Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
तरल बायोप्सी (LB) बायोमेडिकल क्षेत्रमा द्रुत रूपमा लोकप्रियता प्राप्त गर्ने अवधारणा हो।अवधारणा मुख्यतया परिसंचरण एक्स्ट्रासेलुलर DNA (ccfDNA) को टुक्राहरूको पत्ता लगाउनमा आधारित छ, जुन मुख्य रूपमा विभिन्न ऊतकहरूमा कोशिकाको मृत्यु पछि साना टुक्राहरूको रूपमा जारी गरिन्छ।यी टुक्राहरूको सानो अनुपात विदेशी (विदेशी) ऊतक वा जीवहरूबाट उत्पन्न हुन्छ।हालको काममा, हामीले यो अवधारणालाई झिल्लीहरूमा लागू गरेका छौं, एक सेन्टिनेल प्रजाति जुन तिनीहरूको उच्च समुद्री पानी निस्पंदन क्षमताको लागि परिचित छ।हामी समुद्री तटीय इकोसिस्टमको जैवविविधताको बारेमा जानकारी प्रदान गर्न विभिन्न स्रोतहरूबाट वातावरणीय DNA टुक्राहरू कब्जा गर्न प्राकृतिक फिल्टरको रूपमा काम गर्न सिपीहरूको क्षमता प्रयोग गर्छौं।हाम्रो नतिजाले देखाउँछ कि सिपी हेमोलिम्फले DNA टुक्राहरू समावेश गर्दछ जुन आकारमा 1 देखि 5 kb सम्म भिन्न हुन्छ।शटगन सिक्वेन्सिङले देखायो कि ठूलो संख्यामा डीएनए टुक्राहरू विदेशी माइक्रोबियल मूलका हुन्।ती मध्ये, हामीले ब्याक्टेरिया, पुरातात्विक र भाइरसहरूबाट DNA टुक्राहरू भेट्टायौं, जसमा सामान्यतया तटीय समुद्री इकोसिस्टमहरूमा पाइने विभिन्न प्रकारका होस्टहरूलाई संक्रमित गर्न जानिने भाइरसहरू समावेश छन्।निष्कर्षमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि सीपीहरूमा लागू LB को अवधारणाले समुद्री तटीय इकोसिस्टमहरूमा माइक्रोबियल विविधताको बारेमा ज्ञानको समृद्ध तर अझैसम्म अन्वेषण गरिएको स्रोतलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रको जैविक विविधतामा जलवायु परिवर्तन (CC) को प्रभाव अनुसन्धानको द्रुत रूपमा बढिरहेको क्षेत्र हो।ग्लोबल वार्मिङले महत्त्वपूर्ण शारीरिक तनाव मात्र निम्त्याउँदैन, तर यसले समुद्री जीवहरूको थर्मल स्थिरताको विकासवादी सीमाहरूलाई पनि धकेल्छ, धेरै प्रजातिहरूको बासस्थानलाई असर गर्छ, तिनीहरूलाई थप अनुकूल परिस्थितिहरू खोज्न प्रेरित गर्दछ [1, 2]।मेटाजोआन्सको जैवविविधतालाई असर गर्नुको अतिरिक्त, सीसीले होस्ट-माइक्रोबियल अन्तरक्रियाको नाजुक सन्तुलनमा बाधा पुर्‍याउँछ।यो माइक्रोबियल डिस्ब्याक्टेरियोसिसले समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रको लागि गम्भीर खतरा खडा गर्दछ किनभने यसले समुद्री जीवहरूलाई संक्रामक रोगजनकहरू [3, 4] लाई बढी संवेदनशील बनाउँछ।यो विश्वास गरिन्छ कि एसएसले सामूहिक मृत्युमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, जुन विश्वव्यापी समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रको व्यवस्थापनको लागि गम्भीर समस्या हो [5, 6]।धेरै समुद्री प्रजातिहरूको आर्थिक, पारिस्थितिकी र पोषण प्रभावहरूलाई ध्यानमा राखेर यो महत्त्वपूर्ण मुद्दा हो।यो विशेष गरी ध्रुवीय क्षेत्रहरूमा बस्ने द्विभाल्भहरूको लागि सत्य हो, जहाँ सीकेका प्रभावहरू अधिक तत्काल र गम्भीर हुन्छन् [6, 7]।वास्तवमा, माइटिलस एसपीपी जस्ता द्विभाल्भहरू।समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रमा CC को प्रभावहरू निगरानी गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।अचम्मको कुरा होइन, बायोमार्करहरूको एक अपेक्षाकृत ठूलो संख्यामा तिनीहरूको स्वास्थ्य निगरानी गर्न विकसित गरिएको छ, प्रायः दुई-स्तरीय दृष्टिकोण प्रयोग गरी कार्यात्मक बायोमार्करहरू समावेश गर्दछ जसमा इन्जाइमेटिक गतिविधि वा सेलुलर कार्यहरू जस्तै सेल व्यवहार्यता र फागोसाइटिक गतिविधि [8]।यी विधिहरूमा विशेष दबाव संकेतकहरूको एकाग्रताको मापन पनि समावेश छ जुन ठूलो मात्रामा समुद्री पानीको अवशोषण पछि नरम ऊतकहरूमा जम्मा हुन्छ।यद्यपि, उच्च निस्पंदन क्षमता र बाइभल्भको अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणालीले तरल बायोप्सी (LB) को अवधारणा प्रयोग गरेर नयाँ हेमोलिम्फ बायोमार्करहरू विकास गर्ने अवसर प्रदान गर्दछ, बिरामी व्यवस्थापनको लागि सरल र न्यूनतम आक्रामक दृष्टिकोण।रगत नमूनाहरू [9, 10]।यद्यपि मानव LB मा धेरै प्रकारका परिसंचरण अणुहरू फेला पार्न सकिन्छ, यो अवधारणा मुख्य रूपमा प्लाज्मामा परिसंचरण बाह्य DNA (ccfDNA) टुक्राहरूको DNA अनुक्रम विश्लेषणमा आधारित छ।वास्तवमा, मानव प्लाज्मामा परिसंचरण DNA को उपस्थिति 20 औं शताब्दीको मध्यदेखि थाहा छ [११], तर हालका वर्षहरूमा मात्र उच्च-थ्रुपुट अनुक्रम विधिहरूको आगमनले ccfDNA मा आधारित क्लिनिकल निदानको नेतृत्व गरेको छ।यी परिसंचरण DNA टुक्राहरूको उपस्थिति कोशिकाको मृत्यु पछि जीनोमिक DNA (आणविक र माइटोकोन्ड्रियल) को निष्क्रिय रिलीजको कारण हो। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, ccfDNA को एकाग्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<10 ng/mL) तर विभिन्न रोगहरूबाट पीडित वा तनावमा परेका बिरामीहरूमा 5-10 गुणाले वृद्धि गर्न सकिन्छ, जसको परिणामस्वरूप तन्तु क्षति हुन्छ। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, ccfDNA को एकाग्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<10 ng/mL) तर विभिन्न रोगहरूबाट पीडित वा तनावमा परेका बिरामीहरूमा 5-10 गुणाले वृद्धि गर्न सकिन्छ, जसको परिणामस्वरूप तन्तु क्षति हुन्छ। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныпойтой больныпойтой ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, cccDNA को एकाग्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<10 ng/mL), तर यो विभिन्न रोगविज्ञान वा तनावमा भएका बिरामीहरूमा 5-10 गुणाले बढ्न सक्छ जसले तन्तुलाई क्षति पुर्‍याउँछ।在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, 但在患有各种病理或承受压力渂，但在患有各种病理或承受压力渂从而导致组织损伤।在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 択受 栀受5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павципантымостомотогимости или стрессом, что приводит к повреждению тканей। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा ccfDNA सांद्रता सामान्यतया कम (<10 ng/ml) हुन्छ, तर विभिन्न रोगविज्ञान वा तनाव भएका बिरामीहरूमा 5-10-गुना बढाउन सकिन्छ, जसको परिणामस्वरूप तन्तु क्षति हुन्छ।ccfDNA टुक्राहरूको आकार व्यापक रूपमा भिन्न हुन्छ, तर सामान्यतया 150 देखि 200 bp सम्म हुन्छ।[१२]।आत्म-व्युत्पन्न ccfDNA को विश्लेषण, अर्थात्, सामान्य वा रूपान्तरित होस्ट कोशिकाहरूबाट ccfDNA, आणविक र/वा माइटोकोन्ड्रियल जीनोममा उपस्थित आनुवंशिक र एपिजेनेटिक परिवर्तनहरू पत्ता लगाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा चिकित्सकहरूलाई विशिष्ट आणविक-लक्षित उपचारहरू चयन गर्न मद्दत गर्दछ [१३]।