Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईं सीमित CSS समर्थन भएको ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)। यसको अतिरिक्त, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
एकै पटकमा तीन स्लाइडहरूको क्यारोसेल प्रदर्शन गर्दछ। एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्न अघिल्लो र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्न अन्त्यमा स्लाइडर बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।
स्व-एकत्रित तंत्रिका अर्गानेल्सले मानव विकास र रोगको मोडेलिङको लागि एक आशाजनक इन भिट्रो प्लेटफर्मको प्रतिनिधित्व गर्दछ। यद्यपि, अर्गानोइडहरूमा भिभोमा अवस्थित कनेक्टिविटीको अभाव छ, जसले परिपक्वतालाई सीमित गर्दछ र व्यवहार नियन्त्रण गर्ने अन्य सर्किटहरूसँग एकीकरणलाई रोक्छ। यहाँ हामी देखाउँछौं कि नवजात नग्न मुसाको सोमाटोसेन्सरी कोर्टेक्समा प्रत्यारोपित मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोर्टिकल अर्गानोइडहरूले परिपक्व कोशिका प्रकारहरू विकास गर्छन् जुन संवेदी र प्रेरणा-सम्बन्धित सर्किटहरूमा एकीकृत हुन्छन्। एमआरआईले धेरै स्टेम सेल लाइनहरू र जनावरहरूमा प्रत्यारोपण पछिको अर्गानोइड वृद्धि प्रकट गर्‍यो, जबकि एकल-कोर विश्लेषणले कोर्टिकोजेनेसिसको प्रगति र गतिविधि-निर्भर ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्रमको उदय प्रकट गर्‍यो। वास्तवमा, प्रत्यारोपित कोर्टिकल न्यूरोनहरूले तिनीहरूको इन भिट्रो समकक्षहरू भन्दा बढी जटिल रूपात्मक, सिन्याप्टिक, र आन्तरिक झिल्ली गुणहरू प्रदर्शन गर्दछ, जसले टिमोथी सिन्ड्रोम भएका बिरामीहरूमा न्यूरोनल दोषहरू पत्ता लगाउन अनुमति दिन्छ। शारीरिक र कार्यात्मक ट्रेसिङले देखाएको छ कि प्रत्यारोपित अर्गानोइडहरूले थालमोकोर्टिकल र कोर्टिकोकोर्टिकल इनपुटहरू प्राप्त गर्छन्, र तंत्रिका गतिविधिको भिभो रेकर्डिङहरूले सुझाव दिन्छ कि यी इनपुटहरूले मानव कोशिकाहरूमा संवेदी प्रतिक्रियाहरू उत्पन्न गर्न सक्छन्। अन्तमा, कोर्टिकल अर्गानोइडहरूले मुसाको मस्तिष्कभरि एक्सनहरू विस्तार गर्छन्, र तिनीहरूको अप्टोजेनेटिक सक्रियताले इनाम खोज्ने व्यवहार निम्त्याउँछ। यसरी, प्रत्यारोपित मानव कोर्टेक्स न्यूरोनहरू परिपक्व हुन्छन् र व्यवहार नियन्त्रण गर्ने होस्टको सर्किटहरूमा भाग लिन्छन्। हामी यो दृष्टिकोणले बिरामी-व्युत्पन्न कोशिकाहरूमा स्ट्र्यान्ड-स्तर फेनोटाइपहरू पत्ता लगाउन सहज बनाउने अपेक्षा गर्छौं जुन अन्य माध्यमबाट पत्ता लगाउन सकिँदैन।
विकासशील मानव मस्तिष्क एक उल्लेखनीय स्व-व्यवस्थित प्रक्रिया हो जसमा कोषहरू फैलिन्छन्, भिन्न हुन्छन्, माइग्रेट हुन्छन्, र कार्यात्मक न्यूरोनल सर्किटहरू बनाउन जडान हुन्छन् जुन संवेदी अनुभव मार्फत थप परिष्कृत हुन्छन्। मानव मस्तिष्क विकास बुझ्ने एउटा प्रमुख समस्या, विशेष गरी रोगको सन्दर्भमा, मस्तिष्कको तन्तुमा पहुँचको अभाव हो। मानव कोर्टेक्स अर्गानोइड्स (hCO; मानव कोर्टेक्स क्षेत्रको रूपमा पनि चिनिन्छ) सहित स्व-व्यवस्थित अर्गानेल्सले 2,3,4,5,6 उत्पन्न गर्न सक्छ। यद्यपि, धेरै सीमितताहरूले तंत्रिका सर्किटहरूको विकास र कार्यलाई बुझ्नको लागि तिनीहरूको व्यापक प्रयोगलाई सीमित गर्दछ। विशेष गरी, यो स्पष्ट छैन कि hCO परिपक्वता भिभोमा उपस्थित केही सूक्ष्म वातावरणीय र संवेदी इनपुटहरूको अनुपस्थितिले सीमित छ कि छैन। थप रूपमा, किनभने hCO हरू व्यवहारिक परिणामहरू उत्पन्न गर्न सक्ने सर्किटहरूमा एकीकृत छैनन्, आनुवंशिक रूपमा जटिल र व्यवहारिक न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारहरूको मोडेलिङमा तिनीहरूको उपयोगिता हाल सीमित छ।
अक्षुण्ण जीवित मस्तिष्कमा hCO को प्रत्यारोपणले यी सीमितताहरूलाई पार गर्न सक्छ। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि मुसाको कोर्टेक्समा प्रत्यारोपण गरिएका मानव न्यूरोनहरू बाँच्न, प्रोजेक्ट गर्न र मुसाको कोषहरूसँग सञ्चार गर्न सक्षम छन्7,8,9,10,11,12। यद्यपि, यी प्रयोगहरू सामान्यतया वयस्क जनावरहरूमा गरिन्छन्, जसले सिन्याप्टिक र एक्सोनल एकीकरणलाई सीमित गर्न सक्छ। यहाँ, हामी प्रत्यारोपण प्रतिमानको वर्णन गर्छौं जसमा हामीले प्लास्टिक विकासको प्रारम्भिक चरणमा इम्युनोडेफिसिएन्ट मुसाको प्राथमिक सोमाटोसेन्सरी कोर्टेक्स (S1) मा hiPS कोषहरूबाट व्युत्पन्न 3D hCO लाई प्रत्यारोपण गर्यौं। प्रत्यारोपित hCO (t-hCO) न्यूरोनहरूले पर्याप्त परिपक्वताबाट गुज्रन्छन्, संवेदी प्रतिक्रियाहरू उत्प्रेरित गर्ने थालमोकोर्टिकल र कोर्टिकल-कोर्टिकल इनपुटहरू प्राप्त गर्छन्, र इनाम खोज्ने व्यवहार चलाउन मुसाको मस्तिष्कमा एक्सोनल प्रक्षेपणहरू विस्तार गर्छन्। t-hCO को विस्तारित परिपक्वताले टिमोथी सिन्ड्रोम (TS) भएका बिरामीहरूमा न्यूरोनल दोषहरू प्रकट गरेको छ, भोल्टेज-संवेदनशील L-प्रकार CaV1.2 क्याल्सियम च्यानल (CACNA1C द्वारा एन्कोड गरिएको) मा उत्परिवर्तनहरूको कारणले हुने गम्भीर आनुवंशिक विकार।
भिभोमा सर्किटहरूमा मानव कोर्टिकल न्यूरोन्स अध्ययन गर्न, हामीले स्टेरियोट्याक्टिक रूपमा अक्षुण्ण 3D hCO लाई प्रारम्भिक प्रसवोत्तर एथिमिक मुसाहरूको S1 मा प्रत्यारोपण गर्यौं (जन्म पछि 3-7 दिन) (चित्र 1a र चित्र 1a-c को विस्तारित डेटा)। यस बिन्दुमा, थालमोकोर्टिकल र कोर्टिकोकोर्टिकल एक्सोनल प्रक्षेपणहरूले अझै पनि आफ्नो S1 इनर्भेसन पूरा गरेका छैनन् (सन्दर्भ 13)। यसरी, यो दृष्टिकोण अन्तर्जात सर्किटहरूमा प्रभाव कम गर्दै t-hCO एकीकरणलाई अधिकतम बनाउन डिजाइन गरिएको हो। जीवित जनावरहरूमा t-hCO को स्थान कल्पना गर्न, हामीले प्रत्यारोपण पछि 2-3 महिनामा मुसाहरूको T2-भारित MRI मस्तिष्क पुनर्निर्माण गर्यौं (चित्र 1b र विस्तारित डेटा, चित्र 1d)। t-hCO सजिलै अवलोकन गरिएको थियो र t-hCO को आयतन मापन स्थिर स्लाइसहरूबाट गणना गरिएको जस्तै थियो (विस्तारित डेटा चित्र 1d,e; P > 0.05)। t-hCO सजिलै अवलोकन गरिएको थियो र t-hCO को आयतन मापन स्थिर स्लाइसहरूबाट गणना गरिएको जस्तै थियो (विस्तारित डेटा चित्र 1d,e; P > 0.05)। t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> ०,०५)। t-hCO सजिलै अवलोकन गरिएको थियो, र भोल्युमेट्रिक t-hCO मापनहरू निश्चित खण्डहरूको लागि गणना गरिएको जस्तै थिए (विस्तारित डेटा, चित्र 1d, e; P > 0.05)।很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）।很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> ०,०५)। t-hCO सजिलै अवलोकन गरिएको थियो, र भोल्युमेट्रिक t-hCO मापनहरू निश्चित खण्डहरूको लागि गणना गरिएको जस्तै थिए (विस्तारित डेटा, चित्र 1d, e; P > 0.05)।हामीले प्रत्यारोपणको लगभग २ महिना पछि ८१% प्रत्यारोपण गरिएका जनावरहरूमा t-hCO निर्धारण गर्यौं (n = ७२ जनावरहरू; १० hiPS सेल लाइनहरूबाट hCO; पूरक तालिका १ मा hiPS सेल लाइनहरू)। यी मध्ये, ८७% सेरेब्रल कोर्टेक्समा अवस्थित थिए (चित्र १c)। एउटै प्रत्यारोपण गरिएको मुसामा धेरै समय बिन्दुहरूमा क्रमिक MRI स्क्यानहरू गरेर, हामीले ३ महिना भित्र t-hCO भोल्युममा नौ गुणा वृद्धि फेला पार्यौं (चित्र १d र विस्तारित डेटा, चित्र १f)। प्रत्यारोपण गरिएको जनावरहरूको १२ महिना पछि प्रत्यारोपणमा उच्च बाँच्ने दर (७४%) थियो (विस्तारित डेटा, चित्र १g र पूरक तालिका २), र कुनै पनि स्पष्ट मोटर वा मेमोरी कमजोरी, ग्लियोसिस, वा इलेक्ट्रोएन्सेफालोग्राम (EEG) फेला परेन। डेटा चित्र १g र पूरक तालिका २)। १h–m र ३e)।
a, प्रयोगात्मक डिजाइनको योजनाबद्ध। hiPS कोषहरूबाट प्राप्त hCO लाई भिन्नताको ३०-६० दिनमा नवजात नग्न मुसाहरूको S1 मा प्रत्यारोपण गरिएको थियो। b, T2-भारित कोरोनल र तेर्सो MRI छविहरू प्रत्यारोपण पछि S1 मा t-hCO देखाउँदै २ महिना। स्केल बार, २ मिमी। c, प्रत्येक hiPS कोष रेखाको लागि देखाइएको इन्ग्रेफ्टमेन्ट सफलता दरहरूको परिमाण (n = १०८, बारहरू भित्रका संख्याहरूले प्रति hIPS कोष रेखा t-hCO को मात्रा संकेत गर्दछ) र कोर्टिकल वा सबकोर्टिकल स्थान (n = ८८)। d, कोरोनरी धमनीको MRI छवि (बायाँ; स्केल बार, ३ मिमी) र सम्बन्धित ३D भोल्युमेट्रिक पुनर्निर्माण (स्केल बार, ३ मिमी) ले ३ महिनामा t-hCO मा वृद्धि देखाउँदै। e, मुसाको मस्तिष्क कोर्टेक्समा t-hCO ढाँचाहरूको समीक्षा। स्केल बार, १ मिमी। f, माथि बायाँबाट दायाँ देखाइएको t-hCO को प्रतिनिधि इम्युनोसाइटोकेमिकल छविहरू (भिन्नताको समयमा): PPP1R17 (४ महिना पुरानो), NeuN (८ महिना पुरानो), SOX9 र GFAP (८ महिना पुरानो), PDGFRα; (८ महिना), MAP2 (८ महिना) र IBA1 (८ महिना)। स्केल बार, २० µm। HNA को सह-अभिव्यक्तिले मानव उत्पत्तिका कोषहरूलाई संकेत गर्दछ। g, snRNA-seq: Seurat एकीकरण पछि सबै उच्च-गुणस्तर t-hCO न्यूक्लीको एकीकृत मेनिफोल्ड र प्रक्षेपण (UMAP) आयाम घटाउने इमेजिङ (n=3 t-hCO नमूनाहरू, n=2 hiPS सेल लाइनहरू)। एस्ट्रोसाइटहरू, एस्ट्रोसाइट लाइनका कोषहरू; cyc prog, परिसंचरण गर्ने पूर्वजहरू; GluN DL, गहिरो ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्स; GluN DL/SP, गहिरो र सबलामेलर ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्स; GluN UL, माथिल्लो तह ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्स; ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स; OPC, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट पूर्वज कोषहरू; RELN, रिलिन न्यूरोन्स। h, t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेटेड जीनहरूको जीन ओन्टोलोजी (GO) टर्म एन्रिचमेन्ट विश्लेषण (समायोजित P < ०.०५, फोल्ड परिवर्तन > २, न्यूक्लीको कम्तिमा १०% मा व्यक्त गरिएको) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा। h, t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेटेड जीनहरूको जीन ओन्टोलोजी (GO) टर्म एन्रिचमेन्ट विश्लेषण (समायोजित P < ०.०५, फोल्ड परिवर्तन > २, न्यूक्लीको कम्तिमा १०% मा व्यक्त गरिएको) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा। h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) по крайней мере в 10% yader) h, hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा महत्त्वपूर्ण सक्रियता (समायोजित P<0.05, फोल्ड परिवर्तन >2, कम्तिमा १०% केन्द्रकमा अभिव्यक्ति) भएका जीनहरूको लागि जीन ओन्टोलोजी (GO) शब्द संवर्धन विश्लेषण। h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2, 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析। h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 变 后变化> 2, 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 至少 10% 的本体论(GO) 术语富集分析। h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайнев %1меней) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) नामकरण тербощанию. h, t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा जीनहरू उल्लेखनीय रूपमा माथि उठाइएका थिए (समायोजित P < ०.०५, फोल्ड परिवर्तन > २, न्यूक्लीको कम्तिमा १०% मा व्यक्त गरिएको) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा संवर्धन शब्दको ओन्टोलोजिकल (GO) विश्लेषण।डटेड लाइनले ०.०५ को aq मान जनाउँछ। i, सन्दर्भ २२ snRNA-seq वयस्क मोटर कोर्टेक्स डेटासेटबाट लेबल स्थानान्तरण प्रयोग गरेर t-hCO मा GluN सेल प्रकारहरूको UMAP इमेजिङ। CT — कोर्टिकोथैलेमिक कोषहरू, ET — एक्स्ट्रासेरेब्रल कोषहरू, IT — आन्तरिक टेलेन्सेफलिक कोषहरू, NP — प्रक्षेपण नजिक।
त्यसपछि हामीले साइटोआर्किटेक्चर र t-hCO को समग्र सेलुलर संरचनाको मूल्याङ्कन गर्यौं। मुसाको एन्डोथेलियल कोषहरूको एन्टिबडी स्टेनिङले t-hCO सँग भास्कुलराइजेशन प्रकट गर्‍यो, जबकि IBA1 स्टेनिङले ग्राफ्टभरि मुसा माइक्रोग्लियाको उपस्थिति प्रकट गर्‍यो (चित्र 1f र विस्तारित डेटा, चित्र 3c, d)। इम्युनोस्टेनिङले मानव आणविक एन्टिजेन (HNA) सकारात्मक कोषहरू PPP1R17 (कर्टिकल प्रोजेनिटरहरू), NeuN (न्यूरोन), SOX9 र GFAP (ग्लियल-व्युत्पन्न कोषहरू) वा PDGFRα (ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रोजेनिटरहरू) (चित्र 1f) सह-अभिव्यक्त गर्ने प्रकट गर्‍यो। एकल कोष रिजोल्युसनमा t-hCO को सेलुलर संरचना अध्ययन गर्न, हामीले लगभग 8 महिनाको भिन्नता पछि एकल-कोर RNA अनुक्रमण (snRNA-seq) प्रदर्शन गर्‍यौं। मुसाको केन्द्रकको थोक निस्पंदन र हटाउनाले 21,500 उच्च-गुणस्तरको मानव मोनोन्यूक्लियर नक्साहरू प्राप्त गर्‍यो (चित्र 1g र विस्तारित डेटा, चित्र 4a, b)। विशिष्ट कोशिका-प्रकारका मार्करहरूको अभिव्यक्ति ढाँचाहरूले प्रमुख कोर्टिकल कोशिका वर्गहरूको समूहहरू पहिचान गरे, जसमा गहिरो र सतही ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्स, परिसंचरण गर्ने प्रोजेनिटरहरू, ओलिगोडेन्ड्रोसाइटहरू, र एस्ट्रोसाइट वंशहरू समावेश थिए (चित्र १g, विस्तारित डेटा, चित्र ४c, र पूरक तालिका ३)। SATB2 र CTIP2 को लागि इम्युनोस्टेनिङले देखाएको छ कि कोर्टिकल उपप्रकारहरूको उपस्थितिको बावजुद, t-hCO ले स्पष्ट शारीरिक स्तरीकरण देखाएको छैन (विस्तारित डेटा, चित्र ३a)। चरण-मिल्दो snRNA-seq hCO ले ओलिगोडेन्ड्रोसाइटहरूको अनुपस्थिति र GABAergic न्यूरोन्सको उपस्थिति सहित केही अपवादहरू बाहेक व्यापक रूपमा समान कोशिका वर्गहरू उत्पादन गर्‍यो, जसले पार्श्व प्रोजेनिटर कोशिकाहरूको लागि पहिले रिपोर्ट गरिएको अनुकूल इन भिट्रो अवस्थाहरू प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ15 (विस्तारित डेटा, चित्र ४f – i र पूरक तालिका ४)। भिन्न जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणले t-hCO र hCO बीच ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो (पूरक तालिका ५), जसमा सिन्याप्टिक सिग्नलिङ, डेन्ड्रिटिक स्थानीयकरण, र भोल्टेज-गेटेड च्यानल गतिविधि जस्ता न्यूरोनल परिपक्वतासँग सम्बन्धित जीनहरूको सेटहरूको सक्रियता समावेश छ (चित्र १h र पूरक तालिका ५)। तालिका ६)। तदनुसार, कोर्टिकल ग्लुटामेटर्जिक t-hCO न्यूरोन्सले द्रुत ट्रान्सक्रिप्शनल परिपक्वता प्रदर्शन गरे।
