Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Zelfassemblerende neurale organellen vormen een veelbelovend in-vitroplatform voor het modelleren van menselijke ontwikkeling en ziekte. Organoïden missen echter de connectiviteit die in vivo wel bestaat, wat de rijping beperkt en integratie met andere circuits die gedrag controleren verhindert. Hier laten we zien dat corticale organoïden, afkomstig van menselijke stamcellen en getransplanteerd in de somatosensorische cortex van pasgeboren naakte ratten, volwassen celtypen ontwikkelen die integreren in sensorische en motivatiegerelateerde circuits. MRI toonde post-transplantatie organoïdegroei in verschillende stamcellijnen en dieren, terwijl single-core analyse de progressie van corticogenese en de opkomst van een activiteitsafhankelijk transcriptieprogramma aantoonde. Getransplanteerde corticale neuronen vertonen inderdaad complexere morfologische, synaptische en interne membraaneigenschappen dan hun in-vitro-tegenhangers, wat de detectie van neuronale defecten bij patiënten met het syndroom van Timothy mogelijk maakt. Anatomische en functionele tracering heeft aangetoond dat getransplanteerde organellen thalamocorticale en corticocorticale input ontvangen, en in vivo registraties van neurale activiteit suggereren dat deze input sensorische reacties in menselijke cellen kan genereren. Ten slotte strekken corticale organoïden axonen uit door de hele rattenhersenen, en hun optogenetische activering leidt tot beloningsgedrag. Getransplanteerde menselijke cortexneuronen rijpen dus en nemen deel aan de circuits van de gastheer die het gedrag controleren. We verwachten dat deze aanpak de detectie van fenotypes op strengniveau in patiëntafgeleide cellen zal vergemakkelijken die niet op andere manieren kunnen worden gedetecteerd.
De zich ontwikkelende menselijke hersenen zijn een opmerkelijk zelforganiserend proces waarbij cellen prolifereren, differentiëren, migreren en zich verbinden om functionele neuronale circuits te vormen die verder worden verfijnd door sensorische ervaring. Een belangrijk probleem bij het begrijpen van de ontwikkeling van de menselijke hersenen, met name in de context van ziekte, is het gebrek aan toegang tot hersenweefsel. Zelforganiserende organellen, waaronder organoïden van de menselijke cortex (hCO; ook bekend als de menselijke cortexsfeer), kunnen 2,3,4,5 en 6 genereren. Verschillende beperkingen beperken echter hun bredere toepassing in het begrijpen van de ontwikkeling en werking van neurale circuits. Het is met name onduidelijk of de rijping van hCO wordt beperkt door de afwezigheid van bepaalde micro-omgevings- en sensorische input die in vivo aanwezig is. Bovendien, omdat hCO's niet geïntegreerd zijn in circuits die gedragsresultaten kunnen genereren, is hun bruikbaarheid bij het modelleren van genetisch complexe en gedragsmatige neuropsychiatrische stoornissen momenteel beperkt.
De transplantatie van hCO in een intact levend brein kan deze beperkingen overwinnen. Eerdere studies hebben aangetoond dat menselijke neuronen die in de cortex van knaagdieren zijn getransplanteerd, kunnen overleven, projecteren en communiceren met knaagdiercellen7,8,9,10,11,12. Deze experimenten worden echter meestal uitgevoerd op volwassen dieren, wat de synaptische en axonale integratie kan beperken. Hier beschrijven we een transplantatieparadigma waarin we 3D hCO afkomstig van hiPS-cellen transplanteerden in de primaire somatosensorische cortex (S1) van immunodeficiënte ratten in een vroeg stadium van plastische ontwikkeling. Getransplanteerde hCO (t-hCO) neuronen ondergaan een aanzienlijke rijping, ontvangen thalamocorticale en corticaal-corticale input die sensorische reacties opwekt, en breiden axonale projecties uit naar de hersenen van ratten om beloningsgedrag te stimuleren. Verlengde rijping van t-hCO heeft neuronale defecten aan het licht gebracht bij patiënten met het syndroom van Timothy (TS), een ernstige genetische aandoening die wordt veroorzaakt door mutaties in het spanningsgevoelige L-type CaV1.2 calciumkanaal (gecodeerd door CACNA1C).
Om menselijke corticale neuronen in circuits in vivo te bestuderen, transplanteerden we stereotactisch intact 3D hCO in S1 van vroeg-postnatale athymische ratten (dag 3-7 postnataal) (Fig. 1a en uitgebreide gegevens van Fig. 1a-c). Op dit punt hebben de thalamocorticale en corticocorticale axonale projecties hun S1-innervatie nog niet voltooid (ref. 13). Deze aanpak is daarom ontworpen om de t-hCO-integratie te maximaliseren en tegelijkertijd de impact op endogene circuits te minimaliseren. Om de locatie van t-hCO in levende dieren te visualiseren, voerden we T2-gewogen MRI-hersenreconstructies uit van ratten 2-3 maanden na transplantatie (Fig. 1b en uitgebreide gegevens, Fig. 1d). t-hCO werd gemakkelijk waargenomen en volumemetingen van t-hCO kwamen overeen met die berekend uit vaste plakjes (Uitgebreide gegevens Afb. 1d,e; P > 0,05). t-hCO werd gemakkelijk waargenomen en volumemetingen van t-hCO kwamen overeen met die berekend uit vaste plakjes (Uitgebreide gegevens Afb. 1d,e; P > 0,05). t-hCO maakt gebruik van t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO was gemakkelijk waar te nemen en volumetrische t-hCO-metingen waren vergelijkbaar met die berekend voor vaste secties (uitgebreide gegevens, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO,并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO,并且t-hCO t-hCO maakt gebruik van t-hCO-producten, en t-hCO maakt gebruik van t-hCO фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO werd gemakkelijk waargenomen en volumetrische t-hCO-metingen waren vergelijkbaar met die berekend voor vaste secties (uitgebreide gegevens, Fig. 1d, e; P > 0,05).We bepaalden t-hCO bij 81% van de getransplanteerde dieren ongeveer 2 maanden na transplantatie (n = 72 dieren; hCO van 10 hiPS-cellijnen; hiPS-cellijnen in aanvullende tabel 1). Hiervan bevond 87% zich in de hersenschors (Fig. 1c). Door seriële MRI-scans uit te voeren op meerdere tijdstippen bij dezelfde getransplanteerde rat, vonden we een negenvoudige toename van het t-hCO-volume binnen 3 maanden (Fig. 1d en uitgebreide gegevens, Fig. 1f). Getransplanteerde dieren hadden een hoge overlevingskans (74%) 12 maanden na transplantatie (uitgebreide gegevens, Fig. 1g en aanvullende tabel 2), en er werden geen duidelijke motorische of geheugenstoornissen, gliose of elektro-encefalogram (EEG) gevonden. Gegevens Fig. 1g en aanvullende tabel 2). 1u-m en 3e).
a, Schematische weergave van het experimentele ontwerp. hCO2 afkomstig van hiPS-cellen werd getransplanteerd in S1 van pasgeboren naakte ratten op dag 30-60 van de differentiatie. b, T2-gewogen coronale en horizontale MRI-beelden die t-hCO2 in S1 laten zien 2 maanden na transplantatie. Schaalbalk, 2 mm. c, Kwantificering van de slagingspercentages van engraftment weergegeven voor elke hiPS-cellijn (n = 108; getallen binnen de balken geven de hoeveelheid t-hCO2 per hIPS-cellijn aan) en corticale of subcorticale locatie (n = 88). d, MRI-afbeelding van een kransslagader (links; schaalbalk, 3 mm) en bijbehorende 3D volumetrische reconstructie (schaalbalk, 3 mm) die een toename in t-hCO2 gedurende 3 maanden laat zien. e, Overzicht van t-hCO-patronen in de hersenschors van ratten. Schaalbalk, 1 mm. f, Representatieve immunocytochemische beelden van t-hCO, van linksboven naar rechts (tijdens differentiatie): PPP1R17 (4 maanden oud), NeuN (8 maanden oud), SOX9 en GFAP (8 maanden oud), PDGFRα; (8 maanden), MAP2 (8 maanden) en IBA1 (8 maanden). Schaalbalk, 20 µm. Co-expressie van HNA duidt op cellen van menselijke oorsprong. g, snRNA-seq: Unified Manifold and Projection (UMAP) dimensionaliteitsreductie-beeldvorming van alle hoogwaardige t-hCO-kernen na Seurat-integratie (n=3 t-hCO-monsters, n=2 hiPS-cellijnen). Astrocyten, cellen van de astrocytenlijn; cyc prog, circulerende voorlopercellen; GluN DL, diepe glutamaterge neuronen; GluN DL/SP, diepe en sublamellaire glutamaterge neuronen; GluN UL, glutamaterge neuronen in de bovenste laag; oligodendrocyten, oligodendrocyten; OPC, oligodendrocyt-voorlopercellen; RELN, reelin-neuronen. h, Gene Ontology (GO) term verrijkingsanalyse van genen die significant zijn opgereguleerd (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, tot uiting gebracht in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO glutamaterge neuronen vergeleken met hCO glutamaterge neuronen. h, Gene Ontology (GO) term verrijkingsanalyse van genen die significant zijn opgereguleerd (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, tot uiting gebracht in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO glutamaterge neuronen vergeleken met hCO glutamaterge neuronen. h, Gene Ontology (GO) met behulp van Gene Ontology (GO) met P <0,05, waarde van > 2, waarde van крайней мере in 10% ядер) in нейронах t-hCO сравнению с geen hCO. h, Gene Ontology (GO) termverrijkingsanalyse voor genen met significante activering (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, expressie in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO glutamaterge neuronen vergeleken met hCO glutamaterge neuronen. h,与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05, 倍数变化> 2, 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2, 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, покрайней мере в 10% ядер) в t-hCO kan niet worden gebruikt met hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, genen werden significant opgereguleerd (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, uitgedrukt in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO glutamaterge neuronen vergeleken met hCO glutamaterge neuronen Ontologische (GO) analyse van de verrijkingsterm.De stippellijn geeft een q-waarde van 0,05 aan. i, UMAP-beeldvorming van GluN-celtypen in t-hCO met behulp van labeloverdracht uit een referentiedataset van 22 snRNA-seq volwassen motorische cortex. CT — corticothalamische cellen, ET — extracerebrale cellen, IT — interne telencephalische cellen, NP — nabije projectie.
