Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer). In de tussentijd zullen we de site zonder stijlen en JavaScript weergeven om voortdurende ondersteuning te garanderen.
Menselijke darmmorfogenese vestigt crypt-villus-kenmerken van 3D-epitheelmicroarchitectuur en ruimtelijke organisatie. Deze unieke structuur is vereist om de darmhomeostase te behouden door de stamcelniche in de basale crypte te beschermen tegen exogene microbiële antigenen en hun metabolieten. Bovendien presenteren darmvilli en secreterend slijm functioneel gedifferentieerde epitheelcellen met een beschermende barrière op het darmslijmvliesoppervlak. Daarom is het opnieuw creëren van 3D-epitheelstructuren cruciaal voor de constructie van in vitro darmmodellen. Met name de organische nabootsende darm-op-een-chip kan spontane 3D-morfogenese van het darmepitheel induceren met verbeterde fysiologische functies en biomechanica. Hier bieden we een reproduceerbaar protocol om op robuuste wijze intestinale morfogenese in de darm te induceren op een microfluïdische chip en in een in Transwell ingebedde hybride chip. dic-platform, inductie van 3D-morfogenese en karakterisering van gevestigde 3D-epitheel met behulp van meerdere beeldvormingsmodaliteiten. Dit protocol bewerkstelligt regeneratie van functionele darmmicroarchitectuur door basolaterale vloeistofstroom gedurende 5 d te regelen. Onze in vitro morfogenese-methode maakt gebruik van fysiologisch relevante schuifspanning en mechanische beweging en vereist geen complexe celtechniek of -manipulatie, die andere bestaande technieken kan overtreffen. 3D darmepitheellagen in vitro voor biomedische, klinische en farmaceutische toepassingen.
Experimenten tonen aan dat intestinale epitheliale Caco-2-cellen gekweekt in darm-op-een-chip1,2,3,4,5 of dubbellaagse microfluïdische apparaten6,7 spontane 3D-morfogenese in vitro kunnen ondergaan zonder een duidelijk begrip van het onderliggende mechanisme. In onze recente studie ontdekten we dat het verwijderen van basolateraal uitgescheiden morfogeenantagonisten uit kweekapparaten noodzakelijk en voldoende is om 3D-epitheelmorfogenese in vitro te induceren, wat is aangetoond door Caco-2 en patient-der ived intestinale organoïden.Epitheelcellen werden gevalideerd. In deze studie hebben we ons specifiek gericht op de celproductie en concentratieverdeling van een krachtige Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), in darm-op-een-chip en gemodificeerde microfluïdische apparaten die Transwell-inserts bevatten, genaamd "Hybride Chip". morfogenese of verstoort de voorgestructureerde 3D-epitheellaag, wat suggereert dat antagonistische stress tijdens kweek verantwoordelijk is voor intestinale morfogenese in vitro. inserts in grote basolaterale reservoirs in putten).
In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het fabriceren van gut-on-a-chip microdevices en Transwell-insereerbare hybride chips (stappen 1-5) om darmepitheelcellen te kweken op polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerde poreuze membranen (stappen 6A, 7A, 8, 9) of polyestermembranen van Transwell-inserts (stappen 6B, 7B, 8, 9) en geïnduceerde 3D-morfogenese in vitro (stap 10). We identificeerden ook cellulaire en moleculaire kenmerken die indicatief zijn voor weefselspecifieke histogenese en afstammingsafhankelijke cellulaire differentiatie door meerdere beeldvormingsmodaliteiten toe te passen (stappen 11-24). We induceren morfogenese met behulp van menselijke darmepitheelcellen, zoals Caco-2 of intestinale organoïden, in twee kweekformaten met technische details, waaronder oppervlaktemodificatie van poreuze membranen, creatie van 2D-monolagen en intestinale biochemische en reproductie van de biomechanische micro-omgeving.in vitro.To induceren 3D-morfogenese van 2D-epitheelmonolagen, we verwijderden morfogeenantagonisten in beide gekweekte vormen door het medium in het basolaterale compartiment van de cultuur te laten stromen. Ten slotte geven we een weergave van het nut van een regenereerbare 3D-epitheellaag die kan worden gebruikt om morfogeenafhankelijke epitheelgroei, longitudinale gastheer-microbioom co-culturen, pathogene infectie, ontstekingsletsel, epitheliale barrièredisfunctie en op probiotica gebaseerde therapieën te modelleren. invloeden.
Ons protocol kan nuttig zijn voor een breed scala aan wetenschappers op het gebied van fundamentele (bijv. intestinale mucosale biologie, stamcelbiologie en ontwikkelingsbiologie) en toegepast onderzoek (bijv. preklinische geneesmiddelentesten, ziektemodellering, tissue engineering en gastro-enterologie) brede impact. Vanwege de reproduceerbaarheid en robuustheid van ons protocol om 3D-morfogenese van het darmepitheel in vitro te induceren, voorzien we dat onze technische strategie kan worden verspreid onder een publiek dat de dynamiek van celsignalering tijdens de darmontwikkeling bestudeert, regeneratie of homeostase. Bovendien is ons protocol nuttig voor het ondervragen van infecties onder verschillende infectieuze agentia zoals Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 of Vibrio cholerae.Doelgroepen van ziektepathologie en pathogenese zijn ook nuttig. Het gebruik van een on-chip darmmicrofysiologiesysteem kan longitudinale co-cultuur mogelijk maken 10 en daaropvolgende beoordeling van gastheerverdediging, immuunresponsen en pathogeengerelateerd letselherstel in het maagdarmkanaal (GI) 11. Andere gastro-intestinale aandoeningen geassocieerd met lekkende darmsyndroom, coeliakie, ziekte van Crohn, colitis ulcerosa, pouchitis of prikkelbare darmsyndroom kunnen worden gesimuleerd wanneer 3D darmepitheellagen worden geprepareerd met behulp van de patiënt 3D darmepitheellagen, deze ziekten omvatten villusatrofie, verkorting van de crypte, mucosale schade of verminderde epitheliale barrière. Biopsie of van stamcellen afgeleide darmorganoïden12,13. Om de hogere complexiteit van de ziekteomgeving beter te modelleren, kunnen lezers overwegen om ziekterelevante celtypen, zoals mononucleaire cellen uit het perifere bloed van de patiënt (PBMC's), toe te voegen aan modellen die 3D intestinale villus-crypte microarchitecturen bevatten.weefselspecifieke immuuncellen, 5.