t-hCO मा यी ट्रान्सक्रिप्शनल परिवर्तनहरू hCO इन भिट्रो र t-hCO इन भिभो बीचको मोर्फोलॉजिकल भिन्नताहरूसँग सम्बन्धित थिए कि थिएनन् भनेर स्पष्ट पार्न, हामीले ७-८ महिनाको भिन्नता पछि तीव्र खण्डहरूमा चरण-मिल्दो बायोसाइटिन-भरिएको hCO र hCO पुनर्निर्माण गर्यौं। hCO न्यूरोनहरू (चित्र २a)। t-hCO न्यूरोनहरू उल्लेखनीय रूपमा ठूला थिए, सोमा व्यासको १.५ गुणा, डेन्ड्राइटहरू दोब्बर थिए, र इन भिट्रो hCO (चित्र २b) को तुलनामा कुल डेन्ड्राइटिक लम्बाइमा समग्र छ गुणा वृद्धि भएको थियो। थप रूपमा, हामीले hCO न्यूरोनहरू (चित्र २c) भन्दा t-hCO न्यूरोनमा डेन्ड्राइटिक स्पाइनहरूको उल्लेखनीय रूपमा उच्च घनत्व अवलोकन गर्यौं। यसले सुझाव दिन्छ कि t-hCO न्यूरोनहरूले व्यापक डेन्ड्राइटिक लम्बाइ र शाखाहरू पार गर्छन्, जुन निरन्तर कोशिका प्रसारको संयोजनमा, प्रत्यारोपण पछि t-hCO को गहन वृद्धिमा योगदान पुर्‍याउन सक्छ (चित्र १d र विस्तारित डेटा चित्र १f)। यसले हामीलाई इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल गुणहरूको अनुसन्धान गर्न प्रेरित गर्‍यो। झिल्ली क्षमता आठ गुणा बढी थियो (विस्तारित डेटा, चित्र 8d), आराम-अवस्था झिल्ली क्षमता बढी हाइपरपोलराइज्ड थियो (लगभग 20 mV), र वर्तमान इंजेक्शनले hCO न्यूरोन भन्दा t-hCO न्यूरोनमा उच्च अधिकतम उत्तेजना दर प्रेरित गर्‍यो। इन भिट्रो (चित्र 2d), e), जुन t-hCO को ठूला र अधिक जटिल रूपात्मक विशेषताहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ। थप रूपमा, t-hCO न्यूरोनहरूमा सहज उत्तेजक पोस्टसिन्याप्टिक वर्तमान घटनाहरू (EPSC) को आवृत्ति उल्लेखनीय रूपमा उच्च थियो (चित्र 2f), सुझाव दिन्छ कि t-hCO न्यूरोनमा अवलोकन गरिएको डेन्ड्राइटिक स्पाइनहरूको बढ्दो घनत्व कार्यात्मक उत्तेजनासँग सम्बन्धित थियो। यौन सिनेप्स। हामीले लेबल गरिएको ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोनहरू (विस्तारित डेटा, चित्र 6a-c) रेकर्ड गरेर भिट्रोमा hCO न्यूरोनको अपरिपक्व चरित्र पुष्टि गर्‍यौं।
a, ८ महिनाको भिन्नता पछि बायोसाइटिनले भरिएको hCO र t-hCO न्यूरोन्सको 3D पुनर्निर्माण। b, रूपात्मक विशेषताहरूको परिमाणीकरण (n = 8 hCO न्यूरोन, n = 6 t-hCO न्यूरोन; **P = 0.0084, *P = 0.0179 र ***P < 0.0001)। b, रूपात्मक विशेषताहरूको परिमाणीकरण (n = 8 hCO न्यूरोन, n = 6 t-hCO न्यूरोन; **P = 0.0084, *P = 0.0179 र ***P < 0.0001)। б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, ***0179)। b, रूपात्मक विशेषताहरूको परिमाणीकरण (n=8 hCO न्यूरोन, n=6 t-hCO न्यूरोन; **P=0.0084, *P=0.0179, र ***P<0.0001)। b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 咉*00179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 咉*00179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, ***0179)। b, रूपात्मक विशेषताहरूको परिमाणीकरण (n=8 hCO न्यूरोन, n=6 t-hCO न्यूरोन; **P=0.0084, *P=0.0179, र ***P<0.0001)।c, ८ महिनाको भिन्नता पछि hCO र t-hCO डेन्ड्राइटिक शाखाहरूको 3D पुनर्निर्माण। रातो तारा चिन्हले पुटेटिभ डेन्ड्राइटिक मेरुदण्डलाई संकेत गर्दछ। डेन्ड्राइटिक मेरुदण्ड घनत्व परिमाणीकरण (n = 8 hCO न्यूरोन, n = 6 t-hCO न्यूरोन; **P = 0.0092)। d, विश्राम झिल्ली क्षमताको परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १६ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। d, विश्राम झिल्ली क्षमताको परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १६ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। d, विश्राम झिल्ली सम्भाव्यता परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १६ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। d, विश्राम झिल्ली सम्भाव्यता परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १६ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। e, वर्तमान इंजेक्शनहरू बढाएर प्रेरित hCO र t-hCO मा दोहोरिने कार्य क्षमता फायरिङ, र अधिकतम फायरिङ दरको परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरोन, n = 16 t-hCO न्यूरोन; ***P < 0.0001)। e, वर्तमान इंजेक्शनहरू बढाएर प्रेरित hCO र t-hCO मा दोहोरिने कार्य क्षमता फायरिङ, र अधिकतम फायरिङ दरको परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरोन, n = 16 t-hCO न्यूरोन; ***P < 0.0001)। e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максиала максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। e, hCO र t-hCO मा कार्य क्षमता पुन: फायरिङ, अधिकतम फायरिङ दरको वर्तमान वृद्धि र परिमाणीकरणद्वारा प्रेरित (n = 25 hCO न्यूरोन, n = 16 t-hCO न्यूरोन; *** P < 0.0001)। e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的釀大放电率的釀大 5h2神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）। E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量 （电 5 hco , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкая центивия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। e, बढेको वर्तमान आपूर्ति र अधिकतम फायरिङ दरको परिमाणीकरणद्वारा प्रेरित hCO र t-hCO कार्य क्षमताहरूको दोहोरिने फायरिङ (n = 25 hCO न्यूरोन, n = 16 t-hCO न्यूरोन; *** P < 0.0001)। f, ८ महिनाको भिन्नतामा hCO र t-hCO न्यूरोनहरूमा स्वतःस्फूर्त EPSCs (sEPSCs), र सिन्याप्टिक घटनाहरूको आवृत्तिको परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १७ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। f, ८ महिनाको भिन्नतामा hCO र t-hCO न्यूरोनहरूमा स्वतःस्फूर्त EPSCs (sEPSCs), र सिन्याप्टिक घटनाहरूको आवृत्तिको परिमाणीकरण (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १७ t-hCO न्यूरोन; ***P < ०.०००१)। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO र t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыхиная нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001)। f, synaptic घटना दरहरूको भेदभाव र परिमाणीकरणको ८ महिनामा hCO र t-hCO न्यूरोनहरूमा स्वतःस्फूर्त EPSCs (sEPSCs) (n=२५ hCO न्यूरोन, n=१७ t-hCO न्यूरोन; ***P<०.०००१)। f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞n 烞件频率的量化（n 17 t-hCO 神经元；**P <0.0001）। f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001）। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO र t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыхиная нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001)। f, synaptic घटना दरहरूको भेदभाव र परिमाणीकरणको ८ महिनामा hCO र t-hCO न्यूरोनहरूमा स्वतःस्फूर्त EPSCs (sEPSCs) (n = २५ hCO न्यूरोन, n = १७ t-hCO न्यूरोन; *** P<0.0001)।bf को लागि, लाइन १२०८-२ मा hCO र t-hCO समानान्तरमा राखिएको एउटै भिन्नता ब्याचबाट लिइएको थियो। g, t-hCO मा जीनहरूको जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (एकतर्फी फिशरको सटीक परीक्षण) उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेटेड (समायोजित P < 0.05, फोल्ड परिवर्तन > 2, न्यूक्लीको कम्तिमा 10% मा व्यक्त गरिएको) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा इन भिभो माउस अध्ययनबाट पहिचान गरिएको प्रारम्भिक-प्रतिक्रिया (ERG) र ढिलो-प्रतिक्रिया (LRG) गतिविधि-निर्भर जीनहरू र इन भिट्रो न्यूरोन्सबाट मानव-विशिष्ट LRG हरूको जीन सेटहरू सहित।16। g, t-hCO मा जीनहरूको जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (एकतर्फी फिशरको सटीक परीक्षण) उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेटेड (समायोजित P < 0.05, फोल्ड परिवर्तन > 2, न्यूक्लीको कम्तिमा 10% मा व्यक्त गरिएको) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा इन भिभो माउस अध्ययनबाट पहिचान गरिएको प्रारम्भिक-प्रतिक्रिया (ERG) र ढिलो-प्रतिक्रिया (LRG) गतिविधि-निर्भर जीनहरू र इन भिट्रो न्यूरोन्सबाट मानव-विशिष्ट LRG हरूको जीन सेटहरू सहित।16। g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректирован, скорректировань, ० изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) मा глутаматергических нейронах t-hCO hCO наборы генов как rannego (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мыследовании на мышичецих, LRG и нейронов in vitro17 को लागी। g, t-hCO मा महत्वपूर्ण सक्रियता (समायोजित P<0.05, फोल्ड परिवर्तन >2, न्यूक्लीको कम्तिमा १०% मा अभिव्यक्ति) भएका जीनहरूको जीन सेट संवर्धनको विश्लेषण (एक-पुच्छर फिशरको सटीक परीक्षण) hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्सको तुलनामा प्रारम्भिक (ERG) र ढिलो (LRG) गतिविधि-निर्भर जीनहरू दुवैको ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्स सेटहरू इन भिभो मुसा16 र न्यूरोन्स इन भिट्रो17 बाट मानव-विशिष्ट LRGs। g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05, 倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性性 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 谨酸 神经 元 谨酸 神经倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 फिशर 精确）可集研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和 煞煥17 中 中 17 中 17 人类特异性LRG। g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы с глутаматергическими P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) ранотегера सक्रियताको बारेमा ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 र NEIRONAH in vitro17। LRG, специфичные для человека। g, t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोनहरू hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोनहरूको तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा माथि उठाइएका थिए (समायोजित P<0.05, फोल्ड परिवर्तन >2, कम्तिमा १०% प्रारम्भिक प्रतिक्रिया (ERG) र ढिलो प्रतिक्रिया जीन संवर्धन विश्लेषण (एक-पुच्छर फिशरको सटीक परीक्षण) प्रतिक्रिया गतिविधि निर्भर जीनहरू (LRGs) इन भिभो मुसा16 र इन भिट्रो न्यूरोनहरूमा पहिचान गरियो।17 मानव विशिष्ट LRGs।डटेड लाइनले ०.०५ को बोनफेरोनी-सुधार गरिएको P मानलाई संकेत गर्दछ। h, t-hCO ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा LRG जीनको snRNA-seq प्रतिकृतिहरूमा GluN जीन अभिव्यक्ति (प्रत्येक जीनको स्यूडो-प्याकेज र स्केलिंग) उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेट गरिएको थियो। i, t-hCO (माथिल्लो) र hCO (तल्लो) न्यूरोन्समा SCG2 अभिव्यक्ति देखाउने इम्युनोस्टेनिङ। सेतो तीरहरू SCG2+ कोषहरूलाई औंल्याउँछन्। स्केल बार, २५ µm। डेटा औसत ± मानक विचलनको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
एक्स भिभो स्लाइसहरूमा अवलोकन गरिएको t-hCO को बढेको गतिविधिको आधारमा, snRNA-seq ले hCO इन भिट्रोको तुलनामा t-hCO मा जीन ट्रान्सक्रिप्टहरूको गतिविधि-निर्भर अपरेगुलेसन प्रकट गर्‍यो। ग्लुटामेटर्जिक t-hCO न्यूरोनहरूले ढिलो प्रतिक्रिया गतिविधि (चित्र 2g,h) लाई नियमन गर्ने जीनको उच्च स्तर व्यक्त गरे, जुन मुसा र मानव न्यूरोनहरूमा अघिल्लो अध्ययनहरूमा फेला परेको थियो16,17। उदाहरणका लागि, BDNF18, SCG2, र OSTN, एक प्राइमेट-विशिष्ट गतिविधि-नियमन गर्ने जीनले hCO न्यूरोनहरूको तुलनामा t-hCO न्यूरोनमा बढेको अभिव्यक्ति देखायो (चित्र 2g-i)। यसरी, t-hCO न्यूरोनहरूले ट्रान्सक्रिप्शनल, मोर्फोलॉजिकल, र कार्यात्मक विश्लेषणहरूद्वारा hCO न्यूरोनको तुलनामा बढेको परिपक्वता विशेषताहरू प्रदर्शन गरे।