Vervolgens beoordeelden we de cytoarchitectuur en de algehele cellulaire samenstelling van t-hCO. Antilichaamkleuring van rattenendotheelcellen toonde vascularisatie met t-hCO aan, terwijl IBA1-kleuring de aanwezigheid van rattenmicroglia in het gehele transplantaat aantoonde (Fig. 1f en uitgebreide gegevens, Fig. 3c,d). Immunokleuring toonde aan dat cellen positief waren voor humaan nucleair antigeen (HNA) en co-expressie vertoonden van PPP1R17 (corticale voorlopercellen), NeuN (neuronen), SOX9 en GFAP (cellen afkomstig van gliacellen) of PDGFRα (oligodendrocytvoorlopercellen) (Figuur 1f). Om de cellulaire samenstelling van t-hCO op single-cell resolutie te bestuderen, voerden we na ongeveer 8 maanden differentiatie single-core RNA-sequencing (snRNA-seq) uit. Bulkfiltratie en verwijdering van rattenkernen leverden 21.500 hoogwaardige humane mononucleaire kaarten op (Fig. 1g en uitgebreide data, Fig. 4a,b). Expressiepatronen van typische celtypemarkers identificeerden clusters van belangrijke corticale celklassen, waaronder diepe en oppervlakkige glutamaterge neuronen, circulerende voorlopercellen, oligodendrocyten en astrocyten (Fig. 1g, uitgebreide data, Fig. 4c en aanvullende tabel 3). Immunokleuring voor SATB2 en CTIP2 toonde aan dat t-hCO, ondanks de aanwezigheid van corticale subtypes, geen duidelijke anatomische gelaagdheid vertoonde (uitgebreide data, Fig. 3a). Stage-matched snRNA-seq hCO produceerde grotendeels vergelijkbare celklassen, met enkele uitzonderingen, waaronder de afwezigheid van oligodendrocyten en de aanwezigheid van GABA-erge neuronen, wat mogelijk de eerder gerapporteerde gunstige in-vitroomstandigheden voor laterale progenitorcellen weerspiegelt15 (uitgebreide gegevens, Fig. 4f – i en Aanvullende Tabel 4). Differentiële genexpressieanalyse toonde significante verschillen aan in glutamaterge neuronen tussen t-hCO en hCO (Aanvullende Tabel 5), waaronder de activering van sets genen die geassocieerd zijn met neuronale rijping, zoals synaptische signalering, dendritische lokalisatie en spanningsafhankelijke kanaalactiviteit (Figuur 1h en Aanvullende Tabel 5, tabel 6). Corticale glutamaterge t-hCO neuronen vertoonden dan ook een versnelde transcriptionele rijping.
Om te verduidelijken of deze transcriptionele veranderingen in t-hCO verband hielden met morfologische verschillen tussen hCO in vitro en t-hCO in vivo, reconstrueerden we hCO en hCO in acute coupes, gevuld met biocytine, in een vergelijkbaar stadium, na 7–8 maanden differentiatie. t-hCO-neuronen waren significant groter, hadden een somadiameter die 1,5 keer zo groot was, twee keer zoveel dendrieten en een totale zesvoudige toename in de totale dendritische lengte vergeleken met in vitro hCO (Fig. 2b). Bovendien observeerden we een significant hogere dichtheid van dendritische stekels in t-hCO-neuronen dan in hCO-neuronen (Fig. 2c). Dit suggereert dat t-hCO-neuronen een uitgebreide dendritische verlenging en vertakking ondergaan, wat, in combinatie met voortdurende celproliferatie, kan bijdragen aan de intensieve groei van t-hCO na transplantatie (Fig. 1d en Extended Data Fig. 1f). Dit zette ons ertoe aan de elektrofysiologische eigenschappen te onderzoeken. De membraancapaciteit was acht keer hoger (uitgebreide data, Fig. 8d), het membraanpotentiaal in rust was meer gehyperpolariseerd (ongeveer 20 mV) en stroominjectie induceerde een hogere maximale excitatiesnelheid in t-hCO-neuronen dan in hCO-neuronen. (uitgebreide data, Fig. 2d, e), wat consistent is met de grotere en complexere morfologische kenmerken van t-hCO. Bovendien was de frequentie van spontane exciterende postsynaptische stroomgebeurtenissen (EPSC) significant hoger in t-hCO-neuronen (Fig. 2f), wat suggereert dat de verhoogde dichtheid van dendritische stekels die in t-hCO-neuronen werd waargenomen, verband hield met functionele exciteerbaarheid. seksuele synaps. We bevestigden het onvolwassen karakter van hCO-neuronen in vitro door gelabelde glutamaterge neuronen te registreren (uitgebreide data, Fig. 6a-c).
a, 3D-reconstructie van met biocytine gevulde hCO- en t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie. b, Kwantificering van morfologische kenmerken (n = 8 hCO-neuronen, n = 6 t-hCO-neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 en ***P < 0,0001). b, Kwantificering van morfologische kenmerken (n = 8 hCO-neuronen, n = 6 t-hCO-neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 en ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 en *** P <0,0001). b, kwantificering van morfologische kenmerken (n=8 hCO-neuronen, n=6 t-hCO-neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179 en ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 en *** P <0,0001). b, kwantificering van morfologische kenmerken (n=8 hCO-neuronen, n=6 t-hCO-neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179 en ***P<0,0001).c, 3D-reconstructie van hCO- en t-hCO-dendritische takken na 8 maanden differentiatie. Rode asterisken geven mogelijke dendritische stekels aan. Kwantificering van de dichtheid van dendritische stekels (n = 8 hCO-neuronen, n = 6 t-hCO-neuronen; **P = 0,0092). d, Kwantificering van het rustmembraanpotentiaal (n = 25 hCO-neuronen, n = 16 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). d, Kwantificering van het rustmembraanpotentiaal (n = 25 hCO-neuronen, n = 16 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantificering van het rustmembraanpotentiaal (n = 25 hCO-neuronen, n = 16 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantificering van het rustmembraanpotentiaal (n = 25 hCO-neuronen, n = 16 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). e, Herhaalde actiepotentiaalafgifte in hCO en t-hCO geïnduceerd door toenemende stroominjecties, en kwantificering van de maximale vuurfrequentie (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0,0001). e, Herhaalde actiepotentiaalafgifte in hCO en t-hCO geïnduceerd door toenemende stroominjecties, en kwantificering van de maximale vuurfrequentie (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0,0001). e, het gebruik van hCO en t-hCO, het gebruik van hCO en t-hCO, en максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hernieuwde afvuring van actiepotentialen in hCO en t-hCO geïnduceerd door toename van de stroom en kwantificering van de maximale vuurfrequentie (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E, 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电, 以及 最 大 的 量化 (n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO en t-hCO, увеличением подачи тока, en количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, herhaaldelijk afvuren van hCO- en t-hCO-actiepotentialen, geïnduceerd door een verhoogde stroomtoevoer en kwantificering van de maximale vuurfrequentie (n = 25 hCO-neuronen, n = 16 t-hCO-neuronen; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie, en kwantificering van de frequentie van synaptische gebeurtenissen (n = 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie, en kwantificering van de frequentie van synaptische gebeurtenissen (n = 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) in нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки en количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001) . f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie en kwantificering van synaptische gebeurtenissnelheden (n=25 hCO-neuronen, n=17 t-hCO-neuronen; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f,分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) in нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки en количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P<0,0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie en kwantificering van synaptische gebeurtenissnelheden (n = 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; *** P < 0,0001).Voor bf werden hCO en t-hCO in lijn 1208-2 uit dezelfde differentiatiebatch gehaald die parallel werd onderhouden. g, Analyse van de verrijking van genensets (eenzijdige exacte Fisher-toets) van genen die significant zijn opgereguleerd (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, tot uiting gebracht in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO-glutamatere neuronen vergeleken met hCO-glutamatere neuronen met genensets van zowel vroege-respons (ERG) als late-respons (LRG) activiteitsafhankelijke genen geïdentificeerd uit een in vivo-onderzoek bij muizen16 en mensspecifieke LRG's uit in vitro-neuronen17. g, Analyse van de verrijking van genensets (eenzijdige exacte Fisher-toets) van genen die significant zijn opgereguleerd (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, tot uiting gebracht in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO-glutamatere neuronen vergeleken met hCO-glutamatere neuronen met genensets van zowel vroege-respons (ERG) als late-respons (LRG) activiteitsafhankelijke genen geïdentificeerd uit een in vivo-onderzoek bij muizen16 en mensspecifieke LRG's uit in vitro-neuronen17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) in глутаматергических нейронах t-hCO is een oplossing voor het gebruik van t-hCO нейронами hCO наборы как раннего (ERG), так en позднего (LRG) генов, зависящих от активности, in vivo16, en специфических человека LRG of нейронов in vitro17. g, analyse van verrijking van genensets (eenzijdige Fisher's exacte toets) van genen met significante activering (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, expressie in ten minste 10% van de kernen) in t-hCO-glutaminerge neuronen vergeleken met hCO-glutaminerge neuronensets van zowel vroege (ERG) als late (LRG) activiteitsafhankelijke genen geïdentificeerd in in vivo muizen16 en mensspecifieke LRG's uit neuronen in vitro17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2,10% 的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g, t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比, t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中表达） 的 集富集 分析 (单侧 visser 精确））体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, niet meer dan 10% тест Фишера) раннего ответа (ERG) en позднего Het is mogelijk om een ​​​​apparaat te gebruiken (LRG), in vivo in leven te blijven16 en niet in vitro17. LRG, ik denk dat het goed is. g, t-hCO glutamaterge neuronen waren significant opgereguleerd vergeleken met hCO glutamaterge neuronen (aangepaste P < 0,05, voudige verandering > 2, ten minste 10% Vroege respons (ERG) en late respons genverrijkingsanalyse (eenzijdige Fisher's exacte test) responsactiviteitsafhankelijke genen (LRG's) geïdentificeerd in in vivo muizen16 en in vitro neuronen.17 Menselijke specifieke LRG's.De stippellijn geeft een Bonferroni-gecorrigeerde p-waarde van 0,05 aan. h, GluN-genexpressie (pseudopakket en schaling van elk gen) was significant verhoogd in snRNA-seq-replica's van LRG-genen in t-hCO glutamaterge neuronen. i, immunokleuring toont SCG2-expressie in t-hCO (boven) en hCO (onder) neuronen. Witte pijlen wijzen naar SCG2+-cellen. Schaalbalk, 25 µm. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie.