Aangezien 3D-epitheliale microstructuur kan worden gefixeerd en gevisualiseerd zonder het sectieproces, kunnen kijkers die werken aan ruimtelijke transcriptomics en beeldvorming met hoge resolutie of superresolutie geïnteresseerd zijn in onze mapping van de spatiotemporele dynamiek van genen en eiwitten op epitheliale niches.Geïnteresseerd in technologie.Reactie op microbiële of immuunstimuli.Bovendien kan longitudinale gastheer-microbioomoverspraak 10, 14 die de darmhomeostase coördineert, tot stand worden gebracht in de 3D-darmslijmvlieslaag door verschillende microbiële soorten, microbiële gemeenschappen of fecale microbiota samen te kweken, vooral in de darm-op-een-chip.in het platform. Deze aanpak is vooral aantrekkelijk voor doelgroepen die mucosale immunologie, gastro-enterologie, menselijk microbioom, culturomics en klinische microbiologie bestuderen en voorheen niet-gekweekte darmmicrobiota in het laboratorium willen cultiveren. Als ons in vitro morfogeneseprotocol kan worden aangepast aan schaalbare kweekformaten, zoals inzetstukken met meerdere putjes in platen met 24, 96 of 384 putjes die voortdurend basolaterale compartimenten aanvullen, kan het protocol ook worden verspreid onder degenen die farmaceutische, biomedische al of high-throughput screening- of validatieplatforms voor de voedingsindustrie. Als proof-of-principle hebben we onlangs de haalbaarheid aangetoond van een multiplex high-throughput morfogenesesysteem dat schaalbaar is tot een 24-wells plaatformaat. Bovendien zijn er meerdere orgaan-op-een-chip-producten op de markt gebracht16,17,18. herprogrammering van in vitro darmmorfogenese op transcriptoomniveau om medicijnen of biotherapeutica te testen De absorptie en het transport van kandidaat-geneesmiddelen werd beoordeeld met behulp van 3D-darmsurrogaten of met behulp van aangepaste of commerciële orgel-op-een-chip-modellen om de reproduceerbaarheid van het darmmorfogeneseproces te beoordelen.
Er is een beperkt aantal voor de mens relevante experimentele modellen gebruikt om darmepitheelmorfogenese te bestuderen, voornamelijk vanwege het gebrek aan implementeerbare protocollen om 3D-morfogenese in vitro te induceren. In feite is veel van de huidige kennis over darmmorfogenese gebaseerd op dierstudies (bijv. zebravis20, muizen21 of kippen22). Ze zijn echter arbeids- en kostenintensief, kunnen ethisch twijfelachtig zijn en, belangrijker nog, bepalen niet precies menselijke ontwikkelingsprocessen. zijn ook zeer beperkt in hun vermogen om op een multi-way schaalbare manier te worden getest. Daarom presteert ons protocol voor het regenereren van 3D-weefselstructuren in vitro beter dan in vivo diermodellen en andere traditionele statische 2D-celcultuurmodellen. ruimtelijke niches en ecologische evolutie als reactie op gastheerfactoren (bijv. binnenste versus buitenste slijmlagen, secretie van IgA en antimicrobiële peptiden). Bovendien kan 3D-epitheelmorfologie ons in staat stellen te begrijpen hoe de darmmicrobiota zijn gemeenschappen structureert en synergetisch microbiële metabolieten produceert (bijv. korteketenvetzuren) die de cellulaire organisatie en stamcelniches in de basale crypten vormen. Deze kenmerken kunnen alleen worden aangetoond wanneer 3D-epitheellagen in vitro worden gevormd .
Naast onze methode om 3D darmepitheelstructuren te creëren, zijn er verschillende in vitro methoden. Darm-organoïdecultuur is een ultramoderne weefselmanipulatietechniek gebaseerd op het kweken van darmstamcellen onder specifieke morfogeenomstandigheden23,24,25. Het gebruik van 3D-organoïdemodellen voor transportanalyse of gastheer-microbioom co-culturen is echter vaak een uitdaging omdat het darmlumen is ingesloten in de organoïde en daarom de introductie van luminale componenten zoals microbiële cellen of exogeen ous antigenen is beperkt.Toegang tot organoïde lumina kan worden verbeterd met behulp van een micro-injector,26,27 maar deze methode is invasief en arbeidsintensief en vereist gespecialiseerde kennis om uit te voeren. Bovendien weerspiegelen traditionele organoïde culturen die onder statische omstandigheden in hydrogelsteigers worden gehouden, de actieve in vivo biomechanica niet nauwkeurig.