मानव मस्तिष्क विकाससँग t-hCO परिपक्वताको सम्बन्धलाई थप मूल्याङ्कन गर्न, हामीले भ्रूण र वयस्क कोर्टिकल कोशिका प्रकारहरू 19,20 र वयस्क21,22 को ट्रान्सक्रिप्टोमिक तुलनाहरू साथै विकासको क्रममा कोर्टिकल जीन अभिव्यक्ति23 मा व्यापक डेटा प्रदर्शन गर्यौं (विस्तारित डेटा, चित्र 5)। अघिल्लो काम 24 सँग, 7-8 महिनाको भिन्नतामा विश्वव्यापी hCO र t-hCO ट्रान्सक्रिप्टोम परिपक्वता स्थिति इन भिभो विकास समयसँग व्यापक रूपमा सुसंगत छ र ढिलो भ्रूण जीवनको बराबर छ (विस्तारित डेटा चित्र 5a)। उल्लेखनीय रूपमा, हामीले उमेर-मिल्ने hCO को तुलनामा t-hCO मा बढेको ट्रान्सक्रिप्टोम परिपक्वता अवलोकन गर्यौं, साथै साइनाप्टोजेनेसिस, एस्ट्रोजेनेसिस, र माइलिनेसनसँग सम्बन्धित ट्रान्सक्रिप्टोम सक्रियता (विस्तारित डेटा, चित्र 5b-d)। सेलुलर स्तरमा, हामीले t-hCO मा पातलो कोर्टेक्स उपप्रकारको प्रमाण फेला पार्यौं, वयस्क L2/3, L5, र L6 न्यूरोन उपप्रकारहरूसँग ओभरल्याप हुने ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोनहरूको समूहहरू (चित्र 1i) सँग। यसको विपरीत, गर्भावस्थाको मध्यमा ग्लुटामेटर्जिक t-hCO न्यूरोन्स र भ्रूण कोर्टिक न्यूरोन्स बीचको क्लस्टर ओभरल्याप बढी सीमित थियो (विस्तारित डेटा, चित्र 5e-j)। t-hCO न्यूरोन्सहरू मानव प्रसवोत्तर नियोकोर्टिकल न्यूरोन्ससँग कार्यात्मक रूपमा समान छन् कि छैनन् भनेर निर्धारण गर्न, हामीले मानव प्रसवोत्तर कोर्टेक्सको तीखो खण्डहरूमा मानव L2/3 पिरामिडल न्यूरोन्सको इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल रेकर्डिङ र शारीरिक पुनर्निर्माण गर्यौं (विस्तारित डेटा, चित्र 7a)। L2/3 पिरामिडल न्यूरोन्सको इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल गुणहरू t-hCO पिरामिडल न्यूरोन्स (विस्तारित डेटा, चित्र 7e) जस्तै थिए। रूपात्मक रूपमा, प्रसवोत्तर मानव नमूनाहरूबाट L2/3 न्यूरोन्सहरू hCO भन्दा t-hCO सँग बढी मिल्दोजुल्दो थिए, यद्यपि L2/3 कोषहरू लामो थिए, समग्रमा धेरै शाखाहरू थिए, र उच्च मेरुदण्ड घनत्व थियो (चित्र 3g र विस्तारित डेटा, चित्र 7b-)। G)।
a, नियन्त्रण र TS hiPS सेल लाइनहरूद्वारा उत्पादित hCO को नवजात मुसाहरूमा प्रत्यारोपण। b, ८ महिनाको भिन्नता पछि बायोसाइटिनले भरिएको t-hCO न्यूरोनहरूको 3D पुनर्निर्माण। c, औसत डेन्ड्राइटिक लम्बाइको परिमाणीकरण (n = १९ नियन्त्रण न्यूरोन, n = २१ TS न्यूरोन; **P = ०.००४१)। d, नियन्त्रणबाट 3D-पुनर्निर्माण गरिएको डेन्ड्राइटिक शाखाहरू र TS t-hCO8 महिनाको भिन्नतामा, र डेन्ड्राइटिक मेरुदण्ड घनत्वको परिमाणीकरण (n = 16 नियन्त्रण न्यूरोन, n = 21 TS न्यूरोन, ***P < 0.0001)। d, नियन्त्रणबाट 3D-पुनर्निर्माण गरिएको डेन्ड्राइटिक शाखाहरू र TS t-hCO8 महिनाको भिन्नतामा, र डेन्ड्राइटिक मेरुदण्ड घनत्वको परिमाणीकरण (n = 16 नियन्त्रण न्यूरोन, n = 21 TS न्यूरोन, ***P < 0.0001)। d, 3D-RECONSTRUKCIIA дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцединка шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। d, ८ महिनाको भिन्नता र डेन्ड्राइटिक मेरुदण्ड घनत्व परिमाणीकरणमा नियन्त्रण र t-hCO TS बाट डेन्ड्राइटिक शाखाहरूको 3D पुनर्निर्माण (n=१६ नियन्त्रण न्यूरोन, n=२१ TS न्यूरोन, ***P<०.०००१)। d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个煥煥的量化（n 21 个TS 神经元, ***P <0.0001）। d, 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突支 以及 树突棘 密度 量化 6 个突棘 密度 量化元, n = 21 个 ts 神经, *** p <0.0001 ）। d, 3D-RECONSTRUKCIIA дендритных ветвей CONTROLIA и TS t-hCO cherez 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। d, ८ महिनाको भिन्नता र डेन्ड्राइटिक मेरुदण्ड घनत्व परिमाणीकरणमा नियन्त्रण डेन्ड्राइटिक शाखाहरू र TS t-hCO3 को 3D पुनर्निर्माण (n=१६ नियन्त्रण न्यूरोन, n=२१ TS न्यूरोन, ***P<०.०००१)।रातो तारा चिन्हहरूले पुटेटिभ डेन्ड्रिटिक मेरुदण्डहरूलाई संकेत गर्दछ। e, नियन्त्रणमा सहज EPSCs र TS t-hCO न्यूरोनहरू 8 महिनाको भिन्नता पछि। f, संचयी आवृत्ति प्लट र सिन्याप्टिक घटनाहरूको आवृत्ति र आयामको परिमाणीकरण (n=32 नियन्त्रण न्यूरोनहरू, n=26 TS न्यूरोनहरू; **P=0.0076 र P=0.8102)। g, hCO र t-hCO मा TS र नियन्त्रण न्यूरोनहरूको Scholl विश्लेषण। ड्यास गरिएका रेखाहरूले तुलनाको लागि मानव L2/3 प्रसवोत्तर पिरामिडल न्यूरोनहरू देखाउँछन् (n = 24 नियन्त्रण t-hCO न्यूरोनहरू, n = 21 TS t-hCO न्यूरोनहरू, n = 8 नियन्त्रण hCO न्यूरोनहरू, र n = 7 TS hCO न्यूरोनहरू)। डेटा औसत ± मानक विचलनको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
उच्च स्तरमा मानव कोर्टेक्स न्यूरोन्सको मोर्फोलॉजिकल र कार्यात्मक विशेषताहरूको प्रतिकृति बनाउन t-hCO को क्षमताले हामीलाई रोग फेनोटाइपहरू पत्ता लगाउन t-hCO प्रयोग गर्न सकिन्छ कि भनेर अन्वेषण गर्न प्रेरित गर्‍यो। हामीले TS मा ध्यान केन्द्रित गर्‍यौं, CaV1.2 एन्कोडिङ जीनमा गेन-अफ-फंक्शन उत्परिवर्तनबाट हुने गम्भीर न्यूरोडेभलपमेन्टल विकार, जसले न्यूरोन्समा गतिविधि-निर्भर जीन ट्रान्सक्रिप्शन सुरु गर्दछ। हामीले सबैभन्दा सामान्य प्रतिस्थापन (p.G406R) र तीन नियन्त्रणहरू बोकेका तीन TS बिरामीहरूबाट hCO प्राप्त गर्‍यौं (चित्र 3a)। प्रत्यारोपण पछि, हामीले पत्ता लगायौं कि नियन्त्रणहरूको तुलनामा TS न्यूरोन्समा डेन्ड्राइटिक मोर्फोलॉजी परिवर्तन गरिएको थियो (चित्र 3b र विस्तारित डेटा, चित्र 8a,b), प्राथमिक डेन्ड्राइटहरूको संख्यामा दुई गुणा वृद्धि र औसतमा समग्र वृद्धि र डेन्ड्राइटिक लम्बाइमा समग्र कमी (चित्र 3c र विस्तारित डेटा, चित्र 8c)। यो नियन्त्रण न्यूरोन्सको तुलनामा TS मा मेरुदण्डको बढ्दो घनत्व र सहज EPSCs को बढ्दो आवृत्तिसँग सम्बन्धित थियो (चित्र 3d–f र विस्तारित डेटा, चित्र 8g)। थप विश्लेषणले नियन्त्रणहरूको तुलनामा t-hCO TS मा असामान्य डेन्ड्राइटिक शाखाहरूको ढाँचाहरू प्रकट गर्‍यो, तर भिन्नताको समान चरणमा इन भिट्रो TS hCO मा होइन (चित्र 3g)। यो TS मा गतिविधि-निर्भर डेन्ड्राइटिक संकुचन सम्बन्धी हाम्रो अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग मेल खान्छ र यो प्रत्यारोपण प्लेटफर्मको भिभोमा रोग फेनोटाइपहरू पत्ता लगाउने क्षमतालाई हाइलाइट गर्दछ।
त्यसपछि हामीले सोध्यौं कि मुसा S1 मा t-hCO कोषहरू कति हदसम्म कार्यात्मक रूपमा एकीकृत छन्। मुसाहरूमा S1 ले ipsilateral ventral basal र posterior thalamic nuclei, साथै ipsilateral motor र secondary somatosensory cortices, र contralateral S1 बाट बलियो synaptic इनपुटहरू प्राप्त गर्दछ (चित्र 4a)। innervation ढाँचा पुनर्स्थापित गर्न, हामीले hCO लाई रेबिज भाइरस-dG-GFP/AAV-G ले संक्रमित गर्यौं र 3 दिन पछि S1 मुसामा hCO प्रत्यारोपण गर्यौं। हामीले प्रत्यारोपण पछि 7-14 दिनमा ipsilateral S1 र ventral basal ganglia को न्यूरोन्समा घना GFP अभिव्यक्ति अवलोकन गर्यौं (चित्र 4b, c)। थप रूपमा, thalamic मार्कर netrin G1 को एन्टिबडी स्टेनिङले t-hCO मा thalamic अन्त्यहरूको उपस्थिति प्रकट गर्‍यो (चित्र 4d, e)। यी एफेरेन्ट प्रक्षेपणहरूले t-hCO कोषहरूमा synaptic प्रतिक्रियाहरू उत्पन्न गर्न सक्छन् कि भनेर मूल्याङ्कन गर्न, हामीले thalamocortical तहको तीखो खण्डहरूमा मानव कोषहरूबाट सम्पूर्ण कोष रेकर्डिङहरू प्रदर्शन गर्यौं। मुसा S1 को विद्युतीय उत्तेजना, आन्तरिक क्याप्सुल, सेतो पदार्थ, t-hCO नजिकको फाइबर वा t-hCO मा अप्सिन-अभिव्यक्त गर्ने थालमिक अन्त्यहरूको अप्टोजेनेटिक सक्रियताले AMPA रिसेप्टर विरोधी NBQX को सम्पर्कमा आएका t-hCO न्यूरोनहरूमा छोटो-विलम्बता EPSCs प्रेरित गर्दछ। (चित्र 4f, g र विस्तारित डेटा, चित्र 9a-g)। यी डेटाले देखाउँछ कि t-hCO शारीरिक रूपमा मुसाको मस्तिष्कमा एकीकृत छ र मुसा होस्ट तन्तु द्वारा सक्रिय गर्न सक्षम छ।
a, रेबिज ट्र्याकिङ प्रयोगको योजनाबद्ध रेखाचित्र। b, GFP र मानव-विशिष्ट STEM121 अभिव्यक्ति t-hCO र मुसाको सेरेब्रल कोर्टेक्स (माथिल्लो प्यानल) बीच। मुसाको ipsilateral ventral बेसल न्यूक्लियस (VB) (तल्लो बायाँ) र ipsilateral S1 (तल्लो दायाँ) मा GFP अभिव्यक्ति पनि देखाइएको छ। स्केल बार, ५० µm। रातो वर्गहरूले मस्तिष्कका ती क्षेत्रहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ जहाँ छविहरू लिइएका थिए। c, GFP व्यक्त गर्ने कोशिकाहरूको परिमाणीकरण (n = ४ मुसा)। d, e — t-hCO मा नेट्रिन G1+ थालमिक टर्मिनलहरू। d ले t-hCO र VB न्यूक्लियस भएको कोरोनल खण्ड देखाउँछ। स्केल बार, २ मिमी। e ले t-hCO (बायाँ) र VB (दायाँ) न्यूरोन्समा नेट्रिन G1 र STEM121 अभिव्यक्ति देखाउँछ। स्केल बार, ५० µm। सुन्तला डटेड रेखाले t-hCO सीमानालाई संकेत गर्दछ। f, g, S1 मुसा (f) वा आन्तरिक क्याप्सुल (g), (बैजनी) वा बिना (कालो) NBQX (बायाँ) मा विद्युतीय उत्तेजना पछि t-hCO न्यूरोनहरूको वर्तमान ट्रेस। NBQX (n = 6 S1 न्यूरोन, *P = 0.0119; र n = 6 आन्तरिक क्याप्सुल न्यूरोन, **P = 0.0022) (केन्द्र) सँग र बिना EPSC आयामहरू। मुसा S1 (f) वा आन्तरिक क्याप्सुल (g) (दायाँ) को विद्युतीय उत्तेजनाको प्रतिक्रियामा EPSC देखाउने t-hCO न्यूरोनहरूको प्रतिशत। aCSF, कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड। h, 2P इमेजिङ प्रयोगको योजनाबद्ध रेखाचित्र (बायाँ)। t-hCO (मध्य) मा GCaMP6s को अभिव्यक्ति। स्केल बार, 100 µm। GCaMP6s (दायाँ) को फ्लोरोसेन्स समय ल्याप्स। i, सहज गतिविधि फ्लोरोसेन्सको Z-स्कोर। j, जुँगा उत्तेजनाको योजनाबद्ध चित्रण। k, एक परीक्षणमा z-स्कोर गरिएको 2P फ्लोरोसेन्स ट्र्याजेक्टोरीहरू, उदाहरण कक्षहरूमा समय शून्य (ड्यास गरिएको रेखा) मा व्हिस्कर विचलनसँग पङ्क्तिबद्ध। l, समय शून्य (ड्यास गरिएको रेखा) (रातो) वा अनियमित रूपमा उत्पन्न टाइमस्ट्याम्पहरू (खैरो) मा व्हिस्कर विचलनसँग पङ्क्तिबद्ध सबै कक्षहरूको जनसंख्या-औसत z-स्कोर प्रतिक्रियाहरू। m। अप्टिकल मार्किङमा प्रयोगको योजनाबद्ध रेखाचित्र। n, नीलो लेजर उत्तेजना वा व्हिस्कर विक्षेपणको समयमा उदाहरण t-hCO सेलबाट कच्चा भोल्टेज वक्रहरू। रातो तीरहरूले प्रकाश (माथि) वा व्हिस्कर विक्षेपण (तल) द्वारा उत्पन्न पहिलो स्पाइकहरूलाई संकेत गर्दछ। खैरो छायाले व्हिस्कर विक्षेपणको अवधिलाई संकेत गर्दछ। o, शिखर प्रकाश तरंगरूपहरू र व्हिस्कर विक्षेपण प्रतिक्रियाहरू। p, एकल प्रयासको स्पाइकहरू, उदाहरणको कक्षहरूमा व्हिस्करहरूको विचलनसँग पङ्क्तिबद्ध। 0 ले व्हिस्कर विचलन (ड्यास गरिएको रेखा) लाई संकेत गर्दछ। q, सबै फोटोसेन्सिटिभ कोशिकाहरूको लागि जनसंख्या-औसत z-स्कोर फायरिङ दर, समय शून्य (ड्यास गरिएको रेखा) (रातो) मा व्हिस्कर विचलनसँग पङ्क्तिबद्ध वा अनियमित रूपमा उत्पन्न टाइमस्ट्याम्पहरू (खैरो)। r, व्हिस्कर विचलन (n = ३ मुसा) (बायाँ) द्वारा उल्लेखनीय रूपमा परिमार्जित प्रकाशसंवेदनशील एकाइहरूको अनुपात। शिखर z-स्कोर विलम्बता (n = ३ मुसा; n = ५ (हल्का हरियो), n = ४ (गाढा हरियो), र n = ४ (सियान) व्हिस्कर विक्षेपण मोड्युलेशन एकाइहरू प्रति मुसा) (दायाँ)। डेटा औसत ± मानक विचलनको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
त्यसपछि हामीले सोध्यौं कि t-hCO लाई संवेदी उत्तेजनाहरूद्वारा सक्रिय गर्न सकिन्छ कि भनेर। हामीले S1 मुसाहरूमा आनुवंशिक रूपमा एन्कोड गरिएको क्याल्सियम सूचकहरू GCaMP6 व्यक्त गर्ने hCO प्रत्यारोपण गर्यौं। १५० दिन पछि, हामीले फाइबर फोटोमेट्री वा दुई-फोटोन क्याल्सियम इमेजिङ प्रदर्शन गर्यौं (चित्र ४ घन्टा र विस्तारित डेटा, चित्र १० क)। हामीले पत्ता लगायौं कि t-hCO कोशिकाहरूले सिंक्रोनाइज्ड लयबद्ध गतिविधि प्रदर्शन गरे (चित्र ४i, विस्तारित डेटा, चित्र १० ख र पूरक भिडियो १)। शिखर t-hCO गतिविधिलाई चित्रण गर्न, हामीले एनेस्थेटाइज्ड ट्रान्सप्लान्ट मुसाहरूमा बाह्यकोशिकीय इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल रेकर्डिङहरू प्रदर्शन गर्यौं (विस्तारित डेटा, चित्र १०c-f)। हामीले MRI छविहरूबाट स्टेरियोट्याक्सिक निर्देशांकहरू उत्पन्न गरेका छौं; यसरी, यी रेकर्ड गरिएका एकाइहरूले पुटेटिभ मानव न्यूरोनहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, यद्यपि इलेक्ट्रोफिजियोलोजीले मात्र उत्पत्तिको प्रजाति निर्धारण गर्न अनुमति दिँदैन। हामीले गतिविधिको सिंक्रोनाइज्ड फटहरू अवलोकन गर्यौं (विस्तारित डेटा, चित्र १० घ)। विस्फोटहरू लगभग ४६० मिलिसेकेन्डसम्म चलेका थिए र लगभग २ सेकेन्डको मौन अवधिद्वारा छुट्याइएका थिए (विस्तारित डेटा, चित्र १०d, e)। व्यक्तिगत एकाइहरूले प्रति विस्फोट औसतमा लगभग तीन राउन्ड फायर गरे, जुन प्रति विस्फोट दर्ता गरिएको एकाइहरूको लगभग ७३% हो। व्यक्तिगत एकाइहरूको गतिविधिहरू अत्यधिक सहसम्बन्धित थिए, र यी सहसम्बन्धहरू खोप नदिइएका जनावरहरूमा पहिचान गरिएका एकाइहरू भन्दा बढी थिए जुन उही अवस्थाहरूमा रेकर्ड गरिएको थियो (विस्तारित डेटा, चित्र १०f)। पहिचान गरिएको मानव-व्युत्पन्न न्यूरोनहरूको स्पाइक प्रतिक्रियाहरूलाई थप विशेषता दिन, हामीले प्रकाश-संवेदनशील क्यासन च्यानल रोडोप्सिन २ (hChR2) व्यक्त गर्ने hCO सँग प्रत्यारोपण गरिएका एनेस्थेटाइज्ड मुसाहरूमा प्रकाश-ट्यागिङ प्रयोगहरू गर्यौं, जसको माध्यमबाट t-hCO न्यूरोनहरू छोटो-विलम्बता पहिचान (१० मिलिसेकेन्ड भन्दा कम) नीलो प्रकाश उत्तेजनाको प्रतिक्रियामा (चित्र ४m–o)। t-hCO न्यूरोनहरूले क्याल्सियम इमेजिङमा अवलोकन गरिएका जस्तै फ्रिक्वेन्सीहरूमा सहज गतिविधिको विस्फोटहरू प्रदर्शन गरे, साथै प्रकाश चिन्हको अभावमा t-hCO मा प्रदर्शन गरिएको इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल रेकर्डिङहरू (विस्तारित डेटा, चित्र 10c-g)। भिट्रोमा रेकर्ड गरिएको hCO को सम्बन्धित चरणहरूमा कुनै सहज गतिविधि अवलोकन गरिएको थिएन। संवेदी उत्तेजनाहरूद्वारा t-hCO सक्रिय गर्न सकिन्छ कि भनेर मूल्याङ्कन गर्न, हामीले मुसाको जुँगालाई t-hCO बाट छोटकरीमा विचलित गर्यौं (चित्र 4j,m र विस्तारित डेटा, चित्र 10h,k)। अघिल्ला अध्ययनहरू 8,10 अनुसार, t-hCO को एक उपसमूहले जुँगा विक्षेपनको प्रतिक्रियामा बढेको गतिविधि देखायो, जुन डेटालाई अनियमित समय टिकटहरूसँग तुलना गर्दा अवलोकन गरिएको थिएन (चित्र 4k–q र विस्तारित डेटा, चित्र 10h–q)। वास्तवमा, लगभग 54% अप्टो-लेबल गरिएका एकल एकाइहरूले जुँगा उत्तेजना पछि उल्लेखनीय रूपमा बढेको उत्तेजना दर देखाए, लगभग 650 ms मा शिखरमा पुगे (चित्र 4r)। एकसाथ लिँदा, यी तथ्याङ्कहरूले सुझाव दिन्छ कि t-hCO ले उपयुक्त कार्यात्मक इनपुटहरू प्राप्त गर्दछ र वातावरणीय उत्तेजनाहरूद्वारा सक्रिय गर्न सकिन्छ।
