Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। यसै बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
AFEX सँग पूर्व-उपचार गरिएको मकैको स्टोभरमा निरन्तर ओलिगोस्याकराइडहरूको जटिल विश्लेषणको लागि नयाँ इम्युनोलोजिकल र मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधिहरू। लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास जीवाश्म इन्धनको दिगो विकल्प हो र खाना, दाना, इन्धन र रसायन जस्ता उत्पादनहरूको उत्पादनको लागि जैविक प्रविधिहरू विकास गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ। यी प्रविधिहरूको मुख्य कुरा बिरुवाको कोष भित्ताहरूमा पाइने जटिल कार्बोहाइड्रेटहरूलाई ग्लुकोज, जाइलोज र अराबिनोज जस्ता साधारण चिनीहरूमा रूपान्तरण गर्न लागत-प्रतिस्पर्धी प्रक्रियाहरूको विकास हो। लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास धेरै जिद्दी भएकोले, यसलाई इच्छित उत्पादन प्राप्त गर्न थर्मोकेमिकल उपचारहरू (जस्तै, अमोनिया फाइबर एक्सफोलिएशन (AFEX), पातलो एसिड (DA), आयनिक तरल पदार्थ (IL)) र जैविक उपचारहरू (जस्तै, इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस र माइक्रोबियल किण्वन) संयोजनमा गर्नुपर्छ। यद्यपि, जब हाइड्रोलिसिस प्रक्रियामा व्यावसायिक फंगल इन्जाइमहरू प्रयोग गरिन्छ, तब बन्ने घुलनशील चिनीहरूको केवल ७५-८५% मोनोस्याकराइडहरू हुन्छन्, र बाँकी १५-२५% घुलनशील, अस्थिर ओलिगोस्याकराइडहरू हुन्छन्, जुन सधैं सूक्ष्मजीवहरूको लागि उपलब्ध हुँदैनन्। पहिले, हामीले कार्बन र डायटोमेसियस पृथ्वी पृथकीकरण र आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफीको संयोजन प्रयोग गरेर घुलनशील जिद्दी ओलिगोस्याकराइडहरूलाई सफलतापूर्वक अलग र शुद्ध गरेका छौं, र तिनीहरूको इन्जाइम निरोधात्मक गुणहरूको पनि अनुसन्धान गरेका छौं। हामीले पत्ता लगाएका छौं कि उच्च डिग्री पोलिमराइजेशन (DP) मिथाइलेटेड युरोनिक एसिड प्रतिस्थापनहरू भएका ओलिगोस्याकराइडहरूलाई कम DP र तटस्थ ओलिगोस्याकराइडहरू भन्दा व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रणहरूसँग प्रशोधन गर्न बढी गाह्रो हुन्छ। यहाँ हामी बिरुवाको कोष भित्ताहरू र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसेट्समा ग्लाइकन बन्धनहरू चित्रण गर्न बिरुवा बायोमास ग्लाइकनहरूको लागि विशिष्ट मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू (mAbs) प्रयोग गरेर ग्लाइकन प्रोफाइलिङ, म्याट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर डिसोर्प्शन आयनाइजेशन, उडानको समय-स्पेक्ट्रोमेट्री सहित धेरै अतिरिक्त विधिहरूको प्रयोगको रिपोर्ट गर्छौं। MALDI-TOF-MS) ले नकारात्मक आयनहरूको माध्यमिक क्षय पछि स्पेक्ट्रोस्कोपी, ग्यास क्रोमेटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) द्वारा प्राप्त संरचना-जानकारीपूर्ण निदानात्मक शिखरहरू प्रयोग गर्दछ जसले डेरिभेटिजेशनको साथ र बिना ओलिगोसेकराइड बन्डहरू चित्रण गर्दछ। ओलिगोसेकराइडहरूको सानो आकार (DP 4-20) को कारण, यी अणुहरू mAb बाइन्डिङ र क्यारेक्टराइजेसनको लागि प्रयोग गर्न गाह्रो छन्। यो समस्यालाई पार गर्न, हामीले नयाँ बायोटिन कन्जुगेशन-आधारित ओलिगोसेकराइड स्थिरीकरण विधि लागू गर्यौं जसले माइक्रोप्लेट सतहमा कम DP घुलनशील ओलिगोसेकराइडहरूको बहुमतलाई सफलतापूर्वक लेबल गर्‍यो, जुन त्यसपछि विशिष्ट लिगेसन विश्लेषणको लागि उच्च थ्रुपुट mAb प्रणालीमा प्रयोग गरिएको थियो। यो नयाँ विधिले भविष्यमा थप उन्नत उच्च थ्रुपुट ग्लाइकोम एसेजहरूको विकासलाई सहज बनाउनेछ जुन निदान उद्देश्यका लागि बायोमार्करहरूमा उपस्थित ओलिगोसेकराइडहरूलाई अलग गर्न र विशेषता बनाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ।
कृषि, वन, घाँस र काठका सामग्रीहरू मिलेर बनेको लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास, उच्च मूल्यका उत्पादनहरू उत्पादन गर्न खाद्य, दाना, इन्धन र रासायनिक पूर्ववर्तीहरू सहित जैविक-आधारित उत्पादनहरूको उत्पादनको लागि सम्भावित फिडस्टक हो। बिरुवाको कोष भित्ताहरूमा पाइने कार्बोहाइड्रेटहरू (जस्तै सेलुलोज र हेमिसेलुलोज) रासायनिक प्रशोधन र बायोट्रान्सफॉर्मेसन (जस्तै इन्जाइमेटिक हाइड्रोलिसिस र माइक्रोबियल किण्वन) द्वारा मोनोसेकराइडहरूमा डिपोलिमराइज गरिन्छ। सामान्य पूर्व-उपचारहरूमा अमोनिया फाइबर विस्तार (AFEX), पातलो एसिड (DA), आयनिक तरल (IL), र स्टीम विस्फोट (SE) समावेश छन्, जसले बिरुवाको कोष भित्ताहरू खोलेर लिग्नोसेल्युलोज उत्पादन घटाउन रसायन र तापको संयोजन प्रयोग गर्दछ। पदार्थको जिद्दी, ५. इन्जाइमेटिक हाइड्रोलिसिस व्यावसायिक सक्रिय कार्बोहाइड्रेट-युक्त इन्जाइमहरू (CAZymes) र जैविक-आधारित इन्धन र रसायनहरू उत्पादन गर्न ट्रान्सजेनिक खमीर वा ब्याक्टेरिया प्रयोग गरेर माइक्रोबियल किण्वन प्रयोग गरेर उच्च ठोस भारमा गरिन्छ। ६।