Andere benaderingen die door verschillende onderzoeksgroepen worden gebruikt, maken gebruik van voorgestructureerde 3D-hydrogelsteigers om de darmepitheelstructuur na te bootsen door geïsoleerde menselijke darmcellen op het geloppervlak te kweken. Fabriceer hydrogelsteigers met behulp van 3D-geprinte, microgefreesde of lithografisch vervaardigde mallen. Deze methode toont de zelfgeorganiseerde opstelling van geïsoleerde epitheelcellen in vitro met fysiologisch relevante morfogeengradiënten, waardoor een epitheelstructuur met een hoge aspectverhouding en een stroma-epitheelkruis ontstaan ​​De aard van voorgestructureerde scaffolds kan echter de weergave van het spontane morfogenetische proces zelf voorkomen. Deze modellen bieden ook geen dynamische luminale of interstitiële stroming, omdat ze de vloeistofschuifspanning missen die darmcellen nodig hebben om morfogenese te ondergaan en fysiologische functie te krijgen. patronen om intestinale buisvormige structuren te vormen, en intraluminale vloeistofstroom kan worden gerecapituleerd met behulp van een microfluïdische module. Dit model vertoont echter geen spontane morfogenetische processen en omvat ook geen mechanobiologische bewegingen van de darm. 3D-printtechnieken van dezelfde groep waren in staat miniatuurdarmbuizen te creëren met spontane morfogenetische processen. Ondanks de complexe fabricage van verschillende darmsegmenten in de buis, mist dit model ook luminale vloeistofstroom en mechanische vervorming. Bovendien kan de bruikbaarheid van het model beperkt zijn, vooral na de bio het afdrukproces is voltooid, waardoor experimentele omstandigheden of cel-tot-cel-interacties worden verstoord. In plaats daarvan biedt ons voorgestelde protocol spontane darmmorfogenese, fysiologisch relevante schuifspanning, biomechanica die darmmotiliteit nabootsen, toegankelijkheid van onafhankelijke apicale en basolaterale compartimenten en herschepping van complexe biologische micro-omgevingen van modulariteit. Daarom kan ons in vitro 3D-morfogeneseprotocol een aanvullende benadering bieden om de uitdagingen van bestaande methoden te overwinnen.
Ons protocol is volledig gericht op 3D-epitheelmorfogenese, met alleen epitheelcellen in cultuur en geen andere soorten omringende cellen zoals mesenchymale cellen, endotheelcellen en immuuncellen. om de golvende 3D-epitheellaag te recreëren, moeten aanvullende biologische complexiteiten zoals epitheliale-mesenchymale interacties33,34, extracellulaire matrix (ECM)-afzetting35 en, in ons model, crypt-villus-kenmerken die stamcelniches in basale crypten overbrengen, verder worden overwogen. Stromale cellen (bijv. Fibroblasten) in het mesenchym spelen een sleutelrol bij de productie van ECM-eiwitten en regulatie van intestinale morfogenese in vivo35 37,38. De toevoeging van mesenchymcellen aan ons model verbeterde het morfogenetische proces en de efficiëntie van de celhechting. De endotheellaag (dwz capillairen of lymfevaten) speelt een belangrijke rol bij het reguleren van moleculair transport39 en rekrutering van immuuncellen40 in de micro-omgeving van de darm. Bovendien zijn vasculatuurcomponenten die kunnen worden verbonden tussen weefselmodellen een vereiste wanneer weefselmodellen worden ontworpen om multi-orgaaninteracties aan te tonen. Daarom moeten mogelijk endotheelcellen worden opgenomen om meer te modelleren. nauwkeurige fysiologische kenmerken met resolutie op orgaanniveau. Van de patiënt afgeleide immuuncellen zijn ook essentieel voor het vertonen van aangeboren immuunresponsen, antigeenpresentatie, aangeboren adaptieve immuunoverspraak en weefselspecifieke immuniteit in de context van het nabootsen van darmaandoeningen.
Het gebruik van hybride chips is eenvoudiger dan gut-on-a-chip, omdat de installatie van het apparaat eenvoudiger is en het gebruik van Transwell-inserts een schaalbare cultuur van darmepitheel mogelijk maakt. In de handel verkrijgbare Transwell-inserts met polyestermembranen zijn echter niet elastisch en kunnen geen peristaltische bewegingen simuleren. Bovendien bleef het apicale compartiment van het Transwell-insert dat in de hybride chip was geplaatst stationair zonder schuifspanning aan de apicale kant. Het is duidelijk dat de statische eigenschappen in het apicale compartiment zelden mogelijk maken langdurige bacteriële co-cultuur in hybride chips. Hoewel we krachtig 3D-morfogenese in Transwell-inserts kunnen induceren bij gebruik van hybride chips, kan het tekort aan fysiologisch relevante biomechanica en apicale vloeistofstroom de haalbaarheid van hybride chipplatforms voor potentiële toepassingen beperken.
Volledige reconstructies van de menselijke crypte-villus-as in darm-op-een-chip- en hybride-op-een-chip-culturen zijn niet volledig vastgesteld. Aangezien morfogenese begint met een epitheliale monolaag, bieden 3D-microarchitecturen niet noodzakelijkerwijs morfologische gelijkenis met crypten in vivo. Hoewel we de prolifererende celpopulatie nabij het basale crypte-domein in het micro-engineered 3D-epitheel hebben gekarakteriseerd, waren de crypte en villeuze gebieden niet duidelijk afgebakend Hoewel hogere bovenste kanalen op de chip leiden tot een verhoogde hoogte van het micro-engineered epitheel, is de maximale hoogte nog steeds beperkt tot ~300-400 µm. De werkelijke diepte van menselijke darmcrypten in de dunne en dikke darm is respectievelijk ~135 µm en ~400 µm, en de hoogte van de dunne darmvilli is ~600 µm41.
