Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
De evolutie van microbiële parasieten omvat een tegenwicht tussen natuurlijke selectie, waardoor parasieten verbeteren, en genetische drift, waardoor parasieten genen verliezen en schadelijke mutaties accumuleren.Om te begrijpen hoe deze tegenwerking plaatsvindt op de schaal van een enkel macromolecuul, beschrijven we hier de cryo-EM-structuur van het ribosoom van Encephalitozoon cuniculi, een eukaryotisch organisme met een van de kleinste genomen in de natuur.De extreme vermindering van rRNA in ribosomen van E. cuniculi gaat gepaard met ongekende structurele veranderingen, zoals de evolutie van voorheen onbekende gefuseerde rRNA-linkers en rRNA zonder uitstulpingen.Bovendien overleefde het ribosoom van E. cuniculi het verlies van rRNA-fragmenten en eiwitten door het vermogen te ontwikkelen om kleine moleculen te gebruiken als structurele nabootsingen van afgebroken rRNA-fragmenten en eiwitten.Over het algemeen laten we zien dat moleculaire structuren waarvan lang werd gedacht dat ze verminderd, gedegenereerd en onderhevig aan slopende mutaties zijn, een aantal compensatiemechanismen hebben die ze actief houden ondanks extreme moleculaire contracties.
Omdat de meeste groepen microbiële parasieten unieke moleculaire instrumenten hebben om hun gastheren uit te buiten, moeten we vaak verschillende therapieën ontwikkelen voor verschillende groepen parasieten1,2.Nieuw bewijs suggereert echter dat sommige aspecten van de evolutie van parasieten convergerend en grotendeels voorspelbaar zijn, wat wijst op een mogelijke basis voor brede therapeutische interventies bij microbiële parasieten3,4,5,6,7,8,9.
Eerder werk heeft een gemeenschappelijke evolutionaire trend in microbiële parasieten geïdentificeerd, genaamd genoomreductie of genoomverval10,11,12,13.Huidig ​​onderzoek toont aan dat wanneer micro-organismen hun vrijlevende levensstijl opgeven en intracellulaire parasieten (of endosymbionten) worden, hun genomen gedurende miljoenen jaren langzame maar verbazingwekkende metamorfoses ondergaan9,11.In een proces dat bekend staat als genoomverval, accumuleren microbiële parasieten schadelijke mutaties die veel eerder belangrijke genen in pseudogenen veranderen, wat leidt tot geleidelijk genverlies en ineenstorting van mutaties14,15.Deze ineenstorting kan tot 95% van de genen in de oudste intracellulaire organismen vernietigen in vergelijking met nauw verwante vrijlevende soorten.De evolutie van intracellulaire parasieten is dus een touwtrekken tussen twee tegengestelde krachten: darwinistische natuurlijke selectie, die leidt tot de verbetering van parasieten, en de ineenstorting van het genoom, waardoor parasieten in de vergetelheid raken.Hoe de parasiet uit dit getouwtrek is gekomen en de activiteit van zijn moleculaire structuur heeft behouden, blijft onduidelijk.
Hoewel het mechanisme van genoomverval niet volledig wordt begrepen, lijkt het voornamelijk te gebeuren als gevolg van frequente genetische drift.Omdat parasieten in kleine, aseksuele en genetisch beperkte populaties leven, kunnen ze schadelijke mutaties die soms optreden tijdens DNA-replicatie niet effectief elimineren.Dit leidt tot onomkeerbare accumulatie van schadelijke mutaties en vermindering van het genoom van de parasiet.Hierdoor verliest de parasiet niet alleen genen die niet meer nodig zijn voor zijn overleving in de intracellulaire omgeving.Het is het onvermogen van parasietenpopulaties om sporadische schadelijke mutaties effectief te elimineren dat ervoor zorgt dat deze mutaties zich door het hele genoom ophopen, inclusief hun belangrijkste genen.
Veel van ons huidige begrip van genoomreductie is uitsluitend gebaseerd op vergelijkingen van genoomsequenties, met minder aandacht voor veranderingen in daadwerkelijke moleculen die huishoudelijke functies vervullen en dienen als potentiële doelwitten voor medicijnen.Vergelijkende studies hebben aangetoond dat de last van schadelijke intracellulaire microbiële mutaties eiwitten en nucleïnezuren vatbaar lijkt te maken voor verkeerd vouwen en aggregeren, waardoor ze meer chaperonneafhankelijk en overgevoelig voor warmte worden19,20,21,22,23.Bovendien ervoeren verschillende parasieten - onafhankelijke evolutie soms met een tussenpoos van wel 2,5 miljard jaar - een vergelijkbaar verlies van kwaliteitscontrolecentra in hun eiwitsynthese5,6 en DNA-reparatiemechanismen24.Er is echter weinig bekend over de impact van intracellulaire levensstijl op alle andere eigenschappen van cellulaire macromoleculen, inclusief moleculaire aanpassing aan een toenemende last van schadelijke mutaties.
Om de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren van intracellulaire micro-organismen beter te begrijpen, hebben we in dit werk de structuur bepaald van ribosomen van de intracellulaire parasiet Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi is een schimmelachtig organisme dat behoort tot een groep parasitaire microsporidia die ongewoon kleine eukaryotische genomen hebben en daarom worden gebruikt als modelorganismen om genoomverval te bestuderen25,26,27,28,29,30.Onlangs werd de cryo-EM-ribosoomstructuur bepaald voor matig gereduceerde genomen van Microsporidia, Paranosema locustae en Vairimorpha necatrix (~ 3,2 Mb genoom).Deze structuren suggereren dat enig verlies van rRNA-amplificatie wordt gecompenseerd door de ontwikkeling van nieuwe contacten tussen naburige ribosomale eiwitten of de verwerving van nieuwe msL131,32 ribosomale eiwitten.Soort Encephalitozoon (genoom ~ 2,5 miljoen bp), samen met hun nauwste verwant Ordospora, demonstreren de ultieme mate van genoomreductie in eukaryoten - ze hebben minder dan 2000 eiwitcoderende genen, en er wordt verwacht dat hun ribosomen niet alleen verstoken zijn van rRNA-expansiefragmenten (rRNA-fragmenten die eukaryote ribosomen onderscheiden van bacteriële ribosomen) hebben ook vier ribosomale eiwitten vanwege hun gebrek aan homologen in de E. cuniculi ge naam26,27,28.Daarom concludeerden we dat het E. cuniculi-ribosoom voorheen onbekende strategieën voor moleculaire aanpassing aan genoomverval kan onthullen.