यद्यपि, ccfDNA विदेशी स्रोतहरूबाट प्राप्त गर्न सकिन्छ जस्तै ccfDNA गर्भावस्थाको समयमा भ्रूण कोशिकाहरूबाट वा प्रत्यारोपण गरिएका अंगहरूबाट [14,15,16,17]।ccfDNA संक्रामक एजेन्ट (विदेशी) को न्यूक्लिक एसिडको उपस्थिति पत्ता लगाउनको लागि जानकारीको एक महत्त्वपूर्ण स्रोत पनि हो, जसले रगत संस्कृतिहरूद्वारा पहिचान नगरिएको व्यापक संक्रमणहरूको गैर-आक्रामक पत्ता लगाउन अनुमति दिन्छ, संक्रमित ऊतकको आक्रामक बायोप्सीलाई बेवास्ता गर्दै [१८]।हालैका अध्ययनहरूले वास्तवमा देखाएको छ कि मानव रगतमा जानकारीको समृद्ध स्रोत हुन्छ जुन भाइरल र ब्याक्टेरिया रोगजनकहरू पहिचान गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, र मानव प्लाज्मामा पाइने ccfDNA को लगभग 1% विदेशी मूलको हो [१९]।यी अध्ययनहरूले देखाउँछन् कि जीवको परिसंचरण माइक्रोबायोमको जैव विविधता ccfDNA विश्लेषण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गर्न सकिन्छ।यद्यपि, भर्खरै सम्म, यो अवधारणा विशेष रूपमा मानवहरूमा र कम हदसम्म अन्य कशेरुकाहरूमा प्रयोग भएको थियो [20, 21]।
वर्तमान पत्रमा, हामी एलबी सम्भाव्यता Aulacomya atra को ccfDNA को विश्लेषण गर्न प्रयोग गर्छौं, एक दक्षिणी प्रजाति जो सामान्यतया subantarctic Kerguelen टापुहरूमा पाइन्छ, 35 मिलियन वर्ष पहिले गठन भएको ठूलो पठारमा टापुहरूको समूह।ज्वालामुखी विष्फोटन।इन भिट्रो प्रयोगात्मक प्रणाली प्रयोग गरेर, हामीले फेला पारेको छ कि समुद्री पानीमा डीएनए टुक्राहरू तुरुन्तै शिंपीहरू द्वारा लिइन्छ र हेमोलिम्फ डिब्बामा प्रवेश गर्दछ।शटगन अनुक्रमले देखाएको छ कि सिपी हेमोलिम्फ ccfDNA ले यसको आफ्नै र गैर-स्वयं उत्पत्तिको DNA टुक्राहरू समावेश गर्दछ, सिम्बायोटिक ब्याक्टेरिया र चिसो ज्वालामुखी समुद्री तटीय इकोसिस्टमको विशिष्ट बायोमहरूबाट DNA टुक्राहरू समावेश गर्दछ।Hemolymph ccfDNA ले विभिन्न होस्ट दायरा भएका भाइरसहरूबाट व्युत्पन्न भाइरल अनुक्रमहरू पनि समावेश गर्दछ।हामीले हड्डीको माछा, समुद्री एनिमोन, शैवाल र कीराहरू जस्ता बहुसेलुलर जनावरहरूबाट डीएनए टुक्राहरू पनि भेट्टायौं।निष्कर्षमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रमा एक समृद्ध जीनोमिक भण्डार उत्पन्न गर्न समुद्री इन्भर्टेब्रेट्समा LB अवधारणा सफलतापूर्वक लागू गर्न सकिन्छ।
वयस्कहरू (५५-७० मिमी लामो) माइटिलस प्लाटेन्सिस (एम. प्लाटेन्सिस) र औलाकोम्या अट्रा (ए. एट्रा) पोर्ट-ओ-फ्रान्सको अन्तर-ज्वारीय चट्टानी किनारहरू (०४९°२१.२३५ एस, ०७०°१३.४९० ई.)बाट सङ्कलन गरिएको थियो।डिसेम्बर 2018 मा Kerguelen टापुहरू। अन्य वयस्क नीलो सिपहरू (Mytilus spp.) एक व्यावसायिक आपूर्तिकर्ता (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, क्यानाडा) बाट प्राप्त गरियो र 32‰ ​​कृत्रिम ब्राइनको 10-20 L को तापक्रम नियन्त्रित (4°C) वातित ट्याङ्कीमा राखियो।(कृत्रिम समुद्री नुन रीफ क्रिस्टल, तत्काल महासागर, भर्जिनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका)।प्रत्येक प्रयोगको लागि, व्यक्तिगत गोलाहरूको लम्बाइ र वजन मापन गरियो।
यस कार्यक्रमको लागि निःशुल्क खुला पहुँच प्रोटोकल अनलाइन उपलब्ध छ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)।संक्षेपमा, एलबी हेमोलिम्फ अपहरणकर्ता मांसपेशीहरूबाट वर्णन गरिएको [२२]।हेमोलिम्फलाई 1200xg मा 3 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशन द्वारा स्पष्ट गरिएको थियो, प्रयोग नभएसम्म सुपरनेटेन्ट फ्रिज गरिएको थियो (-20 डिग्री सेल्सियस)।cfDNA को अलगाव र शुद्धीकरणको लागि, नमूनाहरू (1.5-2.0 ml) लाई निर्माताको निर्देशन अनुसार NucleoSnap cfDNA किट (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) को प्रयोग गरेर पगालियो र प्रशोधन गरियो।अर्को विश्लेषण नभएसम्म ccfDNA -80°C मा भण्डारण गरिएको थियो।केही प्रयोगहरूमा, ccfDNA पृथक र QIAamp DNA अन्वेषक किट (QIAGEN, टोरन्टो, ओन्टारियो, क्यानाडा) प्रयोग गरेर शुद्ध गरिएको थियो।शुद्ध DNA मानक PicoGreen परख प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो।पृथक ccfDNA को टुक्रा वितरण एक उच्च संवेदनशीलता DNA किट प्रयोग गरेर Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) को प्रयोग गरेर केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।निर्माताको निर्देशन अनुसार ccfDNA नमूनाको 1 μl प्रयोग गरेर परख गरिएको थियो।
हेमोलिम्फ ccfDNA टुक्राहरूको अनुक्रमको लागि, Génome Québec (Montreal, Quebec, क्यानाडा) ले Illumina MiSeq PE75 किटको Illumina DNA मिक्स किट प्रयोग गरेर शटगन पुस्तकालयहरू तयार गर्यो।एक मानक एडाप्टर (BioO) प्रयोग गरिएको थियो।कच्चा डाटा फाइलहरू NCBI अनुक्रम पढ्नुहोस् अभिलेख (SRR8924808 र SRR8924809) बाट उपलब्ध छन्।FastQC [२३] प्रयोग गरेर आधारभूत पढ्ने गुणस्तरको मूल्याङ्कन गरिएको थियो।Trimmomatic [24] क्लिपिङ एडेप्टर र खराब गुणस्तर पढ्नको लागि प्रयोग गरिएको छ।शटगन रिडहरू जोडा भएका छेउहरूसँग फ्ल्याशलाई बेमेलहरूबाट बच्नको लागि 20 bp को न्यूनतम ओभरल्यापको साथ लामो एकल रिडहरूमा मर्ज गरियो [25]। मर्ज गरिएका पढाइहरू BLASTN सँग bivalve NCBI वर्गीकरण डाटाबेस (e मान <1e−3 र 90% homology) प्रयोग गरेर एनोटेट गरिएको थियो, र कम-जटिलता अनुक्रमहरूको मास्किङ DUST [२६] प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो। मर्ज गरिएका पढाइहरू BLASTN सँग bivalve NCBI वर्गीकरण डाटाबेस (e मान <1e−3 र 90% homology) प्रयोग गरेर एनोटेट गरिएको थियो, र कम-जटिलता अनुक्रमहरूको मास्किङ DUST [२६] प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो। Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых двустворчатых र 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]। NCBI bivalve वर्गीकरण डाटाबेस (e value <1e-3 र 90% homology), र कम जटिलता अनुक्रम मास्किङ DUST [२६] प्रयोग गरेर BLASTN सँग एनोटेट गरिएको थियो।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读买]复杂度序列的掩蔽।使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湰 dust 分类 茡类复杂度 序列 的. . . .掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных -3 र 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]। NCBI bivalve वर्गीकरण डाटाबेस (e value <1e-3 र 90% homology) को प्रयोग गरेर BLASTN सँग पोल गरिएको रिड्स एनोटेट गरिएको थियो, र कम जटिलता अनुक्रम मास्किङ DUST [२६] प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।पढाइहरूलाई दुई समूहमा विभाजन गरिएको थियो: द्विभाल्भ अनुक्रमहरूसँग सम्बन्धित (यहाँ स्व-पढ्ने भनिन्छ) र असंबद्ध (गैर-स्व-पढ्ने)।