Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Onlangs is een chemievrij antimicrobieel platform ontwikkeld op basis van nanotechnologie met kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS hebben een hoge oppervlaktelading en zijn verzadigd met reactieve zuurstofsoorten (ROS) die kunnen interageren met een aantal micro-organismen, waaronder door voedsel overgedragen pathogenen, en deze kunnen inactiveren. Hier wordt aangetoond dat hun eigenschappen tijdens de synthese kunnen worden verfijnd en geoptimaliseerd om hun antibacteriële potentieel verder te verbeteren. Het EWNS-laboratoriumplatform is ontworpen om de eigenschappen van EWNS te verfijnen door de syntheseparameters te wijzigen. Karakterisering van EWNS-eigenschappen (lading, grootte en ROS-gehalte) met behulp van moderne analytische methoden. Daarnaast werden ze geëvalueerd op hun microbieel inactivatiepotentieel tegen door voedsel overgedragen micro-organismen zoals Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum en Saccharomyces cerevisiae. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat de eigenschappen van EWNS tijdens de synthese kunnen worden verfijnd, wat resulteert in een exponentiële toename van de inactivatie-efficiëntie. Met name de oppervlaktelading nam met een factor vier toe en de hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten nam toe. De microbiële verwijderingssnelheid was microbieel afhankelijk en varieerde van 1,0 tot 3,8 log na 45 minuten blootstelling aan een aerosoldosis van 40.000 #/cc EWNS.
Microbiële besmetting is de belangrijkste oorzaak van door voedsel overgedragen ziekten die worden veroorzaakt door de inname van ziekteverwekkers of hun toxines. Alleen al in de Verenigde Staten veroorzaakt door voedsel overgedragen ziekten jaarlijks ongeveer 76 miljoen ziekten, 325.000 ziekenhuisopnames en 5.000 sterfgevallen1. Daarnaast schat het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) dat de toegenomen consumptie van verse producten verantwoordelijk is voor 48% van alle gemelde door voedsel overgedragen ziekten in de Verenigde Staten2. De kosten van ziekte en sterfte veroorzaakt door door voedsel overgedragen pathogenen in de Verenigde Staten zijn zeer hoog en worden door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) geschat op meer dan 15,6 miljard dollar per jaar3.
Momenteel worden chemische4, straling5 en thermische6 antimicrobiële interventies om de voedselveiligheid te waarborgen meestal uitgevoerd op beperkte kritische controlepunten (CCP's) in de productieketen (meestal na de oogst en/of tijdens het verpakken) in plaats van continu. Daardoor zijn ze gevoelig voor kruisbesmetting. 7. Voor een betere bestrijding van door voedsel overgedragen ziekten en voedselbederf zijn antimicrobiële interventies nodig die potentieel kunnen worden toegepast in het hele proces van boer tot bord, terwijl de milieu-impact en kosten worden verminderd.
Onlangs is een chemievrij, op nanotechnologie gebaseerd antimicrobieel platform ontwikkeld dat bacteriën op het oppervlak en in de lucht kan inactiveren met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS werd gesynthetiseerd met behulp van twee parallelle processen: elektrospray en waterionisatie (Fig. 1a). Eerdere studies hebben aangetoond dat EWNS een unieke set fysische en biologische eigenschappen hebben8,9,10. EWNS hebben gemiddeld 10 elektronen per structuur en een gemiddelde nanoschaalgrootte van 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Bovendien toonde elektronenspinresonantie (ESR) aan dat EWNS een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS) bevat, voornamelijk hydroxyl (OH•) en superoxide (O2-) radicalen (Fig. 1c)8. EWNS bevindt zich lange tijd in de lucht en kan botsen met in de lucht zwevende en op het oppervlak aanwezige micro-organismen, waardoor hun ROS-lading wordt afgegeven en de micro-organismen worden geïnactiveerd (Fig. 1d). Deze vroege studies toonden ook aan dat EWNS kan interageren met en verschillende gramnegatieve en grampositieve bacteriën, waaronder mycobacteriën, op oppervlakken en in de lucht kan inactiveren. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat de inactivering werd veroorzaakt door verstoring van het celmembraan. Bovendien hebben acute inhalatiestudies aangetoond dat hoge doses EWNS geen longschade of -ontsteking veroorzaken 8 .