Onze cryo-EM-structuur vertegenwoordigt het kleinste eukaryote cytoplasmatische ribosoom dat moet worden gekarakteriseerd en geeft inzicht in hoe de uiteindelijke mate van genoomreductie de structuur, assemblage en evolutie van de moleculaire machinerie die integraal deel uitmaakt van de cel beïnvloedt.We ontdekten dat het ribosoom van E. cuniculi in strijd is met veel van de algemeen geconserveerde principes van RNA-vouwing en ribosoomassemblage, en ontdekten een nieuw, voorheen onbekend ribosomaal eiwit.Vrij onverwacht laten we zien dat microsporidia-ribosomen het vermogen hebben ontwikkeld om kleine moleculen te binden, en veronderstellen dat afknottingen in rRNA en eiwitten evolutionaire innovaties teweegbrengen die uiteindelijk bruikbare eigenschappen aan het ribosoom kunnen verlenen.
Om ons begrip van de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren in intracellulaire organismen te verbeteren, hebben we besloten om E. cuniculi-sporen te isoleren uit culturen van geïnfecteerde zoogdiercellen om hun ribosomen te zuiveren en de structuur van deze ribosomen te bepalen.Het is moeilijk om een ​​groot aantal parasitaire microsporidia te verkrijgen omdat microsporidia niet gekweekt kunnen worden in een voedingsbodem.In plaats daarvan groeien en reproduceren ze alleen in de gastheercel.Om E. cuniculi-biomassa te verkrijgen voor ribosoomzuivering, infecteerden we daarom de zoogdierniercellijn RK13 met E. cuniculi-sporen en kweekten we deze geïnfecteerde cellen gedurende enkele weken om E. cuniculi te laten groeien en vermenigvuldigen.Met behulp van een geïnfecteerde celmonolaag van ongeveer een halve vierkante meter konden we ongeveer 300 mg Microsporidia-sporen zuiveren en gebruiken om ribosomen te isoleren.Vervolgens hebben we de gezuiverde sporen verbroken met glasparels en de ruwe ribosomen geïsoleerd met behulp van stapsgewijze polyethyleenglycolfractionering van de lysaten.Hierdoor konden we ongeveer 300 μg ruwe E. cuniculi-ribosomen verkrijgen voor structurele analyse.
Vervolgens hebben we cryo-EM-afbeeldingen verzameld met behulp van de resulterende ribosoommonsters en deze afbeeldingen verwerkt met behulp van maskers die overeenkomen met de grote ribosomale subeenheid, kleine subeenheidkop en kleine subeenheid.Tijdens dit proces hebben we beelden verzameld van ongeveer 108.000 ribosomale deeltjes en berekende cryo-EM-beelden met een resolutie van 2,7 Å (aanvullende figuren 1-3).Vervolgens hebben we cryoEM-afbeeldingen gebruikt om rRNA, ribosomaal eiwit en winterslaapfactor Mdf1 geassocieerd met E. cuniculi-ribosomen te modelleren (Fig. 1a, b).
a Structuur van het E. cuniculi-ribosoom in complex met de winterslaapfactor Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kaart van winterslaapfactor Mdf1 geassocieerd met het E. cuniculi-ribosoom.c Secundaire structuurkaart waarin hersteld rRNA in Microsporidische soorten wordt vergeleken met bekende ribosomale structuren.De panelen tonen de locatie van de geamplificeerde rRNA-fragmenten (ES) en ribosoom-actieve plaatsen, inclusief de decoderingsplaats (DC), de sarcinicine-lus (SRL) en het peptidyltransferasecentrum (PTC).d De elektronendichtheid die overeenkomt met het peptidyltransferasecentrum van het E. cuniculi-ribosoom suggereert dat deze katalytische plaats dezelfde structuur heeft in de E. cuniculi-parasiet en zijn gastheren, inclusief H. sapiens.e, f De overeenkomstige elektronendichtheid van het decoderingscentrum (e) en de schematische structuur van het decoderingscentrum (f) geven aan dat E. cuniculi residuen U1491 heeft in plaats van A1491 (E. coli-nummering) in veel andere eukaryoten.Deze verandering suggereert dat E. cuniculi mogelijk gevoelig is voor antibiotica die zich op deze actieve site richten.
In tegenstelling tot de eerder vastgestelde structuren van V. necatrix en P. locustae ribosomen (beide structuren vertegenwoordigen dezelfde microsporidia familie Nosematidae en lijken sterk op elkaar), ondergaan 31,32 E. cuniculi ribosomen talrijke processen van rRNA en eiwitfragmentatie.Verdere denaturatie (aanvullende figuren 4-6).In rRNA omvatten de meest opvallende veranderingen volledig verlies van het geamplificeerde 25S rRNA-fragment ES12L en gedeeltelijke degeneratie van h39-, h41- en H18-helices (figuur 1c, aanvullende figuur 4).Van de ribosomale eiwitten omvatten de meest opvallende veranderingen volledig verlies van het eS30-eiwit en verkorting van de eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- en eS7-eiwitten (aanvullende figuren 4, 5).
De extreme reductie van de genomen van Encephalotozoön / Ordospora- soorten wordt dus weerspiegeld in hun ribosoomstructuur: E. cuniculi- ribosomen ervaren het meest dramatische verlies van eiwitgehalte in eukaryote cytoplasmatische ribosomen die onderhevig zijn aan structurele karakterisering, en ze hebben niet eens die rRNA- en eiwitfragmenten die zijn op grote schaal geconserveerd, niet alleen in eukaryoten, maar ook in de drie domeinen van het leven.De structuur van het E. cuniculi-ribosoom biedt het eerste moleculaire model voor deze veranderingen en onthult evolutionaire gebeurtenissen die over het hoofd zijn gezien door zowel vergelijkende genomica als studies van intracellulaire biomoleculaire structuur (aanvullende figuur 7).Hieronder beschrijven we elk van deze gebeurtenissen samen met hun waarschijnlijke evolutionaire oorsprong en hun potentiële impact op de ribosoomfunctie.