व्यावसायिक इन्जाइमहरूमा CAZymes इन्जाइमहरूको जटिल मिश्रणबाट बनेका हुन्छन् जसले जटिल कार्बोहाइड्रेट-चिनी बन्धनहरूलाई सिनर्जस्टिक रूपमा तोडेर मोनोस्याकराइडहरू २,७ बनाउँछन्। हामीले पहिले रिपोर्ट गरेझैं, कार्बोहाइड्रेटसँग लिग्निनको सुगन्धित पोलिमरहरूको जटिल नेटवर्कले तिनीहरूलाई अत्यधिक असहज बनाउँछ, जसले गर्दा अपूर्ण चिनी रूपान्तरण हुन्छ, जसले गर्दा १५-२५% सेक्स ओलिगोस्याकराइडहरू जम्मा हुन्छन् जुन पूर्व-उपचार गरिएको बायोमासको इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिसको समयमा उत्पादन हुँदैनन्। यो विभिन्न बायोमास प्रिट्रीटमेन्ट विधिहरूसँग एक सामान्य समस्या हो। यस अवरोधको केही कारणहरूमा हाइड्रोलिसिसको समयमा इन्जाइम अवरोध, वा बिरुवा बायोमासमा चिनी बन्धन तोड्न आवश्यक पर्ने आवश्यक इन्जाइमहरूको अनुपस्थिति वा कम स्तर समावेश छ। ओलिगोस्याकराइडहरूमा चिनी बन्धन जस्ता चिनीको संरचना र संरचनात्मक विशेषताहरू बुझ्नाले हामीलाई हाइड्रोलिसिसको समयमा चिनी रूपान्तरण सुधार गर्न मद्दत गर्नेछ, जैवप्रौद्योगिकी प्रक्रियाहरूलाई पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादनहरूसँग लागत-प्रतिस्पर्धी बनाउनेछ।
कार्बोहाइड्रेटको संरचना निर्धारण गर्नु चुनौतीपूर्ण छ र यसको लागि तरल क्रोमेटोग्राफी (LC)11,12, आणविक चुम्बकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR)13, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस (CE)14,15,16 र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)17 जस्ता विधिहरूको संयोजन आवश्यक पर्दछ। , अठार। म्याट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) प्रयोग गरेर लेजर डिसोर्प्शन र आयनीकरणको साथ उडानको समयको मास स्पेक्ट्रोमेट्री जस्ता MS विधिहरू कार्बोहाइड्रेट संरचनाहरू पहिचान गर्न बहुमुखी विधि हुन्। हालै, ओलिगोसाकराइड संलग्न स्थितिहरू, एनोमेरिक कन्फिगरेसनहरू, अनुक्रमहरू, र शाखा स्थितिहरू 20, 21 सँग सम्बन्धित औंठाछापहरू पहिचान गर्न सोडियम आयन एडक्टहरूको टक्कर-प्रेरित विच्छेदन (CID) ट्यान्डम MS सबैभन्दा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ।
कार्बोहाइड्रेट बन्धनहरूको गहन पहिचानको लागि ग्लाइकन विश्लेषण एक उत्कृष्ट उपकरण हो22। यो विधिले जटिल कार्बोहाइड्रेट लिङ्केजहरू बुझ्नको लागि बिरुवाको कोशिका भित्ता ग्लाइकनलाई निर्देशित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू (mAbs) प्रयोग गर्दछ। विश्वव्यापी रूपमा २५० भन्दा बढी mAbs उपलब्ध छन्, विभिन्न saccharides24 प्रयोग गरेर विभिन्न रेखीय र शाखायुक्त ओलिगोस्याकराइडहरू विरुद्ध डिजाइन गरिएको। बिरुवाको कोशिका भित्ताको संरचना, संरचना र परिमार्जनहरू चित्रण गर्न धेरै mAbs व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ, किनकि बिरुवाको कोशिका प्रकार, अंग, उमेर, विकास चरण, र वृद्धि वातावरण25,26 मा निर्भर गर्दै महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू छन्। हालसालै, यो विधि बिरुवा र जनावर प्रणालीहरूमा भेसिकल जनसंख्या र सबसेलुलर मार्करहरू, विकास चरणहरू, वा वातावरणीय उत्तेजनाहरू द्वारा निर्धारण गरिएको ग्लाइकन यातायातमा तिनीहरूको सम्बन्धित भूमिकाहरू बुझ्न र इन्जाइम्याटिक गतिविधि निर्धारण गर्न प्रयोग गरिएको छ। पहिचान गरिएका ग्लाइकान्स र जाइलान्सका केही फरक संरचनाहरूमा पेक्टिन (P), जाइलान्स (X), मन्नान (M), जाइलोग्लुकान्स (XylG), मिश्रित बन्धन ग्लुकान्स (MLG), अराबिनोक्सिलान (ArbX), ग्यालेक्टोमान्नान (GalG), ग्लुकुरोनिक एसिड-अरबिनोक्सिलान (GArbX) र अराबिनो-ग्यालेक्टन (ArbG)29 समावेश छन्।
यद्यपि, यी सबै अनुसन्धान प्रयासहरूको बावजुद, उच्च ठोस भार (HSL) हाइड्रोलिसिसको समयमा ओलिगोसेकराइड संचयको प्रकृतिमा केही अध्ययनहरूले मात्र ध्यान केन्द्रित गरेका छन्, जसमा ओलिगोसेकराइड रिलीज, हाइड्रोलिसिसको समयमा ओलिगोमेरिक चेन लम्बाइ परिवर्तनहरू, विभिन्न कम DP पोलिमरहरू, र तिनीहरूको वक्रहरू समावेश छन्। वितरण 30,31,32। यसैबीच, ग्लाइकन विश्लेषण ग्लाइकन संरचनाको व्यापक विश्लेषणको लागि उपयोगी उपकरण साबित भएको भए पनि, एन्टिबडी विधिहरू प्रयोग गरेर पानीमा घुलनशील कम DP ओलिगोसेकराइडहरूको मूल्याङ्कन गर्न गाह्रो छ। 5-10 kDa भन्दा कम आणविक भार भएका साना DP ओलिगोसेकराइडहरू ELISA प्लेटहरू 33, 34 मा बाँध्दैनन् र एन्टिबडी थप्नु अघि धोइन्छ।
यहाँ, पहिलो पटक, हामी मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर एभिडिन-लेपित प्लेटहरूमा ELISA परख प्रदर्शन गर्छौं, घुलनशील रिफ्रेक्टरी ओलिगोस्याकराइडहरूको लागि एक-चरण बायोटिनाइलेसन प्रक्रियालाई ग्लाइकोम विश्लेषणसँग संयोजन गर्दै। ग्लाइकोम विश्लेषणको लागि हाम्रो दृष्टिकोण MALDI-TOF-MS र GC-MS मा आधारित पूरक ओलिगोस्याकराइड लिंकेजहरूको विश्लेषणद्वारा प्रमाणित गरिएको थियो जुन हाइड्रोलाइज्ड चिनी रचनाहरूको ट्राइमेथिलसिलिल (TMS) व्युत्पन्नीकरण प्रयोग गर्दछ। यो नवीन दृष्टिकोण भविष्यमा उच्च-थ्रुपुट विधिको रूपमा विकास गर्न सकिन्छ र बायोमेडिकल अनुसन्धानमा व्यापक अनुप्रयोग पाउन सकिन्छ।
ग्लाइकोसायलेसन जस्ता इन्जाइम र एन्टिबडीहरूको अनुवादपछिको परिमार्जन, ३६ ले तिनीहरूको जैविक गतिविधिलाई असर गर्छ। उदाहरणका लागि, सीरम प्रोटीनको ग्लाइकोसायलेसनमा हुने परिवर्तनहरूले सूजन गठियामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्, र ग्लाइकोसायलेसनमा हुने परिवर्तनहरूलाई निदानात्मक मार्करको रूपमा प्रयोग गरिन्छ ३७। साहित्यमा विभिन्न ग्लाइकानहरू विभिन्न रोगहरूमा सजिलै देखा पर्ने रिपोर्ट गरिएको छ, जसमा जठरांत्र मार्ग र कलेजोको पुरानो सूजन रोगहरू, भाइरल संक्रमणहरू, डिम्बग्रंथि, स्तन र प्रोस्टेट क्यान्सरहरू ३८,३९,४० समावेश छन्। एन्टिबडी-आधारित ग्लाइकान ELISA विधिहरू प्रयोग गरेर ग्लाइकानको संरचना बुझ्नाले जटिल MS विधिहरूको प्रयोग बिना रोग निदानमा थप विश्वास प्रदान गर्नेछ।