Vanuit het oogpunt van beeldvorming kan in situ beeldvorming met superresolutie van 3D-microarchitecturen beperkt zijn tot de darm op een chip, aangezien de vereiste werkafstand van de objectieflens tot de epitheellaag in de orde van grootte van enkele millimeters ligt. Om dit probleem op te lossen, kan een verre doelstelling vereist zijn. Bovendien is het een uitdaging om dunne secties te maken voor de voorbereiding van beeldvormingsmonsters vanwege de hoge elasticiteit van PDMS. Bovendien, aangezien de laag-voor-laag microfabricage van de darm op een chip permanente hechting tussen elke laag inhoudt, het is buitengewoon uitdagend om de bovenste laag te openen of te verwijderen om de oppervlaktestructuur van de epitheellaag te onderzoeken, bijvoorbeeld met behulp van een scanning elektronenmicroscoop (SEM).
De hydrofobiciteit van PDMS is een beperkende factor geweest in op microfluïdica gebaseerde onderzoeken die zich bezighouden met hydrofobe kleine moleculen, aangezien PDMS dergelijke hydrofobe moleculen niet-specifiek kan adsorberen. Alternatieven voor PDMS kunnen worden overwogen met andere polymere materialen. Als alternatief kan oppervlaktemodificatie van PDMS (bijv. Coating met lipofiele materialen 42 of poly(ethyleenglycol) 43) worden overwogen om de adsorptie van hydrofobe moleculen te minimaliseren.
Ten slotte is onze methode niet goed gekarakteriseerd in termen van het bieden van een high-throughput screening of "one-size-fits-all" gebruiksvriendelijk experimenteel platform. Het huidige protocol vereist een spuitpomp per microdevice, die ruimte in beslag neemt in een CO2-incubator en grootschalige experimenten voorkomt. Deze beperking kan aanzienlijk worden verbeterd door de schaalbaarheid van innovatieve kweekformaten (bijv. medium).
Om 3D-morfogenese van menselijk darmepitheel in vitro te induceren, gebruikten we een microfluïdische chip-intestinaal apparaat met twee parallelle microkanalen en een elastisch poreus membraan ertussen om een ​​lumen-capillaire interface te creëren. We demonstreren ook het gebruik van een enkelkanaals microfluïdisch apparaat (een hybride chip) die zorgt voor een continue basolaterale stroom onder gepolariseerde epitheellagen die op Transwell-inserts zijn gekweekt. Op beide platforms kan de morfogenese van verschillende menselijke darmepitheelcellen worden aangetoond door gerichte manipulatie van stroom om morfogeenantagonisten uit het basolaterale compartiment te verwijderen. De gehele experimentele procedure (Figuur 1) bestaat uit vijf delen: (i) microfabricage van de darmchip of Transwell inbrengbare hybride chip (stappen 1-5; Box 1), (ii) bereiding van darmepitheelcellen (Caco-2-cellen) of menselijke darmorganoïden;dozen 2-5), (iii) kweek van darmepitheelcellen op darmchips of hybride chips (stappen 6-9), (iv) inductie van 3D-morfogenese in vitro (stap 10) en (v) ) om de 3D-epitheelmicrostructuur te karakteriseren (stappen 11-24). , tijdelijke, voorwaardelijke of procedurele controles.
We gebruikten twee verschillende kweekplatforms: darm-op-een-chip met rechte kanalen of niet-lineaire ingewikkelde kanalen, of hybride chips met Transwell (TW)-inserts in een microfluïdisch apparaat, gefabriceerd zoals beschreven in Box 1, en stap 1 -5. "Device Fabrication" toont de belangrijkste stappen bij het maken van een enkele chip of een hybride chip. vitro morfogenese" toont de algemene stappen waarin Caco-2 of organoïde-afgeleide epitheelcellen worden gekweekt op een darmchip of op Transwell-inserts van een hybride chip, gevolgd door inductie van 3D-morfogenese en de vorming van een gekarakteriseerde epitheelstructuur. Het programmastapnummer of vaknummer wordt onder elke pijl weergegeven. De applicatie geeft voorbeelden van hoe gevestigde darmepitheellagen kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld bij celdifferentiatiekarakterisering, darmfysiologische studies, oprichting van gastheer-microbioom ecosystemen en ziektemodellering. Immunofluorescentiebeelden in "Cell Differentiation" die kernen, F-actine en MUC2 tonen, uitgedrukt in de 3D Caco-2-epitheellaag gegenereerd op de darmchip. MUC2-signalering is aanwezig in slijmbekercellen en slijm dat wordt afgescheiden door slijmvliesoppervlakken. Fluorescerende beelden in Gut Physiology tonen slijm geproduceerd door kleuring voor siaalzuur en N-acetylglucosamine-residuen met behulp van fluorescerende agglutine van tarwekiemen in.De twee overlappende afbeeldingen in "Host-Microbe Co-Cultures" tonen representatieve gastheer-microbioom-co-culturen in de darm op een chip. Het linkerpaneel toont de co-cultuur van E. coli die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengt met micro-engineered 3D Caco-2 epitheelcellen. Het rechterpaneel toont de lokalisatie van GFP E. coli samen gekweekt met 3D Caco-2 epitheelcellen, gevolgd door immunofluorescentiekleuring met F-actine (rood) en kernen (blauw). Ziektemodellering illustreert gezonde versus lekkende darm in darmontstekingschips onder fysiologische uitdaging met bacteriële antigenen (bijv. Lipopolysaccharide, LPS) en immuuncellen (bijv. PBMC;groen). Caco-2-cellen werden gekweekt om een ​​3D-epitheellaag tot stand te brengen. Schaalbalk, 50 µm. Afbeeldingen in onderste rij: "Differentiatie van cellen" aangepast met toestemming van referentie.2.Oxford Universiteit krant;Overgenomen met toestemming van Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" aangepast met toestemming van ref.3.NAS;"Ziektemodellering" aangepast met toestemming van reference.5.NAS.