त्यसपछि हामीले t-hCO ले मुसाहरूमा व्यवहार नियन्त्रण गर्न सर्किटहरू सक्रिय गर्न सक्छ कि सक्दैन भनेर अनुसन्धान गर्यौं। हामीले पहिले t-hCO न्यूरोनहरूको अक्षहरू मुसाको वरपरका तन्तुहरूमा प्रोजेक्ट गर्छन् कि गर्दैनन् भनेर अनुसन्धान गर्यौं। हामीले hCO लाई EYFP (hChR2-EYFP) मा फ्युज गरिएको hChR2 एन्कोडिङ लेन्टीभाइरसले संक्रमित गर्यौं। ११० दिन पछि, हामीले श्रवण, मोटर, र सोमाटोसेन्सरी कोर्टिसहरू सहित ipsilateral cortical क्षेत्रहरूमा, साथै स्ट्राइटम, हिप्पोक्याम्पस, र थालामस सहित subcortical क्षेत्रहरूमा EYFP अभिव्यक्ति अवलोकन गर्यौं (चित्र ५a)। यी इफरेन्ट प्रक्षेपणहरूले मुसा कोषहरूमा सिन्याप्टिक प्रतिक्रियाहरू उत्पन्न गर्न सक्छन् कि सक्दैनन् भनेर मूल्याङ्कन गर्न, हामीले तीखो मस्तिष्क खण्डहरूमा मुसा सेरेब्रल कोर्टेक्स कोषहरू रेकर्ड गरेर hChR2-EYFP व्यक्त गर्ने t-hCO कोषहरूलाई अप्टिक रूपमा सक्रिय गर्यौं। NBQX द्वारा अवरुद्ध मुसा पिरामिडल कोर्टेक्स न्यूरोनहरूमा नीलो प्रकाश प्रेरित छोटो-विलम्बता EPSCs सँग t-hCO अक्षहरूको सक्रियता, जुन NBQX द्वारा अवरुद्ध गरिएको थियो (चित्र ५b–g)। थप रूपमा, यी प्रतिक्रियाहरूलाई टेट्रोडोटोक्सिन (TTX) द्वारा अवरुद्ध गर्न सकिन्छ र 4-एमिनोपायरिडिन (4-AP) द्वारा पुनर्स्थापित गर्न सकिन्छ, जसले सुझाव दिन्छ कि तिनीहरू मोनोसिन्याप्टिक जडानहरूको कारणले भएको थियो (चित्र 5e)।
a, एक्सन ट्र्याकिङको योजनाबद्ध रेखाचित्र (बायाँ)। t-hCO EYFP अभिव्यक्ति (दायाँ)। स्केल बार, १०० µm। A1, श्रवण कोर्टेक्स, ACC, एन्टेरियर सिङ्गुलेट कोर्टेक्स, d. स्ट्राइटम, डोर्सल स्ट्राइटम, HPC, हिप्पोक्याम्पस; डायाफ्राम, पार्श्व सेप्टम, mPFC, मेडियल प्रिफ्रन्टल कोर्टेक्स, piri, piriform कोर्टेक्स, v. स्ट्राइटम, भेन्ट्रल स्ट्राइटम, VPM, थालामसको भेन्ट्रोपोस्टोमेडियल न्यूक्लियस, VTA, भेन्ट्रल टेगमेन्टल क्षेत्र। रातो वर्गहरूले मस्तिष्कका ती क्षेत्रहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ जहाँ छविहरू लिइएको थियो। b, उत्तेजना प्रयोगको योजनाबद्ध रेखाचित्र। c, d, मानव (c) EYFP+ t-hCO वा मुसा (d) EYFP- कोषहरूमा नीलो प्रकाश-प्रेरित फोटोकरेन्ट (माथि) र भोल्टेज (तल) को प्रतिक्रियाका उदाहरणहरू। e, f, TTX र 4-AR (हरियो), TTX (खैरो) वा aCSF (कालो) (e), (बैजनी) वा बिना (कालो) ) NBQX (e) सहित t-hCO अक्षहरूको नीलो प्रकाश उत्तेजना पछि मुसा न्यूरोनहरूको वर्तमान ट्रेसहरू। g, मुसा कोषहरूमा नीलो प्रकाशद्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाहरूको विलम्बता (n = 16 कोषहरू); तेर्सो बारहरूले औसत विलम्बता (7.13 ms) (बायाँ) लाई संकेत गर्दछ। NBQX (n = ७ कोषहरू; ***P < ०.०००१) (मध्य) सँग वा बिना रेकर्ड गरिएका प्रकाश-उत्पन्न EPSC हरूको आयाम। NBQX (n = ७ कोषहरू; ***P < ०.०००१) (मध्य) सँग वा बिना रेकर्ड गरिएका प्रकाश-उत्पन्न EPSC हरूको आयाम। अम्प्लिटुडा вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (centre मा)। NBQX (n = ७ कोषहरू; ***P < ०.०००१) (केन्द्र) सँग वा बिना रेकर्ड गरिएका प्रकाश-प्रेरित EPSC हरूको आयाम।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）। अम्प्लिटुडा вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (centre मा)। NBQX (n = ७ कोषहरू; ***P < ०.०००१) (केन्द्र) सँग वा बिना रेकर्ड गरिएका प्रकाश-प्रेरित EPSC हरूको आयाम।नीलो प्रकाश (दायाँ) लाई प्रतिक्रिया दिने EPSC हरू देखाउने मुसा कोषहरूको प्रतिशत। h, व्यवहारिक कार्यको योजनाबद्ध रेखाचित्र। d0, दिन 0। i. तालिमको दिन १ (बायाँ) वा दिन १५ (दायाँ) मा अनुकरणीय जनावरहरूको प्रदर्शन। दिन १ (बायाँ) वा दिन १५ (दायाँ केन्द्र) मा गरिएको चाटको औसत संख्या (n = १५० नीलो बत्ती परीक्षणहरू, n = १५० रातो बत्ती परीक्षणहरू; ***P < ०.०००१)। दिन १ (बायाँ) वा दिन १५ (दायाँ केन्द्र) मा गरिएको चाटको औसत संख्या (n = १५० नीलो बत्ती परीक्षणहरू, n = १५० रातो बत्ती परीक्षणहरू; ***P < ०.०००१)। Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) и день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, ситом 150) испытаний с красным светом; ***P <0,0001)। दिन १ (बायाँ) वा दिन १५ (केन्द्र दायाँ) मा गरिएको लिकको औसत संख्या (n = १५० नीलो बत्ती परीक्षणहरू, n = १५० रातो बत्ती परीक्षणहरू; ***P < ०.०००१)।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) и день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, ситом 150) испытаний с красным светом; ***P <0,0001)। दिन १ (बायाँ) वा दिन १५ (केन्द्र दायाँ) मा गरिएको लिकको औसत संख्या (n = १५० नीलो बत्ती परीक्षणहरू, n = १५० रातो बत्ती परीक्षणहरू; ***P < ०.०००१)।दिन १ (बीचमा बायाँ) वा दिन १५ (दायाँ) मा रातो र नीलो प्रकाश परीक्षणहरूको लागि संचयी चाटहरू। NS, महत्त्वपूर्ण छैन। j,k, दिन १ वा १५ मा hChR2-EYFP (j) वा नियन्त्रण फ्लोरोफोर (k) व्यक्त गर्ने t-hCO सँग प्रत्यारोपण गरिएका सबै जनावरहरूको व्यवहारिक विशेषताहरू (hChR2-EYFP: n = ९ मुसा, ** P = ०.००४९; नियन्त्रण: n = ९, P = ०.१४९७)। l, प्राथमिकता स्कोरको विकास (n = 9 hChR2, n = 9 नियन्त्रण; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, प्राथमिकता स्कोरको विकास (n = 9 hChR2, n = 9 नियन्त्रण; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, प्राथमिकता स्कोरको विकास (n = 9 hChR2, n = 9 नियन्त्रणहरू; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, प्राथमिकता स्कोरहरूको विकास (n = 9 hChR2, n = 9 नियन्त्रणहरू; **P < 0.001, ***P < 0.0001)।m, S1 मा t-hCO को अप्टोजेनेटिक सक्रियताको प्रतिक्रियामा FOS अभिव्यक्ति। FOS अभिव्यक्ति (बायाँ), र परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P < 0.05, **P < 0.01 र ***P < 0.001) (दायाँ) को छविहरू देखाइएका छन्। FOS अभिव्यक्ति (बायाँ), र परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P < 0.05, **P < 0.01 र ***P < 0.001) (दायाँ) को छविहरू देखाइएका छन्। Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS अभिव्यक्ति (बायाँ) र परिमाणीकरणका छविहरू (n = 3 प्रति समूह; *P<0.05, **P<0.01, र ***P<0.001) देखाइएका छन् (दायाँ)।显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS अभिव्यक्ति (बायाँ) र परिमाणीकरणका छविहरू (n = 3 प्रति समूह; *P<0.05, **P<0.01, र ***P<0.001) देखाइएका छन् (दायाँ)।स्केल बार, १०० µm। डेटालाई BLA, बेसोलेटरल टन्सिल, MDT, डोर्सोमेडियल थालमिक न्यूक्लियस, PAG, पेरियाक्वेडक्टल ग्रे को औसत ± मानक त्रुटिको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
अन्तमा, हामीले सोध्यौं कि t-hCO ले मुसाको व्यवहारलाई परिमार्जन गर्न सक्छ कि सक्दैन। यो परीक्षण गर्न, हामीले hChR2-EYFP-अभिव्यक्त गर्ने hCO लाई S1 मा प्रत्यारोपण गर्यौं, र ९० दिन पछि, हामीले प्रकाश वितरणको लागि t-hCO मा अप्टिकल फाइबरहरू प्रत्यारोपण गर्यौं। त्यसपछि हामीले मुसाहरूलाई परिमार्जित अपरेट कन्डिसनिङ प्रतिमान (चित्र ५ घन्टा) मार्फत तालिम दियौं। हामीले जनावरहरूलाई व्यवहार परीक्षण कक्षमा राख्यौं र अनियमित रूपमा ५ सेकेन्ड नीलो (४७३ एनएम) र रातो (६३५ एनएम) लेजर उत्तेजनाहरू लागू गर्यौं। यदि जनावरहरूले नीलो प्रकाश उत्तेजनाको समयमा चाटे तर रातो प्रकाश उत्तेजनाको समयमा चाटेनन् भने पानीको इनाम पाए। प्रशिक्षणको पहिलो दिनमा, जनावरहरूले नीलो वा रातो प्रकाशले उत्तेजित हुँदा चाट्नेमा कुनै भिन्नता देखाएनन्। यद्यपि, १५ औं दिनमा, hChR2-EYFP व्यक्त गर्ने hCO सँग प्रत्यारोपण गरिएका जनावरहरूले रातो प्रकाश उत्तेजनाको तुलनामा नीलो प्रकाशले उत्तेजित हुँदा बढी सक्रिय चाट देखाए। चाट्ने व्यवहारमा यी परिवर्तनहरू नियन्त्रण फ्लोरोफोर व्यक्त गर्ने hCO सँग प्रत्यारोपण गरिएका नियन्त्रण जनावरहरूमा अवलोकन गरिएको थिएन (सिकाइ सफलता दर: hChR2 89%, EYFP 0%, चित्र 5i-1 र पूरक भिडियो 2)। यी तथ्याङ्कहरूले सुझाव दिन्छन् कि t-hCO कोषहरूले इनाम खोज्ने व्यवहारलाई उत्तेजित गर्न मुसा न्यूरोनहरूलाई सक्रिय गर्न सक्छन्। यी व्यवहार परिवर्तनहरूमा कुन मुसा t-hCO न्यूरल सर्किटहरू संलग्न हुन सक्छन् भनेर पत्ता लगाउन, हामीले 90 मिनेट पछि प्रशिक्षित जनावरहरू र काटिएका तन्तुहरूमा अप्टोजेनेटिक रूपमा t-hCO सक्रिय गर्यौं। इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीले उत्प्रेरित व्यवहारमा संलग्न धेरै मस्तिष्क क्षेत्रहरूमा गतिविधि-निर्भर FOS प्रोटीनको अभिव्यक्ति प्रकट गर्‍यो, जसमा मध्यवर्ती प्रिफ्रन्टल कोर्टेक्स, मध्यवर्ती थालामस, र पेरियाक्वेडक्टल ग्रे पदार्थ समावेश छ, जुन या त उत्तेजित नियन्त्रण जनावरहरूमा वा जनावरहरूमा व्यक्त गरिएको थियो। चामल। 5m)। सँगै लिँदा, यी तथ्याङ्कहरूले सुझाव दिन्छ कि t-hCO ले व्यवहार चलाउन मुसा न्यूरोनल गतिविधिलाई परिमार्जन गर्न सक्छ।
स्नायु अर्गानोइड्सले मानव विकास र रोग इन भिट्रो अध्ययनको लागि एक आशाजनक प्रणालीको प्रतिनिधित्व गर्दछ, तर तिनीहरू भिभोमा अवस्थित सर्किटहरू बीचको सम्बन्धको अभावले सीमित छन्। हामीले एउटा नयाँ प्लेटफर्म विकास गरेका छौं जसमा हामीले मानव कोशिका विकास र भिभोमा कार्य अध्ययन गर्न इम्युनोकम्प्रोमाइज्ड प्रारम्भिक प्रसवोत्तर मुसाहरूको S1 मा hCO प्रत्यारोपण गरेका छौं। हामीले देखाएका छौं कि t-hCO ले भिट्रोमा अवलोकन नगरिएका परिपक्व कोशिका प्रकारहरू विकास गर्दछ28 र त्यो t-hCO शारीरिक र कार्यात्मक रूपमा मुसाको मस्तिष्कमा एकीकृत हुन्छ। मुसाको स्नायु सर्किटहरूमा t-hCO को एकीकरणले हामीलाई मानव सेलुलर गतिविधि र अध्ययन गरिएको जनावरको व्यवहार बीचको सम्बन्ध स्थापित गर्न अनुमति दियो, जसले देखाउँछ कि t-hCO न्यूरोनहरूले व्यवहारिक प्रतिक्रियाहरू चलाउन मुसाको न्यूरोनल गतिविधिलाई परिमार्जन गर्न सक्छ।
हामीले वर्णन गरेको प्लेटफर्ममा मुसाको दिमागमा मानव कोषहरू प्रत्यारोपण गर्ने सम्बन्धी अघिल्लो अनुसन्धानको तुलनामा धेरै फाइदाहरू छन्। पहिलो, हामीले प्रारम्भिक प्रसवोत्तर मुसाहरूको विकासशील कोर्टेक्समा hCO प्रत्यारोपण गर्यौं, जसले शारीरिक र कार्यात्मक एकीकरणलाई सहज बनाउन सक्छ। दोस्रो, t-hCO MRI अनुगमनले हामीलाई जीवित जनावरहरूमा ग्राफ्ट स्थिति र वृद्धि अध्ययन गर्न अनुमति दियो, जसले हामीलाई दीर्घकालीन बहु-जनावर अध्ययनहरू सञ्चालन गर्न र धेरै hiPS सेल लाइनहरूको विश्वसनीयता स्थापित गर्न अनुमति दियो। अन्तमा, हामीले पृथक एकल कोशिका निलम्बनको सट्टा अक्षुण्ण अर्गानोइडहरू प्रत्यारोपण गर्यौं, जुन मानव कोषहरूको लागि कम विनाशकारी हुन्छन् र मुसाको दिमागमा मानव कोर्टेक्स न्यूरोन्सको एकीकरण र उत्पादनलाई बढावा दिन सक्छन्।
हामी स्वीकार गर्छौं कि यस प्लेटफर्ममा प्रगति भए तापनि, विकासको प्रारम्भिक चरणमा प्रत्यारोपण पछि पनि, अस्थायी, स्थानिय, र क्रस-प्रजाति अवरोधहरूले उच्च निष्ठाका साथ मानव तंत्रिका सर्किटहरूको गठनलाई रोक्छ। उदाहरणका लागि, यो स्पष्ट छैन कि t-hCO मा अवलोकन गरिएको सहज गतिविधिले कोर्टिकल विकासको समयमा अवलोकन गरिएको लयबद्ध गतिविधि जस्तै विकासात्मक फेनोटाइपलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, वा यो t-hCO मा उपस्थित दमनकारी कोशिका प्रकारहरूको अनुपस्थितिको कारणले हो। त्यस्तै, यो स्पष्ट छैन कि t-hCO मा ल्यामिनेशनको अनुपस्थितिले चेन कनेक्टिभिटीलाई कति हदसम्म असर गर्छ30। भविष्यको कामले अन्य कोशिका प्रकारहरू जस्तै मानव माइक्रोग्लिया, मानव एन्डोथेलियल कोशिकाहरू, र GABAergic इन्टरन्यूरनहरूको फरक अनुपातलाई एकीकृत गर्ने कुरामा केन्द्रित हुनेछ जुन एसेम्बली 6 इन भिट्रो प्रयोग गरेर देखाइएको छ, साथै परिवर्तन गरिएको t-hCO मा तंत्रिका एकीकरण र प्रशोधन कसरी हुन सक्छ भनेर बुझ्ने। बिरामीहरूबाट प्राप्त कोशिकाहरूमा ट्रान्सक्रिप्शनल, सिन्याप्टिक र व्यवहारिक स्तरहरू।