Gebaseerd op de verhoogde activiteit van t-hCO, waargenomen in ex vivo slices, toonde snRNA-seq een activiteitsafhankelijke opregulatie van gentranscripten in t-hCO aan vergeleken met hCO in vitro. Glutamaterge t-hCO-neuronen vertoonden hogere niveaus van genen die de activiteit van late responsen reguleren (Fig. 2g,h), die waren gevonden in eerdere studies met muizen- en humane neuronen16,17. BDNF18, SCG2 en OSTN, een activiteitsregulerend gen specifiek voor primaten, vertoonden bijvoorbeeld een verhoogde expressie in t-hCO-neuronen vergeleken met hCO-neuronen (Fig. 2g-i). T-hCO-neuronen vertoonden dus verbeterde maturatiekenmerken vergeleken met hCO-neuronen door transcriptionele, morfologische en functionele analyses.
Om de associatie van t-hCO-rijping met de ontwikkeling van de menselijke hersenen verder te evalueren, voerden we transcriptoomvergelijkingen uit van foetale en volwassen corticale celtypen19,20 en volwassen21,22, evenals uitgebreide gegevens over corticale genexpressie23 tijdens de ontwikkeling (uitgebreide gegevens, Fig. 5). ). met eerder werk24, is de globale hCO- en t-hCO-transcriptoomrijpingsstatus op 7–8 maanden van differentiatie grotendeels consistent met de in vivo-ontwikkelingstijd en is het meest equivalent aan de late foetale levensduur (Uitgebreide gegevens, Fig. 5a). We observeerden met name een verhoogde transcriptoomrijpheid in t-hCO vergeleken met hCO van dezelfde leeftijd, evenals transcriptoomactivatie geassocieerd met synaptogenese, astrogenese en myelinisatie (uitgebreide gegevens, Fig. 5b-d). Op cellulair niveau vonden we bewijs voor een dunner cortexsubtype in t-hCO, met clusters van glutamaterge neuronen die overlapten met volwassen L2/3-, L5- en L6-neuronsubtypen (Figuur 1i). Daarentegen was de clusteroverlap tussen glutamaterge t-hCO-neuronen en foetale corticale neuronen beperkter halverwege de zwangerschap (uitgebreide gegevens, Figuur 5e-j). Om te bepalen of t-hCO-neuronen functioneel vergelijkbaar zijn met menselijke postnatale neocorticale neuronen, voerden we elektrofysiologische opnames en anatomische reconstructies uit van menselijke L2/3-piramidale neuronen in scherpe doorsneden van de menselijke postnatale cortex (uitgebreide gegevens, Fig. 7a). De elektrofysiologische eigenschappen van L2/3-piramidale neuronen waren vergelijkbaar met die van t-hCO-piramidale neuronen (uitgebreide gegevens, Fig. 7e). Morfologisch gezien leken L2/3-neuronen uit postnatale menselijke monsters meer op t-hCO dan op hCO, hoewel L2/3-cellen langer waren, over het geheel genomen meer vertakkingen bevatten en een hogere stekeldichtheid hadden (Fig. 3g en uitgebreide gegevens, Fig. 7b-). G).
a, transplantatie van hCO geproduceerd door controle- en TS hiPS-cellijnen in neonatale ratten. b, 3D-reconstructie van met biocytine gevulde t-hCO-neuronen na 8 maanden differentiatie. c, kwantificering van gemiddelde dendritische lengte (n = 19 controle-neuronen, n = 21 TS-neuronen; **P = 0,0041). d, 3D-gereconstrueerde dendritische vertakkingen van controle en TS t-hCO op 8 maanden differentiatie, en kwantificering van de dendritische stekeldichtheid (n = 16 controle-neuronen, n = 21 TS-neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-gereconstrueerde dendritische vertakkingen van controle en TS t-hCO op 8 maanden differentiatie, en kwantificering van de dendritische stekeldichtheid (n = 16 controle-neuronen, n = 21 TS-neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля en TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки en плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-reconstructie van dendritische vertakkingen van controle en t-hCO TS op 8 maanden differentiatie en kwantificering van de dendritische stekeldichtheid (n=16 controle-neuronen, n=21 TS-neuronen, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d, 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных контроля en TS t-hCO met 8 maanden ondersteuning en плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-reconstructie van controle-dendritische takken en TS t-hCO op 8 maanden differentiatie en kwantificering van de dendritische stekeldichtheid (n=16 controle-neuronen, n=21 TS-neuronen, ***P<0,0001).Rode asterisken geven mogelijke dendritische stekels aan. e, spontane EPSC's in controle- en TS t-hCO neuronen na 8 maanden differentiatie. f, cumulatieve frequentiegrafiek en kwantificering van de frequentie en amplitude van synaptische gebeurtenissen (n = 32 controle-neuronen, n = 26 TS neuronen; **P = 0,0076 en P = 0,8102). g, Scholl-analyse van TS en controle-neuronen in hCO en t-hCO. Stippellijnen tonen menselijke L2/3 postnatale piramidale neuronen ter vergelijking (n = 24 controle-t-hCO neuronen, n = 21 TS t-hCO neuronen, n = 8 controle-hCO neuronen en n = 7 TS hCO neuronen). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie.
Het vermogen van t-hCO om de morfologische en functionele kenmerken van menselijke cortexneuronen op hoog niveau te repliceren, zette ons ertoe aan te onderzoeken of t-hCO gebruikt kon worden om ziektefenotypes te detecteren. We richtten ons op TS, een ernstige neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt veroorzaakt door gain-of-function-mutaties in het gen dat codeert voor CaV1.2, dat activiteitsafhankelijke gentranscriptie in neuronen initieert. We verkregen hCO van drie TS-patiënten met de meest voorkomende substitutie (p.G406R) en drie controles (Fig. 3a). Na transplantatie ontdekten we dat de dendritische morfologie in TS-neuronen was veranderd in vergelijking met controles (Fig. 3b en uitgebreide data, Fig. 8a,b), met een verdubbeling van het aantal primaire dendrieten en een algehele toename van de gemiddelde en algehele afname van de dendritische lengte (Fig. 3c en uitgebreide data, Fig. 8c). Dit ging gepaard met een verhoogde dichtheid van spines en een verhoogde frequentie van spontane EPSC's in TS vergeleken met controleneuronen (Fig. 3d-f en uitgebreide data, Fig. 8g). Verdere analyse toonde patronen van abnormale dendritische vertakking in t-hCO TS vergeleken met controleneuronen, maar niet in in vitro TS hCO in een vergelijkbaar differentiatiestadium (Fig. 3g). Dit komt overeen met onze eerdere rapporten over activiteitsafhankelijke dendritische krimp in TS en onderstreept het vermogen van dit transplantatieplatform om ziektefenotypes in vivo te detecteren.
Vervolgens vroegen we ons af in hoeverre t-hCO-cellen functioneel geïntegreerd zijn in rat S1. S1 bij knaagdieren ontvangt sterke synaptische input van de ipsilaterale ventrale basale en posterieure thalamuskernen, evenals de ipsilaterale motorische en secundaire somatosensorische cortex, en contralaterale S1 (Fig. 4a). Om het innervatiepatroon te herstellen, infecteerden we hCO met rabiësvirus-dG-GFP/AAV-G en transplanteerden we hCO 3 dagen later in S1-rat. We observeerden dichte GFP-expressie in neuronen van de ipsilaterale S1 en ventrale basale ganglia 7-14 dagen na transplantatie (Fig. 4b, c). Bovendien toonde antilichaamkleuring van de thalamische marker netrine G1 de aanwezigheid van thalamische uiteinden in t-hCO aan (Fig. 4d, e). Om te evalueren of deze afferente projecties synaptische reacties in t-hCO-cellen konden opwekken, hebben we volledige celopnames gemaakt van menselijke cellen in scherpe secties van de thalamocorticale laag. Elektrische stimulatie van rat S1, capsula interna, witte stof, vezels nabij t-hCO of optogenetische activering van opsine-expressieve thalamische uiteinden in t-hCO induceerde EPSC's met korte latentie in t-hCO-neuronen die waren blootgesteld aan de AMPA-receptorantagonist NBQX (Fig. 4f, g en uitgebreide data, Fig. 9a–g). Deze gegevens tonen aan dat t-hCO anatomisch geïntegreerd is in de rattenhersenen en geactiveerd kan worden door rattengastweefsel.