Vervolgens ontdekten we dat E. cuniculi-ribosomen, naast grote rRNA-afknottingen, rRNA-variaties hebben op een van hun actieve plaatsen.Hoewel het peptidyltransferasecentrum van het E. cuniculi-ribosoom dezelfde structuur heeft als andere eukaryote ribosomen (Fig. 1d), verschilt het decoderingscentrum vanwege sequentievariatie op nucleotide 1491 (E. coli-nummering, Fig. 1e, f).Deze observatie is belangrijk omdat de decoderingsplaats van eukaryotische ribosomen typisch residuen G1408 en A1491 bevat in vergelijking met bacterieachtige residuen A1408 en G1491.Deze variatie ligt ten grondslag aan de verschillende gevoeligheid van bacteriële en eukaryote ribosomen voor de aminoglycosidefamilie van ribosomale antibiotica en andere kleine moleculen die zich op de decoderingsplaats richten.Op de decoderingsplaats van het E. cuniculi-ribosoom werd residu A1491 vervangen door U1491, waardoor mogelijk een unieke bindingsinterface ontstaat voor kleine moleculen die zich op deze actieve plaats richten.Dezelfde A14901-variant is ook aanwezig in andere microsporidia zoals P. locustae en V. necatrix, wat suggereert dat het wijdverspreid is onder microsporidia-soorten (figuur 1f).
Omdat onze E. cuniculi-ribosoommonsters werden geïsoleerd uit metabolisch inactieve sporen, hebben we de cryo-EM-kaart van E. cuniculi getest op eerder beschreven ribosoombinding onder stress- of uithongeringscondities.Winterslaapfactoren 31,32,36,37, 38. We hebben de eerder vastgestelde structuur van het winterslaapribosoom vergeleken met de cryo-EM-kaart van het E. cuniculi-ribosoom.Voor het aanmeren werden S. cerevisiae-ribosomen gebruikt in een complex met winterslaapfactor Stm138, sprinkhanenribosomen in een complex met de Lso232-factor en V. necatrix-ribosomen in een complex met Mdf1- en Mdf231-factoren.Tegelijkertijd vonden we de cryo-EM-dichtheid die overeenkomt met de rustfactor Mdf1.Vergelijkbaar met Mdf1-binding aan het V. necatrix-ribosoom, bindt Mdf1 ook aan het E. cuniculi-ribosoom, waar het de E-plaats van het ribosoom blokkeert, wat mogelijk helpt om ribosomen beschikbaar te maken wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden na inactivering van het lichaam (Figuur 2).).
Mdf1 blokkeert de E-site van het ribosoom, wat lijkt te helpen het ribosoom te deactiveren wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden.In de structuur van het E. cuniculi-ribosoom vonden we dat Mdf1 een voorheen onbekend contact vormt met de L1-ribosoomstam, het deel van het ribosoom dat de afgifte van gedeacyleerd tRNA uit het ribosoom tijdens eiwitsynthese vergemakkelijkt.Deze contacten suggereren dat Mdf1 dissocieert van het ribosoom met behulp van hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat een mogelijke verklaring biedt voor hoe het ribosoom Mdf1 verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Onze structuur onthulde echter een onbekend contact tussen Mdf1 en het L1-ribosoombeen (het deel van het ribosoom dat helpt bij het vrijmaken van gedeacyleerd tRNA uit het ribosoom tijdens eiwitsynthese).In het bijzonder gebruikt Mdf1 dezelfde contacten als het elleboogsegment van het gedeacyleerde tRNA-molecuul (Fig. 2).Deze eerder onbekende moleculaire modellering toonde aan dat Mdf1 dissocieert van het ribosoom met behulp van hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat verklaart hoe het ribosoom deze winterslaapfactor verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Bij het construeren van het rRNA-model ontdekten we dat het E. cuniculi-ribosoom abnormaal gevouwen rRNA-fragmenten heeft, die we gefuseerd rRNA noemden (Fig. 3).In ribosomen die de drie domeinen van het leven overspannen, vouwt rRNA zich tot structuren waarin de meeste rRNA-basen basen paren en met elkaar vouwen of een interactie aangaan met ribosomale eiwitten38,39,40.In E. cuniculi-ribosomen lijken rRNA's dit vouwprincipe echter te schenden door sommige van hun helices om te zetten in ongevouwen rRNA-gebieden.
Structuur van de H18 25S rRNA-helix in S. cerevisiae, V. necatrix en E. cuniculi.Typisch, in ribosomen die de drie levensdomeinen overspannen, rolt deze linker zich op tot een RNA-helix die 24 tot 34 residuen bevat.In Microsporidia wordt deze rRNA-linker daarentegen geleidelijk gereduceerd tot twee enkelstrengs uridine-rijke linkers die slechts 12 residuen bevatten.De meeste van deze residuen worden blootgesteld aan oplosmiddelen.De figuur laat zien dat parasitaire microsporidia de algemene principes van rRNA-vouwing lijken te schenden, waarbij rRNA-basen meestal gekoppeld zijn aan andere basen of betrokken zijn bij rRNA-eiwitinteracties.In microsporidia nemen sommige rRNA-fragmenten een ongunstige vouw aan, waarbij de voormalige rRNA-helix een enkelstrengs fragment wordt dat bijna in een rechte lijn langwerpig is.Door de aanwezigheid van deze ongebruikelijke regio's kan microsporidia-rRNA verre rRNA-fragmenten binden met behulp van een minimaal aantal RNA-basen.