समग्रमा, यो इन भिभो प्लेटफर्मले एक शक्तिशाली स्रोतको प्रतिनिधित्व गर्दछ जसले इन भिट्रो मानव मस्तिष्क विकास र रोग अनुसन्धानलाई पूरक बनाउन सक्छ। हामी आशा गर्छौं कि यो प्लेटफर्मले हामीलाई अन्यथा मायावी बिरामी-व्युत्पन्न कोशिकाहरूमा नयाँ स्ट्र्यान्ड-स्तर फेनोटाइपहरू पत्ता लगाउन र नयाँ चिकित्सीय रणनीतिहरू परीक्षण गर्न अनुमति दिनेछ।
हामीले पहिले वर्णन गरिए अनुसार HiPS कोषहरूबाट hCO2.5 उत्पन्न गर्यौं। फिडर तहहरूमा कल्चर गरिएका hiPS कोषहरूबाट hCO उत्पादन सुरु गर्न, hiPS कोषहरूको अक्षुण्ण उपनिवेशहरूलाई डिस्पेस (०.३५ मिलीग्राम/एमएल) प्रयोग गरेर कल्चर डिशहरूबाट हटाइयो र hiPS सेल कल्चर माध्यम भएका डिशहरू भएको अल्ट्रा-लो एट्याचमेन्ट प्लास्टिक कल्चरहरूमा स्थानान्तरण गरियो। (कर्निङ) दुई SMAD अवरोधकहरू डोर्सोमोर्फिन (५ μM; P५४९९, सिग्मा-एल्ड्रिच) र SB-४३१५४२ (१० μM; १६१४, टोक्रिस) र ROCK अवरोधक Y-२७६३२ (१० μM; S१०४९, सेलेकचेम) सँग पूरक गरियो। पहिलो ५ दिनमा, hiPS कोष माध्यम दैनिक परिवर्तन गरियो र डोर्सोमोर्फिन र SB-४३१५४२ थपियो। निलम्बनको छैटौं दिनमा, न्यूरल स्फेरोइडहरूलाई न्यूरोबासल-ए (१०८८८, लाइफ टेक्नोलोजी), भिटामिन ए बिनाको बी-२७ सप्लिमेन्ट (१२५८७, लाइफ टेक्नोलोजी), ग्लुटाम्याक्स (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी), पेनिसिलिन र स्ट्रेप्टोमाइसिन (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी) भएको न्यूरल माध्यममा स्थानान्तरण गरियो र २४ औं दिनसम्म एपिडर्मल ग्रोथ फ्याक्टर (EGF; २० एनजी एमएल−१; आर एन्ड डी सिस्टम्स) र फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फ्याक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल−१; आर एन्ड डी सिस्टम्स) ले पूरक गरियो। दिन २५ देखि दिन ४२ सम्म, माध्यमलाई मस्तिष्कबाट व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फ्याक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल−१, पेप्रोटेक) र न्यूरोट्रोफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल−१; पेप्रोटेक) ले पूरक गरियो जसमा प्रत्येक अर्को दिन मध्यम परिवर्तनहरू गरिन्थ्यो। निलम्बनको छैटौं दिनमा, न्यूरल स्फेरोइडहरूलाई न्यूरोबासल-ए (१०८८८, लाइफ टेक्नोलोजी), भिटामिन ए बिनाको बी-२७ सप्लिमेन्ट (१२५८७, लाइफ टेक्नोलोजी), ग्लुटाम्याक्स (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी), पेनिसिलिन र स्ट्रेप्टोमाइसिन (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी) भएको न्यूरल माध्यममा स्थानान्तरण गरियो र २४ औं दिनसम्म एपिडर्मल ग्रोथ फ्याक्टर (EGF; २० एनजी एमएल−१; आर एन्ड डी सिस्टम्स) र फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फ्याक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल−१; आर एन्ड डी सिस्टम्स) ले पूरक गरियो। दिन २५ देखि दिन ४२ सम्म, माध्यमलाई मस्तिष्कबाट व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फ्याक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल−१, पेप्रोटेक) र न्यूरोट्रोफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल−१; पेप्रोटेक) ले पूरक गरियो जसमा प्रत्येक अर्को दिन मध्यम परिवर्तनहरू गरिन्थ्यो।निलम्बनको छैटौं दिनमा, न्यूरल स्फेरोइडहरूलाई न्यूरोबासल-ए (१०८८८, लाइफ टेक्नोलोजी), भिटामिन ए बिनाको बी-२७ सप्लिमेन्ट (१२५८७, लाइफ टेक्नोलोजी), ग्लुटाम्याक्स (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी), पेनिसिलिन भएको न्यूरल माध्यममा स्थानान्तरण गरियो।и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста; ng/ml; R&D प्रणालीहरू) 24-Go दिन। र स्ट्रेप्टोमाइसिन (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजीज) र २४ दिनसम्म एपिडर्मल ग्रोथ फ्याक्टर (EGF; २० ng/ml; R&D सिस्टम्स) र फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फ्याक्टर २ (FGF2; २० ng/ml; R&D सिस्टम्स) सँग पूरक।२५ देखि ४२ दिनसम्म, मस्तिष्कबाट प्राप्त न्यूरोट्रोफिक कारक (BDNF; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) र न्यूरोट्रोफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) माध्यममा थपियो, प्रत्येक अर्को दिन माध्यम परिवर्तन गर्दै।在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素AB2-7补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基的神经培养基中和链頓टेक्नोलोजीहरू）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D सिस्टम्स）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天।在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a 的 含有 的 第 6 天 将 神经补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 神经 培养 基 中 链霉素 1: 100 Life टेक्नोलोजीहरू） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）笩謇層24. 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-A (10888, लाइफ टेक्नोलोजी), добавку, добавку витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) फ्याक्टोरा रोस्टा (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; छैटौं दिनमा, न्यूरोस्फियर सस्पेन्सनहरूलाई न्यूरोबासल-ए (१०८८८, लाइफ टेक्नोलोजी), भिटामिन ए बिनाको बी-२७ सप्लिमेन्ट (१२५८७, लाइफ टेक्नोलोजी), ग्लुटाम्याक्स (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी), पेनिसिलिन-न्युट्रलाइज्ड स्ट्रेप्टोमाइसिन (१:१००, लाइफ टेक्नोलोजी) भएको पूरकमा स्विच गरियो जसमा एपिडर्मल ग्रोथ फ्याक्टर (EGF; २० एनजी एमएल-१; आर एन्ड डी सिस्टम्स) र फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फ्याक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल-१) १ समावेश गरिएको थियो; R&D प्रणालीहरू) 24-Go दिन। (आर एण्ड डी सिस्टम्स) २४ दिन सम्म।२५ देखि ४२ दिनसम्म, मस्तिष्कबाट प्राप्त न्यूरोट्रोफिक फ्याक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) र न्यूरोट्रोफिक फ्याक्टर ३ (NT3; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) प्रत्येक अर्को दिन कल्चर माध्यममा थपियो। मध्यम एक पटक परिवर्तन गरियो।४३ औं दिनबाट सुरु गर्दै, hCO लाई पूरक नभएको न्यूरोबेसल-ए माध्यम (NM; १०८८०२२, थर्मो फिशर) मा प्रत्येक ४-६ दिनमा मध्यम परिवर्तनको साथ राखिएको थियो। फिडरलेस अवस्थामा कल्चर गरिएका hiPS कोषहरूबाट hCO प्राप्त गर्न, hiPS कोषहरूलाई Accutase (AT-१०४, Innovate Cell Technologies) सँग ३७°C मा ७ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, एकल कोषहरूमा विभाजित गरिएको थियो, र AggreWell 800 प्लेटहरू (३४८१५, STEMCELL Technologies) मा ROCK अवरोधक Y-२७६३२ (१० μM; S१०४९, Selleckchem) सँग पूरक Essential 8 माध्यममा प्रति इनार ३ × १०६ एकल कोषहरूको घनत्वमा प्लेट गरिएको थियो। २४ घण्टा पछि, इनारहरूमा रहेको मिडियालाई डोर्सोमोर्फिन (२.५ μM; P5499, सिग्मा-एल्ड्रिच) र SB-४३१५४२ (१० μM; १६१४) ले पूरक गरिएको Essential 6 मिडिया (A1516401, Life Technologies) भएको मिडियामा माथि र तल पाइपेट गरियो। , Tocrida)। दिन २ देखि ६ सम्म, Essential 6 माध्यमलाई दैनिक डोर्सोमोर्फिन र पूरक SB-४३१५४२ ले प्रतिस्थापन गरियो। छैटौं दिनदेखि, न्यूरोस्फियर सस्पेन्सनहरूलाई न्यूरोबेसल माध्यममा स्थानान्तरण गरियो र माथि वर्णन गरिए अनुसार मर्मत गरियो।
सबै पशु प्रक्रियाहरू स्ट्यानफोर्ड विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु हेरचाह प्रशासनिक समिति (APLAC) द्वारा अनुमोदित पशु हेरचाह दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो। गर्भवती युथिमिक RNU (rnu/+) मुसाहरू (चार्ल्स रिभर ल्याबोरेटरीज) खरिद गरिएको थियो वा राखिएको थियो। जनावरहरूलाई खाना र पानीको साथ १२ घण्टाको प्रकाश-अँध्यारो चक्रमा राखिएको थियो। तीन देखि सात दिन उमेरका नग्न (FOXN1–/–) मुसाका कुकुरहरूलाई काट्नु अघि अपरिपक्व जुँगाको वृद्धिद्वारा पहिचान गरिएको थियो। कुकुरहरू (पुरुष र महिला) लाई २-३% आइसोफ्लुरेनले बेहोस बनाइएको थियो र स्टेरियोट्याक्सिक फ्रेममा राखिएको थियो। ड्युरा मेटरको अखण्डता कायम राख्दै S1 माथि लगभग २-३ मिमी व्यास भएको खोपडीको ट्रेपेनेशन गरिएको थियो। त्यसपछि ड्युरालाई छेड्न क्रेनियोटोमीको ठीक बाहिर ३०-G सुई (लगभग ०.३ मिमी) प्रयोग गर्नुहोस्। त्यसपछि पातलो ३×३ सेमी प्याराफिल्ममा HCO लगाउनुहोस् र अतिरिक्त माध्यम हटाउनुहोस्। २३ G, ४५° सुईमा जोडिएको ह्यामिल्टन सिरिन्ज प्रयोग गरेर, सुईको सबैभन्दा टाढाको छेउमा hCO लाई बिस्तारै तान्नुहोस्। त्यसपछि स्टेरियोट्याक्सिक उपकरणमा जोडिएको सिरिन्ज पम्पमा सिरिन्ज स्थापना गर्नुहोस्। त्यसपछि सुईको टुप्पो ड्युरा (z = ० मिमी) मा पहिले बनाइएको ०.३ मिमी चौडा पङ्चर प्वालमाथि राख्नुहोस् र सुई ड्युरा मेटर A को बीचमा नपुगुन्जेल सिरिन्जलाई १-२ मिमी (z = लगभग –१.५ मिमी) साँघुरो पार्नुहोस्। बाक्लो सिल बनाइन्छ। त्यसपछि सिरिन्जलाई z = -०.५ मिमीमा कोर्टिकल सतहको केन्द्रमा उठाउनुहोस् र प्रति मिनेट १-२ µl को दरमा hCO इन्जेक्सन गर्नुहोस्। hCO इन्जेक्सन पूरा भएपछि, सुईलाई ०.२-०.५ मिमी प्रति मिनेटको दरमा फिर्ता लिइन्छ, छाला सिलाई गरिन्छ, र कुकुरलाई तुरुन्तै पूर्ण निको नभएसम्म न्यानो तताउने प्याडमा राखिन्छ। केही जनावरहरूलाई द्विपक्षीय रूपमा प्रत्यारोपण गरिएको थियो।
सबै पशु प्रक्रियाहरू स्ट्यानफोर्ड विश्वविद्यालय APLAC-अनुमोदित पशु हेरचाह दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो। मुसाहरू (प्रत्यारोपण पछि ६० दिन भन्दा बढी) लाई ५% आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसियाको साथ प्रेरित गरिएको थियो र इमेजिङको क्रममा १-३% आइसोफ्लुरेनले एनेस्थेटाइज गरिएको थियो। दृश्यावलोकनको लागि, अन्तर्राष्ट्रिय इलेक्ट्रिक कम्पनी (IECO) ग्रेडियन्ट ड्राइभको साथ ७ टेस्ला सक्रिय रूपमा ढालिएको तेर्सो बोरहोल स्क्यानर ब्रुकर (ब्रुकर कर्पोरेशन), १२० मिमी (६०० mT/m, १००० T/m/s) को आन्तरिक व्यास भएको ढालिएको ग्रेडियन्ट इन्सर्ट AVANCE प्रयोग गरेर प्रयोग गरिएको थियो। III, आठ-च्यानल बहु-कुण्डली RF र बहु-कोर क्षमताहरू, र साथमा रहेको अनुच्छेद ६.०.१ प्लेटफर्म। रेकर्डिङ ८६ मिमीको आन्तरिक व्यास भएको सक्रिय रूपमा डिकपल्ड भोल्युमेट्रिक RF कोइल र केवल प्राप्त गर्नको लागि चार-च्यानल क्रायो-कूल्ड RF कोइल प्रयोग गरेर गरिएको थियो। अक्षीय २D टर्बो-RARE (दोहोरिने समय = २५०० मिलिसेकेन्ड, प्रतिध्वनि समय = ३३ मिलिसेकेन्ड, २ औसत) १६ स्लाइस क्याप्चरहरू सहित, स्लाइस मोटाई ०.६–०.८ मिमी, २५६ × २५६ नमूनाहरू समावेश गर्दै। संकेतहरू २ सेमीको आन्तरिक व्यास भएको क्वाड्रेचर ट्रान्सीभर भोल्युमेट्रिक आरएफ कोइल प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो (र्‍यापिड एमआर इन्टरनेशनल, एलएलसी)। अन्तमा, ३D रेन्डरिङ र भोल्युम विश्लेषणको लागि बिल्ट-इन इमारिस (बिटप्लेन) सतह अनुमान प्रकार्यहरू प्रयोग गर्नुहोस्। सफल प्रत्यारोपणलाई प्रत्यारोपण गरिएको गोलार्धमा निरन्तर T2-भारित MRI सिग्नलका क्षेत्रहरू गठन गरिएको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो। ग्राफ्ट अस्वीकृतिलाई प्रत्यारोपण गरिएको गोलार्धमा निरन्तर T2-भारित MRI सिग्नलका क्षेत्रहरू उत्पादन नगर्ने ग्राफ्टको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो। सबकोर्टिकल t-hCO लाई पछिल्ला विश्लेषणबाट बहिष्कृत गरिएको थियो।
दुई-फोटोन क्याल्सियम इमेजिङको लागि hCO मा GCaMP6s लाई स्थिर रूपमा व्यक्त गर्न, hiPS कोषहरूलाई pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro बाट संक्रमित गरियो र त्यसपछि एन्टिबायोटिकको चयन गरियो। संक्षेपमा, कोषहरूलाई EDTA सँग अलग गरियो र पोलिब्रिन (५ μg/ml) र १५ μl भाइरसको उपस्थितिमा लगभग ३००,००० कोषहरूको घनत्वमा १ मिलीलीटर आवश्यक ८ माध्यममा निलम्बन गरियो। त्यसपछि कोषहरूलाई ६० मिनेटको लागि सस्पेन्सनमा इन्क्युबेट गरियो र प्रति इनार ५०,००० कोषहरूको घनत्वमा बीउ गरियो। संगम पछि, कोषहरूलाई ५-१० दिनको लागि वा स्थिर कोलोनीहरू देखा नपरेसम्म ५-१० μg ml-१ पुरोमाइसिनले उपचार गरियो। केही परिमार्जनहरू सहित पहिले वर्णन गरिए अनुसार तीव्र hCO संक्रमण गरिएको थियो। संक्षेपमा, दिन ३०-४५ hCO लाई १०० μl स्नायु माध्यम भएको १.५ मिलीलीटर एपेन्डोर्फ माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। त्यसपछि लगभग ९० µl माध्यम हटाइन्छ, ३-६ µl उच्च टाइटर लेन्टीभाइरस (०.५ x १०८ देखि १.२ x १०९ सम्म) ट्यूबमा थपिन्छ, र hCO लाई ३० मिनेटको लागि इन्क्यूबेटरमा स्थानान्तरण गरिन्छ। त्यसपछि प्रत्येक ट्यूबमा ९०-१०० µl माध्यम थप्नुहोस् र ट्यूबहरूलाई रातभर इन्क्यूबेटरमा फिर्ता गर्नुहोस्। भोलिपल्ट, कम संलग्न प्लेटहरूमा ताजा स्नायु माध्यममा hCO स्थानान्तरण गर्नुहोस्। ७ दिन पछि, संक्रमण गुणस्तरको दृश्यावलोकन र मूल्याङ्कनको लागि hCO लाई २४-कुञ्जी गिलासको तल्लो प्लेटहरूमा स्थानान्तरण गरियो। pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE र pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE भेक्टरबिल्डरद्वारा उत्पन्न गरिएको थियो। लेन्टीभाइरस धेरैजसो प्रयोगहरूमा प्रयोग गरिन्छ किनभने यो होस्ट जीनोममा एकीकृत हुन्छ, जसले संक्रमित सेल लाइनहरूमा रिपोर्टर जीन अभिव्यक्तिलाई अनुमति दिन्छ। रेबिज फलो-अपको लागि, दिन ३०-४५ hCO लाई रेबिज-ΔG-eGFP र AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (प्लाज्मिड #६७५२८, एडजिन) सँग सह-संक्रमित गरिएको थियो, ३ दिनसम्म राम्ररी धोइयो, र S1 मा मुसामा प्रत्यारोपण गरियो र ७-१४ दिनसम्म भिभोमा राखिएको थियो।
