एम्प्लिकनहरू उत्पन्न गर्यो।कारण a) HTS11 अनुक्रमण त्रुटिहरू, b) प्राइमरहरूको गुणस्तरमा प्रभाव (NNK) 1-12, र c) स्ट्यान्डबाइ लाइब्रेरीमा वाइल्ड-टाइप (wt) फेज (स्केलेटन इन्सर्टहरू) को उपस्थिति, एक अनुक्रम फिल्टरिंग प्रक्रिया केवल प्रमाणित अनुक्रम जानकारी निकाल्न लागू गरिएको थियो।यी फिल्टर चरणहरू सबै HTS अनुक्रम पुस्तकालयहरूमा लागू हुन्छन्।मानक पुस्तकालयको लागि, कुल 233,868 पढाइहरू प्राप्त गरिएका थिए, जसमध्ये 39% फिल्टर मापदण्डमा उत्तीर्ण भएका थिए र पुस्तकालय विश्लेषण र त्यसपछिका राउन्डहरूका लागि चयनको लागि प्रयोग गरियो (पूरक चित्र 1c–e)।पढाइहरू मुख्यतया 36 न्यूक्लियोटाइड्स (पूरक चित्र 1c) मा एक चोटीको साथ लम्बाइमा 3 आधार जोडीको गुणनहरू थिए, पुस्तकालय डिजाइन (NNK) 1-12 पुष्टि गर्दै।उल्लेखनीय रूपमा, पुस्तकालय सदस्यहरूको लगभग 11% मा 12-आयामी जंगली-प्रकार (wt) ब्याकबोन PAGISRELVDKL सम्मिलित थियो, र लगभग आधा अनुक्रमहरू (49%) सम्मिलित वा मेटाइएका थिए।पुस्तकालय पुस्तकालयको HTS ले पुस्तकालयमा पेप्टाइडहरूको उच्च विविधता पुष्टि गर्‍यो: पेप्टाइड अनुक्रमहरूको 81% भन्दा बढी एक पटक मात्र फेला पर्यो र ≥4 प्रतिलिपिहरूमा मात्र 1.5% देखा पर्यो (पूरक चित्र 2a)।एमिनो एसिड (एए) को फ्रिक्वेन्सीहरू रिपटोयरमा सबै 12 स्थानहरूमा डिजेनेरेट एनकेके रिपर्टोयर (पूरक चित्र 2b) द्वारा उत्पन्न कोडनहरूको संख्याको लागि अपेक्षित आवृत्तिहरूसँग राम्रोसँग सम्बन्धित छ।यी सम्मिलितहरू द्वारा एन्कोड गरिएको एए अवशेषहरूको अवलोकन गरिएको आवृत्ति गणना गरिएको आवृत्ति (r = 0.893) (पूरक चित्र 2c) सँग राम्रोसँग सम्बन्धित छ।इंजेक्शनको लागि फेज पुस्तकालयहरूको तयारीमा एन्डोटोक्सिनको प्रवर्धन र हटाउने चरणहरू समावेश छन्।यो पहिले फेज पुस्तकालयहरूको विविधतालाई सम्भावित रूपमा कम गर्न देखाइएको छ 12,13।तसर्थ, हामीले एक प्लेट-एम्प्लीफाइड फेज पुस्तकालयलाई क्रमबद्ध गर्यौं जुन एन्डोटोक्सिन हटाउने प्रक्रियाबाट गुज्रिएको थियो र AA को आवृत्ति अनुमान गर्न मूल पुस्तकालयसँग तुलना गर्‍यौं।एक बलियो सहसंबंध (r = 0.995) मूल पोखरी र एम्प्लीफाइड र शुद्ध पोखरी (पूरक चित्र 2d) बीच अवलोकन गरिएको थियो, T7 फेज प्रयोग गरेर प्लेटहरूमा एम्प्लीफाइड क्लोनहरू बीचको प्रतिस्पर्धाले ठूलो पूर्वाग्रहको कारण बनाउँदैन।यो तुलना प्रत्येक पुस्तकालयमा ट्रिपेप्टाइड मोटिफहरूको आवृत्तिमा आधारित छ, किनकि पुस्तकालयहरूको विविधता (~ 109) HTS सँग पनि पूर्ण रूपमा कब्जा गर्न सकिँदैन।प्रत्येक स्थितिमा aa को फ्रिक्वेन्सी विश्लेषणले प्रविष्ट गरिएको भण्डारको अन्तिम तीन स्थानहरूमा सानो स्थिति-निर्भर पूर्वाग्रह प्रकट गर्‍यो (पूरक चित्र 2e)।अन्तमा, हामीले पुस्तकालयको गुणस्तर र विविधता स्वीकार्य रहेको निष्कर्ष निकाल्यौं र चयनका धेरै राउन्डहरू बीचको फेज पुस्तकालयहरूको प्रवर्धन र तयारीका कारण विविधतामा थोरै मात्र परिवर्तनहरू देखिएका थिए।
सीरियल सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूना शल्यक्रियाद्वारा सचेत मुसाको सीएममा क्यान्युला प्रत्यारोपण गरेर T7 फेज इन्जेक्टेड (iv) BBB र/वा BCSFB (चित्र 1a-b) मार्फत इन्जेक्सन गर्न सजिलो बनाउन सकिन्छ।हामीले भिभो चयन (चित्र 1c) को पहिलो तीन राउन्डहरूमा दुई स्वतन्त्र चयन हातहरू (आर्म्स A र B) प्रयोग गर्यौं।हामीले बिस्तारै छनोटको पहिलो तीन राउन्डमा प्रस्तुत गरिएको फेजको कुल मात्रा घटाएर छनोटको कठोरता बढाएका छौं।प्यानिङको चौथो राउन्डको लागि, हामीले शाखा A र B बाट नमूनाहरू जोड्यौं र तीन अतिरिक्त स्वतन्त्र चयनहरू प्रदर्शन गर्यौं।यस मोडेलमा T7 फेज कणहरूको इन भिभो गुणहरू अध्ययन गर्न, जंगली-प्रकार फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इन्सर्ट) पुच्छर नस मार्फत मुसाहरूमा इन्जेक्ट गरिएको थियो।विभिन्न समय बिन्दुहरूमा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र रगतबाट फेजहरूको पुन: प्राप्तिले देखायो कि तुलनात्मक रूपमा सानो T7 icosahedral फेजहरू रगतको डिब्बाबाट द्रुत प्रारम्भिक निकासी चरण थियो (पूरक चित्र। 3)।प्रशासित टाइटर र मुसाको रगतको मात्राको आधारमा, हामीले गणना गर्यौं कि लगभग 1% wt।प्रशासित खुराकबाट फेज इन्ट्राभेनस इन्जेक्सनको 10 मिनेट पछि रगतमा पत्ता लगाइएको थियो।यस प्रारम्भिक द्रुत गिरावट पछि, 27.7 मिनेटको आधा-जीवनको साथ एक ढिलो प्राथमिक क्लियरेन्स मापन गरियो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, CSF कम्पार्टमेन्टबाट धेरै थोरै फेजहरू मात्र पुन: प्राप्त गरियो, CSF डिब्बामा जंगली-प्रकारको फेज माइग्रेसनको लागि कम पृष्ठभूमिलाई संकेत गर्दै (पूरक चित्र 3)।औसतमा, रगतमा T7 फेजको लगभग 1 x 10-3% टाइटरहरू र 4 x 10-8% प्रारम्भिक इन्फ्युज्ड फेजहरू सम्पूर्ण नमूना अवधि (0-250 मिनेट) मा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा पत्ता लगाइयो।उल्लेखनीय रूपमा, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा जंगली प्रकारको फेजको आधा-जीवन (25.7 मिनेट) रगतमा देखाइएको जस्तै थियो।यी डेटाले देखाउँछ कि रगतबाट CSF डिब्बालाई अलग गर्ने बाधा सीएम-क्यान्युलेटेड मुसाहरूमा अक्षुण्ण छ, जसले फेज लाइब्रेरीहरूको भिभो चयनमा रगतबाट सजिलै CSF डिब्बामा पठाइने क्लोनहरू पहिचान गर्न अनुमति दिन्छ।
(a) ठूलो पोखरीबाट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) को पुन: नमूनाको लागि एक विधि सेट अप गर्दै।(b) केन्द्रीय स्नायु प्रणाली (CNS) बाधाको सेलुलर स्थान र रगत-मस्तिष्क अवरोध (BBB) ​​र रगत-मस्तिष्क अवरोध पार गर्ने पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न प्रयोग गरिने चयन रणनीति देखाउने रेखाचित्र।(c) भिवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिङ फ्लोचार्टमा।छनोटको प्रत्येक राउन्डमा, फेजहरू (बाण भित्रका पशु पहिचानकर्ताहरू) नशामा इन्जेक्सन गरियो।दुई स्वतन्त्र वैकल्पिक शाखाहरू (A, B) छनोटको चौथो राउन्डसम्म अलग-अलग राखिएका छन्।चयन राउन्ड 3 र 4 को लागि, CSF बाट निकालिएको प्रत्येक फेज क्लोन म्यानुअल रूपमा क्रमबद्ध गरिएको थियो।(d) T7 पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 1012 phages/animal) को इन्ट्राभेनस इन्जेक्सन पछि दुई क्यान्युलेटेड मुसाहरूमा चयनको पहिलो राउन्डको समयमा रगत (रातो सर्कलहरू) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (हरियो त्रिकोण) बाट अलग गरिएको फेजको काइनेटिक्स।नीलो वर्गहरूले रगतमा फेजको औसत प्रारम्भिक एकाग्रतालाई संकेत गर्दछ, कुल रगतको मात्रालाई ध्यानमा राखेर, इंजेक्शन गरिएको फेजको मात्राबाट गणना गरिन्छ।कालो वर्गहरूले रगत फेज सांद्रताबाट एक्स्ट्रपोलेट गरिएको y रेखाको प्रतिच्छेदन बिन्दुलाई संकेत गर्दछ।(e,f) पेप्टाइडमा पाइने सम्भावित ओभरल्यापिङ ट्रिपेप्टाइड मोटिफहरूको सापेक्ष आवृत्ति र वितरण प्रस्तुत गर्नुहोस्।1000 पठनहरूमा पाइने मोटिफहरूको संख्या देखाइएको छ।महत्त्वपूर्ण रूपमा (p <0.001) समृद्ध मोटिफहरू रातो थोप्लाहरूले चिन्ह लगाइएका छन्।(e) इन्जेक्सन गरिएको पुस्तकालयको ट्राइपेप्टाइड मोटिफको सापेक्ष आवृत्तिलाई जनावरहरू #1.1 र #1.2 बाट रक्त-व्युत्पन्न फेजसँग तुलना गर्ने सहसंबंध स्क्याटरप्लट।(f) रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा पृथक जनावर फेज ट्राइपेप्टाइड मोटिफ्स #1.1 र #1.2 को सापेक्ष आवृत्तिहरूको तुलना गर्ने सहसंबंध स्क्याटरप्लट।(g, h) रगतमा समृद्ध फेजको अनुक्रम ID प्रतिनिधित्व (g) बनाम इन्जेक्टेड पुस्तकालयहरू र CSF (h) बनाम रगतमा समृद्ध भएको फेज दुवै जनावरहरूमा भिभो चयनको राउन्ड पछि।एक-अक्षर कोडको साइजले त्यो स्थितिमा कति पटक एमिनो एसिड हुन्छ भनेर संकेत गर्दछ।हरियो = ध्रुवीय, बैजनी = तटस्थ, नीलो = आधारभूत, रातो = अम्लीय र कालो = हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड।चित्र 1a, b एडवार्ड उरिच द्वारा डिजाइन र उत्पादन गरिएको थियो।