कन्टिगहरू उत्पन्न गर्न MEGAHIT प्रयोग गरेर दुई समूहहरू अलग-अलग भेला भएका थिए [27]।यसैबीच, एलियन माइक्रोबायोम रिड्सको वर्गीकरण वितरणलाई Kraken2 [२८] प्रयोग गरेर वर्गीकृत गरिएको थियो र ग्यालेक्सी [२९, ३०] मा क्रोना पाई चार्टद्वारा ग्राफिक रूपमा प्रतिनिधित्व गरिएको थियो।हाम्रो प्रारम्भिक प्रयोगहरूबाट इष्टतम kmers-59 हुन निर्धारण गरिएको थियो। सेल्फ कन्टिगहरू त्यसपछि अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (bivalve NCBI डाटाबेस, e मान <1e−10 र 60% homology) सँग पङ्क्तिबद्धताद्वारा पहिचान गरियो। सेल्फ कन्टिगहरू त्यसपछि अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (bivalve NCBI डाटाबेस, e मान <1e−10 र 60% homology) सँग पङ्क्तिबद्धताद्वारा पहिचान गरियो। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN омология 60%) для окончательной аннотации। अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (NCBI bivalve डेटाबेस, e value <1e-10 र 60% homology) सँग मिलाएर स्व-कन्टिगहरू पहिचान गरियो।ब्लास्टन终注释।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)। BLASTN (NCBI bivalve डाटाबेस, e value <1e-10 र 60% homology) सँग मिलाएर अन्तिम एनोटेसनको लागि स्व-कन्टिगहरू पहिचान गरियो। समानान्तरमा, ननसेल्फ ग्रुप कन्टिगहरू BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान <1e−10 र 60% homology) सँग एनोटेट गरिएको थियो। समानान्तरमा, ननसेल्फ ग्रुप कन्टिगहरू BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान <1e−10 र 60% homology) सँग एनोटेट गरिएको थियो। PARALLLEльно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06могиои)। समानान्तरमा, विदेशी समूह कन्टिगहरू BLASTN (NT NCBI डाटाबेस, e मान <1e-10 र 60% homology) सँग एनोटेट गरिएको थियो।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群। Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, e ६०%)। समानान्तरमा, गैर-सेल्फ समूह कन्टिगहरू BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान <1e-10 र 60% homology) सँग एनोटेट गरिएको थियो। BLASTX पनि nr र RefSeq प्रोटीन NCBI डाटाबेसहरू (e value < 1e−10 र 60% homology) को प्रयोग गरेर nonself contigs मा सञ्चालन गरिएको थियो। BLASTX पनि nr र RefSeq प्रोटीन NCBI डाटाबेसहरू (e value < 1e−10 र 60% homology) को प्रयोग गरेर nonself contigs मा सञ्चालन गरिएको थियो। BLASTX ट्याक्स был проведен на несамостоятельных CONTIGAх с использованием баз данных белка nr र RefSeq NCBI (<%1-e06m)। BLASTX nr र RefSeq NCBI प्रोटीन डाटाबेसहरू (e value <1e-10 र 60% homology) प्रयोग गरेर गैर-सेल्फ कन्टिगहरूमा पनि प्रदर्शन गरिएको थियो।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%। BLASTX ट्याक्जे выполняли на несамостоятельных CONTIGAх с использованием баз данных белка nr र RefSeq NCBI (значение e <10логиом %06)। BLASTX nr र RefSeq NCBI प्रोटीन डाटाबेसहरू (e मान <1e-10 र 60% homology) प्रयोग गरेर गैर-सेल्फ कन्टिगहरूमा पनि प्रदर्शन गरिएको थियो।गैर-सेल्फ-कन्टिगहरूको BLASTN र BLASTX पूलहरूले अन्तिम कन्टिगहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ (पूरक फाइल हेर्नुहोस्)।
PCR को लागि प्रयोग गरिने प्राइमरहरू तालिका S1 मा सूचीबद्ध छन्।Taq DNA पोलिमरेज (बायो बेसिक क्यानाडा, मार्कहम, ON) ccfDNA लक्ष्य जीनहरू विस्तार गर्न प्रयोग गरिएको थियो।निम्न प्रतिक्रिया अवस्थाहरू प्रयोग गरियो: 3 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनेटको लागि एनेलिङ तापमान सेट गर्नुहोस्, 1 मिनेटको लागि 72 डिग्री सेल्सियसमा विस्तार गर्नुहोस्, 35 चक्रहरू, र अन्तमा 10 मिनेट भित्र 72 डिग्री सेल्सियस।।PCR उत्पादनहरू इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा एगारोज जेल (1.5%) मा SYBRTM सेफ डीएनए जेल स्टेन (इनभिट्रोजन, बर्लिंगटन, ON, क्यानडा) 95 V मा अलग गरिएको थियो।
मुसलहरू (Mytilus spp.) 500 ml अक्सिजनयुक्त समुद्री पानी (32 PSU) मा 24 घण्टाको लागि 4 डिग्री सेल्सियसमा अनुकूल बनाइयो।मानव galectin-7 cDNA अनुक्रम (NCBI एक्सेस नम्बर L07769) को इन्कोडिङ इन्सर्ट भएको प्लाज्मिड DNA 190 μg/μl को अन्तिम एकाग्रतामा शीशीमा थपियो।DNA थप नगरी उही परिस्थितिमा इन्क्युबेटेड झिल्लीहरू नियन्त्रण थिए।तेस्रो कन्ट्रोल ट्याङ्कीमा झिल्ली बिनाको डीएनए थियो।समुद्री पानीमा DNA को गुणस्तर निगरानी गर्न, समुद्री पानीको नमूनाहरू (20 μl; तीन पुनरावृत्ति) प्रत्येक ट्याङ्कीबाट संकेत गरिएको समयमा लिइयो।प्लाज्मिड DNA ट्रेसेबिलिटीको लागि, LB झिल्लीहरू संकेत गरिएको समयमा काटिएको थियो र qPCR र ddPCR द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।समुद्री पानीमा उच्च नुन सामग्रीको कारणले गर्दा, सबै PCR परीक्षणहरू अघि एलिकोटहरू PCR गुणस्तरको पानी (1:10) मा पातलो गरिएको थियो।
डिजिटल ड्रपलेट PCR (ddPCR) BioRad QX200 प्रोटोकल (मिसिसाउगा, ओन्टारियो, क्यानडा) प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।इष्टतम तापमान (तालिका S1) निर्धारण गर्न तापमान प्रोफाइल प्रयोग गर्नुहोस्।ड्रपहरू QX200 ड्रप जेनेरेटर (BioRad) प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएको थियो।ddPCR निम्नानुसार गरिएको थियो: 5 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकेन्डको लागि 95 डिग्री सेल्सियसको 50 चक्र र 1 मिनेटको लागि दिइएको एनेलिङ तापमान र 30 सेकेन्डको लागि 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनेटको लागि 4 डिग्री सेल्सियस र 5 मिनेट भित्र 90 डिग्री सेल्सियस।QX200 ड्रप रिडर (BioRad) प्रयोग गरेर ड्रप र सकारात्मक प्रतिक्रियाहरूको संख्या (प्रतिलिपि/µl को संख्या) मापन गरियो।१०,००० भन्दा कम थोपा भएका नमूनाहरू अस्वीकार गरियो।प्रत्येक पटक ddPCR चलाउँदा ढाँचा नियन्त्रण गरिएको थिएन।
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) र LGALS7 विशिष्ट प्राइमरहरू प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।QuantiFast SYBR ग्रीन पीसीआर किट (QIAGEN) को प्रयोग गरेर सबै मात्रात्मक पीसीआरहरू 20 μl मा प्रदर्शन गरियो।qPCR 95°C मा 15 मिनेट इन्क्युबेशन र त्यसपछि 40 चक्रहरू 95°C मा 10 सेकेन्ड र 60°C मा 60 सेकेन्डमा एक डेटा सङ्कलन गरेर सुरु गरिएको थियो।qPCR को अन्त्यमा 95°C मा 5 s, 60 s को लागि 65°C, र 97°C मा क्रमिक मापन प्रयोग गरेर पग्लने वक्रहरू उत्पन्न गरियो।प्रत्येक qPCR ट्रिपलीकेटमा प्रदर्शन गरिएको थियो, नियन्त्रण नमूनाहरू बाहेक।