a, Schematisch diagram van een experiment met rabiëstracking. b, GFP- en mensspecifieke STEM121-expressie tussen t-hCO en de hersencortex van ratten (bovenste paneel). Ook getoond is GFP-expressie in de ipsilaterale ventrale basale nucleus (VB) van ratten (linksonder) en ipsilaterale S1 (rechtsonder). Schaalbalk, 50 µm. De rode vierkanten geven de hersengebieden aan waar de beelden zijn genomen. c, Kwantificering van cellen die GFP tot expressie brengen (n = 4 ratten). d, e — Netrine G1+-thalamische terminalen in t-hCO. d toont een coronale doorsnede met t-hCO- en VB-kernen. Schaalbalk, 2 mm. e toont Netrine G1- en STEM121-expressie in t-hCO- (links) en VB-neuronen (rechts). Schaalbalk, 50 µm. De oranje stippellijn geeft de t-hCO-grens aan. f, g, Stroomsporen van t-hCO-neuronen na elektrische stimulatie in S1-rat (f) of capsula interna (g), met (paars) of zonder (zwart) NBQX (links). EPSC-amplitudes met en zonder NBQX (n = 6 S1-neuronen, *P = 0,0119; en n = 6 capsula interna, **P = 0,0022) (midden). Percentage t-hCO-neuronen met EPSC als reactie op elektrische stimulatie van rat S1 (f) of capsula interna (g) (rechts). aCSF, kunstmatige cerebrospinale vloeistof. h, schema van het 2P-beeldvormingsexperiment (links). Expressie van GCaMP6's in t-hCO (midden). Schaalbalk, 100 µm. Fluorescentietijdsverloop van GCaMP6's (rechts). i, Z-score van spontane fluorescentieactiviteit. j, schematische weergave van snorstimulatie. k, z-gescoorde 2P-fluorescentietrajecten in één proef, uitgelijnd met de snorhaarafwijking op tijdstip nul (stippellijn) in voorbeeldcellen. l, populatiegemiddelde z-scoreresponsen van alle cellen uitgelijnd met de snorhaarafwijking op tijdstip nul (stippellijn) (rood) of willekeurig gegenereerde tijdstempels (grijs). m. Schematisch diagram van het experiment met optische markering. n, Ruwe spanningscurven van een voorbeeld t-hCO-cel tijdens blauwe laserstimulatie of snorhaarafbuiging. Rode pijlen geven de eerste pieken aan die veroorzaakt worden door licht (boven) of door snorhaarafbuiging (onder). Grijze arcering geeft perioden van snorhaarafbuiging aan. o, Pieklichtgolfvormen en snorhaarafbuigingsresponsen. p, pieken van een enkele poging, uitgelijnd met de afwijking van de snorharen in de cellen van het voorbeeld. 0 geeft snorhaarafbuiging aan (stippellijn). q, populatiegemiddelde z-score-vuurfrequentie voor alle lichtgevoelige cellen, uitgelijnd met de snorhaarafwijking op tijdstip nul (stippellijn) (rood) of willekeurig gegenereerde tijdstempels (grijs). r, Percentage lichtgevoelige eenheden significant gemoduleerd door de snorhaarafwijking (n = 3 ratten) (links). Piekz-score-latentie (n = 3 ratten; n = 5 (lichtgroen), n = 4 (donkergroen) en n = 4 (cyaan) snorhaarafwijkingsmodulatie-eenheden per rat) (rechts). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie.
Vervolgens vroegen we ons af of t-hCO in vivo geactiveerd kon worden door sensorische stimuli. We transplanteerden hCO dat de genetisch gecodeerde calciumindicatoren GCaMP6 tot expressie bracht in S1-ratten. Na 150 dagen voerden we vezelfotometrie of tweefoton-calciumbeeldvorming uit (Figuur 4h en uitgebreide data, Fig. 10a). We ontdekten dat t-hCO-cellen een gesynchroniseerde ritmische activiteit vertoonden (Figuur 4i, Uitgebreide data, Figuur 10b en Aanvullende Video 1). Om de piekactiviteit van t-hCO te karakteriseren, voerden we extracellulaire elektrofysiologische opnames uit bij verdoofde transplantatieratten (uitgebreide data, Fig. 10c-f). We hebben stereotactische coördinaten gegenereerd uit MRI-beelden; deze opgenomen eenheden vertegenwoordigen dus vermoedelijk menselijke neuronen, hoewel elektrofysiologie alleen niet toelaat om een ​​soort van oorsprong te bepalen. We observeerden gesynchroniseerde uitbarstingen van activiteit (uitgebreide data, Fig. 10d). De bursts duurden ongeveer 460 ms en werden gescheiden door stilteperiodes van ongeveer 2 s (uitgebreide data, Fig. 10d, e). Individuele eenheden vuurden gemiddeld ongeveer drie schoten per burst af, wat neerkomt op ongeveer 73% van de geregistreerde eenheden per burst. De activiteiten van individuele eenheden waren sterk gecorreleerd, en deze correlaties waren hoger dan die van eenheden die werden geïdentificeerd bij niet-gevaccineerde dieren die onder dezelfde omstandigheden werden geregistreerd (uitgebreide data, Fig. 10f). Om de spike-responsen van geïdentificeerde, van mensen afkomstige neuronen verder te karakteriseren, voerden we experimenten met lichtmarkering uit op verdoofde ratten die getransplanteerd waren met hCO dat het lichtgevoelige kationkanaal rhodopsine 2 (hChR2) tot expressie bracht. Via dit kanaal herkennen t-hCO-neuronen met een korte latentie (minder dan 10 ms) als reactie op blauwe lichtstimuli (Fig. 4m–o). t-hCO-neuronen vertoonden uitbarstingen van spontane activiteit bij frequenties die vergelijkbaar waren met die waargenomen bij calciumbeeldvorming, evenals elektrofysiologische opnames uitgevoerd in t-hCO bij afwezigheid van lichtmarkering (uitgebreide gegevens, Fig. 10c-g). Er werd geen spontane activiteit waargenomen in de corresponderende stadia van hCO die in vitro werden opgenomen. Om te beoordelen of t-hCO geactiveerd kon worden door sensorische stimuli, hebben we de snorharen van de rat kortstondig van t-hCO afgebogen (Fig. 4j,m en uitgebreide gegevens, Fig. 10h,k). Volgens eerdere studies8,10 vertoonde een subset van t-hCO-cellen verhoogde activiteit als reactie op afbuiging van de snorharen, wat niet werd waargenomen toen de gegevens werden vergeleken met willekeurige tijdstempels (Fig. 4k–q en uitgebreide gegevens, Fig. 10h–q). Inderdaad, ongeveer 54% van de opto-gelabelde afzonderlijke eenheden vertoonde een significant verhoogde opwindingsfrequentie na snorhaarstimulatie, met een piek rond 650 ms (Fig. 4r). Samengevat suggereren deze gegevens dat t-hCO de juiste functionele input ontvangt en geactiveerd kan worden door omgevingstimuli.
Vervolgens onderzochten we of t-hCO-netwerken bij ratten konden activeren om gedrag te sturen. Eerst onderzochten we of de axonen van t-hCO-neuronen in de omliggende weefsels van de rat projecteren. We infecteerden hCO met een lentivirus dat codeert voor hChR2, gefuseerd aan EYFP (hChR2-EYFP). Na 110 dagen observeerden we EYFP-expressie in ipsilaterale corticale gebieden, waaronder de auditieve, motorische en somatosensorische cortex, evenals in subcorticale gebieden, waaronder het striatum, de hippocampus en de thalamus (Fig. 5a). Om te beoordelen of deze efferente projecties synaptische reacties in rattencellen konden opwekken, activeerden we t-hCO-cellen die hChR2-EYFP tot expressie brachten optisch door scherpe hersensecties van rattenhersencortexcellen op te nemen. Activering van t-hCO-axonen met blauw licht induceerde EPSC's met korte latentie in neuronen van de piramidale cortex van ratten, die werden geblokkeerd door NBQX (Fig. 5b-g). Bovendien konden deze reacties worden geblokkeerd door tetrodotoxine (TTX) en hersteld door 4-aminopyridine (4-AP), wat suggereert dat ze werden veroorzaakt door monosynaptische verbindingen (Fig. 5e).
a, Schematisch diagram van axontracking (links). t-hCO EYFP-expressie (rechts). Schaalbalk, 100 µm. A1, auditieve cortex, ACC, anterieure cingulate cortex, d. striatum, dorsaal striatum, HPC, hippocampus; diafragma, lateraal septum, mPFC, mediale prefrontale cortex, piriformis cortex, v. striatum, ventraal striatum, VPM, ventropostomediale nucleus van de thalamus, VTA, ventrale tegmentale regio. De rode vierkanten geven de hersengebieden weer waar de beelden zijn genomen. b, Schematisch diagram van het stimulatie-experiment. c, d, Voorbeelden van de respons op door blauw licht geïnduceerde fotostroom (boven) en spanning (onder) in humane (c) EYFP+ t-hCO of ratten (d) EYFP- cellen. e, f, Huidige sporen van rattenneuronen na stimulatie van t-hCO-axonen met blauw licht met TTX en 4-AR (groen), TTX (grijs) of aCSF (zwart) (e), met (paars) of zonder (zwart) ) ) NBQX (e). g, latentie van reacties geïnduceerd door blauw licht in rattencellen (n = 16 cellen); horizontale balken geven de gemiddelde latentie aan (7,13 ms) (links). Amplitude van door licht opgewekte EPSC's opgenomen met of zonder NBQX (n = 7 cellen; ***P < 0,0001) (midden). Amplitude van door licht opgewekte EPSC's opgenomen met of zonder NBQX (n = 7 cellen; ***P < 0,0001) (midden). Als u EPSC gebruikt, kunt u dit met NBQX doen (n = 7 punten; ***P <0,0001) (in центре). Amplitude van lichtgeïnduceerde EPSC's opgenomen met of zonder NBQX (n = 7 cellen; ***P < 0,0001) (midden).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Als u EPSC gebruikt, kunt u dit met NBQX doen (n = 7 punten; ***P <0,0001) (in центре). Amplitude van lichtgeïnduceerde EPSC's opgenomen met of zonder NBQX (n = 7 cellen; ***P < 0,0001) (midden).Percentage rattencellen met EPSC's die reageren op blauw licht (rechts). h, Schematisch diagram van een gedragstaak. d0, dag 0. i. Prestaties van voorbeeldige dieren op dag 1 (links) of dag 15 (rechts) van de training. Het gemiddelde aantal likken uitgevoerd op dag 1 (links) of dag 15 (rechts in het midden) (n = 150 blauwlichtproeven, n = 150 roodlichtproeven; ***P < 0,0001). Het gemiddelde aantal likken uitgevoerd op dag 1 (links) of dag 15 (rechts in het midden) (n = 150 blauwlichtproeven, n = 150 roodlichtproeven; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных in день 1 (слева) или день 15 (in центре справа) (n = 150 eenheden met een waarde, n = 150 eenheden красным светом; ***P<0,0001). Gemiddeld aantal likken uitgevoerd op dag 1 (links) of dag 15 (midden rechts) (n = 150 blauwlichtproeven, n = 150 roodlichtproeven; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 ***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных in день 1 (слева) или день 15 (in центре справа) (n = 150 eenheden met een waarde, n = 150 eenheden красным светом; ***P<0,0001). Gemiddeld aantal likken uitgevoerd op dag 1 (links) of dag 15 (midden rechts) (n = 150 blauwlichtproeven, n = 150 roodlichtproeven; ***P < 0,0001).Cumulatieve likbewegingen voor proeven met rood en blauw licht op dag 1 (links midden) of dag 15 (rechts). NS, niet significant. j,k, Gedragskenmerken van alle dieren die op dag 1 of 15 getransplanteerd zijn met t-hCO-expressie van hChR2-EYFP (j) of controlefluorofoor (k) (hChR2-EYFP: n = 9 ratten, ** P = 0,0049; controle: n = 9, P = 0,1497). l, Evolutie van voorkeurscore (n = 9 hChR2, n = 9 controle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolutie van voorkeurscore (n = 9 hChR2, n = 9 controle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolutie van de voorkeurscore (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolutie van voorkeurscores (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-expressie in reactie op optogenetische activering van t-hCO in S1. Afbeeldingen van FOS-expressie (links) en kwantificering (n = 3 per groep; *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001) (rechts) worden weergegeven. Afbeeldingen van FOS-expressie (links) en kwantificering (n = 3 per groep; *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001) (rechts) worden weergegeven. FOS (слева) en количественного определения (n = 3 op группу; * P <0,05, ** P <0,01 en *** P <0,001) (справа). Afbeeldingen van FOS-expressie (links) en kwantificering (n = 3 per groep; *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001) worden rechts weergegeven.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 FOS (слева) en количественного определения (n = 3 op группу; * P <0,05, ** P <0,01 en *** P <0,001) (справа). Afbeeldingen van FOS-expressie (links) en kwantificering (n = 3 per groep; *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001) worden rechts weergegeven.Schaalbalk, 100 µm. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van BLA, basolaterale tonsil, MDT, dorsomediale thalamuskern, PAG, periaqueductaal grijs.
