Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। यसै बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
औषधि परीक्षणको लागि मुटुको शारीरिक वातावरणलाई सही रूपमा पुनरुत्पादन गर्न सक्ने भरपर्दो इन भिट्रो प्रणालीको आवश्यकता छ। मानव मुटुको तन्तु संस्कृति प्रणालीहरूको सीमित उपलब्धताले हृदयको औषधि प्रभावहरूको गलत व्याख्या निम्त्याएको छ। यहाँ, हामीले कार्डियक टिस्यु कल्चर मोडेल (CTCM) विकास गरेका छौं जसले इलेक्ट्रोमेकानिकली मुटुका टुक्राहरूलाई उत्तेजित गर्छ र हृदय चक्रको सिस्टोलिक र डायस्टोलिक चरणहरूमा शारीरिक तनावबाट गुज्रन्छ। १२ दिनको कल्चर पछि, यो दृष्टिकोणले हृदय खण्डहरूको व्यवहार्यतामा आंशिक रूपमा सुधार ल्यायो, तर तिनीहरूको संरचनात्मक अखण्डतालाई पूर्ण रूपमा सुरक्षित राखेन। त्यसकारण, सानो अणु स्क्रिनिङ पछि, हामीले पत्ता लगायौं कि हाम्रो माध्यममा १०० nM ट्राइयोडोथायरोनिन (T3) र १ μM डेक्सामेथासोन (Dex) थप्दा १२ दिनसम्म खण्डहरूको सूक्ष्म संरचना कायम रह्यो। T3/Dex उपचारको संयोजनमा, CTCM प्रणालीले १२ दिनसम्म ताजा मुटुको तन्तुको समान स्तरमा ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोफाइलहरू, व्यवहार्यता, चयापचय गतिविधि, र संरचनात्मक अखण्डता कायम राख्यो। यसको अतिरिक्त, कल्चरमा कार्डियक टिस्युको अत्यधिक स्ट्रेचिङले हाइपरट्रोफिक कार्डियक सिग्नलिङलाई प्रेरित गर्छ, जसले कार्डियक स्ट्रेचबाट प्रेरित हाइपरट्रोफिक अवस्थाहरूको नक्कल गर्न CTCM को क्षमताको प्रमाण प्रदान गर्दछ। निष्कर्षमा, CTCM ले लामो समयसम्म कल्चरमा मुटुको फिजियोलोजी र प्याथोफिजियोलोजीलाई मोडेल गर्न सक्छ, जसले भरपर्दो औषधि स्क्रिनिङलाई सक्षम बनाउँछ।
क्लिनिकल अनुसन्धान गर्नु अघि, भरपर्दो इन भिट्रो प्रणालीहरू आवश्यक पर्दछ जसले मानव मुटुको शारीरिक वातावरणलाई सही रूपमा पुनरुत्पादन गर्न सक्छ। त्यस्ता प्रणालीहरूले परिवर्तन गरिएका मेकानिकल स्ट्रेच, मुटुको गति, र इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल गुणहरूको नक्कल गर्नुपर्छ। पशु मोडेलहरू सामान्यतया हृदय शरीरक्रिया विज्ञानको लागि स्क्रिनिङ प्लेटफर्मको रूपमा प्रयोग गरिन्छ जसमा मानव मुटुमा औषधिहरूको प्रभावहरू प्रतिबिम्बित गर्न सीमित विश्वसनीयता हुन्छ। १,२। अन्ततः, आदर्श कार्डियक टिस्यु कल्चर एक्सपेरिमेन्टल मोडेल (CTCM) एक मोडेल हो जुन विभिन्न चिकित्सीय र औषधीय हस्तक्षेपहरूको लागि अत्यधिक संवेदनशील र विशिष्ट छ, जसले मानव मुटुको शरीरक्रिया विज्ञान र प्याथोफिजियोलोजीलाई सही रूपमा पुनरुत्पादन गर्दछ। यस्तो प्रणालीको अनुपस्थितिले हृदय विफलताको लागि नयाँ उपचारहरूको खोजलाई सीमित गर्दछ ४,५ र बजारबाट बाहिर निस्कनुको प्रमुख कारणको रूपमा औषधि कार्डियोटोक्सिसिटीलाई निम्त्याएको छ।
विगत एक दशकमा, आठ गैर-हृदय रोग औषधिहरू क्लिनिकल प्रयोगबाट फिर्ता लिइएको छ किनभने तिनीहरूले QT अन्तराल लम्बाइ निम्त्याउँछन् जसले गर्दा भेन्ट्रिकुलर एरिथमिया र अचानक मृत्यु हुन्छ। यसरी, हृदय रोगको प्रभावकारिता र विषाक्तता मूल्याङ्कन गर्न भरपर्दो प्रिक्लिनिकल स्क्रिनिङ रणनीतिहरूको बढ्दो आवश्यकता छ। औषधि स्क्रिनिङ र विषाक्तता परीक्षणमा मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेन्ट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPS-CM) को हालैको प्रयोगले यस समस्याको आंशिक समाधान प्रदान गर्दछ। यद्यपि, hiPS-CM को अपरिपक्व प्रकृति र हृदय रोगको तन्तुको बहुकोशिकीय जटिलताको अभाव यस विधिको प्रमुख सीमितताहरू हुन्। हालैका अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि प्रारम्भिक hiPS-CM प्रयोग गरेर सहज संकुचन सुरु भएको केही समय पछि कार्डियाक टिस्यु हाइड्रोजेलहरू गठन गरेर र समयसँगै बिस्तारै विद्युतीय उत्तेजना बढाएर यो सीमिततालाई आंशिक रूपमा पार गर्न सकिन्छ। यद्यपि, यी hiPS-CM सूक्ष्म ऊतकहरूमा वयस्क मायोकार्डियमको परिपक्व इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल र संकुचनशील गुणहरूको अभाव छ। यसको अतिरिक्त, मानव हृदयको तन्तुको संरचना अझ जटिल हुन्छ, जसमा एन्डोथेलियल कोषहरू, न्यूरोन्स र स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्टहरू सहित विभिन्न कोष प्रकारहरूको विषम मिश्रण हुन्छ, जुन बाह्यकोशिकीय म्याट्रिक्स प्रोटीनहरूको विशिष्ट सेटहरूद्वारा आपसमा जोडिएको हुन्छ। वयस्क स्तनधारी मुटुमा गैर-कार्डियोमायोसाइट जनसंख्या ११,१२,१३ को यो विषमता व्यक्तिगत कोष प्रकारहरू प्रयोग गरेर हृदयको तन्तुको मोडेलिङ गर्न प्रमुख बाधा हो। यी प्रमुख सीमितताहरूले शारीरिक र रोगविज्ञान अवस्थाहरूमा अक्षुण्ण मायोकार्डियल तन्तुको संवर्धनको लागि विधिहरू विकास गर्ने महत्त्वलाई जोड दिन्छन्।
मानव मुटुको कल्चर्ड पातलो (३०० µm) खण्डहरू अक्षुण्ण मानव मायोकार्डियमको आशाजनक मोडेल साबित भएका छन्। यो विधिले मानव मुटुको तन्तु जस्तै पूर्ण ३D बहुकोशिकीय प्रणालीमा पहुँच प्रदान गर्दछ। यद्यपि, २०१९ सम्म, कल्चर्ड मुटु खण्डहरूको प्रयोग छोटो (२४ घण्टा) कल्चर अस्तित्व द्वारा सीमित थियो। यो भौतिक-यांत्रिक स्ट्रेचको अभाव, हावा-तरल इन्टरफेस, र कार्डियक टिस्युको आवश्यकताहरूलाई समर्थन नगर्ने साधारण मिडियाको प्रयोग सहित धेरै कारकहरूको कारणले हो। २०१९ मा, धेरै अनुसन्धान समूहहरूले कार्डियक टिस्यु कल्चर प्रणालीहरूमा मेकानिकल कारकहरू समावेश गर्नाले कल्चर जीवन विस्तार गर्न, कार्डियक अभिव्यक्ति सुधार गर्न र कार्डियक प्याथोलोजीको नक्कल गर्न सक्छ भनेर प्रदर्शन गरे। दुई सुरुचिपूर्ण अध्ययनहरू १७ र १८ ले देखाउँछन् कि एकअक्षीय मेकानिकल लोडिङले कल्चरको समयमा कार्डियक फेनोटाइपमा सकारात्मक प्रभाव पार्छ। यद्यपि, यी अध्ययनहरूले कार्डियक चक्रको गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक लोडिङ प्रयोग गरेनन्, किनकि मुटुका खण्डहरू आइसोमेट्रिक तन्य बल १७ वा रेखीय अक्सोटोनिक लोडिङ १८ ले लोड गरिएको थियो। टिस्यु स्ट्रेचिङका यी विधिहरूले धेरै कार्डियक जीनहरूको दमन वा असामान्य स्ट्रेच प्रतिक्रियाहरूसँग सम्बन्धित जीनहरूको अत्यधिक अभिव्यक्तिको परिणामस्वरूप परिणामस्वरूप भयो। उल्लेखनीय रूपमा, पिटौलिस एट अल। १९ ले बल ट्रान्सड्यूसर प्रतिक्रिया र तनाव ड्राइभहरू प्रयोग गरेर कार्डियक साइकल पुनर्निर्माणको लागि गतिशील हार्ट स्लाइस कल्चर बाथ विकास गरे। यद्यपि यो प्रणालीले इन भिट्रो कार्डियक साइकल मोडेलिङलाई अझ सटीक बनाउन अनुमति दिन्छ, विधिको जटिलता र कम थ्रुपुटले यस प्रणालीको प्रयोगलाई सीमित गर्दछ। हाम्रो प्रयोगशालाले हालै विद्युतीय उत्तेजना र पोर्सिन र मानव मुटुको तन्तुको खण्डहरूको व्यवहार्यता कायम राख्नको लागि अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरेर सरलीकृत कल्चर प्रणाली विकास गरेको छ। २०,२१।
हालको पाण्डुलिपिमा, हामी कार्डियक टिस्यु कल्चर मोडेल (CTCM) को वर्णन गर्छौं जसले पोर्सिन मुटुको खण्डहरू प्रयोग गर्दछ जसले कार्डियक चक्रको समयमा त्रि-आयामी कार्डियक फिजियोलोजी र प्याथोफिजियोलोजिकल डिस्टेन्सनलाई पुन: संक्षेप गर्न ह्युमरल संकेतहरू समावेश गर्दछ। यो CTCM ले प्रि-क्लिनिकल औषधि भविष्यवाणीको शुद्धतालाई पहिले कहिल्यै हासिल नगरिएको स्तरमा बढाउन सक्छ जसले प्रि-क्लिनिकल औषधि परीक्षणको लागि स्तनधारी मुटुको फिजियोलोजी/प्याथोफिजियोलोजीको नक्कल गर्ने लागत-प्रभावी, मध्य-थ्रुपुट कार्डियक प्रणाली प्रदान गर्दछ।
हेमोडायनामिक मेकानिकल सिग्नलहरूले भिट्रो २२,२३,२४ मा कार्डियोमायोसाइट प्रकार्य कायम राख्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। हालको पाण्डुलिपिमा, हामीले एक CTCM (चित्र १a) विकास गरेका छौं जसले शारीरिक आवृत्तिहरू (१.२ हर्ट्ज, प्रति मिनेट ७२ धड्कन) मा विद्युतीय र यान्त्रिक उत्तेजना दुवै प्रेरित गरेर वयस्क हृदय वातावरणको नक्कल गर्न सक्छ। डायस्टोलको समयमा अत्यधिक तन्तु तन्किनेबाट बच्न, तन्तुको आकार २५% ले बढाउन ३D प्रिन्टिङ उपकरण प्रयोग गरिएको थियो (चित्र १b)। C-PACE प्रणालीद्वारा प्रेरित विद्युतीय गतिलाई कार्डियक चक्रलाई पूर्ण रूपमा पुनरुत्पादन गर्न डेटा अधिग्रहण प्रणाली प्रयोग गरेर सिस्टोल अघि १०० ms सुरु गर्न समय दिइएको थियो। टिस्यु कल्चर प्रणालीले माथिल्लो कक्षमा मुटुको स्लाइसहरूको विस्तारको लागि लचिलो सिलिकन झिल्लीलाई चक्रीय रूपमा विस्तार गर्न प्रोग्रामेबल वायमेटिक एक्चुएटर (LB इन्जिनियरिङ, जर्मनी) प्रयोग गर्दछ। प्रणालीलाई प्रेसर ट्रान्सड्यूसर मार्फत बाह्य हावा रेखासँग जोडिएको थियो, जसले दबाब (± १ mmHg) र समय (± १ ms) (चित्र १c) लाई सही रूपमा समायोजन गर्न सम्भव बनायो।
a उपकरणको कल्चर चेम्बर भित्र नीलो रंगमा देखाइएको ७ मिमी सपोर्ट रिङमा टिस्यु सेक्सन जोड्नुहोस्। कल्चर चेम्बरलाई पातलो लचिलो सिलिकन झिल्लीले एयर चेम्बरबाट अलग गरिएको छ। चुहावट रोक्नको लागि प्रत्येक चेम्बरको बीचमा ग्यास्केट राख्नुहोस्। उपकरणको ढक्कनमा विद्युतीय उत्तेजना प्रदान गर्ने ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरू हुन्छन्। b ठूलो टिस्यु उपकरण, गाइड रिङ र सपोर्ट रिङको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। टिस्यु सेक्सनहरू (खैरो) उपकरणको बाहिरी किनारामा रहेको ग्रूभमा राखिएको गाइड रिङको साथ ओभरसाइज्ड उपकरणमा राखिन्छन्। गाइड प्रयोग गरेर, कार्डियक टिस्युको सेक्सनमा टिस्यु एक्रिलिक टाँसिने टाँसिने समर्थन रिङलाई सावधानीपूर्वक राख्नुहोस्। c प्रोग्रामेबल वायमेटिक एक्चुएटर (PPD) द्वारा नियन्त्रित एयर चेम्बर प्रेसरको कार्यको रूपमा विद्युतीय उत्तेजनाको समय देखाउने ग्राफ। प्रेसर सेन्सरहरू प्रयोग गरेर विद्युतीय उत्तेजनालाई सिङ्क्रोनाइज गर्न डेटा अधिग्रहण उपकरण प्रयोग गरिएको थियो। जब कल्चर चेम्बरमा दबाब सेट थ्रेसहोल्डमा पुग्छ, विद्युतीय उत्तेजना ट्रिगर गर्न C-PACE-EM मा पल्स सिग्नल पठाइन्छ। d इन्क्यूबेटर शेल्फमा राखिएको चार CTCM को छवि। चारवटा उपकरणहरू एउटा PPD मा वायवीय सर्किट मार्फत जोडिएका हुन्छन्, र वायवीय सर्किटमा रहेको दबाब निगरानी गर्न हेमोस्टेटिक भल्भमा दबाब सेन्सरहरू घुसाइन्छ। प्रत्येक उपकरणमा छ वटा तन्तु खण्डहरू हुन्छन्।
एउटै वायवीय एक्चुएटर प्रयोग गरेर, हामीले ४ वटा CTCM उपकरणहरू नियन्त्रण गर्न सक्षम भयौं, जसमध्ये प्रत्येकले ६ वटा तन्तु खण्डहरू समात्न सक्छ (चित्र १d)। CTCM मा, हावाको चापलाई तरल पदार्थको चेम्बरमा सिंक्रोनस चापमा रूपान्तरण गरिन्छ र मुटुको टुक्राको शारीरिक विस्तारलाई प्रेरित गर्छ (चित्र २a र पूरक चलचित्र १)। ८० मिमी Hg मा तन्तुको तन्किने मूल्याङ्कन। कलाले तन्तु खण्डहरूको तन्किने २५% देखाएको छ (चित्र २b)। यो प्रतिशत तन्किने सामान्य कार्डियक सेक्सन संकुचनशीलताको लागि २.२–२.३ µm को शारीरिक सार्कोमेर लम्बाइसँग मेल खान्छ। अनुकूलन क्यामेरा सेटिङहरू प्रयोग गरेर तन्तुको चालको मूल्याङ्कन गरिएको थियो (पूरक चित्र १)। तन्तुको चालको आयाम र वेग (चित्र २c, d) कार्डियक चक्रको समयमा तन्किने र सिस्टोल र डायस्टोलको समयमा समयसँग मेल खान्छ (चित्र २b)। संकुचन र विश्रामको समयमा हृदयको तन्किने संस्कृतिको समयमा संकुचनशीलतामा विद्युतीय उत्तेजनाको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न, हामीले छायांकन एल्गोरिथ्म (पूरक चित्र २क,ख) प्रयोग गरेर सक्रिय विकृति निर्धारण गर्ने विधि विकास गर्यौं र विद्युतीय उत्तेजना सहित र बिना विकृतिहरू बीच भेद गर्न सक्षम भयौं। मुटुको एउटै भाग (चित्र २च)। काटिएको भाग (R6-9) को चल क्षेत्रमा, विद्युतीय उत्तेजनाको समयमा भोल्टेज विद्युतीय उत्तेजनाको अभावको तुलनामा २०% बढी थियो, जसले संकुचन कार्यमा विद्युतीय उत्तेजनाको योगदानलाई संकेत गर्दछ।
हावाको चेम्बरको चाप, तरल पदार्थको चेम्बरको चाप, र तन्तुको चाल मापनको प्रतिनिधि ट्रेसले पुष्टि गर्छ कि चेम्बरको चापले तरल पदार्थको चेम्बरको चापलाई परिवर्तन गर्छ, जसले गर्दा तन्तुको टुक्राको चाल मिल्छ। b प्रतिशत स्ट्रेच (सुन्तला) सँग मिल्दोजुल्दो तन्तु खण्डहरूको प्रतिशत स्ट्रेच (नीलो) को प्रतिनिधि ट्रेस। c कार्डियक स्लाइसको मापन गरिएको गति गतिको मापन गरिएको गतिसँग मिल्दोजुल्दो छ। (d) मुटुको टुक्रामा चक्रीय गति (नीलो रेखा) र वेग (सुन्तला डटेड लाइन) को प्रतिनिधि प्रक्षेपण। e चक्र समयको परिमाण (n = प्रति समूह १९ स्लाइसहरू, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), संकुचन समय (n = प्रति समूह १९ स्लाइसहरू, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), तन्तुको चाल (n = २५)। स्लाइसहरू)/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = २४(D0), २५(D12) स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह) र शिखर विश्राम दर (n=२४(D0), २५(D12) स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह)। दुई-पुच्छर भएको विद्यार्थीको टी-परीक्षणले कुनै पनि प्यारामिटरमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखाएन। f प्रतिनिधि स्ट्रेन विश्लेषणले (रातो) र (नीलो) विद्युतीय उत्तेजना बिनाको तन्तु खण्डहरूको ट्रेस, एउटै खण्डबाट तन्तु खण्डहरूको दश क्षेत्रीय क्षेत्रहरू। तल्लो प्यानलहरूले विभिन्न खण्डहरूबाट दश क्षेत्रहरूमा विद्युतीय उत्तेजना सहित र बिना तन्तु खण्डहरूमा तनावमा प्रतिशत भिन्नताको परिमाण देखाउँछन्। (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ८ स्लाइस/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p < ०.०००१, **p < ०.०१, *p < ०.०५)। (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ८ स्लाइस/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p < ०.०००१, **p < ०.०१, *p < ०.०५)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,001, *p<0,5)। (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ८ खण्ड/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）। (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)। (n = ८ खण्ड/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट, दुई-पुच्छर भएको विद्यार्थीको t-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।त्रुटि पट्टीहरूले औसत ± मानक विचलनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
हाम्रो अघिल्लो स्थिर बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस कल्चर प्रणाली [२०, २१] मा, हामीले विद्युतीय उत्तेजना लागू गरेर र मध्यम संरचनालाई अनुकूलन गरेर ६ दिनसम्म मुटुका स्लाइसहरूको व्यवहार्यता, कार्य र संरचनात्मक अखण्डता कायम राख्यौं। यद्यपि, १० दिन पछि, यी तथ्याङ्कहरू तीव्र रूपमा घटे। हामी हाम्रो अघिल्लो स्थिर बायोमिमेटिक कल्चर प्रणाली २०, २१ नियन्त्रण अवस्था (Ctrl) मा कल्चर गरिएका खण्डहरूलाई सन्दर्भ गर्नेछौं र हामी हाम्रो पहिले अनुकूलित माध्यमलाई एकसाथ मेकानिकल र विद्युतीय उत्तेजना (CTCM) अन्तर्गत MC अवस्था र संस्कृतिको रूपमा प्रयोग गर्नेछौं। भनिन्छ। पहिले, हामीले निर्धारण गर्यौं कि विद्युतीय उत्तेजना बिनाको यान्त्रिक उत्तेजना ६ दिनसम्म तन्तु व्यवहार्यता कायम राख्न अपर्याप्त थियो (पूरक चित्र ३a,b)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, STCM प्रयोग गरेर फिजियो-मेकानिकल र विद्युतीय उत्तेजनाको परिचयसँगै, १२-दिनको मुटु खण्डहरूको व्यवहार्यता MS अवस्थाहरूमा ताजा मुटु खण्डहरूमा जस्तै रह्यो, तर Ctrl अवस्थाहरूमा होइन, MTT विश्लेषण (चित्र १) द्वारा देखाइए अनुसार। ३a)। यसले सुझाव दिन्छ कि कार्डियक चक्रको मेकानिकल उत्तेजना र सिमुलेशनले हाम्रो अघिल्लो स्थिर संस्कृति प्रणालीमा रिपोर्ट गरिएको भन्दा दोब्बर लामो समयसम्म तन्तु खण्डहरूलाई व्यवहार्य राख्न सक्छ। यद्यपि, कार्डियक ट्रोपोनिन T र कोनेक्सिन 43 को इम्युनोलेबलिङद्वारा तन्तु खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डताको मूल्याङ्कनले देखाएको छ कि दिन १२ मा MC तन्तुहरूमा कन्नेक्सिन 43 अभिव्यक्ति उही दिनको नियन्त्रणको तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा बढी थियो। यद्यपि, एकरूप कोनेक्सिन 43 अभिव्यक्ति र Z-डिस्क गठन पूर्ण रूपमा कायम राखिएको थिएन (चित्र 3b)। हामी तन्तु संरचनात्मक अखण्डता 26 मापन गर्न कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) ढाँचा प्रयोग गर्छौं, ट्रोपोनिन-T र कोनेक्सिन स्टेनिङ43 मा आधारित छवि-आधारित गहिरो सिकाइ पाइपलाइन स्थानीयकरणको बलको सन्दर्भमा हृदय स्लाइसहरूको संरचनात्मक अखण्डता र प्रतिदीप्ति स्वचालित रूपमा परिमाण गर्न। यो विधिले सन्दर्भमा वर्णन गरिए अनुसार स्वचालित र निष्पक्ष तरिकाले हृदय तन्तुको संरचनात्मक अखण्डतालाई विश्वसनीय रूपमा परिमाण गर्न कन्भोलुसनल न्यूरल नेटवर्क (CNN) र गहिरो सिकाइ ढाँचा प्रयोग गर्दछ। 26. स्थिर नियन्त्रण खण्डहरूको तुलनामा MC तन्तुले दिन 0 मा सुधारिएको संरचनात्मक समानता देखायो। यसको अतिरिक्त, म्यासनको ट्राइक्रोम स्टेनिङले कल्चरको १२ औं दिनमा नियन्त्रण अवस्थाको तुलनामा एमएस अवस्थाहरूमा फाइब्रोसिसको प्रतिशत उल्लेखनीय रूपमा कम देखाएको छ (चित्र ३c)। CTCM ले दिन १२ मा मुटुको तन्तु खण्डहरूको व्यवहार्यतालाई ताजा मुटुको तन्तुको जस्तै स्तरमा बढाए पनि, यसले मुटुको तन्तु खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डतामा उल्लेखनीय रूपमा सुधार गरेन।
बार ग्राफले १२ दिनको लागि ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) वा मुटुका स्लाइसहरू कल्चरको MTT व्यवहार्यताको परिमाणीकरण देखाउँछ या त स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) वा CTCM (D12 MC) मा (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl), १२ (D12 MC) स्लाइसहरू/समूह विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र **p < ०.०१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। बार ग्राफले १२ दिनको लागि ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) वा मुटुका स्लाइसहरू कल्चरको MTT व्यवहार्यताको परिमाणीकरण देखाउँछ या त स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) वा CTCM (D12 MC) मा (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl), १२ (D12 MC) स्लाइसहरू/समूह विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र **p < ०.०१ D१२ Ctrl को तुलनामा)।हिस्टोग्रामले विभिन्न सुँगुरहरूबाट स्थिर संस्कृति (D12 नियन्त्रण) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियन्त्रण)), 12 (D12 MC) खण्डहरू/समूहमा MTT ताजा मुटु खण्डहरू (D0) वा मुटु खण्डहरूको संस्कृतिको व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ;####p <0,0001 по сравнению с D0 र **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र **p < ०.०१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D12 Ctrl)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单单启曯︕DNOVA相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)। a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D12 Ctrl) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,###p < 0.0001，Ctr.p.2.**ताजा मुटु खण्डहरू (D0) वा स्थिर संस्कृति (D12 नियन्त्रण) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियन्त्रण)) मा १२ दिनको लागि कल्चर गरिएको मुटु खण्डहरूमा MTT व्यवहार्यताको परिमाण देखाउने हिस्टोग्राम, विभिन्न सुँगुरहरूबाट १२ (D12 MC) खण्डहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा, **p < ०.०१ D१२ Ctrl को तुलनामा)।b ट्रोपोनिन-टी (हरियो), कनेक्सिन ४३ (रातो) र DAPI (नीलो) भर्खरै अलग गरिएको मुटु खण्डहरू (D0) वा स्थिर अवस्था (Ctrl) वा CTCM अवस्था (MC) अन्तर्गत १२ दिनको लागि कल्चर गरिएको मुटु खण्डहरूमा प्रतिनिधि इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू (खाली स्केल = १०० µm)। मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखण्डताको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह प्रत्येक फरक सुँगुरबाट, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < 0.0001 D0 को तुलनामा र ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखण्डताको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभिन्न सुँगुरहरूबाट प्रत्येक स्लाइस/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < 0.0001 D0 को तुलनामा र ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। Количественная оценка структурной centre разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению)। कृत्रिम बुद्धिमत्ताद्वारा हृदय तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाण निर्धारण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभिन्न सुँगुरहरूबाट खण्डहरू/समूहहरू, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; ####p < 0.0001 बनाम D0 र ****p < 0.0001 सँग D12 Ctrl को तुलनामा)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह प्रत्येक विभिन्न सुँगुर, एक-तर्फी ANOVA परीक्षण।相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/विभिन्न सुँगुरहरूको प्रत्येक समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण। ##0p0与D0相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D055), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению сr12)। मुटुको तन्तुको संरचनात्मक अखण्डता मापन गर्न कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूको समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण; ####p<0.0001 बनाम .D0 तुलनाको लागि ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। c म्यासनको ट्राइक्रोम दागले दागिएका मुटुका टुक्राहरूको लागि प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र परिमाणीकरण (दायाँ) (स्केल बेयर = ५०० µm) (n = फरक सुँगुरबाट १० स्लाइस/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ को तुलनामा Ctrl)। c म्यासनको ट्राइक्रोम दागले दागिएका मुटुका टुक्राहरूको लागि प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र परिमाणीकरण (दायाँ) (स्केल बेयर = ५०० µm) (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट प्रत्येकको १० स्लाइस/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; #### p < ०.०००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ को तुलनामा Ctrl)। c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,000p *** D 0,0001 0,001 PO D12 Ctrl सँग सर्भनेनियु)। c म्यासनको ट्राइक्रोम दागले दागिएका मुटुका खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र परिमाणीकरण (दायाँ) (अनकोटेड स्केल = ५०० µm) (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट १० खण्ड/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; #### p < ० .०००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺則 0m0µm0个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0.1相比)। C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度度尸度裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勐 单勐 单勐 单勐 अनोवा 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного <###### ०,०००१ पो сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c म्यासनको ट्राइक्रोम दाग (खाली = ५०० µm) ले दागिएका मुटुका खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र परिमाण (दायाँ) (n = १० खण्ड/समूह, प्रत्येक फरक सुँगुरबाट, भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषणद्वारा परीक्षण गरिएको;### # p < ०.०००१ D० को तुलनामा, ***p < ०.००१ D१२ को तुलनामा Ctrl)।त्रुटि पट्टीहरूले औसत ± मानक विचलनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
हामीले परिकल्पना गर्यौं कि कल्चर माध्यममा साना अणुहरू थपेर, कार्डियोमायोसाइट अखण्डता सुधार गर्न सकिन्छ र CTCM कल्चरको समयमा फाइब्रोसिस विकास कम गर्न सकिन्छ। त्यसैले हामीले हाम्रो स्थिर नियन्त्रण संस्कृतिहरू 20,21 प्रयोग गरेर साना अणुहरूको लागि स्क्रिनिङ गर्यौं किनभने थोरै संख्यामा भ्रामक कारकहरू थिए। यस स्क्रिनको लागि डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्रायियोडोथायरोनिन (T3), र SB431542 (SB) छनोट गरिएको थियो। यी साना अणुहरू पहिले hiPSC-CM संस्कृतिहरूमा सार्कोमेर लम्बाइ, T-ट्यूब्युलहरू, र चालन वेग बढाएर कार्डियोमायोसाइटहरूको परिपक्वता प्रेरित गर्न प्रयोग गरिएको छ। थप रूपमा, Dex (एक ग्लुकोकोर्टिकोइड) र SB दुवै सूजनलाई दबाउन जानिन्छ 29,30। त्यसकारण, हामीले परीक्षण गर्यौं कि यी साना अणुहरूको एक वा संयोजन समावेश गर्नाले हृदय खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डतामा सुधार हुनेछ। प्रारम्भिक स्क्रिनिङको लागि, प्रत्येक यौगिकको खुराक सेल कल्चर मोडेलहरूमा सामान्यतया प्रयोग हुने सांद्रता (1 μM Dex27, 100 nM T327, र 2.5 μM SB31) को आधारमा चयन गरिएको थियो। १२ दिनको कल्चर पछि, T3 र Dex को संयोजनले इष्टतम कार्डियोमायोसाइट संरचनात्मक अखण्डता र न्यूनतम फाइब्रस पुनर्निर्माणमा परिणाम दियो (पूरक चित्र ४ र ५)। थप रूपमा, T3 र Dex को यी सांद्रताहरूको दोब्बर वा दोब्बर प्रयोगले सामान्य सांद्रताको तुलनामा हानिकारक प्रभावहरू उत्पादन गर्‍यो (पूरक चित्र ६a,b)।
प्रारम्भिक स्क्रिनिङ पछि, हामीले ४ वटा कल्चर अवस्थाहरूको हेड-टू-हेड तुलना गर्यौं (चित्र ४a): Ctrl: हाम्रो अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरेर पहिले वर्णन गरिएको स्थिर संस्कृतिमा कल्चर गरिएको मुटुको खण्डहरू; २०.२१ TD: T3 र Ctrl बुधबार थपिएको Dex; MC: हाम्रो पहिले अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरेर CTCM मा कल्चर गरिएको मुटुको खण्डहरू; र MT: T3 र Dex माध्यममा थपिएको CTCM। १२ दिनको खेती पछि, MS र MT तन्तुहरूको व्यवहार्यता MTT परख (चित्र ४b) द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको ताजा तन्तुहरूमा जस्तै रह्यो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, ट्रान्सवेल कल्चर (TD) मा T3 र Dex थप्दा Ctrl अवस्थाहरूको तुलनामा व्यवहार्यतामा उल्लेखनीय सुधार भएन, जसले हृदय खण्डहरूको व्यवहार्यता कायम राख्न मेकानिकल उत्तेजनाको महत्त्वपूर्ण भूमिकालाई संकेत गर्दछ।
१२ दिनको लागि माध्यममा यान्त्रिक उत्तेजना र T3/Dex पूरकको प्रभाव मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिने चार संस्कृति अवस्थाहरू चित्रण गर्ने प्रयोगात्मक डिजाइन रेखाचित्र। b बार ग्राफले ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), विभिन्न सुँगुरहरूबाट १२ (D12 MC) स्लाइसहरू/समूहको तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा संस्कृति पछि १२ दिनको व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 को तुलनामा र **p < 0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। b बार ग्राफले ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), विभिन्न सुँगुरहरूबाट १२ (D12 MC) स्लाइसहरू/समूहको तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा संस्कृति पछि १२ दिनको व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 को तुलनामा र **p < 0.01 D12 ctrl को तुलनामा)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (कन्ट्रोल, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), 12/12 (MC2/MC) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 र **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। b बार ग्राफले ताजा मुटु खण्डहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MT), 12 (D12 MC) खण्डहरू/समूहको तुलनामा सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC, र MT) मा संस्कृति पछि १२ दिनमा व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ जुन विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एक-तर्फी ANOVA परीक्षण; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 बनाम D0 र **p < 0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1r1D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.001，###p <0.0** ०.०१ 与D12控制)।ख ४ १२ (D१२ एमसी) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (कन्ट्रोल, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (10D) 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, D0, **p <0,01 по сравнению (नियन्त्रण D12 सँग)। b विभिन्न सुँगुरहरू १२ (D12 MC) खण्डहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षणबाट ताजा मुटु खण्डहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT) को तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC र MT) देखाउने हिस्टोग्राम; ####p<0.0001, ###p<0.001 बनाम D0, **p<0.01 बनाम नियन्त्रण D12)। c बार ग्राफले ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) को तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा कल्चर पछि १२ दिनको ग्लुकोज फ्लक्सको परिमाणीकरण देखाउँछ (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ६ स्लाइसहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ###p < ०.००१, D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। c बार ग्राफले ताजा मुटुका स्लाइसहरू (D0) को तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा कल्चर पछि १२ दिनको ग्लुकोज फ्लक्सको परिमाणीकरण देखाउँछ (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ६ स्लाइसहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ###p < ०.००१, D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех 4 усеховирования (कन्ट्रोल, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, однолясть свиней, одноясть свиней ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 र ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c हिस्टोग्रामले ताजा मुटु खण्डहरू (D0) को तुलनामा सबै ४ कल्चर अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC र MT) अन्तर्गत १२ दिन पछिको ग्लुकोज फ्लक्सको परिमाणीकरण देखाउँछ (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट ६ खण्डहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; ###p < ०.००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.与D12 Ctrl 相比）। C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , , , , , , , , ， 猪 猪单吡吡测试；###p <0.001，与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховивирования (कन्ट्रोल, टीडी, एमसी र एमटी) тесты ANOVA; ###p <0,001 PO сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (controll)। c हिस्टोग्रामले ताजा मुटु खण्डहरू (D0) (n = 6 खण्डहरू/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एकतर्फी रूपमा) को तुलनामा सबै 4 कल्चर अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC, र MT) को लागि १२ दिन पोस्ट-कल्चरमा ग्लुकोज फ्लक्सको परिमाणीकरण देखाउँछ। ANOVA परीक्षणहरू गरिएको थियो, ###p < 0.001 D0 को तुलनामा, ***p < 0.001 D12 को तुलनामा (नियन्त्रण)।d दस क्षेत्रीय तन्तु खण्ड बिन्दुहरूमा ताजा (नीलो), दिन १२ MC (हरियो), र दिन १२ MT (रातो) तन्तुहरूको स्ट्रेन विश्लेषण प्लटहरू (n = ४ स्लाइसहरू/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण; समूहहरू बीच कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता थिएन)। e ज्वालामुखी प्लटले १०-१२ दिनको लागि स्थिर अवस्था (Ctrl) वा MT अवस्था (MT) अन्तर्गत कल्चर गरिएको मुटु खण्डहरूको तुलनामा ताजा मुटु खण्डहरू (D0) मा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको जीनहरू देखाउँछ। f प्रत्येक कल्चर अवस्था अन्तर्गत कल्चर गरिएको मुटु खण्डहरूको लागि सार्कोमेर जीनको तापनकशाला। त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
फ्याटी एसिड अक्सिडेशनबाट ग्लाइकोलिसिसमा स्विचमा मेटाबोलिक निर्भरता कार्डियोमायोसाइट डिडिफरेंशिएशनको एक विशेषता हो। अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइटहरूले मुख्यतया ATP उत्पादनको लागि ग्लुकोज प्रयोग गर्छन् र केही क्रिस्टा5,32 सहित हाइपोप्लास्टिक माइटोकोन्ड्रिया हुन्छन्। ग्लुकोज उपयोग विश्लेषणले देखायो कि MC र MT अवस्थाहरूमा, ग्लुकोज उपयोग दिन 0 तन्तुहरूमा जस्तै थियो (चित्र 4c)। यद्यपि, Ctrl नमूनाहरूले ताजा तन्तुको तुलनामा ग्लुकोज उपयोगमा उल्लेखनीय वृद्धि देखायो। यसले संकेत गर्दछ कि CTCM र T3/Dex को संयोजनले तन्तु व्यवहार्यता बढाउँछ र 12-दिनको कल्चर्ड हृदय खण्डहरूको मेटाबोलिक फेनोटाइपलाई सुरक्षित राख्छ। थप रूपमा, स्ट्रेन विश्लेषणले देखायो कि MT र MS अवस्थाहरूमा 12 दिनसम्म स्ट्रेन स्तर ताजा हृदय तन्तुमा जस्तै रह्यो (चित्र 4d)।
कार्डियक स्लाइस टिस्युको विश्वव्यापी ट्रान्सक्रिप्शनल परिदृश्यमा CTCM र T3/Dex को समग्र प्रभावको विश्लेषण गर्न, हामीले चारै फरक कल्चर अवस्थाहरूबाट कार्डियक स्लाइसहरूमा RNAseq प्रदर्शन गर्यौं (पूरक डेटा १)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, MT खण्डहरूले ताजा मुटुको तन्तुसँग उच्च ट्रान्सक्रिप्शनल समानता देखाए, १३,६४२ जीनहरू मध्ये केवल १६ भिन्न रूपमा व्यक्त गरियो। यद्यपि, हामीले पहिले देखाइएझैं, Ctrl स्लाइसहरूले १०-१२ दिनको कल्चर पछि १२२९ भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको जीनहरू प्रदर्शन गरे (चित्र ४e)। यी डेटाहरू हृदय र फाइब्रोब्लास्ट जीनहरूको qRT-PCR द्वारा पुष्टि गरिएको थियो (पूरक चित्र ७a-c)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, Ctrl खण्डहरूले कार्डियक र कोशिका चक्र जीनहरूको डाउनरेगुलेसन र सूजन जीन कार्यक्रमहरूको सक्रियता देखाए। यी डेटाहरूले सुझाव दिन्छन् कि डिडिफरेंशिएसन, जुन सामान्यतया लामो समयसम्म कल्चर पछि हुन्छ, MT अवस्थाहरू अन्तर्गत पूर्ण रूपमा कम हुन्छ (पूरक चित्र ८a,b)। सार्कोमेर जीनको सावधानीपूर्वक अध्ययनले देखाएको छ कि MT अवस्थाहरूमा मात्र सार्कोमेर (चित्र ४f) र आयन च्यानल (पूरक चित्र ९) लाई एन्कोड गर्ने जीनहरू संरक्षित छन्, जसले तिनीहरूलाई Ctrl, TD, र MC अवस्थाहरू अन्तर्गत दमनबाट जोगाउँछ। यी तथ्याङ्कहरूले देखाउँछन् कि मेकानिकल र ह्युमरल उत्तेजना (T3/Dex) को संयोजनको साथ, मुटुको स्लाइस ट्रान्सक्रिप्टोम संस्कृतिमा १२ दिन पछि ताजा मुटुको स्लाइसहरू जस्तै रहन सक्छ।
यी ट्रान्सक्रिप्शनल निष्कर्षहरू यस तथ्यद्वारा समर्थित छन् कि मुटुको खण्डहरूमा कार्डियोमायोसाइट्सको संरचनात्मक अखण्डता MT अवस्थाहरूमा १२ दिनसम्म राम्रोसँग संरक्षित हुन्छ, जुन अक्षुण्ण र स्थानीयकृत कनेक्सिन ४३ (चित्र ५a) द्वारा देखाइएको छ। थप रूपमा, MT अवस्थाहरूमा मुटुको खण्डहरूमा फाइब्रोसिस Ctrl को तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो र ताजा मुटुको खण्डहरू जस्तै थियो (चित्र ५b)। यी तथ्याङ्कहरूले देखाउँछन् कि मेकानिकल उत्तेजना र T3/Dex उपचारको संयोजनले संस्कृतिमा मुटुको खण्डहरूमा मुटुको संरचनालाई प्रभावकारी रूपमा संरक्षित गर्दछ।
भर्खरै अलग गरिएको मुटुको खण्डहरू (D0) मा वा चारै मुटुको खण्ड कल्चर अवस्थाहरूमा १२ दिनको लागि कल्चर गरिएको ट्रोपोनिन-टी (हरियो), कन्नेक्सिन ४३ (रातो), र DAPI (नीलो) को प्रतिनिधि इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू (स्केल बार = १०० µm)। विभिन्न सुँगुरहरूबाट मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखण्डता (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) स्लाइस/समूहको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < 0.0001 D0 को तुलनामा र *p < 0.05, वा ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। विभिन्न सुँगुरहरूबाट मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखण्डता (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) स्लाइस/समूहको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; #### p < 0.0001 D0 को तुलनामा र *p < 0.05, वा ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl12 , DMCD12 , DMC22) MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p <05,***00,* D12 Ctrl सँग सर्भनेनियु)। विभिन्न सुँगुरहरूबाट कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) खण्डहरू/समूह प्रयोग गरेर मुटुको तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाण निर्धारण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; #### p < 0.0001 D0 को तुलनामा र *p < 0.05 वा ****p < 0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）।对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 廉 12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）।एकतर्फी ANOVA परीक्षणको साथ विभिन्न सुँगुरहरू (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) खण्डहरू/समूह) मा कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रयोग गरेर हृदय तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाण निर्धारण;#### p <0,0001 по сравнению с D0 र *p < 0,05 वा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। #### p < ०.०००१ D० को तुलनामा र *p < ०.०५ वा ****p < ०.०००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। b म्यासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = ५०० µm) (n = १० (D0, D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MC), विभिन्न सुँगुरहरूबाट ९ (D12 MT) स्लाइसहरू/समूहको लागि प्रतिनिधि छविहरू र परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१, वा ****p < ०.०००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। b म्यासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = ५०० µm) (n = १० (D0, D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MC), विभिन्न सुँगुरहरूबाट ९ (D12 MT) स्लाइसहरू/समूहको लागि प्रतिनिधि छविहरू र परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा र ***p < ०.००१, वा ****p < ०.०००१ D१२ Ctrl को तुलनामा)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонных, выполняется односторон; по сравнению с D0 र ***p < 0,001 वा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b प्रतिनिधि छविहरू र म्यासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC), 9 (D12 MT) खण्डहरू/समूह विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एकतर्फी ANOVA प्रदर्शन गरियो; ####p < 0.0001 बनाम D0 र ***p < 0.001 वा ****p < 0.0001 बनाम D12 Ctrl)। b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D CTRL相比，***p <0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####D0p0相比,***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линека = ०म०म) (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC) 0,001 वा ****p < 0,0001 D12 Ctrl सँग)। b म्यासनको ट्राइक्रोम (स्केल बार = ५०० µm) (n = १० (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC), विभिन्न सुँगुर/समूहबाट ९ (D12 MT) खण्डहरू, एउटा ANOVA विधि; ####p < ०.०००१ D० को तुलनामा, ***p < ०.००१ वा ****p < ०.०००१ D१२ Ctrl को तुलनामा) ले रंगिएका मुटुका खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू र परिमाणीकरण।त्रुटि पट्टीहरूले औसत ± मानक विचलनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
अन्तमा, कार्डियक हाइपरट्रोफीको नक्कल गर्ने CTCM को क्षमता कार्डियक टिस्यु स्ट्रेच बढाएर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। CTCM मा, शिखर वायु कक्षको चाप ८० mmHg बाट ८० mmHg सम्म बढ्यो। Art. (सामान्य स्ट्रेच) १४० mmHg सम्म Art. (चित्र ६a)। यो स्ट्रेचमा ३२% वृद्धिसँग मेल खान्छ (चित्र ६b), जुन पहिले हाइपरट्रोफीमा देखिने जस्तै सार्कोमेर लम्बाइ प्राप्त गर्न हृदय खण्डहरूको लागि आवश्यक सम्बन्धित प्रतिशत स्ट्रेचको रूपमा देखाइएको थियो। संकुचन र विश्रामको समयमा कार्डियक टिस्युको स्ट्रेच र वेग छ दिनको कल्चर (चित्र ६c) को समयमा स्थिर रह्यो। MT अवस्थाबाट कार्डियक टिस्युलाई छ दिनको लागि सामान्य स्ट्रेच (MT (सामान्य)) वा ओभरस्ट्रेच अवस्था (MT (OS)) को अधीनमा राखिएको थियो। पहिले नै चार दिनको कल्चर पछि, हाइपरट्रोफिक बायोमार्कर NT-ProBNP MT (सामान्य) अवस्थाहरू (चित्र ७a) को तुलनामा MT (OS) अवस्थाहरू अन्तर्गत माध्यममा उल्लेखनीय रूपमा बढाइएको थियो। यसको अतिरिक्त, छ दिनको कल्चरिङ पछि, MT (OS) (चित्र 7b) मा कोषको आकार MT मुटुको खण्डहरू (सामान्य) को तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो। यसको अतिरिक्त, NFATC4 आणविक स्थानान्तरण अत्यधिक तन्तुहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो (चित्र 7c)। यी परिणामहरूले हाइपरडिस्टेन्सन पछि प्याथोलॉजिकल रिमोडेलिंगको प्रगतिशील विकास देखाउँछन् र CTCM उपकरणलाई स्ट्रेच-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी सिग्नलिङ अध्ययन गर्न प्लेटफर्मको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ भन्ने अवधारणालाई समर्थन गर्छन्।
हावा चेम्बरको चाप, तरल पदार्थको चेम्बरको चाप, र तन्तुको चाल मापनको प्रतिनिधि ट्रेसले पुष्टि गर्छ कि चेम्बरको चापले तरल पदार्थको चेम्बरको चापलाई परिवर्तन गर्छ, जसले गर्दा तन्तुको टुक्राको समान गति हुन्छ। b सामान्यतया फैलिएको (सुन्तला) र अत्यधिक फैलिएको (नीलो) तन्तु खण्डहरूको लागि प्रतिनिधि तन्तु प्रतिशत र तन्तु दर वक्रहरू। c चक्र समय (n = प्रति समूह १९ स्लाइसहरू, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), संकुचन समय (n = १८-१९ स्लाइसहरू प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), विश्राम समय (n = १९ स्लाइसहरू प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट) देखाउने बार ग्राफ, तन्तुको चालको आयाम (n = १४ स्लाइसहरू/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = १४ स्लाइसहरू/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट) र शिखर विश्राम दर (n = १४ (D0), १५ (D6) ) खण्डहरू/समूहहरू) विभिन्न सुँगुरहरूबाट), दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षणले कुनै पनि प्यारामिटरमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखाएको छैन, जसले संकेत गर्दछ कि यी प्यारामिटरहरू ओभरभोल्टेजको साथ ६ दिनको संस्कृतिमा स्थिर रहे। त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
विभिन्न सुँगुरहरूबाट MT सामान्य स्ट्रेच (Norm) वा ओभरस्ट्रेचिङ (OS) अवस्थाहरू (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4 MTOS) स्लाइसहरू/समूह अन्तर्गत कल्चर गरिएको मुटुको स्लाइसहरूबाट कल्चर मिडियामा NT-ProBNP सांद्रताको बार ग्राफ परिमाणीकरण, दुई-तर्फी ANOVA गरिन्छ; **p < सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा ०.०१)। विभिन्न सुँगुरहरूबाट MT सामान्य स्ट्रेच (Norm) वा ओभरस्ट्रेचिङ (OS) अवस्थाहरू (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4 MTOS) स्लाइसहरू/समूह अन्तर्गत कल्चर गरिएको मुटुको स्लाइसहरूबाट कल्चर मिडियामा NT-ProBNP सांद्रताको बार ग्राफ परिमाणीकरण, दुई-तर्फी ANOVA गरिन्छ; **p < सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा ०.०१)।सामान्य MT स्ट्रेच (सामान्य) वा ओभरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4).MTOS) स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूहको अवस्थामा कल्चर गरिएको मुटुको स्लाइसहरूबाट कल्चर माध्यममा NT-ProBNP सांद्रताको मात्रात्मक हिस्टोग्राम, भिन्नताको दुई-कारक विश्लेषण गरिन्छ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा p < ०.०१)। a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離४ (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < ०.०१)। MT सामान्य स्ट्रेच (Norm) वा ओभरस्ट्रेच (OS) सर्तहरू (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm猪的切片/组，可以双向方方发发动; **सामान्य स्ट्रेचिङको तुलनामा, p <0.01)।विभिन्न सुँगुरहरूबाट सामान्य MT स्ट्रेच (सामान्य) वा ओभरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) र D4 MTOS) स्लाइसहरू/समूहको अवस्थामा कल्चर गरिएको मुटुका स्लाइसहरूमा NT-ProBNP सांद्रताको हिस्टोग्राम परिमाणीकरण, भिन्नताको दुई-तर्फी विश्लेषण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा p < ०.०१)। b ट्रोपोनिन-टी र WGA (बायाँ) ले दाग लगाइएको मुटुको टुक्राहरूको लागि प्रतिनिधि छविहरू र सेल आकार परिमाण (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सुँगुरहरूबाट 10 फरक स्लाइसहरूबाट कोषहरू/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p < सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा 0.0001)। b ट्रोपोनिन-टी र WGA (बायाँ) र सेल आकार परिमाण (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) सेलहरू/समूह विभिन्न सुँगुरहरूबाट 10 फरक स्लाइसहरूबाट दाग लगाइएको मुटुका स्लाइसहरूका लागि प्रतिनिधि छविहरू, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p < सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разовения) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой; *** Свостовой t- 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)। b ट्रोपोनिन-टी र AZP (बायाँ) र कोष आकार परिमाण (दायाँ) ले रंगिएका मुटुका खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सुँगुरहरूबाट १० फरक खण्डहरूबाट कोषहरू/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण गरिएको थियो; ****p < सामान्य स्ट्रेनको तुलनामा ०.०००१)। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图 3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）। b क्याल्केरिन-टी र WGA (बायाँ) र कोष आकार (दायाँ) ले दाग लगाइएका मुटुका टुक्राहरूको प्रतिनिधि छविहरू (n = 330 (D6 MTOS), १० फरक स्लाइसहरूबाट 369 (D6 MTNorm)) सामान्य स्ट्रेचिङको तुलनामा कोषहरू/विवरण, सामान्य परीक्षणको परिणाम; ****p < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размественная (сердца) MTOS), 369 (D6 MTNorm) и 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0*p0p01; нормальным (रास्तीकरण)। b ट्रोपोनिन-टी र AZP (बायाँ) ले रंगिएका मुटुका खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू र कोषको आकार (दायाँ) को परिमाणीकरण (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सुँगुरहरूबाट १० फरक खण्डहरूबाट) कोषहरू/समूह, दुई-पुच्छर मापदण्ड विद्यार्थीको t; ****p < सामान्य स्ट्रेनको तुलनामा ०.०००१)। c दिन ० र दिन ६ को लागि प्रतिनिधि छविहरू ट्रोपोनिन-टी र NFATC4 को लागि इम्युनोलेबल गरिएको MTOS मुटुको स्लाइसहरू र विभिन्न सुँगुरहरूबाट CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइसहरू/समूहको केन्द्रकमा NFATC4 को स्थानान्तरणको परिमाणीकरण, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; *p < ०.०५)। c दिन ० र दिन ६ को लागि प्रतिनिधि छविहरू ट्रोपोनिन-टी र NFATC4 को लागि इम्युनोलेबल गरिएको MTOS मुटुको स्लाइसहरू र विभिन्न सुँगुरहरूबाट CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइसहरू/समूहको केन्द्रकमा NFATC4 को स्थानान्तरणको परिमाणीकरण, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; *p < ०.०५)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т र NFATC4, и компания ट्रान्स्लोकासिइ NFATC4 मा ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्टुडेन्टा; *p <0,05)। c ० र ६ दिनको MTOS मा मुटुको खण्डहरूको लागि प्रतिनिधि छविहरू, ट्रोपोनिन-T र NFATC4 को लागि इम्युनोलेबल गरिएको, र गुफा कोषहरूको केन्द्रकमा NFATC4 स्थानान्तरणको परिमाणीकरण (n = ४ (D०), ३ (D6 MTOS) स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह) दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण गरियो; *p < ०.०५)। c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) , 3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05)। c calcanin-T र NFATC4 इम्युनोलेबलिङ 第0天和第6天MTOS हृदय स्लाइसहरू, र NFATC4 विभिन्न NFATC4 易位至CM सेल न्यूक्लियस 的 मात्रा化 (n = 4 (D0) 廤/6 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 廤/燤)时间双尾学生et 电影；*p < ०.०५)। c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS मा 0 र 6 दिनमा иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и конличацевести TRANSLOKACII NFATC4 मा ядра CM बाट разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;05)। c विभिन्न सुँगुरहरू (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइसहरू/समूह, दुई-पुच्छर t-मापदण्ड विद्यार्थीहरूको; *p < 0.05) बाट CM को केन्द्रकमा ट्रोपोनिन-T र NFATC4 इम्युनोलेबलिङ र NFATC4 ट्रान्सलोकेशनको परिमाणीकरणको लागि दिन ० र ६ मा MTOS मुटुका स्लाइसहरूको प्रतिनिधि छविहरू।त्रुटि पट्टीहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
ट्रान्सलेशनल कार्डियोभास्कुलर अनुसन्धानका लागि सेलुलर मोडेलहरू आवश्यक पर्दछ जसले हृदयको वातावरणलाई सही रूपमा पुनरुत्पादन गर्दछ। यस अध्ययनमा, एक CTCM उपकरण विकसित गरिएको थियो र विशेषता दिइएको थियो जसले हृदयको अल्ट्राथिन खण्डहरूलाई उत्तेजित गर्न सक्छ। CTCM प्रणालीमा शारीरिक रूपमा सिंक्रोनाइज्ड इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना र T3 र Dex तरल पदार्थ संवर्धन समावेश छ। जब सुँगुरको मुटुको खण्डहरू यी कारकहरूको सम्पर्कमा आए, तिनीहरूको व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखण्डता, चयापचय गतिविधि, र ट्रान्सक्रिप्शनल अभिव्यक्ति १२ दिनको कल्चर पछि ताजा मुटुको तन्तुमा जस्तै रह्यो। थप रूपमा, हृदयको तन्तुको अत्यधिक स्ट्रेचिङले हाइपरएक्सटेन्सनको कारणले मुटुको हाइपरट्रोफी निम्त्याउन सक्छ। समग्रमा, यी नतिजाहरूले सामान्य हृदय फेनोटाइप कायम राख्न शारीरिक संस्कृति अवस्थाहरूको महत्त्वपूर्ण भूमिकालाई समर्थन गर्दछ र औषधि जाँचको लागि प्लेटफर्म प्रदान गर्दछ।
कार्डियोमायोसाइट्सको कार्य र अस्तित्वको लागि इष्टतम वातावरण सिर्जना गर्न धेरै कारकहरूले योगदान पुर्‍याउँछन्। यी कारकहरूमध्ये सबैभन्दा स्पष्ट (१) अन्तरकोशिकीय अन्तरक्रिया, (२) इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना, (३) ह्युमरल कारकहरू, र (४) मेटाबोलिक सब्सट्रेटहरूसँग सम्बन्धित छन्। शारीरिक कोशिका-देखि-कोशिका अन्तरक्रियाहरूलाई बाह्य कोशिका म्याट्रिक्सद्वारा समर्थित बहु कोशिका प्रकारहरूको जटिल त्रि-आयामी नेटवर्कहरू आवश्यक पर्दछ। यस्ता जटिल कोशिका अन्तरक्रियाहरू व्यक्तिगत कोशिका प्रकारहरूको सह-संस्कृतिद्वारा इन भिट्रोमा पुनर्निर्माण गर्न गाह्रो हुन्छ, तर हृदय खण्डहरूको अर्गानोटाइपिक प्रकृति प्रयोग गरेर सजिलै प्राप्त गर्न सकिन्छ।
कार्डियक फेनोटाइप ३३,३४,३५ कायम राख्न कार्डियोमायोसाइट्सको मेकानिकल स्ट्रेचिङ र विद्युतीय उत्तेजना महत्वपूर्ण हुन्छ। hiPSC-CM कन्डिसनिङ र परिपक्वताको लागि मेकानिकल उत्तेजना व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ, धेरै सुरुचिपूर्ण अध्ययनहरूले हालै एकअक्षीय लोडिङ प्रयोग गरेर संस्कृतिमा मुटुको स्लाइसहरूको मेकानिकल उत्तेजनाको प्रयास गरेका छन्। यी अध्ययनहरूले देखाउँछन् कि २D एकअक्षीय मेकानिकल लोडिङले संस्कृतिको समयमा मुटुको फेनोटाइपमा सकारात्मक प्रभाव पार्छ। यी अध्ययनहरूमा, मुटुका खण्डहरू या त आइसोमेट्रिक टेन्सिल फोर्स १७, रेखीय अक्सोटोनिक लोडिङ १८ ले लोड गरिएको थियो, वा बल ट्रान्सड्यूसर प्रतिक्रिया र तनाव ड्राइभहरू प्रयोग गरेर कार्डियक चक्र पुन: सिर्जना गरिएको थियो। यद्यपि, यी विधिहरूले वातावरणीय अनुकूलन बिना एकअक्षीय टिस्यु स्ट्रेच प्रयोग गर्छन्, जसको परिणामस्वरूप धेरै कार्डियक जीनहरूको दमन हुन्छ वा असामान्य स्ट्रेच प्रतिक्रियाहरूसँग सम्बन्धित जीनहरूको अत्यधिक अभिव्यक्ति हुन्छ। यहाँ वर्णन गरिएको CTCM ले ३D इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना प्रदान गर्दछ जसले चक्र समय र शारीरिक स्ट्रेच (२५% स्ट्रेच, ४०% सिस्टोल, ६०% डायस्टोल, र ७२ धड्कन प्रति मिनेट) को सन्दर्भमा प्राकृतिक कार्डियक चक्रको नक्कल गर्दछ। यद्यपि यो त्रि-आयामिक यान्त्रिक उत्तेजना मात्र तन्तुको अखण्डता कायम राख्न पर्याप्त छैन, तन्तुको व्यवहार्यता, कार्य र अखण्डतालाई पर्याप्त रूपमा कायम राख्न T3/Dex प्रयोग गरेर ह्युमरल र यान्त्रिक उत्तेजनाको संयोजन आवश्यक छ।
वयस्क मुटुको फेनोटाइपलाई परिमार्जन गर्न हास्यपूर्ण कारकहरूले महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। यो HiPS-CM अध्ययनहरूमा हाइलाइट गरिएको थियो जसमा T3 र Dex लाई कोष परिपक्वतालाई गति दिन कल्चर मिडियामा थपिएको थियो। T3 ले कोष झिल्लीहरूमा एमिनो एसिड, चिनी र क्याल्सियमको ढुवानीमा प्रभाव पार्न सक्छ36। थप रूपमा, T3 ले MHC-α अभिव्यक्ति र MHC-β डाउनरेगुलेसनलाई बढावा दिन्छ, भ्रूण CM मा ढिलो ट्विच मायोफिब्रिलहरूको तुलनामा परिपक्व कार्डियोमायोसाइटहरूमा द्रुत ट्विच मायोफिब्रिलहरूको गठनलाई बढावा दिन्छ। हाइपोथाइराइड बिरामीहरूमा T3 को कमीले मायोफिब्रिलर ब्यान्डहरूको क्षति र टोन विकासको कम दरमा परिणाम दिन्छ37। डेक्सले ग्लुकोकोर्टिकोइड रिसेप्टरहरूमा कार्य गर्दछ र पृथक परफ्युज गरिएको मुटुहरूमा मायोकार्डियल संकुचनशीलता बढाउन देखाइएको छ; 38 यो सुधार क्याल्सियम निक्षेप-संचालित प्रविष्टि (SOCE) 39,40 मा प्रभावसँग सम्बन्धित मानिन्छ। थप रूपमा, डेक्सले यसको रिसेप्टरहरूमा बाँध्छ, जसले प्रतिरक्षा कार्य र सूजनलाई दबाउने व्यापक इन्ट्रासेलुलर प्रतिक्रिया निम्त्याउँछ30।
हाम्रो नतिजाले संकेत गर्छ कि भौतिक मेकानिकल उत्तेजना (MS) ले Ctrl को तुलनामा समग्र कल्चर कार्यसम्पादनमा सुधार ल्यायो, तर कल्चरमा १२ दिनसम्म व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखण्डता र हृदय अभिव्यक्ति कायम राख्न असफल भयो। Ctrl को तुलनामा, CTCM (MT) कल्चरहरूमा T3 र Dex थप्दा व्यवहार्यतामा सुधार आयो र १२ दिनसम्म ताजा मुटुको तन्तुसँग समान ट्रान्सक्रिप्शन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखण्डता र मेटाबोलिक गतिविधि कायम राखियो। थप रूपमा, टिस्यु स्ट्रेचको डिग्री नियन्त्रण गरेर, STCM प्रणालीको बहुमुखी प्रतिभालाई चित्रण गर्दै STCM प्रयोग गरेर हाइपरएक्सटेन्सन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी मोडेल सिर्जना गरिएको थियो। यो ध्यान दिनुपर्छ कि यद्यपि कार्डियक रिमोडेलिंग र फाइब्रोसिसमा सामान्यतया अक्षुण्ण अंगहरू समावेश हुन्छन् जसको परिसंचरण कोषहरूले उपयुक्त साइटोकाइनहरू साथै फागोसाइटोसिस र अन्य पुनर्निर्माण कारकहरू प्रदान गर्न सक्छन्, हृदयका खण्डहरूले अझै पनि तनाव र आघातको प्रतिक्रियामा फाइब्रोटिक प्रक्रियाको नक्कल गर्न सक्छन्। मायोफाइब्रोब्लास्टहरूमा। यो पहिले यस कार्डियक स्लाइस मोडेलमा मूल्याङ्कन गरिएको छ। यो ध्यान दिनुपर्छ कि CTCM प्यारामिटरहरू ट्याचिकार्डिया, ब्राडीकार्डिया, र मेकानिकल परिसंचरण समर्थन (मेकानिकल अनलोड गरिएको मुटु) जस्ता धेरै अवस्थाहरूको अनुकरण गर्न दबाब/विद्युतीय आयाम र आवृत्ति परिवर्तन गरेर परिमार्जन गर्न सकिन्छ। यसले प्रणालीलाई औषधि परीक्षणको लागि मध्यम थ्रुपुट बनाउँछ। अत्यधिक परिश्रम-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी मोडेल गर्ने CTCM को क्षमताले व्यक्तिगत उपचारको लागि यो प्रणालीको परीक्षणको लागि मार्ग प्रशस्त गर्दछ। निष्कर्षमा, वर्तमान अध्ययनले देखाउँछ कि मेकानिकल स्ट्रेच र ह्युमरल उत्तेजना कार्डियक टिस्यु सेक्सनहरूको संस्कृति कायम राख्नको लागि महत्त्वपूर्ण छ।
यद्यपि यहाँ प्रस्तुत गरिएको तथ्याङ्कले CTCM अक्षुण्ण मायोकार्डियम मोडेलिङको लागि एक धेरै आशाजनक प्लेटफर्म हो भनेर सुझाव दिन्छ, यो कल्चर विधिमा केही सीमितताहरू छन्। CTCM कल्चरको मुख्य सीमा भनेको यसले स्लाइसहरूमा निरन्तर गतिशील मेकानिकल तनावहरू थोपर्छ, जसले प्रत्येक चक्रको समयमा कार्डियक स्लाइस संकुचनलाई सक्रिय रूपमा निगरानी गर्ने क्षमतालाई रोक्छ। थप रूपमा, कार्डियक सेक्सनहरूको सानो आकार (७ मिमी) को कारणले गर्दा, परम्परागत बल सेन्सरहरू प्रयोग गरेर कल्चर प्रणालीहरू बाहिर सिस्टोलिक प्रकार्यको मूल्याङ्कन गर्ने क्षमता सीमित छ। हालको पाण्डुलिपिमा, हामीले अप्टिकल भोल्टेजलाई संकुचनात्मक प्रकार्यको सूचकको रूपमा मूल्याङ्कन गरेर यो सीमालाई आंशिक रूपमा पार गर्छौं। यद्यपि, यो सीमालाई थप कामको आवश्यकता पर्नेछ र भविष्यमा क्याल्सियम र भोल्टेज-संवेदनशील रंगहरू प्रयोग गरेर अप्टिकल म्यापिङ जस्ता संस्कृतिमा हृदय स्लाइसहरूको कार्यको अप्टिकल अनुगमनको लागि विधिहरू प्रस्तुत गरेर सम्बोधन गर्न सकिन्छ। CTCM को अर्को सीमा यो हो कि काम गर्ने मोडेलले शारीरिक तनाव (प्रीलोड र आफ्टरलोड) हेरफेर गर्दैन। CTCM मा, धेरै ठूला तन्तुहरूमा डायस्टोल (पूर्ण स्ट्रेच) र सिस्टोल (विद्युतीय उत्तेजनाको समयमा संकुचन लम्बाइ) मा २५% शारीरिक स्ट्रेच पुनरुत्पादन गर्न विपरीत दिशामा दबाब प्रेरित गरिएको थियो। भविष्यमा हुने CTCM डिजाइनहरूमा दुवै तर्फबाट हृदयको तन्तुमा पर्याप्त दबाब दिएर र हृदयको कक्षहरूमा हुने सही दबाब-भोल्युम सम्बन्धहरू लागू गरेर यो सीमा हटाउनु पर्छ।
यस पाण्डुलिपिमा रिपोर्ट गरिएको ओभरस्ट्रेच-प्रेरित पुनर्निर्माण हाइपरट्रोफिक हाइपरस्ट्रेच संकेतहरूको नक्कल गर्न सीमित छ। यसरी, यो मोडेलले ह्युमरल वा स्नायु कारकहरू (जुन यस प्रणालीमा अवस्थित छैनन्) को आवश्यकता बिना नै स्ट्रेच-प्रेरित हाइपरट्रोफिक संकेतनको अध्ययनमा मद्दत गर्न सक्छ। CTCM को बहुलता बढाउन थप अध्ययनहरू आवश्यक छ, उदाहरणका लागि, प्रतिरक्षा कोशिकाहरूसँग सह-संस्कृति, परिसंचरण प्लाज्मा ह्युमरल कारकहरू, र न्यूरोनल कोशिकाहरूसँग सह-संस्कृति गर्दा इनर्भेसनले CTCM सँग रोग मोडेलिङको सम्भावनाहरूलाई सुधार गर्नेछ।
यस अध्ययनमा तेह्र सुँगुरहरू प्रयोग गरिएको थियो। सबै पशु प्रक्रियाहरू संस्थागत दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो र लुइसभिल विश्वविद्यालयको संस्थागत पशु हेरचाह र प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित गरिएको थियो। महाधमनी आर्च क्ल्याम्प गरिएको थियो र मुटुलाई १ लिटर बाँझ कार्डियोप्लेजिया (११० एमएम NaCl, १.२ एमएम CaCl2, १६ एमएम KCl, १६ एमएम MgCl2, १० एमएम NaHCO3, ५ यू/एमएल हेपरिन, ७.४ सम्मको पीएच) ले पर्फ्यूज गरिएको थियो; मुटुहरूलाई बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म बरफ-चिसो कार्डियोप्लेजिक घोलमा संरक्षित गरिएको थियो जुन सामान्यतया <१० मिनेट हुन्छ। मुटुहरूलाई बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म बरफ-चिसो कार्डियोप्लेजिक घोलमा संरक्षित गरिएको थियो जुन सामान्यतया <१० मिनेट हुन्छ। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. मुटुहरूलाई बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म बरफ-चिसो कार्डियोप्लेजिक घोलमा भण्डारण गरिएको थियो, जसमा सामान्यतया <१० मिनेट लाग्छ।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟। Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. प्रयोगशालामा बरफमा ढुवानी नगरेसम्म मुटुलाई बरफमा कार्डियोप्लेजियामा राख्नुहोस्, सामान्यतया <१० मिनेट।
CTCM उपकरण SolidWorks कम्प्युटर-एडेड डिजाइन (CAD) सफ्टवेयरमा विकसित गरिएको थियो। कल्चर चेम्बरहरू, डिभाइडरहरू र एयर चेम्बरहरू CNC स्पष्ट एक्रिलिक प्लास्टिकबाट बनेका छन्। ७ मिमी व्यासको ब्याक-अप रिङ केन्द्रमा उच्च घनत्व पोलिथिलीन (HDPE) बाट बनेको छ र तल मिडिया सिल गर्न प्रयोग गरिने सिलिकन ओ-रिङ समायोजन गर्न ओ-रिङ ग्रूभ छ। पातलो सिलिका झिल्लीले कल्चर चेम्बरलाई सेपरेशन प्लेटबाट अलग गर्छ। सिलिकन झिल्ली ०.०२″ बाक्लो सिलिकन पानाबाट लेजर काटिएको छ र यसको कठोरता ३५A छ। तल र माथि सिलिकन गास्केटहरू १/१६″ बाक्लो सिलिकन पानाबाट लेजर काटिएका छन् र यसको कठोरता ५०A छ। ब्लकलाई बाँध्न र हावा बन्द सिल सिर्जना गर्न ३१६L स्टेनलेस स्टील स्क्रू र पखेटा नटहरू प्रयोग गरिन्छ।
C-PACE-EM प्रणालीसँग एकीकृत गर्नको लागि एक समर्पित प्रिन्टेड सर्किट बोर्ड (PCB) डिजाइन गरिएको छ। PCB मा रहेका स्विस मेसिन कनेक्टर सकेटहरू चाँदीको प्लेटेड तामाको तार र इलेक्ट्रोडहरूमा स्क्रू गरिएका कांस्य ०-६० स्क्रूहरूद्वारा ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरूसँग जोडिएका छन्। प्रिन्टेड सर्किट बोर्ड थ्रीडी प्रिन्टरको कभरमा राखिएको छ।
CTCM उपकरणलाई प्रोग्रामेबल वायमेटिक एक्चुएटर (PPD) द्वारा नियन्त्रित गरिन्छ जसले कार्डियक साइकल जस्तै नियन्त्रित रक्तसञ्चार चाप सिर्जना गर्दछ। हावा कक्ष भित्रको चाप बढ्दै जाँदा, लचिलो सिलिकन झिल्ली माथितिर फैलिन्छ, जसले गर्दा तन्तु साइट मुनिको माध्यमलाई बाध्य पार्छ। त्यसपछि तन्तुको क्षेत्र तरल पदार्थको यस निष्कासनद्वारा तन्किनेछ, जसले डायस्टोलको समयमा मुटुको शारीरिक विस्तारको नक्कल गर्दछ। विश्रामको शिखरमा, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरू मार्फत विद्युतीय उत्तेजना लागू गरिएको थियो, जसले हावा कक्षमा दबाब कम गर्‍यो र तन्तु खण्डहरूको संकुचन गर्‍यो। पाइप भित्र हावा प्रणालीमा दबाब पत्ता लगाउन दबाब सेन्सर भएको हेमोस्टेटिक भल्भ छ। दबाब सेन्सरद्वारा महसुस गरिएको दबाब ल्यापटपमा जडान गरिएको डेटा सङ्कलकमा लागू गरिन्छ। यसले ग्यास कक्ष भित्रको दबाबको निरन्तर निगरानी गर्न अनुमति दिन्छ। जब अधिकतम चेम्बर चाप पुग्यो (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS), डेटा अधिग्रहण उपकरणलाई C-PACE-EM प्रणालीमा 2 ms को लागि biphasic भोल्टेज संकेत उत्पन्न गर्न संकेत पठाउन आदेश दिइएको थियो, 4 V मा सेट गरियो।
मुटुको खण्डहरू प्राप्त गरियो र ६ वटा इनारहरूमा कल्चर अवस्थाहरू निम्नानुसार गरियो: काटिएका मुटुहरूलाई स्थानान्तरण पोतबाट चिसो (४° सेल्सियस) कार्डियोप्लेजिया भएको ट्रेमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। बायाँ भेन्ट्रिकललाई बाँझ ब्लेडले अलग गरिएको थियो र १-२ सेन्टिमिटरको टुक्रामा काटिएको थियो। यी टिस्यु ब्लकहरूलाई टिस्यु सपोर्टमा टिस्यु एडहेसिभको साथ जोडिएको थियो र टायरोडको घोल भएको कम्पन गर्ने माइक्रोटोम टिस्यु बाथमा राखिएको थियो र निरन्तर अक्सिजनयुक्त (३ ग्राम/लिटर २,३-ब्युटेनेडियोन मोनोअक्सिम (BDM), १४० मिटर NaCl (८.१८ ग्राम)।), ६ मिटर KCl (०.४४७ ग्राम), १० मिटर D-ग्लुकोज (१.८६ ग्राम), १० मिटर HEPES (२.३८ ग्राम), १ मिटर MgCl2 (१ मिली १ एम घोल), १.८ मिटर CaCl2 (१.८ मिटर १ एम घोल), १ मिटर ddH2O सम्म। कम्पन गर्ने माइक्रोटोमलाई ८० हर्ट्जको फ्रिक्वेन्सीमा, २ मिमीको तेर्सो कम्पन एम्प्लिच्युडमा र ०.०३ मिमी/सेकेन्डको अग्रिम दरमा ३०० µm बाक्लो स्लाइसहरू काट्न सेट गरिएको थियो। घोललाई चिसो राख्न टिस्यु बाथलाई बरफले घेरिएको थियो र तापक्रम ४°C मा कायम राखिएको थियो। माइक्रोटोम बाथबाट टिस्यु सेक्सनहरूलाई बरफमा निरन्तर अक्सिजनयुक्त टायरोड घोल भएको इन्क्युबेशन बाथमा स्थानान्तरण गर्नुहोस् जबसम्म एउटा कल्चर प्लेटको लागि पर्याप्त खण्डहरू प्राप्त हुँदैनन्। ट्रान्सवेल कल्चरहरूको लागि, टिस्यु सेक्सनहरूलाई बाँझ ६ मिमी चौडा पोलियुरेथेन सपोर्टमा जोडिएको थियो र ६ मिलिलिटर अनुकूलित माध्यम (१९९ माध्यम, १x ITS पूरक, १०% FBS, ५ ng/ml VEGF, १० ng/ml FGF-क्षारीय र २X एन्टिबायोटिक-एन्टिफंगल) मा राखिएको थियो। C-Pace मार्फत टिस्यु सेक्सनहरूमा विद्युतीय उत्तेजना (१० V, फ्रिक्वेन्सी १.२ Hz) लागू गरिएको थियो। TD अवस्थाहरूको लागि, प्रत्येक माध्यम परिवर्तनमा १०० nM र १ μM मा ताजा T3 र Dex थपिएको थियो। दिनको ३ पटक प्रतिस्थापन गर्नु अघि माध्यम अक्सिजनले भरिएको हुन्छ। टिस्यु सेक्सनहरूलाई ३७°C र ५% CO2 मा इन्क्यूबेटरमा कल्चर गरिएको थियो।
CTCM कल्चरहरूको लागि, टिस्यु सेक्सनहरू परिमार्जित टायरोडको घोल भएको पेट्री डिशमा अनुकूलित 3D प्रिन्टरमा राखिएको थियो। यो उपकरण मुटुको टुक्राको आकार समर्थन रिंगको क्षेत्रफलको 25% ले बढाउन डिजाइन गरिएको हो। यो गरिन्छ ताकि टायरोडको घोलबाट माध्यममा स्थानान्तरण गरिसकेपछि र डायस्टोलको समयमा मुटुका खण्डहरू फैलिँदैनन्। हिस्टोक्रिलिक ग्लु प्रयोग गरेर, 300 µm बाक्लो खण्डहरू 7 मिमी व्यासको समर्थन रिंगमा फिक्स गरियो। टिस्यु सेक्सनहरूलाई समर्थन रिंगमा जोडेपछि, अतिरिक्त टिस्यु सेक्सनहरू काट्नुहोस् र संलग्न टिस्यु सेक्सनहरूलाई बरफ (4°C) मा टायरोड घोलको बाथमा फिर्ता राख्नुहोस् जबसम्म एउटा उपकरणको लागि पर्याप्त खण्डहरू तयार हुँदैनन्। सबै उपकरणहरूको लागि कुल प्रशोधन समय 2 घण्टा भन्दा बढी हुनु हुँदैन। 6 टिस्यु सेक्सनहरू तिनीहरूको समर्थन रिंगहरूमा जोडिएपछि, CTCM उपकरण भेला गरियो। CTCM कल्चर चेम्बर 21 मिलीलीटर पूर्व-अक्सिजनयुक्त माध्यमले पूर्व-भरिएको छ। टिस्यु सेक्सनहरूलाई कल्चर चेम्बरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस् र पिपेटको साथ कुनै पनि हावा बुलबुले सावधानीपूर्वक हटाउनुहोस्। त्यसपछि टिस्यु सेक्सनलाई प्वालमा निर्देशित गरिन्छ र बिस्तारै ठाउँमा थिचिन्छ। अन्तमा, उपकरणमा इलेक्ट्रोड क्याप राख्नुहोस् र उपकरणलाई इन्क्यूबेटरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। त्यसपछि CTCM लाई एयर ट्यूब र C-PACE-EM प्रणालीमा जडान गर्नुहोस्। वायमेटिक एक्चुएटर खुल्छ र एयर भल्भले CTCM खोल्छ। C-PACE-EM प्रणालीलाई २ ms को लागि बिफासिक पेसिङको समयमा १.२ Hz मा ४ V डेलिभर गर्न कन्फिगर गरिएको थियो। माध्यम दिनमा दुई पटक परिवर्तन गरिएको थियो र इलेक्ट्रोडहरूमा ग्रेफाइट जम्मा हुनबाट बच्नको लागि इलेक्ट्रोडहरू दिनमा एक पटक परिवर्तन गरिएको थियो। आवश्यक भएमा, तिनीहरूको कल्चर इनारबाट टिस्यु सेक्सनहरू हटाउन सकिन्छ ताकि तिनीहरू मुनि परेको कुनै पनि हावाको बुलबुले बाहिर निकालियोस्। MT उपचार अवस्थाहरूको लागि, T3/Dex लाई १०० nM T3 र १ μM Dex सँग प्रत्येक माध्यम परिवर्तनको साथ ताजा थपिएको थियो। CTCM उपकरणहरूलाई ३७°C र ५% CO2 मा इन्क्यूबेटरमा कल्चर गरिएको थियो।
मुटुका टुक्राहरूको फैलिएको प्रक्षेपण प्राप्त गर्न, एउटा विशेष क्यामेरा प्रणाली विकास गरिएको थियो। Navitar Zoom 7000 18-108mm म्याक्रो लेन्स (Navitar, San Francisco, CA) सँग SLR क्यामेरा (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) प्रयोग गरिएको थियो। ताजा माध्यमले माध्यमलाई प्रतिस्थापन गरेपछि कोठाको तापक्रममा दृश्यावलोकन गरिएको थियो। क्यामेरालाई 51° कोणमा राखिएको छ र भिडियो प्रति सेकेन्ड 30 फ्रेममा रेकर्ड गरिएको छ। पहिले, मुटुका टुक्राहरूको गति मापन गर्न Image-J सँग खुला स्रोत सफ्टवेयर (MUSCLEMOTION43) प्रयोग गरिएको थियो। आवाजबाट बच्न मुटुका टुक्राहरूलाई धड्काउन रुचि भएका क्षेत्रहरू परिभाषित गर्न MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) प्रयोग गरेर मास्क सिर्जना गरिएको थियो। म्यानुअल रूपमा खण्डित मास्कहरू फ्रेम अनुक्रममा सबै छविहरूमा लागू गरिन्छ र त्यसपछि MUSCLEMOTION प्लग-इनमा पठाइन्छ। मांसपेशी गतिले सन्दर्भ फ्रेमको सापेक्षमा यसको गति मापन गर्न प्रत्येक फ्रेममा पिक्सेलको औसत तीव्रता प्रयोग गर्दछ। डेटा रेकर्ड गरियो, फिल्टर गरियो र कार्डियक साइकलको समयमा चक्र समय मापन गर्न र तन्तुको तन्किने मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरियो। रेकर्ड गरिएको भिडियोलाई पहिलो-अर्डर शून्य-चरण डिजिटल फिल्टर प्रयोग गरेर पोस्ट-प्रोसेस गरिएको थियो। तन्तुको तन्किने (पीक-टु-पीक) मापन गर्न, रेकर्ड गरिएको सिग्नलमा शिखर र ट्रफहरू बीच भेद गर्न शिखर-टु-पीक विश्लेषण गरिएको थियो। थप रूपमा, सिग्नल बहाव हटाउन छैठौं अर्डर बहुपद प्रयोग गरेर डिट्रेन्डिङ गरिन्छ। विश्वव्यापी तन्तु गति, चक्र समय, विश्राम समय, र संकुचन समय निर्धारण गर्न MATLAB मा प्रोग्राम कोड विकसित गरिएको थियो (पूरक कार्यक्रम कोड ४४)।
स्ट्रेन विश्लेषणको लागि, मेकानिकल स्ट्रेच मूल्याङ्कनको लागि सिर्जना गरिएका उही भिडियोहरू प्रयोग गरेर, हामीले पहिले MUSCLEMOTION सफ्टवेयर अनुसार गति शिखरहरू (गतिको उच्चतम (माथिल्लो) र सबैभन्दा कम (तल्लो) बिन्दुहरू) प्रतिनिधित्व गर्ने दुई छविहरू ट्रेस गर्यौं। त्यसपछि हामीले तन्तु क्षेत्रहरू खण्डित गर्यौं र खण्डित तन्तुमा छायाँ एल्गोरिथ्मको एक रूप लागू गर्यौं (पूरक चित्र २a)। त्यसपछि खण्डित तन्तुलाई दस उपसतहहरूमा विभाजन गरियो, र प्रत्येक सतहमा तनाव निम्न समीकरण प्रयोग गरेर गणना गरियो: स्ट्रेन = (Sup-Sdown)/Sdown, जहाँ Sup र Sdown क्रमशः कपडाको माथिल्लो र तल्लो छायाँबाट आकारको दूरी हुन् (पूरक चित्र २b)।
मुटुका खण्डहरूलाई ४% प्याराफर्मल्डिहाइडमा ४८ घण्टाको लागि फिक्स गरिएको थियो। स्थिर तन्तुहरूलाई १०% र २०% सुक्रोजमा १ घण्टाको लागि निर्जलित गरिएको थियो, त्यसपछि रातभर ३०% सुक्रोजमा। त्यसपछि खण्डहरूलाई इष्टतम काट्ने तापक्रम कम्पाउन्ड (OCT कम्पाउन्ड) मा इम्बेड गरिएको थियो र बिस्तारै आइसोपेन्टेन/ड्राई आइस बाथमा फ्रिज गरिएको थियो। OCT इम्बेडिङ ब्लकहरूलाई -८० °C मा अलग नभएसम्म भण्डार गर्नुहोस्। स्लाइडहरू ८ μm को मोटाईको खण्डको रूपमा तयार गरिएको थियो।
मुटुको भागबाट OCT हटाउन, स्लाइडहरूलाई ९५ डिग्री सेल्सियसमा ५ मिनेटको लागि तताउने ब्लकमा तताउनुहोस्। प्रत्येक स्लाइडमा १ मिली PBS थप्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, त्यसपछि कोठाको तापक्रममा १५ मिनेटको लागि PBS मा ०.१% Triton-X सेट गरेर खण्डहरूमा प्रवेश गर्नुहोस्। गैर-विशिष्ट एन्टिबडीहरूलाई नमूनामा बाँध्नबाट रोक्नको लागि, स्लाइडहरूमा १ मिली ३% BSA घोल थप्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। त्यसपछि BSA हटाइयो र स्लाइडहरूलाई PBS ले धोइयो। प्रत्येक नमूनालाई पेन्सिलले चिन्ह लगाउनुहोस्। प्राथमिक एन्टिबडीहरू (१% BSA मा १:२०० पातलो) (कनेक्सिन ४३ (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) र ट्रोपोनिन-T (थर्मो साइन्टिफिक; #MA5-12960) ९० मिनेटमा थपियो, त्यसपछि माध्यमिक एन्टिबडीहरू (१% BSA मा १:२०० पातलो) मुसा Alexa Fluor ४८८ (थर्मो साइन्टिफिक; #A16079), खरायो Alexa Fluor ५९४ (थर्मो साइन्टिफिक; #T6391) विरुद्ध थप ९० मिनेटको लागि थपियो। PBS ले ३ पटक धोइयो। पृष्ठभूमिबाट लक्ष्य दाग छुट्याउन, हामीले नियन्त्रणको रूपमा माध्यमिक एन्टिबडी मात्र प्रयोग गर्यौं। अन्तमा, DAPI आणविक दाग थपियो र स्लाइडहरू भेक्टाशिल्ड (भेक्टर प्रयोगशालाहरू) मा राखियो र नेल पालिसले बन्द गरियो। -x म्याग्निफिकेसन) र ४०x म्याग्निफिकेसनको साथ किन्स माइक्रोस्कोप।
WGA-Alexa Fluor 555 (थर्मो साइन्टिफिक; #W32464) PBS मा ५ μg/ml मा WGA स्टेनिङको लागि प्रयोग गरिएको थियो र कोठाको तापक्रममा ३० मिनेटको लागि निश्चित खण्डहरूमा लागू गरिएको थियो। त्यसपछि स्लाइडहरूलाई PBS ले धोइयो र प्रत्येक स्लाइडमा सुडान ब्ल्याक थपियो र ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरियो। त्यसपछि स्लाइडहरूलाई PBS ले धोइयो र भेक्टाशिल्ड इम्बेडिङ माध्यम थपियो। स्लाइडहरूलाई ४०x म्याग्निफिकेसनमा किन्स माइक्रोस्कोपमा दृश्यात्मक रूपमा देखाइयो।
माथि वर्णन गरिए अनुसार नमूनाहरूबाट OCT हटाइयो। OCT हटाएपछि, स्लाइडहरूलाई रातभरि बोइनको घोलमा डुबाउनुहोस्। त्यसपछि स्लाइडहरूलाई १ घण्टाको लागि डिस्टिल्ड पानीले पखालियो र त्यसपछि १० मिनेटको लागि बिब्रिच एलो एसिड फुचसिन घोलमा राखियो। त्यसपछि स्लाइडहरूलाई डिस्टिल्ड पानीले धोइयो र ५% फस्फोमोलिब्डेनम/५% फस्फोटुङ्गस्टिक एसिडको घोलमा १० मिनेटको लागि राखियो। कुल्ला नगरी, स्लाइडहरूलाई १५ मिनेटको लागि सिधै एनिलीन नीलो घोलमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। त्यसपछि स्लाइडहरूलाई डिस्टिल्ड पानीले धोइयो र १% एसिटिक एसिड घोलमा २ मिनेटको लागि राखियो। स्लाइडहरूलाई २०० एन इथेनॉलमा सुकाइयो र जाइलिनमा स्थानान्तरण गरियो। दाग गरिएका स्लाइडहरूलाई १०x उद्देश्यको साथ किन्स माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर दृश्यीकरण गरियो। किन्स विश्लेषक सफ्टवेयर प्रयोग गरेर फाइब्रोसिस क्षेत्र प्रतिशत परिमाण गरिएको थियो।
निर्माताको प्रोटोकल अनुसार केही परिमार्जनहरू सहित CyQUANT™ MTT सेल व्यवहार्यता परख (Invitrogen, Carlsbad, CA), क्याटलग नम्बर V13154। विशेष गरी, MTT विश्लेषणको क्रममा एकरूप तन्तु आकार सुनिश्चित गर्न 6 मिमी व्यासको सर्जिकल पंच प्रयोग गरिएको थियो। निर्माताको प्रोटोकल अनुसार तन्तुहरूलाई MTT सब्सट्रेट भएको १२-कुवा प्लेटको इनारमा व्यक्तिगत रूपमा प्लेट गरिएको थियो। खण्डहरू ३ घण्टाको लागि ३७° सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिन्छन् र जीवित तन्तुले बैजनी फर्माजान यौगिक बनाउन MTT सब्सट्रेटलाई मेटाबोलाइज गर्दछ। मुटुको खण्डहरूबाट बैजनी फर्माजान निकाल्न MTT घोललाई १ मिली DMSO ले बदल्नुहोस् र १५ मिनेटको लागि ३७° सेल्सियसमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्। नमूनाहरूलाई ९६-कुवा स्पष्ट तल्लो प्लेटहरूमा DMSO मा १:१० मा पातलो पारिएको थियो र साइटेशन प्लेट रिडर (बायोटेक) प्रयोग गरेर बैजनी रंगको तीव्रता ५७० nm मा मापन गरिएको थियो। हृदयको प्रत्येक टुक्राको तौलमा पठनहरू सामान्यीकृत गरिएको थियो।