सिपीहरू तिनीहरूको उच्च निस्पंदन दरको लागि चिनिएको हुनाले, हामीले पहिले तिनीहरूले समुद्री पानीमा रहेको डीएनए टुक्राहरू फिल्टर गर्न र राख्न सक्छन् कि भनेर अनुसन्धान गर्‍यौं।यी टुक्राहरू तिनीहरूको अर्ध-खुला लिम्फेटिक प्रणालीमा जम्मा हुन्छन् कि भनेर हामी पनि चासो राख्थ्यौं।हामीले नीलो सिपी ट्यांकहरूमा थपिएका घुलनशील डीएनए टुक्राहरूको भाग्य ट्रेस गरेर प्रयोगात्मक रूपमा यो समस्या समाधान गर्यौं।DNA टुक्राहरूको ट्र्याकिङको सुविधाको लागि, हामीले मानव ग्यालेक्टिन-7 जीन समावेश गर्ने विदेशी (सेल्फ होइन) प्लाज्मिड डीएनए प्रयोग गर्यौं।ddPCR ले समुद्रको पानी र झिल्लीमा प्लाज्मिड डीएनए टुक्राहरू ट्रेस गर्दछ।हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि यदि समुद्रको पानीमा DNA टुक्राहरूको मात्रा समयको साथ तुलनात्मक रूपमा स्थिर रह्यो (7 दिनसम्म) सिंपीहरूको अनुपस्थितिमा, तब झिल्लीहरूको उपस्थितिमा यो स्तर लगभग 8 घण्टा भित्र पूर्ण रूपमा गायब हुन्छ (चित्र 1a,b)।एक्सोजेनस डीएनएका टुक्राहरू इन्ट्राभल्भ्युलर फ्लुइड र हेमोलिम्फ (चित्र 1c) मा 15 मिनेट भित्र सजिलै पत्ता लगाइयो।यी टुक्राहरू अझै पनि एक्सपोजर पछि 4 घण्टा सम्म पत्ता लगाउन सकिन्छ।डीएनए टुक्राहरूको सन्दर्भमा यो फिल्टरिंग गतिविधि ब्याक्टेरिया र शैवाल [31] को फिल्टरिंग गतिविधिसँग तुलना गर्न सकिन्छ।यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि सिपीहरूले आफ्नो तरल पदार्थको डिब्बामा विदेशी डीएनए फिल्टर गर्न र जम्मा गर्न सक्छन्।
समुद्री पानीमा प्लाज्मिड DNA को सापेक्षिक सांद्रता (A) वा झिल्लीहरूको अनुपस्थिति (B) मा, ddPCR द्वारा मापन।A मा, नतिजाहरूलाई प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिन्छ, बक्सहरूको किनाराहरूले 75 औं र 25 औं प्रतिशतलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।फिट लगरिदमिक वक्र रातोमा देखाइएको छ, र खैरो रंगमा छाया गरिएको क्षेत्रले 95% आत्मविश्वास अन्तराललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।B मा, रातो रेखाले औसत र निलो रेखाले एकाग्रताको लागि 95% आत्मविश्वास अन्तराललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।C हेमोलिम्फमा प्लाज्मिड DNA को संचय र प्लाज्मिड DNA थपिए पछि विभिन्न समयमा सिपीहरूको भल्भ्युलर फ्लुइड।नतिजाहरू पत्ता लगाइएका पूर्ण प्रतिलिपिहरू/mL (±SE) को रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ।
अर्को, हामीले केरगुलेन टापुहरूमा सिपीको ओछ्यानबाट सङ्कलन गरिएका सिपीहरूमा ccfDNA को उत्पत्तिको अनुसन्धान गर्‍यौं, सीमित एन्थ्रोपोजेनिक प्रभाव भएका टापुहरूको दुर्गम समूह।यस उद्देश्यको लागि, सिपी hemolymphs बाट cccDNA लाई पृथक गरीएको थियो र सामान्यतया मानव cccDNA शुद्ध गर्न प्रयोग गरिने विधिहरू द्वारा शुद्ध गरिएको थियो [32, 33]।हामीले पत्ता लगायौं कि सिपीहरूमा औसत हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता कम माइक्रोग्राम प्रति एमएल हेमोलिम्फ दायरामा छ (तालिका S2, पूरक जानकारी हेर्नुहोस्)।सांद्रताको यो दायरा स्वस्थ मानिसहरूको तुलनामा धेरै ठूलो छ (कम न्यानोग्राम प्रति मिलिलिटर), तर दुर्लभ अवस्थामा, क्यान्सर रोगीहरूमा, ccfDNA को स्तर प्रति मिलिलिटर धेरै माइक्रोग्राम पुग्न सक्छ [34, 35]।हेमोलिम्फ ccfDNA को आकार वितरणको विश्लेषणले देखायो कि यी टुक्राहरू आकारमा धेरै भिन्न हुन्छन्, 1000 bp देखि 1000 bp सम्म।5000 bp सम्म (चित्र 2)।समान नतिजाहरू सिलिका-आधारित QIAamp अन्वेषक किट प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो, सामान्यतया फोरेंसिक विज्ञानमा प्रयोग गरिने विधि ccfDNA [36] सहित कम एकाग्रता DNA नमूनाहरूबाट जीनोमिक डीएनएलाई द्रुत रूपमा अलग गर्न र शुद्ध गर्न।
सिपी हेमोलिम्फ का प्रतिनिधि ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम।NucleoSnap प्लाज्मा किट (शीर्ष) र QIAamp DNA अन्वेषक किटको साथ निकालिएको।B भायोलिन प्लट सिपीहरूमा hemolymph ccfDNA सांद्रता (±SE) को वितरण देखाउँदै।कालो र रातो रेखाहरूले क्रमशः मध्य र पहिलो र तेस्रो चतुर्थांश प्रतिनिधित्व गर्दछ।
मानव र प्राइमेटहरूमा ccfDNA को लगभग 1% विदेशी स्रोत छ [21, 37]।बाइभल्भको अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणाली, माइक्रोबियल-समृद्ध समुद्री पानी, र सिपी ccfDNA को आकार वितरणलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले परिकल्पना गर्यौं कि mussel hemolymph ccfDNA मा माइक्रोबियल DNA को समृद्ध र विविध पोखरी हुन सक्छ।यो परिकल्पना परीक्षण गर्न, हामीले केरगुलेन टापुहरूबाट सङ्कलन गरिएका Aulacomya atra नमूनाहरूबाट hemolymph ccfDNA क्रमबद्ध गर्यौं, 10 मिलियन भन्दा बढी पढाइहरू, जसमध्ये 97.6% ले गुणस्तर नियन्त्रण पास गर्‍यो।त्यसपछि पढाइहरूलाई BLASTN र NCBI बाइभल्भ डाटाबेसहरू (चित्र S1, पूरक जानकारी) प्रयोग गरेर स्वयम् र गैर-सेल्फ स्रोतहरू अनुसार वर्गीकृत गरियो।
मानवमा, दुवै परमाणु र माइटोकोन्ड्रियल डीएनए रगत प्रवाहमा जारी गर्न सकिन्छ [38]।यद्यपि, हालको अध्ययनमा, सीपीहरूको आणविक जीनोमिक डीएनएलाई विस्तृत रूपमा वर्णन गर्न सम्भव थिएन, किनकि ए एट्रा जीनोमलाई क्रमबद्ध वा वर्णन गरिएको छैन।यद्यपि, हामीले बिभल्भ लाइब्रेरी (चित्र S2, पूरक जानकारी) प्रयोग गरेर आफ्नै उत्पत्तिका धेरै ccfDNA टुक्राहरू पहिचान गर्न सक्षम भयौं।हामीले ती A. atra जीनहरूको निर्देशित PCR प्रवर्धनद्वारा हाम्रो आफ्नै उत्पत्तिको DNA टुक्राहरूको उपस्थिति पुष्टि गर्‍यौं (चित्र 3)।त्यसैगरी, A. atra को माइटोकोन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डाटाबेसमा उपलब्ध छ भनेर, कसैले A. atra को hemolymph मा mitochondrial ccfDNA टुक्राहरूको उपस्थितिको लागि प्रमाण फेला पार्न सक्छ।माइटोकोन्ड्रियल डीएनए टुक्राहरूको उपस्थिति पीसीआर प्रवर्धन (चित्र 3) द्वारा पुष्टि भयो।
A. atra (रातो थोप्ला - स्टक नम्बर: SRX5705969) र M. platensis (नीलो थोप्ला - स्टक नम्बर: SRX5705968) को हेमोलिम्फमा विभिन्न माइटोकोन्ड्रियल जीनहरू थिए।Breton et al., 2011 B एम्प्लीफिकेशन अफ हेमोलिम्फ सुपरनेटान्ट बाट A. Atra FTA पेपरमा भण्डार गरिएको।PCR मिक्स भएको PCR ट्युबमा सिधै थप्नको लागि 3 mm पंच प्रयोग गर्नुहोस्।