Tot slot vroegen we ons af of t-hCO rattengedrag kon moduleren. Om dit te testen, transplanteerden we hCO met hChR2-EYFP-expressie in S1 en 90 dagen later implanteerden we optische vezels in t-hCO voor lichtafgifte. Vervolgens trainden we de ratten met een gemodificeerd operant conditioneringparadigma (Fig. 5h). We plaatsten de dieren in een gedragstestkamer en pasten willekeurig 5 seconden lang blauwe (473 nm) en rode (635 nm) laserstimuli toe. Dieren kregen een waterbeloning als ze likten tijdens stimulatie met blauw licht, maar likten niet tijdens stimulatie met rood licht. Op de eerste dag van de training vertoonden de dieren geen verschil in likken bij stimulatie met blauw of rood licht. Op dag 15 vertoonden dieren die getransplanteerd waren met hCO met hChR2-EYFP-expressie echter actiever likken bij stimulatie met blauw licht in vergelijking met stimulatie met rood licht. Deze veranderingen in likgedrag werden niet waargenomen bij controlegroepen die getransplanteerd waren met hCO3 dat de controlefluorofoor tot expressie bracht (leersuccespercentage: hChR2 89%, EYFP 0%, Figuur 5i-1 en Aanvullende Video 2). Deze gegevens suggereren dat t-hCO-cellen rattenneuronen kunnen activeren om beloningszoekend gedrag te stimuleren. Om te achterhalen welke t-hCO-neuroncircuits bij ratten mogelijk betrokken zijn bij deze gedragsveranderingen, activeerden we t-hCO3 optogenetisch in getrainde dieren en verzamelden we 90 minuten later weefsel. Immunohistochemie toonde expressie van het activiteitsafhankelijke FOS-eiwit in verschillende hersengebieden die betrokken zijn bij gemotiveerd gedrag, waaronder de mediale prefrontale cortex, mediale thalamus en periaqueductale grijze stof, die tot expressie kwam in ongestimuleerde controlegroepen of in dieren. (rijst. 5m). Samengevat suggereren deze gegevens dat t-hCO3 de neuronale activiteit van ratten kan moduleren om gedrag te sturen.
Neurale organoïden vormen een veelbelovend systeem voor het bestuderen van menselijke ontwikkeling en ziekte in vitro, maar ze worden beperkt door het gebrek aan verbindingen tussen de circuits die in vivo wel bestaan. We hebben een nieuw platform ontwikkeld waarbij we hCO transplanteerden in S1 van immuungecompromitteerde ratten in de vroege postnatale fase om de ontwikkeling en functie van menselijke cellen in vivo te bestuderen. We hebben aangetoond dat t-hCO volwassen celtypen ontwikkelt die niet in vitro zijn waargenomen28 en dat t-hCO anatomisch en functioneel geïntegreerd is in de hersenen van knaagdieren. De integratie van t-hCO in de neurale circuits van knaagdieren stelde ons in staat een verband te leggen tussen menselijke cellulaire activiteit en het bestudeerde diergedrag. Dit toont aan dat t-hCO-neuronen de neuronale activiteit van ratten kunnen moduleren om gedragsreacties te stimuleren.
Het platform dat we beschrijven, heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder onderzoek naar het transplanteren van menselijke cellen in knaagdierhersenen. Ten eerste hebben we hCO getransplanteerd in de zich ontwikkelende cortex van vroeg-postnatale ratten, wat de anatomische en functionele integratie kan vergemakkelijken. Ten tweede stelde t-hCO MRI-monitoring ons in staat om de positie en groei van het transplantaat bij levende dieren te bestuderen, waardoor we langetermijnstudies met meerdere dieren konden uitvoeren en de betrouwbaarheid van verschillende hiPS-cellijnen konden vaststellen. Tot slot hebben we intacte organoïden getransplanteerd in plaats van geïsoleerde suspensies van individuele cellen, die minder destructief zijn voor menselijke cellen en de integratie en aanmaak van menselijke cortexneuronen in rattenhersenen kunnen bevorderen.
We erkennen dat ondanks de vooruitgang in dit platform, tijdelijke, ruimtelijke en soortoverschrijdende beperkingen de vorming van menselijke neurale circuits met hoge betrouwbaarheid verhinderen, zelfs na transplantatie in een vroeg stadium van ontwikkeling. Het is bijvoorbeeld niet duidelijk of de spontane activiteit die wordt waargenomen in t-hCO een ontwikkelingsfenotype vertegenwoordigt dat vergelijkbaar is met de ritmische activiteit die wordt waargenomen tijdens de corticale ontwikkeling, of dat dit te wijten is aan de afwezigheid van suppressieve celtypen die aanwezig zijn in t-hCO. Evenzo is het niet duidelijk in hoeverre de afwezigheid van laminatie in t-hCO de ketenconnectiviteit beïnvloedt30. Toekomstig werk zal zich richten op de integratie van andere celtypen, zoals humane microglia, humane endotheelcellen en variërende proporties GABA-erge interneuronen, zoals aangetoond met behulp van assembly 6 in vitro, evenals het begrijpen hoe neurale integratie en verwerking kunnen plaatsvinden op transcriptioneel, synaptisch en gedragsniveau in cellen afkomstig van patiënten.
Al met al vormt dit in-vivoplatform een ​​krachtige bron die de in-vitro-ontwikkeling van de menselijke hersenen en het onderzoek naar ziekten kan aanvullen. We verwachten dat dit platform ons in staat zal stellen om nieuwe fenotypes op strengniveau te ontdekken in anderszins ongrijpbare, van patiënten afkomstige cellen en nieuwe therapeutische strategieën te testen.
We genereerden hCO2.5 uit HiPS-cellen zoals eerder beschreven. Om de hCO2-productie te initiëren van hiPS-cellen gekweekt op feeder-lagen, werden intacte kolonies van hiPS-cellen uit kweekschalen verwijderd met behulp van dispase (0,35 mg/ml) en overgebracht naar plastic culturen met ultralage hechting, die schaaltjes met hiPS-celkweekmedium bevatten. (Corning) aangevuld met twee SMAD-remmers: dorsomorfine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) en ROCK-remmer Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Gedurende de eerste 5 dagen werd het hiPS-celmedium dagelijks ververst en werden dorsomorfine en SB-431542 toegevoegd. Op de zesde dag in suspensie werden neurale sferoïden overgebracht naar neuraal medium met neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement zonder vitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilline en streptomycine (1:100, Life Technologies) en aangevuld met de epidermale groeifactor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tot dag 24. Van dag 25 tot dag 42 werd het medium aangevuld met door de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) met mediumwisselingen om de dag. Op de zesde dag in suspensie werden neurale sferoïden overgebracht naar neuraal medium met neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement zonder vitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilline en streptomycine (1:100, Life Technologies) en aangevuld met de epidermale groeifactor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tot dag 24. Van dag 25 tot dag 42 werd het medium aangevuld met door de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) met mediumwisselingen om de dag.Op de zesde dag in suspensie werden de neurale sferoïden overgebracht naar een neuraal medium met Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement zonder vitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) en penicilline.en стрептомицин (1:100, Life Technologies) en дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) en фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) naar 24-го дня. en streptomycine (1:100, Life Technologies) en aangevuld met epidermale groeifactor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) tot dag 24.Van dag 25 tot en met 42 werden brain-derived neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) aan het medium toegevoegd, waarbij het medium om de dag werd ververst.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,，Life Technologies）,不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologieën）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D-systemen）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systemen）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888, Life Technologies） 不 含 维生素 a 的b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 ， Life Technologieën） 表皮 生长 因子 ((20 ng ml-1; r & d-systemen) 成 纤维 细胞 生长 2 (fgf2; 20 ng ml-1; R&D-systemen) 直至第24天。 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, одержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) met meer informatie роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) en фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Op dag 6 werden de neurosfeersuspensies overgeschakeld naar een supplement met neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement zonder vitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilline-geneutraliseerde streptomycine (1:100, Life Technologies) aangevuld met epidermale groeifactor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) op 24-jarige leeftijd. R&D Systems) tot dag 24.Van dag 25 tot en met 42 werden om de dag hersenneurotrofe factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofe factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) aan het kweekmedium toegevoegd. Mediumverversing vond eenmaal plaats.Vanaf dag 43 werd hCO2 gehandhaafd in ongesupplementeerd neurobasaal-A-medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) met mediumverversing om de 4-6 dagen. Om hCO2 te verkrijgen uit hiPS-cellen die gekweekt waren onder feederless-omstandigheden, werden hiPS-cellen 7 minuten geïncubeerd met Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) bij 37 °C, gedissocieerd in individuele cellen en uitgeplaat op AggreWell 800-platen (34815, STEMCELL Technologies) met een dichtheid van 3 × 106 individuele cellen per well in Essential 8-medium aangevuld met de ROCK-remmer Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Na 24 uur werden de media in de wells op en neer gepipetteerd in media met Essential 6-media (A1516401, Life Technologies), aangevuld met dorsomorfine (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Van dag 2 tot en met 6 werd Essential 6-medium dagelijks vervangen door dorsomorfine en supplement SB-431542. Vanaf dag 6 werden de neurosfeersuspensies overgebracht naar het neurobasale medium en bewaard zoals hierboven beschreven.