Het meest opvallende voorbeeld van deze evolutionaire overgang is te zien in de H18 25S rRNA-helix (Fig. 3).Bij soorten van E. coli tot mensen bevatten de basen van deze rRNA-helix 24-32 nucleotiden, die een enigszins onregelmatige helix vormen.In eerder geïdentificeerde ribosomale structuren van V. necatrix en P. locustae,31,32 zijn de basen van de H18-helix gedeeltelijk ontrold, maar de nucleotide-basenparing blijft behouden.In E. cuniculi wordt dit rRNA-fragment echter de kortste linkers 228UUUGU232 en 301UUUUUUUUU307.In tegenstelling tot typische rRNA-fragmenten, rollen deze uridine-rijke linkers niet op en maken ze geen uitgebreid contact met ribosomale eiwitten.In plaats daarvan nemen ze oplosmiddel-open en volledig ontvouwde structuren aan waarin de rRNA-strengen bijna recht worden verlengd.Deze uitgerekte conformatie verklaart hoe E. cuniculi slechts 12 RNA-basen gebruikt om het gat van 33 Å tussen de H16- en H18-rRNA-helices te vullen, terwijl andere soorten minstens twee keer zoveel rRNA-basen nodig hebben om het gat te vullen.
We kunnen dus aantonen dat, door energetisch ongunstige vouwing, parasitaire microsporidia een strategie hebben ontwikkeld om zelfs die rRNA-segmenten samen te trekken die grotendeels geconserveerd blijven tussen soorten in de drie domeinen van het leven.Blijkbaar kan E. cuniculi, door mutaties te accumuleren die rRNA-helices transformeren in korte poly-U-linkers, ongebruikelijke rRNA-fragmenten vormen die zo min mogelijk nucleotiden bevatten voor ligatie van distale rRNA-fragmenten.Dit helpt verklaren hoe microsporidia een dramatische vermindering van hun moleculaire basisstructuur bereikten zonder hun structurele en functionele integriteit te verliezen.
Een ander ongebruikelijk kenmerk van E. cuniculi-rRNA is het verschijnen van rRNA zonder verdikkingen (fig. 4).Uitstulpingen zijn nucleotiden zonder basenparen die uit de RNA-helix draaien in plaats van erin te verstoppen.De meeste rRNA-uitsteeksels werken als moleculaire hechtmiddelen en helpen aangrenzende ribosomale eiwitten of andere rRNA-fragmenten te binden.Sommige uitstulpingen fungeren als scharnieren, waardoor de rRNA-helix optimaal kan buigen en vouwen voor productieve eiwitsynthese 41 .
a Een rRNA-uitsteeksel (S. cerevisiae-nummering) is afwezig in de ribosoomstructuur van E. cuniculi, maar is aanwezig in de meeste andere eukaryoten b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens en E. cuniculi interne ribosomen.parasieten missen veel van de oude, sterk geconserveerde rRNA-uitstulpingen.Deze verdikkingen stabiliseren de ribosoomstructuur;daarom duidt hun afwezigheid in microsporidia op een verminderde stabiliteit van rRNA-vouwing in microsporidia-parasieten.Vergelijking met P-stammen (L7/L12-stammen in bacteriën) laat zien dat het verlies van rRNA-bobbels soms samenvalt met het verschijnen van nieuwe bobbels naast de verdwenen bobbels.De H42-helix in het 23S/28S-rRNA heeft een oude uitstulping (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) die naar schatting minstens 3,5 miljard jaar oud is vanwege zijn bescherming in drie levensdomeinen.Bij microsporidia wordt deze uitstulping geëlimineerd.Er verscheen echter een nieuwe uitstulping naast de verloren uitstulping (A1306 in E. cuniculi).
Opvallend genoeg ontdekten we dat E. cuniculi-ribosomen de meeste rRNA-uitstulpingen missen die in andere soorten worden aangetroffen, waaronder meer dan 30 uitstulpingen die in andere eukaryoten zijn geconserveerd (Fig. 4a).Dit verlies elimineert veel contacten tussen ribosomale subeenheden en aangrenzende rRNA-helices, waardoor soms grote holle ruimtes in het ribosoom ontstaan, waardoor het E. cuniculi-ribosoom poreuzer wordt in vergelijking met meer traditionele ribosomen (Fig. 4b).We ontdekten met name dat de meeste van deze uitstulpingen ook verloren gingen in de eerder geïdentificeerde V. necatrix en P. locustae ribosoomstructuren, die over het hoofd werden gezien door eerdere structurele analyses31,32.
Soms gaat het verlies van rRNA-uitstulpingen gepaard met de ontwikkeling van nieuwe uitstulpingen naast de verloren uitstulping.De ribosomale P-stam bevat bijvoorbeeld een U1208-uitstulping (in Saccharomyces cerevisiae) die van E. coli op de mens is overgegaan en wordt daarom geschat op 3,5 miljard jaar oud.Tijdens de eiwitsynthese helpt deze uitstulping de P-stam te bewegen tussen open en gesloten conformaties, zodat het ribosoom translatiefactoren kan rekruteren en deze naar de actieve site kan brengen.In E. cuniculi ribosomen is deze verdikking afwezig;een nieuwe verdikking (G883) die zich alleen in drie basenparen bevindt, kan echter bijdragen aan het herstel van de optimale flexibiliteit van de P-stam (Fig. 4c).
Onze gegevens over rRNA zonder uitstulpingen suggereren dat rRNA-minimalisatie niet beperkt is tot het verlies van rRNA-elementen op het oppervlak van het ribosoom, maar ook de ribosoomkern kan omvatten, waardoor een parasietspecifiek moleculair defect ontstaat dat niet is beschreven in vrijlevende cellen.levende soorten worden waargenomen.