Zowel gut-on-chip als hybride chips werden vervaardigd met behulp van PDMS-replica's die door zachte lithografie uit siliciummallen werden gehaald en van een patroon werden voorzien met SU-8. Het ontwerp van de microkanalen in elke chip wordt bepaald door rekening te houden met hydrodynamica zoals schuifspanning en hydrodynamische druk. Het oorspronkelijke gut-on-a-chip-ontwerp (Extended Data Fig. 1a), dat bestond uit twee naast elkaar geplaatste parallelle rechte microkanalen, is geëvolueerd tot een complexe gut-on-a -chip (Extended Data Fig. 1b) die een paar gebogen microkanalen bevat om een ​​verhoogde vloeistofverblijftijd, niet-lineaire stromingspatronen en multiaxiale vervorming van gekweekte cellen te induceren (Fig. 2a-f) 12. Wanneer complexere biomechanica van de darm opnieuw moeten worden gecreëerd, kunnen complexe darm-op-een-chips worden gekozen. We hebben aangetoond dat de ingewikkelde Gut-Chip ook sterk 3D-morfogenese induceert in een vergelijkbaar tijdsbestek met een vergelijkbare mate van epithe liale groei in vergelijking met de originele Gut-Chip, ongeacht het gekweekte celtype. Daarom zijn lineaire en complexe on-chip darmontwerpen onderling uitwisselbaar om 3D-morfogenese te induceren.2a). Om de darm op een chip te fabriceren, werd de voorbereide bovenste PDMS-laag achtereenvolgens gebonden aan een poreuze PDMS-film en vervolgens uitgelijnd met de onderste PDMS-laag door onomkeerbare binding met behulp van een corona-behandelaar (Fig. 2b-f). Om hybride chips te fabriceren, werden uitgeharde PDMS-replica's gebonden aan glasplaatjes om microfluïdische apparaten met één kanaal te creëren die plaats konden bieden aan Transwell-inserts (Fig. 2h en Uitgebreide gegevens Fig. 2). Het hechtingsproces is uitgevoerd door de oppervlakken van de PDMS-replica en glas te behandelen met zuurstofplasma of coronabehandeling. Na sterilisatie van het gemicrofabriceerde apparaat dat aan de siliconenbuis was bevestigd, was de opstelling van het apparaat klaar om 3D-morfogenese van het darmepitheel uit te voeren (figuur 2g).
a, Schematische weergave van de bereiding van PDMS-onderdelen uit siliconenvormen met SU-8-patroon. De niet-uitgeharde PDMS-oplossing werd op een siliconenvorm gegoten (links), uitgehard bij 60 ° C (midden) en uit de vorm gehaald (rechts). Het uit de vorm gehaalde PDMS werd in stukken gesneden en gereinigd voor verder gebruik.b, Foto van de siliconenvorm die werd gebruikt om de PDMS-bovenlaag te bereiden. bovenste en onderste PDMS-componenten en het geassembleerde on-chip intestinale apparaat.e, Schema van de uitlijning van de bovenste, membraan- en onderste PDMS-componenten. Elke laag is onomkeerbaar gebonden door plasma- of coronabehandeling.f, Schema van het gefabriceerde darm-op-een-chip-apparaat met bovenop ingewikkelde microkanalen en vacuümkamers.g, Opstelling van darm-op-een-chip voor microfluïdische celkweek. Het chipapparaat werd voor verwerking op het deksel van een petrischaal van 150 mm geplaatst. Het bindmiddel wordt gebruikt om de siliconenbuis te sluiten. h, Visuele momentopnamen van hybride chipfabricage en 3D-morfogenese met behulp van hybride chips. Transwell-inserts die onafhankelijk zijn bereid om 2D-monolagen van darmepitheelcellen te kweken werden in de hybride chip ingebracht om intestinale 3D-morfogenese te induceren. gedrukt met toestemming van reference.4.Elsevier.
In dit protocol werden de Caco-2-cellijn en intestinale organoïden gebruikt als epitheliale bronnen (Fig. 3a). Beide soorten cellen werden onafhankelijk gekweekt (Box 2 en Box 5) en gebruikt om de ECM-gecoate microkanalen van on-chip gut of Transwell-inserts te zaaien. om gedissocieerde celsuspensies te bereiden door trypsinevloeistof (box 2). Menselijke darmorganoïden van darmbiopsieën of chirurgische resecties werden gekweekt in Matrigel-steigerkoepels in platen met 24 putjes om de structurele micro-omgeving te ondersteunen. Medium met essentiële morfogenen (zoals Wnt, R-spondin en Noggin) en groeifactoren bereid zoals beschreven in Box 3 werd om de dag aangevuld totdat de organoïden groeiden tot ~ 500 µm in diameter. Volledig gekweekte organoïden worden geoogst en gedissocieerd in enkele cellen om op darm- of Transwell-inzetstukken op een chip te zaaien (Box 5). Zoals we eerder hebben gemeld, kan het worden onderscheiden op basis van ziektetype (bijv. Colitis ulcerosa, ziekte van Crohn, colorectale kanker of normale donor), laesieplaats (bijv. laesie versus niet-laesiegebied) en gastro-intestinale locatie in het kanaal (bijv. twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, blindedarm, colon of rectum). We bieden een geoptimaliseerd protocol in vak 5 voor het kweken van darmorganoïden (coloïden) die doorgaans hogere concentraties morfogenen vereisen dan organoïden van de dunne darm.
a, workflow voor de inductie van darmmorfogenese in de darmchip. Caco-2 menselijk darmepitheel en darmorganoïden worden in dit protocol gebruikt om 3D-morfogenese aan te tonen. De geïsoleerde epitheelcellen werden gezaaid in het voorbereide darm-op-een-chip-apparaat (chipvoorbereiding). Zodra cellen zijn gezaaid (gezaaid) en bevestigd (bevestigd) aan het poreuze PDMS-membraan op dag 0 (D0), wordt apicale (AP) stroom geïnitieerd en onderhouden voor de eerste 2 dagen (stroom, AP, D0-D2). Basolaterale (BL) stroom wordt ook geïnitieerd samen met cyclische rekbewegingen (rek, stroom, AP en BL) wanneer een volledige 2D-monolaag wordt gevormd. Intestinale 3D-morfogenese vond spontaan plaats na 5 dagen microfluïdische cultuur (morfogenese, D5). Fasecontrastbeelden tonen representatieve morfologie van Caco-2-cellen bij elke experimentele stap of tijdstip (staafdiagram, 100 µm). Vier schematische diagrammen ter illustratie van de overeenkomstige cascades van darmmorfogenese (rechtsboven). De gestreepte pijlen in het schema geven de richting van de vloeistofstroom weer. b, SEM-afbeelding die de oppervlaktetopologie van het gevestigde 3D Caco-2-epitheel toont (links). De inzet die het vergrote gebied markeert (wit gestreept vak) toont de geregenereerde microvilli op de 3D Caco-2-laag (rechts). c, Horizontaal vooraanzicht van gevestigde Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rood) en continue borstelgrensmembranen met het label F-actine (groen) en kernen (blauw) Immunofluorescentie confocale visualisatie van epitheelcellen op darmchips. Pijlen die naar het middelste schema wijzen, geven de locatie van het brandpuntsvlak aan voor elke confocale weergave. ificatie van het verstrekte beeld.e, DIC-microfoto van organoïde 3D-epitheel gevestigd in de darm op plak genomen op dag 7.f, Overlay immunofluorescentiebeelden die markeringen voor stamcellen tonen (LGR5;magenta), slijmbekercellen (MUC2; groen), F-actine (grijs) en kernen (cyaan) gegroeid op darmchips gedurende 3 dagen, respectievelijk (links) en 13 dagen (midden) organoïden op de epitheellaag. Zie ook uitgebreide gegevens Figuur 3, die LGR5-signalering benadrukt zonder MUC2-signalering. kleuring van het plasmamembraan met CellMask-kleurstof (rechts) op dag 13 van de kweek. Schaalbalk is 50 μm, tenzij anders vermeld.b Herdrukt met toestemming van referentie.2.Oxford Universiteit krant;c Aangepast met toestemming van Reference.2.Oxford Universiteit krant;e en f aangepast met toestemming door verwijzing.12 Onder Creative Commons-licentie CC BY 4.0.
In de darm op een chip is het noodzakelijk om het hydrofobe oppervlak van het poreuze PDMS-membraan aan te passen voor een succesvolle ECM-coating. In dit protocol passen we twee verschillende methoden toe om de hydrofobiciteit van PDMS-membranen te wijzigen. op chemicaliën gebaseerde oppervlaktefunctionalisatie om efficiënte afzetting van ECM-eiwitten te bereiken door achtereenvolgens polyethyleenimine (PEI) en glutaaraldehyde toe te passen op PDMS-microkanalen. Na oppervlaktemodificatie werden ECM-eiwitten afgezet om het gefunctionaliseerde PDMS-oppervlak te bedekken en vervolgens in het geïsoleerde organoïde epitheel geïntroduceerd. Nadat de cellen zijn bevestigd, begint de microfluïdische celcultuur door alleen het medium in het bovenste microkanaal te perfuseren totdat de cellen een volledige monolaag vormen, terwijl het onderste microkanaal statische omstandigheden handhaaft. Deze geoptimaliseerde methode voor oppervlakteactivering en ECM-coating maakt de bevestiging van organoïde epitheel mogelijk om 3D-morfogenese op het PDMS-oppervlak te induceren.
Transwell-culturen vereisen ook ECM-coating voorafgaand aan het zaaien van cellen;Transwell-culturen vereisen echter geen complexe voorbehandelingsstappen om het oppervlak van poreuze inserts te activeren. Voor het kweken van Caco-2-cellen op Transwell-inserts versnelt ECM-coating op poreuze inserts de hechting van gedissocieerde Caco-2-cellen (<1 uur) en vorming van nauwe overgangsbarrières (<1-2 dagen). monolaag met barrière-integriteit. Transwell-culturen worden uitgevoerd in platen met 24 putjes zonder het gebruik van hybride chips.
In vitro 3D-morfogenese kan worden geïnitieerd door vloeistofstroom toe te passen op het basolaterale aspect van een gevestigde epitheellaag. In de darm op een chip begon epitheliale morfogenese toen het medium werd geperfundeerd in de bovenste en onderste microkanalen (Fig. 3a). Zoals eerder beschreven, is het van cruciaal belang om vloeistofstroom in het onderste (basolaterale) compartiment te introduceren voor continue verwijdering van directionele uitgescheiden morfogeenremmers. Vanwege de schuifspanning passen we meestal dubbele stroming toe in de darm op een chip. In hybride chips werden Transwell-inserts met epitheliale monolagen in de hybride chips ingebracht. Vervolgens werd het medium aangebracht onder de basolaterale zijde van het poreuze Transwell-insert via het microkanaal. Darmmorfogenese vond plaats 3-5 dagen na het begin van de basolaterale stroming in beide kweekplatforms.