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging, goedgekeurd door de Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Drachtige euthymische RNU (rnu/+) ratten werden gekocht (Charles River Laboratories) of gehuisvest. De dieren werden gehouden in een licht-donkercyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum. Naakte (FOXN1–/–) rattenjongen van drie tot zeven dagen oud werden geïdentificeerd door de groei van onvolgroeide snorharen vóór de afschot. Puppy's (mannelijk en vrouwelijk) werden verdoofd met 2-3% isofluraan en op een stereotactisch frame geplaatst. Een trepanatie van de schedel met een diameter van ongeveer 2-3 mm boven S1 werd uitgevoerd, waarbij de integriteit van de dura mater behouden bleef. Gebruik vervolgens een 30-G naald (ongeveer 0,3 mm) net buiten de craniotomie om de dura te doorboren. Breng vervolgens HCO aan op een dunne parafilm van 3 × 3 cm en verwijder overtollig medium. Gebruik een Hamilton-spuit, bevestigd aan een naald van 23 G en 45°, om voorzichtig hCO2 in het meest distale uiteinde van de naald te zuigen. Installeer vervolgens de spuit op de spuitpomp die is aangesloten op het stereotactische apparaat. Plaats vervolgens de punt van de naald over een eerder gemaakt punctiegaatje van 0,3 mm breed in de dura (z = 0 mm) en vernauw de spuit 1-2 mm (z = ongeveer -1,5 mm) totdat de naald zich tussen de dura mater A bevindt. Er ontstaat een dichte afsluiting. Breng vervolgens de spuit omhoog naar het midden van het corticale oppervlak bij z = -0,5 mm en injecteer hCO2 met een snelheid van 1-2 µl per minuut. Na voltooiing van de hCO2-injectie wordt de naald teruggetrokken met een snelheid van 0,2-0,5 mm per minuut, wordt de huid gehecht en wordt de pup onmiddellijk op een warm verwarmingskussen gelegd totdat hij volledig is hersteld. Sommige dieren werden bilateraal getransplanteerd.
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de door Stanford University APLAC goedgekeurde richtlijnen voor dierverzorging. Ratten (meer dan 60 dagen na transplantatie) werden geïnduceerd met 5% isofluraananesthesie en verdoofd met 1-3% isofluraan tijdens de beeldvorming. Voor visualisatie werd een 7 Tesla actief afgeschermde horizontale boorgatscanner Bruker (Bruker Corp.) met een International Electric Company (IECO) gradiëntaandrijving, een afgeschermde gradiëntinzet met een interne diameter van 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) gebruikt met AVANCE. III, achtkanaals multi-coil RF en multi-core-functionaliteit, en het bijbehorende Paravision 6.0.1-platform. De opname werd uitgevoerd met een actief ontkoppelde volumetrische RF-spoel met een interne diameter van 86 mm en een vierkanaals cryogekoelde RF-spoel, uitsluitend voor ontvangst. Axiale 2D Turbo-RARE (herhalingstijd = 2500 ms, echotijd = 33 ms, 2 gemiddelden) met 16 slice captures, slice dikte 0,6–0,8 mm, met 256 × 256 samples. De signalen werden ontvangen met behulp van een kwadratuur transceiver volumetrische RF-spoel met een interne diameter van 2 cm (Rapid MR International, LLC). Gebruik ten slotte de ingebouwde Imaris (BitPlane) oppervlakteschattingsfuncties voor 3D-rendering en volumeanalyse. Een succesvolle transplantatie werd gedefinieerd als een transplantatie waarbij gebieden met een continu T2-gewogen MRI-signaal werden gevormd in de getransplanteerde hemisfeer. Graftafstoting werd gedefinieerd als een transplantaat dat geen gebieden met een continu T2-gewogen MRI-signaal produceerde in de getransplanteerde hemisfeer. Subcorticale t-hCO werd uitgesloten van de verdere analyse.
Om GCaMP6s stabiel tot expressie te brengen in hCO2 voor tweefoton-calciumbeeldvorming, werden hiPS-cellen geïnfecteerd met pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, gevolgd door selectie van antibiotica. Kort gezegd werden de cellen gedissocieerd met EDTA en gesuspendeerd in 1 ml Essential 8-medium met een dichtheid van ongeveer 300.000 cellen in aanwezigheid van polybreen (5 μg/ml) en 15 μl virus. De cellen werden vervolgens 60 minuten in suspensie geïncubeerd en geënt met een dichtheid van 50.000 cellen per well. Na confluentie werden de cellen behandeld met 5-10 μg ml-1 puromycine gedurende 5-10 dagen of totdat stabiele kolonies ontstonden. Acute hCO2-infectie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven5 met enkele aanpassingen. Kort gezegd: breng dag 30-45 hCO2 over in 1,5 ml Eppendorf-microcentrifugebuisjes met 100 µl zenuwmedium. Vervolgens wordt ongeveer 90 µl medium verwijderd, 3-6 µl lentivirus met een hoge titer (van 0,5 x 108 tot 1,2 x 109) aan de buis toegevoegd en de hCO3 gedurende 30 minuten in de incubator geplaatst. Voeg vervolgens 90-100 µl medium toe aan elke buis en zet de buizen een nacht terug in de incubator. De volgende dag wordt de hCO3 overgebracht naar vers zenuwmedium in platen met lage hechting. Na 7 dagen werd de hCO3 overgebracht naar 24-wells platen met glazen bodem voor visualisatie en evaluatie van de infectiekwaliteit. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE en pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE werden gegenereerd met VectorBuilder. Lentivirus wordt in de meeste experimenten gebruikt omdat het geïntegreerd is in het gastheergenoom, waardoor reportergenexpressie in geïnfecteerde cellijnen mogelijk is. Voor de follow-up van hondsdolheid werd hCO op dag 30-45 gecoïnfecteerd met rabies-ΔG-eGFP en AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmide #67528, Addgene), grondig gewassen gedurende 3 dagen en getransplanteerd in ratten in S1 en in vivo gehouden gedurende 7-14 dagen.
Voor immunocytochemie werden dieren verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met PBS gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences). Hersenen werden gefixeerd in 4% PFA gedurende 2 uur of een nacht bij 4 °C, cryoconserveerd in 30% sucrose in PBS gedurende 48-72 uur en ingebed in 1:1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) en coronale secties werden gemaakt op 30 µm met behulp van een cryostaat (Leica). Voor immunohistochemie van dikke secties werden dieren geperfuseerd met PBS en werden de hersenen gedissecteerd en coronaal gesneden op 300-400 µm met behulp van een vibratoom (Leica) en de secties werden gefixeerd met 4% PFA gedurende 30 minuten. Vervolgens werden de cryosecties of dikke secties gewassen met PBS, gedurende 1 uur geblokkeerd bij kamertemperatuur (10% normaal ezelserum (NDS) en 0,3% Triton X-100 verdund in PBS) en geblokkeerd met een blokkeeroplossing bij 4°C. – Incubatie De cryosecties werden een nacht geïncubeerd en de dikke secties werden gedurende 5 dagen geïncubeerd. De primaire antilichamen die werden gebruikt waren: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konijn, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konijn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konijn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konijn, 1:200; HPA047819, Atlas-antilichamen), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konijn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konijn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). De primaire antilichamen die werden gebruikt waren: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konijn, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konijn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konijn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konijn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konijn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konijn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1 :100; ab5076, abcam). Gebruik de volgende gegevens: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (мышиный, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). De primaire antilichamen die werden gebruikt waren: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konijn, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konijn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konijn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konijn, 1:200; HPA047819, Atlas-antilichamen), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konijn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konijn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81,abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D-systemen），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181,abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D-systemen），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systemen）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konijn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam).De primaire gebruikte antilichamen waren: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konijn, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kip, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konijn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konijn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konijn, 1:200; HPA047819, Atlas-antilichaam), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konijn), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konijn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).De coupes werden vervolgens gewassen met PBS en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (bevroren coupes) of een nacht bij 4 °C (dikke coupes) geïncubeerd met secundair antilichaam. Alexa Fluor secundair antilichaam (Life Technologies) verdund 1:1000 in blokkerende oplossing werd gebruikt. Na het wassen met PBS werden de kernen gevisualiseerd met een Hoechst 33258 (Life Technologies). Ten slotte werden de objectglaasjes op een microscoop geplaatst met dekglaasjes (Fisher Scientific) met behulp van een Aquamount (Polysciences) en geanalyseerd op een Keyence fluorescentiemicroscoop (BZ-X analyzer) of een Leica TCS SP8 confocale microscoop (Las-X) op de afbeelding. De afbeeldingen werden verwerkt met behulp van het ImageJ-programma (Fiji). Om het aandeel menselijke neuronen in t-hCO en de rattencortex te kwantificeren, werden 387,5 μm brede rechthoekige afbeeldingen gemaakt in het centrum van de t-hCO, op of nabij de rand van de rattencortex. De transplantaatranden werden bepaald door veranderingen in weefseltransparantie, HNA+-kernen en/of de aanwezigheid van weefselautofluorescentie te beoordelen. In elke afbeelding werd het totale aantal NeuN+- en HNA+-cellen gedeeld door het totale aantal NeuN+-cellen in hetzelfde gebied. Om ervoor te zorgen dat alleen cellen met kernen in het beeldvlak worden meegeteld, worden alleen cellen die ook Hoechst+ zijn, in de berekening meegenomen. Twee afbeeldingen met een tussenruimte van minimaal 1 mm werden gemiddeld om de statistische fout te verkleinen.