Na het modelleren van canonieke ribosomale eiwitten en rRNA, ontdekten we dat conventionele ribosomale componenten de drie delen van het cryo-EM-beeld niet kunnen verklaren.Twee van deze fragmenten zijn kleine moleculen (figuur 5, aanvullende figuur 8).Het eerste segment is ingeklemd tussen de ribosomale eiwitten uL15 en eL18 op een positie die gewoonlijk wordt ingenomen door de C-terminus van eL18, die is ingekort in E. cuniculi.Hoewel we de identiteit van dit molecuul niet kunnen bepalen, wordt de grootte en vorm van dit dichtheidseiland goed verklaard door de aanwezigheid van spermidinemoleculen.De binding aan het ribosoom wordt gestabiliseerd door microsporidia-specifieke mutaties in de uL15-eiwitten (Asp51 en Arg56), die de affiniteit van het ribosoom voor dit kleine molecuul lijken te vergroten, omdat ze uL15 in staat stellen het kleine molecuul in een ribosomale structuur te wikkelen.Aanvullende figuur 2).8, aanvullende gegevens 1, 2).
Cryo-EM-beeldvorming die de aanwezigheid van nucleotiden buiten de ribose gebonden aan het E. cuniculi-ribosoom laat zien.In het E. cuniculi-ribosoom neemt dit nucleotide dezelfde plaats in als het 25S rRNA A3186-nucleotide (Saccharomyces cerevisiae-nummering) in de meeste andere eukaryotische ribosomen.b In de ribosomale structuur van E. cuniculi bevindt dit nucleotide zich tussen de ribosomale eiwitten uL9 en eL20, waardoor het contact tussen de twee eiwitten wordt gestabiliseerd.cd eL20 sequentieconserveringsanalyse onder microsporidia-soorten.De fylogenetische boom van Microsporidia-soorten (c) en meervoudige sequentie-uitlijning van het eL20-eiwit (d) tonen aan dat nucleotide-bindende residuen F170 en K172 geconserveerd zijn in de meest typische Microsporidia, met uitzondering van S. lophii, met uitzondering van vroeg vertakkende Microsporidia, die de ES39L-rRNA-extensie behield.e Deze figuur laat zien dat nucleotide-bindende residuen F170 en K172 alleen aanwezig zijn in eL20 van het sterk gereduceerde microsporidia-genoom, maar niet in andere eukaryoten.Over het algemeen suggereren deze gegevens dat microsporidische ribosomen een nucleotide-bindingsplaats hebben ontwikkeld die AMP-moleculen lijkt te binden en deze gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in de ribosomale structuur te stabiliseren.De hoge conservering van deze bindingsplaats in Microsporidia en de afwezigheid ervan in andere eukaryoten suggereert dat deze plaats een selectief overlevingsvoordeel kan bieden voor Microsporidia.De nucleotide-bindende pocket in het microsporidia-ribosoom lijkt dus geen gedegenereerd kenmerk of eindvorm van rRNA-afbraak te zijn, zoals eerder beschreven, maar eerder een nuttige evolutionaire innovatie die het microsporidia-ribosoom in staat stelt om direct kleine moleculen te binden en ze als moleculaire bouwstenen te gebruiken.bouwstenen voor ribosomen.Deze ontdekking maakt het microsporidia-ribosoom het enige bekende ribosoom dat een enkele nucleotide als structurele bouwsteen gebruikt.f Hypothetische evolutionaire route afgeleid van nucleotidebinding.
De tweede dichtheid met laag molecuulgewicht bevindt zich op het grensvlak tussen ribosomale eiwitten uL9 en eL30 (Fig. 5a).Deze interface werd eerder beschreven in de structuur van het Saccharomyces cerevisiae-ribosoom als een bindingsplaats voor het 25S-nucleotide van rRNA A3186 (onderdeel van de ES39L rRNA-extensie)38.Er werd aangetoond dat in gedegenereerde P. locustae ES39L-ribosomen dit grensvlak een onbekende enkele nucleotide 31 bindt, en er wordt aangenomen dat dit nucleotide een gereduceerde uiteindelijke vorm van rRNA is, waarin de lengte van rRNA ~ 130-230 basen is.ES39L wordt gereduceerd tot een enkele nucleotide 32.43.Onze cryo-EM-afbeeldingen ondersteunen het idee dat dichtheid kan worden verklaard door nucleotiden.De hogere resolutie van onze structuur toonde echter aan dat dit nucleotide een extraribosomaal molecuul is, mogelijk AMP (Fig. 5a, b).
Vervolgens vroegen we of de nucleotide-bindingsplaats verscheen in het E. cuniculi-ribosoom of dat deze eerder bestond.Omdat nucleotidebinding voornamelijk wordt gemedieerd door de Phe170- en Lys172-residuen in het eL30-ribosomale eiwit, hebben we de conservering van deze residuen in 4396 representatieve eukaryoten beoordeeld.Zoals in het geval van uL15 hierboven, vonden we dat de Phe170- en Lys172-residuen alleen sterk geconserveerd zijn in typische Microsporidia, maar afwezig zijn in andere eukaryoten, waaronder atypische Microsporidia Mitosporidium en Amphiamblys, waarin het ES39L-rRNA-fragment niet is gereduceerd 44, 45, 46 (Fig. 5c).-e).
Alles bij elkaar ondersteunen deze gegevens het idee dat E. cuniculi en mogelijk andere canonieke microsporidia het vermogen hebben ontwikkeld om op efficiënte wijze grote aantallen kleine metabolieten in de ribosoomstructuur te vangen om de afname van rRNA- en eiwitniveaus te compenseren.Door dit te doen, hebben ze een uniek vermogen ontwikkeld om nucleotiden buiten het ribosoom te binden, wat aantoont dat parasitaire moleculaire structuren dit compenseren door overvloedige kleine metabolieten te vangen en ze te gebruiken als structurele nabootsers van afgebroken RNA- en eiwitfragmenten..