(a) Elektrospray treedt op wanneer een hoge spanning wordt aangelegd tussen een capillaire buis met vloeistof en een tegenelektrode. (b) Het aanleggen van hoge druk resulteert in twee verschillende verschijnselen: (i) elektrospraying van water en (ii) vorming van reactieve zuurstofsoorten (ionen) die in het EWNS worden gevangen. (c) De unieke structuur van EWNS. (d) Vanwege hun nanoschaalachtige aard zijn EWNS zeer mobiel en kunnen ze interacteren met in de lucht zwevende ziekteverwekkers.
Het vermogen van het antimicrobiële EWNS-platform om door voedsel overgedragen micro-organismen op het oppervlak van vers voedsel te inactiveren, is recentelijk ook aangetoond. Ook is aangetoond dat de oppervlaktelading van EWNS in combinatie met een elektrisch veld kan worden gebruikt om gerichte afgifte te bereiken. Bovendien waren de voorlopige resultaten voor biologische tomaten na een blootstelling van 90 minuten aan een EWNS van ongeveer 50.000 #/cm3 bemoedigend, waarbij verschillende door voedsel overgedragen micro-organismen zoals E. coli en Listeria 11 werden waargenomen. Bovendien lieten voorlopige organoleptische tests geen sensorische effecten zien in vergelijking met controletomaten. Hoewel deze initiële inactiveringsresultaten bemoedigend zijn voor toepassingen in de voedselveiligheid, zelfs bij zeer lage EWNS-doses van 50.000 #/cc, is het duidelijk dat een hoger inactivatiepotentieel gunstiger zou zijn om het risico op infectie en bederf verder te verminderen.
We richten ons onderzoek hier op de ontwikkeling van een EWNS-generatieplatform om de syntheseparameters nauwkeurig af te stemmen en de fysisch-chemische eigenschappen van EWNS te optimaliseren en zo hun antibacteriële potentieel te vergroten. Optimalisatie is met name gericht op het verhogen van hun oppervlaktelading (om de gerichte afgifte te verbeteren) en ROS-gehalte (om de inactiveringsefficiëntie te verbeteren). Karakteriseer geoptimaliseerde fysisch-chemische eigenschappen (grootte, lading en ROS-gehalte) met behulp van moderne analytische methoden en maak gebruik van veelvoorkomende voedselmicro-organismen zoals E. .
EVNS werd gesynthetiseerd door gelijktijdige elektrospraying en ionisatie van zeer zuiver water (18 MΩ cm–1). De elektrische vernevelaar 12 wordt doorgaans gebruikt voor het vernevelen van vloeistoffen en de synthese van polymeer- en keramische deeltjes 13 en vezels 14 van gecontroleerde grootte.
Zoals beschreven in eerdere publicaties 8, 9, 10, 11, werd in een typisch experiment een hoge spanning aangelegd tussen een metalen capillair en een geaarde tegenelektrode. Tijdens dit proces treden twee verschillende verschijnselen op: i) elektrospray en ii) waterionisatie. Een sterk elektrisch veld tussen de twee elektroden zorgt ervoor dat negatieve ladingen zich ophopen op het oppervlak van het gecondenseerde water, wat resulteert in de vorming van Taylor-kegels. Hierdoor worden sterk geladen waterdruppels gevormd, die verder uiteenvallen in kleinere deeltjes, zoals in de Rayleigh-theorie16. Tegelijkertijd zorgen sterke elektrische velden ervoor dat sommige watermoleculen zich splitsen en elektronen afstoten (ioniseren), wat leidt tot de vorming van een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS)17. De gelijktijdig gegenereerde ROS18 werd ingekapseld in EWNS (Fig. 1c).