इम्युनोसाइटोकेमिस्ट्रीको लागि, जनावरहरूलाई बेहोस बनाइयो र PBS र त्यसपछि ४% प्याराफर्मल्डिहाइड (PBS मा PFA; इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी साइन्सेस) ले ट्रान्सकार्डियली पर्फ्युज गरियो। दिमागलाई ४% PFA मा २ घण्टा वा रातभर ४°C मा फिक्स गरियो, PBS मा ३०% सुक्रोजमा ४८-७२ घण्टाको लागि क्रायोप्रिजर्भ गरियो, र १:१ मा इम्बेड गरियो, ३०% सुक्रोज: OCT (Tissue-Tek OCT कम्पाउन्ड ४५८३, Sakura Finetek) र कोरोनल सेक्सनहरू ३० µm मा क्रायोस्टेट (Leica) प्रयोग गरेर बनाइयो। बाक्लो सेक्सनहरूको इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीको लागि, जनावरहरूलाई PBS ले पर्फ्युज गरियो, र मस्तिष्कलाई विच्छेदन गरियो र भाइब्रेटोम (Leica) प्रयोग गरेर ३००-४०० µm मा कोरोनलली सेक्सन गरियो र सेक्सनहरूलाई ३० मिनेटको लागि ४% PFA ले फिक्स गरियो। त्यसपछि क्रायोसेक्शन वा बाक्लो भागहरूलाई PBS ले धोइयो, कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि ब्लक गरियो (१०% सामान्य गधाको सीरम (NDS) र ०.३% ट्राइटन X-१०० PBS मा पातलो) र ४°C मा ब्लकिङ घोलले ब्लक गरियो। - इन्क्युबेशन क्रायोसेक्शनहरूलाई रातभर इन्क्युबेट गरियो र बाक्लो भागहरूलाई ५ दिनको लागि इन्क्युबेट गरियो। प्रयोग गरिएका प्राथमिक एन्टिबडीहरू थिए: एन्टी-न्यूएन (मुसा, १:५००; ab104224, abcam) एन्टी-CTIP2 (मुसा, १:३००; ab18465, abcam), एन्टी-GFAP (खरायो, १:१,०००; Z0334, डाको), एन्टी-GFP (कुखुरा, १:१,०००; GTX13970, GeneTex), एन्टी-HNA (मुसा, १:२००; ab191181, abcam), एन्टी-न्यूएन (खरायो, १:५००; ABN78, मिलिपोर), एन्टी-PDGFRA (खरायो, १:२००; sc-338, सान्ता क्रुज), एन्टी-PPP1R17 (खरायो, १:२००; HPA047819, एटलस एन्टिबडीहरू), एन्टी-RECA-1 (मुसा, १:५०; ab9774, abcam), एन्टी-SCG2 (खरायो, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटिनटेक), एन्टी-SOX9 (खरायो, १:५००; AF3075, R&D प्रणालीहरू), नेट्रिन G1a (खरायो, १:१००; AF1166, R&D प्रणालीहरू), एन्टी-STEM121 (मुसा, १:२००; Y40410, टकारा बायो), एन्टी-SATB2 (मुसा, १:५०; ab51502, abcam), एन्टी-GAD65/67 (खरायो, १:४००; ABN904, मिलिपोर) र एन्टी-IBA1 (खरायो, १:१००; ab5076, abcam)। प्रयोग गरिएका प्राथमिक एन्टिबडीहरू थिए: एन्टी-न्यूएन (मुसा, १:५००; ab104224, abcam) एन्टी-CTIP2 (मुसा, १:३००; ab18465, abcam), एन्टी-GFAP (खरायो, १:१,०००; Z0334, डाको), एन्टी-GFP (कुखुरा, १:१,०००; GTX13970, GeneTex), एन्टी-HNA (मुसा, १:२००; ab191181, abcam), एन्टी-न्यूएन (खरायो, १:५००; ABN78, मिलिपोर), एन्टी-PDGFRA (खरायो, १:२००; sc-338, सान्ता क्रुज), एन्टी-PPP1R17 (खरायो, १:२००; HPA047819, एटलस एन्टिबडीहरू), एन्टी-RECA-1 (मुसा, १:५०; ab9774, abcam), एन्टी-SCG2 (खरायो, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटिनटेक), एन्टी-SOX9 (खरायो, १:५००; AF3075, R&D प्रणालीहरू), नेट्रिन G1a (खरायो, १:१००; AF1166, R&D प्रणालीहरू), एन्टी-STEM121 (मुसा, १:२००; Y40410, Takara Bio), एन्टी-SATB2 (मुसा, १:५०; ab51502, abcam), एन्टी-GAD65/67 (खरायो, १:४००; ABN904, मिलिपोर) र एन्टी-IBA1 (खरायो, १:१००; ab5076, abcam)। Использовались следующие первичные antитела: antи-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), antи-CTIP2 (крысиные, ab06, abcam) एन्टी-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), एन्टी- -GFP (कुरिसा, 1:1000; GTX13970, GeneTex), एन्टी-एचएनए (мышь, 1:200; ab1N198), ab1919 (क्रोलिक, 1:500; ABN78, मिलीपुर), एन्टी-पीडीजीएफआरए (क्रोलिक, 1:200; sc-338, SANTA-KRUZ), एन्टी-PPP1R17 (क्रोलिक, 1:200; HPA047819, एटलस एन्टिबडीज), एन्टी-RECA-1 (m:19, 74, abcam), एन्टी-एससीजी२ (क्रोलिक , १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटिनटेक), एन्टी-एसओएक्स९ (कोजी, १:५००; एएफ३०७५, आर एन्ड डी सिस्टम्स), नेट्रिन जी१ए (कोजी, १:१००, आर१६६; सिस्टम), anti-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) र anti-IBA1 (koza, 1 :100; , AB507)। प्रयोग गरिएका प्राथमिक एन्टिबडीहरू थिए: एन्टी-न्यूएन (मुसा, १:५००; ab१०४२२४, abcam), एन्टी-CTIP२ (मुसा, १:३००; ab१८४६५, abcam), एन्टी-GFAP (खरायो, १:१०००; Z०३३४, डाको), एन्टी-GFP (कुखुरा, १:१०००; GTX१३९७०, GeneTex), एन्टी-HNA (मुसा, १:२००; ab१९११८१, abcam), एन्टी-न्यूएन (खरायो, १:५००; ABN७८, मिलिपोर), एन्टी-PDGFRA (खरायो, १:२००; sc-३३८, सान्ता क्रुज), एन्टी-PPP1R17 (खरायो, १:२००; HPA०४७८१९, एटलस एन्टिबडीहरू), एन्टी-RECA-१ (मुसा, १:५०; ab9774, abcam), एन्टी- SCG2 (खरायो, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटिनटेक), एन्टी-SOX9 (बाख्रा, १:५००; AF3075, R&D प्रणालीहरू), नेट्रिन G1a (बाख्रा, १:१००; AF1166, R&D प्रणालीहरू), एन्टी- STEM121 (मुसा, १:२००; Y40410, टकारा बायो), एन्टी- SATB2 (मुसा, १:५०; ab51502, abcam), एन्टी- GAD65/67 (खरायो, १:४००; ABN904, मिलिपोर) र एन्टी-IBA1 (बाख्रा, १:१००; ab5076, abkam)।使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1:3 00；ab18465, abcam）, 抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GF P（鸡, 1:1,000；GTX13970, GeneTex）,抗HNA（小鼠, 1:200；ab1911 81, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipor）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338, Santa Cruz）, 抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, Atlas抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166,R&D प्रणालीहरू), 抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465, abcam）, 抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GFP（鸡, 1:1,000；GTX13970, GeneTex）,抗HNA（小鼠, 1:200；ab 191181, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipor％弔,抗1: 200;sc-338, सान्ता Cruz）, 抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819, Atlas 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774, abcam）,抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166）, R&0s:R&0;Y40410, Takara Bio), एन्टी-SATB2 (मुसा, १:५०; ab51502, abcam), एन्टी-GAD65/67 (खरायो, १:४००; ABN904, मिलिपुर) र एन्टी-IBA1 (बाख्रा, १:१००; ab5076, abcam)।प्रयोग गरिएका प्राथमिक एन्टिबडीहरू थिए: एन्टी-न्यूएन (मुसा, १:५००; ab104224, abcam), एन्टी-CTIP2 (मुसा, १:३००; ab18465, abcam), एन्टी-GFAP (खरायो, १:१०००; Z0334, डाको)। , एन्टी-GFP (कुखुरा, १:१०००; GTX13970, GeneTex), एन्टी-HNA (मुसा, १:२००; ab191181, abcam), एन्टी-NeuN (खरायो, १:५००; ABN78, मिलिपोर), एन्टी-PDGFRA (खरायो, १:२००; sc-३३८, सान्ता क्रुज), एन्टी-PPP1R17 (खरायो, १:२००; HPA047819, एटलस एन्टिबडी), एन्टी-RECA-1 (मुसा, १:५०; ab9774, abcam), एन्टी-SCG2 (खरायो), १:१००;20357-1-AP, प्रोटिनटेक), एन्टी-SOX9 (कोजा, 1:500; AF3075, R&D प्रणाली), NETRIN G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), ANTI -STEM121, Y40121; Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) र ANTI-IBA1 (koza, 1:100, бакам6)। २०३५७-१-एपी, प्रोटिनटेक), एन्टी-SOX9 (बाख्रा, १:५००; AF3075, R&D प्रणालीहरू), नेट्रिन G1a (बाख्रा, १:१००; AF1166, R&D प्रणालीहरू), एन्टी-STEM121 (मुसा, १:२००; Y40410, टकारा बायो), एन्टी-SATB2 (मुसा, १:५०; ab51502, abcam), एन्टी-GAD65/67 (खरायो, १:४००; ABN904, मिलिपोर), र एन्टी-IBA1 (बाख्रा, १:१००; ab5076, abkam)।त्यसपछि खण्डहरूलाई PBS ले धोइयो र कोठाको तापक्रममा (फ्रोजन सेक्सनहरू) वा ४°C (बाक्लो सेक्सनहरू) मा १ घण्टाको लागि माध्यमिक एन्टिबडीले इन्क्युबेट गरियो। Alexa Fluor माध्यमिक एन्टिबडी (Life Technologies) १:१००० मा पातलो ब्लकिङ सोल्युसन प्रयोग गरियो। PBS ले धोएपछि, न्यूक्लीहरूलाई Hoechst 33258 (Life Technologies) ले दृश्यावलोकन गरियो। अन्तमा, स्लाइडहरूलाई एक्वामाउन्ट (Polysciences) प्रयोग गरेर कभरस्लिपहरू (फिशर साइन्टिफिक) सहितको माइक्रोस्कोपमा राखिएको थियो र छविमा Keyence फ्लोरोसेन्ट माइक्रोस्कोप (BZ-X विश्लेषक) वा Leica TCS SP8 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (Las-X) मा विश्लेषण गरिएको थियो। छविहरूलाई ImageJ कार्यक्रम (Fiji) प्रयोग गरेर प्रशोधन गरिएको थियो। t-hCO र मुसा कोर्टेक्समा मानव न्यूरोन्सको अनुपात मापन गर्न, मुसा कोर्टेक्सको किनारमा वा नजिकै, t-hCO को केन्द्रमा ३८७.५ μm चौडा आयताकार छविहरू लिइयो। ग्राफ्ट मार्जिनहरू तन्तु पारदर्शिता, HNA+ न्यूक्ली, र/वा तन्तु अटोफ्लोरेसेन्सको उपस्थितिमा परिवर्तनहरूको मूल्याङ्कन गरेर निर्धारण गरिएको थियो। प्रत्येक छविमा, NeuN+ र HNA+ कोषहरूको कुल संख्यालाई एउटै क्षेत्रमा NeuN+ कोषहरूको कुल संख्याले भाग गरिएको थियो। छवि समतलमा केन्द्रक भएका कोषहरू मात्र गणना गरिएको छ भनी सुनिश्चित गर्न, गणनामा Hoechst+ पनि भएका कोषहरू मात्र समावेश गरिएका छन्। सांख्यिकीय त्रुटि कम गर्न कम्तिमा १ मिमीले छुट्याइएका दुई छविहरूको औसत निकालिएको थियो।
नमूना सङ्कलन गर्नुभन्दा एक हप्ता अगाडि, hCO प्रत्यारोपण गरिएका जनावरहरूलाई (लगभग ८ महिनाको भिन्नता) अँध्यारो कोठामा राख्नुहोस् जसमा संवेदी उत्तेजना कम गर्न जुँगा काटिएको हुन्छ। पहिले वर्णन गरिएअनुसार केही परिमार्जनहरू सहित न्यूक्लीको अलगाव गरिएको थियो। संक्षेपमा, t-hCO र hCO लाई डिटर्जेन्ट-मेकानिकल सेल लिसिस र २ मिली गिलास टिस्यु ग्राइन्डर (D8938, सिग्मा-एल्ड्रिच/किम्बल) प्रयोग गरेर नष्ट गरिएको थियो। त्यसपछि कच्चा नाभिकहरूलाई ४० µm फिल्टर प्रयोग गरेर फिल्टर गरिएको थियो र सुक्रोज घनत्व ग्रेडियन्ट प्रदर्शन गर्नु अघि ४ डिग्री सेल्सियसमा १० मिनेटको लागि ३२० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। सेन्ट्रीफ्यूगेशन चरण पछि (४ डिग्री सेल्सियसमा २० मिनेटको लागि ३२० ग्राम), नमूनाहरूलाई ०.२ एकाइहरू µl-१ RNase अवरोधक (४० u µl-१, AM2682, एम्बियन) थपेर ०.०४% BSA/PBS मा पुन: निलम्बन गरिएको थियो र ४० µm प्रवाह फिल्टरबाट पार गरिएको थियो। त्यसपछि विच्छेदित केन्द्रकहरूलाई ०.०२% BSA भएको PBS मा पुन: निलम्बन गरियो र क्रोमियम सिंगल सेल ३′ चिपमा लोड गरियो (प्रति लेन ८,००० कोषहरूको अनुमानित रिकभरी)। snRNA-seq पुस्तकालयहरू क्रोमियम सिंगल सेल ३′ GEM, लाइब्रेरी र जेल बीड किट v३ (१०x जीनोमिक्स) को साथ तयार पारिएको थियो। snRNA-seq पुस्तकालयहरू क्रोमियम सिंगल सेल ३′ GEM, लाइब्रेरी र जेल बीड किट v३ (१०x जीनोमिक्स) को साथ तयार पारिएको थियो। Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью क्रोमियम एकल सेल 3′ GEM, पुस्तकालय र जेल मनका किट v3 (10x जेनोमिक्स)। snRNA-seq पुस्तकालयहरू क्रोमियम सिंगल सेल ३′ GEM, लाइब्रेरी र जेल बीड किट v3 (१०x जीनोमिक्स) प्रयोग गरेर तयार पारिएका थिए। snRNA-seq 文库是使用Chromium एकल सेल 3′ GEM, पुस्तकालय र जेल मनका किट v3 (10x जेनोमिक्स) 制备的। snRNA-seq 文库是使用Chromium एकल सेल 3′ GEM, पुस्तकालय र जेल मनका किट v3 (10x जेनोमिक्स) 制备的। Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)। snRNA-seq पुस्तकालय क्रोमियम सिंगल सेल ३′ GEM, लाइब्रेरी र जेल बीड किट v३ (१०x जीनोमिक्स) प्रयोग गरेर तयार पारिएको थियो।विभिन्न नमूनाहरूबाट पुस्तकालयहरू एडमेरा हेल्थद्वारा नोभासेक S4 (इलुमिना) मा जम्मा र अनुक्रमित गरिएको थियो।