Het derde niet-gesimuleerde deel van onze cryo-EM-kaart, gevonden in de grote ribosomale subeenheid.De relatief hoge resolutie (2,6 Å) van onze kaart suggereert dat deze dichtheid toebehoort aan eiwitten met unieke combinaties van grote zijketenresiduen, waardoor we deze dichtheid konden identificeren als een eerder onbekend ribosomaal eiwit dat we identificeerden omdat het msL2 heette (Microsporidia-specifiek eiwit L2) (methoden, figuur 6).Ons homologieonderzoek toonde aan dat msL2 geconserveerd is in de Microsporidia-clade van het geslacht Encephaliter en Orosporidium, maar afwezig is in andere soorten, waaronder andere Microsporidia.In de ribosomale structuur neemt msL2 een opening in die wordt gevormd door het verlies van het verlengde ES31L-rRNA.In deze leegte helpt msL2 de rRNA-vouwing te stabiliseren en kan het het verlies van ES31L compenseren (Afbeelding 6).
een elektronendichtheid en model van het Microsporidia-specifieke ribosomale eiwit msL2 gevonden in E. cuniculi ribosomen.b Bij de meeste eukaryote ribosomen, waaronder het 80S-ribosoom van Saccharomyces cerevisiae, gaat ES19L-rRNA-amplificatie verloren bij de meeste Microsporidische soorten.De eerder vastgestelde structuur van het V. necatrix microsporidia ribosoom suggereert dat het verlies van ES19L in deze parasieten wordt gecompenseerd door de evolutie van het nieuwe msL1 ribosomale eiwit.In deze studie ontdekten we dat het E. cuniculi-ribosoom ook een extra ribosomaal RNA-nabootsend eiwit ontwikkelde als een schijnbare compensatie voor het verlies van ES19L.Echter, msL2 (momenteel geannoteerd als het hypothetische ECU06_1135-eiwit) en msL1 hebben verschillende structurele en evolutionaire oorsprong.c Deze ontdekking van het genereren van evolutionair niet-verwante msL1- en msL2-ribosomale eiwitten suggereert dat als ribosomen schadelijke mutaties in hun rRNA accumuleren, ze ongekende niveaus van samenstellingsdiversiteit kunnen bereiken in zelfs een kleine subset van nauw verwante soorten.Deze ontdekking zou kunnen helpen de oorsprong en evolutie van het mitochondriale ribosoom te verduidelijken, dat bekend staat om zijn sterk gereduceerde rRNA en abnormale variabiliteit in eiwitsamenstelling tussen soorten.
Vervolgens hebben we het msL2-eiwit vergeleken met het eerder beschreven msL1-eiwit, het enige bekende microsporidia-specifieke ribosomale eiwit dat wordt aangetroffen in het V. necatrix-ribosoom.We wilden testen of msL1 en msL2 evolutionair verwant zijn.Onze analyse toonde aan dat msL1 en msL2 dezelfde holte in de ribosomale structuur innemen, maar verschillende primaire en tertiaire structuren hebben, wat hun onafhankelijke evolutionaire oorsprong aangeeft (Fig. 6).Onze ontdekking van msL2 levert dus het bewijs dat groepen compacte eukaryote soorten onafhankelijk structureel verschillende ribosomale eiwitten kunnen ontwikkelen om het verlies van rRNA-fragmenten te compenseren.Deze bevinding is opmerkelijk omdat de meeste cytoplasmatische eukaryote ribosomen een onveranderlijk eiwit bevatten, waaronder dezelfde familie van 81 ribosomale eiwitten.Het verschijnen van msL1 en msL2 in verschillende clades van microsporidia als reactie op het verlies van uitgebreide rRNA-segmenten suggereert dat degradatie van de moleculaire architectuur van de parasiet ervoor zorgt dat parasieten compenserende mutaties zoeken, wat uiteindelijk kan leiden tot hun verwerving in verschillende parasietpopulaties.structuren.
Toen ons model ten slotte was voltooid, vergeleken we de samenstelling van het E. cuniculi-ribosoom met de samenstelling die werd voorspeld op basis van de genoomsequentie.Van verschillende ribosomale eiwitten, waaronder eL14, eL38, eL41 en eS30, werd eerder gedacht dat ze ontbraken in het E. cuniculi-genoom vanwege de schijnbare afwezigheid van hun homologen in het E. cuniculi-genoom.Verlies van veel ribosomale eiwitten wordt ook voorspeld bij de meeste andere sterk gereduceerde intracellulaire parasieten en endosymbionten.Hoewel de meeste vrijlevende bacteriën bijvoorbeeld dezelfde familie van 54 ribosomale eiwitten bevatten, hebben slechts 11 van deze eiwitfamilies detecteerbare homologen in elk geanalyseerd genoom van gastheer-beperkte bacteriën.Ter ondersteuning van dit idee is experimenteel een verlies van ribosomale eiwitten waargenomen in V. necatrix en P. locustae microsporidia, die de eL38- en eL4131,32-eiwitten missen.
Onze structuren laten echter zien dat alleen eL38, eL41 en eS30 daadwerkelijk verloren gaan in het E. cuniculi-ribosoom.Het eL14-eiwit was geconserveerd en onze structuur toonde aan waarom dit eiwit niet kon worden gevonden in het homologieonderzoek (Fig. 7).In E. cuniculi-ribosomen gaat het grootste deel van de eL14-bindingsplaats verloren als gevolg van afbraak van het met rRNA geamplificeerde ES39L.Bij afwezigheid van ES39L verloor eL14 het grootste deel van zijn secundaire structuur en was slechts 18% van de eL14-sequentie identiek in E. cuniculi en S. cerevisiae.Dit slechte behoud van de sequentie is opmerkelijk omdat zelfs Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens - organismen die 1,5 miljard jaar na elkaar zijn geëvolueerd - meer dan 51% van dezelfde residuen in eL14 delen.Dit abnormale verlies van conservering verklaart waarom E. cuniculi eL14 momenteel wordt geannoteerd als het vermeende M970_061160-eiwit en niet als het eL1427 ribosomale eiwit.