हाम्रो अघिल्लो अध्ययनले देखाएको छ कि प्रिट्रीटमेन्ट र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस पछि पनि जिद्दी ओलिगोसेकराइडहरू हाइड्रोलाइज्ड रह्यो (चित्र १)। हाम्रो पहिले प्रकाशित कार्यमा, हामीले AFEX-प्रिट्रीट गरिएको मकै स्टोभर हाइड्रोलाइजेट (ACSH)8 बाट ओलिगोसेकराइडहरू अलग गर्न सक्रिय चारकोल ठोस-चरण निकासी विधि विकास गर्यौं। प्रारम्भिक निकासी र विभाजन पछि, ओलिगोसेकराइडहरूलाई आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी (SEC) द्वारा थप अंश गरिएको थियो र आणविक वजनको क्रममा सङ्कलन गरिएको थियो। विभिन्न प्रिट्रीटमेन्टहरूबाट निस्केका चिनी मोनोमरहरू र ओलिगोमरहरूलाई चिनी संरचना विश्लेषणद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। विभिन्न प्रिट्रीटमेन्ट विधिहरूद्वारा प्राप्त चिनी ओलिगोमरहरूको सामग्रीको तुलना गर्दा, जिद्दी ओलिगोसेकराइडहरूको उपस्थिति बायोमासलाई मोनोसेकराइडमा रूपान्तरणमा एक सामान्य समस्या हो र यसले कम्तिमा १०-१५% र १८% सम्म चिनी उत्पादनमा कमी ल्याउन सक्छ। अमेरिका। यो विधि ओलिगोसेकराइड अंशहरूको थप ठूलो मात्रामा उत्पादनको लागि प्रयोग गरिन्छ। परिणामस्वरूप ACH र विभिन्न आणविक वजन भएका यसको पछिल्ला अंशहरूलाई यस कार्यमा ओलिगोसेकराइडहरूको विशेषताको लागि प्रयोगात्मक सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।
पूर्व-उपचार र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस पछि, निरन्तर ओलिगोस्याकराइडहरू हाइड्रोलाइसिस नभएका रहे। यहाँ (A) एक ओलिगोस्याकराइड पृथकीकरण विधि हो जसमा सक्रिय कार्बन र डायटोमेसियस अर्थको प्याक गरिएको बेड प्रयोग गरेर AFEX-पूर्व-उपचार गरिएको मकै स्टोभर हाइड्रोलाइसेट (ACSH) बाट ओलिगोस्याकराइडहरू अलग गरिन्छन्; (B) ओलिगोस्याकराइडहरू अलग गर्ने विधि। ओलिगोस्याकराइडहरूलाई आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी (SEC) द्वारा थप अलग गरिएको थियो; (C) विभिन्न पूर्व-उपचारहरूबाट निस्कने स्याकराइड मोनोमरहरू र ओलिगोमरहरू (पातलो एसिड: DA, आयनिक तरल: IL र AFEX)। इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस अवस्थाहरू: २५% (w/w) को उच्च ठोस लोडिङ (लगभग ८% ग्लुकन लोडिङ), ९६ घण्टा हाइड्रोलिसिस, २० मिलीग्राम/ग्राम व्यावसायिक इन्जाइम लोडिङ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 अनुपात) र (D) AFEX पूर्व-उपचार गरिएको मकै स्टोभर (ACS) बाट निस्कने ग्लुकोज, जाइलोज र एराबिनोजका चिनी मोनोमरहरू र ओलिगोमरहरू।
ठोस बायोमास अवशेषहरूबाट अलग गरिएका अर्कहरूमा ग्लाइकान्सको व्यापक संरचनात्मक विश्लेषणको लागि ग्लाइकान्स विश्लेषण उपयोगी उपकरण साबित भएको छ। यद्यपि, यो परम्परागत विधि प्रयोग गरेर पानीमा घुलनशील स्याकराइडहरूलाई कम प्रतिनिधित्व गरिएको छ41 किनभने कम आणविक तौल ओलिगोस्याकराइडहरू ELISA प्लेटहरूमा स्थिर गर्न गाह्रो हुन्छन् र एन्टिबडी थप्नु अघि धोइन्छ। त्यसकारण, एन्टिबडी बाइन्डिङ र विशेषताको लागि, एभिडिन-लेपित ELISA प्लेटहरूमा घुलनशील, गैर-अनुपालन ओलिगोस्याकराइडहरू कोट गर्न एक-चरण बायोटिनाइलेसन विधि प्रयोग गरिएको थियो। यो विधि हाम्रो पहिले उत्पादित ACSH र यसको आणविक तौल (वा पोलिमराइजेसनको डिग्री, DP) मा आधारित अंश प्रयोग गरेर परीक्षण गरिएको थियो। कार्बोहाइड्रेटको घटाउने छेउमा बायोटिन-LC-हाइड्राजाइड थपेर ओलिगोस्याकराइड बाइन्डिङ आत्मीयता बढाउन एक-चरण बायोटिनाइलेसन प्रयोग गरिएको थियो (चित्र २)। समाधानमा, घटाउने छेउमा रहेको हेमियासेटल समूहले हाइड्राजोन बन्धन बनाउन बायोटिन-LC-हाइड्राजाइडको हाइड्राजाइड समूहसँग प्रतिक्रिया गर्दछ। रिड्युसिङ एजेन्ट NaCNBH3 को उपस्थितिमा, हाइड्राजोन बन्धनलाई स्थिर बायोटिनिलेटेड अन्तिम उत्पादनमा घटाइन्छ। चिनी घटाउने अन्त्यको परिमार्जनसँगै, कम DP ओलिगोस्याकराइडहरूलाई ELISA प्लेटहरूमा बाँध्न सम्भव भयो, र हाम्रो अध्ययनमा यो ग्लाइकन-लक्षित mAbs प्रयोग गरेर एभिडिन-लेपित प्लेटहरूमा गरिएको थियो।
बायोटिनिलेटेड ओलिगोस्याकराइडहरूको लागि ELISA मा आधारित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरूको स्क्रिनिङ। यहाँ (A) ओलिगोस्याकराइडहरूको संयुक्त बायोटिनिलेसन र त्यसपछिको ELISA स्क्रिनिङले न्युट्रएभिडिन लेपित प्लेटहरूमा ग्लाइकन-लक्षित mAbs सँग र (B) प्रतिक्रिया उत्पादनहरूको बायोटिनिलेसनको लागि एक-चरण प्रक्रिया देखाउँछ।
त्यसपछि ओलिगोस्याकराइड-संयुग्मित एन्टिबडीहरू भएका एभिडिन-लेपित प्लेटहरूलाई प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीहरूमा थपियो र प्रकाश- र समय-संवेदनशील माध्यममा धोइयो। एन्टिबडी बाइन्डिङ पूरा भएपछि, प्लेटलाई इन्क्युबेट गर्न TMB सब्सट्रेट थप्नुहोस्। प्रतिक्रिया अन्ततः सल्फ्यूरिक एसिडको साथ रोकियो। एन्टिबडी-विशिष्ट क्रस-लिङ्किङ पत्ता लगाउन प्रत्येक एन्टिबडीको बाइन्डिङ शक्ति निर्धारण गर्न इन्क्युबेटेड प्लेटहरूको विश्लेषण ELISA रिडर प्रयोग गरेर गरिएको थियो। प्रयोगको विवरण र प्यारामिटरहरूको लागि, सम्बन्धित खण्ड "सामग्री र विधिहरू" हेर्नुहोस्।