हामीले फेज पेप्टाइड लाइब्रेरीलाई दुई सीएम इन्स्ट्रुमेन्ट मुसा (क्लेड्स ए र बी) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र रगतबाट अलग फेज (चित्र 1d) मा इन्जेक्ट गर्यौं।पुस्तकालयको प्रारम्भिक द्रुत निकासी जंगली प्रकारको फेजको तुलनामा कम स्पष्ट थियो।दुबै जनावरहरूमा इंजेक्शन गरिएको पुस्तकालयको औसत आधा-जीवन रगतमा 24.8 मिनेट थियो, जंगली प्रकारको फेज जस्तै, र CSF मा 38.5 मिनेट।प्रत्येक जनावरबाट रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेज नमूनाहरू एचटीएसको अधीनमा थिए र सबै पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू छोटो ट्राइपेप्टाइड मोटिफको उपस्थितिको लागि विश्लेषण गरियो।Tripeptide motifs चयन गरिएको थियो किनभने तिनीहरू संरचना गठन र पेप्टाइड-प्रोटिन अन्तरक्रिया 14,15 को लागि न्यूनतम आधार प्रदान गर्दछ।हामीले इन्जेक्टेड फेज लाइब्रेरी र दुबै जनावरहरूको रगतबाट निकालिएका क्लोनहरू (चित्र 1e) बीचको आकृतिहरूको वितरणमा राम्रो सम्बन्ध फेला पार्यौं।तथ्याङ्कले सङ्केत गर्छ कि पुस्तकालयको संरचना रगतको कम्पार्टमेन्टमा थोरै मात्र समृद्ध छ।Weblogo16 सफ्टवेयरको अनुकूलन प्रयोग गरेर प्रत्येक स्थितिमा एमिनो एसिड फ्रिक्वेन्सीहरू र सहमति अनुक्रमहरू थप विश्लेषण गरियो।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले रगत ग्लाइसिन अवशेषहरूमा बलियो संवर्धन पाएका छौं (चित्र १ ग्राम)।जब रगतलाई CSF बाट चयन गरिएका क्लोनहरूसँग तुलना गरिएको थियो, बलियो चयन र केही मोटिफहरूको विच्छेदन देखियो (चित्र 1f), र 12-सदस्य (चित्र 1h) मा पूर्वनिर्धारित स्थानहरूमा निश्चित एमिनो एसिडहरू प्राथमिकतामा उपस्थित थिए।विशेष रूपमा, व्यक्तिगत जनावरहरूमा मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थमा उल्लेखनीय भिन्नता थियो, जबकि रगत ग्लाइसिन संवर्धन दुवै जनावरहरूमा देखियो (पूरक चित्र 4a–j)।जनावरहरू #1.1 र #1.2 को सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा अनुक्रम डेटाको कडा फिल्टरिङ पछि, कुल 964 र 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइडहरू प्राप्त गरियो (पूरक चित्र। 1d-e)।पृथक फेज क्लोनहरू एम्प्लीफाइड गरियो र भिभो चयनको दोस्रो चरणको अधीनमा थियो।छनोटको दोस्रो राउन्डबाट निकालिएका फेजहरू प्रत्येक जनावरमा HTS को अधीनमा थिए र सबै पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू ट्रिपेप्टाइड मोटिफहरू (चित्र 2a, b, ef) को घटनाको विश्लेषण गर्न एक मोटिफ पहिचान कार्यक्रममा इनपुटको रूपमा प्रयोग गरियो।CSF बाट बरामद भएको फेजको पहिलो चक्रको तुलनामा, हामीले शाखा A र B (चित्र 2) मा CSF मा धेरै आकृतिहरूको थप चयन र अचयन देख्यौं।एक नेटवर्क पहिचान एल्गोरिदम लागू गरियो कि तिनीहरूले लगातार अनुक्रमको विभिन्न ढाँचाहरू प्रतिनिधित्व गर्छन् भनेर निर्धारण गर्न।CSF द्वारा वैकल्पिक क्लेड A (Fig. 2c, d) र clade B (Fig. 2g, h) मा 12-आयामी अनुक्रमहरू बीच स्पष्ट समानता देखियो।प्रत्येक शाखामा संकलन गरिएको विश्लेषणले 12-मेर पेप्टाइड्स (पूरक चित्र 5c,d) को लागि फरक चयन प्रोफाइलहरू र छनोटको पहिलो राउन्डको तुलनामा दोस्रो चरणको छनोट पछि CSF/ब्लड टाइटर अनुपातमा समयसँगै वृद्धि भएको खुलासा गर्‍यो (पूरक चित्र 5e)।)।
भिवो फंक्शनल फेज डिस्प्ले चयनको लगातार दुई राउन्डहरूद्वारा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा मोटिफहरू र पेप्टाइड्सको संवर्धन।
प्रत्येक जनावरको पहिलो राउन्डबाट बरामद भएका सबै सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेजहरू (जनावरहरू #1.1 र #1.2) पोल, एम्प्लीफाइड, HT-अनुक्रमित र सँगै पुन: इन्जेक्ट गरियो (2 x 1010 फेज/जनावर) 2 SM क्यान्युलेट गरिएको मुसा (#1.1 → #)।२.१ र २.२, १.२ → २.३ र २.४)।(a,b,e,f) पहिलो र दोस्रो चयन राउन्डहरूमा सबै CSF-व्युत्पन्न फेजहरूको ट्रिपेप्टाइड मोटिफहरूको सापेक्ष आवृत्तिको तुलना गर्ने सहसंबंध स्क्याटरप्लटहरू।सापेक्ष फ्रिक्वेन्सी र आकृतिहरूको वितरण सबै सम्भावित ओभरल्यापिङ ट्रिपेप्टाइडहरू दुवै अभिमुखीकरणहरूमा पेप्टाइडहरूमा पाइन्छ।1000 पठनहरूमा पाइने मोटिफहरूको संख्या देखाइएको छ।तुलनात्मक पुस्तकालयहरू मध्ये कुनै एकमा महत्त्वपूर्ण रूपमा (p <0.001) चयन गरिएका वा बहिष्कृत गरिएका मोटिफहरू रातो थोप्लाहरूसँग हाइलाइट गरिएका छन्।(c, d, g, h) भिभो चयनमा राउन्ड 2 र 1 मा आधारित सबै CSF- सम्पन्न १२ एमिनो एसिड लामो अनुक्रमहरूको अनुक्रम लोगो प्रतिनिधित्व।एक-अक्षर कोडको साइजले त्यो स्थितिमा कति पटक एमिनो एसिड हुन्छ भनेर संकेत गर्दछ।लोगो प्रतिनिधित्व गर्न, दुई चयन राउन्डहरू बीच व्यक्तिगत जनावरहरूबाट निकालिएको CSF अनुक्रमहरूको आवृत्ति तुलना गरिन्छ र दोस्रो राउन्डमा समृद्ध अनुक्रमहरू देखाइन्छ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 र (h) #1.2–#2।(c, d) जनावरहरूमा दिइएको स्थितिमा सबैभन्दा समृद्ध एमिनो एसिडहरू नं.२.१ र नं.२.२ वा (g, h) जनावरहरूमा नं.2.3 र नं।2.4 रंगमा देखाइएको छ।हरियो = ध्रुवीय, बैजनी = तटस्थ, नीलो = आधारभूत, रातो = अम्लीय र कालो = हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड।
छनोटको तेस्रो राउन्ड पछि, हामीले 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरू (#3.1 र #3.2) 332 CSF-पुनर्गठित फेज क्लोनहरू दुई जनावरहरूबाट पृथक (पूरक चित्र 6a) बाट पहिचान गर्यौं।अनुक्रम LGSVS (18.7%) मा उच्चतम सापेक्षिक अनुपात थियो, त्यसपछि जंगली-प्रकार सम्मिलित PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), र SARGSWREIVSLS (2.2%)।अन्तिम चौथो राउन्डमा, हामीले तीनवटा अलग-अलग जनावरहरू (चित्र 1c) बाट स्वतन्त्र रूपमा चयन गरिएका दुईवटा शाखाहरू जम्मा गर्यौं।CSF बाट बरामद 925 अनुक्रमित फेज क्लोनहरू मध्ये, चौथो राउन्डमा हामीले 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरू फेला पार्यौं (पूरक चित्र 6b), जसमध्ये जंगली-प्रकारको फेजको सापेक्ष अनुपात 0.8% मा झर्यो।चौथो राउन्डमा सबैभन्दा सामान्य CSF क्लोनहरू LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), GRPQKINGARVC (3.6%), %2SSDRL (3.6%) थिए।%))।चयन गरिएका पेप्टाइडहरूको लम्बाइ दायरा NNK पुस्तकालय डिजाइनको लागि डिजेनेरेट कोडनहरू प्रयोग गर्दा लाइब्रेरी प्राइमरहरूमा न्यूक्लियोटाइड सम्मिलित/मेटाउने वा समयपूर्व रोकिने कोडनहरूको कारण हो।प्रिमच्योर स्टप कोडनहरूले छोटो पेप्टाइडहरू उत्पन्न गर्छन् र तिनीहरूमा अनुकूल एए मोटिफ समावेश भएकोले चयन गरिन्छ।लामो पेप्टाइडहरू सिंथेटिक पुस्तकालयहरूको प्राइमरहरूमा सम्मिलित/मेटाइने परिणाम हुन सक्छ।यसले डिजाइन गरिएको स्टप कोडनलाई फ्रेम बाहिर राख्छ र नयाँ स्टप कोडन डाउनस्ट्रीम नदेखिएसम्म यसलाई पढ्छ।