en het Microsporidia-ribosoom verloor de ES39L-rRNA-extensie, waardoor de eL14-ribosomale eiwitbindingsplaats gedeeltelijk werd geëlimineerd.Bij afwezigheid van ES39L ondergaat het eL14-microspore-eiwit een verlies van secundaire structuur, waarbij de voormalige rRNA-bindende α-helix degenereert tot een lus van minimale lengte.b Uitlijning van meerdere sequenties laat zien dat het eL14-eiwit sterk geconserveerd is in eukaryote soorten (57% sequentie-identiteit tussen homologen van gist en mens), maar slecht geconserveerd en divergerend in microsporidia (waarin niet meer dan 24% van de residuen identiek is aan de eL14-homoloog).van S. cerevisiae of H. sapiens).Deze slechte sequentiebehoud en secundaire structuurvariabiliteit verklaren waarom de eL14-homoloog nooit is gevonden in E. cuniculi en waarom wordt aangenomen dat dit eiwit verloren is gegaan in E. cuniculi.Daarentegen was E. cuniculi eL14 eerder geannoteerd als een vermeend M970_061160-eiwit.Deze waarneming suggereert dat de diversiteit van het microsporidia-genoom momenteel wordt overschat: sommige genen waarvan momenteel wordt aangenomen dat ze verloren zijn gegaan in microsporidia, zijn in feite bewaard gebleven, zij het in sterk gedifferentieerde vormen;in plaats daarvan wordt aangenomen dat sommigen coderen voor microsporidia-genen voor wormspecifieke eiwitten (bijv. het hypothetische eiwit M970_061160) dat feitelijk codeert voor de zeer diverse eiwitten die in andere eukaryoten worden aangetroffen.
Deze bevinding suggereert dat rRNA-denaturatie kan leiden tot een dramatisch verlies van sequentiebehoud in aangrenzende ribosomale eiwitten, waardoor deze eiwitten ondetecteerbaar worden voor homologieonderzoeken.We kunnen dus de werkelijke mate van moleculaire afbraak in kleine genoomorganismen overschatten, aangezien sommige eiwitten waarvan men dacht dat ze verloren waren, in feite blijven bestaan, zij het in sterk veranderde vormen.
Hoe kunnen parasieten de functie van hun moleculaire machines behouden onder omstandigheden van extreme genoomreductie?Onze studie beantwoordt deze vraag door de complexe moleculaire structuur (ribosoom) van E. cuniculi te beschrijven, een organisme met een van de kleinste eukaryote genomen.
Het is al bijna twee decennia bekend dat eiwit- en RNA-moleculen in microbiële parasieten vaak verschillen van hun homologe moleculen in vrijlevende soorten omdat ze geen centra voor kwaliteitscontrole hebben, gereduceerd zijn tot 50% van hun grootte in vrijlevende microben, enz. .veel slopende mutaties die vouwing en functie aantasten.Van de ribosomen van kleine genoomorganismen, waaronder veel intracellulaire parasieten en endosymbionten, wordt bijvoorbeeld verwacht dat ze verschillende ribosomale eiwitten en tot een derde van de rRNA-nucleotiden missen in vergelijking met vrijlevende soorten 27, 29, 30, 49. De manier waarop deze moleculen functioneren in parasieten blijft grotendeels een mysterie, voornamelijk bestudeerd door middel van vergelijkende genomica.
Onze studie toont aan dat de structuur van macromoleculen vele aspecten van evolutie kan onthullen die moeilijk te extraheren zijn uit traditionele vergelijkende genomische studies van intracellulaire parasieten en andere gastheer-beperkte organismen (aanvullende figuur 7).Het voorbeeld van het eL14-eiwit laat bijvoorbeeld zien dat we de werkelijke mate van afbraak van het moleculaire apparaat bij parasitaire soorten kunnen overschatten.Encephalitische parasieten worden nu verondersteld honderden microsporidia-specifieke genen te hebben.Onze resultaten laten echter zien dat sommige van deze ogenschijnlijk specifieke genen eigenlijk gewoon heel verschillende varianten zijn van genen die veel voorkomen in andere eukaryoten.Bovendien laat het voorbeeld van het msL2-eiwit zien hoe we nieuwe ribosomale eiwitten over het hoofd zien en de inhoud van parasitaire moleculaire machines onderschatten.Het voorbeeld van kleine moleculen laat zien hoe we de meest ingenieuze innovaties in parasitaire moleculaire structuren die hen nieuwe biologische activiteit kunnen geven, over het hoofd kunnen zien.
Alles bij elkaar genomen, verbeteren deze resultaten ons begrip van de verschillen tussen de moleculaire structuren van gastheer-beperkte organismen en hun tegenhangers in vrijlevende organismen.We laten zien dat moleculaire machines, waarvan lang werd gedacht dat ze gereduceerd, gedegenereerd en onderhevig aan verschillende slopende mutaties zijn, in plaats daarvan een reeks ongebruikelijke structurele kenmerken hebben die systematisch over het hoofd worden gezien.
Aan de andere kant suggereren de niet-omvangrijke rRNA-fragmenten en gefuseerde fragmenten die we vonden in de ribosomen van E. cuniculi dat genoomreductie zelfs die delen van de fundamentele moleculaire machinerie kan veranderen die bewaard zijn gebleven in de drie domeinen van het leven – na bijna 3,5 miljard jaar.onafhankelijke evolutie van soorten.
De uitstulpingsvrije en gefuseerde rRNA-fragmenten in E. cuniculi-ribosomen zijn van bijzonder belang in het licht van eerdere studies van RNA-moleculen in endosymbiotische bacteriën.In de bladluis endosymbiont Buchnera aphidicola is bijvoorbeeld aangetoond dat rRNA- en tRNA-moleculen temperatuurgevoelige structuren hebben als gevolg van A + T-samenstellingsbias en een groot deel van niet-canonieke basenparen .Deze veranderingen in RNA, evenals veranderingen in eiwitmoleculen, worden nu verondersteld verantwoordelijk te zijn voor de te grote afhankelijkheid van endosymbionten van partners en het onvermogen van endosymbionten om warmte over te dragen 21, 23.Hoewel parasitaire microsporidia-rRNA structureel verschillende veranderingen heeft, suggereert de aard van deze veranderingen dat verminderde thermische stabiliteit en grotere afhankelijkheid van chaperonne-eiwitten algemene kenmerken kunnen zijn van RNA-moleculen in organismen met gereduceerde genomen.