Plaats de hCO-transplantaatdieren (ongeveer 8 maanden differentiatie) een week vóór de monsterafname in een donkere kamer met bijgeknipte snorharen om sensorische stimulatie te minimaliseren. De isolatie van de kernen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met enkele aanpassingen. Kort gezegd werden t-hCO en hCO vernietigd met behulp van detergent-mechanische cellysis en een 2 ml glazen weefselmolen (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). De ruwe kernen werden vervolgens afgefiltreerd met een 40 µm filter en 10 minuten gecentrifugeerd bij 320 g bij 4 °C, waarna een sucrosedichtheidsgradiënt werd uitgevoerd. Na de centrifugatiestap (320 g gedurende 20 minuten bij 4 °C) werden de monsters geresuspendeerd in 0,04% BSA/PBS met toevoeging van 0,2 eenheden µl-1 RNase-remmer (40 u µl-1, AM2682, Ambion) en door een 40 µm-flowfilter geleid. De gedissocieerde kernen werden vervolgens geresuspendeerd in PBS met 0,02% BSA en geladen op een Chromium Single Cell 3'-chip (geschatte opbrengst van 8000 cellen per baan). snRNA-seq-bibliotheken werden bereid met de Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-bibliotheken werden bereid met de Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Met snRNA-seq kunt u de Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) gebruiken. De snRNA-seq-bibliotheken werden bereid met behulp van Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Het snRNA-seq-apparaat bevat Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). De snRNA-seq-bibliotheek werd voorbereid met behulp van Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotheken van verschillende monsters werden samengevoegd en gesequenced door Admera Health op NovaSeq S4 (Illumina).
De genexpressieniveaus voor elke veronderstelde nucleaire barcode werden gekwantificeerd met behulp van de 10x Genomics CellRanger-analysesoftware (versie 6.1.2). De reads werden vergeleken met een combinatie van humane (GRCh38, Ensemble, versie 98) en rattenreferentiegenomen (Rnor_6.0, Ensemble, versie 100), gecreëerd met de opdracht mkref en met behulp van count met de opdracht –include-introns=TRUE om include-reads te kwantificeren die waren toegewezen aan intronregio's. Voor t-hCO-monsters werden humane kernen geïdentificeerd op basis van de conservatieve eis dat ten minste 95% van alle toegewezen reads overeenkomt met het humane genoom. Alle daaropvolgende analyses werden uitgevoerd op een gefilterde barcode-array-uitvoer van de CellRanger met behulp van het R-pakket (versie 4.1.2) Seurat (versie 4.1.1)32.
Om ervoor te zorgen dat alleen kernen van hoge kwaliteit in de daaropvolgende analyse worden opgenomen, werd voor elk monster een iteratief filterproces geïmplementeerd. Eerst werden kernen van lage kwaliteit met minder dan 1000 unieke genen en meer dan 20% van de totale mitochondriën geïdentificeerd en verwijderd. Vervolgens werd de matrix met onbewerkte genen genormaliseerd door middel van geregulariseerde negatieve binominale regressie met behulp van de sctransform(vst.flavor=”v2″)-functie, die ook de 3000 meest variabele genen identificeerde met behulp van standaardparameters. Dimensiereductie werd uitgevoerd op de genen met de hoogste variabele met behulp van Principal Component Analysis (PCA) met standaardparameters met een datasetdimensie van 30 (dims = 30 werd gekozen op basis van visuele inspectie van knielocaties en gebruikt voor alle monsters en ensembleanalyses). Vervolgens voerden we verschillende rondes van iteratieve clustering uit (resolutie = 1) om genen te classificeren op basis van een abnormaal laag aantal genen (mediaan onder het 10e percentiel) en een abnormaal hoog aantal mitochondriale genen (mediaan boven het 95e percentiel). Dit resulteerde in de identificatie en verwijdering van mogelijke cellen van lage kwaliteit. clusters en/of een hoog percentage vermoedelijke tweelingen geïdentificeerd met behulp van het DoubletFinder33-pakket (gemiddelde DoubletFinder-score boven het 95e percentiel). t-hCO-monsters (n=3) en hCO-monsters (n=3). werden afzonderlijk geïntegreerd met behulp van de IntegrateData-functie met de bovenstaande parameters. Vervolgens werd een nieuwe ronde kwalitatieve filtering van de geïntegreerde dataset uitgevoerd, zoals hierboven beschreven.
Na het verwijderen van de kernels van lage kwaliteit werd de geïntegreerde dataset gegroepeerd (resolutie = 0,5) en ingebed voor UMAP34-visualisatiedoeleinden. Markergenen voor elk cluster werden bepaald met behulp van de FindMarkers-functie met standaardparameters berekend op basis van genormaliseerde genexpressiegegevens. We identificeren en classificeren belangrijke celklassen door foetale en volwassen corticale referentiedatasets te combineren met markergenexpressie 19, 20, 21, 35 en annotatie. Circulerende precursors werden met name geïdentificeerd door de expressie van MKI67 en TOP2A. Progenitorclusters werden gedefinieerd door de afwezigheid van mitotische transcripten, hoge overlap met multipotente gliale progenitorclusters beschreven in de foetale cortex in de late metafase, en EGFR- en OLIG1-expressie. We gebruiken de term astrocyt om verschillende stadia van astrocytdifferentiatie te omvatten, van late radiale glia tot maturatie van astrocyten. Astrocytclusters brengen hoge niveaus van SLC1A3 en AQP4 tot expressie en blijken te passen bij subtypes van foetale radiale glia en/of volwassen astrocyten. OPC's brengen PDGFRA en SOX10 tot expressie, terwijl oligodendrocyten myelinisatiemarkers (MOG en MYRF) tot expressie brengen. Glutamaterge neuronen werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van neuronale transcripten (SYT1 en SNAP25), de afwezigheid van GABA-erge markers (GAD2) en de expressie van NEUROD6, SLC17A7, BCL11B of SATB2. GluN-neuronen werden verder onderverdeeld in hogere (SATB2-expressie en verlies van BCL11B) en diepe (BCL11B-expressie) subklassen. Veronderstelde subplaatneuronen (SP) brengen bekende SP18-markers tot expressie, zoals ST18 en SORCS1, naast diepe GluN-markers. Cellen die op het plexus choroideus lijken, werden geïdentificeerd op basis van TTR-expressie. Cellen die op het meningeaal lijken, drukten fibroblast-geassocieerde genen uit en brachten pia-/vasculaire cellen van de referentiegegevensset in kaart.
Differentiële analyse van genexpressie tussen t-hCO- en hCO-subklassen werd uitgevoerd met behulp van een nieuw ontwikkelde pseudo-batchmethode, gereproduceerd in samples, geïmplementeerd met het Libra R-pakket (versie 1.0.0). EdgeR log-likelihood tests (versie 3.36.0, pakket R) werden specifiek uitgevoerd voor groepen door het aantal genen in cellen voor een bepaalde celklasse op te tellen voor elke samplereplicatie. Voor heatmapvisualisatie werden genormaliseerde waarden per miljoen (CPM) berekend met behulp van edgeR (cpm()-functie) en geschaald (om een ​​gemiddelde van 0 en een standaarddeviatie van 1 te verkrijgen). Gene Ontology (GO)-verrijkingsanalyse van significant opgereguleerde t-hCO GluN-genen werd uitgevoerd (Benjamini-Hochberg gecorrigeerde p-waarde van minder dan 0,05, uitgedrukt in ten minste 10% van de t-hCO GluN-cellen en een factor 2-toename in verandering). Uitgevoerd met behulp van ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. We gebruiken de ToppFun-app met standaardparameters en rapporteren Benjamini-Hochberg-gecorrigeerde p-waarden berekend op basis van GO-geannoteerde hypergeometrische tests.
Om onze snRNA-seq-clusters te matchen met geannoteerde celclusters uit referentiestudies van primaire single-cell RNA-seq of adult snRNA-seq19,20,21,22, hebben we een paired dataset-integratiebenadering toegepast. We gebruikten de SCTransform (v2) normalisatieworkflow in Seurat om clusteroverlap tussen datasets te integreren en te vergelijken (met dezelfde parameters als hierboven). Individuele datasets werden willekeurig gesubset tot 500 cellen of cores per oorspronkelijke cluster voor rekenefficiëntie. Met een vergelijkbare aanpak als eerder beschreven, werd clusteroverlap gedefinieerd als het percentage cellen of kernen in elke gepoolde cluster dat overlapte met het label van de referentiecluster. Om GluN's verder te classificeren, gebruikten we Seurats TransferData-workflow voor GluN-subsetgegevens om referentiedatasetlabels aan onze GluN-cellen toe te wijzen.