Figuur 2a toont het EWNS-generatiesysteem dat is ontwikkeld en gebruikt in de EWNS-synthese in deze studie. Gezuiverd water, opgeslagen in een gesloten fles, werd via een teflonbuis (binnendiameter 2 mm) in een 30G roestvrijstalen naald (metalen capillair) geleid. De waterstroom wordt geregeld door de luchtdruk in de fles, zoals weergegeven in figuur 2b. De naald is gemonteerd op een teflonconsole en kan handmatig worden ingesteld op een bepaalde afstand van de tegenelektrode. De tegenelektrode is een gepolijste aluminium schijf met een gat in het midden voor bemonstering. Onder de tegenelektrode bevindt zich een aluminium bemonsteringsbuis, die via een bemonsteringspoort is verbonden met de rest van de experimentele opstelling (figuur 2b). Om ladingsopbouw te voorkomen die de werking van de sampler zou kunnen verstoren, zijn alle componenten van de sampler elektrisch geaard.
(a) Engineered Water Nanostructure Generation System (EWNS). (b) Dwarsdoorsnede van de sampler en elektrospray, met de belangrijkste parameters. (c) Experimentele opstelling voor bacterie-inactivering.
Het hierboven beschreven EWNS-generatiesysteem kan belangrijke bedrijfsparameters wijzigen om de fijnafstemming van de EWNS-eigenschappen te vergemakkelijken. Pas de aangelegde spanning (V), de afstand tussen de naald en de tegenelektrode (L) en de waterstroom (φ) door het capillair aan om de EWNS-karakteristieken nauwkeurig af te stemmen. Het symbool dat wordt gebruikt om verschillende combinaties weer te geven, is: [V (kV), L (cm)]. Pas de waterstroom aan om een ​​stabiele Taylor-kegel van een bepaalde set te verkrijgen [V, L]. Voor deze studie werd de diameter van de opening van de tegenelektrode (D) op 0,5 inch (1,29 cm) gehouden.
Vanwege de beperkte geometrie en asymmetrie kan de elektrische veldsterkte niet worden berekend op basis van basisprincipes. In plaats daarvan werd de QuickField™-software (Svendborg, Denemarken)19 gebruikt om het elektrische veld te berekenen. Het elektrische veld is niet uniform, dus de waarde van het elektrische veld aan de punt van de capillair werd gebruikt als referentiewaarde voor verschillende configuraties.
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd op basis van Taylor-conusvorming, Taylor-conusstabiliteit, EWNS-productiestabiliteit en reproduceerbaarheid. Verschillende combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1.
De uitgang van het EWNS-generatiesysteem werd rechtstreeks aangesloten op een Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) voor het meten van de deeltjesaantalconcentratie, en op een Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) voor aerosolstromen werd gemeten zoals beschreven in onze vorige publicatie. Zowel de SMPS als de aerosolelektrometer bemonsterden met een stroomsnelheid van 0,5 l/min (totale monsterstroom 1 l/min). De deeltjesconcentratie en de aerosolstroom werden gedurende 120 seconden gemeten. De meting wordt 30 keer herhaald. Op basis van stroommetingen wordt de totale aerosollading berekend en wordt de gemiddelde EWNS-lading geschat voor een gegeven totaal aantal geselecteerde EWNS-deeltjes. De gemiddelde kosten van EWNS kunnen worden berekend met behulp van vergelijking (1):
waarbij IEl de gemeten stroom is, NSMPS de digitale concentratie die met de SMPS is gemeten en φEl de stroomsnelheid per elektrometer is.
Omdat de relatieve vochtigheid (RV) de oppervlaktelading beïnvloedt, werden de temperatuur en de RV tijdens het experiment constant gehouden op respectievelijk 21°C en 45%.
Atoomkrachtmicroscopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) en de AC260T-sonde (Olympus, Tokio, Japan) werden gebruikt om de grootte en levensduur van het EWNS te meten. De AFM-scanfrequentie was 1 Hz, het scangebied was 5 μm × 5 μm en er waren 256 scanlijnen. Alle beelden werden onderworpen aan een eerste-orde-beelduitlijning met behulp van Asylum-software (maskerbereik 100 nm, drempelwaarde 100 pm).