हामी ACSH मा उपस्थित घुलनशील ओलिगोस्याकराइडहरू साथै लिग्नोसेल्युलोसिक हाइड्रोलाइसेट्सबाट अलग गरिएका कच्चा र शुद्ध ओलिगोस्याकराइड अंशहरूमा रहेको घुलनशील ओलिगोस्याकराइडहरूको विशेषतालाई चित्रण गरेर विशिष्ट अनुप्रयोगहरूको लागि यो नयाँ विकसित विधिको उपयोगिता प्रदर्शन गर्छौं। चित्र ३ मा देखाइए अनुसार, बायोएसिलेटेड ग्लाइकोम परख विधिहरू प्रयोग गरेर ACSH मा पहिचान गरिएका सबैभन्दा सामान्य एपिटोप-प्रतिस्थापन गरिएका जाइलान्सहरू सामान्यतया युरोनिक (U) वा मिथाइलुरोनिक (MeU) र पेक्टिक एराबिनोग्यालेक्टन्स हुन्। तिनीहरूमध्ये धेरैजसो गैर-हाइड्रोलाइज्ड ठोस पदार्थहरू (UHS)43 को ग्लाइकान्सको विश्लेषणमा हाम्रो अघिल्लो अध्ययनमा पनि फेला परेका थिए।
कोष भित्ता ग्लाइक्यानमा निर्देशित मोनोक्लोनल एन्टिबडी प्रयोग गरेर रिक्याल्सिट्रन्ट ओलिगोसेकराइड एपिटोपहरूको पत्ता लगाउने। "तटस्थ" अंश ACN अंश हो र "एसिडिक" अंश FA अंश हो। हिटम्यापमा उज्यालो रातोले उच्च एपिटोप सामग्रीलाई संकेत गर्दछ, र उज्यालो नीलोले खाली पृष्ठभूमिलाई संकेत गर्दछ। स्केलमा रङ मानहरू सूत्रहरू N=2 को लागि कच्चा OD मानहरूमा आधारित छन्। एन्टिबडीहरू द्वारा पहिचान गरिएका मुख्य एपिटोपहरू दायाँतिर देखाइएका छन्।
यी गैर-सेल्युलोज संरचनाहरूलाई परीक्षण गरिएको व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रणमा सबैभन्दा सामान्य सेल्युलोज र हेमिसेल्युलोजद्वारा विभाजित गर्न सकिएन, जसमा सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने व्यावसायिक इन्जाइमहरू समावेश छन्। त्यसकारण, तिनीहरूको हाइड्रोलिसिसको लागि नयाँ सहायक इन्जाइमहरू आवश्यक पर्दछ। आवश्यक गैर-सेल्युलोज सहायक इन्जाइमहरू बिना, यी गैर-सेल्युलोज बन्धनहरूले मोनोसेकराइडहरूमा पूर्ण रूपान्तरणलाई रोक्छन्, भले पनि तिनीहरूको अभिभावक चिनी पोलिमरहरू छोटो टुक्राहरूमा व्यापक रूपमा हाइड्रोलाइज गरिएका छन् र व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रणहरू प्रयोग गरेर विघटन गरिएका छन्।
सिग्नल वितरण र यसको बाइन्डिङ शक्तिको थप अध्ययनले देखाएको छ कि बाइन्डिङ एपिटोपहरू उच्च DP चिनी अंशहरूमा (A, B, C, DP २०+ सम्म) कम DP अंशहरू (D, E, F, DP) डाइमरहरूमा भन्दा कम थिए (चित्र १)। एसिड टुक्राहरू तटस्थ टुक्राहरू भन्दा गैर-सेल्युलोज एपिटोपहरूमा बढी सामान्य हुन्छन्। यी घटनाहरू हाम्रो अघिल्लो अध्ययनमा अवलोकन गरिएको ढाँचासँग मेल खान्छ, जहाँ उच्च DP र एसिड मोइटीहरू इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिसको लागि बढी प्रतिरोधी थिए। त्यसकारण, गैर-सेल्युलोज ग्लाइकन एपिटोपहरू र U र MeU प्रतिस्थापनहरूको उपस्थितिले ओलिगोस्याकराइडहरूको स्थिरतामा ठूलो योगदान पुर्‍याउन सक्छ। यो ध्यान दिनुपर्छ कि कम DP ओलिगोस्याकराइडहरूको लागि बाइन्डिङ र पत्ता लगाउने दक्षता समस्याग्रस्त हुन सक्छ, विशेष गरी यदि एपिटोप डाइमेरिक वा ट्राइमेरिक ओलिगोस्याकराइड हो भने। यो विभिन्न लम्बाइका व्यावसायिक ओलिगोस्याकराइडहरू प्रयोग गरेर परीक्षण गर्न सकिन्छ, प्रत्येकमा एउटा मात्र एपिटोप हुन्छ जुन एक विशिष्ट mAb मा बाँधिन्छ।
यसरी, संरचना-विशिष्ट एन्टिबडीहरूको प्रयोगले निश्चित प्रकारका रिक्याल्सिट्रन्ट बन्धनहरू प्रकट गर्‍यो। प्रयोग गरिएको एन्टिबडीको प्रकार, उपयुक्त लिगेसन ढाँचा, र यसले उत्पादन गर्ने संकेतको शक्ति (सबैभन्दा कम र प्रचुर मात्रामा) मा निर्भर गर्दै, नयाँ इन्जाइमहरू पहिचान गर्न सकिन्छ र थप पूर्ण ग्लाइकोकन्भर्सनको लागि इन्जाइम मिश्रणमा अर्ध-परिमाणात्मक रूपमा थप्न सकिन्छ। उदाहरणको रूपमा ACSH ओलिगोसाकराइडहरूको विश्लेषण लिँदै, हामी प्रत्येक बायोमास सामग्रीको लागि ग्लाइकन बन्धनको डाटाबेस सिर्जना गर्न सक्छौं। यहाँ यो ध्यान दिनुपर्छ कि एन्टिबडीहरूको फरक आत्मीयतालाई ध्यानमा राख्नुपर्छ, र यदि तिनीहरूको आत्मीयता अज्ञात छ भने, यसले विभिन्न एन्टिबडीहरूको संकेतहरू तुलना गर्दा निश्चित कठिनाइहरू सिर्जना गर्नेछ। थप रूपमा, एउटै एन्टिबडीको लागि नमूनाहरू बीच ग्लाइकन बन्धनको तुलना राम्रोसँग काम गर्न सक्छ। यी जिद्दी बन्धनहरूलाई त्यसपछि CAZyme डाटाबेससँग लिङ्क गर्न सकिन्छ, जहाँबाट हामी इन्जाइमहरू पहिचान गर्न सक्छौं, उम्मेदवार इन्जाइमहरू चयन गर्न सक्छौं र बन्धन तोड्ने इन्जाइमहरूको लागि परीक्षण गर्न सक्छौं, वा बायोरिफाइनरीहरूमा प्रयोगको लागि यी इन्जाइमहरू व्यक्त गर्न माइक्रोबियल प्रणालीहरू विकास गर्न सक्छौं।44।
लिग्नोसेल्युलोसिक हाइड्रोलाइसेट्समा उपस्थित कम आणविक तौल ओलिगोसेकराइडहरू चित्रण गर्न वैकल्पिक विधिहरूको पूरक इम्युनोलोजिकल विधिहरूले कसरी मूल्याङ्कन गर्छन् भनेर मूल्याङ्कन गर्न, हामीले एउटै प्यानल (चित्र ५) ओलिगोसेकराइड भागमा GC-MS मा आधारित TMS-व्युत्पन्न स्याकराइडहरूको MALDI (चित्र ४, S1-S8) र विश्लेषण गर्यौं। ओलिगोसेकराइड अणुहरूको सामूहिक वितरण अभिप्रेत संरचनासँग मेल खान्छ कि खाँदैन भनेर तुलना गर्न MALDI प्रयोग गरिन्छ। चित्र ४ मा तटस्थ घटक ACN-A र ACN-B को MC देखाइएको छ। ACN-A विश्लेषणले DP ४-८ (चित्र ४) देखि DP २२ (चित्र S1) सम्मका पेन्टोज चिनीहरूको दायरा पुष्टि गर्‍यो, जसको तौल MeU-xylan ओलिगोसेकराइडहरूसँग मेल खान्छ। ACN-B विश्लेषणले DP ८-१५ सँग पेन्टोज र ग्लुकोक्सिलान श्रृंखला पुष्टि गर्‍यो। चित्र S3 जस्ता पूरक सामग्रीमा, FA-C एसिडिक मोइटी मास वितरण नक्साले 8-15 को DP भएको (Me)U प्रतिस्थापित पेन्टोज चिनीको दायरा देखाउँछ जुन ELISA-आधारित mAb स्क्रिनिङमा पाइने प्रतिस्थापित जाइल्यानहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ। एपिटोपहरू एकरूप छन्।