सामान्यतया, हामीले नमूना आउटपुट डेटासँग इनपुट डेटा तुलना गरेर सबै चार चयन राउन्डहरूको लागि संवर्धन कारकहरू गणना गर्यौं।स्क्रिनिङको पहिलो चरणको लागि, हामीले गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि सन्दर्भको रूपमा जंगली-प्रकार फेज टाइटरहरू प्रयोग गर्यौं।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, पहिलो CSF चक्रमा नकारात्मक फेज चयन धेरै बलियो थियो, तर रगतमा होइन (चित्र 3a), जुन CSF डिब्बामा पेप्टाइड लाइब्रेरीका अधिकांश सदस्यहरूको निष्क्रिय प्रसारको कम सम्भावनाको कारणले हुन सक्छ वा सापेक्ष फेजहरू ब्याक्टेरियो भन्दा रक्तप्रवाहबाट बढी प्रभावकारी रूपमा कायम राख्न वा हटाइन्छ।यद्यपि, दोस्रो चरणको प्यानिङमा, दुवै क्लेडहरूमा CSF मा फेजहरूको बलियो चयन अवलोकन गरिएको थियो, जसले अघिल्लो राउन्ड CSF अपटेकलाई बढावा दिने पेप्टाइडहरू प्रदर्शन गर्ने फेजहरूमा समृद्ध भएको सुझाव दिन्छ (चित्र 3a)।फेरि, महत्त्वपूर्ण रगत संवर्धन बिना।तेस्रो र चौथो राउन्डमा पनि, फेज क्लोनहरू CSF मा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थिए।छनोटको अन्तिम दुई राउन्डहरू बीचको प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमको सापेक्षिक आवृत्तिको तुलना गर्दै, हामीले छनोटको चौथो राउन्ड (चित्र 3b) मा अनुक्रमहरू अझ बढी समृद्ध भएको फेला पार्यौं।दुवै पेप्टाइड अभिमुखीकरण प्रयोग गरेर सबै 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरूबाट कुल 931 ट्रिपेप्टाइड मोटिफहरू निकालिएको थियो।चौथो राउन्डमा सबैभन्दा समृद्ध मोटिफहरू इन्जेक्ट गरिएको पुस्तकालय (कट-अफ: 10% संवर्धन) (पूरक चित्र 6c) को तुलनामा सबै राउन्डहरूमा तिनीहरूको संवर्धन प्रोफाइलहरूको लागि अझ नजिकबाट जाँच गरियो।छनोटको सामान्य ढाँचाले देखाएको छ कि अध्ययन गरिएका धेरैजसो उद्देश्यहरू दुवै छनोट शाखाका सबै अघिल्लो राउन्डहरूमा समृद्ध थिए।यद्यपि, केही आकृतिहरू (जस्तै SGL, VSG, LGS GSV) वैकल्पिक क्लेड A बाट मुख्य रूपमा थिए, जबकि अन्य (जस्तै FGW, RTN, WGF, NTR) वैकल्पिक क्लेड B मा समृद्ध थिए।
CSF-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइडहरू र स्ट्रेप्टाभिडिन पेलोडहरूमा संयुग्मित बायोटिनिलेटेड लीडर पेप्टाइडहरूको CSF यातायातको प्रमाणीकरण।
(a) इन्जेक्टेड (इनपुट = I) फेज (PFU) टाइटर र निर्धारित CSF फेज टाइटर (आउटपुट = O) मा आधारित सबै चार राउन्डहरू (R1-R4) मा गणना गरिएको संवर्धन अनुपात।पछिल्लो तीन राउन्डहरू (R2-R4) को लागि संवर्धन कारकहरू अघिल्लो राउन्ड र वजन डेटाको साथ पहिलो राउन्ड (R1) सँग तुलना गरेर गणना गरिएको थियो।खुला बारहरू सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड हुन्, छायादार बारहरू प्लाज्मा हुन्।(***p <0.001, विद्यार्थीको टी-टेस्टमा आधारित)।(b) सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा फेज पेप्टाइडहरूको सूची, छनोटको राउन्ड 4 पछि CSF मा सङ्कलन गरिएका सबै फेजहरूमा तिनीहरूको सापेक्षिक अनुपात अनुसार क्रमबद्ध।छवटा सबैभन्दा सामान्य फेज क्लोनहरू राउन्ड 3 र 4 चयन (इन्सेटहरू) बीचको रंग, नम्बर र तिनीहरूको संवर्धन कारकहरूमा हाइलाइट गरिएका छन्।(c,d) राउन्ड 4 बाट छवटा सबैभन्दा समृद्ध फेज क्लोनहरू, खाली फेज र अभिभावकीय फेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरू CSF नमूना मोडेलमा व्यक्तिगत रूपमा विश्लेषण गरियो।CSF र रगतको नमूनाहरू तोकिएको समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरियो।(c) बराबर मात्रामा ६ उम्मेदवार फेज क्लोनहरू (२ x १०१० फेज/जनावरहरू), खाली फेजहरू (#१७७९) (२ x १०१० फेज/जनावरहरू) र स्टक फेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरू (२ x १०१२ फेजहरू/जनावरहरू) इन्जेक्सन गरी कम्तिमा ३ सीएमको पुच्छरमा अलग्गै राखिएको हुन्छ।प्रत्येक इन्जेक्टेड फेज क्लोन र फेज पेप्टाइड लाइब्रेरीको CSF फार्माकोकाइनेटिक्स समयसँगै देखाइएको छ।(d) नमूना समय मा सबै बरामद phages/mL को लागि औसत CSF/रक्त अनुपात देखाउँछ।(e) चार सिंथेटिक लिडर पेप्टाइड्स र एउटा स्क्र्याम्बल्ड कन्ट्रोल बायोटिनसँग स्ट्रेप्टाभिडिनसँग जोडिएको थियो तिनीहरूको एन-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) मार्फत इन्जेक्सन (पुच्छर नस iv, 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाभिडिन/किग्रा)।कम्तिमा तीन इन्ट्युटेड मुसा (N = 3)।)।CSF नमूनाहरू संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरियो र स्ट्रेप्टाभिडिन सांद्रताहरू CSF एन्टी-स्ट्रेप्टाभिडिन ELISA (nd = पत्ता लागेन) द्वारा मापन गरियो।(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ANOVA परीक्षणमा आधारित)।(f) सबैभन्दा समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (बैजनी) को चौथो राउन्ड चयनबाट अन्य चयन गरिएका फेज पेप्टाइड क्लोनहरूसँग एमिनो एसिड अनुक्रमको तुलना।समान र समान एमिनो एसिड टुक्राहरू रंग-कोडित छन्।
चौथो राउन्ड (चित्र 3b) मा सबै समृद्ध चरणहरू मध्ये, छ उम्मेद्वार क्लोनहरू CSF नमूना मोडेलमा थप व्यक्तिगत विश्लेषणको लागि चयन गरियो।छ उम्मेदवार फेजको बराबर मात्रा, खाली फेज (इनसर्ट छैन) र प्रोफेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरू तीन क्यान्युलेटेड CM जनावरहरूमा इन्जेक्ट गरियो, र फार्माकोकाइनेटिक्स CSF (चित्र 3c) र रगत (पूरक चित्र 7) एसेसमा निर्धारण गरियो।परीक्षण गरिएका सबै फेज क्लोनहरूले खाली नियन्त्रण फेज (#1779) भन्दा 10-1000 गुणा उच्च स्तरमा CSF डिब्बालाई लक्षित गरे।उदाहरणका लागि, क्लोन #2020 र #2077 मा नियन्त्रण फेज भन्दा लगभग 1000 गुणा उच्च CSF टाइटरहरू थिए।प्रत्येक चयन गरिएको पेप्टाइडको फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल फरक छ, तर ती सबैमा उच्च CSF होमिङ क्षमता छ।हामीले क्लोन #1903 र #2011 को लागि समयको साथ निरन्तर घटेको अवलोकन गर्यौं, जबकि क्लोन #2077, #2002 र #2009 को लागि पहिलो 10 मिनेटको बृद्धिले सक्रिय यातायातलाई संकेत गर्न सक्छ तर प्रमाणित गर्न आवश्यक छ।क्लोन #2020, #2002, र #2077 उच्च स्तरमा स्थिर भयो, जबकि क्लोन #2009 को CSF एकाग्रता प्रारम्भिक वृद्धि पछि बिस्तारै घट्यो।हामीले त्यसपछि प्रत्येक CSF उम्मेद्वारको सापेक्ष आवृत्तिलाई यसको रगत एकाग्रता (चित्र 3d) सँग तुलना गर्‍यौं।प्रत्येक CSF उम्मेद्वारको रगतको टाइटरसँग सबै नमूना समयहरूमा औसत टाइटरको सहसम्बन्धले देखायो कि छवटा उम्मेद्वारहरू मध्ये तीनको रगत CSF मा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध भएको थियो।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, क्लोन #2077 ले उच्च रगत स्थिरता देखायो (पूरक चित्र 7)।पेप्टाइडहरू आफैले CSF डिब्बामा फेज कणहरू बाहेक अन्य कार्गोहरू सक्रिय रूपमा ढुवानी गर्न सक्षम छन् भन्ने कुरा पुष्टि गर्न, हामीले एन-टर्मिनसमा पेप्टाइडहरू फेज कणसँग जोड्ने चारवटा लीडर पेप्टाइडहरू बायोटिनसँग व्युत्पन्न गरेका थिए।बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड्स (न. 2002, 2009, 2020 र 2077) लाई स्ट्रेप्टाभिडिन (SA) सँग मिलाएर फेज ज्यामितिको नक्कल गर्ने मल्टिमेरिक रूपहरू प्राप्त गर्नका लागि गरिएको थियो।