De testtrechter werd verwijderd en het mica-oppervlak werd gedurende een middelingstijd van 120 seconden op een afstand van 2,0 cm van de tegenelektrode geplaatst om deeltjesagglomeratie en de vorming van onregelmatige druppels op het mica-oppervlak te voorkomen. EWNS werd direct op het oppervlak van vers gesneden mica gespoten (Ted Pella, Redding, CA). Afbeelding van het mica-oppervlak direct na AFM-sputteren. De contacthoek van het oppervlak van vers gesneden, ongemodificeerd mica is bijna 0°, waardoor EVNS in de vorm van een koepel over het mica-oppervlak wordt verdeeld. De diameter (a) en hoogte (h) van de diffunderende druppels werden rechtstreeks gemeten vanuit de AFM-topografie en gebruikt om het koepelvormige diffusievolume van EWNS te berekenen met behulp van onze eerder gevalideerde methode. Ervan uitgaande dat de EWNS aan boord hetzelfde volume hebben, kan de equivalente diameter worden berekend met behulp van vergelijking (2):
Gebaseerd op onze eerder ontwikkelde methode werd een elektronenspinresonantie (ESR) spinval gebruikt om de aanwezigheid van kortlevende radicaalintermediairen in EWNS te detecteren. Aerosolen werden door een 650 μm Midget-sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) geleid die een 235 mM oplossing bevatte van DEPMPO(5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Alle ESR-metingen werden uitgevoerd met een Bruker EMX-spectrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) en een flatpanelcel. De Acquisit-software (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) werd gebruikt om de gegevens te verzamelen en te analyseren. De ROS-karakteristieken werden alleen bepaald voor een reeks bedrijfsomstandigheden [-6,5 kV, 4,0 cm]. De EWNS-concentraties werden gemeten met behulp van de SMPS, rekening houdend met de EWNS-verliezen in het inslaglichaam.
De ozonniveaus werden gecontroleerd met een 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Voor alle EWNS-eigenschappen wordt de gemiddelde waarde als meetwaarde gebruikt en de standaarddeviatie als meetfout. Er zijn t-tests uitgevoerd om de waarden van de geoptimaliseerde EWNS-kenmerken te vergelijken met de overeenkomstige waarden van de basis-EWNS.
Figuur 2c toont een eerder ontwikkeld en gekarakteriseerd elektrostatische precipitatie (EPES) "trek"-systeem dat kan worden gebruikt voor gerichte afgifte van EWNS aan het oppervlak. EPES maakt gebruik van EVNS-ladingen die direct naar het oppervlak van het doelwit kunnen worden "geleid" onder invloed van een sterk elektrisch veld. Details van het EPES-systeem worden gepresenteerd in een recente publicatie van Pyrgiotakis et al. 11 . EPES bestaat dus uit een 3D-geprinte PVC-kamer met taps toelopende uiteinden en bevat twee parallelle roestvrijstalen (304 roestvrij staal, spiegelgecoate) metalen platen in het midden op een afstand van 15,24 cm van elkaar. De platen werden verbonden met een externe hoogspanningsbron (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), de onderste plaat werd altijd verbonden met positieve spanning en de bovenste plaat werd altijd verbonden met aarde (zwevende aarde). De kamerwanden zijn bedekt met aluminiumfolie, dat elektrisch is geaard om deeltjesverlies te voorkomen. De kamer heeft een afgesloten voordeur waardoor testoppervlakken op kunststof standaards kunnen worden geplaatst. Hierdoor liggen ze boven de onderste metalen plaat en wordt interferentie door hoge spanning voorkomen.
De depositie-efficiëntie van EWNS in EPES werd berekend volgens een eerder ontwikkeld protocol dat gedetailleerd is beschreven in aanvullende figuur S111.
Als controlekamer werd een tweede cilindrische stromingskamer in serie aangesloten op het EPES-systeem, waarin een tussenliggend HEPA-filter werd gebruikt om EWNS te verwijderen. Zoals weergegeven in figuur 2c, werd de EWNS-aerosol door twee ingebouwde kamers gepompt. Het filter tussen de controlekamer en EPES verwijdert alle resterende EWNS, wat resulteert in dezelfde temperatuur (T), relatieve vochtigheid (RV) en ozonconcentraties.