Aan de andere kant laten onze structuren zien dat microsporidia van parasieten een uniek vermogen hebben ontwikkeld om breed geconserveerde rRNA- en eiwitfragmenten te weerstaan, en het vermogen hebben ontwikkeld om overvloedige en gemakkelijk beschikbare kleine metabolieten te gebruiken als structurele nabootsingen van gedegenereerde rRNA- en eiwitfragmenten.Degradatie van de moleculaire structuur..Deze mening wordt ondersteund door het feit dat kleine moleculen die het verlies van eiwitfragmenten in het rRNA en ribosomen van E. cuniculi compenseren, binden aan microsporidia-specifieke residuen in de uL15- en eL30-eiwitten.Dit suggereert dat binding van kleine moleculen aan ribosomen een product kan zijn van positieve selectie, waarbij Microsporidia-specifieke mutaties in ribosomale eiwitten zijn geselecteerd vanwege hun vermogen om de affiniteit van ribosomen voor kleine moleculen te vergroten, wat kan leiden tot efficiëntere ribosomale organismen.De ontdekking onthult een slimme innovatie in de moleculaire structuur van microbiële parasieten en geeft ons een beter begrip van hoe moleculaire structuren van parasieten hun functie behouden ondanks reductieve evolutie.
Op dit moment blijft de identificatie van deze kleine moleculen onduidelijk.Het is niet duidelijk waarom het uiterlijk van deze kleine moleculen in de ribosomale structuur verschilt tussen microsporidia-soorten.Het is met name niet duidelijk waarom nucleotidebinding wordt waargenomen in de ribosomen van E. cuniculi en P. locustae, en niet in de ribosomen van V. necatrix, ondanks de aanwezigheid van het F170-residu in de eL20- en K172-eiwitten van V. necatrix.Deze deletie kan worden veroorzaakt door residu 43 uL6 (aangrenzend aan de nucleotide-bindende pocket), dat tyrosine is in V. necatrix en niet threonine in E. cuniculi en P. locustae.De omvangrijke aromatische zijketen van Tyr43 kan de nucleotidebinding verstoren vanwege sterische overlap.Als alternatief kan de schijnbare nucleotide-deletie het gevolg zijn van de lage resolutie van cryo-EM-beeldvorming, die de modellering van V. necatrix ribosomale fragmenten belemmert.
Aan de andere kant suggereert ons werk dat het proces van genoomverval een inventieve kracht kan zijn.Met name de structuur van het E. cuniculi-ribosoom suggereert dat het verlies van rRNA- en eiwitfragmenten in het microsporidia-ribosoom een ​​evolutionaire druk creëert die veranderingen in de ribosoomstructuur bevordert.Deze varianten komen ver van de actieve plaats van het ribosoom voor en lijken te helpen bij het behouden (of herstellen) van een optimale ribosoomassemblage die anders zou worden verstoord door gereduceerd rRNA.Dit suggereert dat een belangrijke innovatie van het microsporidia-ribosoom lijkt te zijn geëvolueerd tot een behoefte om gene drift te bufferen.
Misschien wordt dit het best geïllustreerd door nucleotidebinding, die tot nu toe nog nooit in andere organismen is waargenomen.Het feit dat nucleotide-bindende residuen aanwezig zijn in typische microsporidia, maar niet in andere eukaryoten, suggereert dat nucleotide-bindingsplaatsen niet alleen relikwieën zijn die wachten om te verdwijnen, of de laatste plaats voor rRNA om te worden hersteld in de vorm van individuele nucleotiden.In plaats daarvan lijkt deze site een handige functie die zich had kunnen ontwikkelen tijdens verschillende rondes van positieve selectie.Nucleotidebindingsplaatsen kunnen een bijproduct zijn van natuurlijke selectie: zodra ES39L is afgebroken, worden microsporidia gedwongen compensatie te zoeken om optimale ribosoombiogenese te herstellen in afwezigheid van ES39L.Aangezien dit nucleotide de moleculaire contacten van het A3186-nucleotide in ES39L kan nabootsen, wordt het nucleotidemolecuul een bouwsteen van het ribosoom, waarvan de binding verder wordt verbeterd door mutatie van de eL30-sequentie.
Met betrekking tot de moleculaire evolutie van intracellulaire parasieten laat onze studie zien dat de krachten van darwinistische natuurlijke selectie en genetische drift van genoomverval niet parallel werken, maar oscilleren.Ten eerste elimineert genetische drift belangrijke kenmerken van biomoleculen, waardoor compensatie hard nodig is.Alleen wanneer parasieten door middel van darwinistische natuurlijke selectie aan deze behoefte voldoen, krijgen hun macromoleculen de kans om hun meest indrukwekkende en innovatieve eigenschappen te ontwikkelen.Belangrijk is dat de evolutie van nucleotidebindingsplaatsen in het ribosoom van E. cuniculi suggereert dat dit verlies-voor-winstpatroon van moleculaire evolutie niet alleen schadelijke mutaties afschrijft, maar soms geheel nieuwe functies toekent aan parasitaire macromoleculen.
Dit idee komt overeen met de bewegende evenwichtstheorie van Sewell Wright, die stelt dat een strikt systeem van natuurlijke selectie het vermogen van organismen om te innoveren beperkt51,52,53.Als genetische drift natuurlijke selectie verstoort, kunnen deze driften echter veranderingen teweegbrengen die op zichzelf niet adaptief (of zelfs schadelijk) zijn, maar leiden tot verdere veranderingen die zorgen voor een hogere fitheid of nieuwe biologische activiteit.Ons raamwerk ondersteunt dit idee door te illustreren dat hetzelfde type mutatie dat de vouw en functie van een biomolecuul vermindert, de belangrijkste trigger lijkt te zijn voor de verbetering ervan.In overeenstemming met het win-win-evolutionaire model laat ons onderzoek zien dat genoomverval, traditioneel gezien als een degeneratief proces, ook een belangrijke aanjager van innovatie is, waardoor macromoleculen soms en misschien zelfs vaak nieuwe parasitaire activiteiten kunnen verwerven.kan ze gebruiken.