ACS मा उपस्थित घुलनशील गैर-अनुपालन ओलिगोस्याकराइडहरूको MALDI-MS स्पेक्ट्रम। यहाँ, (A) मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड (DP 4-8) प्रतिस्थापन गरिएको ग्लुकुरोक्सिलान ओलिगोस्याकराइडहरू र (B) ग्लुकुरोक्सिलान (DP 8-15) द्वारा प्रतिस्थापन गरिएको ACN-B जाइल्यान र मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड ओलिगोस्याकराइडहरू भएको ACN-A कम तौल दायरा अंशहरू।
रिफ्र्याक्टरी ओलिगोस्याकराइडहरूको ग्लाइकन अवशेषको संरचनाको विश्लेषण। यहाँ (A) GC-MS विश्लेषण प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएका विभिन्न ओलिगोस्याकराइड अंशहरूको TMS स्याकराइड संरचना। (B) ओलिगोस्याकराइडहरूमा उपस्थित विभिन्न TMS-व्युत्पन्न चिनीहरूको संरचना। ACN - तटस्थ ओलिगोस्याकराइडहरू भएको एसिटोनिट्राइल अंश र FA - एसिड ओलिगोस्याकराइडहरू भएको फेरुलिक एसिड अंश।
चित्र S9 मा देखाइए अनुसार ओलिगोस्याकराइड अंशको LC-MS विश्लेषणबाट अर्को रोचक निष्कर्ष निकालियो (विधिहरू इलेक्ट्रोनिक पूरक सामग्रीमा देख्न सकिन्छ)। ACN-B अंशको लिगेसनको क्रममा हेक्सोज र -OAc समूहहरूको टुक्राहरू बारम्बार अवलोकन गरिएको थियो। यो खोजले ग्लाइकोम र MALDI-TOF विश्लेषणमा अवलोकन गरिएको विखंडनलाई मात्र पुष्टि गर्दैन, तर पूर्व-उपचार गरिएको लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमासमा सम्भावित कार्बोहाइड्रेट डेरिभेटिभहरूको बारेमा नयाँ जानकारी पनि प्रदान गर्दछ।
हामीले TMS चिनी डेरिभेटिजेशन प्रयोग गरेर ओलिगोसेकराइड अंशको चिनी संरचनाको पनि विश्लेषण गर्यौं। GC-MS प्रयोग गरेर, हामीले ओलिगोसेकराइड अंशमा तंत्रिका (गैर-व्युत्पन्न) र एसिडिक चिनी (GluA र GalA) को संरचना निर्धारण गर्यौं (चित्र ५)। ग्लुकोरोनिक एसिड अम्लीय घटक C र D मा पाइन्छ, जबकि ग्यालेक्टुरोनिक एसिड अम्लीय घटक A र B मा पाइन्छ, जुन दुवै अम्लीय चिनीका उच्च DP घटक हुन्। यी नतिजाहरूले हाम्रो ELISA र MALDI डेटा मात्र पुष्टि गर्दैनन्, तर ओलिगोसेकराइड संचयको हाम्रो अघिल्लो अध्ययनहरूसँग पनि मेल खान्छ। त्यसकारण, हामी विश्वास गर्छौं कि ओलिगोसेकराइडहरूको बायोटिनाइलेसन र त्यसपछिको ELISA स्क्रिनिङ प्रयोग गर्ने आधुनिक इम्युनोलोजिकल विधिहरू विभिन्न जैविक नमूनाहरूमा घुलनशील रिकाल्सिट्रन्ट ओलिगोसेकराइडहरू पत्ता लगाउन पर्याप्त छन्।
ELISA-आधारित mAb स्क्रिनिङ विधिहरू धेरै फरक विधिहरूद्वारा प्रमाणित भएको हुनाले, हामी यो नयाँ मात्रात्मक विधिको सम्भावनालाई थप अन्वेषण गर्न चाहन्थ्यौं। दुई व्यावसायिक ओलिगोस्याकराइडहरू, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) र 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), कोष भित्ता ग्लाइकनलाई लक्षित गर्ने नयाँ mAb दृष्टिकोण प्रयोग गरेर खरिद गरी परीक्षण गरिएको थियो। चित्र ६ ले बायोटिनिलेटेड बाइन्डिङ सिग्नल र ओलिगोस्याकराइड सांद्रताको लग सांद्रता बीचको रेखीय सहसम्बन्ध देखाउँछ, जसले सम्भावित Langmuir सोखना मोडेललाई सुझाव दिन्छ। mAbs मध्ये, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, र CCRC-M151 XHE सँग सम्बन्धित छन्, र CCRC-M108, CCRC-M109, र LM11 1 nm देखि 100 nano को दायरामा A2XX सँग सम्बन्धित छन्। प्रयोगको क्रममा एन्टिबडीहरूको सीमित उपलब्धताको कारणले गर्दा, प्रत्येक ओलिगोसेकराइड सांद्रतासँग सीमित प्रयोगहरू गरिएको थियो। यहाँ यो कुरा ध्यान दिनुपर्छ कि केही एन्टिबडीहरूले सब्सट्रेटको रूपमा उही ओलिगोसेकराइडमा धेरै फरक प्रतिक्रिया दिन्छन्, सम्भवतः किनभने तिनीहरू थोरै फरक एपिटोपहरूमा बाँधिन्छन् र धेरै फरक बाइन्डिङ एफिनिटीहरू हुन सक्छन्। नयाँ mAb दृष्टिकोण वास्तविक नमूनाहरूमा लागू गर्दा सही एपिटोप पहिचानको संयन्त्र र प्रभावहरू धेरै जटिल हुनेछन्।
विभिन्न ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण mAbs को पत्ता लगाउने दायरा निर्धारण गर्न दुई व्यावसायिक ओलिगोस्याकराइडहरू प्रयोग गरिएको थियो। यहाँ, ओलिगोस्याकराइड सांद्रताको लग सांद्रतासँगको रेखीय सहसम्बन्धले (A) mAb सँग XHE र (B) mAb सँग A2XX को लागि Langmuir सोखना ढाँचाहरूलाई संकेत गर्दछ। सम्बन्धित एपिटोपहरूले परखमा सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरिएका व्यावसायिक ओलिगोस्याकराइडहरूको संरचनाहरूलाई संकेत गर्दछ।
ग्लाइकन-लक्षित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू (ग्लाइकोकोमिक विश्लेषण वा ELISA-आधारित mAb स्क्रिनिङ) को प्रयोग बिरुवाको बायोमास बनाउने अधिकांश प्रमुख कोशिका भित्ता ग्लाइकनहरूको गहन विशेषताको लागि एक शक्तिशाली उपकरण हो। यद्यपि, शास्त्रीय ग्लाइकन विश्लेषणले ठूला कोशिका भित्ता ग्लाइकनहरूलाई मात्र चित्रण गर्दछ, किनकि धेरैजसो ओलिगोसेकराइडहरू ELISA प्लेटहरूमा कुशलतापूर्वक स्थिर हुँदैनन्। यस अध्ययनमा, AFEX-पूर्व-उपचार गरिएको मकै स्टोभरलाई उच्च ठोस सामग्रीमा इन्जाइम्याटिक रूपमा हाइड्रोलाइज गरिएको थियो। हाइड्रोलाइजेटमा रिक्याल्सिट्रन्ट कोशिका भित्ता कार्बोहाइड्रेटहरूको संरचना निर्धारण गर्न चिनी विश्लेषण प्रयोग गरिएको थियो। यद्यपि, हाइड्रोलाइजेटहरूमा साना ओलिगोसेकराइडहरूको mAb विश्लेषणलाई कम आँकलन गरिएको छ, र ELISA प्लेटहरूमा ओलिगोसेकराइडहरूलाई प्रभावकारी रूपमा स्थिर गर्न थप उपकरणहरू आवश्यक पर्दछ।