Er is vastgesteld dat belangrijke door voedsel overgedragen micro-organismen verse voedingsmiddelen besmetten, zoals E. coli (ATCC #27325), fecale indicator Salmonella enterica (ATCC #53647), door voedsel overgedragen pathogeen Listeria harmless (ATCC #33090), surrogaat voor pathogene Listeria monocytogenes, afgeleid van ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), een vervanger voor bederfgist en een resistentere geïnactiveerde bacterie, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Koop willekeurige dozen biologische cherrytomaten bij de lokale supermarkt en bewaar ze in de koelkast bij 4 °C tot gebruik (maximaal 3 dagen). De proeftomaten waren allemaal even groot, ongeveer 1,25 cm in diameter.
De protocollen voor cultuur, inoculatie, blootstelling en kolonietelling worden gedetailleerd beschreven in onze vorige publicatie en in de aanvullende gegevens. De effectiviteit van EWNS werd geëvalueerd door geënte tomaten gedurende 45 minuten bloot te stellen aan 40.000 #/cm3. Kort gezegd werden drie tomaten gebruikt om de overlevende micro-organismen op tijdstip t = 0 min te evalueren. Drie tomaten werden in EPES geplaatst en blootgesteld aan EWNS met 40.000 #/cc (EWNS-belichte tomaten) en de resterende drie werden in de controlekamer geplaatst (controletomaten). Er werd geen verdere verwerking van de tomaten in beide groepen uitgevoerd. Aan EWNS blootgestelde tomaten en controletomaten werden na 45 minuten verwijderd om het effect van EWNS te evalueren.
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De data-analyse werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in de aanvullende gegevens.
Inactiveringsmechanismen werden beoordeeld door sedimentatie van blootgestelde EWNS-monsters (45 min bij een EWNS-aerosolconcentratie van 40.000 #/cm3) en niet-bestraalde monsters van onschadelijke bacteriën zoals E. coli, Salmonella enterica en Lactobacillus. De deeltjes werden gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde en 0,03% picrinezuur in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na het wassen, postfixeer met 1% osmiumtetroxide (OsO4)/1,5% kaliumferrocyanide (KFeCN6) gedurende 2 uur, was 3 keer in water en incubeer 1 uur in 1% uranylacetaat, was vervolgens tweemaal in water en dehydrateer vervolgens gedurende 10 minuten in 50%, 70%, 90% en 100% alcohol. De monsters werden vervolgens 1 uur in propyleenoxide geplaatst en geïmpregneerd met een 1:1-mengsel van propyleenoxide en TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). De monsters werden ingebed in TAAB Epon en 48 uur gepolymeriseerd bij 60 °C. De uitgeharde korrelige hars werd gesneden en gevisualiseerd met behulp van TEM met behulp van een conventionele transmissie-elektronenmicroscoop JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), uitgerust met een AMT 2k CCD-camera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, VS).
Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Voor elk meetpunt werden bacteriële wasbeurten in drievoud uitgevoerd, wat resulteerde in een totaal van negen datapunten per punt. Het gemiddelde hiervan werd gebruikt als de bacteriële concentratie voor dat specifieke micro-organisme. De standaarddeviatie werd gebruikt als meetfout. Alle punten tellen mee.
De logaritme van de afname van de concentratie bacteriën ten opzichte van t = 0 min werd berekend met behulp van de volgende formule:
waarbij C0 de concentratie van bacteriën in het controlemonster op tijdstip 0 is (d.w.z. nadat het oppervlak is gedroogd, maar voordat het in de kamer wordt geplaatst) en Cn de concentratie van bacteriën op het oppervlak na n minuten blootstelling.
Om rekening te houden met de natuurlijke afbraak van bacteriën tijdens de blootstelling van 45 minuten, werd de logreductie ten opzichte van de controle na 45 minuten ook als volgt berekend:
waarbij Cn de concentratie bacteriën in het controlemonster is op tijdstip n en Cn-Control de concentratie van controlebacteriën op tijdstip n. De gegevens worden weergegeven als een logaritmische reductie ten opzichte van de controle (geen blootstelling aan EWNS).