यो ढाँचाले हामीलाई रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा कार्गो-ट्रान्सपोर्टिङ प्रोटीन पेप्टाइड्सको रूपमा SA एक्सपोजर मापन गर्न पनि अनुमति दियो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, फेज डाटा प्राय: पुन: उत्पादन गर्न सकिन्छ जब सिंथेटिक पेप्टाइडहरू यस SA-संयुग्मित ढाँचामा प्रशासित थिए (चित्र 3e)।स्क्र्याम्बल गरिएको पेप्टाइड्समा कम प्रारम्भिक एक्सपोजर र 48 घण्टा भित्र पत्ता लगाउन नसकिने स्तरको साथ छिटो CSF क्लियरेन्स थियो।CSF स्पेसमा यी पेप्टाइड फेज क्लोनहरूको डेलिभरी मार्गहरूमा अन्तरदृष्टि प्राप्त गर्न, हामीले भिवोमा इन्ट्राभेनस इन्जेक्सन पछि 1 घण्टा फेज कणहरू प्रत्यक्ष रूपमा पत्ता लगाउन इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) को प्रयोग गरेर व्यक्तिगत फेज पेप्टाइड हिटहरूको स्थानीयकरण विश्लेषण गर्‍यौं।विशेष रूपमा, क्लोन #2002, #2077, र #2009 मस्तिष्क केशिकाहरूमा बलियो दागबाट पत्ता लगाउन सकिन्छ, जबकि नियन्त्रण फेज (#1779) र क्लोन #2020 पत्ता लागेन (पूरक चित्र 8)।यसले सुझाव दिन्छ कि यी पेप्टाइड्सले BBB पार गरेर मस्तिष्कमा प्रभाव पार्न योगदान पुर्‍याउँछ।यस परिकल्पनालाई परीक्षण गर्न थप विस्तृत विश्लेषण आवश्यक छ, किनकि BSCFB मार्ग पनि समावेश हुन सक्छ।अन्य चयन गरिएका पेप्टाइडहरूसँग सबैभन्दा समृद्ध क्लोन (#2002) को एमिनो एसिड अनुक्रम तुलना गर्दा, यो नोट गरिएको थियो कि तिनीहरूमध्ये केहीमा समान एमिनो एसिड विस्तारहरू छन्, जसले समान यातायात संयन्त्र (चित्र 3f) लाई संकेत गर्न सक्छ।
यसको अद्वितीय प्लाज्मा प्रोफाइल र समयको साथ CSF मा उल्लेखनीय वृद्धिको कारण, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 लाई लामो 48-घण्टा अवधिमा थप अन्वेषण गरिएको थियो र निरन्तर SA स्तरहरू (चित्र 4a) सँग सम्बन्धित CSF मा तीव्र वृद्धि पुन: उत्पादन गर्न सक्षम थियो।अन्य पहिचान गरिएका फेज क्लोनहरूको सन्दर्भमा, #2077 मस्तिष्क केशिकाहरूका लागि कडा रूपमा दाग भयो र उच्च रिजोल्युसनमा हेर्दा केशिका मार्कर लेक्टिनसँग महत्त्वपूर्ण कोलोकलाइजेशन देखायो र सम्भवतः parenchymal ठाउँमा केही दागहरू (चित्र 4b)।पेप्टाइड-मध्यस्थ औषधीय प्रभावहरू CNS मा प्राप्त गर्न सकिन्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्न, हामीले एउटा प्रयोग प्रदर्शन गर्‍यौं जसमा i) #2077 ट्रान्जिट पेप्टाइड र ii) BACE1 अवरोधक पेप्टाइड SA सँग दुई फरक अनुपातमा मिश्रित गरिएको थियो।एउटा संयोजनको लागि हामीले BACE1 पेप्टाइड अवरोधक मात्र प्रयोग गर्यौं र अर्कोको लागि हामीले BACE1 पेप्टाइड अवरोधकको 1:3 अनुपात #2077 पेप्टाइड प्रयोग गर्यौं।दुबै नमूनाहरू नशाबाट प्रशासित गरिएको थियो र रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड स्तरहरू बीटा-एमाइलाइड पेप्टाइड 40 (Abeta40) समयको साथ मापन गरियो।Abeta40 CSF मा मापन गरिएको थियो किनकि यसले मस्तिष्क parenchyma मा BACE1 अवरोध प्रतिबिम्बित गर्दछ।अपेक्षित रूपमा, दुबै कम्प्लेक्सहरूले Abeta40 (चित्र 4c, d) को रक्त स्तरलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्यो।यद्यपि, पेप्टाइडको मिश्रण भएको नमूनाहरू मात्र नं.2077 र SA मा जोडिएको BACE1 पेप्टाइडको अवरोधले सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (चित्र 4c) मा Abeta40 मा उल्लेखनीय कमी ल्यायो।तथ्यांकले देखाउँछ कि पेप्टाइड नं.2077 ले 60 kDa SA प्रोटिनलाई CNS मा ढुवानी गर्न सक्षम छ र BACE1 पेप्टाइडको SA-conjugated inhibitors सँग फार्माकोलजिकल प्रभावहरू पनि प्रेरित गर्दछ।
(a) CSF पेप्टाइड #2077 (RLSSVDSDLSGC) र कम्तिमा तीन CM-intubated मुसाहरूमा अनइन्जेक्टेड कन्ट्रोल फेज (#1779) को दीर्घकालीन फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइलहरू देखाउँदै T7 फेजको क्लोनल इन्जेक्शन (2 × 10 फेज/जनावर)।(b) फेज-इन्जेक्टेड मुसा (2 × 10 10 फेज/जनावर) मा प्रतिनिधि कॉर्टिकल माइक्रोवेसेलहरूको कन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवि पेप्टाइड #2077 र भाँडाहरू (लेक्टिन) को काउन्टरस्टेनिङ देखाउँदै।यी फेज क्लोनहरू 3 मुसाहरूलाई प्रशासित गरियो र पर्फ्यूजन अघि 1 घण्टाको लागि प्रसारित गर्न अनुमति दिइयो।मस्तिष्कहरू T7 फेज क्याप्सिडको बिरूद्ध पोलीक्लोनल FITC-लेबल गरिएको एन्टिबडीहरूसँग सेक्शन गरिएको र दाग गरिएको थियो।परफ्युजन र त्यसपछिको फिक्सेसनको दस मिनेट अघि, DyLight594-लेबल गरिएको लेक्टिन नशाबाट प्रशासित गरिएको थियो।केशिका र पेरिभास्कुलर ब्रेन टिस्युको लुमेनमा माइक्रोवेसेल्स र फेज (हरियो) को लुमिनल साइडको लेक्टिन स्टेनिङ (रातो) देखाउँदै फ्लोरोसेन्ट छविहरू।स्केल बार 10 µm सँग मेल खान्छ।(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide एक्लै वा biotinylated ट्रान्जिट पेप्टाइड #2077 को संयोजनमा स्ट्रेप्टाभिडिनसँग जोडिएको थियो र त्यसपछि कम्तिमा तीन क्यान्युलेट CM मुसा (10 mg streptavidin/kg) को इन्ट्राभेनस इन्जेक्सनद्वारा जोडिएको थियो।Aβ40 मा BACE1 पेप्टाइड अवरोधक-मध्यस्थता घटाइ Aβ1-40 ELISA द्वारा रगत (रातो) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला) मा संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा मापन गरिएको थियो।राम्रो स्पष्टताको लागि, 100% को स्केलमा ग्राफमा डटेड रेखा कोरिएको छ।(c) 3:1 अनुपातमा ट्रान्जिट पेप्टाइड #2077 र BACE1 निरोधक पेप्टाइडमा स्ट्रेप्टाभिडिन कन्जुगेट गरिएको मुसामा रगत (रातो त्रिकोण) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला त्रिकोण) मा Aβ40 मा प्रतिशत कमी।(d) रगत Aβ40 (रातो सर्कलहरू) र मुसाहरूको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला सर्कलहरू) मा स्ट्रेप्टाभिडिन र BACE1 निरोधक पेप्टाइडसँग मात्र उपचार गरिएको प्रतिशतमा कमी।नियन्त्रणमा Aβ एकाग्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) थियो।
फेज डिस्प्ले बायोमेडिकल अनुसन्धानका धेरै क्षेत्रमा सफलतापूर्वक लागू गरिएको छ।यो विधि vivo vascular diversity study18,19 को लागि प्रयोग गरिएको छ र साथै मस्तिष्क वाहिकाहरू 20,21,22,23,24,25,26 लाई लक्षित गर्ने अध्ययनहरू।यस अध्ययनमा, हामीले यस चयन विधिको प्रयोगलाई मस्तिष्कका भाँडाहरूलाई लक्षित गर्ने पेप्टाइड्सको प्रत्यक्ष पहिचानमा मात्र नभई रक्त-मस्तिष्क अवरोध पार गर्न सक्रिय यातायात गुणहरू भएका उम्मेद्वारहरूको खोजमा पनि विस्तार गर्यौं।हामी अब CM intubated मुसा मा एक invivo चयन प्रक्रिया को विकास को वर्णन र CSF homing गुणहरु संग पेप्टाइड्स पहिचान गर्न को लागी यसको सम्भाव्यता को प्रदर्शन गर्दछ।T7 फेज प्रयोग गरेर 12-मेर अनियमित पेप्टाइडहरूको पुस्तकालय प्रदर्शन गर्दै, हामीले T7 फेज पर्याप्त सानो छ (लगभग 60 एनएम व्यास) 10 रगत-मस्तिष्क अवरोधमा अनुकूलित हुनको लागि प्रदर्शन गर्न सक्षम थियौं, जसले गर्दा सिधै रक्त-मस्तिष्क अवरोध वा choroid पार गर्दछ।हामीले अवलोकन गर्‍यौं कि क्यान्युलेटेड सीएम मुसाहरूबाट CSF कटाई भिभो फंक्शनल स्क्रिनिङ विधिमा राम्रोसँग नियन्त्रित थियो, र निकालिएको फेज भास्कुलेटरमा मात्र बाँधिएको होइन तर रगत-मस्तिष्क अवरोधमा ट्रान्सपोर्टरको रूपमा पनि काम गर्दछ।यसबाहेक, रगत सङ्कलन गरेर र CSF र रगत-व्युत्पन्न फेजहरूमा HTS लागू गरेर, हामीले पुष्टि गर्यौं कि CSF को छनोट राउन्ड राउन्डहरू बीचको विस्तारको लागि रगत संवर्धन वा फिटनेसबाट प्रभावित थिएन।