हामी यहाँ न्यूट्रएभिडिन™ लेपित प्लेटहरूमा ELISA स्क्रिनिङ गरेर ओलिगोस्याकराइड बायोटिनाइलेसन संयोजन गरेर mAb स्क्रिनिङको लागि एक नयाँ र कुशल ओलिगोस्याकराइड स्थिरीकरण विधिको रिपोर्ट गर्छौं। स्थिर बायोटिनाइलेटेड ओलिगोस्याकराइडहरूले एन्टिबडीको लागि पर्याप्त आत्मीयता देखाए जसले रिक्याल्सिट्रन्ट ओलिगोस्याकराइडहरूको द्रुत र कुशल पहिचान सक्षम गर्दछ। मास स्पेक्ट्रोमेट्रीमा आधारित यी जिद्दी ओलिगोस्याकराइडहरूको संरचनाको विश्लेषणले इम्युनोस्क्रिनिङको यो नयाँ दृष्टिकोणको नतिजा पुष्टि गर्‍यो। यसरी, यी अध्ययनहरूले देखाउँछन् कि ओलिगोस्याकराइड बायोटिनाइलेसन र ग्लाइकन-लक्षित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरूसँग ELISA स्क्रिनिङको संयोजन ओलिगोस्याकराइडहरूमा क्रसलिङ्कहरू पत्ता लगाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ र ओलिगोस्याकराइडहरूको संरचनालाई चित्रण गर्ने अन्य जैव रासायनिक अध्ययनहरूमा व्यापक रूपमा लागू गर्न सकिन्छ।
यो बायोटिन-आधारित ग्लाइकन प्रोफाइलिङ विधि बिरुवाको बायोमासमा घुलनशील ओलिगोस्याकराइडहरूको रिक्याल्सिट्रन्ट कार्बोहाइड्रेट बन्धनको अनुसन्धान गर्न सक्षम पहिलो रिपोर्ट हो। यसले जैव इन्धन उत्पादनको कुरा गर्दा बायोमासका केही भागहरू किन यति जिद्दी छन् भनेर बुझ्न मद्दत गर्दछ। यो विधिले ग्लाइकोम विश्लेषण विधिहरूमा महत्त्वपूर्ण खाडल भर्छ र बिरुवाको ओलिगोस्याकराइडभन्दा बाहिरका सब्सट्रेटहरूको फराकिलो दायरामा यसको प्रयोग विस्तार गर्दछ। भविष्यमा, हामी बायोटिनाइलेसनको लागि रोबोटिक्स प्रयोग गर्न सक्छौं र ELISA प्रयोग गरेर नमूनाहरूको उच्च-थ्रुपुट विश्लेषणको लागि हामीले विकास गरेको विधि प्रयोग गर्न सक्छौं।
पायोनियर ३३ए१४ हाइब्रिड बीउबाट उब्जाइएको मकैको पराल (CS) सन् २०१० मा कोलोराडोको रेस्थित क्रेमर फार्मबाट काटिएको थियो। जग्गाधनीबाट अनुमति लिएर, यो बायोमास अनुसन्धानको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिप-लक झोलाहरूमा ६% भन्दा कम आर्द्रतामा सुख्खा भण्डारण गरिएको थियो। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिप-लक झोलाहरूमा ६% भन्दा कम आर्द्रतामा सुख्खा भण्डारण गरिएको थियो। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिपर गरिएको झोलाहरूमा <6% आर्द्रतामा सुख्खा भण्डारण गरिएको थियो।样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中।样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा ६% भन्दा कम आर्द्रता भएको जिपर झोलाहरूमा भण्डारण गरिन्छ।अध्ययनले स्थानीय र राष्ट्रिय दिशानिर्देशहरूको पालना गर्‍यो। NREL प्रोटोकल प्रयोग गरेर संरचनात्मक विश्लेषण गरिएको थियो। संरचनामा ३१.४% ग्लुकान, १८.७% जाइलान, ३.३% अरबिनान, १.२% ग्यालेक्टन, २.२% एसिटिल, १४.३% लिग्निन, १.७% प्रोटिन र १३.४% खरानी पाइएको थियो।
Cellic® CTec2 (१३८ मिलीग्राम प्रोटिन/मिली, लट VCNI 0001) नोभोजाइम्स (फ्र्याङ्कलिन्टन, NC, USA) बाट सेल्युलेज, β-ग्लुकोसिडेज र Cellic® HTec2 (१५७ मिलीग्राम प्रोटिन/मिली, लट VHN00001) को जटिल मिश्रण हो। Multifect Pectinase® (७२ मिलीग्राम प्रोटिन/मिली), पेक्टिन डिग्रेडिङ इन्जाइमहरूको जटिल मिश्रण, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) द्वारा दान गरिएको थियो। Kjeldahl नाइट्रोजन विश्लेषण (AOAC विधि २००१.११, डेयरी वन कोअपरेटिभ इंक, इथाका, NY, USA) प्रयोग गरेर प्रोटिन सामग्री अनुमान गरेर (र गैर-प्रोटीन नाइट्रोजनको योगदान घटाएर) इन्जाइम प्रोटिन सांद्रता निर्धारण गरिएको थियो। डायटोमेसियस अर्थ ५४५ EMD मिलिपोर (बिलेरिका, MA) बाट खरिद गरिएको थियो। सक्रिय कार्बन (DARCO, १०० मेष ग्रेन्युल), एभिसेल (PH-१०१), बिच जाइलान, र अन्य सबै रसायनहरू सिग्मा-एल्ड्रिच (सेन्ट लुइस, MO) बाट खरिद गरिएको थियो।
AFEX पूर्व-उपचार GLBRC (बायोमास रूपान्तरण अनुसन्धान प्रयोगशाला, MSU, Lansing, MI, USA) मा गरिएको थियो। पूर्व-उपचार १४०° C मा १५ मिनेटको लागि गरिएको थियो। स्टेनलेस स्टील बेन्चटप ब्याच रिएक्टर (Parr Instruments Company) मा ६०% (w/w) लोडिङमा निर्जल अमोनिया र बायोमासको १:१ अनुपातमा ४६ निवास समय। यो गर्न ३० मिनेट लाग्यो। रिएक्टरलाई १४०° C मा ल्याइएको थियो र अमोनिया द्रुत रूपमा छोडिएको थियो, जसले गर्दा बायोमास चाँडै कोठाको तापक्रममा फर्कन सक्यो। AFEX पूर्व-उपचार गरिएको मकैको स्टोभर (ACS) को संरचना उपचार नगरिएको मकैको स्टोभर (UT-CS) जस्तै थियो।