De morfologische kenmerken van micro-engineered 3D-epitheellagen kunnen worden geanalyseerd door verschillende beeldvormingsmodaliteiten toe te passen, waaronder fasecontrastmicroscopie, differentieel interferentiecontrast (DIC)-microscopie, SEM of immunofluorescentie confocale microscopie (figuren 3 en 4). Fasecontrast of DIC-beeldvorming kan eenvoudig worden uitgevoerd op elk moment tijdens de kweek om de vorm en het uitsteeksel van 3D-epitheellagen te controleren. -a-chip en hybride chipplatforms kunnen real-time in situ beeldvorming bieden zonder dat het apparaat in secties hoeft te worden verdeeld of gedemonteerd. Bij het uitvoeren van immunofluorescentiebeeldvorming (figuren 1, 3c, f en 4b, c), worden cellen doorgaans gefixeerd met 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), gevolgd door Triton X-100 en 2% (wt/vol)) runderserumalbumine (BSA), in volgorde.Afhankelijk van het celtype, verschillende fixatieven, permeabilizers en blokkerende middelen kunnen worden gebruikt. Primaire antilichamen gericht op afstammingsafhankelijke cel- of regiomarkers worden gebruikt om cellen te markeren die in situ op de chip zijn geïmmobiliseerd, gevolgd door secundaire antilichamen samen met een kleurstof tegenkleuring gericht op ofwel de kern (bijv. 4′,6-diamidino-2-fenyleen) indool, DAPI) of F-actine (bijv. fluorescent gelabeld phalloidin). Op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming kan ook in situ worden uitgevoerd om slijm te detecteren productie (afb.1, "Celdifferentiatie" en "Darmfysiologie"), willekeurige kolonisatie van microbiële cellen (Fig. 1, "Host-microbe co-cultuur"), de rekrutering van immuuncellen (Fig. 1, 'Ziektemodellering') of de contouren van 3D-epitheelmorfologie (Fig. 3c, f en 4b, c). Bij het aanpassen van de darm op de chip om de bovenste laag van de onderste microkanaallaag te scheiden, zoals beschreven in ref. Fig. 2, de 3D-epitheelmorfologie evenals de microvilli op de apicale borstelrand kunnen worden gevisualiseerd door SEM (Fig. 3b). De expressie van differentiatiemarkers kan worden beoordeeld door kwantitatieve PCR5 of eencellige RNA-sequencing uit te voeren. In dit geval worden 3D-lagen van epitheelcellen gekweekt in darmchips of hybride chips geoogst door trypsinisatie en vervolgens gebruikt voor moleculaire of genetische analyse.
a, Workflow voor de inductie van intestinale morfogenese in een hybride chip. Caco-2 en intestinale organoïden worden in dit protocol gebruikt om 3D-morfogenese in een hybride chipplatform aan te tonen. Gedissocieerde epitheelcellen werden gezaaid in geprepareerde Transwell-inserts (TW-voorbereiding; zie onderstaande afbeelding). Nadat de cellen waren gezaaid (gezaaid) en bevestigd aan polyestermembranen in Transwell-inserts, werden alle cellen gekweekt onder statische omstandigheden (TW-cultuur). Na 7 dagen, een enkele Transwell-insert met een 2D-monolaag van epitheelcellen werd geïntegreerd in een hybride chip om een ​​basolaterale stroom (Flow, BL) te introduceren, wat uiteindelijk leidde tot het genereren van een 3D-epitheellaag (morfogenese). Fasecontrastmicrofoto's die morfologische kenmerken tonen van epitheelcellen van menselijke organen afgeleid van normale donor (C103-lijn) stijgende dikke darm bij elke experimentele stap of tijdstip. De schema's in de bovenste lagen illustreren de experimentele configuratie voor elke stap. b, Hybride chips (schema links) kunnen leiden tot 3 D-morfogenese van organoïde epitheelcellen met top-down confocale microscopiebeelden genomen op verschillende Z-posities (boven, midden en onder;zie rechter schema en bijbehorende stippellijnen).vertoonde duidelijke morfologische kenmerken. F-actine (cyaan), nucleus (grijs). c, Fluorescentie confocale microfoto's (3D-hoekweergave) van van organoïde afgeleide epitheelcellen gekweekt in statische Transwell (TW; inzet in witte stippellijn) versus hybride chip (grootste volledige opname) die respectievelijk 2D versus 3D morfologie vergelijken. Een paar 2D verticale dwarsdoorsneden weergaven (inzet in de rechterbovenhoek; "XZ") tonen ook 2D en 3D-kenmerken. Schaalbalk, 100 µm.c Herdrukt met toestemming van reference.4.Elsevier.
Controles kunnen worden voorbereid door dezelfde cellen (Caco-2 of intestinale organoïde epitheelcellen) te kweken tot tweedimensionale monolagen onder conventionele statische kweekomstandigheden. Met name kan de uitputting van voedingsstoffen het gevolg zijn van de beperkte volumecapaciteit van de microkanalen (dwz ~ 4 μL in het bovenste kanaal op het oorspronkelijke ontwerp van de darmchip). Daarom kan de epitheliale morfologie voor en na toepassing van basolaterale stroom ook worden vergeleken.
Het zachte lithografieproces moet worden uitgevoerd in een schone kamer. Voor elke laag op de chip (bovenste en onderste lagen en membranen) en hybride chips werden verschillende fotomaskers gebruikt en op afzonderlijke siliciumwafels vervaardigd omdat de hoogte van de microkanalen verschillend was. De doelhoogten van de bovenste en onderste microkanalen van de darm op de chip zijn respectievelijk 500 µm en 200 µm. De kanaaldoelhoogte van de hybride chip is 200 µm.
Plaats een 3-inch siliciumwafel in een schaal met aceton. Zwenk de plaat voorzichtig gedurende 30 seconden en laat de wafel vervolgens aan de lucht drogen. Breng de wafel over naar een plaat met IPA en draai de plaat vervolgens 30 seconden rond om schoon te maken.
Optioneel kan een piranha-oplossing (mengsel van waterstofperoxide en geconcentreerd zwavelzuur, 1:3 (vol/vol)) worden gebruikt om de verwijdering van organische resten van het oppervlak van de siliciumwafel te maximaliseren.