समुद्री पानीमा प्रचुर मात्रामा माइक्रोबियल सामग्रीलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले सुरुमा हेमोलिम्फमा माइक्रोबियल डीएनए अनुक्रमहरूको विशेषतामा ध्यान केन्द्रित गर्यौं।यो गर्नको लागि, हामी दुई फरक रणनीतिहरू प्रयोग गर्दछौं।पहिलो रणनीतिले Kraken2 प्रयोग गर्‍यो, एक एल्गोरिथ्म-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम जसले माइक्रोबियल अनुक्रमहरूलाई BLAST र अन्य उपकरणहरूसँग तुलना गर्न सक्ने सटीकतासँग पहिचान गर्न सक्छ [28]।6719 भन्दा बढी रिडहरू ब्याक्टेरिया मूलको हो भनेर निर्धारण गरिएको थियो, जबकि 124 र 64 क्रमशः पुरातात्विक र भाइरसबाट थिए (चित्र 4)।सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा ब्याक्टेरियल डीएनए टुक्राहरू फर्मिक्युट्स (46%), प्रोटोब्याक्टेरिया (27%), र ब्याक्टेरोइडेट्स (17%) (चित्र 4a) थिए।यो वितरण समुद्री नीलो मसल माइक्रोबायोम [39, 40] को अघिल्लो अध्ययनहरूसँग अनुरूप छ।Gammaproteobacteria प्रोटोब्याक्टेरिया (44%) को मुख्य वर्ग थियो, धेरै Vibrionales (चित्र 4b) सहित।ddPCR विधिले A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] को ccfDNA मा Vibrio DNA टुक्राहरूको उपस्थिति पुष्टि गर्‍यो।ccfDNA को ब्याक्टेरिया उत्पत्तिको बारेमा थप जानकारी प्राप्त गर्न, एक अतिरिक्त दृष्टिकोण लिइयो (चित्र S2, पूरक जानकारी)। यस अवस्थामा, ओभरल्याप्डलाई जोडा-अन्तको पढाइको रूपमा भेला गरिएको थियो र BLASTN र 1e−3 को e मान र > 90% homology को साथ कटअफ प्रयोग गरेर सेल्फ (bivalves) वा nonself origin को रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो। यस अवस्थामा, ओभरल्याप्डलाई जोडा-अन्तको पढाइको रूपमा भेला गरिएको थियो र BLASTN र 1e−3 को e मान र > 90% homology को साथ कटअफ प्रयोग गरेर सेल्फ (bivalves) वा nonself origin को रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как совбыстения ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 र отсечения с гомологией> 90%। यस अवस्थामा, ओभरल्यापिङ रीडहरू जोडी-समाप्त रिडहरूको रूपमा सङ्कलन गरियो र BLASTN र 1e-3 को e मान प्रयोग गरेर नेटिभ (बाइभल्भ) वा गैर-मूल रूपमा वर्गीकृत गरियो र > 90% समरूपताको साथ कटअफ।在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 吀为自身（双壳类）或非自身来源।在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 的0% 和 和1 使用 ब्लास्टन 和1>源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身।।।।।।। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы cal и несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN र 1e-3 र порога гомологии> ९०%। यस अवस्थामा, ओभरल्यापिङ पढाइहरू जोडी-समाप्त पढाइहरूको रूपमा सङ्कलन गरिएको थियो र e BLASTN र 1e-3 मानहरू र एक homology थ्रेसहोल्ड> 90% प्रयोग गरेर आफ्नै (bivalves) वा गैर-मौलिक रूपमा वर्गीकृत गरियो।ए. एट्रा जीनोम अझै क्रमबद्ध नभएकोले, हामीले मेगाहिट नेक्स्ट जेनेरेसन सिक्वेन्सिङ (एनजीएस) एसेम्बलरको डे नोवो एसेम्बली रणनीति प्रयोग गर्यौं।कुल 147,188 कन्टिगहरू उत्पत्तिको आश्रित (bivalves) को रूपमा पहिचान गरिएको छ।यी कन्टिगहरू त्यसपछि BLASTN र BLASTX प्रयोग गरेर 1e-10 को ई-मानहरूसँग विस्फोट गरियो।यस रणनीतिले हामीलाई A. atra ccfDNA मा उपस्थित 482 गैर-बाइभल्भ टुक्राहरू पहिचान गर्न अनुमति दियो।यी डीएनए टुक्राहरू मध्ये आधा भन्दा बढी (५७%) ब्याक्टेरियाबाट प्राप्त गरिएको थियो, मुख्यतया सल्फोट्रोफिक सिम्बियोन्टहरू सहित गिल सिम्बियोन्टहरू र गिल सिम्बियोन्ट्स सोलेम्या भेलुम (चित्र 5) बाट।
प्रकार स्तरमा सापेक्ष प्रचुरता।B दुई मुख्य फिला (फिर्मिक्युट्स र प्रोटियोब्याक्टेरिया) को माइक्रोबियल विविधता।ddPCR C Vibrio spp को प्रतिनिधि प्रवर्धन।A. तीन एट्रा हेमोलिम्फहरूमा 16S rRNA जीन (नीलो) को टुक्राहरू।
कुल 482 सङ्कलन कन्टिगहरू विश्लेषण गरियो।मेटाजेनोमिक कन्टिग एनोटेशन (प्रोकारियोट्स र युकेरियोट्स) को वर्गीकरण वितरणको सामान्य प्रोफाइल।B BLASTN र BLASTX द्वारा पहिचान गरिएको ब्याक्टेरिया DNA टुक्राहरूको विस्तृत वितरण।
Kraken2 विश्लेषणले यो पनि देखाएको छ कि मुसल ccfDNA मा पुरातात्विक DNA टुक्राहरू समावेश छन्, जसमा Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), र Thaurmarcheota (11%) (चित्र 6a) समावेश छ।Euryarchaeota र Crenarchaeota बाट व्युत्पन्न DNA टुक्राहरूको उपस्थिति, पहिले क्यालिफोर्नियाली सिपीहरूको माइक्रोबियल समुदायमा फेला पर्यो, आश्चर्यको रूपमा आउनु हुँदैन [42]।यद्यपि Euryarchaeota प्रायः चरम अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित छ, यो अब मान्यता प्राप्त छ कि Euryarchaeota र Crenarcheota दुवै समुद्री क्रायोजेनिक वातावरणमा सबैभन्दा सामान्य प्रोकारियोटहरू हुन् [43, 44]।केरगुलेन पठार [४५] मा तल्लो चुहावटबाट व्यापक मिथेन चुहावट र केरगुलेन टापुहरू [४६] को तटमा परेको सम्भावित माइक्रोबियल मिथेन उत्पादनको भर्खरै रिपोर्टहरू दिएर, सिपीहरूमा मिथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवहरूको उपस्थिति अचम्मको कुरा होइन।
त्यसपछि हाम्रो ध्यान डीएनए भाइरसबाट पढाइमा सर्यो।हाम्रो सबै भन्दा राम्रो ज्ञान को लागी, यो झिल्ली को भाइरस सामग्री को पहिलो अफ-लक्ष्य अध्ययन हो।अपेक्षित रूपमा, हामीले ब्याक्टेरियोफेज (काउडोभाइराल्स) (चित्र 6b) को डीएनए टुक्राहरू फेला पारे।यद्यपि, सबैभन्दा सामान्य भाइरल डीएनए न्यूक्लियोसाइटोभाइरसको फिलमबाट आउँछ, जसलाई न्यूक्लियर साइटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए भाइरस (NCLDV) पनि भनिन्छ, जसमा कुनै पनि भाइरसको सबैभन्दा ठूलो जीनोम हुन्छ।यस फिलम भित्र, धेरै जसो DNA अनुक्रम परिवार Mimimidoviridae (58%) र Poxviridae (21%), जसका प्राकृतिक होस्टहरूमा कशेरुका र आर्थ्रोपोडहरू समावेश छन्, जबकि यी DNA अनुक्रमहरूको एक सानो अनुपात ज्ञात भाइरोलोजिकल शैवालसँग सम्बन्धित छ।समुद्री युकेरियोटिक शैवाललाई संक्रमित गर्दछ।क्रमहरू पान्डोरा भाइरसबाट पनि प्राप्त गरिएको थियो, कुनै पनि ज्ञात भाइरल जेनेराको सबैभन्दा ठूलो जीनोम आकारको विशाल भाइरस।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमणद्वारा निर्धारण गरिए अनुसार भाइरसबाट संक्रमित हुने होस्टहरूको दायरा अपेक्षाकृत ठूलो थियो (चित्र S3, पूरक जानकारी)।यसमा Baculoviridae र Iridoviridae जस्ता कीराहरूलाई संक्रमित गर्ने भाइरसहरू, साथै अमिबा, शैवाल र कशेरुकाहरूलाई सङ्क्रमित गर्ने भाइरसहरू समावेश छन्।हामीले पिथोभाइरस साइबेरिकम जीनोमसँग मिल्ने क्रमहरू पनि फेला पार्यौं।पिटोभाइरस (जसलाई "जोम्बी भाइरस" पनि भनिन्छ) लाई पहिले साइबेरियामा ३०,००० वर्ष पुरानो पर्माफ्रोस्टबाट अलग गरिएको थियो [४७]।तसर्थ, हाम्रा नतिजाहरूले यी भाइरसहरूको सबै आधुनिक प्रजातिहरू विलुप्त छैनन् [४८] र यी भाइरसहरू रिमोट सबार्क्टिक समुद्री इकोसिस्टमहरूमा उपस्थित हुन सक्छन् भनेर देखाउँदै अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ।
अन्तमा, हामीले अन्य बहुसेलुलर जनावरहरूबाट डीएनए टुक्राहरू फेला पार्न सक्छौं कि भनेर जाँच गर्यौं।BLASTN र BLASTX द्वारा nt, nr र RefSeq पुस्तकालयहरू (जीनोमिक र प्रोटीन) सँग कुल 482 विदेशी कन्टिगहरू पहिचान गरिएको थियो।हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि बहुसेलुलर जनावरहरूको ccfDNA को विदेशी टुक्राहरूमा हड्डीको हड्डीको DNA प्रबल हुन्छ (चित्र 5)।कीरा र अन्य प्रजातिका डीएनए टुक्राहरू पनि फेला परेका छन्।डीएनए टुक्राहरूको अपेक्षाकृत ठूलो भाग पहिचान गरिएको छैन, सम्भवतः स्थलीय प्रजातिहरूको तुलनामा जीनोमिक डाटाबेसमा ठूलो संख्यामा समुद्री प्रजातिहरूको कम प्रतिनिधित्वको कारणले [४९]।
हालको पेपरमा, हामी एलबी अवधारणालाई सिपीहरूमा लागू गर्छौं, तर्क गर्दै कि हेमोलिम्फ ccfDNA शट अनुक्रमले समुद्री तटीय इकोसिस्टमको संरचनामा अन्तरदृष्टि प्रदान गर्न सक्छ।विशेष गरी, हामीले फेला पार्‍यौं कि 1) सिपी हेमोलिम्फमा अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (माइक्रोग्राम स्तर) अपेक्षाकृत ठूलो (~ 1-5 kb) परिसंचरण DNA टुक्राहरू छन्;2) यी डीएनए टुक्राहरू स्वतन्त्र र गैर-स्वतन्त्र दुवै हुन् 3) यी डीएनए टुक्राहरूको विदेशी स्रोतहरू मध्ये, हामीले ब्याक्टेरिया, पुरातात्विक र भाइरल डीएनए, साथै अन्य बहुसेलुलर जनावरहरूको डीएनए भेट्टायौं;4) हेमोलिम्फमा यी विदेशी ccfDNA टुक्राहरूको संचय द्रुत रूपमा हुन्छ र सिपीहरूको आन्तरिक फिल्टरिंग गतिविधिमा योगदान गर्दछ।अन्तमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि LB को अवधारणा, जुन अहिलेसम्म मुख्यतया बायोमेडिसिनको क्षेत्रमा लागू गरिएको छ, ज्ञानको धनी तर अनपेक्षित स्रोतलाई एन्कोड गर्दछ जुन सेन्टिनेल प्रजातिहरू र तिनीहरूको वातावरण बीचको अन्तरक्रियालाई राम्रोसँग बुझ्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
प्राइमेटहरू बाहेक, ccfDNA अलगाव स्तनधारी जनावरहरूमा रिपोर्ट गरिएको छ, मुसा, कुकुर, बिरालो र घोडाहरू [50, 51, 52]।यद्यपि, हाम्रो ज्ञानमा, हाम्रो अध्ययन खुला परिसंचरण प्रणालीको साथ समुद्री प्रजातिहरूमा ccfDNA को पत्ता लगाउने र अनुक्रमण गर्ने रिपोर्ट गर्ने पहिलो हो।यो संरचनात्मक विशेषता र सिपीहरूको फिल्टर गर्ने क्षमताले, कम्तिमा आंशिक रूपमा, अन्य प्रजातिहरूको तुलनामा DNA टुक्राहरू परिसंचरणको विभिन्न आकार विशेषताहरू व्याख्या गर्न सक्छ।मानिसमा, रगतमा परिक्रमा गर्ने अधिकांश डीएनए टुक्राहरू 150 देखि 200 bp सम्मको आकारमा साना टुक्राहरू हुन्।167 bp को अधिकतम शिखर संग [34, 53]।DNA टुक्राहरूको सानो तर महत्त्वपूर्ण भाग आकारमा 300 र 500 bp बीचको हुन्छ, र लगभग 5% 900 bp भन्दा लामो हुन्छ।[५४]।यस आकारको वितरणको कारण यो हो कि प्लाज्मामा ccfDNA को मुख्य स्रोत कोशिकाको मृत्युको परिणामको रूपमा हुन्छ, या त कोशिकाको मृत्युको कारण वा स्वस्थ व्यक्तिहरूमा परिसंचरण हेमाटोपोएटिक कोशिकाहरूको नेक्रोसिसको कारण वा क्यान्सर रोगीहरूमा ट्युमर कोशिकाहरूको अपोप्टोसिसको कारणले हुन्छ (सर्कुलेट ट्युमर DNA भनिन्छ)।, ctDNA)।हेमोलिम्फ ccfDNA को आकार वितरण जुन हामीले झिल्लीमा 1000 देखि 5000 bp सम्म पाएका थियौं, यसले सुझाव दिन्छ कि सिपी ccfDNA फरक उत्पत्ति छ।यो एक तार्किक परिकल्पना हो, किनकि सिपीहरूमा अर्ध-खुला भास्कुलर प्रणाली हुन्छ र तिनीहरू माइक्रोबियल जीनोमिक डीएनएको उच्च सांद्रता भएको समुद्री जलीय वातावरणमा बस्छन्।वास्तवमा, एक्सोजेनस डीएनए प्रयोग गरेर हाम्रो प्रयोगशाला प्रयोगहरूले देखाएको छ कि सीपहरू समुद्री पानीमा DNA टुक्राहरू जम्मा गर्छन्, कम्तिमा केही घण्टा पछि तिनीहरू सेल्युलर अपटेक र/वा रिलीज र/वा विभिन्न संस्थाहरूमा भण्डारण पछि अपमानित हुन्छन्।कोशिकाहरूको दुर्लभता (दुवै प्रोकारियोटिक र युकेरियोटिक) लाई दिईएको, इन्ट्राभल्भ्युलर कम्पार्टमेन्टहरूको प्रयोगले स्व-स्रोतहरू र विदेशी स्रोतहरूबाट ccfDNA को मात्रा घटाउनेछ।द्विभाल्भ जन्मजात प्रतिरक्षाको महत्त्व र परिसंचरण फागोसाइट्सको ठूलो संख्यालाई ध्यानमा राख्दै, हामीले थप परिकल्पना गर्यौं कि विदेशी ccfDNA पनि परिसंचरण फागोसाइटहरूमा समृद्ध हुन्छ जसले सूक्ष्मजीवहरू र/वा सेलुलर मलबेको इन्जेसनमा विदेशी DNA जम्मा गर्छ।सँगै लिइएको, हाम्रो परिणामहरूले देखाउँछ कि bivalve hemolymph ccfDNA आणविक जानकारीको एक अद्वितीय भण्डार हो र एक प्रहरी प्रजातिको रूपमा तिनीहरूको स्थितिलाई सुदृढ गर्दछ।
हाम्रो डेटाले संकेत गर्दछ कि ब्याक्टेरिया-व्युत्पन्न हेमोलिम्फ ccfDNA टुक्राहरूको अनुक्रम र विश्लेषणले होस्ट ब्याक्टेरियल फ्लोरा र वरपरको समुद्री पारिस्थितिकी तंत्रमा रहेको ब्याक्टेरियाको बारेमा मुख्य जानकारी प्रदान गर्न सक्छ।शट सिक्वेन्सिङ प्रविधिहरूले कमेन्सल ब्याक्टेरिया ए. एट्रा गिलका अनुक्रमहरू पत्ता लगाएका छन् जुन सन्दर्भ पुस्तकालय पूर्वाग्रहको कारणले गर्दा परम्परागत 16S rRNA पहिचान विधिहरू प्रयोग गरिएको भए छुटेको थियो।वास्तवमा, Kerguelen मा एउटै सिपी तहमा M. platensis बाट सङ्कलन गरिएको LB डेटाको हाम्रो प्रयोगले गिल-सम्बन्धित ब्याक्टेरियल सिम्बियोन्टहरूको संरचना दुवै सिपी प्रजातिहरूको लागि समान थियो भनेर देखाएको छ (चित्र S4, पूरक जानकारी)।दुई आनुवंशिक रूपमा फरक झिल्लीहरूको यो समानताले चिसो, गन्धक, र ज्वालामुखी जम्मा Kerguelen [55, 56, 57, 58] मा ब्याक्टेरिया समुदायहरूको संरचना प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।बायोटर्बेटेड तटीय क्षेत्रहरू [५९], जस्तै पोर्ट-ओ-फ्रान्सको तटबाट सिपीहरू फसल गर्दा सल्फर-कम गर्ने सूक्ष्मजीवहरूको उच्च स्तर राम्रोसँग वर्णन गरिएको छ।अर्को सम्भावना यो हो कि कमेन्सल सिपी फ्लोरा तेर्सो प्रसारण [60, 61] द्वारा प्रभावित हुन सक्छ।सामुद्रिक वातावरण, समुद्रीतलाको सतह र झिल्लीमा सिम्बायोटिक ब्याक्टेरियाको संरचना बीचको सम्बन्ध निर्धारण गर्न थप अनुसन्धान आवश्यक छ।यी अध्ययनहरू हाल जारी छन्।
हेमोलिम्फ ccfDNA को लम्बाइ र एकाग्रता, यसको शुद्धिकरणको सहजता, र द्रुत शटगन अनुक्रमलाई अनुमति दिन उच्च गुणस्तर समुद्री तटीय इकोसिस्टमहरूमा जैव विविधताको मूल्याङ्कन गर्न सिपी ccfDNA प्रयोग गर्ने धेरै फाइदाहरू मध्ये केही हुन्।यो दृष्टिकोण विशेष गरी दिइएको इकोसिस्टम [62, 63] मा भाइरल समुदाय (viromes) को विशेषता को लागी प्रभावकारी छ।ब्याक्टेरिया, पुरातात्विक र युकेरियोट्सको विपरीत, भाइरल जीनोमहरूमा 16S अनुक्रमहरू जस्ता फाइलोजेनेटिक रूपमा संरक्षित जीनहरू हुँदैनन्।हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि सिपहरू जस्ता सूचक प्रजातिहरूबाट लिक्विड बायोप्सीहरू अपेक्षाकृत ठूलो संख्यामा ccfDNA भाइरस टुक्राहरू पहिचान गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ जुन सामान्यतया तटीय समुद्री इकोसिस्टममा बस्ने होस्टहरूलाई संक्रमित गर्न जानिन्छ।यसमा प्रोटोजोआ, आर्थ्रोपड, कीरा, बोटबिरुवा र ब्याक्टेरिया भाइरस (जस्तै, ब्याक्टेरियोफेज) लाई संक्रमित गर्न जान्ने भाइरसहरू समावेश छन्।हामीले Kerguelen (तालिका S2, पूरक जानकारी) मा एउटै झिल्ली तहमा सङ्कलन गरिएको नीलो सिपहरू (M. platensis) को hemolymph ccfDNA virome को जाँच गर्दा त्यस्तै वितरण फेला पर्‍यो।ccfDNA को शटगन अनुक्रमण वास्तवमा मानव वा अन्य प्रजातिहरूको भाइरोमको अध्ययनमा गति प्राप्त गर्ने नयाँ दृष्टिकोण हो [21, 37, 64]।यो दृष्टिकोण विशेष गरी डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए भाइरसहरूको अध्ययनको लागि उपयोगी छ, किनकि बाल्टीमोर [65] मा सबैभन्दा विविध र व्यापक वर्गको भाइरसहरूको प्रतिनिधित्व गर्ने सबै डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए भाइरसहरू बीच कुनै एकल जीन सुरक्षित गरिएको छैन।यद्यपि यी धेरैजसो भाइरसहरू अवर्गीकृत रहन्छन् र भाइरल संसारको पूर्ण रूपमा अज्ञात भागका भाइरसहरू समावेश हुन सक्छन् [६६], हामीले ए. एट्रा र एम. प्लाटेन्सिस सिपीहरूको भाइरोमहरू र होस्ट दायराहरू दुई प्रजातिहरू बीचमा परेको फेला पारेका छौं।त्यसै गरी (चित्र S3, अतिरिक्त जानकारी हेर्नुहोस्)।यो समानता अचम्मको कुरा होइन, किनकि यसले वातावरणमा रहेको DNA को ग्रहण गर्ने क्षमताको कमीलाई प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।शुद्ध आरएनए प्रयोग गरेर भविष्यका अध्ययनहरू हाल आरएनए भाइरोमको विशेषता बनाउन आवश्यक छ।
हाम्रो अध्ययनमा, हामीले कोवार्स्की र सहकर्मीहरू [37] को कामबाट अनुकूलित एक धेरै कठोर पाइपलाइन प्रयोग गर्‍यौं, जसले नेटिभ ccfDNA को एसेम्बली अघि र पछि पूल गरिएको रिड्स र कन्टिगहरूको दुई-चरण मेटाउने प्रयोग गर्‍यो, नतिजा नपुगेको पढाइको उच्च अनुपातमा।तसर्थ, हामी इन्कार गर्न सक्दैनौं कि यी अनम्याप गरिएका केही पाठहरूको अझै पनि आफ्नै उत्पत्ति हुन सक्छ, मुख्य रूपमा किनभने हामीसँग यस सिपी प्रजातिको सन्दर्भ जीनोम छैन।हामीले यो पाइपलाइन पनि प्रयोग गर्‍यौं किनभने हामी सेल्फ र गैर-सेल्फ रिडहरू र Illumina MiSeq PE75 द्वारा उत्पन्न गरिएको पढ्ने लम्बाइहरू बीचको काइमेराहरू बारे चिन्तित थियौं।बहुसंख्यक अज्ञात पठनहरूको अर्को कारण यो हो कि धेरै समुद्री जीवाणुहरू, विशेष गरी दुर्गम क्षेत्रहरू जस्तै केरगुलेन, एनोटेट गरिएको छैन।हामीले Illumina MiSeq PE75 को प्रयोग गर्यौं, मानव ccfDNA जस्तै ccfDNA खण्ड लम्बाइ मान्दै।भविष्यका अध्ययनहरूका लागि, हेमोलिम्फ ccfDNA ले मानिस र/वा स्तनपायीहरू भन्दा लामो पढेको देखाउने हाम्रो नतिजाहरू दिएर, हामी लामो ccfDNA टुक्राहरूको लागि अझ उपयुक्त अनुक्रमणिका प्लेटफर्म प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं।यस अभ्यासले गहिरो विश्लेषणका लागि थप सङ्केतहरू पहिचान गर्न धेरै सजिलो बनाउनेछ।हाल अनुपलब्ध पूर्ण A. atra आणविक जीनोम अनुक्रम प्राप्त गर्नाले स्वयं र गैर-स्व स्रोतहरूबाट ccfDNA को भेदभावलाई पनि धेरै सहज बनाउनेछ।हाम्रो अनुसन्धानले तरल बायोप्सीको अवधारणालाई शिंपीहरूमा लागू गर्ने सम्भावनामा केन्द्रित भएको कुरालाई ध्यानमा राख्दै, हामी आशा गर्छौं कि यो अवधारणा भविष्यको अनुसन्धानमा प्रयोग हुने भएकाले, नयाँ औजार र पाइपलाइनहरू यस विधिको सम्भाव्यता बढाउनको लागि विकास गरिनेछ।समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र।
एक गैर-आक्रामक क्लिनिकल बायोमार्करको रूपमा, ccfDNA को उच्च मानव प्लाज्मा स्तरहरू विभिन्न रोगहरू, ऊतक क्षति, र तनाव अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित छन् [67,68,69]।यो वृद्धि ऊतक क्षति पछि यसको आफ्नै मूल को डीएनए टुक्राहरु को रिलीज संग सम्बन्धित छ।हामीले तीव्र गर्मी तनाव प्रयोग गरेर यस मुद्दालाई सम्बोधन गर्‍यौं, जसमा सिपीहरू संक्षिप्त रूपमा 30 डिग्री सेल्सियसको तापक्रममा परेका थिए।हामीले यस विश्लेषणलाई तीनवटा स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा तीन फरक प्रकारका मुसलहरूमा प्रदर्शन गर्यौं।यद्यपि, हामीले तीव्र गर्मी तनाव पछि ccfDNA स्तरहरूमा कुनै परिवर्तन फेला पारेनौं (चित्र S5, अतिरिक्त जानकारी हेर्नुहोस्)।यो आविष्कारले कम्तिमा पनि आंशिक रूपमा, यो तथ्यलाई व्याख्या गर्न सक्छ कि सीपहरू अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणाली हुन्छ र तिनीहरूको उच्च फिल्टरिंग गतिविधिको कारणले ठूलो मात्रामा विदेशी डीएनए जम्मा हुन्छ।अर्कोतर्फ, सिपीहरू, धेरै इन्भर्टेब्रेटहरू जस्तै, तनाव-प्रेरित ऊतक क्षतिको लागि अधिक प्रतिरोधी हुन सक्छ, जसले गर्दा तिनीहरूको हेमोलिम्फमा ccfDNA को रिलीज सीमित हुन्छ [70, 71]।
आज सम्म, जलीय पारिस्थितिक प्रणाली मा जैव विविधता को DNA विश्लेषण मुख्य रूप देखि पर्यावरण DNA (eDNA) metabarcoding मा केन्द्रित छ।यद्यपि, यो विधि सामान्यतया जैविक विविधता विश्लेषणमा सीमित हुन्छ जब प्राइमरहरू प्रयोग गरिन्छ।शटगन सिक्वेन्सिङको प्रयोगले PCR को सीमितता र प्राइमर सेटहरूको पक्षपाती चयनलाई बेवास्ता गर्छ।यसरी, एक अर्थमा, हाम्रो विधि भर्खरै प्रयोग गरिएको उच्च-थ्रुपुट ईडीएनए शटगन अनुक्रमण विधिको नजिक छ, जुन सीधा टुक्रा DNA अनुक्रम गर्न र लगभग सबै जीवहरूको विश्लेषण गर्न सक्षम छ [72, 73]।यद्यपि, त्यहाँ धेरै आधारभूत मुद्दाहरू छन् जसले LB लाई मानक eDNA विधिहरूबाट अलग गर्छ।निस्सन्देह, eDNA र LB बीचको मुख्य भिन्नता प्राकृतिक फिल्टर होस्टहरूको प्रयोग हो।eDNA को अध्ययन को लागी एक प्राकृतिक फिल्टर को रूप मा स्पन्ज र bivalves (Dresseina spp.) को रूप मा समुद्री प्रजातिहरु को प्रयोग रिपोर्ट गरिएको छ [74, 75]।यद्यपि, ड्रेसेनाको अध्ययनले टिस्यु बायोप्सीहरू प्रयोग गर्‍यो जसबाट डीएनए निकालिएको थियो।LB बाट ccfDNA को विश्लेषणलाई टिश्यु बायोप्सी, ईडीएनए वा टिस्यु बायोप्सीसँग सम्बन्धित विशेष र कहिलेकाहीँ महँगो उपकरण र रसदको आवश्यकता पर्दैन।वास्तवमा, हामीले भर्खरै रिपोर्ट गरेका छौं कि LB बाट ccfDNA कोल्ड चेन कायम नगरी FTA समर्थनको साथ भण्डारण र विश्लेषण गर्न सकिन्छ, जुन दुर्गम क्षेत्रहरूमा अनुसन्धानको लागि ठूलो चुनौती हो [76]।तरल बायोप्सीबाट ccfDNA को निकासी पनि सरल छ र शटगन अनुक्रम र PCR विश्लेषणको लागि उच्च गुणस्तरको DNA प्रदान गर्दछ।ईडीएनए विश्लेषण [७७] सँग सम्बन्धित केही प्राविधिक सीमितताहरू दिएर यो ठूलो फाइदा हो।नमूना विधिको सरलता र कम लागत पनि दीर्घकालीन अनुगमन कार्यक्रमहरूको लागि विशेष रूपमा उपयुक्त छ।तिनीहरूको उच्च फिल्टरिङ क्षमताको अतिरिक्त, bivalves को अर्को प्रसिद्ध विशेषता भनेको तिनीहरूको म्यूकसको रासायनिक म्यूकोपोलिसेकराइड संरचना हो, जसले भाइरसहरूको अवशोषणलाई बढावा दिन्छ [78, 79]।यसले जैविक विविधता र दिइएको जलीय पारिस्थितिक प्रणालीमा जलवायु परिवर्तनको प्रभावलाई चित्रण गर्नका लागि द्विभाल्भहरूलाई एक आदर्श प्राकृतिक फिल्टर बनाउँछ।यद्यपि होस्ट-व्युत्पन्न DNA टुक्राहरूको उपस्थिति eDNA को तुलनामा विधिको सीमितताको रूपमा देख्न सकिन्छ, eDNA को तुलनामा यस्तो नेटिभ ccfDNA भएकोसँग सम्बन्धित लागत स्वास्थ्य अध्ययनहरूको लागि उपलब्ध जानकारीको विशाल मात्राको लागि एकै साथ बुझ्न सकिन्छ।अफसेट होस्ट।यसमा होस्ट होस्टको जीनोममा एकीकृत भाइरल अनुक्रमहरूको उपस्थिति समावेश छ।यो बिभल्भ्स [80, 81] मा तेर्सो रूपमा प्रसारित ल्यूकेमिक रेट्रोभाइरसहरूको उपस्थिति दिएर, सिपीहरूको लागि विशेष गरी महत्त्वपूर्ण छ।eDNA मा LB को अर्को फाइदा यो हो कि यसले हेमोलिम्फमा रक्त कोशिकाहरू परिसंचरण गर्ने फागोसाइटिक गतिविधिको शोषण गर्दछ, जसले सूक्ष्मजीवहरू (र तिनीहरूको जीनोमहरू) लाई घेर्छ।Phagocytosis bivalves [82] मा रक्त कोशिकाहरूको मुख्य कार्य हो।अन्तमा, विधिले झिल्लीको उच्च फिल्टरिङ क्षमता (औसत 1.5 l/h समुद्री पानी) र दुई-दिनको परिसंचरणको फाइदा लिन्छ, जसले समुद्री पानीको विभिन्न तहहरूको मिश्रणलाई बढाउँछ, जसले heterologous eDNA कब्जा गर्न अनुमति दिन्छ।[८३, ८४]।तसर्थ, सिपीको पोषण, आर्थिक, र वातावरणीय प्रभावहरूलाई ध्यानमा राखेर सिपी ccfDNA विश्लेषण एउटा रोचक माध्यम हो।मानिसबाट सङ्कलन गरिएको एलबीको विश्लेषण जस्तै, यो विधिले बाह्य पदार्थहरूको प्रतिक्रियामा होस्ट डीएनएमा आनुवंशिक र एपिजेनेटिक परिवर्तनहरू मापन गर्ने सम्भावना पनि खोल्छ।उदाहरणका लागि, नेटिभ ccfDNA मा nanopore sequencing को प्रयोग गरेर जीनोम-वाइड मेथिलेसन विश्लेषण गर्न तेस्रो-पुस्ताको अनुक्रमण प्रविधिहरू परिकल्पना गर्न सकिन्छ।यो प्रक्रियालाई सहजै छ कि सिपी ccfdna टुक्राहरूको लम्बाई लामो-पढ्ने सिमांकूफाटाबाट मिल्दोजुल्दो छ जुन यो देखाइएको छ कि DNA METHTHYLALLALLALLATILE विश्लेषण र धेरै पुस्ताहरूको लागि जारी छ।तसर्थ, यसले जलवायु परिवर्तन वा प्रदूषकहरू [८७] को जोखिम पछि प्रतिक्रियालाई नियन्त्रण गर्ने अन्तर्निहित संयन्त्रहरूमा बहुमूल्य अन्तरदृष्टि प्रदान गर्न सक्छ।यद्यपि, LB को प्रयोग सीमितता बिना छैन।भन्न आवश्यक छैन, यसको लागि इकोसिस्टममा सूचक प्रजातिहरूको उपस्थिति आवश्यक छ।माथि उल्लेख गरिए अनुसार, दिइएको इकोसिस्टमको जैवविविधता मूल्याङ्कन गर्न LB प्रयोग गर्नको लागि पनि एक कठोर बायोइन्फर्मेटिक्स पाइपलाइन चाहिन्छ जसले स्रोतबाट DNA टुक्राहरूको उपस्थितिलाई ध्यानमा राख्छ।अर्को प्रमुख समस्या समुद्री प्रजातिका लागि सन्दर्भ जीनोमहरूको उपलब्धता हो।यो आशा छ कि समुद्री स्तनपायी जीनोम परियोजना र हालै स्थापित फिश10k परियोजना [८८] जस्ता पहलहरूले भविष्यमा यस्तो विश्लेषणलाई सहज बनाउनेछ।समुद्री फिल्टर-फिडिंग जीवहरूमा LB अवधारणाको आवेदन पनि अनुक्रमण प्रविधिमा नवीनतम प्रगतिहरूसँग मिल्दो छ, यसले वातावरणीय तनावको प्रतिक्रियामा समुद्री बासस्थानको स्वास्थ्यको बारेमा महत्त्वपूर्ण जानकारी प्रदान गर्न बहु-ओम बायोमार्करहरूको विकासको लागि राम्रोसँग उपयुक्त छ।
जीनोम अनुक्रमण डेटा NCBI अनुक्रम पढ्नुहोस् संग्रह https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 अन्तर्गत जम्मा गरिएको छ।
ब्रियर्ले एएस, किंग्सफोर्ड एमजे समुद्री जीवन र पारिस्थितिक प्रणालीमा जलवायु परिवर्तनको प्रभाव।कोल जीवविज्ञान।2009;१९: P602–P614।
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al।जलवायु परिवर्तन र समुद्री वातावरणमा अन्य स्थानीय तनावहरूको संयुक्त प्रभावहरू विचार गर्नुहोस्।सामान्य वैज्ञानिक वातावरण।२०२१;७५५:१४२५६४।
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al।)।मार्चको पहिलो विज्ञान।२०२०; ७:४८।
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. दोहोरिने तातो तनाव अवस्थाहरूमा कम गर्मी सहनशीलताले नीलो सिपीहरूको उच्च गर्मीको मृत्युदरलाई बताउँछ।वैज्ञानिक रिपोर्ट 2019;९:१७४९८।
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al।जनावरको मृत्युको आवृत्ति, कारण र हदमा हालैका परिवर्तनहरू।Proc Natl Acad Sci USA।२०१५;११२:१०८३-८।
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al।धेरै गैर-प्रजाति-विशिष्ट रोगजनकहरूले पिन्ना नोबिलिसको सामूहिक मृत्युको कारण हुन सक्छ।जीवन।२०२०; १०:२३८।
ब्राडली एम, कउट्स एसजे, जेनकिन्स ई, ओ'हारा टीएम।आर्कटिक जुनोटिक रोगहरूमा जलवायु परिवर्तनको सम्भावित प्रभाव।इंट जे सर्कम्पोलर स्वास्थ्य।2005;६४:४६८–७७।
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.तटीय प्रदूषण निगरानीमा संकेत जीवहरूको रूपमा ब्लू सिपल्स (माइटिलस एडुलिस एसपीपी।: एक समीक्षा।Mar Environ Res 2017;130:338-65।
सिरवेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बर्डेली ए। क्यान्सर उपचारमा लिक्विड बायोप्सीको एकीकरण।नेट रेभ क्लीन ओनकोल।2017;१४:५३१–४८।
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al।तरल बायोप्सी परिपक्वता: ट्युमर डीएनए परिसंचरण गर्न अनुमति दिन्छ।Nat Rev क्यान्सर।2017; 17: 223-38।
Mandel P., Metais P. मानव प्लाज्मा मा न्यूक्लिक एसिड।Soc Biol सहायकहरूको बैठक मिनेट।1948;१४२:२४१-३।
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. क्यान्सर उपचारको लागि आणविक मार्करको रूपमा सेल-फ्री DNA को लागि नयाँ भूमिका।बायोमोलर विश्लेषण को मात्रा।2019; 17: 100087।
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid बायोप्सी क्लिनिकमा प्रवेश गर्दछ - कार्यान्वयन मुद्दाहरू र भविष्यका चुनौतीहरू।नेट रेभ क्लिन ओनकोल।२०२१;१८:२९७–३१२।
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW र अन्य।भ्रूणको डीएनए मातृको प्लाज्मा र सीरममा पाइन्छ।ल्यान्सेट।1997;३५०:४८५-७।
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR गर्भावस्था को पाठ्यक्रम को अध्ययन र गर्भावस्था को समयमा महिला को रगत मा परिसंचरण एक्स्ट्रासेलुलर आरएनए को प्रयोग गरेर यसको जटिलताहरु।डोपेडियाट्रिक्स।२०२०; ८:६०५२१९।
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al।तरल बायोप्सी: मृगौला ग्राफ्टमा एलोजेनिक घावहरू पत्ता लगाउन डोनर सेल-फ्री डीएनए प्रयोग गरिन्छ।नेट रेभ नेफ्रोल।२०२१;१७:५९१–६०३।
जुआन एफसी, लो वाईएम प्रसवपूर्व निदानमा नवाचार: मातृ प्लाज्मा जीनोम अनुक्रम।अन्ना एमडी।2016;67:419-32।
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al।संक्रमित शारीरिक तरल पदार्थको अर्को पुस्ताको मेटाजेनोमिक अनुक्रमको साथ द्रुत रोगजनक पत्ता लगाउने।नेट मेडिसिन।२०२१; २७:११५-२४।