ओलिगोस्याकराइडको ठूलो मात्रामा उत्पादनको लागि सुरुवाती सामग्रीको रूपमा उच्च ठोस पदार्थ ACSH २५% (w/w) (लगभग ८% डेक्सट्रान लोडिङ) तयार गरिएको थियो। ACS को इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस Cellic® Ctec2 १० मिलीग्राम प्रोटिन/g ग्लुकान (पूर्व उपचारित बायोमासमा), Htec2 (नोभोजाइम्स, फ्र्याङ्कलिन्टन, NC), ५ मिलीग्राम प्रोटिन/g ग्लुकान, र मल्टिफेक्ट पेक्टिनेज (जेनेन्कोर इंक, संयुक्त राज्य अमेरिका) सहितको व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रण प्रयोग गरेर गरिएको थियो। ) , ५ मिलीग्राम प्रोटिन/g डेक्सट्रान। इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस ५-लिटर बायोरिएक्टरमा ३ लिटर, pH ४.८, ५०°C र २५० rpm को काम गर्ने मात्रा भएको थियो। ९६ घण्टाको लागि हाइड्रोलिसिस पछि, हाइड्रोलाइजेटलाई ३० मिनेटको लागि ६००० rpm मा र त्यसपछि १४००० rpm मा ३० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा संकलन गरिएको थियो। त्यसपछि हाइड्रोलाइजेटलाई ०.२२ मिमी फिल्टर बीकर मार्फत बाँझ निस्पंदन गरिएको थियो। फिल्टर गरिएको हाइड्रोलाइजेटलाई ४ डिग्री सेल्सियसमा बाँझ बोतलहरूमा भण्डारण गरिएको थियो र त्यसपछि कार्बनमा विभाजन गरिएको थियो।
NREL प्रयोगशाला विश्लेषण प्रक्रियाहरू अनुसार निकासी-आधारित बायोमास नमूनाहरूको संरचनाको विश्लेषण: संरचना विश्लेषणको लागि नमूनाहरूको तयारी (NREL/TP-510-42620) र बायोमासमा संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट र लिग्निनको निर्धारण (NREL/TP-510 – 42618)47।
हाइड्रोलाइजेट स्ट्रिमको ओलिगोसेकराइड विश्लेषण अटोक्लेभ-आधारित एसिड हाइड्रोलाइजेस विधि प्रयोग गरेर २ मिली स्केलमा गरिएको थियो। १० मिली स्क्रू क्याप कल्चर ट्यूबमा हाइड्रोलाइजेट नमूनालाई ७२% सल्फ्यूरिक एसिडको ६९.७ µl सँग मिसाउनुहोस् र १२१ डिग्री सेल्सियसमा बेन्चटपमा १ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, बरफमा चिसो पार्नुहोस् र उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) शीशीमा फिल्टर गर्नुहोस्। एसिड-हाइड्रोलाइजेड नमूनामा रहेको कुल चिनी सांद्रताबाट गैर-हाइड्रोलाइजेड नमूनामा मोनोसेकराइडको सांद्रता घटाएर ओलिगोसेकराइडको सांद्रता निर्धारण गरिएको थियो।
बायो-रेड एमिनेक्स HPX-87H स्तम्भमा अटोस्याम्पलर, स्तम्भ हीटर, आइसोक्रेटिक पम्प, र अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टरले सुसज्जित शिमाडजु HPLC प्रणाली प्रयोग गरेर एसिड हाइड्रोलाइज्ड बायोमासमा ग्लुकोज, जाइलोज र एराबिनोज सांद्रताको विश्लेषण गरिएको थियो। स्तम्भलाई ५०°C मा राखिएको थियो र ०.६ मिली/मिनेट ५ मिमी H2SO4 पानीको प्रवाहमा एल्युटेड गरिएको थियो।
हाइड्रोलाइजेट सुपरनाटेन्टलाई मोनोमर र ओलिगोसेकराइड सामग्रीको लागि पातलो पारिएको थियो र विश्लेषण गरिएको थियो। इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस पछि प्राप्त मोनोमेरिक चिनीहरूलाई बायो-रेड (हर्क्युलिस, CA) एमिनेक्स HPX-87P स्तम्भ र खरानी गार्ड स्तम्भले सुसज्जित HPLC द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। स्तम्भको तापक्रम ८०°C मा कायम राखिएको थियो, पानीलाई ०.६ मिली/मिनेटको प्रवाह दरको साथ मोबाइल चरणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। रेफरी ४१, ४८, ४९ मा वर्णन गरिएका विधिहरू अनुसार १२१°C मा पातलो एसिडमा हाइड्रोलिसिस द्वारा ओलिगोसेकराइडहरू निर्धारण गरिएको थियो।
पहिले वर्णन गरिएका प्रक्रियाहरू २७, ४३, ५०, ५१ प्रयोग गरेर कच्चा, AFEX पूर्व-उपचार गरिएको र सबै गैर-हाइड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषहरू (सिरियल सेल भित्ता अर्कको उत्पादन र तिनीहरूको mAb स्क्रिनिङ सहित) मा Saccharide विश्लेषण गरिएको थियो। ग्लाइकोम विश्लेषणको लागि, बिरुवाको कोष भित्ता सामग्रीको अल्कोहल-अघुलनशील अवशेषहरू बायोमास अवशेषहरूबाट तयार गरिन्छन् र अमोनियम अक्सालेट (५० mM), सोडियम कार्बोनेट (५० mM र ०.५% w/v), CON जस्ता बढ्दो आक्रामक अभिकर्मकहरू (१M र ४M, दुबै १% w/v सोडियम बोरोहाइड्राइडको साथ) र पहिले वर्णन गरिए अनुसार एसिड क्लोराइटको साथ क्रमिक निकासी गरिन्छ। त्यसपछि अर्कहरूलाई कोष भित्ता ग्लाइकानमा निर्देशित mAb50s को जटिल प्यानल विरुद्ध ELISA को अधीनमा राखियो, र mAb बाइन्डिङ प्रतिक्रियाहरूलाई ताप नक्साको रूपमा प्रस्तुत गरियो। बिरुवाको कोष भित्ता ग्लाइकानलाई लक्षित गर्ने mAbs प्रयोगशाला स्टकहरू (CCRC, JIM र MAC श्रृंखला) बाट खरिद गरिएको थियो।
ओलिगोस्याकराइडको एक-चरण बायोटिनाइलेसन। कार्बोहाइड्रेटको बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइडसँग संयोजन निम्न प्रक्रिया प्रयोग गरेर गरिएको थियो। बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड (४.६ मिलीग्राम/१२ माइक्रोमोल) लाई ६५ डिग्री सेल्सियसमा १ मिनेटको लागि जोडदार हलचल र तताएर डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO, ७० माइक्रोलिटर) मा घुलनशील बनाइएको थियो। हिमनदीयुक्त एसिटिक एसिड (३० माइक्रोलिटर) थपिएको थियो र मिश्रणलाई सोडियम साइनोबोरोहाइडराइड (६.४ मिलीग्राम/१०० माइक्रोमोल) मा खन्याइएको थियो र ६५ डिग्री सेल्सियसमा लगभग १ मिनेटको लागि तताइएपछि पूर्ण रूपमा घुलनशील बनाइएको थियो। त्यसपछि, प्रतिक्रिया मिश्रणको ५ देखि ८ माइक्रोलिटर सुकेको ओलिगोस्याकराइड (१-१०० एनएमओल) मा थपिएको थियो ताकि लेबलको १० गुणा वा बढी मोलर अतिरिक्त रिड्युसिङ एन्डमा प्राप्त गर्न सकियोस्। प्रतिक्रिया ६५ डिग्री सेल्सियसमा २ घण्टाको लागि गरिएको थियो, त्यसपछि नमूनाहरू तुरुन्तै शुद्ध पारिएको थियो। लेबलिङ प्रयोगहरूमा कटौती बिना कुनै सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड प्रयोग गरिएको थिएन, र नमूनाहरूलाई २.५ घण्टाको लागि ६५° सेल्सियसमा प्रतिक्रिया गरिएको थियो।