यद्यपि, रगतको डिब्बा चयन प्रक्रियाको एक हिस्सा हो, किनकि CSF डिब्बामा पुग्न सक्षम फेजहरू मस्तिष्कमा आफूलाई समृद्ध बनाउन पर्याप्त समयसम्म रगतको प्रवाहमा बाँच्न र परिसंचरण गर्नुपर्दछ।कच्चा HTS डेटाबाट भरपर्दो अनुक्रम जानकारी निकाल्नको लागि, हामीले विश्लेषण कार्यप्रवाहमा प्लेटफर्म-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटिहरूमा अनुकूलित फिल्टरहरू लागू गर्यौं।स्क्रिनिङ विधिमा काइनेटिक प्यारामिटरहरू समावेश गरेर, हामीले रगतमा जंगली-प्रकार T7 फेजहरू (t½ ~ 28 मिनेट) को द्रुत फार्माकोकाइनेटिक्स पुष्टि गर्‍यौं24, 27, 28 र तिनीहरूको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (t½ ~ 26 मिनेट) प्रति मिनेटमा आधा-जीवन पनि निर्धारण गर्‍यौं।रगत र CSF मा समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइलहरूको बावजुद, CSF मा फेजको रगत एकाग्रताको 0.001% मात्र पत्ता लगाउन सकिन्छ, रगत-मस्तिष्क अवरोधमा जंगली-प्रकार T7 फेजको कम पृष्ठभूमि गतिशीलतालाई संकेत गर्दछ।यो कार्यले vivo प्यानिङ रणनीतिहरूमा प्रयोग गर्दा छनोटको पहिलो राउन्डको महत्त्वलाई हाइलाइट गर्दछ, विशेष गरी फेज प्रणालीहरूको लागि जुन सर्कुलेशनबाट द्रुत रूपमा खाली गरिन्छ, किनकि केही क्लोनहरू CNS कम्पार्टमेन्टमा पुग्न सक्षम हुन्छन्।यसरी, पहिलो राउन्डमा, पुस्तकालय विविधतामा कमी धेरै ठूलो थियो, किनकि यो धेरै कडा CSF मोडेलमा सीमित संख्यामा क्लोनहरू मात्र सङ्कलन गरिएको थियो।यो भिभो प्यानिङ रणनीतिमा धेरै छनोट चरणहरू समावेश थिए जस्तै CSF कम्पार्टमेन्टमा सक्रिय संचय, रगत डिब्बामा क्लोन बाँच्ने, र पहिलो 10 मिनेट भित्र रगतबाट T7 फेज क्लोनहरू द्रुत रूपमा हटाउने (चित्र 1d र पूरक चित्र 4M)।)।यसरी, पहिलो राउन्ड पछि, CSF मा विभिन्न फेज क्लोनहरू पहिचान गरियो, यद्यपि एउटै प्रारम्भिक पूल व्यक्तिगत जनावरहरूको लागि प्रयोग गरिएको थियो।यसले ठूलो संख्यामा पुस्तकालय सदस्यहरूको साथमा स्रोत पुस्तकालयहरूको लागि धेरै कडा छनौट चरणहरूले विविधतामा उल्लेखनीय कमी ल्याउने सुझाव दिन्छ।त्यसकारण, अनियमित घटनाहरू प्रारम्भिक छनोट प्रक्रियाको अभिन्न अंग बन्नेछ, परिणामलाई धेरै प्रभाव पार्छ।यो सम्भव छ कि मूल पुस्तकालयका धेरै क्लोनहरूमा धेरै समान CSF संवर्धन प्रवृत्ति थियो।यद्यपि, एउटै प्रयोगात्मक अवस्थाहरूमा पनि, प्रारम्भिक पूलमा प्रत्येक विशेष क्लोनको सानो संख्याको कारण चयन परिणामहरू फरक हुन सक्छन्।
CSF मा समृद्ध मोटिफहरू रगतमा भएकाहरू भन्दा भिन्न हुन्छन्।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले व्यक्तिगत जनावरहरूको रगतमा ग्लाइसिन-अमीर पेप्टाइडहरू तिर पहिलो परिवर्तन देख्यौं।(चित्र। 1g, पूरक फिग। 4e, 4f)।ग्लाइसिन पेप्टाइड्स भएको फेज अधिक स्थिर हुन सक्छ र संचलनबाट बाहिर निकालिने सम्भावना कम हुन्छ।यद्यपि, यी ग्लाइसिन युक्त पेप्टाइडहरू सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरूमा फेला परेनन्, यसले सुझाव दिन्छ कि क्युरेट गरिएको पुस्तकालयहरूले दुई फरक छनोट चरणहरू पार गरे: एउटा रगतमा र अर्कोलाई सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा जम्मा हुन अनुमति दिइयो।छनोटको चौथो राउन्डको परिणामस्वरूप CSF- समृद्ध क्लोनहरू व्यापक रूपमा परीक्षण गरिएको छ।लगभग सबै व्यक्तिगत रूपमा परीक्षण गरिएका क्लोनहरू खाली नियन्त्रण फेजको तुलनामा CSF मा समृद्ध भएको पुष्टि भयो।एक पेप्टाइड हिट (#2077) थप विवरणमा जाँच गरियो।यसले अन्य हिटहरू (चित्र 3d र पूरक चित्र 7) को तुलनामा लामो प्लाज्मा आधा-जीवन देखाएको छ, र चाखलाग्दो कुरा के छ भने, यो पेप्टाइडले C-टर्मिनसमा सिस्टिन अवशेष समावेश गर्दछ।यो भर्खरै देखाइएको छ कि पेप्टाइडहरूमा सिस्टिन थप्दा अल्बुमिन 29 लाई बन्धन गरेर तिनीहरूको फार्माकोकाइनेटिक गुणहरू सुधार गर्न सकिन्छ।यो हाल पेप्टाइड #2077 को लागि अज्ञात छ र थप अध्ययन आवश्यक छ।केही पेप्टाइड्सले CSF संवर्धन (डेटा देखाइएको छैन) मा भ्यालेन्स-निर्भरता देखायो, जुन T7 क्याप्सिडको प्रदर्शित सतह ज्यामितिसँग सम्बन्धित हुन सक्छ।हामीले प्रयोग गरेको T7 प्रणालीले प्रत्येक पेप्टाइड प्रति फेज कणको 5-15 प्रतिहरू देखायो।IHC उम्मेद्वारको नेतृत्व फेज क्लोनहरूमा मुसाको सेरेब्रल कोर्टेक्स (पूरक चित्र।तथ्याङ्कले कम्तिमा तीनवटा क्लोनहरू (नम्बर २००२, नम्बर २००९ र नम्बर २०७७) ले BBB सँग अन्तरक्रिया गरेको देखाएको छ।यो BBB अन्तरक्रियाले CSF को संचयमा वा यी क्लोनहरूको सीधा BCSFB मा आवागमनको परिणाम हो कि भनेर निर्धारण गर्न बाँकी छ।महत्त्वपूर्ण रूपमा, हामीले देखाउँछौं कि चयन गरिएका पेप्टाइडहरूले तिनीहरूको CSF यातायात क्षमता राख्छ जब संश्लेषित र प्रोटीन कार्गोमा बाध्य हुन्छ।SA मा एन-टर्मिनल बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइडहरू बाइन्डिङले अनिवार्य रूपमा रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (चित्र 3e) मा तिनीहरूको सम्बन्धित फेज क्लोनहरूसँग प्राप्त परिणामहरूलाई दोहोर्याउँछ।अन्तमा, हामी देखाउँछौं कि लेड पेप्टाइड #2077 ले SA मा संयुग्मित BACE1 को बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड अवरोधकको मस्तिष्क कार्यलाई बढावा दिन सक्षम छ, जसले CSF (चित्र 4) मा Abeta40 स्तरहरूलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाएर CNS मा स्पष्ट फार्माकोडाइनामिक प्रभावहरू निम्त्याउँछ।हामीले सबै हिटहरूको पेप्टाइड अनुक्रम होमोलोजी खोज प्रदर्शन गरेर डेटाबेसमा कुनै पनि होमलोगहरू पहिचान गर्न असमर्थ भयौं।यो नोट गर्न महत्त्वपूर्ण छ कि T7 पुस्तकालयको आकार लगभग 109 छ, जबकि 12-mers को लागि सैद्धान्तिक पुस्तकालय आकार 4 x 1015 हो। त्यसैले, हामीले 12-mer पेप्टाइड पुस्तकालयको विविधता स्पेसको सानो अंश मात्र चयन गर्यौं, जसको मतलब यो हुन सक्छ कि अधिक अनुकूलित स्पेस पेप्टाइड्स द्वारा पहिचान गर्न सकिन्छ।काल्पनिक रूपमा, हामीले यी पेप्टाइडहरूको कुनै पनि प्राकृतिक समरूपहरू फेला पार्न नसक्नुको एउटा कारण मस्तिष्कमा निश्चित पेप्टाइड मोटिफहरूको अनियन्त्रित प्रवेशलाई रोक्नको लागि विकासको क्रममा अचयन हुन सक्छ।
सँगै लिएर, हाम्रा नतिजाहरूले भिवोमा सेरेब्रोभास्कुलर बाधाको यातायात प्रणालीहरू पहिचान गर्न र थप विस्तारमा पहिचान गर्न भविष्यको कामको लागि आधार प्रदान गर्दछ।यस विधिको आधारभूत सेटअप कार्यात्मक चयन रणनीतिमा आधारित छ जसले सेरेब्रल भास्कुलर बाइन्डिङ गुणहरू भएका क्लोनहरू मात्र पहिचान गर्दैन, तर यसमा सफल क्लोनहरूले सीएनएस डिब्बामा भिभोमा जैविक अवरोधहरू पार गर्न आन्तरिक गतिविधिहरू समावेश गर्दछ।यी पेप्टाइडहरूको ढुवानीको संयन्त्र र मस्तिष्क क्षेत्रको लागि विशिष्ट माइक्रोभास्कुलचरमा बाँध्न तिनीहरूको प्राथमिकतालाई स्पष्ट पार्नु हो।यसले BBB र रिसेप्टरहरूको यातायातको लागि नयाँ मार्गहरू पत्ता लगाउन सक्छ।हामी आशा गर्छौं कि पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू सीधा सेरेब्रोभास्कुलर रिसेप्टरहरूमा वा BBB वा BCSFB मार्फत ढुवानी गरिएका लिगान्डहरूमा बाँध्न सक्छन्।यस कार्यमा फेला परेको CSF यातायात गतिविधिसँग पेप्टाइड भेक्टरहरू थप अनुसन्धान गरिनेछ।हामी हाल यी पेप्टाइड्सको BBB र/वा BCSFB पार गर्ने क्षमताको लागि मस्तिष्क विशिष्टताको अनुसन्धान गर्दैछौं।यी नयाँ पेप्टाइडहरू नयाँ रिसेप्टरहरू वा मार्गहरूको सम्भावित खोजको लागि र मस्तिष्कमा जीवविज्ञान जस्ता म्याक्रोमोलेक्युलहरूको डेलिभरीको लागि नयाँ अत्यधिक कुशल प्लेटफर्महरूको विकासको लागि अत्यन्त मूल्यवान उपकरणहरू हुनेछन्।