Piranha-oplossing is uiterst corrosief en genereert warmte. Er zijn aanvullende veiligheidsmaatregelen nodig. Laat de oplossing voor afvalverwijdering afkoelen en doe deze in een schone, droge afvalcontainer. Gebruik secundaire containers en label afvalcontainers op de juiste manier. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de faciliteit voor meer gedetailleerde procedures.
Dehydrateer de wafels door ze gedurende 10 minuten op een hete plaat van 200 °C te plaatsen. Na uitdroging werd de wafel vijf keer in lucht geschud om af te koelen.
Giet ~ 10 g fotoresist SU-8 2100 op het midden van de gereinigde siliciumwafel. Gebruik een pincet om de fotoresist gelijkmatig over de wafel te verdelen. Plaats de wafel af en toe op een hete plaat van 65°C om de fotoresist minder plakkerig en gemakkelijker te verspreiden te maken. Plaats de wafel niet rechtstreeks op de hete plaat.
SU-8 werd gelijkmatig verdeeld over de wafer door spincoating uit te voeren. Programmeer een inkomende rotatie van de SU-8 gedurende 5-10 s om zich voort te planten met 500 tpm bij een versnelling van 100 tpm/s. Stel de hoofdspin in voor patronen met een dikte van 200 µm bij 1500 tpm, of bereik een dikte van 250 µm (maak een hoogte van 500 µm voor de bovenste laag van de darm op de chip; zie "Kritieke stappen" hieronder) set bij een acceleratie van 300 tpm/s 30 seconden bij 1.200 tpm.
De hoofdrotatiesnelheid kan worden aangepast aan de doeldikte van het SU-8-patroon op de siliciumwafel.
Om SU-8-patronen met een hoogte van 500 µm te fabriceren voor de bovenste laag van de darm op de chip, werden de spincoating- en zachte bakstappen van deze doos (stappen 7 en 8) achtereenvolgens herhaald (zie stap 9) om twee lagen van 250 µm te produceren.
Bak de SU-8 gecoate wafels zacht door de wafels gedurende 5 minuten voorzichtig op een hete plaat bij 65 °C te plaatsen, schakel vervolgens de instelling over naar 95 °C en incubeer nog eens 40 minuten.
Om een ​​hoogte van 500 μm van het SU-8-patroon in het bovenste microkanaal te bereiken, herhaalt u stap 7 en 8 om twee 250 μm dikke SU-8-lagen te genereren.
Voer met behulp van de UV Mask Aligner een lamptest uit volgens de instructies van de fabrikant om de belichtingstijd van de wafer te berekenen.(belichtingstijd, ms) = (belichtingsdosis, mJ/cm2)/(lampvermogen, mW/cm2).
Plaats na het bepalen van de belichtingstijd het fotomasker op de maskerhouder van de UV-maskeruitlijner en plaats het fotomasker op de SU-8 gecoate wafer.
Plaats het bedrukte oppervlak van het fotomasker direct op de SU-8 gecoate zijde van de siliciumwafel om UV-verspreiding te minimaliseren.
Stel de met SU-8 gecoate wafel en het fotomasker verticaal bloot aan 260 mJ/cm2 UV-licht gedurende de vooraf bepaalde belichtingstijd (zie stap 10 van dit kader).
Na UV-blootstelling werden SU-8-gecoate siliciumwafels gebakken bij 65 ° C gedurende 5 minuten en 95 ° C gedurende 15 minuten op elke hete plaat om patronen te vervaardigen met een hoogte van 200 μm. Verleng de nabaktijd bij 95 ° C tot 30 minuten om patronen met een hoogte van 500 μm te vervaardigen.
De ontwikkelaar wordt in een glazen schaal gegoten en de gebakken wafel wordt in de schaal geplaatst. Het volume van de SU-8-ontwikkelaar kan variëren, afhankelijk van de grootte van de glasplaat. Zorg ervoor dat u voldoende SU-8-ontwikkelaar gebruikt om onbelichte SU-8 volledig te verwijderen. Als u bijvoorbeeld een glazen schaal met een diameter van 150 mm en een inhoud van 1 L gebruikt, gebruikt u ongeveer 300 ml SU-8-ontwikkelaar. Ontwikkel de mal gedurende 25 minuten met af en toe zachte rotatie.
Spoel de ontwikkelde mal af met ~ 10 mL verse ontwikkelaar, gevolgd door IPA door de oplossing te besproeien met een pipet.
Plaats de wafel in een plasmareiniger en stel gedurende 1,5 min bloot aan zuurstofplasma (atmosferisch gas, doeldruk 1 × 10−5 Torr, vermogen 125 W).
Plaats de wafel in een vacuümexsiccator met daarin een glasplaatje. Wafels en objectglaasjes kunnen naast elkaar worden geplaatst. Als de vacuümexsiccator door een plaat in meerdere lagen is verdeeld, plaatst u de objectglaasjes in de onderste kamer en de wafels in de bovenste kamer. Laat 100 μL trichloor(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl)silaanoplossing op een glasplaatje vallen en breng vacuüm aan voor silanisatie.
Ontdooi een flacon met bevroren Caco-2-cellen in een waterbad van 37 °C en breng de ontdooide cellen vervolgens over in een T75-kolf met 15 ml voorverwarmd Caco-2-medium van 37 °C.
Om Caco-2-cellen te passeren bij ~90% confluentie, verwarm eerst Caco-2-medium, PBS en 0,25% trypsine/1 mM EDTA in een waterbad van 37°C.
Aspireer het medium door vacuümaspiratie. Was de cellen tweemaal met 5 mL warme PBS door vacuümaspiratie te herhalen en verse PBS toe te voegen.