प्रत्येक अनुमानित आणविक बारकोडको लागि जीन अभिव्यक्ति स्तरहरू १०x जेनोमिक्स सेलरेन्जर विश्लेषण सफ्टवेयर प्याकेज (संस्करण ६.१.२) प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो। विशेष गरी, पठनहरू मानव (GRCh38, Ensemble, संस्करण ९८) र मुसा (Rnor_6.0, Ensemble, संस्करण १००) सन्दर्भ जीनोमहरूको संयोजन विरुद्ध मिलाइएको थियो जुन mkref आदेशको साथ सिर्जना गरिएको थियो र –include-introns=TRUE आदेशको साथ गणना प्रयोग गरेर परिमाणमा इन्ट्रोन क्षेत्रहरूमा म्याप गरिएका पठनहरू समावेश गर्दछ। t-hCO नमूनाहरूको लागि, मानव केन्द्रकहरू रूढिवादी आवश्यकताको आधारमा पहिचान गरिएको थियो कि सबै म्याप गरिएका पठनहरूको कम्तिमा ९५% मानव जीनोमसँग मेल खान्छ। सबै पछिल्ला विश्लेषणहरू R प्याकेज (संस्करण ४.१.२) Seurat (संस्करण ४.१.१)३२ प्रयोग गरेर सेलरेन्जरबाट फिल्टर गरिएको बारकोड एरे आउटपुटमा गरिएको थियो।
पछिल्ला विश्लेषणमा उच्च गुणस्तरका केन्द्रकहरू मात्र समावेश गरिएको सुनिश्चित गर्न, प्रत्येक नमूनाको लागि पुनरावृत्ति फिल्टरिङ प्रक्रिया लागू गरिएको थियो। पहिलो, १००० भन्दा कम अद्वितीय जीनहरू फेला परेका र कुल माइटोकोन्ड्रियाको २०% भन्दा बढी भएका कम-गुणस्तरका केन्द्रकहरू पहिचान गरी हटाइन्छ। त्यसपछि, कच्चा जीन नम्बर म्याट्रिक्सलाई sctransform(vst.flavor=”v2″) प्रकार्य प्रयोग गरेर नियमित नकारात्मक द्विपदीय प्रतिगमनद्वारा सामान्यीकृत गरिएको थियो, जसले पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर ३००० सबैभन्दा चर जीनहरू पनि पहिचान गर्‍यो। ३० को डेटा सेट आयाम प्रयोग गरेर पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित प्रिन्सिपल कम्पोनेन्ट विश्लेषण (PCA) प्रयोग गरेर माथिल्लो चर जीनहरूमा आयाम घटाइएको थियो (घुँडा साइटहरूको दृश्य निरीक्षणको आधारमा dims = ३० छनोट गरिएको थियो र सबै नमूनाहरू र एन्सेम्बल विश्लेषणहरूको लागि प्रयोग गरिएको थियो)। त्यसपछि हामीले असामान्य रूपमा कम जीन गणना (१० औं प्रतिशतभन्दा कम मध्यस्थता), असामान्य रूपमा उच्च माइटोकोन्ड्रियल जीन गणना (९५ औं प्रतिशतभन्दा माथि मध्यस्थता) को आधारमा जीनहरू वर्गीकृत गर्न पुनरावृत्ति क्लस्टरिङ (रिजोल्युसन = १) को धेरै राउन्डहरू प्रदर्शन गर्यौं कम गुणस्तरका पुटेटिभ कोशिकाहरू पहिचान गर्न र हटाउन। क्लस्टरहरू र/वा DoubletFinder33 प्याकेज प्रयोग गरेर पहिचान गरिएका शंकास्पद जुम्ल्याहाहरूको उच्च अनुपात (९५ औं प्रतिशतभन्दा माथि DoubletFinder स्कोर)। t-hCO नमूनाहरू (n=३) र hCO नमूनाहरू (n=३) छुट्टाछुट्टै एकीकृत गरिएको थियो। माथिका प्यारामिटरहरूसँग IntegrateData प्रकार्यलाई एकीकृत गर्नुहोस्। त्यसपछि माथि वर्णन गरिए अनुसार एकीकृत डेटा सेटको गुणात्मक फिल्टरिङको अर्को चरण प्रदर्शन गरियो।
कम गुणस्तरको कर्नेलहरू हटाएपछि, एकीकृत डेटासेटलाई समूहबद्ध गरियो (रिजोल्युसन = ०.५) र UMAP34 दृश्य उद्देश्यका लागि इम्बेड गरियो। प्रत्येक क्लस्टरको लागि मार्कर जीनहरू सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति डेटाबाट गणना गरिएको पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित FindMarkers प्रकार्य प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो। हामी मार्कर जीन अभिव्यक्ति १९,२०,२१,३५ र एनोटेसनको साथ भ्रूण र वयस्क कोर्टिकल सन्दर्भ डेटासेटहरू संयोजन गरेर प्रमुख कोशिका वर्गहरू पहिचान र वर्गीकृत गर्छौं। विशेष गरी, MKI67 र TOP2A को अभिव्यक्तिद्वारा परिसंचरण पूर्ववर्तीहरू पहिचान गरिएको थियो। प्रोजेनिटर क्लस्टरहरू माइटोटिक ट्रान्सक्रिप्टहरूको अनुपस्थिति, लेट मेटाफेस भ्रूण कोर्टेक्समा वर्णन गरिएको बहुपोटेन्ट ग्लियल प्रोजेनिटर क्लस्टरहरूसँग उच्च ओभरल्याप, र EGFR र OLIG1 अभिव्यक्तिद्वारा परिभाषित गरिएको थियो। हामी लेट रेडियल ग्लियादेखि एस्ट्रोसाइटहरूको परिपक्वतासम्म, एस्ट्रोसाइट भिन्नताका धेरै अवस्थाहरू समेट्न एस्ट्रोसाइट शब्द प्रयोग गर्छौं। एस्ट्रोसाइट क्लस्टरहरूले SLC1A3 र AQP4 को उच्च स्तर व्यक्त गर्छन् र भ्रूण रेडियल ग्लिया र/वा वयस्क एस्ट्रोसाइटहरूको उपप्रकारहरूसँग नक्सा गर्न देखाइएको छ। OPC हरूले PDGFRA र SOX10 व्यक्त गर्छन् भने ओलिगोडेन्ड्रोसाइटहरूले माइलिनेसन मार्करहरू (MOG र MYRF) व्यक्त गर्छन्। ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोनहरू न्यूरोनल ट्रान्सक्रिप्टहरू (SYT1 र SNAP25), GABAergic मार्करहरू (GAD2) को अनुपस्थिति, र NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, वा SATB2 को अभिव्यक्ति द्वारा पहिचान गरिएको थियो। GluN न्यूरोनहरूलाई माथिल्लो (SATB2 अभिव्यक्ति र BCL11B को हानि) र गहिरो (BCL11B अभिव्यक्ति) उपवर्गहरूमा थप विभाजित गरिएको थियो। पुटेटिभ सबप्लेट (SP) न्यूरोनहरूले गहिरो GluN मार्करहरूको अतिरिक्त ST18 र SORCS1 जस्ता ज्ञात SP18 मार्करहरू व्यक्त गर्छन्। कोरोइड प्लेक्सस-जस्तो कोशिकाहरू TTR अभिव्यक्तिद्वारा पहिचान गरिएको थियो, र मेनिन्जियल-जस्तो कोशिकाहरूले फाइब्रोब्लास्ट-सम्बन्धित जीनहरू व्यक्त गरे र सन्दर्भ डेटा सेटको पियल/भास्कुलर कोशिकाहरू म्याप गरे।
t-hCO र hCO उपवर्गहरू बीचको जीन अभिव्यक्तिको भिन्न विश्लेषण Libra R प्याकेज (संस्करण १.०.०) प्रयोग गरेर लागू गरिएका नमूनाहरूमा पुन: उत्पादन गरिएको नयाँ विकसित स्यूडो-ब्याच विधि प्रयोग गरेर गरिएको थियो। विशेष गरी, edgeR लग-सम्भावना परीक्षणहरू (संस्करण ३.३६.०, प्याकेज R) प्रत्येक नमूना प्रतिकृतिको लागि दिइएको सेल वर्गको लागि कोषहरूमा जीनहरूको संख्या संक्षेप गरेर समूहहरूको लागि गरिएको थियो। हीटम्याप भिजुअलाइजेशनको लागि, edgeR (cpm() प्रकार्य) प्रयोग गरेर सामान्यीकृत प्रति मिलियन (CPM) मानहरू गणना गरिन्छ र मापन गरिन्छ (औसत = ०, मानक विचलन = १ प्राप्त गर्न)। उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेटेड t-hCO GluN जीनहरूको जीन ओन्टोलोजी (GO) संवर्धन विश्लेषण गरिएको थियो (बेन्जामिनी-होचबर्गले t-hCO GluN कोषहरूको कम्तिमा १०% मा व्यक्त गरिएको ०.०५ भन्दा कमको P मान सुधार गरिएको थियो र कम्तिमा २ पटक परिवर्तनमा गुणा वृद्धि भएको थियो)। ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 प्रयोग गरेर गरिएको थियो। हामी पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित ToppFun एप प्रयोग गर्छौं र GO-एनोटेटेड हाइपरजियोमेट्रिक परीक्षणहरूबाट गणना गरिएका बेन्जामिनी-होचबर्ग-सुधार गरिएका P-मानहरू रिपोर्ट गर्छौं।
प्राथमिक एकल-कोशिका RNA-seq वा वयस्क snRNA-seq19,20,21,22 को सन्दर्भ अध्ययनबाट एनोटेटेड सेल क्लस्टरहरूसँग हाम्रो snRNA-seq क्लस्टरहरू मिलाउन, हामीले एक जोडी डेटासेट एकीकरण दृष्टिकोण लागू गर्यौं। हामीले डेटासेटहरू बीच क्लस्टर ओभरल्यापहरू एकीकृत गर्न र तुलना गर्न Seurat मा SCTransform (v2) सामान्यीकरण कार्यप्रवाह प्रयोग गर्यौं (माथिको जस्तै प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर)। व्यक्तिगत डेटासेटहरू कम्प्युटेसनल दक्षताको लागि प्रति मूल क्लस्टरमा 500 कोशिकाहरू वा कोरहरू सम्म अनियमित रूपमा सबसेट गरिएको थियो। पहिले वर्णन गरिएको समान दृष्टिकोण प्रयोग गरेर, क्लस्टर ओभरल्यापलाई सन्दर्भ क्लस्टरको लेबलसँग ओभरल्याप गरिएको प्रत्येक पूल गरिएको क्लस्टरमा कोशिकाहरू वा केन्द्रकहरूको अनुपातको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो। GluN हरूलाई थप वर्गीकरण गर्न, हामीले हाम्रो GluN कोशिकाहरूमा सन्दर्भ डेटासेट लेबलहरू तोक्न GluN सबसेट डेटाको लागि Seurat को TransferData कार्यप्रवाह प्रयोग गर्यौं।
t-hCO र hCO नमूनाहरूको विश्वव्यापी ट्रान्सक्रिप्टोमको परिपक्वता स्थितिको मूल्याङ्कन गर्न, हामीले हाम्रा छद्म-बल्क नमूनाहरूलाई BrainSpan/psychENCODE23 सँग तुलना गर्यौं, जसमा मानव मस्तिष्क विकासमा फैलिएको ठूलो RNA अनुक्रम समावेश छ। हामीले गर्भाधानको १० हप्ता पछि र पछि, ५५६७ जीनहरूमा (हाम्रो डेटासँगै) कोर्टिकल नमूनाहरूबाट संयुक्त ढाँचा-सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति म्याट्रिक्समा PCA प्रदर्शन गर्यौं जुन पहिले BrainSpan कोर्टिकल नमूनाहरूमा सक्रिय रूपमा पहिचान गरिएको थियो (घन मोडेल प्रयोग गरेर उमेरद्वारा व्याख्या गरिएको विकासात्मक भिन्नतामा ५०% भन्दा बढीको रूपमा परिभाषित)३८। थप रूपमा, हामीले पहिले वर्णन गरिए अनुसार गैर-नकारात्मक म्याट्रिक्स फ्याक्टराइजेशन प्रयोग गरेर न्यूरोडेभलपमेन्टको प्रमुख ट्रान्सक्रिप्टोम हस्ताक्षरहरूसँग सम्बन्धित जीनहरू निकाल्यौं। गैर-नकारात्मक म्याट्रिक्स फ्याक्टराइजेशन प्रक्रिया प्रयोग गरेर गणना गरिएको नमूना तौलहरू Zhu et al.38 द्वारा वर्णन गरिएका पाँच हस्ताक्षरहरू मध्ये प्रत्येकको लागि विस्तारित डेटाको साथ चित्र ५b मा प्लट गरिएको छ। फेरि, गतिविधिमा निर्भर ट्रान्सक्रिप्शनल मार्करहरू पहिले प्रकाशित अध्ययनहरूबाट लिइएको थियो। विशेष गरी, पूरक तालिका ३ Hrvatin et al.16 बाट दृश्य उत्तेजना पछि माउस भिजुअल कोर्टेक्स snRNA-seq सङ्कलनद्वारा पहिचान गरिएको ग्लुटामेटर्जिक न्यूरोन्समा ERG र LRG उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेट गरिएको थियो। मानव-समृद्ध LRG हरू KCl-सक्रिय मानव भ्रूण मस्तिष्क संस्कृतिहरूबाट प्राप्त गरिएको थियो र उत्तेजना पछि ६ घण्टा कटाई गरिएको थियो, र फिल्टर गरिएका जीनहरू मानिसहरूमा उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेट गरिएको थियो तर मुसाहरूमा होइन (पूरक तालिका ४)। यी जीन सेटहरू प्रयोग गरेर जीन सेट संवर्धनको विश्लेषण एक-तर्फी फिशरको सटीक परीक्षण प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
आइसोफ्लुरेनले मुसालाई बेहोस बनाउनुहोस्, दिमाग निकाल्नुहोस् र चिसो (लगभग ४° सेल्सियस) अक्सिजनयुक्त (९५% O2 र ५% CO2) सुक्रोज घोलमा राख्नुहोस् जसमा २३४ mM सुक्रोज, ११ mM ग्लुकोज, २६ mM NaHCO3, २.५ mM KCl, १.२५ mM। NaH2PO4, १० mM MgSO4 र ०.५ mM CaCl2 (लगभग ३१० mOsm) समावेश छन्। पहिले वर्णन गरिए अनुसार t-hCO3 भएको मुसाको मस्तिष्कको कोरोनल खण्डहरू (३००–४०० µm) Leica VT1200 भाइब्रेटोम प्रयोग गरेर बनाइएको थियो। त्यसपछि खण्डहरूलाई निरन्तर कोठाको तापक्रममा अक्सिजनेशन भएको सेक्सनिङ चेम्बरमा स्थानान्तरण गरियो जसमा aCSF निम्नबाट तयार पारिएको थियो: १० mM ग्लुकोज, २६ mM NaHCO3, २.५ mM KCl, १.२५ mM NaHPO4, १ mM MgSO4, २ mM CaCl2 र १२६ mM NaCl (२९८ mOsm)। रेकर्डिङ गर्नुभन्दा कम्तिमा ४५ मिनेट अघि। खण्डहरूलाई डुबेको चेम्बरमा रेकर्ड गरिएको थियो जहाँ तिनीहरूलाई aCSF (९५% O2 र ५% CO2 शीशी) ले निरन्तर पर्फ्यूज गरिएको थियो। सबै डेटा कोठाको तापक्रममा रेकर्ड गरिएको थियो। t-hCO न्यूरोनहरूलाई १२७ mM पोटासियम ग्लुकोनेट, ८ mM NaCl, ४ mM म्याग्नेसियम ATP, ०.३ mM सोडियम GTP, १० mM HEPES, र ०.६ mM EGTA, pH ७.२, KOH (२९० mOsm) सँग समायोजित आन्तरिक घोलले भरिएको बोरोसिलिकेट गिलास पिपेटले समाप्त गरिएको थियो। पुन: प्राप्तिको लागि, रेकर्डिङ समाधानमा बायोसाइटिन (०.२%) थपियो।
डेटा MultiClamp 700B एम्पलीफायर (आणविक उपकरणहरू) र Digidata 1550B डिजिटाइजर (आणविक उपकरणहरू) प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो, 2 kHz मा कम-पास फिल्टर गरिएको थियो, 20 kHz मा डिजिटाइज गरिएको थियो, र Clampfit (आणविक उपकरणहरू), Origin (OriginPro) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। 2021b, OriginLab)। र अनुकूलन MATLAB प्रकार्यहरू (Mathworks)। JPCalc प्रयोग गरेर जंक्शन क्षमता गणना गरिएको थियो र प्रविष्टिहरू -14 mV को गणना गरिएको मानमा समायोजन गरिएको थियो। अपरेशन IV मा -250 देखि 750 pA सम्म, 10-25 pA चरणहरूमा वर्तमान चरणहरूको श्रृंखला समावेश छ।
पहिले वर्णन गरिएझैं, hCO न्यूरोन्सको प्याच-क्ल्याम्प रेकर्डिङको क्रममा थालामस, सेतो पदार्थ, र S1 एफेरेन्टहरू थैलामोकोर्टिकल स्लाइसहरूमा विद्युतीय रूपमा उत्तेजित भएका थिए। संक्षेपमा, मस्तिष्कलाई १०° कोणमा झुकेको ३D प्रिन्टिङ टेबलमा राखिएको थियो, र मस्तिष्कको अगाडिको भाग ३५° कोणमा काटिएको थियो। त्यसपछि मस्तिष्कलाई काटिएको सतहमा टाँसिएको थियो र खण्ड गरिएको थियो, थैलामोकोर्टिकल फैलिएको अक्षहरूलाई सुरक्षित गर्दै। द्विध्रुवी टंगस्टन इलेक्ट्रोडहरू (०.५ MΩ) दोस्रो माइक्रोम्यानिपुलेटरमा माउन्ट गरिएको थियो र प्रति कोष चार क्षेत्रहरू (भित्री क्याप्सुल, सेतो पदार्थ, S1 र hCO) उत्तेजित गर्न रणनीतिक रूपमा राखिएको थियो। ०.०३–०.१ हर्ट्जमा ३०० µA फासिक उत्तेजना पछि सिन्याप्टिक प्रतिक्रियाहरू रेकर्ड गर्नुहोस्।
hChR2-अभिव्यक्त गर्ने hCO न्यूरोनहरू ४८० nm मा सक्रिय पारिएका थिए र कोषहरू नजिक hChR2 अभिव्यक्ति रेकर्ड गर्न LED (Prizmatix) द्वारा उत्पन्न प्रकाश पल्सहरू ×४० वस्तु (०.९ NA; Olympus) मार्फत लागू गरिएको थियो। प्रकाशित क्षेत्र व्यास लगभग ०.५ मिमी छ र कुल शक्ति १०-२० mW छ। पल्स चौडाइ १० ms मा सेट गरिएको थियो, जुन व्यवहारिक सिकाइ प्रयोगको क्रममा दिइएको पल्ससँग मेल खान्छ। विभिन्न उत्तेजना फ्रिक्वेन्सीहरू १ देखि २० Hz सम्म प्रयोग गरिएको थियो, तर परिमाण निर्धारणको लागि श्रृंखलाको पहिलो पल्स मात्र प्रयोग गरिएको थियो। सिन्याप्टिक अवरोधक वा सहजीकरण मार्गहरूमा प्रभाव कम गर्न रेलहरू बीचको अन्तरालहरू सामान्यतया ३० सेकेन्ड भन्दा लामो हुन्छन्। hChR2 प्रतिक्रिया मोनोसिन्याप्टिक थियो कि भनेर परीक्षण गर्न, हामीले EPSC प्रतिक्रिया गायब नभएसम्म बाथमा TTX (१ μM) लागू गर्यौं, र त्यसपछि ४-एमिनोपायरिडिन (४-AP; १०० μM) लागू गर्यौं। सामान्यतया, LED फायरिङ र EPSC उत्पादन बीच अलि लामो ढिलाइको साथ, केही मिनेट भित्र प्रतिक्रिया फर्काइन्छ। प्रतिक्रिया AMPA रिसेप्टरहरू द्वारा संचालित छ कि छैन भनेर परीक्षण गर्न NBQX (10 μM) प्रयोग गरिएको थियो।