बायोटिनाइलेटेड ओलिगोस्याकराइड्सका नमूनाहरूको ELISA कोटिंग र धुलाई। एभिडिन-लेपित प्लेटको प्रत्येक इनारमा २५ μl बायोटिनाइलेटेड नमूनाहरू (०.१ M Tris बफर घोल (TBS) को ५ मिलीलीटरमा पातलो पारिएको प्रत्येक गाढा नमूनाको १०० μl) थपियो। नियन्त्रण इनारहरूलाई ०.१ M TBS मा १० μg/ml को सांद्रतामा ५० μl बायोटिनले लेपित गरिएको थियो। खाली मापनको लागि कोटिंगको रूपमा डिओनाइज्ड पानी प्रयोग गरिएको थियो। ट्याब्लेटलाई अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा २ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। ग्रेनियर फ्ल्याट ३A को लागि प्रोग्राम नम्बर ११ प्रयोग गरेर ०.१ M TBS मा ०.१% स्किम्ड दूधले प्लेटलाई ३ पटक धुनुहोस्।
प्राथमिक एन्टिबडीहरू थप्ने र धुने। प्रत्येक इनारमा ४० μl प्राथमिक एन्टिबडी थप्नुहोस्। अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि माइक्रोप्लेट इन्क्युबेट गर्नुहोस्। त्यसपछि ग्रेनियर फ्ल्याट ३A को लागि वाश प्रोग्राम #११ प्रयोग गरेर प्लेटहरूलाई ०.१% दूध ०.१M TBS मा ३ पटक धोइयो।
दोस्रो एन्टिबडी थप्नुहोस् र धुनुहोस्। प्रत्येक इनारमा ५० μl मुसा/मुसाको दोस्रो एन्टिबडी (०.१% दूधमा १:५००० ०.१ M TBS मा पातलो) थप्नुहोस्। अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि माइक्रोप्लेट इन्क्युबेट गर्नुहोस्। त्यसपछि ग्रेनियर फ्ल्याट ५A प्लेट वाश प्रोग्राम #१२ प्रयोग गरेर माइक्रोप्लेटहरूलाई ०.१% दूधमा ०.१ M TBS मा ५ पटक धोइयो।
सब्सट्रेट थप्दै। आधार सब्सट्रेटमा ५० μl ३,३′,५,५′-टेट्रामेथाइलबेन्जिडिन (TMB) थप्नुहोस् (१५ मिलीलीटर डिआयोनाइज्ड पानीमा २ थोपा बफर, ३ थोपा TMB, २ थोपा हाइड्रोजन पेरोक्साइड थपेर)। TMB सब्सट्रेट तयार गर्नुहोस्। र प्रयोग गर्नु अघि भोर्टेक्स)। माइक्रोप्लेटलाई कोठाको तापक्रममा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। अँध्यारोमा।
चरण पूरा गर्नुहोस् र ट्याब्लेट पढ्नुहोस्। प्रत्येक इनारमा १ एन सल्फ्यूरिक एसिडको ५० μl थप्नुहोस् र ELISA रिडर प्रयोग गरेर ४५० देखि ६५५ एनएम सम्मको अवशोषण रेकर्ड गर्नुहोस्।
यी विश्लेषणहरूको १ मिलीग्राम/मिली घोल डिआयोनाइज्ड पानीमा तयार गर्नुहोस्: अराबिनोज, रामनोज, फ्युकोज, जाइलोज, ग्यालेक्टुरोनिक एसिड (GalA), ग्लुकोरोनिक एसिड (GlcA), म्यानोज, ग्लुकोज, ग्यालेक्टोज, ल्याक्टोज, N-एसिटिलम्यानोसामाइन (manNAc), N-एसिटिलग्लुकोसामाइन। (glcNAc), N-एसिटिलग्यालेक्टोसामाइन (galNAc), इनोसिटोल (आन्तरिक मानक)। तालिका १ मा देखाइएको १ मिलीग्राम/मिली चिनी घोल थपेर दुई मापदण्डहरू तयार पारिएका थिए। नमूनाहरू -८० डिग्री सेल्सियसमा जम्मा गरिन्छन् र सबै पानी नहटाएसम्म (सामान्यतया लगभग १२-१८ घण्टा) लियोफिलाइज गरिन्छन्।
विश्लेषणात्मक सन्तुलनमा स्क्रू क्याप ट्यूबहरूमा १००-५०० µg नमूना थप्नुहोस्। थपिएको मात्रा रेकर्ड गर्नुहोस्। नमूनालाई विलायकको विशिष्ट सांद्रतामा विघटन गर्नु र तरल एलिक्वोटको रूपमा ट्यूबमा थप्नु उत्तम हुन्छ। प्रत्येक नमूना ट्यूबको लागि आन्तरिक मानकको रूपमा २० µl १ mg/ml इनोसिटोल प्रयोग गर्नुहोस्। नमूनामा थपिएको आन्तरिक मानकको मात्रा मानक ट्यूबमा थपिएको आन्तरिक मानकको मात्रा जस्तै हुनुपर्छ।
स्क्रू क्याप शीशीमा ८ मिलिलिटर निर्जल मेथानोल थप्नुहोस्। त्यसपछि ४ मिलिलिटर ३ नाइट्रेट मेथानोलिक एचसीएल घोल, बन्द गरी हल्लाइदिनुहोस्। यो प्रक्रियामा पानी प्रयोग गरिँदैन।
ओलिगोस्याकराइड नमूनाहरू र मानक TMS ट्यूबहरूमा १ M HCl मिथानोल घोलको ५०० µl थप्नुहोस्। नमूनाहरूलाई रातभर (१६८ घण्टा) ८०° सेल्सियसमा थर्मल ब्लकमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। मेथानोलिसिस उत्पादनलाई कोठाको तापक्रममा सुकाउने मेनिफोल्ड प्रयोग गरेर सुकाउनुहोस्। २०० µl MeOH थप्नुहोस् र फेरि सुकाउनुहोस्। यो प्रक्रिया दुई पटक दोहोर्याइएको छ। नमूनामा २०० µl मिथानोल, १०० µl पाइरिडिन र १०० µl एसिटिक एनहाइड्राइड थप्नुहोस् र राम्रोसँग मिलाउनुहोस्। नमूनाहरूलाई ३० मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरिएको थियो। र सुकाइएको थियो। २०० µl मिथानोल थप्नुहोस् र फेरि सुकाउनुहोस्।
२०० µl ट्राई-सिल थप्नुहोस् र क्याप गरिएको ट्यूबलाई २० मिनेटको लागि तताउनुहोस्। ८०°C, त्यसपछि कोठाको तापक्रममा चिसो पार्नुहोस्। नमूनालाई लगभग ५० µl को मात्रामा सुकाउन सुकाउने मेनिफोल्ड प्रयोग गर्नुहोस्। यो ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ कि हामीले नमूनाहरूलाई पूर्ण रूपमा सुक्न दिएनौं।
२ मिलि हेक्सेन थप्नुहोस् र भोर्टेक्सिङ गरेर राम्रोसँग मिसाउनुहोस्। ५-३/४ इन्च व्यासको पिपेटको माथि गिलास ऊन घुसाएर पाश्चर पिपेट (५-८ मिमी) को टुक्राहरू काँचको ऊनको टुक्राले भर्नुहोस्। नमूनाहरूलाई २ मिनेटको लागि ३००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। कुनै पनि अघुलनशील अवशेषहरू अवक्षेपित हुन्छन्। नमूनालाई १००-१५० µl सम्म सुकाउनुहोस्। लगभग १ μl को मात्रा GC-MS मा ८० °C को प्रारम्भिक तापक्रम र २.० मिनेटको प्रारम्भिक समयमा इन्जेक्ट गरिएको थियो (तालिका २)।