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd op basis van Taylor-kegelvorming, Taylor-kegelstabiliteit, EWNS-productiestabiliteit en reproduceerbaarheid. Verschillende combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1. Twee gevallen met stabiele en reproduceerbare eigenschappen (Taylor-kegel, EWNS-generatie en stabiliteit in de tijd) werden geselecteerd voor een uitgebreide studie. In fig. 3 worden de resultaten weergegeven voor de lading, grootte en het ROS-gehalte in beide gevallen. De resultaten worden ook samengevat in tabel 1. Ter referentie bevatten zowel afbeelding 3 als tabel 1 de eigenschappen van de eerder gesynthetiseerde, niet-geoptimaliseerde EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Statistische significantieberekeningen met behulp van een tweezijdige t-toets worden opnieuw gepubliceerd in aanvullende tabel S2. Daarnaast omvatten aanvullende gegevens studies naar het effect van de diameter (D) van het bemonsteringsgat van de tegenelektrode en de afstand tussen de aardelektrode en de punt (L) (aanvullende figuren S2 en S3).
(ac) Grootteverdeling gemeten door AFM. (df) Oppervlakteladingskarakteristiek. (g) ROS-karakterisering van de EPR.
Het is ook belangrijk om op te merken dat onder alle bovenstaande omstandigheden de gemeten ionisatiestroom tussen 2 en 6 μA lag en de spanning tussen -3,8 en -6,5 kV, wat resulteerde in een stroomverbruik van minder dan 50 mW voor deze enkele EWNS-generatiecontactmodule. Hoewel EWNS onder hoge druk werd gesynthetiseerd, waren de ozonniveaus zeer laag en kwamen ze nooit boven de 60 ppb uit.
Aanvullende figuur S4 toont de gesimuleerde elektrische velden voor respectievelijk de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Voor de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] bedragen de veldberekeningen respectievelijk 2 × 105 V/m en 4,7 × 105 V/m. Dit is te verwachten, aangezien in het tweede geval de spanning-afstandsverhouding veel groter is.
Figuur 3a en b tonen de EWNS-diameter gemeten met de AFM8. De berekende gemiddelde EWNS-diameters waren respectievelijk 27 nm en 19 nm voor de [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] schema's. Voor de [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] scenario's zijn de geometrische standaarddeviaties van de verdelingen respectievelijk 1,41 en 1,45, wat wijst op een smalle grootteverdeling. Zowel de gemiddelde grootte als de geometrische standaarddeviatie liggen zeer dicht bij de basislijn-EWNS, respectievelijk 25 nm en 1,41. Figuur 3c toont de grootteverdeling van de basis-EWNS, gemeten met dezelfde methode en onder dezelfde omstandigheden.
Figuur 3d toont de resultaten van de ladingskarakterisering. De gegevens zijn gemiddelde metingen van 30 gelijktijdige concentratiemetingen (#/cm3) en stroomsterkte (I). De analyse laat zien dat de gemiddelde lading op de EWNS 22 ± 6 e- en 44 ± 6 e- bedraagt ​​voor respectievelijk [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Ze hebben significant hogere oppervlakteladingen vergeleken met de baseline EWNS (10 ± 2 e-), twee keer hoger dan het [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenario en vier keer hoger dan het [-3,8 kV, 0,5 cm]. Figuur 3f toont de ladingsgegevens voor de baseline-EWNS.
Uit de concentratiekaarten van het EWNS-getal (aanvullende figuren S5 en S6) blijkt dat het [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenario aanzienlijk meer deeltjes bevat dan het [-3,8 kV, 0,5 cm]-scenario. Het is ook vermeldenswaard dat de concentratie van het EWNS-getal tot 4 uur lang werd gemonitord (aanvullende figuren S5 en S6), waarbij de stabiliteit van de EWNS-generatie in beide gevallen dezelfde concentratieniveaus van deeltjesaantallen liet zien.
Figuur 3g toont het EPR-spectrum na aftrek van de geoptimaliseerde EWNS-controle (achtergrond) bij [-6,5 kV, 4,0 cm]. De ROS-spectra werden ook vergeleken met het Baseline-EWNS-scenario in een eerder gepubliceerd werk. Het aantal EWNS-deeltjes dat reageert met spintraps werd berekend op 7,5 × 104 EWNS/s, wat vergelijkbaar is met de eerder gepubliceerde Baseline-EWNS8. De EPR-spectra toonden duidelijk de aanwezigheid van twee soorten ROS aan, waarbij O₂- de overheersende soort was en OH₂ minder talrijk. Bovendien toonde een directe vergelijking van de piekintensiteiten aan dat de geoptimaliseerde EWNS een significant hoger ROS-gehalte had in vergelijking met de baseline-EWNS.
Figuur 4 toont de depositie-efficiëntie van EWNS in EPES. De gegevens zijn ook samengevat in Tabel I en vergeleken met de originele EWNS-gegevens. Voor beide gevallen van EUNS is de depositie bijna 100%, zelfs bij een lage spanning van 3,0 kV. Doorgaans is 3,0 kV voldoende voor 100% depositie, ongeacht de verandering in de oppervlaktelading. Onder dezelfde omstandigheden bedroeg de depositie-efficiëntie van Baseline-EWNS slechts 56% vanwege hun lagere lading (gemiddeld 10 elektronen per EWNS).
Figuur 5 en tabel 2 geven een samenvatting van de inactiveringswaarde van micro-organismen die op het oppervlak van tomaten zijn geïnoculeerd na blootstelling aan ongeveer 40.000 #/cm3 EWNS gedurende 45 minuten in de optimale modus [-6,5 kV, 4,0 cm]. Geïnoculeerde E. coli en Lactobacillus innocuous vertoonden een significante afname van 3,8 log gedurende de blootstelling van 45 minuten. Onder dezelfde omstandigheden vertoonde S. enterica een afname van 2,2 log, terwijl S. cerevisiae en M. parafortutum een ​​afname van 1,0 log vertoonden.
De elektronenmicroscoopfoto's (figuur 6) tonen de fysieke veranderingen die EWNS veroorzaakt in onschadelijke cellen van Escherichia coli, Streptococcus en Lactobacillus, wat leidt tot hun inactivering. De controlebacteriën hadden intacte celmembranen, terwijl de blootgestelde bacteriën beschadigde buitenmembranen hadden.
Elektronenmicroscopische beeldvorming van de controlebacteriën en de blootgestelde bacteriën toonde schade aan het membraan.
De gegevens over de fysisch-chemische eigenschappen van de geoptimaliseerde EWNS laten gezamenlijk zien dat de eigenschappen (oppervlaktelading en ROS-gehalte) van de EWNS aanzienlijk verbeterd zijn in vergelijking met de eerder gepubliceerde EWNS-basisgegevens8,9,10,11. Aan de andere kant bleef hun grootte in het nanometerbereik, zeer vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde resultaten, waardoor ze lange tijd in de lucht konden blijven. De waargenomen polydispersiteit kan worden verklaard door veranderingen in de oppervlaktelading die de grootte van EWNS bepalen, de willekeur van het Rayleigh-effect en potentiële coalescentie. Zoals echter gedetailleerd door Nielsen et al.22, vermindert een hoge oppervlaktelading de verdamping door de oppervlakte-energie/-spanning van de waterdruppel effectief te verhogen. In onze vorige publicatie8 werd deze theorie experimenteel bevestigd voor microdruppels22 en EWNS. Verlies van lading gedurende de loop van de tijd kan ook de grootte beïnvloeden en bijdragen aan de waargenomen grootteverdeling.
Bovendien bedraagt ​​de lading per structuur ongeveer 22-44 e-, afhankelijk van de situatie, wat aanzienlijk hoger is dan bij de basis-EWNS, die een gemiddelde lading heeft van 10 ± 2 elektronen per structuur. Opgemerkt dient echter te worden dat dit de gemiddelde lading van EWNS is. Seto et al. hebben aangetoond dat de lading inhomogeen is en een lognormale verdeling volgt21. Vergeleken met ons eerdere werk verdubbelt een verdubbeling van de oppervlaktelading de depositie-efficiëntie in het EPES-systeem tot bijna 100%11.