पहिले वर्णन गरिए अनुसार तीव्र hCO खण्डहरू सिर्जना गरिएको थियो। संक्षेपमा, hCO खण्डहरू ४% एगारोजमा इम्बेड गरिएको थियो र १२६ mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM NaH2PO4, १ mM MgSO4, २ mM CaCl2, २६ mM NaHCO3 र १० mM d-(+) -ग्लुकोज भएको कोषहरूमा स्थानान्तरण गरिएको थियो। खण्डहरूलाई Leica VT1200 भाइब्रेटर प्रयोग गरेर कोठाको तापक्रममा २००–३०० µm मा काटिएको थियो र कोठाको तापक्रममा ASF मा भण्डारण गरिएको थियो। त्यसपछि, प्रत्यक्ष स्लाइसस्कोप माइक्रोस्कोप (साइन्टिफिका) अन्तर्गत hCO खण्डहरूमा सम्पूर्ण कोषहरूको प्याच-क्याम्प रेकर्डिङ गरिएको थियो। खण्डहरूलाई aCSF (९५% O2 र ५% CO2) ले पर्फ्यूज गरिएको थियो र कोठाको तापक्रममा सेल संकेतहरू रेकर्ड गरिएको थियो। १२७ एमएम पोटासियम ग्लुकोनेट, ८ एमएम NaCl, ४ एमएम म्याग्नेसियम एटीपी, ०.३ एमएम सोडियम जीटीपी, १० एमएम HEPES, र ०.६ एमएम EGTA, आन्तरिक pH ७, २, KOH (ओस्मोलारिटी २९०) सँग समायोजित गरिएको घोलले भरिएको बोरोसिलिकेट गिलास पिपेट प्रयोग गरेर hCO न्यूरोनहरू लागू गरियो। रिकभरी उद्देश्यका लागि, आन्तरिक घोलमा ०.२% बायोसाइटिन थप्नुहोस्।
क्ल्याम्पेक्स (क्ल्याम्पेक्स ११.१, आणविक उपकरणहरू) द्वारा मल्टीक्ल्याम्प ७००B एम्पलीफायर (आणविक उपकरणहरू) र डिजिडेटा १५५०B डिजिटाइजर (आणविक उपकरणहरू) प्रयोग गरेर डेटा प्राप्त गरिएको थियो, २ kHz मा कम-पास फिल्टर गरिएको थियो, २० kHz मा डिजिटलाइज गरिएको थियो, र विश्लेषणको लागि क्ल्याम्पफिट (संस्करण १०.६) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो, आणविक उपकरणहरू) र अनुकूलन MATLAB प्रकार्यहरू (MATLAB २०१९b, Mathworks)। JPCalc प्रयोग गरेर जंक्शन क्षमता गणना गरिएको थियो र प्रविष्टिहरू -१४ mV को गणना गरिएको जंक्शन क्षमतामा समायोजन गरिएको थियो। अपरेशन IV मा -५० देखि २५० pA सम्म ५-१० pA चरणहरूमा वर्तमान चरणहरूको श्रृंखला समावेश छ।
पिन्च गरिएको न्यूरोन्सको मोर्फोलॉजिकल पुनर्निर्माणको लागि, आन्तरिक घोलमा ०.२% बायोसाइटिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) थपिएको थियो। ह्याकिङ पछि कोषहरू कम्तिमा १५ मिनेटको लागि प्राइम गरिन्छ। त्यसपछि दर्ता गरिएको झिल्ली पूर्ण रूपमा बन्द नभएसम्म पिपेटलाई १-२ मिनेटको लागि बिस्तारै तानिन्छ। सेक्सन फिजियोलोजी प्रक्रिया पछ्याउँदै, सेक्सनहरूलाई ४% PFA मा ४° सेल्सियसमा रातभर फिक्स गरियो, PBS X3 ले धोइयो, र स्ट्रेप्टाभिडिन-कन्जुगेटेड DyLight ५४९ वा DyLight ४०५ (भेक्टर ल्याब्स) सँग १:१००० मा पातलो पारियो। बायोसाइटिन (२%; सिग्मा-एल्ड्रिच) भरिएका कोषहरूलाई कोठाको तापक्रममा प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङको क्रममा २ घण्टाको लागि लेबल गरिएको थियो। त्यसपछि सेक्सनहरूलाई एक्वामाउन्ट (थर्मो साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर माइक्रोस्कोपी स्लाइडहरूमा माउन्ट गरिएको थियो र भोलिपल्ट Leica TCS SP8 कन्फोकल माइक्रोस्कोपमा संख्यात्मक एपर्चर ×४० १.३, म्याग्निफिकेसन ×०.९–१.०, xy भएको तेल इमर्सन उद्देश्य प्रयोग गरेर दृश्यीकरण गरिएको थियो। नमूना दर प्रति माइक्रोन लगभग ७ पिक्सेल छ। १ µm अन्तरालमा Z-स्ट्याकहरू क्रमिक रूपमा प्राप्त गरियो, र प्रत्येक न्यूरोनको सम्पूर्ण डेन्ड्रिटिक रूखलाई ढाक्न z-स्ट्याक मोजाइक र Leica-आधारित स्वत: स्टिचिंग गरियो। त्यसपछि neuTube 40 इन्टरफेस प्रयोग गरेर न्यूरोनहरूलाई अर्ध-म्यानुअल रूपमा ट्र्याक गरियो र SWC फाइलहरू उत्पन्न गरियो। त्यसपछि फाइलहरू SimpleNeuriteTracer41 Fiji प्लगइन (ImageJ, संस्करण 2.1.0; NIH) मा अपलोड गरियो।
स्ट्यानफोर्ड विश्वविद्यालयको संस्थागत समीक्षा बोर्डद्वारा अनुमोदित प्रोटोकल अनुसार सूचित सहमतिमा मानव कोर्टिकल तन्तु प्राप्त गरिएको थियो। रिफ्रेक्टरी एपिलेप्सीको लागि शल्यक्रियाको भागको रूपमा फ्रन्टल कोर्टेक्स (मध्य फ्रन्टल गाइरस) को रिसेक्सनद्वारा मानव प्रसवोत्तर तन्तु (३ र १८ वर्ष पुरानो) को दुई नमूनाहरू प्राप्त गरिएको थियो। रिसेक्सन पछि, बरफ-चिसो NMDG-aCSF मा तन्तु काट्नुहोस् जसमा समावेश छन्: ९२ mM NMDG, २.५ mM KCl, १.२५ mM NaH2PO4, ३० mM NaHCO3, २० mM HEPES, २५ mM ग्लुकोज, २ mM थियोरिया, ५ mM सोडियम एस्कर्बेट, ३ mM ​​सोडियम पाइरुभेट, ०.५ mM CaCl2 ४H२O र १० mM MgSO४ ७H२O। गाढा हाइड्रोक्लोरिक एसिडको साथ pH ७.३-७.४ मा टाइट्रेट गर्नुहोस्। माथि वर्णन गरिएको प्रक्रिया अनुसार टिस्युहरू प्रयोगशालामा ३० मिनेट भित्र पुर्‍याइयो र कोरोनल सेक्सनहरू लिइयो।
सबै जनावर प्रक्रियाहरू स्ट्यानफोर्ड विश्वविद्यालय APLAC-अनुमोदित पशु हेरचाह दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो। मुसाहरू (प्रत्यारोपण पछि १४० दिन भन्दा बढी) लाई ५% आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसियाको साथ प्रेरित गरिएको थियो र १-३% आइसोफ्लुरेनले शल्यक्रियाद्वारा बेहोस पारिएको थियो। जनावरहरूलाई स्टेरियोट्याक्सिक फ्रेम (Kopf) मा राखिएको थियो र निरन्तर रिलीज बुप्रेनोर्फिन (SR) छालाको छालाको छेउमा इंजेक्सन गरिएको थियो। खोपडीलाई खुला गरिएको छ, सफा गरिएको छ र ३-५ हड्डीका स्क्रूहरू घुसाइएको छ। t-hCO लाई लक्षित गर्न, हामीले MRI छविहरूबाट स्टेरियोट्याक्सिक निर्देशांकहरू उत्पन्न गर्यौं। रुचिको ठाउँमा एउटा गड्ढे प्वाल ड्रिल गरिएको थियो र फाइबरहरू (४०० µm व्यास, NA ०.४८, डोरिक) hCO सतहबाट १०० µm तल झारिएको थियो र UV-उपचारयोग्य दन्त सिमेन्ट (Relyx) ले खोपडीमा सुरक्षित गरिएको थियो।
फाइबर फोटोमेट्रिक रेकर्डिङहरू पहिले वर्णन गरिए अनुसार गरियो42। सहज गतिविधि रेकर्ड गर्न, मुसाहरूलाई सफा पिंजडामा राखिएको थियो र फाइबर अप्टिक फोटोमेट्रिक डेटा अधिग्रहण प्रणालीमा जडान गरिएको ४०० µm व्यासको फाइबर अप्टिक प्याच केबल (डोरिक) प्रत्यारोपित फाइबर अप्टिक केबलमा जडान गरिएको थियो। मोटर गतिविधिको १०-मिनेट रेकर्डिङको क्रममा, जनावरहरू पिंजडा अन्वेषण गर्न स्वतन्त्र थिए। उत्तेजित गतिविधि रेकर्ड गर्न, मुसाहरू (प्रत्यारोपण पछि १४० दिन भन्दा बढी) लाई प्रेरणाको लागि ५% आइसोफ्लुरेन र मर्मतसम्भारको लागि १-३% आइसोफ्लुरेनले बेहोस पारिएको थियो। जनावरलाई स्टेरियोट्याक्टिक फ्रेम (Kopf) मा राख्नुहोस् र t-hCO को विपरीत छेउमा रहेको जुँगाहरू लगभग २ सेन्टिमिटरमा काटिन्छन् र पाइजोइलेक्ट्रिक एक्चुएटर (PI) मा जोडिएको जालबाट पार गरिन्छ। ४०० µm फाइबर अप्टिक प्याच केबल (डोरिक) प्रत्यारोपित फाइबरमा जडान गरिएको थियो र डेटा अधिग्रहण प्रणालीमा जडान गरिएको थियो। त्यसपछि t-hCO को विपरीत छेउमा रहेका जुँगाहरूलाई २० मिनेटको रेकर्डिङ अवधिमा पिजोइलेक्ट्रिक ड्राइभद्वारा अनियमित समयमा ५० पटक (२० हर्ट्जमा २ मिमी, प्रति प्रस्तुतीकरण २ सेकेन्ड) विचलित गरियो। अनुकूलन MATLAB कोडको साथ विक्षेपन समय नियन्त्रण गर्न Arduino MATLAB समर्थन प्याकेज प्रयोग गर्नुहोस्। घटनाहरू ट्रान्जिस्टर-ट्रान्जिस्टर तर्क (TTL) पल्स प्रयोग गरेर डेटा अधिग्रहण सफ्टवेयरमा सिङ्क्रोनाइज गरिन्छन्।
प्रत्यारोपण पछि १४० दिन भन्दा बढी समय लागेका मुसाहरूलाई ५% आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसिया दिइयो र शल्यक्रिया मार्फत १-३% आइसोफ्लुरेनले बेहोस बनाइयो। जनावरहरूलाई स्टेरियोट्याक्सिक फ्रेम (कोप्फ) मा राखिएको थियो र बुप्रेनोर्फिन एसआर र डेक्सामेथासोनलाई छालाको छालामा सुई लगाइएको थियो। खोपडीलाई खुला पारिएको थियो, सफा गरिएको थियो र ३-५ हड्डीका स्क्रूहरू घुसाइएका थिए। t-hCO लाई लक्षित गर्न, हामीले MRI छविहरूबाट स्टेरियोट्याक्सिक निर्देशांकहरू उत्पन्न गर्यौं। प्रत्यारोपण गरिएको hCO माथि सिधै उच्च गतिको ड्रिलको साथ गोलाकार क्रेनियोटोमी (लगभग १ सेमी व्यास) गरिएको थियो। हड्डी सकेसम्म पातलो भएपछि, तर सम्पूर्ण हड्डीमा ड्रिल गर्नु अघि, अन्तर्निहित t-hCO प्रकट गर्न बाँकी अक्षुण्ण पेल्भिक डिस्क हटाउन फोर्सेप्स प्रयोग गर्नुहोस्। क्रेनियोटोमी बाँझ नुनले भरिएको थियो, र UV-क्युर गरिएको डेन्टल सिमेन्ट (रेलिक्स) को साथ खोपडीमा कभरस्लिप र विशेष हेड पिन जोडिएको थियो।
Nikon LWD (×१६, ०.८ NA) उद्देश्यको साथ ब्रुकर मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर दुई-फोटन इमेजिङ गरिएको थियो। GCaMP6 इमेजिङ ९२० nm मा १.४x सिंगल z-प्लेन म्याग्निफिकेसन र ८x औसत ७.५ fps सहित गरिएको थियो। मुसाहरूलाई ५% आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसियाको साथ प्रेरित गरिएको थियो र १-३% आइसोफ्लुरेनसँग राखिएको थियो। मुसाहरूलाई अनुकूलित हेड फिक्स्चरमा राखिएको थियो र लेन्स मुनि राखिएको थियो। मोटर गतिविधिको ३-मिनेट पृष्ठभूमि रेकर्डिङ प्राप्त गरिएको थियो। रेकर्डिङको २० मिनेटको अवधिमा, ५० पफहरू (प्रत्येक प्रस्तुति १०० मिलिसेक लामो) पिकोप्राइसर प्रयोग गरेर t-hCO विपरीत व्हिस्कर प्याडमा अनियमित रूपमा डेलिभर गरिएको थियो। अनुकूलन MATLAB कोडको साथ फट्ने समय नियन्त्रण गर्न Arduino MATLAB समर्थन प्याकेज प्रयोग गर्नुहोस्। TTL पल्स प्रयोग गरेर डेटा अधिग्रहण सफ्टवेयर (PrairieView ५.५) सँग घटनाहरू सिङ्क्रोनाइज गर्नुहोस्। विश्लेषणको लागि, फिजीमा सुरु गरिएको MoCo कार्यक्रममा affine सुधार प्रयोग गरेर xy गतिको लागि छविहरू सच्याइयो। CNMF-E43 प्रयोग गरेर व्यक्तिगत कक्षहरूबाट फ्लोरोसेन्ट ट्रेसहरूको निकासी। रुचिको प्रत्येक क्षेत्रको लागि फ्लोरोसेन्स निकालियो, dF/F वक्रहरूमा रूपान्तरण गरियो, र त्यसपछि z-स्कोरहरूमा रूपान्तरण गरियो।
प्रत्यारोपण पछि १४० दिन भन्दा बढी समय लागेका मुसाहरूलाई ५% आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसिया दिइयो र शल्यक्रिया मार्फत १-३% आइसोफ्लुरेनले बेहोस बनाइयो। जनावरहरूलाई स्टेरियोट्याक्सिक फ्रेम (कोप्फ) मा राखिएको थियो र बुप्रेनोर्फिन एसआर र डेक्सामेथासोनलाई छालाको तलतिर इन्जेक्सन गरिएको थियो। t-hCO को विपरीत छेउमा रहेको जुँगालाई लगभग २ सेन्टिमिटरसम्म काटियो र पिजोइलेक्ट्रिक एक्चुएटरसँग जोडिएको जाल मार्फत थ्रेड गरियो। खोपडीलाई खुला र सफा गरिएको छ। खोपडीमा स्टेनलेस स्टील ग्राउन्ड स्क्रू जोडिएको छ। t-hCO लाई लक्षित गर्न, हामीले MRI छविहरूबाट स्टेरियोट्याक्सिक निर्देशांकहरू उत्पन्न गर्यौं। t-hCO माथि उच्च गतिको ड्रिलको साथ गोलाकार क्रेनियोटोमी (लगभग १ सेमी व्यास) गर्नुहोस्। हड्डी सकेसम्म पातलो भएपछि, तर सम्पूर्ण हड्डीमा ड्रिल गर्नु अघि, अन्तर्निहित t-hCO प्रकट गर्न बाँकी अक्षुण्ण पेल्भिक डिस्क हटाउन फोर्सेप्स प्रयोग गर्नुहोस्। व्यक्तिगत कोषहरू ३२-च्यानल वा ६४-च्यानल उच्च-घनत्व सिलिकन प्रोबहरू (क्याम्ब्रिज न्यूरोटेक) प्रयोग गरेर रेकर्ड गरिएका थिए जुन ग्राउन्ड स्क्रूमा ग्राउन्ड गरिएको थियो र RHD एम्पलीफायरहरू (इन्टान) सँग पूर्व-एम्प्लीफाइ गरिएको थियो। क्रेनियोटोमी मार्फत इलेक्ट्रोडहरूलाई लक्षित साइटमा कम गर्न म्यानिपुलेटर प्रयोग गर्नुहोस्, जुन बाँझ सलाइनले भरिएको छ। ओपन इफिस डाटा अधिग्रहण प्रणाली प्रयोग गरेर ३० kHz को फ्रिक्वेन्सीमा डेटा सङ्कलन गरिएको थियो। रेकर्डिङ तब मात्र जारी रह्यो जब हामीले १० भन्दा बढी च्यानलहरूमा अत्यधिक सहसम्बन्धित लयबद्ध सहज गतिविधि पत्ता लगायौं, जसले सुझाव दिन्छ कि इलेक्ट्रोडहरू ग्राफ्टमा अवस्थित थिए (दुई-फोटोन क्याल्सियम इमेजिङ डेटामा आधारित)। मोटर गतिविधिको १०-मिनेट पृष्ठभूमि रेकर्डिङ प्राप्त गरियो। त्यसपछि t-hCO को विपरीत छेउमा रहेका जुँगाहरूलाई २० मिनेटको रेकर्डिङ अवधिमा पिजोइलेक्ट्रिक ड्राइभद्वारा अनियमित समयमा ५० पटक (२० हर्ट्जमा २ मिमी, प्रति प्रस्तुतीकरण २ सेकेन्ड) विचलित गरियो। Arduino (MATLAB २०१९b) को लागि MATLAB समर्थन प्याकेज प्रयोग गरेर, अनुकूलन MATLAB कोडको साथ विक्षेपन समय नियन्त्रण गर्नुहोस्। डेटा अधिग्रहण सफ्टवेयरसँग घटनाहरू सिङ्क्रोनाइज गर्न TTL पल्सहरू प्रयोग गर्नुहोस्।
अप्टिकल मार्किङ प्रयोगहरूको लागि, ४७३ एनएम लेजर (ओमिक्रोन) मा जडान गरिएको २०० µm अप्टिकल प्याच कर्ड (डोरिक) क्रेनियोटोमी माथि राखिएको २०० µm अप्टिकल फाइबरमा जडान गरिएको थियो। यसको तुरुन्तै अघि, जम्पर पावरलाई २० मेगावाटमा समायोजन गर्नुहोस्। क्रेनियोटोमी मार्फत इलेक्ट्रोडहरूलाई लक्षित साइटमा कम गर्न म्यानिपुलेटर प्रयोग गर्नुहोस्, जुन बाँझ सलाइनले भरिएको हुन्छ। रेकर्डिङको सुरुमा, ४७३ एनएम (फ्रिक्वेन्सी २ हर्ट्ज, पल्स अवधि १० एमएस) प्रकाशका दस पल्सहरू उत्सर्जित भएका थिए। फोटोसेन्सिटिभ कोषहरूलाई ७०% वा सोभन्दा बढी परीक्षणहरूमा १० एमएस प्रकाश भित्र स्पाइक प्रतिक्रिया प्रदर्शन गर्ने कोषहरूको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो।