Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। यसै बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
लिक्विड बायोप्सी (LB) एउटा अवधारणा हो जुन बायोमेडिकल क्षेत्रमा द्रुत गतिमा लोकप्रिय हुँदै गइरहेको छ। यो अवधारणा मुख्यतया विभिन्न तन्तुहरूमा कोष मृत्यु पछि साना टुक्राहरूको रूपमा बाहिर निस्कने बाह्य कोषीय DNA (ccfDNA) को टुक्राहरूको पहिचानमा आधारित छ। यी टुक्राहरूको सानो अनुपात विदेशी (विदेशी) तन्तु वा जीवहरूबाट उत्पन्न हुन्छ। हालको काममा, हामीले यो अवधारणालाई सिपी कीराहरूमा लागू गरेका छौं, जुन तिनीहरूको उच्च समुद्री पानी निस्पंदन क्षमताको लागि परिचित एक सेन्टिनेल प्रजाति हो। हामी समुद्री तटीय पारिस्थितिक प्रणालीको जैविक विविधताको बारेमा जानकारी प्रदान गर्न विभिन्न स्रोतहरूबाट वातावरणीय DNA टुक्राहरू कब्जा गर्न प्राकृतिक फिल्टरको रूपमा काम गर्न सिपी कीराहरूको क्षमता प्रयोग गर्छौं। हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि सिपी कीरा हेमोलिम्फमा DNA टुक्राहरू हुन्छन् जुन आकारमा धेरै भिन्न हुन्छन्, 1 देखि 5 kb सम्म। शटगन अनुक्रमणले देखाएको छ कि ठूलो संख्यामा DNA टुक्राहरू विदेशी माइक्रोबियल उत्पत्तिका छन्। तिनीहरूमध्ये, हामीले ब्याक्टेरिया, आर्किया र भाइरसहरूबाट DNA टुक्राहरू फेला पार्यौं, जसमा तटीय समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूमा सामान्यतया पाइने विभिन्न होस्टहरूलाई संक्रमित गर्न ज्ञात भाइरसहरू समावेश छन्। निष्कर्षमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि सिपी कीराहरूमा लागू गरिएको LB को अवधारणाले समुद्री तटीय पारिस्थितिक प्रणालीमा सूक्ष्मजीव विविधताको बारेमा ज्ञानको एक समृद्ध तर अझैसम्म अन्वेषण नगरिएको स्रोतलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
जलवायु परिवर्तन (CC) को समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीको जैविक विविधतामा पर्ने प्रभाव अनुसन्धानको द्रुत गतिमा बढ्दो क्षेत्र हो। ग्लोबल वार्मिङले महत्त्वपूर्ण शारीरिक तनाव मात्र निम्त्याउँदैन, तर समुद्री जीवहरूको थर्मल स्थिरताको विकासवादी सीमालाई पनि धकेल्छ, जसले गर्दा धेरै प्रजातिहरूको बासस्थानमा असर पर्छ, जसले गर्दा उनीहरूलाई थप अनुकूल अवस्थाहरू खोज्न प्रेरित गर्छ [1, 2]। मेटाजोआन्सको जैविक विविधतालाई असर गर्नुको साथै, CC ले होस्ट-माइक्रोबियल अन्तरक्रियाको नाजुक सन्तुलनमा बाधा पुर्‍याउँछ। यो माइक्रोबियल डिस्ब्याक्टेरियोसिसले समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूको लागि गम्भीर खतरा निम्त्याउँछ किनभने यसले समुद्री जीवहरूलाई संक्रामक रोगजनकहरूको लागि बढी संवेदनशील बनाउँछ [3, 4]। यो विश्वास गरिन्छ कि SS ले सामूहिक मृत्युमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, जुन विश्वव्यापी समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूको व्यवस्थापनको लागि गम्भीर समस्या हो [5, 6]। धेरै समुद्री प्रजातिहरूको आर्थिक, पारिस्थितिक र पोषण प्रभावहरूलाई ध्यानमा राख्दै यो एउटा महत्त्वपूर्ण मुद्दा हो। यो विशेष गरी ध्रुवीय क्षेत्रहरूमा बस्ने बाइभल्भहरूको लागि सत्य हो, जहाँ CK को प्रभावहरू बढी तत्काल र गम्भीर हुन्छन् [6, 7]। वास्तवमा, माइटिलस spp जस्ता बाइभल्भहरू। समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीमा CC को प्रभावहरूको निगरानी गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ। अचम्म मान्नु पर्दैन, तिनीहरूको स्वास्थ्यको निगरानी गर्न अपेक्षाकृत ठूलो संख्यामा बायोमार्करहरू विकास गरिएको छ, प्रायः एन्जाइमेटिक गतिविधि वा कोशिका व्यवहार्यता र फागोसाइटिक गतिविधि जस्ता सेलुलर कार्यहरूमा आधारित कार्यात्मक बायोमार्करहरू समावेश गर्ने दुई-स्तरीय दृष्टिकोण प्रयोग गरेर [8]। यी विधिहरूमा ठूलो मात्रामा समुद्री पानी अवशोषित भएपछि नरम तन्तुहरूमा जम्मा हुने विशिष्ट दबाव सूचकहरूको सांद्रताको मापन पनि समावेश छ। यद्यपि, उच्च निस्पंदन क्षमता र द्विभाल्भहरूको अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणालीले तरल बायोप्सी (LB) को अवधारणा प्रयोग गरेर नयाँ हेमोलिम्फ बायोमार्करहरू विकास गर्ने अवसर प्रदान गर्दछ, बिरामी व्यवस्थापनको लागि एक सरल र न्यूनतम आक्रामक दृष्टिकोण। रगत नमूनाहरू [9, 10]। यद्यपि मानव LB मा धेरै प्रकारका परिसंचरण अणुहरू फेला पार्न सकिन्छ, यो अवधारणा मुख्यतया प्लाज्मामा परिसंचरण बाह्य कोशिकीय DNA (ccfDNA) टुक्राहरूको DNA अनुक्रमण विश्लेषणमा आधारित छ। वास्तवमा, मानव प्लाज्मामा परिसंचरणशील डीएनएको उपस्थिति २० औं शताब्दीको मध्यदेखि नै ज्ञात छ [11], तर हालैका वर्षहरूमा मात्र उच्च-थ्रुपुट अनुक्रमण विधिहरूको आगमनले ccfDNA मा आधारित क्लिनिकल निदानको नेतृत्व गरेको छ। यी परिसंचरणशील डीएनए टुक्राहरूको उपस्थिति आंशिक रूपमा कोशिका मृत्यु पछि जीनोमिक डीएनए (न्यूक्लियर र माइटोकोन्ड्रियल) को निष्क्रिय रिलीजको कारणले हो। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, ccfDNA को सांद्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<१० ng/mL) तर विभिन्न रोगविज्ञानबाट पीडित वा तनावमा परेका बिरामीहरूमा यो ५-१० गुणाले बढ्न सक्छ, जसले गर्दा तन्तु क्षति हुन्छ। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, ccfDNA को सांद्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<१० ng/mL) तर विभिन्न रोगविज्ञानबाट पीडित वा तनावमा परेका बिरामीहरूमा यो ५-१० गुणाले बढ्न सक्छ, जसले गर्दा तन्तु क्षति हुन्छ। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 раз у больныйтой больныйтой подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा, cccDNA को सांद्रता सामान्यतया कम हुन्छ (<१० ng/mL), तर विभिन्न रोगविज्ञान भएका वा तनावमा रहेका बिरामीहरूमा यो ५-१० गुणा बढ्न सक्छ जसले गर्दा तन्तु क्षति हुन्छ।在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渞01的受度通常较低（倍, 从而导致组织损伤।在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 慊叀叀增加 5-10 倍, 从而 组织。 . 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцымистом патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей। स्वस्थ व्यक्तिहरूमा ccfDNA सांद्रता सामान्यतया कम (<१० ng/ml) हुन्छ, तर विभिन्न रोगविज्ञान वा तनाव भएका बिरामीहरूमा ५-१० गुणा बढ्न सक्छ, जसले गर्दा तन्तु क्षति हुन्छ।ccfDNA टुक्राहरूको आकार व्यापक रूपमा फरक हुन्छ, तर सामान्यतया १५० देखि २०० bp सम्म हुन्छ। [12]। स्व-व्युत्पन्न ccfDNA को विश्लेषण, अर्थात्, सामान्य वा रूपान्तरित होस्ट कोषहरूबाट ccfDNA, आणविक र/वा माइटोकोन्ड्रियल जीनोममा उपस्थित आनुवंशिक र एपिजेनेटिक परिवर्तनहरू पत्ता लगाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा चिकित्सकहरूलाई विशिष्ट आणविक-लक्षित उपचारहरू चयन गर्न मद्दत गर्दछ [13]। यद्यपि, ccfDNA गर्भावस्थाको समयमा भ्रूण कोषहरूबाट वा प्रत्यारोपित अंगहरूबाट ccfDNA जस्ता विदेशी स्रोतहरूबाट प्राप्त गर्न सकिन्छ [14,15,16,17]। ccfDNA संक्रामक एजेन्ट (विदेशी) को न्यूक्लिक एसिडको उपस्थिति पत्ता लगाउनको लागि जानकारीको एक महत्त्वपूर्ण स्रोत पनि हो, जसले रक्त संस्कृतिहरू द्वारा पहिचान नगरिएका व्यापक संक्रमणहरूको गैर-आक्रामक पत्ता लगाउन अनुमति दिन्छ, संक्रमित तन्तुको आक्रामक बायोप्सीलाई बेवास्ता गर्दै [18]। हालैका अध्ययनहरूले वास्तवमा देखाएको छ कि मानव रगतमा जानकारीको एक समृद्ध स्रोत हुन्छ जुन भाइरल र ब्याक्टेरिया रोगजनकहरू पहिचान गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, र मानव प्लाज्मामा पाइने ccfDNA को लगभग 1% विदेशी मूलको हो [19]। यी अध्ययनहरूले देखाउँछन् कि जीवको परिसंचरण गर्ने माइक्रोबायोमको जैविक विविधता ccfDNA विश्लेषण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गर्न सकिन्छ। यद्यपि, हालसम्म, यो अवधारणा विशेष रूपमा मानवहरूमा र केही हदसम्म अन्य कशेरुकाहरूमा प्रयोग गरिन्थ्यो [20, 21]।
यस पत्रमा, हामी Aulacomya atra को ccfDNA को विश्लेषण गर्न LB क्षमता प्रयोग गर्छौं, जुन सामान्यतया उप-अन्टार्क्टिक केर्गुलेन टापुहरूमा पाइने दक्षिणी प्रजाति हो, जुन ३५ मिलियन वर्ष पहिले बनेको ठूलो पठारको माथि टापुहरूको समूह हो। ज्वालामुखी विस्फोट। इन भिट्रो प्रयोगात्मक प्रणाली प्रयोग गरेर, हामीले समुद्री पानीमा रहेका DNA टुक्राहरू सिपीहरूले चाँडै लिने र हेमोलिम्फ डिब्बामा प्रवेश गर्ने पत्ता लगायौं। शटगन अनुक्रमणले देखाएको छ कि सिपी हेमोलिम्फ ccfDNA मा यसको आफ्नै र गैर-स्व-उत्पत्तिको DNA टुक्राहरू छन्, जसमा सिम्बायोटिक ब्याक्टेरिया र चिसो ज्वालामुखी समुद्री तटीय पारिस्थितिक प्रणालीको विशिष्ट बायोमहरूबाट DNA टुक्राहरू समावेश छन्। Hemolymph ccfDNA मा विभिन्न होस्ट दायराहरू भएका भाइरसहरूबाट व्युत्पन्न भाइरल अनुक्रमहरू पनि छन्। हामीले हड्डीको माछा, समुद्री एनिमोन, शैवाल र कीराहरू जस्ता बहुकोशिकीय जनावरहरूबाट DNA टुक्राहरू पनि फेला पार्यौं। निष्कर्षमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि LB अवधारणालाई समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूमा समृद्ध जीनोमिक भण्डार उत्पन्न गर्न समुद्री इन्भर्टेब्रेटहरूमा सफलतापूर्वक लागू गर्न सकिन्छ।
वयस्कहरू (५५-७० मिमी लामो) माइटिलस प्लेटेन्सिस (एम. प्लेटेन्सिस) र औलाकोम्या एट्रा (ए. एट्रा) पोर्ट-औ-फ्रान्सको अन्तरजातीय चट्टानी किनारहरू (०४९°२१.२३५ एस, ०७०°१३.४९० ई.) बाट सङ्कलन गरिएका थिए। डिसेम्बर २०१८ मा केर्गुलेन टापुहरू। अन्य वयस्क नीलो सिपी (माइटिलस एसपीपी.) एक व्यावसायिक आपूर्तिकर्ता (PEI मुसल किंग इंक, प्रिन्स एडवर्ड आइल्याण्ड, क्यानडा) बाट प्राप्त गरिएको थियो र १०-२० लिटर ३२‰ कृत्रिम नुन भएको तापक्रम नियन्त्रित (४° सेल्सियस) वातित ट्याङ्कीमा राखिएको थियो। (कृत्रिम समुद्री नुन रीफ क्रिस्टल, इन्स्ट्यान्ट ओशन, भर्जिनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका)। प्रत्येक प्रयोगको लागि, व्यक्तिगत खोलहरूको लम्बाइ र तौल मापन गरिएको थियो।
यस कार्यक्रमको लागि नि:शुल्क खुला पहुँच प्रोटोकल अनलाइन उपलब्ध छ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)। संक्षेपमा, वर्णन गरिए अनुसार अपहरणकारी मांसपेशीहरूबाट LB हेमोलिम्फ सङ्कलन गरिएको थियो [22]। हेमोलिम्फलाई १२००×g मा ३ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा स्पष्ट पारिएको थियो, सुपरनेटेन्ट प्रयोग नभएसम्म (-२०°C) जमेको थियो। cfDNA को अलगाव र शुद्धीकरणको लागि, निर्माताको निर्देशन अनुसार NucleoSnap cfDNA किट (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) प्रयोग गरेर नमूनाहरू (१.५-२.० मिली) पग्लिए र प्रशोधन गरियो। ccfDNA थप विश्लेषण नभएसम्म -८०°C मा भण्डारण गरिएको थियो। केही प्रयोगहरूमा, ccfDNA लाई QIAamp DNA अन्वेषक किट (QIAGEN, टोरन्टो, ओन्टारियो, क्यानडा) प्रयोग गरेर अलग र शुद्ध गरिएको थियो। शुद्ध DNA मानक पिकोग्रीन परख प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो। पृथक ccfDNA को खण्ड वितरणलाई उच्च संवेदनशीलता DNA किट प्रयोग गरेर Agilent 2100 बायोएनालाइजर (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) प्रयोग गरेर केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। निर्माताको निर्देशन अनुसार ccfDNA नमूनाको 1 µl प्रयोग गरेर परख गरिएको थियो।
हेमोलिम्फ ccfDNA टुक्राहरूको अनुक्रमणको लागि, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ले Illumina MiSeq PE75 किटको Illumina DNA मिक्स किट प्रयोग गरेर शटगन पुस्तकालयहरू तयार पारे। एक मानक एडाप्टर (BioO) प्रयोग गरिएको थियो। कच्चा डेटा फाइलहरू NCBI सिक्वेन्स रिड आर्काइभ (SRR8924808 र SRR8924809) बाट उपलब्ध छन्। FastQC [23] प्रयोग गरेर आधारभूत पठन गुणस्तर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। ट्रिममोमेटिक [24] क्लिपिङ एडेप्टरहरू र खराब गुणस्तरका पठनहरूको लागि प्रयोग गरिएको छ। बेमेलबाट बच्नको लागि जोडी छेउ भएका शटगन रिडहरूलाई FLASH लाई न्यूनतम 20 bp ओभरल्यापको साथ लामो एकल रिडहरूमा मर्ज गरिएको थियो [25]। मर्ज गरिएका पठनहरूलाई द्विभाल्भ NCBI वर्गीकरण डाटाबेस (e मान < 1e−3 र 90% समरूपता) प्रयोग गरेर BLASTN सँग एनोटेट गरिएको थियो, र DUST [26] प्रयोग गरेर कम-जटिलता अनुक्रमहरूको मास्किङ गरिएको थियो। मर्ज गरिएका पठनहरूलाई द्विभाल्भ NCBI वर्गीकरण डाटाबेस (e मान < 1e−3 र 90% समरूपता) प्रयोग गरेर BLASTN सँग एनोटेट गरिएको थियो, र DUST [26] प्रयोग गरेर कम-जटिलता अनुक्रमहरूको मास्किङ गरिएको थियो। Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатюх двустворчатих 1e-3 र 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]। NCBI बाइभल्भ वर्गीकरण डाटाबेस (e मान < 1e-3 र 90% समरूपता) प्रयोग गरेर BLASTN सँग पूल गरिएका पठनहरू एनोटेट गरिएको थियो, र DUST [26] प्रयोग गरेर कम जटिलता अनुक्रम मास्किङ गरिएको थियो।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读乶D, ST用释合并的读买]进行低复杂度序列的掩蔽।使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合幨 读湔] dust 忻类 [2]进行 复杂度 序列 的. . . .掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствохорчам таксономической (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности NCBI बाइभल्भ वर्गीकरण डाटाबेस (e मान <1e-3 र 90% समरूपता) प्रयोग गरेर BLASTN सँग पूल गरिएका पठनहरू एनोटेट गरिएको थियो, र DUST [26] प्रयोग गरेर कम जटिलता अनुक्रम मास्किङ गरिएको थियो।पठनहरूलाई दुई समूहमा विभाजन गरिएको थियो: बाइभल्भ अनुक्रमहरूसँग सम्बन्धित (यहाँ स्व-पठन भनिन्छ) र असंबद्ध (गैर-स्व-पठन)। कन्टिगहरू उत्पन्न गर्न MEGAHIT प्रयोग गरेर दुई समूहहरू छुट्टाछुट्टै भेला गरिएको थियो [27]। यसैबीच, एलियन माइक्रोबायोम पठनहरूको वर्गीकरण वितरणलाई Kraken2 [28] प्रयोग गरेर वर्गीकृत गरिएको थियो र Galaxy [29, 30] मा Krona पाई चार्टद्वारा ग्राफिक रूपमा प्रतिनिधित्व गरिएको थियो। हाम्रो प्रारम्भिक प्रयोगहरूबाट इष्टतम kmers kmers-59 हुने निर्धारण गरिएको थियो। त्यसपछि अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (द्विभाल्भ NCBI डाटाबेस, e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) सँग पङ्क्तिबद्धताद्वारा सेल्फ कन्टिगहरू पहिचान गरियो। त्यसपछि अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (द्विभाल्भ NCBI डाटाबेस, e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) सँग पङ्क्तिबद्धताद्वारा सेल्फ कन्टिगहरू पहिचान गरियो। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых , e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации। त्यसपछि अन्तिम एनोटेसनको लागि BLASTN (NCBI bivalve डाटाबेस, e मान <1e-10 र 60% समरूपता) सँग मिलाएर सेल्फ-कन्टिगहरू पहिचान गरियो।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)। त्यसपछि BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 र 60% homology) सँग मिलाएर अन्तिम एनोटेसनको लागि सेल्फ-कन्टिगहरू पहिचान गरियो। समानान्तरमा, ननसेल्फ ग्रुप कन्टिगहरूलाई BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) सँग एनोटेट गरिएको थियो। समानान्तरमा, ननसेल्फ ग्रुप कन्टिगहरूलाई BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) सँग एनोटेट गरिएको थियो। PARALLLEльно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06могиои)। समानान्तरमा, विदेशी समूह कन्टिगहरूलाई BLASTN (NT NCBI डाटाबेस, e मान <1e-10 र 60% समरूपता) सँग एनोटेट गरिएको थियो।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群। Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, GOMOLOGIIA 60%)। समानान्तरमा, गैर-स्वयं समूह कन्टिगहरूलाई BLASTN (nt NCBI डाटाबेस, e मान <1e-10 र 60% समरूपता) सँग एनोटेट गरिएको थियो। BLASTX nr र RefSeq प्रोटीन NCBI डाटाबेसहरू (e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) प्रयोग गरेर ननसेल्फ कन्टिगहरूमा पनि सञ्चालन गरिएको थियो। BLASTX nr र RefSeq प्रोटीन NCBI डाटाबेसहरू (e मान < 1e−10 र 60% समरूपता) प्रयोग गरेर ननसेल्फ कन्टिगहरूमा पनि सञ्चालन गरिएको थियो। BLASTX ट्याक्स был проведен на несамостоятельных CONTIGAх с использованием баз данных белка nr र RefSeq NCBI ६०%)। BLASTX nr र RefSeq NCBI प्रोटीन डाटाबेस (e मान < 1e-10 र 60% समरूपता) प्रयोग गरेर गैर-स्वयं कन्टिगहरूमा पनि प्रदर्शन गरिएको थियो।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%। BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI ६०%)। BLASTX nr र RefSeq NCBI प्रोटीन डाटाबेस (e मान <1e-10 र 60% समरूपता) प्रयोग गरेर गैर-स्वयं कन्टिगहरूमा पनि प्रदर्शन गरिएको थियो।गैर-स्व-कन्टिगहरूको BLASTN र BLASTX पूलहरूले अन्तिम कन्टिगहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ (पूरक फाइल हेर्नुहोस्)।
PCR का लागि प्रयोग गरिने प्राइमरहरू तालिका S1 मा सूचीबद्ध छन्। Taq DNA पोलिमरेज (बायो बेसिक क्यानडा, मार्कहम, ON) ccfDNA लक्षित जीनहरूलाई प्रवर्द्धन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। निम्न प्रतिक्रिया अवस्थाहरू प्रयोग गरिएको थियो: 95°C मा 3 मिनेटको लागि विकृतीकरण, 95°C मा 1 मिनेटको लागि, 1 मिनेटको लागि एनिलिङ तापमान सेट गर्नुहोस्, 72°C मा 1 मिनेटको लागि लम्बाइ, 35 चक्रहरू, र अन्तमा 10 मिनेट भित्र 72°C। । PCR उत्पादनहरूलाई SYBRTM सुरक्षित DNA जेल स्टेन (इन्भिट्रोजन, बर्लिंगटन, ON, क्यानडा) 95 V मा भएको एगारोज जेल (1.5%) मा इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा अलग गरिएको थियो।
सिपी कीराहरू (Mytilus spp.) लाई ४°C मा २४ घण्टाको लागि ५०० मिलीलीटर अक्सिजनयुक्त समुद्री पानी (३२ PSU) मा अभ्यस्त पारिएको थियो। मानव ग्यालेक्टिन-७ cDNA अनुक्रम (NCBI एक्सेसन नम्बर L07769) लाई एन्कोड गर्ने इन्सर्ट भएको प्लाज्मिड DNA लाई १९० μg/μl को अन्तिम सांद्रतामा शीशीमा थपिएको थियो। DNA थप नगरी उही अवस्थामा इन्क्युबेट गरिएका सिपी कीराहरू नियन्त्रण थिए। तेस्रो नियन्त्रण ट्याङ्कीमा सिपी कीरा बिनाको DNA थियो। समुद्री पानीमा DNA को गुणस्तर निगरानी गर्न, संकेत गरिएको समयमा प्रत्येक ट्याङ्कीबाट समुद्री पानीको नमूनाहरू (२० μl; तीन पुनरावृत्ति) लिइएको थियो। प्लाज्मिड DNA ट्रेसेबिलिटीको लागि, LB सिपी कीराहरू संकेत गरिएको समयमा काटिएका थिए र qPCR र ddPCR द्वारा विश्लेषण गरिएका थिए। समुद्री पानीमा उच्च नुन सामग्रीको कारण, सबै PCR परीक्षणहरू गर्नु अघि PCR गुणस्तरको पानी (१:१०) मा एलिक्वोटहरू पातलो पारिएको थियो।
डिजिटल ड्रपलेट PCR (ddPCR) BioRad QX200 प्रोटोकल (मिसिसाउगा, ओन्टारियो, क्यानडा) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। इष्टतम तापक्रम निर्धारण गर्न तापक्रम प्रोफाइल प्रयोग गर्नुहोस् (तालिका S1)। QX200 ड्रप जेनेरेटर (BioRad) प्रयोग गरेर ड्रपहरू उत्पन्न गरियो। ddPCR निम्नानुसार गरिएको थियो: ५ मिनेटको लागि ९५°C, ३० सेकेन्डको लागि ९५°C को ५० चक्र र १ मिनेटको लागि दिइएको एनिलिङ तापक्रम र ३० सेकेन्डको लागि ७२°C, ५ मिनेटको लागि ४°C र ५ मिनेट भित्र ९०°C। QX200 ड्रप रिडर (BioRad) प्रयोग गरेर ड्रपहरूको संख्या र सकारात्मक प्रतिक्रियाहरू (प्रतिलिपिहरूको संख्या/µl) मापन गरिएको थियो। १०,००० भन्दा कम थोपा भएका नमूनाहरू अस्वीकार गरियो। ddPCR चलाउँदा प्रत्येक पटक ढाँचा नियन्त्रण गरिएको थिएन।
qPCR रोटर-जीन® ३००० (कोर्बेट रिसर्च, सिड्नी, अष्ट्रेलिया) र LGALS7 विशिष्ट प्राइमरहरू प्रयोग गरेर गरिएको थियो। सबै मात्रात्मक PCR हरू QuantiFast SYBR ग्रीन PCR किट (QIAGEN) प्रयोग गरेर २० µl मा गरिएको थियो। qPCR ९५°C मा १५ मिनेट इन्क्युबेशनको साथ सुरु गरिएको थियो र त्यसपछि १० सेकेन्डको लागि ९५°C मा ४० चक्रहरू र ६० सेकेन्डको लागि ६०°C मा एक डेटा सङ्कलन गरिएको थियो। ५ सेकेन्डको लागि ९५°C, ६० सेकेन्डको लागि ६५°C, र qPCR को अन्त्यमा ९७°C मा क्रमिक मापन प्रयोग गरेर पग्लने वक्रहरू उत्पन्न गरिएको थियो। नियन्त्रण नमूनाहरू बाहेक, प्रत्येक qPCR तीन प्रतिकृतिमा गरिएको थियो।
सिपी कीराहरू उच्च निस्पंदन दरका लागि परिचित भएकाले, हामीले पहिले समुद्री पानीमा रहेका DNA टुक्राहरूलाई फिल्टर गर्न र राख्न सक्छन् कि सक्दैनन् भनेर अनुसन्धान गर्यौं। यी टुक्राहरू तिनीहरूको अर्ध-खुला लिम्फेटिक प्रणालीमा जम्मा हुन्छन् कि हुँदैनन् भन्ने कुरामा पनि हामी इच्छुक थियौं। हामीले नीलो सिपी कीरा ट्याङ्कीहरूमा थपिएका घुलनशील DNA टुक्राहरूको भाग्य पत्ता लगाएर यो समस्यालाई प्रयोगात्मक रूपमा समाधान गर्यौं। DNA टुक्राहरूको ट्र्याकिङलाई सहज बनाउन, हामीले मानव ग्यालेक्टिन-७ जीन भएको विदेशी (स्वयं होइन) प्लाज्मिड DNA प्रयोग गर्यौं। ddPCR ले समुद्री पानी र सिपी कीराहरूमा प्लाज्मिड DNA टुक्राहरू पत्ता लगाउँछ। हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि यदि सिपी कीराहरूको अनुपस्थितिमा समुद्री पानीमा DNA टुक्राहरूको मात्रा समयसँगै (७ दिनसम्म) अपेक्षाकृत स्थिर रह्यो भने, सिपी कीराहरूको उपस्थितिमा यो स्तर लगभग ८ घण्टा भित्र पूर्ण रूपमा गायब हुन्छ (चित्र १क,ख)। बाह्य DNA का टुक्राहरू इन्ट्राभल्भ्युलर फ्लुइड र हेमोलिम्फमा १५ मिनेट भित्र सजिलै पत्ता लगाइयो (चित्र १ग)। यी टुक्राहरू अझै पनि सम्पर्क पछि ४ घण्टा सम्म पत्ता लगाउन सकिन्छ। डीएनए टुक्राहरूको सन्दर्भमा यो फिल्टरिङ गतिविधि ब्याक्टेरिया र शैवालको फिल्टरिङ गतिविधिसँग तुलना गर्न सकिन्छ [31]। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि सिपी कीराहरूले आफ्नो तरल पदार्थको डिब्बामा विदेशी डीएनए फिल्टर गर्न र जम्मा गर्न सक्छन्।
ddPCR द्वारा मापन गरिएको सिपी कीराहरूको उपस्थिति (A) वा अनुपस्थिति (B) मा समुद्री पानीमा प्लाज्मिड DNA को सापेक्षिक सांद्रता। A मा, परिणामहरू प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिन्छ, बक्सहरूको किनाराहरूले 75 औं र 25 औं प्रतिशतकहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ। फिट गरिएको लघुगणकीय वक्र रातो रंगमा देखाइएको छ, र खैरो रंगमा छायाँ गरिएको क्षेत्रले 95% विश्वास अन्तराललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। B मा, रातो रेखाले औसतलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ र नीलो रेखाले सांद्रताको लागि 95% विश्वास अन्तराललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। C प्लाज्मिड DNA थपेपछि विभिन्न समयमा सिपी कीराहरूको हेमोलिम्फ र भल्भ्युलर तरल पदार्थमा प्लाज्मिड DNA को संचय। परिणामहरू निरपेक्ष प्रतिलिपिहरू पत्ता लगाइएका/mL (±SE) को रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ।
अर्को, हामीले केर्गुलेन टापुहरूमा रहेको सिपी कीराबाट सङ्कलन गरिएका सिपीहरूमा ccfDNA को उत्पत्तिको अनुसन्धान गर्यौं, जुन सीमित मानवजन्य प्रभाव भएका टापुहरूको दुर्गम समूह हो। यस उद्देश्यका लागि, सिपी कीरा हेमोलिम्फबाट cccDNA लाई मानव cccDNA शुद्ध गर्न प्रयोग गरिने विधिहरूद्वारा अलग र शुद्ध गरिएको थियो [32, 33]। हामीले पत्ता लगायौं कि सिपी कीराहरूमा औसत हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता प्रति मिली हेमोलिम्फ दायरामा कम माइक्रोग्राम हुन्छ (तालिका S2, पूरक जानकारी हेर्नुहोस्)। सांद्रताको यो दायरा स्वस्थ मानिसहरूको तुलनामा धेरै ठूलो छ (प्रति मिलिलिटर कम न्यानोग्राम), तर दुर्लभ अवस्थामा, क्यान्सर रोगीहरूमा, ccfDNA को स्तर प्रति मिलिलिटर धेरै माइक्रोग्राम पुग्न सक्छ [34, 35]। हेमोलिम्फ ccfDNA को आकार वितरणको विश्लेषणले देखाएको छ कि यी टुक्राहरू आकारमा धेरै भिन्न हुन्छन्, 1000 bp देखि 1000 bp सम्म। 5000 bp सम्म (चित्र 2)। सिलिका-आधारित QIAamp अन्वेषक किट प्रयोग गरेर समान परिणामहरू प्राप्त गरियो, जुन सामान्यतया फोरेन्सिक विज्ञानमा ccfDNA सहित कम सांद्रता DNA नमूनाहरूबाट जीनोमिक DNA लाई द्रुत रूपमा अलग गर्न र शुद्ध गर्न प्रयोग गरिने विधि हो [36]।
सिपी कीराको हेमोलिम्फको प्रतिनिधि ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम। न्यूक्लियोस्न्याप प्लाज्मा किट (माथि) र QIAamp DNA अन्वेषक किटको साथ निकालिएको। B भ्वायलिन प्लटले सिपी कीरामा हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) को वितरण देखाउँछ। कालो र रातो रेखाहरूले क्रमशः मध्यक र पहिलो र तेस्रो चतुर्थकहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
मानिस र प्राइमेटहरूमा लगभग १% ccfDNA को विदेशी स्रोत हुन्छ [21, 37]। बाइभल्भहरूको अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणाली, सूक्ष्मजीव-समृद्ध समुद्री पानी, र मसेल ccfDNA को आकार वितरणलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले परिकल्पना गर्यौं कि मसेल हेमोलिम्फ ccfDNA मा माइक्रोबियल DNA को एक समृद्ध र विविध पूल हुन सक्छ। यो परिकल्पना परीक्षण गर्न, हामीले केर्गुलेन टापुहरूबाट सङ्कलन गरिएका Aulacomya atra नमूनाहरूबाट हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमित गर्यौं, जसले १ करोड भन्दा बढी पठनहरू उत्पादन गर्‍यो, जसमध्ये ९७.६% ले गुणस्तर नियन्त्रण पार गर्यो। त्यसपछि पठनहरूलाई BLASTN र NCBI बाइभल्भ डाटाबेसहरू (चित्र S1, पूरक जानकारी) प्रयोग गरेर स्व र गैर-स्व स्रोतहरू अनुसार वर्गीकृत गरियो।
मानिसमा, आणविक र माइटोकोन्ड्रियल दुवै डीएनए रक्तप्रवाहमा रिलिज हुन सक्छ [38]। यद्यपि, हालको अध्ययनमा, ए. एट्रा जीनोमलाई अनुक्रमित वा वर्णन गरिएको नभएको कारणले गर्दा, सिपी कीराहरूको आणविक जीनोमिक डीएनएको विस्तृत रूपमा वर्णन गर्न सम्भव थिएन। यद्यपि, हामीले बाइभल्भ लाइब्रेरी (चित्र S2, पूरक जानकारी) प्रयोग गरेर हाम्रो आफ्नै उत्पत्तिको धेरै ccfDNA टुक्राहरू पहिचान गर्न सक्षम भयौं। हामीले ती A. एट्रा जीनहरूको निर्देशित PCR प्रवर्धनद्वारा हाम्रो आफ्नै उत्पत्तिको DNA टुक्राहरूको उपस्थिति पनि पुष्टि गर्यौं जुन अनुक्रमित थिए (चित्र 3)। त्यस्तै गरी, A. एट्राको माइटोकोन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डाटाबेसमा उपलब्ध भएकोले, A. एट्राको हेमोलिम्फमा माइटोकोन्ड्रियल ccfDNA टुक्राहरूको उपस्थितिको प्रमाण पाउन सकिन्छ। माइटोकोन्ड्रियल DNA टुक्राहरूको उपस्थिति PCR प्रवर्धनद्वारा पुष्टि गरिएको थियो (चित्र 3)।
A. atra (रातो थोप्लाहरू - स्टक नम्बर: SRX5705969) र M. platensis (नीलो थोप्लाहरू - स्टक नम्बर: SRX5705968) को हेमोलिम्फमा विभिन्न माइटोकोन्ड्रियल जीनहरू PCR द्वारा प्रवर्द्धित थिए। ब्रेटन एट अल., २०११ B बाट रूपान्तरित चित्र A. atra बाट हेमोलिम्फ सुपरनेटेन्टको प्रवर्द्धन FTA कागजमा भण्डारण गरिएको। PCR मिश्रण भएको PCR ट्यूबमा सिधै थप्न ३ मिमी पंच प्रयोग गर्नुहोस्।
समुद्री पानीमा प्रचुर मात्रामा माइक्रोबियल सामग्री भएकोले, हामीले सुरुमा हेमोलिम्फमा माइक्रोबियल डीएनए अनुक्रमहरूको विशेषता वर्णनमा ध्यान केन्द्रित गर्यौं। यो गर्न, हामी दुई फरक रणनीतिहरू प्रयोग गर्छौं। पहिलो रणनीतिले Kraken2 प्रयोग गर्‍यो, एक एल्गोरिथ्म-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम जसले BLAST र अन्य उपकरणहरूसँग तुलना गर्न सकिने शुद्धताका साथ माइक्रोबियल अनुक्रमहरू पहिचान गर्न सक्छ [28]। 6719 भन्दा बढी पठनहरू ब्याक्टेरिया उत्पत्तिको हुने निर्धारण गरिएको थियो, जबकि 124 र 64 क्रमशः आर्किया र भाइरसहरूबाट थिए (चित्र 4)। सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा ब्याक्टेरिया डीएनए टुक्राहरू फर्मिक्युट्स (46%), प्रोटियोब्याक्टेरिया (27%), र ब्याक्टेरॉइडेट्स (17%) (चित्र 4a) थिए। यो वितरण समुद्री नीलो मसेल माइक्रोबायोम [39, 40] को अघिल्लो अध्ययनहरूसँग मेल खान्छ। गामाप्रोटियोब्याक्टेरिया प्रोटियोब्याक्टेरिया (44%) को मुख्य वर्ग थियो, जसमा धेरै Vibrionales (चित्र 4b) समावेश छन्। ddPCR विधिले A. atra hemolymph (चित्र ४c) [४१] को ccfDNA मा Vibrio DNA टुक्राहरूको उपस्थिति पुष्टि गर्‍यो। ccfDNA को ब्याक्टेरिया उत्पत्तिको बारेमा थप जानकारी प्राप्त गर्न, एक अतिरिक्त दृष्टिकोण अपनाइएको थियो (चित्र S2, पूरक जानकारी)। यस अवस्थामा, ओभरल्याप गरिएका रिडहरूलाई पेयर-एन्ड रिडको रूपमा भेला गरिएको थियो र BLASTN र 1e−3 को e मान र >90% समरूपता भएको कटअफ प्रयोग गरेर स्व (द्विभाल्भ) वा गैर-स्व उत्पत्तिको रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो। यस अवस्थामा, ओभरल्याप गरिएका रिडहरूलाई पेयर-एन्ड रिडको रूपमा भेला गरिएको थियो र BLASTN र 1e−3 को e मान र >90% समरूपता भएको कटअफ प्रयोग गरेर स्व (द्विभाल्भ) वा गैर-स्व उत्पत्तिको रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 र отсечения с гомологией> 90%। यस अवस्थामा, ओभरल्यापिङ रिडहरूलाई जोडी-समाप्त रिडहरूको रूपमा सङ्कलन गरिएको थियो र BLASTN र 1e-3 को e मान र >90% समरूपताको साथ कटअफ प्रयोग गरेर नेटिभ (द्विभाल्भ) वा गैर-मौलिकको रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो।在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源।在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 ब्लास्ट 和 和1 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身।।।।।।। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстеруваны моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 र порога гомологии> ९०%। यस अवस्थामा, ओभरल्यापिङ रिडहरूलाई जोडी-समाप्त रिडहरूको रूपमा सङ्कलन गरिएको थियो र e BLASTN र 1e-3 मानहरू र homology थ्रेसहोल्ड >90% प्रयोग गरेर आफ्नै (द्विभाल्भ) वा गैर-मौलिकको रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो।A. atra जीनोम अझै अनुक्रमित नभएको हुनाले, हामीले MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) एसेम्बलरको de novo असेंबली रणनीति प्रयोग गर्यौं। कुल १४७,१८८ कन्टिगहरूलाई उत्पत्तिको आश्रित (द्विभाल्भ) को रूपमा पहिचान गरिएको छ। त्यसपछि यी कन्टिगहरूलाई BLASTN र BLASTX प्रयोग गरेर १e-१० को e-मानहरूद्वारा विस्फोट गरिएको थियो। यो रणनीतिले हामीलाई A. atra ccfDNA मा उपस्थित ४८२ गैर-द्विभाल्भ टुक्राहरू पहिचान गर्न अनुमति दियो। यी DNA टुक्राहरूको आधा भन्दा बढी (५७%) ब्याक्टेरियाबाट प्राप्त गरिएको थियो, मुख्यतया गिल सिम्बियोन्टहरूबाट, सल्फोट्रोफिक सिम्बियोन्टहरू सहित, र गिल सिम्बियोन्टहरू सोलेम्या भेलुमबाट (चित्र ५)।
प्रकार स्तरमा सापेक्षिक प्रशस्तता। B दुई मुख्य फाइला (फर्मिक्युट्स र प्रोटियोब्याक्टेरिया) को सूक्ष्मजीव विविधता। ddPCR C Vibrio spp को प्रतिनिधि प्रवर्धन। A. तीन एट्रा हेमोलिम्फमा 16S rRNA जीन (नीलो) को टुक्राहरू।
जम्मा ४८२ सङ्कलन गरिएका कन्टिगहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। मेटाजेनोमिक कन्टिग एनोटेशनहरू (प्रोक्यारियोट्स र युकेरियोट्स) को वर्गीकरण वितरणको सामान्य प्रोफाइल। B BLASTN र BLASTX द्वारा पहिचान गरिएका ब्याक्टेरिया DNA टुक्राहरूको विस्तृत वितरण।
Kraken2 विश्लेषणले यो पनि देखाएको छ कि सिपी कीरा ccfDNA मा आर्किएल DNA टुक्राहरू थिए, जसमा Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), र Thaurmarcheota (11%) को DNA टुक्राहरू समावेश थिए (चित्र 6a)। क्यालिफोर्नियाली सिपी कीराहरूको माइक्रोबियल समुदायमा पहिले पाइने Euryarchaeota र Crenarchaeota बाट प्राप्त DNA टुक्राहरूको उपस्थिति अचम्मको कुरा होइन [42]। यद्यपि Euryarchaeota प्रायः चरम अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित छ, अब यो मान्यता प्राप्त छ कि Euryarchaeota र Crenarchaeota दुवै समुद्री क्रायोजेनिक वातावरणमा सबैभन्दा सामान्य प्रोकारियोटहरू मध्ये एक हुन् [43, 44]। केर्गुलेन पठार [45] मा तल्लो चुहावटबाट व्यापक मिथेन चुहावट र केर्गुलेन टापुहरूको तटमा अवलोकन गरिएको सम्भावित माइक्रोबियल मिथेन उत्पादनको हालैको रिपोर्टहरूलाई ध्यानमा राख्दै, सिपी कीराहरूमा मेथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवहरूको उपस्थिति आश्चर्यजनक छैन [46]।
त्यसपछि हाम्रो ध्यान DNA भाइरसबाट प्राप्त अध्ययनहरूमा केन्द्रित भयो। हाम्रो ज्ञान अनुसार, यो सिपी कीराहरूको भाइरस सामग्रीको पहिलो अफ-लक्ष्य अध्ययन हो। अपेक्षा गरिए अनुसार, हामीले ब्याक्टेरियोफेज (Caudovirales) को DNA टुक्राहरू फेला पार्यौं (चित्र 6b)। यद्यपि, सबैभन्दा सामान्य भाइरल DNA न्यूक्लियोसाइटोभाइरसको फाइलमबाट आउँछ, जसलाई न्यूक्लियर साइटोप्लाज्मिक लार्ज DNA भाइरस (NCLDV) पनि भनिन्छ, जसमा कुनै पनि भाइरसको सबैभन्दा ठूलो जीनोम हुन्छ। यस फाइलम भित्र, धेरैजसो DNA अनुक्रमहरू Mimimidoviridae (58%) र Poxviridae (21%) परिवारहरूसँग सम्बन्धित छन्, जसका प्राकृतिक होस्टहरूमा कशेरुका र आर्थ्रोपोडहरू समावेश छन्, जबकि यी DNA अनुक्रमहरूको सानो अनुपात ज्ञात भाइरोलोजिकल शैवालसँग सम्बन्धित छ। समुद्री युकेरियोटिक शैवाललाई संक्रमित गर्दछ। अनुक्रमहरू Pandora भाइरसबाट पनि प्राप्त गरिएको थियो, जुन कुनै पनि ज्ञात भाइरल जेनेराको सबैभन्दा ठूलो जीनोम आकारको विशाल भाइरस हो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमण द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार भाइरसबाट संक्रमित हुने ज्ञात होस्टहरूको दायरा अपेक्षाकृत ठूलो थियो (चित्र S3, पूरक जानकारी)। यसमा बाकुलोभिरिडे र इरिडोभिरिडे जस्ता कीराहरूलाई संक्रमित गर्ने भाइरसहरू, साथै अमिबा, शैवाल र कशेरुकाहरूलाई संक्रमित गर्ने भाइरसहरू समावेश छन्। हामीले पिथोभाइरस साइबेरिकम जीनोमसँग मिल्ने अनुक्रमहरू पनि फेला पार्यौं। पिटोभाइरसहरू ("जोम्बी भाइरस" भनेर पनि चिनिन्छ) पहिलो पटक साइबेरियामा ३०,००० वर्ष पुरानो पर्माफ्रस्टबाट अलग गरिएको थियो [47]। यसरी, हाम्रा नतिजाहरू अघिल्ला रिपोर्टहरूसँग मिल्दोजुल्दो छन् जसले देखाउँछ कि यी भाइरसहरूको सबै आधुनिक प्रजातिहरू लोप भएका छैनन् [48] र यी भाइरसहरू दुर्गम उपआर्क्टिक समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूमा उपस्थित हुन सक्छन्।
अन्तमा, हामीले अन्य बहुकोशिकीय जनावरहरूबाट DNA टुक्राहरू फेला पार्न सक्छौं कि भनेर परीक्षण गर्यौं। BLASTN र BLASTX द्वारा nt, nr र RefSeq पुस्तकालयहरू (जीनोमिक र प्रोटीन) सहित कुल ४८२ विदेशी कन्टिगहरू पहिचान गरिएको थियो। हाम्रो नतिजाले देखाउँछ कि बहुकोशिकीय जनावरहरूको ccfDNA को विदेशी टुक्राहरूमा हड्डीको हड्डीको DNA प्रबल हुन्छ (चित्र ५)। कीराहरू र अन्य प्रजातिहरूबाट DNA टुक्राहरू पनि फेला परेका छन्। DNA टुक्राहरूको अपेक्षाकृत ठूलो भाग पहिचान गरिएको छैन, सम्भवतः स्थलीय प्रजातिहरूको तुलनामा जीनोमिक डाटाबेसहरूमा ठूलो संख्यामा समुद्री प्रजातिहरूको कम प्रतिनिधित्वको कारणले गर्दा [49]।
यस पत्रमा, हामी LB अवधारणालाई सिपी कीराहरूमा लागू गर्छौं, तर्क गर्छौं कि हेमोलिम्फ ccfDNA शट अनुक्रमणले समुद्री तटीय पारिस्थितिक प्रणालीको संरचनामा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ। विशेष गरी, हामीले फेला पार्यौं कि १) सिपी कीरा हेमोलिम्फमा अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (माइक्रोग्राम स्तर) अपेक्षाकृत ठूला (~१-५ kb) परिसंचरण गर्ने DNA टुक्राहरू छन्; २) यी DNA टुक्राहरू स्वतन्त्र र गैर-स्वतन्त्र दुवै छन् ३) यी DNA टुक्राहरूको विदेशी स्रोतहरू मध्ये, हामीले ब्याक्टेरिया, आर्किएल र भाइरल DNA, साथै अन्य बहुकोशिकीय जनावरहरूको DNA भेट्टायौं; ४) हेमोलिम्फमा यी विदेशी ccfDNA टुक्राहरूको संचय द्रुत रूपमा हुन्छ र सिपी कीराहरूको आन्तरिक फिल्टरिंग गतिविधिमा योगदान पुर्‍याउँछ। निष्कर्षमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि LB को अवधारणा, जुन अहिलेसम्म मुख्यतया बायोमेडिसिनको क्षेत्रमा लागू गरिएको छ, ज्ञानको एक समृद्ध तर अनपेक्षित स्रोतलाई एन्कोड गर्दछ जुन सेन्टिनेल प्रजातिहरू र तिनीहरूको वातावरण बीचको अन्तरक्रियालाई राम्रोसँग बुझ्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
प्राइमेटहरूका अतिरिक्त, मुसा, कुकुर, बिरालो र घोडाहरू सहित स्तनधारी जनावरहरूमा ccfDNA अलगाव रिपोर्ट गरिएको छ [50, 51, 52]। यद्यपि, हाम्रो ज्ञान अनुसार, हाम्रो अध्ययन खुला परिसंचरण प्रणाली भएका समुद्री प्रजातिहरूमा ccfDNA को पत्ता लगाउने र अनुक्रमण गर्ने पहिलो अध्ययन हो। सिपी कीराहरूको यो शारीरिक विशेषता र फिल्टर गर्ने क्षमताले, कम्तिमा आंशिक रूपमा, अन्य प्रजातिहरूको तुलनामा परिसंचरण DNA टुक्राहरूको फरक आकारका विशेषताहरूलाई व्याख्या गर्न सक्छ। मानिसहरूमा, रगतमा परिसंचरण गर्ने अधिकांश DNA टुक्राहरू 150 देखि 200 bp सम्मको आकारका साना टुक्राहरू हुन्। अधिकतम शिखर 167 bp [34, 53]। DNA टुक्राहरूको सानो तर महत्त्वपूर्ण भाग 300 र 500 bp आकारको बीचमा हुन्छ, र लगभग 5% 900 bp भन्दा लामो हुन्छ। [54]। यो आकार वितरणको कारण यो हो कि प्लाज्मामा ccfDNA को मुख्य स्रोत कोशिका मृत्युको परिणामस्वरूप हुन्छ, या त कोशिका मृत्युको कारणले वा स्वस्थ व्यक्तिहरूमा परिसंचरण गर्ने हेमाटोपोएटिक कोशिकाहरूको नेक्रोसिसको कारणले वा क्यान्सर बिरामीहरूमा ट्यूमर कोशिकाहरूको एपोप्टोसिसको कारणले (जसलाई परिसंचरण गर्ने ट्यूमर DNA भनिन्छ)। , ctDNA)। हामीले सिपी कीराहरूमा फेला पारेको हेमोलिम्फ ccfDNA को आकार वितरण १००० देखि ५००० bp सम्म थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि सिपी कीराहरूको ccfDNA को फरक उत्पत्ति हुन्छ। यो एक तार्किक परिकल्पना हो, किनकि सिपी कीराहरूमा अर्ध-खुला भास्कुलर प्रणाली हुन्छ र माइक्रोबियल जीनोमिक DNA को उच्च सांद्रता भएको समुद्री जलीय वातावरणमा बस्छन्। वास्तवमा, बाह्य DNA प्रयोग गर्ने हाम्रो प्रयोगशाला प्रयोगहरूले देखाएको छ कि सिपी कीराहरूले समुद्री पानीमा DNA टुक्राहरू जम्मा गर्छन्, कम्तिमा केही घण्टा पछि तिनीहरू सेलुलर अपटेक पछि घट्छन् र/वा रिलीज हुन्छन् र/वा विभिन्न संस्थाहरूमा भण्डारण गरिन्छ। कोशिकाहरूको दुर्लभतालाई ध्यानमा राख्दै (प्रोकारियोटिक र युकेरियोटिक दुवै), इन्ट्राभल्भ्युलर कम्पार्टमेन्टहरूको प्रयोगले स्व-स्रोतहरू साथै विदेशी स्रोतहरूबाट ccfDNA को मात्रा घटाउनेछ। बाइभल्भ जन्मजात प्रतिरक्षाको महत्त्व र ठूलो संख्यामा परिसंचरण हुने फागोसाइटहरूको महत्त्वलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले थप परिकल्पना गर्यौं कि विदेशी ccfDNA पनि सूक्ष्मजीवहरू र/वा सेलुलर मलबेको सेवन गर्दा विदेशी DNA जम्मा गर्ने परिसंचरण हुने फागोसाइटहरूमा समृद्ध हुन्छ। एकसाथ लिँदा, हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि बाइभल्भ हेमोलिम्फ ccfDNA आणविक जानकारीको एक अद्वितीय भण्डार हो र एक सेन्टिनेल प्रजातिको रूपमा तिनीहरूको स्थितिलाई सुदृढ बनाउँछ।
हाम्रो तथ्याङ्कले ब्याक्टेरियाबाट व्युत्पन्न हेमोलिम्फ ccfDNA टुक्राहरूको अनुक्रमण र विश्लेषणले होस्ट ब्याक्टेरिया वनस्पति र वरपरको समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीमा उपस्थित ब्याक्टेरियाको बारेमा प्रमुख जानकारी प्रदान गर्न सक्छ भन्ने संकेत गर्छ। शट अनुक्रमण प्रविधिहरूले कमेन्सल ब्याक्टेरिया A. atra गिलको अनुक्रमहरू प्रकट गरेको छ जुन परम्परागत 16S rRNA पहिचान विधिहरू प्रयोग गरिएको भए छुट्ने थियो, आंशिक रूपमा सन्दर्भ पुस्तकालय पूर्वाग्रहको कारणले। वास्तवमा, केर्गुलेनमा एउटै सिपी तहमा M. प्लेटेन्सिसबाट सङ्कलन गरिएको LB डेटाको हाम्रो प्रयोगले देखायो कि गिल-सम्बन्धित ब्याक्टेरिया सिम्बियोन्टहरूको संरचना दुवै सिपी प्रजातिहरूको लागि समान थियो (चित्र S4, पूरक जानकारी)। दुई आनुवंशिक रूपमा फरक सिपीहरूको यो समानताले केर्गुलेनको चिसो, सल्फरयुक्त र ज्वालामुखी निक्षेपहरूमा ब्याक्टेरिया समुदायहरूको संरचनालाई प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ [55, 56, 57, 58]। पोर्ट-औ-फ्रान्सको तट जस्ता जैविक टर्बेटेड तटीय क्षेत्रहरू [59] बाट सिपीहरू काट्दा सल्फर-कम गर्ने सूक्ष्मजीवहरूको उच्च स्तर राम्रोसँग वर्णन गरिएको छ। अर्को सम्भावना यो छ कि कोमेन्सल सिपी कीराको वनस्पति तेर्सो प्रसारणबाट प्रभावित हुन सक्छ [60, 61]। समुद्री वातावरण, समुद्री सतह र सिपी कीरामा सिम्बायोटिक ब्याक्टेरियाको संरचना बीचको सम्बन्ध निर्धारण गर्न थप अनुसन्धान आवश्यक छ। यी अध्ययनहरू हाल जारी छन्।
हेमोलिम्फ ccfDNA को लम्बाइ र सांद्रता, यसको शुद्धीकरणको सहजता, र द्रुत बन्दुक अनुक्रमणलाई अनुमति दिन उच्च गुणस्तर समुद्री तटीय पारिस्थितिक प्रणालीमा जैविक विविधताको मूल्याङ्कन गर्न मसेल ccfDNA प्रयोग गर्ने धेरै फाइदाहरू मध्ये केही हुन्। यो दृष्टिकोण विशेष गरी दिइएको पारिस्थितिक प्रणालीमा भाइरल समुदायहरू (भाइरोमहरू) को विशेषता निर्धारण गर्न प्रभावकारी छ [62, 63]। ब्याक्टेरिया, आर्किया र युकेरियोट्सको विपरीत, भाइरल जीनोमहरूमा 16S अनुक्रमहरू जस्ता फाइलोजेनेटिक रूपमा संरक्षित जीनहरू हुँदैनन्। हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि मसेल जस्ता सूचक प्रजातिहरूबाट तरल बायोप्सीहरू सामान्यतया तटीय समुद्री पारिस्थितिक प्रणालीहरूमा बस्ने होस्टहरूलाई संक्रमित गर्न ज्ञात ccfDNA भाइरस टुक्राहरूको अपेक्षाकृत ठूलो संख्या पहिचान गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ। यसमा प्रोटोजोआ, आर्थ्रोपोड, कीरा, बोटबिरुवा र ब्याक्टेरिया भाइरसहरू (जस्तै, ब्याक्टेरियोफेजहरू) लाई संक्रमित गर्न ज्ञात भाइरसहरू समावेश छन्। हामीले केर्गुलेनमा एउटै मसेल तहमा सङ्कलन गरिएको नीलो मसेल (M. platensis) को हेमोलिम्फ ccfDNA भाइरोमको जाँच गर्दा समान वितरण फेला पर्यो (तालिका S2, पूरक जानकारी)। ccfDNA को शटगन अनुक्रमण वास्तवमा मानव वा अन्य प्रजातिहरूको भाइरसको अध्ययनमा गति लिइरहेको नयाँ दृष्टिकोण हो [21, 37, 64]। यो दृष्टिकोण विशेष गरी डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA भाइरसहरूको अध्ययनको लागि उपयोगी छ, किनकि बाल्टिमोरमा भाइरसहरूको सबैभन्दा विविध र फराकिलो वर्गको प्रतिनिधित्व गर्ने सबै डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA भाइरसहरूमा कुनै पनि जीन संरक्षित छैन [65]। यद्यपि यी धेरैजसो भाइरसहरू वर्गीकृत छैनन् र भाइरल संसारको पूर्ण रूपमा अज्ञात भागबाट भाइरसहरू समावेश हुन सक्छन् [66], हामीले पत्ता लगायौं कि सिपी A. atra र M. platensis को भाइरस र होस्ट दायराहरू दुई प्रजातिहरू बीच पर्छन्। त्यस्तै गरी (चित्र S3, थप जानकारी हेर्नुहोस्)। यो समानता आश्चर्यजनक छैन, किनकि यसले वातावरणमा उपस्थित DNA को अवशोषणमा चयनात्मकताको कमीलाई प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ। RNA भाइरसको विशेषता निर्धारण गर्न शुद्ध RNA प्रयोग गर्ने भविष्यका अध्ययनहरू हाल आवश्यक छन्।
हाम्रो अध्ययनमा, हामीले कोवार्स्की र सहकर्मीहरूको कामबाट अनुकूलित धेरै कठोर पाइपलाइन प्रयोग गर्यौं [37], जसले नेटिभ ccfDNA को एसेम्बली अघि र पछि पूल गरिएको रिड र कन्टिगहरूको दुई-चरण मेटाउने प्रयोग गर्‍यौं, जसले गर्दा अनम्याप गरिएको रिडहरूको उच्च अनुपात भयो। त्यसकारण, हामी यो कुरालाई अस्वीकार गर्न सक्दैनौं कि यी अनम्याप गरिएका रिडहरू मध्ये केहीको अझै पनि आफ्नै उत्पत्ति हुन सक्छ, मुख्यतया किनभने हामीसँग यस मसल प्रजातिको लागि सन्दर्भ जीनोम छैन। हामीले यो पाइपलाइन पनि प्रयोग गर्यौं किनभने हामी स्व र गैर-स्व-रिडहरू बीचको काइमेराहरू र इलुमिना MiSeq PE75 द्वारा उत्पन्न गरिएको पढ्ने लम्बाइको बारेमा चिन्तित थियौं। धेरैजसो अनचार्टेड रिडिङहरूको अर्को कारण यो हो कि धेरैजसो समुद्री सूक्ष्मजीवहरू, विशेष गरी केर्गुलेन जस्ता दुर्गम क्षेत्रहरूमा, एनोटेट गरिएको छैन। हामीले इलुमिना MiSeq PE75 प्रयोग गर्यौं, मान्दै कि ccfDNA टुक्रा लम्बाइ मानव ccfDNA जस्तै छ। भविष्यका अध्ययनहरूका लागि, हाम्रो नतिजाहरूले हेमोलिम्फ ccfDNA लाई मानिस र/वा स्तनधारी जनावरहरू भन्दा लामो पढ्ने देखाएको छ, हामी लामो ccfDNA टुक्राहरूको लागि उपयुक्त अनुक्रमण प्लेटफर्म प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं। यो अभ्यासले गहिरो विश्लेषणको लागि थप संकेतहरू पहिचान गर्न धेरै सजिलो बनाउनेछ। हाल अनुपलब्ध पूर्ण A. atra आणविक जीनोम अनुक्रम प्राप्त गर्नाले स्व र गैर-स्व स्रोतहरूबाट ccfDNA को भेदभावलाई पनि धेरै सहज बनाउनेछ। हाम्रो अनुसन्धानले तरल बायोप्सीको अवधारणालाई सिपी कीराहरूमा लागू गर्ने सम्भावनामा केन्द्रित भएकोले, हामी आशा गर्छौं कि भविष्यको अनुसन्धानमा यो अवधारणा प्रयोग गरिएपछि, सिपी कीराहरूको माइक्रोबियल विविधता अध्ययन गर्न यस विधिको सम्भावना बढाउन नयाँ उपकरणहरू र पाइपलाइनहरू विकास गरिनेछ। समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र।
गैर-आक्रामक क्लिनिकल बायोमार्करको रूपमा, ccfDNA को बढेको मानव प्लाज्मा स्तर विभिन्न रोगहरू, तन्तु क्षति, र तनाव अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित छ [67,68,69]। यो वृद्धि तन्तु क्षति पछि यसको आफ्नै उत्पत्तिको DNA टुक्राहरूको रिलीजसँग सम्बन्धित छ। हामीले तीव्र ताप तनाव प्रयोग गरेर यो मुद्दालाई सम्बोधन गर्यौं, जसमा मसेलहरू 30 डिग्री सेल्सियसको तापक्रममा छोटो समयको लागि उजागर भएका थिए। हामीले तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा तीन फरक प्रकारका मसेलहरूमा यो विश्लेषण गर्यौं। यद्यपि, हामीले तीव्र ताप तनाव पछि ccfDNA स्तरमा कुनै परिवर्तन फेला पारेनौं (चित्र S5, थप जानकारी हेर्नुहोस्)। यो खोजले कम्तिमा आंशिक रूपमा, मसेलहरूमा अर्ध-खुला परिसंचरण प्रणाली हुन्छ र तिनीहरूको उच्च फिल्टरिंग गतिविधिको कारणले ठूलो मात्रामा विदेशी DNA जम्मा हुन्छ भन्ने तथ्यलाई व्याख्या गर्न सक्छ। अर्कोतर्फ, मसेलहरू, धेरै इन्भर्टेब्रेट्स जस्तै, तनाव-प्रेरित तन्तु क्षतिको लागि बढी प्रतिरोधी हुन सक्छन्, जसले गर्दा तिनीहरूको हेमोलिम्फमा ccfDNA को रिलीज सीमित हुन्छ [70, 71]।
आजसम्म, जलीय पारिस्थितिक प्रणालीमा जैविक विविधताको DNA विश्लेषण मुख्यतया वातावरणीय DNA (eDNA) मेटाबारकोडिङमा केन्द्रित छ। यद्यपि, प्राइमरहरू प्रयोग गर्दा जैविक विविधता विश्लेषणमा यो विधि सामान्यतया सीमित हुन्छ। शटगन अनुक्रमणको प्रयोगले PCR को सीमितता र प्राइमर सेटहरूको पक्षपाती चयनलाई बेवास्ता गर्दछ। यसरी, एक अर्थमा, हाम्रो विधि हालसालै प्रयोग गरिएको उच्च-थ्रुपुट eDNA शटगन अनुक्रमण विधिको नजिक छ, जसले खण्डित DNA लाई प्रत्यक्ष रूपमा अनुक्रम गर्न र लगभग सबै जीवहरूको विश्लेषण गर्न सक्षम छ [72, 73]। यद्यपि, त्यहाँ धेरै आधारभूत मुद्दाहरू छन् जसले LB लाई मानक eDNA विधिहरूबाट छुट्याउँछ। अवश्य पनि, eDNA र LB बीचको मुख्य भिन्नता प्राकृतिक फिल्टर होस्टहरूको प्रयोग हो। eDNA अध्ययनको लागि प्राकृतिक फिल्टरको रूपमा स्पन्ज र बाइभल्भ (Dresseina spp.) जस्ता समुद्री प्रजातिहरूको प्रयोग रिपोर्ट गरिएको छ [74, 75]। यद्यपि, Dreissena को अध्ययनले DNA निकालिएको तन्तु बायोप्सीहरू प्रयोग गर्‍यो। LB बाट ccfDNA को विश्लेषण गर्न टिस्यु बायोप्सी, विशेष र कहिलेकाहीं महँगो उपकरण र eDNA वा टिस्यु बायोप्सीसँग सम्बन्धित रसदको आवश्यकता पर्दैन। वास्तवमा, हामीले भर्खरै रिपोर्ट गरेका छौं कि LB बाट ccfDNA लाई FTA समर्थनको साथ भण्डारण र विश्लेषण गर्न सकिन्छ कोल्ड चेन कायम नगरी, जुन दुर्गम क्षेत्रहरूमा अनुसन्धानको लागि एक प्रमुख चुनौती हो [76]। तरल बायोप्सीबाट ccfDNA को निकासी पनि सरल छ र शटगन अनुक्रमण र PCR विश्लेषणको लागि उच्च गुणस्तरको DNA प्रदान गर्दछ। eDNA विश्लेषणसँग सम्बन्धित केही प्राविधिक सीमितताहरूलाई ध्यानमा राख्दै यो एक ठूलो फाइदा हो [77]। नमूना विधिको सरलता र कम लागत दीर्घकालीन अनुगमन कार्यक्रमहरूको लागि पनि विशेष गरी उपयुक्त छ। तिनीहरूको उच्च फिल्टरिङ क्षमताको अतिरिक्त, बाइभल्भहरूको अर्को प्रसिद्ध विशेषता तिनीहरूको म्यूकसको रासायनिक म्यूकोपोलिसेकराइड संरचना हो, जसले भाइरसहरूको अवशोषणलाई बढावा दिन्छ [78, 79]। यसले बाइभल्भहरूलाई दिइएको जलीय पारिस्थितिक प्रणालीमा जैविक विविधता र जलवायु परिवर्तनको प्रभावलाई चित्रण गर्न एक आदर्श प्राकृतिक फिल्टर बनाउँछ। यद्यपि होस्ट-व्युत्पन्न DNA टुक्राहरूको उपस्थिति eDNA को तुलनामा विधिको सीमितताको रूपमा देख्न सकिन्छ, eDNA को तुलनामा यस्तो नेटिभ ccfDNA हुनुसँग सम्बन्धित लागत स्वास्थ्य अध्ययनहरूको लागि उपलब्ध विशाल जानकारीको लागि एकै साथ बुझ्न सकिन्छ। अफसेट होस्ट। यसमा होस्ट होस्टको जीनोममा एकीकृत भाइरल अनुक्रमहरूको उपस्थिति समावेश छ। यो विशेष गरी सिपी कीराहरूको लागि महत्त्वपूर्ण छ, बाइभल्भहरूमा तेर्सो रूपमा प्रसारित ल्युकेमिक रेट्रोभाइरसहरूको उपस्थितिलाई ध्यानमा राख्दै [80, 81]। eDNA भन्दा LB को अर्को फाइदा यो हो कि यसले हेमोलिम्फमा रक्त कोशिकाहरू परिसंचरण गर्ने फागोसाइटिक गतिविधिको शोषण गर्दछ, जसले सूक्ष्मजीवहरू (र तिनीहरूको जीनोमहरू) लाई घेर्छ। फ्यागोसाइटोसिस बाइभल्भहरूमा रक्त कोशिकाहरूको मुख्य कार्य हो [82]। अन्तमा, विधिले सिपी कीराहरूको उच्च फिल्टरिंग क्षमता (औसत 1.5 l/h समुद्री पानी) र दुई-दिनको परिसंचरणको फाइदा लिन्छ, जसले समुद्री पानीको विभिन्न तहहरूको मिश्रण बढाउँछ, हेटेरोलोगस eDNA को कब्जा गर्न अनुमति दिन्छ। [83, 84]। तसर्थ, सिपी कीराको पोषण, आर्थिक र वातावरणीय प्रभावलाई ध्यानमा राख्दै, सिपी कीराको ccfDNA विश्लेषण एक रोचक माध्यम हो। मानिसबाट सङ्कलन गरिएको LB को विश्लेषण जस्तै, यो विधिले बाह्य पदार्थहरूको प्रतिक्रियामा होस्ट DNA मा आनुवंशिक र एपिजेनेटिक परिवर्तनहरू मापन गर्ने सम्भावना पनि खोल्छ। उदाहरणका लागि, न्यानोपोर सिक्वेन्सिङ प्रयोग गरेर नेटिभ ccfDNA मा जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण गर्न तेस्रो-पुस्ताको अनुक्रमण प्रविधिहरूको परिकल्पना गर्न सकिन्छ। यो प्रक्रियालाई यो तथ्यले सहज बनाउनु पर्छ कि सिपी कीराको ccfDNA टुक्राहरूको लम्बाइ लामो-पढ्ने अनुक्रमण प्लेटफर्महरूसँग आदर्श रूपमा उपयुक्त छ जसले रासायनिक रूपान्तरणको आवश्यकता बिना एकल अनुक्रमणबाट जीनोम-वाइड DNA मिथाइलेशन विश्लेषण चलाउन अनुमति दिन्छ।85,86] यो एक रोचक सम्भावना हो, किनकि यो देखाइएको छ कि DNA मिथाइलेशन ढाँचाहरूले वातावरणीय तनावको प्रतिक्रिया प्रतिबिम्बित गर्दछ र धेरै पुस्ताहरूमा जारी रहन्छ। त्यसकारण, यसले जलवायु परिवर्तन वा प्रदूषकहरूको सम्पर्क पछि प्रतिक्रियालाई नियन्त्रण गर्ने अन्तर्निहित संयन्त्रहरूमा बहुमूल्य अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ [87]। यद्यपि, LB को प्रयोग सीमाहरू बिना छैन। भन्नु पर्दैन, यसको लागि पारिस्थितिक प्रणालीमा सूचक प्रजातिहरूको उपस्थिति आवश्यक छ। माथि उल्लेख गरिएझैं, दिइएको पारिस्थितिक प्रणालीको जैविक विविधताको मूल्याङ्कन गर्न LB प्रयोग गर्न पनि स्रोतबाट DNA टुक्राहरूको उपस्थितिलाई ध्यानमा राख्ने कठोर जैविक सूचना विज्ञान पाइपलाइन आवश्यक पर्दछ। अर्को प्रमुख समस्या समुद्री प्रजातिहरूको लागि सन्दर्भ जीनोमहरूको उपलब्धता हो। आशा छ कि समुद्री स्तनधारी जीनोम परियोजना र हालै स्थापित Fish10k परियोजना [88] जस्ता पहलहरूले भविष्यमा यस्तो विश्लेषणलाई सहज बनाउनेछन्। समुद्री फिल्टर-फिडिङ जीवहरूमा LB अवधारणाको प्रयोग अनुक्रमण प्रविधिमा नवीनतम प्रगतिहरूसँग पनि उपयुक्त छ, जसले गर्दा वातावरणीय तनावको प्रतिक्रियामा समुद्री बासस्थानको स्वास्थ्यको बारेमा महत्त्वपूर्ण जानकारी प्रदान गर्न बहु-ओम बायोमार्करहरूको विकासको लागि यसलाई राम्रोसँग उपयुक्त बनाउँछ।
जीनोम सिक्वेन्सिङ डेटा NCBI सिक्वेन्स रिड आर्काइभ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 मा बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 अन्तर्गत जम्मा गरिएको छ।
ब्रियरली एएस, किंग्सफोर्ड एमजे समुद्री जीवन र पारिस्थितिक प्रणालीमा जलवायु परिवर्तनको प्रभाव। कोल जीवविज्ञान। २००९; १९: P602–P614।
गिस्सी ई, मानिया ई, मजारिस एडी, फ्राशेट्टी एस, अल्म्पानिडो वी, बेभिलाक्वा एस, आदि। जलवायु परिवर्तन र समुद्री वातावरणमा अन्य स्थानीय तनावका संयुक्त प्रभावहरूलाई विचार गर्नुहोस्। सामान्य वैज्ञानिक वातावरण। २०२१;७५५:१४२५६४।
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al। )। मार्चको पहिलो विज्ञान। २०२०; ७:४८।
सेरोन्ट एल, निकास्ट्रो सीआर, जरदी जीआई, गोबरभिल ई। दोहोरिने गर्मी तनावको अवस्थामा कम ताप सहनशीलताले नीलो सिपी कीराको उच्च गर्मी मृत्युदरलाई व्याख्या गर्दछ। वैज्ञानिक रिपोर्ट २०१९; ९:१७४९८।
फे एसबी, सिपिएलस्की एएम, नुस्ले एस, सर्भान्टेस-योशिदा के, ह्वान जेएल, ह्युबर ईआर, आदि। जनावरको मृत्युको आवृत्ति, कारण र हदमा हालसालै भएका परिवर्तनहरू। प्रोक नेटल एकेड साइन्स युएसए। २०१५; ११२: १०८३-८।
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al। धेरै गैर-प्रजाति-विशिष्ट रोगजनकहरूले पिन्ना नोबिलिसको सामूहिक मृत्युको कारण हुन सक्छ। जीवन। २०२०; १०:२३८।
ब्राडली एम, काउट्स एसजे, जेनकिन्स ई, ओ'हारा टीएम। आर्कटिक जुनोटिक रोगहरूमा जलवायु परिवर्तनको सम्भावित प्रभाव। इन्टर जे सर्कम्पोलर स्वास्थ्य। २००५; ६४:४६८–७७।
बेयर जे., ग्रीन एनडब्ल्यू, ब्रूक्स एस., एलन आईजे, रुस ए., गोमेज टी. एट अल। तटीय प्रदूषण अनुगमनमा संकेत जीवहरूको रूपमा नीलो सिपी कीरा (माइटिलस एडुलिस एसपीपी.): एक समीक्षा। मार्च वातावरणीय अध्ययन २०१७; १३०:३३८-६५।
सिराभेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बार्डेली ए। क्यान्सर उपचारमा तरल बायोप्सीको एकीकरण। नेट रेभ क्लीन ओन्कोल। २०१७; १४:५३१–४८।
वान जेसीएम, मासी सी, गार्सिया-कोर्बाचो जे, मौलिएर एफ, ब्रेन्टन जेडी, काल्डास सी, एट अल। तरल बायोप्सी परिपक्वता: ट्यूमर डीएनएलाई परिसंचरण गर्न अनुमति दिन्छ। नेट रेभ क्यान्सर। २०१७;१७:२२३–३८।
मन्डेल पी., मेटाइस पी. मानव प्लाज्मामा न्यूक्लिक एसिड। सोस बायोल सहायक कम्पनीहरूको बैठक मिनेट। १९४८; १४२:२४१-३।
ब्रोंखोर्स्ट एजे, उंगेरर डब्ल्यू, होल्डेनरीडर एस। क्यान्सर उपचारको लागि आणविक मार्करको रूपमा कोशिका-मुक्त डीएनएको लागि नयाँ भूमिका। बायोमोलर विश्लेषणको परिमाणीकरण। २०१९;१७:१०००८७।
इग्नाटियाडिस एम., स्लेज जीडब्ल्यू, जेफ्री एसएस लिक्विड बायोप्सी क्लिनिकमा प्रवेश गर्छ - कार्यान्वयनका मुद्दाहरू र भविष्यका चुनौतीहरू। नेट रेभ क्लिन ओन्कोल। २०२१; १८:२९७–३१२।
लो वाईएम, कोर्बेटा एन., चेम्बरलेन पीएफ, राई डब्ल्यू., सार्जेन्ट आईएल, रेडम्यान सीडब्ल्यू र अन्य। भ्रूण डीएनए मातृ प्लाज्मा र सीरममा उपस्थित हुन्छ। ल्यान्सेट। १९९७; ३५०:४८५-७।
मुफारे एमएन, वोंग आरजे, श जीएम, स्टीभेन्सन डीके, क्वेक एसआर गर्भावस्थाको समयमा महिलाहरूको रगतमा परिसंचरण हुने बाह्य कोशिकीय आरएनए प्रयोग गरेर गर्भावस्थाको क्रममा र यसको जटिलताहरूको अध्ययन। डोपेडियाट्रिक्स। २०२०;८:६०५२१९।
ओलेरिच एम, शेरवुड के, केउन पी, शुट्ज ई, बेक जे, स्टेगबाउर जे, एट अल। लिक्विड बायोप्सी: मिर्गौला ग्राफ्टमा एलोजेनिक घावहरू पत्ता लगाउन दाता कोष-मुक्त डीएनए प्रयोग गरिन्छ। नेट रेभ नेफ्रोल। २०२१; १७:५९१–६०३।
जुआन एफसी, लो वाईएम प्रसवपूर्व निदानमा नवीनता: मातृ प्लाज्मा जीनोम अनुक्रमण। अन्ना एमडी। २०१६;६७:४१९-३२।
गु डब्लु, डेङ एक्स, ली एम, सुकु वाईडी, अरेभालो एस, स्ट्राइक डी, एट अल। संक्रमित शारीरिक तरल पदार्थको अर्को पुस्ताको मेटाजेनोमिक अनुक्रमणको साथ द्रुत रोगजनक पत्ता लगाउने। नेट मेडिसिन। २०२१;२७:११५-२४।