पहिले वर्णन गरिएको विधिको परिमार्जन प्रयोग गरेर ठूलो सिस्टरना (CM) क्यानुलेट गर्नुहोस्।एनेस्थेटाइज्ड विस्टार मुसा (200-350 ग्राम) लाई स्टेरियोटेक्सिक उपकरणमा माउन्ट गरिएको थियो र खोपडीलाई पर्दाफास गर्न कपाल र एसेप्टली रूपमा तयार गरिएको टाउकोमा मध्य चीरा बनाइएको थियो।माथिल्लो स्याशको क्षेत्रमा दुईवटा प्वालहरू ड्रिल गर्नुहोस् र प्वालहरूमा फिक्सिङ स्क्रूहरू जोड्नुहोस्।CM मा स्टेनलेस स्टील क्यानुलाको स्टेरियोट्याक्टिक मार्गदर्शनको लागि पार्श्व ओसिपिटल क्रेस्टमा अतिरिक्त प्वाल ड्रिल गरिएको थियो।क्यान्युला वरिपरि दन्त सिमेन्ट लागू गर्नुहोस् र स्क्रूसँग सुरक्षित गर्नुहोस्।फोटो-क्युरिङ र सिमेन्ट कडा भएपछि, छालाको घाउलाई 4/0 सुप्रामिड सिवनले बन्द गरिएको थियो।क्यानुलाको उचित स्थानमा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) को सहज रिसाव द्वारा पुष्टि हुन्छ।स्टेरियोटेक्सिक उपकरणबाट मुसालाई हटाउनुहोस्, उपयुक्त पोस्टपोरेटिभ हेरचाह र दुखाइ व्यवस्थापन प्राप्त गर्नुहोस्, र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा रगतका लक्षणहरू नदेखिएसम्म यसलाई कम्तिमा एक हप्तासम्म निको हुन दिनुहोस्।Wistar मुसा (Crl:WI/Han) चार्ल्स नदी (फ्रान्स) बाट प्राप्त गरिएको थियो।सबै मुसाहरू विशिष्ट रोगजनक-मुक्त अवस्थाहरूमा राखिएका थिए।सबै पशु प्रयोगहरू स्विट्जरल्याण्डको बासेल शहरको भेटेरिनरी कार्यालयद्वारा अनुमोदित भएका थिए र पशु लाइसेन्स नम्बर 2474 (सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र मुसाको मस्तिष्कमा चिकित्सकीय उम्मेदवारहरूको स्तर मापन गरेर सक्रिय मस्तिष्क यातायातको मूल्याङ्कन) अनुसार गरिएको थियो।
सीएम क्यानुला हातमा लिएर बिस्तारै मुसालाई सचेत राख्नुहोस्।क्यान्युलाबाट Datura हटाउनुहोस् र 10 μl सहज रूपमा बग्ने सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड सङ्कलन गर्नुहोस्।क्यानुलाको पेटेन्सी अन्ततः सम्झौता भएको हुनाले, रगत प्रदूषण वा विकृतिको कुनै प्रमाण नभएको स्पष्ट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरू मात्र यस अध्ययनमा समावेश गरिएको थियो।समानान्तरमा, लगभग 10-20 μl रगत पुच्छरको टुप्पोमा रहेको सानो चीराबाट हेपरिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) भएको ट्यूबमा लिइयो।CSF र रगत विभिन्न समय बिन्दुहरूमा T7 फेजको इन्ट्राभेनस इन्जेक्सन पछि संकलन गरिएको थियो।प्रत्येक CSF नमूना सङ्कलन गर्नु अघि लगभग 5-10 μl तरल पदार्थ खारेज गरिएको थियो, जुन क्याथेटरको मृत मात्रासँग मेल खान्छ।
पुस्तकालयहरू T7Select 10-3b भेक्टर प्रयोग गरेर T7Select प्रणाली म्यानुअल (नोभागेन, रोजेनबर्ग एट अल।, Innovations 6, 1-6, 1996) मा वर्णन गरिए अनुसार उत्पन्न गरिएको थियो।संक्षेपमा, एक अनियमित 12-मेर डीएनए सम्मिलित निम्न ढाँचामा संश्लेषित गरिएको थियो:
NNK कोडन सम्मिलितमा डबल स्टप कोडन र एमिनो एसिड ओभरएक्सप्रेसनबाट बच्न प्रयोग गरिएको थियो।N प्रत्येक न्यूक्लियोटाइडको म्यानुअल रूपमा मिश्रित समानुपातिक अनुपात हो, र K एडिनाइन र साइटोसिन न्यूक्लियोटाइडहरूको म्यानुअल रूपमा मिश्रित इक्विमोलर अनुपात हो।एकल स्ट्रेन्डेड क्षेत्रहरूलाई dNTP (Novagen) र Klenow बफर (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) मा 37 डिग्री सेल्सियसमा 3 घण्टाको लागि थप इन्क्युबेशनद्वारा डबल स्ट्र्यान्डेड डीएनएमा रूपान्तरण गरियो।प्रतिक्रिया पछि, EtOH वर्षाद्वारा डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनए बरामद गरियो।परिणामस्वरूप DNA प्रतिबन्ध इन्जाइमहरू EcoRI र HindIII (दुबै रोचेबाट) द्वारा पचाइएको थियो।क्लीभ्ड र प्युरिफाइड (QIAquick, Qiagen) इन्सर्ट (T4 ligase, New England Biolabs) लाई 10B क्याप्सिड जीनको एमिनो एसिड 348 पछि प्रि-क्लीभ T7 भेक्टरमा इन-फ्रेममा लगाइयो।लिगेसन प्रतिक्रियाहरू इन भिट्रो प्याकेजिङ अघि 18 घण्टाको लागि 16 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड थिए।भिट्रोमा फेज प्याकेजिङ्ग T7Select 10-3b क्लोनिङ किट (Novagen) सँग आपूर्ति गरिएका निर्देशनहरू अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो र प्याकेजिङ्ग समाधानलाई Escherichia coli (BLT5615, Novagen) प्रयोग गरेर लिसिसमा एक पटक विस्तार गरिएको थियो।लाइसेट्सलाई ग्लिसरोलको स्टक समाधानको रूपमा सेन्ट्रीफ्युज गरिएको, टाइट्रेटेड र -80 डिग्री सेल्सियसमा फ्रिज गरिएको थियो।
प्रोप्राइटरी 454/Roche-amplicon फ्यूजन प्राइमरहरू प्रयोग गरेर ब्रोथ वा प्लेटमा विस्तारित फेज चर क्षेत्रहरूको प्रत्यक्ष PCR प्रवर्धन।फर्वार्ड फ्युजन प्राइमरले चर क्षेत्र (NNK) 12 (टेम्प्लेट-विशिष्ट), GS FLX टाइटेनियम एडाप्टर A, र चार-बेस लाइब्रेरी कुञ्जी अनुक्रम (TCAG) (पूरक चित्र 1a) लाई जोड्ने क्रमहरू समावेश गर्दछ:
रिभर्स फ्युजन प्राइमरमा क्याप्चर बीडसँग जोडिएको बायोटिन र इमल्शन PCR को समयमा क्लोनल एम्प्लीफिकेशनको लागि आवश्यक GS FLX टाइटेनियम एडाप्टर बी पनि समावेश छ:
त्यसपछि 454 GS-FLX टाइटेनियम प्रोटोकल अनुसार amplicons 454/Roche pyrosequencing को अधीनमा थिए।म्यानुअल सेङ्गर सिक्वेन्सिङका लागि (एप्लाइड बायोसिस्टम हिटाची 3730 xl DNA विश्लेषक), T7 फेज DNA PCR द्वारा एम्प्लीफाइड गरिएको थियो र निम्न प्राइमर जोडीहरूसँग क्रमबद्ध गरिएको थियो:
रोचे फास्ट स्टार्ट डीएनए पोलिमरेज किट (निर्माताको निर्देशन अनुसार) को प्रयोग गरेर व्यक्तिगत फलकहरूबाट सम्मिलितहरू PCR प्रवर्धनको अधीनमा थिए।तातो सुरुवात गर्नुहोस् (९५ डिग्री सेल्सियसमा १० मिनेट) र ३५ बूस्ट साइकलहरू (९५ डिग्री सेल्सियसमा ५० सेकेन्ड, ५० डिग्री सेल्सियसमा १ मिनेट र ७२ डिग्री सेल्सियसमा १ मिनेट)।
पुस्तकालयहरूबाट फेज, जंगली प्रकारको फेज, CSF र रगतबाट उद्धार गरिएको फेज, वा व्यक्तिगत क्लोनहरू Escherichia coli BL5615 मा TB ब्रोथ (Sigma Aldrich) मा वा 500 cm2 भाँडाहरूमा (थर्मो साइन्टिफिक) 4 घन्टाको लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा विस्तार गरिएको थियो।प्लेटहरू ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लुका एनालिटिकल) को साथ कुल्ला गरेर वा बाँझ पिपेट टिपहरूसँग प्लेकहरू सङ्कलन गरेर प्लेटहरूबाट फेज निकालिएको थियो।फेजलाई कल्चर सुपरनेटान्ट वा एक्स्ट्र्याक्शन बफरबाट एक राउण्ड पोलिथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी ८०००) वर्षा (प्रोमेगा) बाट अलग गरिएको थियो र ट्रिस-ईडीटीए बफरमा पुन: निलम्बन गरिएको थियो।
एम्प्लीफाइड फेजलाई इन्ट्राभेनस (IV) इन्जेक्सन (५०० μl/जनावर) अघि एन्डोटक्सिन हटाउने मोती (Miltenyi Biotec) को प्रयोग गरेर एन्डोटक्सिन हटाउने 2-3 राउन्डको अधीनमा थियो।पहिलो राउन्डमा, २×१०१२ फेजहरू प्रस्तुत गरिएको थियो;दोस्रोमा, 2×1010 फेजहरू;तेस्रो र चौथो छनोट राउन्डमा, प्रति जनावर 2×109 फेजहरू।CSF मा फेज सामग्री र संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन रगत नमूनाहरू निर्माताको निर्देशन (T7 चयन प्रणाली म्यानुअल) अनुसार प्लेक गणना द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।फाज चक्बनको पुच्छर शिरामा शुद्ध शिरामा शुद्ध पदमा शुद्ध शिराबाट शुद्ध शिराबाट शुद्ध शिशर वा फेजरको फसलहरू, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट, min0 मिनेट क्रमशः CSF र रगतका नमूनाहरू प्रदर्शन गरियो।इन भिभो प्यानिङका कुल चार राउन्डहरू सञ्चालन गरिएका थिए जसमा दुई चयन गरिएका शाखाहरूलाई छुट्टाछुट्टै भण्डारण गरिएको थियो र चयनको पहिलो तीन राउन्डहरूमा विश्लेषण गरिएको थियो।चयनको पहिलो दुई राउन्डबाट CSF बाट निकालिएका सबै फेज इन्सर्टहरू 454/Roche pyrosequencing को अधीनमा थिए, जबकि चयनको अन्तिम दुई राउन्डबाट CSF बाट निकालिएका सबै क्लोनहरू म्यानुअल रूपमा क्रमबद्ध थिए।छनोटको पहिलो राउन्डका सबै रगत फेजहरू पनि 454/Roche pyrosequencing को अधीनमा थिए।फेज क्लोनहरूको इंजेक्शनको लागि, चयन गरिएका फेजहरूलाई E. coli (BL5615) मा 500 cm2 प्लेटहरूमा 4 घण्टाको लागि 37°C मा एम्प्लीफाइड गरियो।व्यक्तिगत रूपमा चयन गरिएको र म्यानुअल रूपमा क्रमबद्ध क्लोनहरू TB माध्यममा प्रचार गरिएको थियो।फेज निकासी पछि, एन्डोटोक्सिनको शुद्धीकरण र हटाउने (माथि वर्णन गरिए अनुसार), 300 μl मा 2×1010 फेज/जनावरलाई एउटा पुच्छर नसमा इन्जेक्सन गरिएको थियो।
अनुक्रम डेटाको पूर्व-प्रशोधन र गुणात्मक फिल्टरिङ।कच्चा 454/Roche डाटा विक्रेता सफ्टवेयर प्रयोग गरेर बाइनरी मानक स्ट्रिम नक्सा ढाँचा (sff) बाट Pearson मानव पढ्न योग्य ढाँचा (fasta) मा रूपान्तरण गरियो।न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमको थप प्रशोधन स्वामित्व सी प्रोग्रामहरू र स्क्रिप्टहरू (अप्रकाशित सफ्टवेयर प्याकेज) प्रयोग गरी तल वर्णन गरिएको रूपमा प्रदर्शन गरिएको थियो।प्राथमिक डेटाको विश्लेषणले कडा बहु-चरण फिल्टरिङ प्रक्रियाहरू समावेश गर्दछ।फिल्टर फिल्टर गर्न कि एक मान्य 12ME सम्मिलित डीएनए अनुक्रम सम्मिलित गरिएको छ, यो पाठहरू लेबल सुरू गर्न लेबल रूपमा प igned ्क्तिबद्ध गरिएको छ (CCTGCAGCGATCGCGTCGCGCGCGCGCGपङ्क्तिबद्धता प्रति पङ्क्तिबद्ध 2 असंगतिहरूलाई अनुमति दिँदै31।तसर्थ, स्टार्ट र स्टप ट्यागहरू बिना पढ्ने र ब्याकग्राउन्ड इन्सर्टहरू समावेश गरिएका पढाइहरू, जस्तै, मिल्दोजुल्दो संख्याको अनुमत संख्या भन्दा बढी पङ्क्तिबद्धताहरू, पुस्तकालयबाट हटाइयो।बाँकी पढाइहरूको लागि, N-mer DNA अनुक्रम स्टार्ट मार्कबाट विस्तार हुन्छ र स्टप मार्क अघि समाप्त हुन्छ मूल पढ्ने अनुक्रमबाट एक्साइज गरिएको थियो र थप प्रशोधन गरिएको थियो (यसपछि "इन्सर्ट" भनिन्छ)।सम्मिलितको अनुवाद पछि, प्राइमरको 5′ छेउमा रहेको पहिलो स्टप कोडन पछिको भाग सम्मिलितबाट हटाइन्छ।थप रूपमा, प्राइमरको 3′ छेउमा अपूर्ण कोडनहरू निम्त्याउने न्यूक्लियोटाइडहरू पनि हटाइयो।केवल पृष्ठभूमि अनुक्रमहरू समावेश गर्ने सम्मिलितहरू बहिष्कार गर्न, एमिनो एसिड ढाँचा "PAG" बाट सुरु हुने अनुवादित घुसाइहरू पनि हटाइयो।पुस्तकालयबाट ३ भन्दा कम एमिनो एसिडको पोस्ट-अनुवाद लम्बाइ भएका पेप्टाइडहरू हटाइयो।अन्तमा, इन्सर्ट पूलमा रिडन्डन्सी हटाउनुहोस् र प्रत्येक अनौठो इन्सर्टको फ्रिक्वेन्सी निर्धारण गर्नुहोस्।यस विश्लेषणको नतिजाहरूमा न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमहरू (इन्सर्टहरू) र तिनीहरूको (पढ्ने) फ्रिक्वेन्सीहरू (पूरक चित्रहरू 1c र 2) को सूची समावेश थियो।
अनुक्रम समानताद्वारा समूह N-mer DNA सम्मिलितहरू: 454/Roche-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटिहरू हटाउन (जस्तै homopolymer विस्तारहरूको अनुक्रममा समस्याहरू) र कम महत्त्वपूर्ण रिडन्डन्सीहरू हटाउन, पहिले फिल्टर गरिएको N-mer DNA अनुक्रम सम्मिलितहरू (इन्सर्टहरू) समानताद्वारा क्रमबद्ध छन्।पुनरावृत्ति एल्गोरिथ्म प्रयोग गरी सम्मिलितहरू (2 नमिल्ने आधारहरूलाई अनुमति दिइएको) निम्न रूपमा परिभाषित गरिएको छ: प्रविष्टिहरू पहिले तिनीहरूको फ्रिक्वेन्सी (उच्चतमदेखि न्यून) द्वारा क्रमबद्ध हुन्छन्, र यदि तिनीहरू समान छन् भने, तिनीहरूको माध्यमिक क्रमबद्ध लम्बाइ (सबैभन्दा लामो देखि छोटो) द्वारा।यसरी, सबैभन्दा बारम्बार र सबैभन्दा लामो सम्मिलनहरूले पहिलो "समूह" परिभाषित गर्दछ।समूह आवृत्ति कुञ्जी आवृत्तिमा सेट गरिएको छ।त्यसपछि, क्रमबद्ध सूचीमा बाँकी रहेका प्रत्येक सम्मिलनलाई निडलम्यान-वन्स्च पङ्क्तिबद्धताद्वारा समूहमा थप्ने प्रयास गरियो।यदि एक पङ्क्तिबद्धतामा बेमेल, सम्मिलितहरू, वा मेटाउनेहरूको संख्या 2 को थ्रेसहोल्ड भन्दा बढी छैन भने, सम्मिलन समूहमा थपिएको छ, र समग्र समूह फ्रिक्वेन्सी कति पटक सम्मिलन थपिएको थियो द्वारा बढाइन्छ।समूहमा थपिएका सम्मिलितहरूलाई प्रयोगको रूपमा चिन्ह लगाइन्छ र थप प्रशोधनबाट बहिष्कृत गरिन्छ।यदि सम्मिलित अनुक्रम पहिले नै अवस्थित समूहमा थप्न सकिँदैन भने, सम्मिलित अनुक्रम उपयुक्त सम्मिलित आवृत्तिको साथ नयाँ समूह सिर्जना गर्न प्रयोग गरिन्छ र प्रयोग गरिएको रूपमा चिन्ह लगाइन्छ।पुनरावृत्ति समाप्त हुन्छ जब प्रत्येक प्रविष्टि अनुक्रम या त नयाँ समूह बनाउन प्रयोग गरिएको छ वा पहिले नै अवस्थित समूहमा समावेश गर्न सकिन्छ।आखिर, न्यूक्लियोटाइडहरू समावेश समूहबद्ध इन्सर्टहरू अन्ततः पेप्टाइड अनुक्रमहरू (पेप्टाइड पुस्तकालयहरू) मा अनुवाद गरिन्छ।यस विश्लेषणको नतिजा सम्मिलितहरूको सेट र तिनीहरूको संगत फ्रिक्वेन्सीहरू हो जसले लगातार पठनहरूको संख्या बनाउँछ (पूरक चित्र। 2)।
मोटिफ जेनेरेसन: अद्वितीय पेप्टाइडहरूको सूचीमा आधारित, तल देखाइए अनुसार सबै सम्भावित एमिनो एसिड ढाँचाहरू (एए) समावेश गरी एउटा पुस्तकालय सिर्जना गरिएको थियो।लम्बाइ 3 को प्रत्येक सम्भावित ढाँचा पेप्टाइडबाट निकालिएको थियो र यसको उल्टो ढाँचा सबै ढाँचाहरू (ट्रिपेप्टाइड्स) समावेश भएको साझा आकृति पुस्तकालयको साथ थपिएको थियो।अत्यधिक दोहोरिने आकृतिहरूको पुस्तकालयहरू क्रमबद्ध गरियो र अनावश्यकता हटाइयो।त्यसपछि, मोटिफ लाइब्रेरीमा प्रत्येक ट्रिपेप्टाइडको लागि, हामीले कम्प्युटेसनल उपकरणहरू प्रयोग गरेर पुस्तकालयमा यसको उपस्थिति जाँच गर्यौं।यस अवस्थामा, फेला परेको मोटिफ ट्राइपेप्टाइड भएको पेप्टाइडको फ्रिक्वेन्सी थपिएको छ र मोटिफ लाइब्रेरीमा मोटिफमा तोकिएको छ ("मोटिफहरूको संख्या")।मोटिफ जेनेरेशनको नतिजा भनेको ट्रिपेप्टाइड्स (मोटिफ्स) को सबै घटनाहरू र तिनीहरूका सम्बन्धित मानहरू समावेश गर्ने दुई-आयामी एरे हो, जुन अनुक्रमणिका पढाइहरूको संख्या हो जसले गर्दा रिडहरू फिल्टर, समूहबद्ध र अनुवादित हुँदा सम्बन्धित मोटिफमा परिणाम हुन्छ।माथिको विवरणमा वर्णन गरिए अनुसार मेट्रिक्स।
मोटिफ्स र सम्बन्धित स्क्याटरप्लटहरूको संख्याको सामान्यीकरण: प्रत्येक नमूनाको लागि मोटिफहरूको संख्या प्रयोग गरेर सामान्य गरिएको थियो।
जहाँ ni विषय समावेश भएको पढ्ने संख्या हो।यसरी, vi ले नमूनामा motif i समावेश गरी पढ्ने (वा पेप्टाइड्स) को प्रतिशत आवृत्ति प्रतिनिधित्व गर्दछ।मोटिफहरूको गैर-सामान्यीकृत संख्याका लागि P-मानहरू फिशरको सटीक परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।मोटिभको संख्याको सहरेलोग्रामको सन्दर्भमा, स्पियरम्यानको सहसम्बन्धहरू आरसँग सामान्यीकृत संख्याको उद्देश्य प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।
पेप्टाइड लाइब्रेरीमा प्रत्येक स्थानमा एमिनो एसिडको सामग्री कल्पना गर्न, वेब लोगोग्राम 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) सिर्जना गरिएको थियो।पहिलो, 12-मेर पेप्टाइडको प्रत्येक स्थानमा एमिनो एसिडको सामग्री 20 × 12 म्याट्रिक्समा भण्डार गरिएको छ।त्यसपछि, प्रत्येक स्थानमा समान सापेक्ष एमिनो एसिड सामग्री भएको 1000 पेप्टाइडहरूको सेट फास्टा-क्रम ढाँचामा उत्पन्न हुन्छ र वेब-लोगो 3 मा इनपुटको रूपमा प्रदान गरिन्छ, जसले प्रत्येक स्थितिमा सापेक्षिक एमिनो एसिड सामग्रीको ग्राफिकल प्रतिनिधित्व उत्पन्न गर्दछ।दिइएको पेप्टाइड पुस्तकालयको लागि।बहुआयामिक डेटासेटहरू कल्पना गर्नको लागि, तातो नक्साहरू R मा आन्तरिक रूपमा विकसित उपकरण प्रयोग गरेर सिर्जना गरिएको थियो (बायोसहीटम्याप, अझै जारी हुन-आउने-आर प्याकेज)।तातो नक्सामा प्रस्तुत डेन्ड्रोग्रामहरू वार्डको पदानुक्रमिक क्लस्टरिङ विधि प्रयोग गरेर इक्लिडियन दूरी मेट्रिकको साथ गणना गरिएको थियो।मोटिफ स्कोरिङ डेटाको सांख्यिकीय विश्लेषणको लागि, फिशरको सटीक परीक्षण प्रयोग गरेर असामान्य स्कोरिङका लागि P मानहरू गणना गरियो।विद्यार्थीको टी-टेस्ट वा ANOVA प्रयोग गरेर अन्य डेटासेटहरूको P-मानहरू R मा गणना गरियो।
चयन गरिएका फेज क्लोनहरू र सम्मिलितहरू बिना फेजहरू पुच्छर नस (२×१०१० फेज/३०० μl PBS मा जनावर) मार्फत इन्जेक्सन गरिएको थियो।पर्फ्युजन र त्यसपछिको फिक्सेसनको दस मिनेट अघि, उही जनावरहरूलाई 100 μl DyLight594-लेबल गरिएको लेक्टिन (भेक्टर ल्याबोरेटरीज इंक, DL-1177) को साथ इन्जेक्सन गरिएको थियो।फेज इन्जेक्सन पछि 60 मिनेट पछि, मुसाहरूलाई 50 एमएल पीबीएस र 50 एमएल 4% पीएफए/पीबीएसको साथ हृदयमा परफ्युज गरियो।मस्तिष्क नमूनाहरू थप रूपमा 4% पीएफए/पीबीएसमा रातभर फिक्स गरियो र 4 डिग्री सेल्सियसमा 30% सुक्रोजमा रातभर भिजाइयो।नमूनाहरू OCT मिश्रणमा फ्ल्यास जम्मा हुन्छन्।जमेको नमूनाहरूको इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण कोठाको तापक्रममा 30 µm क्रायोसेक्शनहरूमा 1% BSA को साथ अवरुद्ध गरिएको थियो र T7 फेज (Novus NB 600-376A) विरुद्ध 4 °C मा पोलिक्लोनल FITC-लेबल गरिएको एन्टिबडीहरूसँग इन्क्युटेड गरिएको थियो।रातभर इन्क्युबेशन गर्नुहोस्।अन्तमा, खण्डहरू 3 पटक पीबीएससँग धोइयो र कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) द्वारा जाँच गरियो।
98% को न्यूनतम शुद्धता संग सबै पेप्टाइड्स जेनस्क्रिप्ट संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा संश्लेषित गरिएको थियो, बायोटिनाइलेटेड र lyophilized।बायोटिन एन-टर्मिनसमा अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसर मार्फत बाँधिएको छ।मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोग गरेर सबै पेप्टाइडहरू जाँच गर्नुहोस्।
स्ट्रेप्टाभिडिन (सिग्मा S0677) लाई बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनाइलेटेड BACE1 निरोधक पेप्टाइड, वा बायोटिनाइलेटेड BACE1 निरोधक पेप्टाइड र BACE1 अवरोधक पेप्टाइडमा 5-गुणा समानुपातिक अतिरिक्तको साथ मिश्रित थियो।इन्जेक्सन अघि 1 घण्टा कोठाको तापमानमा।Streptavidin-conjugated peptides 10 mg/kg को एक खुराक मा एक मस्तिष्क गुहा भएको मुसाको पुच्छर नसाहरु मध्ये एक मा नशामा इंजेक्शन गरियो।
स्ट्रेप्टाभिडिन-पेप्टाइड परिसरहरूको एकाग्रता एलिसा द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।Nunc Maxisorp microtiter प्लेटहरू (Sigma) 1.5 μg/ml माउस एन्टि-स्ट्रेप्टाभिडिन एन्टिबडी (थर्मो, MA1-20011) को साथ 4°C मा रातभर लेपित गरियो।ब्लक गरिसकेपछि (ब्लकिङ बफर: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% BSA) कोठाको तापक्रममा २ घन्टासम्म, प्लेटलाई ०.०५% Tween-20/PBS (वाश बफर) ले धुनुहोस् र सेकेन्डमा ब्लकिङ ब्लकमा 3 सेकेन्ड ब्लकहरू थपिएको थियो। लस्मा 1:10,000, CSF 1:115)।त्यसपछि प्लेटलाई डिटेक्शन एन्टिबडी (१ μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) को साथ 4°C मा रातभर इन्क्युबेटेड गरियो।तीनवटा धुने चरणहरू पछि, स्ट्रेप्टाभिडिनलाई TMB सब्सट्रेट समाधान (रोचे) मा २० मिनेटसम्म इन्क्युबेशनद्वारा पत्ता लगाइयो।1M H2SO4 संग रंग विकास रोके पछि, 450 nm मा अवशोषण मापन गर्नुहोस्।
streptavidin-peptide-BACE1 अवरोधक जटिलको प्रकार्य Aβ(1-40) ELISA द्वारा निर्माताको प्रोटोकल (वाको, 294-64701) अनुसार मूल्याङ्कन गरिएको थियो।छोटकरीमा, CSF नमूनाहरू मानक diluent (1:23) मा पातलो गरियो र BNT77 क्याप्चर एन्टिबडीको साथ लेपित 96-वेल प्लेटहरूमा 4°C मा रातभर इन्क्युबेटेड गरियो।पाँचवटा धुने चरणहरू पछि, HRP-कन्जुगेटेड BA27 एन्टिबडी थपियो र 4 डिग्री सेल्सियसमा 2 घण्टासम्म इन्क्युबेटेड गरियो, त्यसपछि पाँचवटा धुने चरणहरू।Aβ(1–40) कोठाको तापक्रममा 30 मिनेटको लागि TMB समाधानमा इन्क्युबेशनद्वारा पत्ता लगाइएको थियो।स्टप समाधानको साथ रङको विकास रोकिएपछि, 450 एनएममा अवशोषण मापन गर्नुहोस्।प्लाज्मा नमूनाहरू Aβ(1–40) ELISA अघि ठोस चरण निकासीको अधीनमा थिए।प्लाज्मा 0.2% DEA (सिग्मा) मा 96-वेल प्लेटहरूमा थपियो र 30 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेटेड गरियो।SPE प्लेटहरू (Oasis, 186000679) लाई पानी र 100% मिथानोलले क्रमशः धोएपछि, SPE प्लेटहरूमा प्लाज्मा नमूनाहरू थपियो र सबै तरल पदार्थ हटाइयो।नमूनाहरू धोइयो (पहिले 5% मिथेनोलको साथ त्यसपछि 30% मिथानोल) र 2% NH4OH/90% मिथानोलको साथ एल्युट गरियो।स्थिर N2 वर्तमानमा 99 मिनेटको लागि 55°C मा इल्युएट सुकाइसकेपछि, नमूनाहरू मानक डाइल्युन्टहरूमा घटाइयो र Aβ(1–40) माथि वर्णन गरिए अनुसार मापन गरियो।
यो लेख कसरी उद्धृत गर्ने: Urich, E. et al।Vivo मा पहिचान गरिएको ट्रान्जिट पेप्टाइड्स प्रयोग गरेर मस्तिष्कमा कार्गो डेलिभरी।विज्ञान।५, १४१०४;doi:10.1038/srep14104 (2015)।
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB र Moos T. लक्षित थेरापी प्रयोग गरेर मस्तिष्कमा म्याक्रोमोलेक्युलर ड्रग्सको डेलिभरी।जर्नल अफ न्यूरोकेमिस्ट्री 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., र Martinez-Martinez, P. रक्त-मस्तिष्क अवरोध पार पेप्टाइड र प्रोटीन ड्रग्स को वितरण।Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
Pardridge, WM रक्त-मस्तिष्क अवरोध: मस्तिष्क औषधि विकास मा एक बाधा।NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)।
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, र Byrd, A. सुधारिएको औषधि वितरण र कोरोइड प्लेक्सस-CSF मार्ग मार्फत मस्तिष्कमा लक्षित गर्ने सम्भावनाहरू।औषधि अनुसन्धान 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
Pardridge, WM मस्तिष्क वितरणको लागि आणविक ट्रोजन घोडाहरूसँग बायोफार्मास्युटिकल्सको आधुनिकीकरण।Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
Pardridge, WM रिसेप्टर-मध्यस्थता पेप्टाइड रक्त-मस्तिष्क अवरोध पार।Endocr Rev. 7, 314-330 (1986)।
Niewoehner, J. et al।मोनोभ्यालेन्ट आणविक शटलहरू प्रयोग गरेर चिकित्सीय एन्टिबडीहरूको मस्तिष्क प्रवेश र प्रभावकारिता बढाउनुहोस्।न्यूरोन 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
बिएन-ली, एन एट अल।ट्रान्सफरिन रिसेप्टर (TfR) यातायातले TfR एन्टिबडीहरूको आत्मीयता भेरियन्टहरूको मस्तिष्क अपटेक निर्धारण गर्दछ।J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।