पहिले वर्णन गरिए अनुसार ग्लुकोज उपयोग परीक्षणको लागि मुटुको टुक्रा मिडियालाई १ μCi/ml [५-३H]-ग्लुकोज (मोराभेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, CA, USA) भएको मिडियाले प्रतिस्थापन गरिएको थियो। ४ घण्टाको इन्क्युबेशन पछि, १०० μl ०.२ N HCl भएको खुला माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा १०० μl माध्यम थप्नुहोस्। त्यसपछि ट्यूबलाई ३७°C मा ७२ घण्टाको लागि [३H]२O वाष्पीकरण गर्न ५०० μl dH2O भएको सिन्टिलेशन ट्यूबमा राखिएको थियो। त्यसपछि सिन्टिलेशन ट्यूबबाट माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब हटाउनुहोस् र १० मिली सिन्टिलेशन फ्लुइड थप्नुहोस्। ट्राइ-कार्ब २९००TR तरल सिन्टिलेशन विश्लेषक (प्याकार्ड बायोसाइन्स कम्पनी, मेरिडेन, CT, USA) प्रयोग गरेर सिन्टिलेशन गणनाहरू गरिएको थियो। त्यसपछि ग्लुकोजको उपयोग [5-3H]-ग्लुकोज विशिष्ट गतिविधि, अपूर्ण सन्तुलन र पृष्ठभूमि, [5-3H]-लाई लेबल नगरिएको ग्लुकोजमा पातलो पार्ने, र सिन्टिलेशन काउन्टर दक्षतालाई ध्यानमा राखेर गणना गरिएको थियो। डेटा मुटुको खण्डहरूको द्रव्यमानमा सामान्यीकृत गरिन्छ।
ट्राइजोलमा तन्तु एकरूपता पछि, निर्माताको प्रोटोकल अनुसार Qiagen miRNeasy माइक्रो किट #210874 प्रयोग गरेर मुटुको खण्डहरूबाट RNA अलग गरिएको थियो। RNAsec पुस्तकालय तयारी, अनुक्रमण र डेटा विश्लेषण निम्नानुसार गरिएको थियो:
आरएनए पुस्तकालयको तयारीको लागि प्रति नमूना १ μg आरएनए सुरुवाती सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। निर्माताको सिफारिसहरू पालना गर्दै इल्युमिना (NEB, USA) को लागि NEBNext UltraTM RNA पुस्तकालय तयारी किट प्रयोग गरेर अनुक्रमण पुस्तकालयहरू उत्पन्न गरिएको थियो, र प्रत्येक नमूनाको लागि विशेषता अनुक्रमहरूमा अनुक्रमणिका कोडहरू थपिएका थिए। संक्षेपमा, mRNA लाई पोलि-T ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूसँग जोडिएको चुम्बकीय मोतीहरू प्रयोग गरेर कुल RNA बाट शुद्ध गरिएको थियो। NEBNext पहिलो स्ट्र्यान्ड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर (5X) मा उच्च तापक्रममा डिभ्यालेन्ट क्याशनहरू प्रयोग गरेर खण्डीकरण गरिन्छ। पहिलो स्ट्र्यान्ड cDNA लाई अनियमित हेक्सामर प्राइमरहरू र M-MuLV रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (RNase H-) प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिएको थियो। त्यसपछि दोस्रो स्ट्र्यान्ड cDNA लाई DNA पोलिमरेज I र RNase H प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिन्छ। बाँकी ओभरह्याङहरूलाई एक्सोन्यूक्लिज/पोलिमरेज गतिविधिद्वारा ब्लन्ट एन्डहरूमा रूपान्तरण गरिन्छ। DNA टुक्राको ३′ छेउको एडिनेलेसन पछि, यसलाई हाइब्रिडाइजेसनको लागि तयार गर्न हेयरपिन लूप संरचना भएको NEBNext एडाप्टर यसमा जोडिएको हुन्छ। १५०-२०० bp को मनपर्ने लम्बाइको cDNA टुक्राहरूको चयनको लागि। AMPure XP प्रणाली (Beckman Coulter, Beverly, USA) प्रयोग गरेर पुस्तकालयका टुक्राहरू शुद्ध पारिएको थियो। त्यसपछि, एडाप्टरसँग बाँधिएको आकार-चयन गरिएको cDNA सहितको ३ μl USER इन्जाइम (NEB, USA) १५ मिनेटको लागि ३७°C मा र त्यसपछि PCR अघि ९५°C मा ५ मिनेटको लागि प्रयोग गरिएको थियो। त्यसपछि PCR फ्युजन हाई-फिडेलिटी DNA पोलिमरेज, युनिभर्सल PCR प्राइमरहरू, र इन्डेक्स (X) प्राइमरहरू प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो। अन्तमा, PCR उत्पादनहरू शुद्ध पारिएको थियो (AMPure XP प्रणाली) र Agilent Bioanalyzer 2100 प्रणालीमा पुस्तकालय गुणस्तर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। त्यसपछि cDNA लाइब्रेरीलाई नोभासेक सिक्वेन्सर प्रयोग गरेर अनुक्रमित गरिएको थियो। Illumina बाट कच्चा छवि फाइलहरू CASAVA बेस कलिङ प्रयोग गरेर कच्चा पठनहरूमा रूपान्तरण गरिएको थियो। कच्चा डेटा FASTQ(fq) ढाँचा फाइलहरूमा भण्डारण गरिन्छ जसमा पढ्ने अनुक्रमहरू र सम्बन्धित आधार गुणहरू हुन्छन्। फिल्टर गरिएको अनुक्रमण पठनहरू Sscrofa11.1 सन्दर्भ जीनोमसँग मिलाउन HISAT2 चयन गर्नुहोस्। सामान्यतया, HISAT2 ले कुनै पनि आकारको जीनोमलाई समर्थन गर्दछ, जसमा ४ अर्ब आधार भन्दा ठूला जीनोमहरू समावेश छन्, र धेरैजसो प्यारामिटरहरूको लागि पूर्वनिर्धारित मानहरू सेट गरिएका छन्। RNA Seq डेटाबाट स्प्लिसिङ रिडहरू HISAT2 प्रयोग गरेर कुशलतापूर्वक पङ्क्तिबद्ध गर्न सकिन्छ, जुन हाल उपलब्ध सबैभन्दा छिटो प्रणाली हो, जुन अन्य कुनै पनि विधि भन्दा समान वा राम्रो शुद्धताका साथ हो।
ट्रान्सक्रिप्टहरूको प्रशस्तताले जीन अभिव्यक्तिको स्तरलाई प्रत्यक्ष रूपमा प्रतिबिम्बित गर्दछ। जीन अभिव्यक्ति स्तरहरू जीनोम वा एक्सोनसँग सम्बन्धित ट्रान्सक्रिप्टहरूको प्रशस्तता (अनुक्रम गणना) द्वारा मूल्याङ्कन गरिन्छ। पठनहरूको संख्या जीन अभिव्यक्ति स्तर, जीन लम्बाइ, र अनुक्रम गहिराइको समानुपातिक हुन्छ। FPKM (प्रति मिलियन आधार जोडी अनुक्रमित ट्रान्सक्रिप्टको प्रति हजार आधार जोडी टुक्राहरू) गणना गरिएको थियो र DESeq2 प्याकेज प्रयोग गरेर भिन्न अभिव्यक्तिको P-मानहरू निर्धारण गरिएको थियो। त्यसपछि हामीले निर्मित R-प्रकार्य "p.adjust" मा आधारित बेन्जामिनी-होचबर्ग विधि9 प्रयोग गरेर प्रत्येक P मानको लागि गलत खोज दर (FDR) गणना गर्यौं।
मुटुको भागबाट अलग गरिएको RNA लाई थर्मो (थर्मो, क्याट. नम्बर. ११७५६०५०) बाट सुपरस्क्रिप्ट IV भिलो मास्टर मिक्स प्रयोग गरेर २०० ng/μl को सांद्रतामा cDNA मा रूपान्तरण गरिएको थियो। मात्रात्मक RT-PCR एप्लाइड बायोसिस्टम्स एन्डुरा प्लेट माइक्रोएम्प ३८४-वेल पारदर्शी प्रतिक्रिया प्लेट (थर्मो, क्याट. नम्बर. ४४८३३१९) र माइक्रोएम्प अप्टिकल एडेसिभ (थर्मो, क्याट. नम्बर. ४३११९७१) प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो। प्रतिक्रिया मिश्रणमा ५ µl ताकमान फास्ट एडभान्स्ड मास्टर मिक्स (थर्मो, क्याट # ४४४४५५७), ०.५ µl ताकमान प्राइमर र ३.५ µl H2O प्रति इनार मिश्रित थियो। मानक qPCR चक्रहरू चलाइयो र एप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वान्टस्टुडियो ५ वास्तविक-समय PCR उपकरण (३८४-वेल मोड्युल; उत्पादन # A28135) प्रयोग गरेर CT मानहरू मापन गरियो। Taqman प्राइमरहरू Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) बाट खरिद गरिएका थिए। सबै नमूनाहरूको CT मानहरू हाउसकिपिङ जीन GAPDH मा सामान्यीकृत गरिएको थियो।
निर्माताको प्रोटोकल अनुसार NT-ProBNP किट (सुँगुर) (बिरालो नं. MBS2086979, MyBioSource) प्रयोग गरेर NT-ProBNP को मिडिया रिलीजको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। संक्षेपमा, प्रत्येक इनारमा प्रत्येक नमूना र मानकको २५० µl प्रतिलिपिमा थपिएको थियो। नमूना थपेपछि तुरुन्तै, प्रत्येक इनारमा ५० µl एसे रिएजेन्ट A थप्नुहोस्। प्लेटलाई बिस्तारै हल्लाउनुहोस् र सीलेन्टले सिल गर्नुहोस्। त्यसपछि ट्याब्लेटहरू १ घण्टाको लागि ३७°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि घोललाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र इनारहरूलाई ३५० µl १X वाश सोल्युसनले ४ पटक धुनुहोस्, प्रत्येक पटक १-२ मिनेटको लागि वाश सोल्युसन इन्क्युबेट गर्नुहोस्। त्यसपछि प्रति इनार १०० µl एसे रिएजेन्ट B थप्नुहोस् र प्लेट सीलेन्टले सिल गर्नुहोस्। ट्याब्लेटलाई बिस्तारै हल्लाइयो र ३७°C मा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। घोललाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र इनारहरूलाई ३५० µl १X वाश सोल्युसनले ५ पटक धुनुहोस्। प्रत्येक इनारमा ९० µl सब्सट्रेट सोल्युसन थप्नुहोस् र प्लेटलाई सिल गर्नुहोस्। प्लेटलाई ३७°C मा १०-२० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। प्रत्येक इनारमा ५० µl स्टप सोल्युसन थप्नुहोस्। ४५० nm मा सेट गरिएको साइटेशन (बायोटेक) प्लेट रिडर प्रयोग गरेर प्लेट तुरुन्तै मापन गरियो।
५% प्रकार I त्रुटि दरको साथ प्यारामिटरमा १०% निरपेक्ष परिवर्तन पत्ता लगाउन ८०% भन्दा बढी शक्ति प्रदान गर्ने समूह आकारहरू छनौट गर्न पावर विश्लेषणहरू गरिएको थियो। ५% प्रकार I त्रुटि दरको साथ प्यारामिटरमा १०% निरपेक्ष परिवर्तन पत्ता लगाउन ८०% भन्दा बढी शक्ति प्रदान गर्ने समूह आकारहरू छनौट गर्न पावर विश्लेषणहरू गरिएको थियो। Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения PARAMETTRA SA 5% частотой ошибок TIPA I। ५% प्रकार I त्रुटि दरको साथ १०% निरपेक्ष प्यारामिटर परिवर्तन पत्ता लगाउन ८०% भन्दा बढी शक्ति प्रदान गर्ने समूह आकारहरू चयन गर्न पावर विश्लेषण गरिएको थियो।进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将枯变化和5％将提供.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将枯变化和5％将提供. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ८०% мощности для обнаружения 10% PARAMETROV र 5% частоты ошибок TIPA I। १०% निरपेक्ष प्यारामिटर परिवर्तन र ५% प्रकार I त्रुटि दर पत्ता लगाउन ८०% भन्दा बढी शक्ति प्रदान गर्ने समूह आकार चयन गर्न पावर विश्लेषण गरिएको थियो।प्रयोग गर्नुअघि टिस्यु सेक्सनहरू अनियमित रूपमा चयन गरिएको थियो। सबै विश्लेषणहरू अवस्था-अन्ध थिए र सबै डेटा विश्लेषण गरिसकेपछि मात्र नमूनाहरू डिकोड गरिएको थियो। सबै सांख्यिकीय विश्लेषणहरू गर्न ग्राफप्याड प्रिज्म सफ्टवेयर (सान डिएगो, CA) प्रयोग गरिएको थियो। सबै तथ्याङ्कहरूको लागि, <0.05 मानहरूमा p-मानहरूलाई महत्त्वपूर्ण मानिएको थियो। सबै तथ्याङ्कहरूको लागि, p-मानहरू <०.०५ मानहरूमा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो। Для всей статистики p-значения считались значимыmi pri значениях <0,05। सबै तथ्याङ्कहरूको लागि, p-मानहरू <०.०५ मानहरूमा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的। Для всей статистики p-значения считались значимыmi pri значениях <0,05। सबै तथ्याङ्कहरूको लागि, p-मानहरू <०.०५ मानहरूमा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो।दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण केवल २ तुलनाहरू सहित डेटामा गरिएको थियो। धेरै समूहहरू बीचको महत्त्व निर्धारण गर्न एक-तर्फी वा दुई-तर्फी ANOVA प्रयोग गरिएको थियो। पोस्ट-हक परीक्षणहरू गर्दा, टुकीको सुधार धेरै तुलनाहरूको लागि खातामा लागू गरिएको थियो। विधिहरू खण्डमा वर्णन गरिए अनुसार FDR र p.adjust गणना गर्दा RNAsec डेटामा विशेष सांख्यिकीय विचारहरू हुन्छन्।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अनुसन्धान रिपोर्ट सारांश हेर्नुहोस्।