Sommige onderwerpen voor het oplossen van problemen met LC zijn nooit achterhaald, aangezien er problemen zijn in de LC-praktijk, zelfs als de instrumenttechnologie in de loop van de tijd verbetert. Er zijn veel manieren waarop problemen kunnen ontstaan ​​in een LC-systeem en eindigen in een slechte vorm van de piek. Wanneer zich problemen voordoen met betrekking tot de vorm van de piek, helpt een korte lijst met mogelijke oorzaken voor deze resultaten onze ervaring met het oplossen van problemen te vereenvoudigen.
Het was leuk om deze kolom "LC-probleemoplossing" te schrijven en elke maand over onderwerpen na te denken, omdat sommige onderwerpen nooit uit de mode raken. Terwijl op het gebied van chromatografieonderzoek bepaalde onderwerpen of ideeën achterhaald raken omdat ze worden vervangen door nieuwere en betere ideeën, op het gebied van probleemoplossing, sinds het eerste artikel over probleemoplossing verscheen in dit tijdschrift (destijds het LC Journal), aangezien sommige onderwerpen nog steeds relevant zijn) in 1983(1). (LC) (bijvoorbeeld de relatieve vergelijking van ons begrip van het effect van druk op retentie [2] Nieuwe ontwikkelingen) Onze interpretatie van LC-resultaten en het oplossen van problemen met moderne LC-instrumenten. In de aflevering van deze maand ga ik verder met mijn serie (3), die begon in december 2021, die zich richtte op enkele van de 'leven en dood'-onderwerpen van LC-probleemoplossing — elementen die geweldig zijn voor elke probleemoplosser zijn essentieel, ongeacht de leeftijd van het systeem dat we gebruiken. Het kernonderwerp van deze serie is zeer relevant voor de LCGC's beroemde "LC Troubleshooting Guide"-wandkaart (4) die in veel laboratoria hangt. Voor het derde deel van deze serie heb ik ervoor gekozen om me te concentreren op kwesties die verband houden met piekvorm of piekkarakteristieken. Ongelooflijk genoeg somt de wandkaart 44 verschillende mogelijke oorzaken op van een slechte piekvorm! We kunnen niet al deze problemen in detail bespreken in één artikel, dus in dit eerste deel over het onderwerp zal ik me concentreren op enkele van de problemen die ik het vaakst zie. Ik hoop dat jonge en oude LC-gebruikers enkele nuttige tips en herinneringen over dit belangrijke onderwerp zullen vinden .
Ik merk dat ik steeds vaker vragen over het oplossen van problemen beantwoord met "alles is mogelijk". Dit antwoord lijkt misschien gemakkelijk bij het overwegen van waarnemingen die moeilijk te interpreteren zijn, maar ik vind het vaak passend. Met veel mogelijke oorzaken van een slechte piekvorm, is het belangrijk om een ​​open geest te houden bij het overwegen van wat het probleem zou kunnen zijn, en om prioriteit te kunnen geven aan mogelijke oorzaken om onze inspanningen voor het oplossen van problemen te beginnen, waarbij we ons concentreren op de meest voorkomende mogelijkheden. Dit punt is erg belangrijk. mogelijk.
Een belangrijke stap bij het oplossen van problemen - maar een die volgens mij wordt onderschat - is erkennen dat er een probleem is dat moet worden opgelost. Erkennen dat er een probleem is, betekent vaak erkennen dat wat er met het gereedschap gebeurt anders is dan onze verwachtingen, die zijn gevormd door theorie, empirische kennis en ervaring (5). De "piekvorm" waarnaar hier wordt verwezen, verwijst eigenlijk niet alleen naar de vorm van de piek (symmetrisch, asymmetrisch, glad, pluizig, voorrand, staartvorm, enz.), maar ook naar de breedte. De werkelijke piekvorm is eenvoudig. Theorie (6) ondersteunt goed de leerboekverwachting dat, in de meeste gevallen, de chromatografische pieken symmetrisch moeten zijn en moeten voldoen aan de vorm van een Gauss-verdeling, zoals getoond in figuur 1a. Wat we verwachten van piekbreedtes is een complexere kwestie, en we zullen dit onderwerp in een toekomstig artikel bespreken. besteed tijd aan het bespreken van enkele specifieke voorbeelden van situaties die tot deze vormtypen kunnen leiden.
Soms worden er helemaal geen pieken waargenomen in het chromatogram waar ze naar verwachting zullen worden geëlueerd. De bovenstaande wandkaart geeft aan dat de afwezigheid van een piek (ervan uitgaande dat het monster daadwerkelijk de doelanalyt bevat in een concentratie die de detector voldoende zou moeten laten reageren om het boven de ruis te zien) meestal verband houdt met een probleem met het instrument of met onjuiste omstandigheden van de mobiele fase (als ze al worden waargenomen).pieken, meestal te "zwak"). Een korte lijst van mogelijke problemen en oplossingen in deze categorie is te vinden in Tabel I.
Zoals hierboven vermeld, is de vraag hoeveel piekverbreding moet worden getolereerd voordat er aandacht aan wordt besteed en wordt geprobeerd het op te lossen, een complex onderwerp dat ik in een toekomstig artikel zal bespreken. Mijn ervaring is dat aanzienlijke piekverbreding vaak gepaard gaat met een significante verandering in piekvorm, en piekstaartvorming komt vaker voor dan pre-peak of splitsing. De nominaal symmetrische pieken worden echter ook verbreed, wat verschillende redenen kan hebben:
Elk van deze problemen is in detail besproken in eerdere nummers van Troubleshooting LC, en lezers die geïnteresseerd zijn in deze onderwerpen kunnen deze eerdere artikelen raadplegen voor informatie over de hoofdoorzaken en mogelijke oplossingen voor deze problemen.Meer details.
Peak tailing, peak fronting en splitsing kunnen allemaal worden veroorzaakt door chemische of fysische verschijnselen, en de lijst met mogelijke oplossingen voor deze problemen varieert sterk, afhankelijk van of we te maken hebben met een chemisch of fysisch probleem. Door de verschillende pieken in een chromatogram te vergelijken, kunt u vaak belangrijke aanwijzingen vinden over wie de boosdoener is. Als alle pieken in een chromatogram vergelijkbare vormen vertonen, is de oorzaak hoogstwaarschijnlijk niet fysiek.
De chemische oorzaken van peak tailing zijn te complex om hier kort te bespreken. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar de recente uitgave van "LC Troubleshooting" voor een meer diepgaande bespreking (10). Een gemakkelijke manier om te proberen is echter om de massa van de geïnjecteerde analyt te verminderen en te kijken of de vorm van de piek verbetert. Als dat het geval is, dan is dit een goede aanwijzing dat het probleem "massa-overbelasting" is. In dit geval moet de methode worden beperkt tot het injecteren van kleine analytmassa's, of de chromatografische omstandigheden moeten worden worden verkregen, zelfs met grotere massa's geïnjecteerd.
Er zijn ook veel mogelijke fysieke redenen voor peak tailing. Lezers die geïnteresseerd zijn in een gedetailleerde bespreking van de mogelijkheden worden verwezen naar een ander recent nummer van "LC Troubleshooting" (11). Een van de meest voorkomende fysieke oorzaken van peak tailing is een slechte verbinding op een punt tussen de injector en detector (12). Een extreem voorbeeld wordt getoond in figuur 1d, verkregen in mijn laboratorium een ​​paar weken geleden. een roestvrijstalen capillair. Na enkele eerste experimenten met het oplossen van problemen, realiseerden we ons dat de poortdiepte in de injectieklepstator veel dieper was dan we gewend waren, wat resulteerde in een groot dood volume aan de onderkant van de poort. Dit probleem is eenvoudig op te lossen door de injectielus te vervangen door een andere buis, we kunnen de ferrule in de juiste positie plaatsen om het dode volume aan de onderkant van de poort te elimineren.
Piekfronten zoals weergegeven in figuur 1e kunnen ook worden veroorzaakt door fysische of chemische problemen. Een veelvoorkomende fysieke oorzaak van de voorrand is dat het deeltjesbed van de kolom niet goed is gepakt, of dat de deeltjes in de loop van de tijd zijn gereorganiseerd. Net als bij piekuitval veroorzaakt door dit fysische fenomeen, is de beste manier om dit op te lossen door de kolom te vervangen en door te gaan. vastgehouden door de stationaire fase (vandaar de retentiefactor) is lineair gerelateerd aan de concentratie van de analyt in de kolom. Chromatografisch betekent dit dat naarmate de massa van de analyt die in de kolom wordt geïnjecteerd toeneemt, de piek groter wordt, maar niet breder. Deze relatie wordt verbroken wanneer het retentiegedrag niet-lineair is en de pieken niet alleen groter maar ook breder worden naarmate er meer massa wordt geïnjecteerd. Bovendien bepalen niet-lineaire vormen de vorm van chromatografische pieken, wat resulteert in voor- of achterranden. overbelasting die peak tailing veroorzaakt (10), peak lead veroorzaakt door niet-lineaire retentie kan ook worden gediagnosticeerd door de geïnjecteerde analytmassa te verminderen. Als de vorm van de piek verbetert, moet de methode worden aangepast om de injectiekwaliteit die de leading edge veroorzaakt niet te overschrijden, of de chromatografische omstandigheden moeten worden gewijzigd om dit gedrag te minimaliseren.
Soms nemen we iets waar dat lijkt op een "gesplitste" piek, zoals weergegeven in afbeelding 1f. De eerste stap bij het oplossen van dit probleem is om te bepalen of de vorm van de piek het gevolg is van gedeeltelijke co-elutie (dwz de aanwezigheid van twee verschillende maar nauw eluerende verbindingen). Als er in feite twee verschillende analyten dicht bij elkaar elueren, is het een kwestie van hun resolutie verbeteren (bijvoorbeeld door de selectiviteit, retentie of het aantal platen te vergroten), en de schijnbare "gesplitste" pieken zijn gerelateerd aan fysieke prestatie heeft niets te maken met de kolom zelf. tien, de belangrijkste aanwijzing voor deze beslissing is of alle pieken in het chromatogram gespleten vormen vertonen, of slechts één of twee. Als het slechts één of twee zijn, is het waarschijnlijk een co-elutieprobleem;als alle pieken gesplitst zijn, is het waarschijnlijk een fysiek probleem, hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de kolom zelf.
Gespleten pieken gerelateerd aan de fysische eigenschappen van de kolom zelf zijn meestal het gevolg van gedeeltelijk geblokkeerde inlaat- of uitlaatfrits, of reorganisatie van deeltjes in de kolom, waardoor de mobiele fase sneller kan stromen dan de mobiele fase in bepaalde gebieden van de kolomkanaalvorming. in andere regio's (11). Gedeeltelijk verstopte frit kan soms worden verwijderd door de stroom door de kolom om te keren;mijn ervaring is echter dat dit meestal een oplossing voor de korte termijn is in plaats van voor de lange termijn. Dit is vaak dodelijk bij moderne kolommen als de deeltjes zich opnieuw combineren in de kolom. Op dit punt is het het beste om de kolom te vervangen en door te gaan.
De piek in figuur 1g, ook van een recent exemplaar in mijn eigen laboratorium, geeft meestal aan dat het signaal zo hoog is dat het de bovenkant van het responsbereik heeft bereikt. Voor optische absorptiedetectoren (in dit geval UV-vis), wanneer de analytconcentratie erg hoog is, absorbeert de analyt het meeste licht dat door de detectorstroomcel gaat, waardoor er heel weinig licht overblijft om te worden gedetecteerd. Onder deze omstandigheden wordt het elektrische signaal van de fotodetector sterk beïnvloed door verschillende bronnen van ruis, zoals strooilicht en "donkerstroom", waardoor signaal erg "wazig" van uiterlijk en onafhankelijk van de analytconcentratie.Wanneer dit gebeurt, kan het probleem vaak eenvoudig worden opgelost door het injectievolume van de analyt te verkleinen, het injectievolume te verkleinen, het monster te verdunnen of beide.
Op de chromatografieschool gebruiken we het detectorsignaal (d.w.z. de y-as in het chromatogram) als een indicator van de analytconcentratie in het monster. Het lijkt dus vreemd om een ​​chromatogram te zien met een signaal onder nul, aangezien de eenvoudige interpretatie is dat dit een negatieve analytconcentratie aangeeft – wat natuurlijk fysiek niet mogelijk is. Mijn ervaring is dat negatieve pieken het vaakst worden waargenomen bij gebruik van optische absorptiedetectoren (bijv. UV-vis).
In dit geval betekent een negatieve piek simpelweg dat de moleculen die uit de kolom elueren minder licht absorberen dan de mobiele fase zelf direct voor en na de piek. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren bij gebruik van relatief lage detectiegolflengten (<230 nm) en mobiele fase-additieven die het meeste licht bij deze golflengten absorberen. Dergelijke additieven kunnen mobiele fase-oplosmiddelcomponenten zijn, zoals methanol of buffercomponenten zoals acetaat of formiaat. se (deze methode wordt soms "indirecte UV-detectie" genoemd) (13). Als we echter echt negatieve pieken helemaal willen vermijden, is in het geval van absorptiedetectie de beste oplossing om een ​​andere detectiegolflengte te gebruiken zodat de analyt meer absorbeert dan de mobiele fase, of verander de samenstelling van de mobiele fase zodat ze minder licht absorberen dan analyten.
Negatieve pieken kunnen ook verschijnen wanneer de brekingsindex (RI)-detectie wordt gebruikt wanneer de brekingsindex van andere componenten dan de analyt in het monster, zoals de oplosmiddelmatrix, verschilt van de brekingsindex van de mobiele fase. Dit gebeurt ook met UV-vis-detectie, maar dit effect wordt vaak afgezwakt ten opzichte van RI-detectie. In beide gevallen kunnen negatieve pieken worden geminimaliseerd door de samenstelling van de monstermatrix beter af te stemmen op die van de mobiele fase.
In deel drie, over het basisonderwerp van LC-probleemoplossing, besprak ik situaties waarin de waargenomen piekvorm afwijkt van de verwachte of normale piekvorm. Effectieve probleemoplossing van dergelijke problemen begint met kennis van verwachte piekvormen (gebaseerd op theorie of eerdere ervaring met bestaande methoden), dus afwijkingen van deze verwachtingen zijn duidelijk. Piekvormproblemen hebben veel verschillende mogelijke oorzaken (te breed, achterwaarts, voorrand, enz.). In deze aflevering bespreek ik in detail enkele van de redenen die ik het vaakst zie. geeft niet alle mogelijkheden weer. Lezers die geïnteresseerd zijn in een uitgebreidere lijst met oorzaken en oplossingen kunnen de LCGC "LC Troubleshooting Guide" wandkaart raadplegen.
(4) LCGC "LC Troubleshooting Guide" wandkaart.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), blz. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31-44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.