Om de maturatiestatus van het globale transcriptoom van t-hCO- en hCO-monsters te beoordelen, vergeleken we onze pseudo-bulkmonsters met BrainSpan/psychENCODE23, een grote RNA-sequentie die de ontwikkeling van de menselijke hersenen bestrijkt. We voerden PCA uit op een gecombineerde patroongenormaliseerde genexpressiematrix uit corticale monsters 10 weken na de conceptie en later, in 5567 genen (samen met onze data) die eerder als actief waren geïdentificeerd in corticale monsters van BrainSpan (gedefinieerd als meer dan 50% ontwikkelingsvariantie verklaard door leeftijd met behulp van een kubisch model)38. Daarnaast leidden we genen af ​​die geassocieerd zijn met belangrijke transcriptoomkenmerken van neurologische ontwikkeling met behulp van niet-negatieve matrixfactorisatie, zoals eerder beschreven. De monstergewichten berekend met behulp van de niet-negatieve matrixfactorisatieprocedure zijn weergegeven in Fig. 5b met uitgebreide gegevens voor elk van de vijf kenmerken beschreven door Zhu et al.38. Ook hier werden activiteitsafhankelijke transcriptionele markers afgeleid uit eerder gepubliceerde studies. Met name ERG en LRG waren significant verhoogd in glutamaterge neuronen, geïdentificeerd door de snRNA-seq-collectie van de visuele cortex van muizen na visuele stimulatie, zoals weergegeven in aanvullende tabel 3 (Hrvatin et al.16). Met mensen verrijkte LRG's werden verkregen uit met KCl geactiveerde menselijke foetale hersenkweken en 6 uur na stimulatie geoogst. De gefilterde genen waren significant verhoogd bij mensen, maar niet bij knaagdieren (aanvullende tabel 4). Analyse van de verrijking van genensets met behulp van deze genensets werd uitgevoerd met behulp van een eenwegs-exacte Fisher-toets.
Verdoof ratten met isofluraan, verwijder de hersenen en plaats ze in koude (ongeveer 4 °C) zuurstofrijke (95% O₂ en 5% CO₂) sucroseoplossing voor coupes die het volgende bevatten: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO₂, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₂, 10 mM MgSO₂ en 0,5 mM CaCl₂ (ongeveer 310 mOsm). Coronale coupes van rattenhersenen (300–400 µm) met t-hCO₂ werden gemaakt met een Leica VT1200-vibratoom zoals eerder beschreven39. De coupes werden vervolgens overgebracht naar een snijkamer met continue zuurstoftoevoer bij kamertemperatuur, met aCSF bereid uit: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 en 126 mM NaCl (298 mOsm). Dit gebeurde ten minste 45 minuten vóór de opname. De coupes werden opgenomen in een ondergedompelde kamer waar ze continu werden doorstroomd met aCSF (een flesje met 95% O2 en 5% CO2). Alle gegevens werden bij kamertemperatuur geregistreerd. t-hCO-neuronen werden afgesloten met een pipet van borosilicaatglas gevuld met een oplossing van 127 mM kaliumgluconaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium-ATP, 0,3 mM natrium-GTP, 10 mM HEPES en 0,6 mM EGTA, pH 7,2, interne oplossing gecorrigeerd met KOH (290 mOsm). Om de opname te herstellen, werd biocytine (0,2%) aan de opnamevloeistof toegevoegd.
De gegevens werden verkregen met een MultiClamp 700B-versterker (Molecular Devices) en een Digidata 1550B-digitaliseerder (Molecular Devices), laagdoorlaatgefilterd op 2 kHz, gedigitaliseerd op 20 kHz en geanalyseerd met Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) en aangepaste MATLAB-functies (Mathworks). De junctiepotentiaal werd berekend met JPCalc en de waarden werden aangepast aan de berekende waarde van -14 mV. Operatie IV bestaat uit een reeks stroomstappen in stappen van 10-25 pA, van -250 tot 750 pA.
De thalamus, witte stof en S1-afferenten werden elektrisch gestimuleerd in thalamocorticale slices tijdens patch-clamp-opnames van hCO-neuronen, zoals eerder beschreven. Kort gezegd: de hersenen werden op een 3D-printtafel geplaatst, gekanteld onder een hoek van 10°, en de voorkant van de hersenen werd onder een hoek van 35° gesneden. De hersenen werden vervolgens aan het snijvlak gelijmd en in coupes gesneden, waarbij de uitstekende thalamocorticale axonen behouden bleven. Bipolaire wolfraamelektroden (0,5 MΩ) werden op een tweede micromanipulator gemonteerd en strategisch gepositioneerd om vier regio's per cel te stimuleren (binnenste capsule, witte stof, S1 en hCO). Registreer synaptische responsen na 300 µA fasische stimulatie met 0,03–0,1 Hz.
HCO-neuronen die hChR2 tot expressie brachten, werden geactiveerd bij 480 nm en lichtpulsen, gegenereerd door een LED (Prizmatix), werden via een ×40 objectief (0,9 NA; Olympus) toegediend om de hChR2-expressie nabij de cellen te registreren. De diameter van het belichte veld is ongeveer 0,5 mm en het totale vermogen is 10-20 mW. De pulsbreedte werd ingesteld op 10 ms, wat overeenkomt met de puls die werd gegeven tijdens het gedragsleerexperiment. Er werden verschillende stimulatiefrequenties gebruikt, van 1 tot 20 Hz, maar alleen de eerste puls van de reeks werd gebruikt voor kwantificering. De intervallen tussen de reeksen zijn meestal langer dan 30 s om het effect op synaptische remmende of faciliterende paden te minimaliseren. Om te testen of de hChR2-respons monosynaptisch was, brachten we TTX (1 μM) aan op het bad totdat de EPSC-reactie verdween, en voegden vervolgens 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) toe. Normaal gesproken wordt er binnen enkele minuten een respons verkregen, met een iets langere vertraging tussen het activeren van de LED en het genereren van EPSC. NBQX (10 μM) werd gebruikt om te testen of de respons wordt aangestuurd door AMPA-receptoren.
Scherpe hCO-coupes werden gemaakt zoals eerder beschreven. Kort gezegd werden de hCO-coupes ingebed in 4% agarose en overgebracht naar cellen met 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₄ en 10 mM d-(+)-glucose. De coupes werden gesneden op 200-300 µm bij kamertemperatuur met behulp van een Leica VT1200-vibrator en bewaard in ASF bij kamertemperatuur. Vervolgens werd patch-camp registratie van hele cellen uitgevoerd op hCO-coupes onder een directe SliceScope-microscoop (Scientifica). De coupes werden geperfuseerd met aCSF (95% O₂ en 5% CO₂) en de celsignalen werden geregistreerd bij kamertemperatuur. hCO-neuronen werden toegediend met behulp van een pipet van borosilicaatglas gevuld met een oplossing van 127 mM kaliumgluconaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium-ATP, 0,3 mM natrium-GTP, 10 mM HEPES en 0,6 mM EGTA, interne pH 7,2, gecorrigeerd met KOH (osmolariteit 290). Voeg voor herstel 0,2% Biocytin toe aan de interne oplossing.
De gegevens werden verzameld met Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) met behulp van een MultiClamp 700B-versterker (Molecular Devices) en een Digidata 1550B-digitaliseerder (Molecular Devices). De gegevens werden gefilterd met een laagdoorlaatfilter op 2 kHz, gedigitaliseerd op 20 kHz en geanalyseerd met Clampfit (versie 10.6) voor analyse (Molecular Devices) en aangepaste MATLAB-functies (MATLAB 2019b, Mathworks). De junctiepotentiaal werd berekend met JPCalc en de waarden werden aangepast aan de berekende junctiepotentiaal van -14 mV. Operatie IV bestaat uit een reeks stroomstappen in stappen van 5-10 pA van -50 tot 250 pA.
Voor de morfologische reconstructie van geknepen neuronen werd 0,2% biocytine (Sigma-Aldrich) aan de interne oplossing toegevoegd. De cellen worden na het hacken ten minste 15 minuten geprimed. De pipet wordt vervolgens 1-2 minuten langzaam opgezogen totdat het geregistreerde membraan volledig is afgesloten. Na de coupefysiologische procedure werden de coupes een nacht bij 4 °C gefixeerd in 4% PFA, gewassen met PBS x3 en 1:1000 verdund met streptavidine-geconjugeerd DyLight 549 of DyLight 405 (Vector Labs). Cellen gevuld met biocytine (2%; Sigma-Aldrich) werden gelabeld tijdens patch-clamp-opname bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. De coupes werden vervolgens op microscoopglaasjes gemonteerd met behulp van een Aquamount (Thermo Scientific) en de volgende dag gevisualiseerd op een Leica TCS SP8 confocale microscoop met een olie-immersie objectief met een numerieke apertuur × 40 1,3, vergroting × 0,9–1,0, x y . De bemonsteringsfrequentie is ongeveer 7 pixels per micron. Z-stapels met intervallen van 1 µm werden serieel verkregen, en z-stapelmozaïeken en Leica-gebaseerde autostitching werden uitgevoerd om de volledige dendritische boom van elk neuron te bestrijken. Neuronen werden vervolgens semi-handmatig gevolgd met behulp van de neuTube 40-interface en er werden SWC-bestanden gegenereerd. De bestanden werden vervolgens geüpload naar de SimpleNeuriteTracer41 Fiji-plugin (ImageJ, versie 2.1.0; NIH).
Menselijk corticaal weefsel werd verkregen met geïnformeerde toestemming volgens een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board van Stanford University. Twee monsters van menselijk postpartumweefsel (3 en 18 jaar oud) werden verkregen door resectie van de frontale cortex (middenfrontale gyrus) als onderdeel van een operatie voor refractaire epilepsie. Na resectie werd het weefsel verzameld in ijskoude NMDG-aCSF met: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaHCO₄, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thioureum, 5 mM natriumascorbaat, 3 mM natriumpyruvaat, 0,5 mM CaCl₂ 4H₂O en 10 mM MgSO₂ 7H₂O. Titreer tot pH 7,3-7,4 met geconcentreerd zoutzuur. De weefsels werden binnen 30 minuten naar het laboratorium gebracht en er werden coronale coupes genomen volgens de hierboven beschreven procedure.
Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de door Stanford University APLAC goedgekeurde richtlijnen voor dierverzorging. Ratten (meer dan 140 dagen na transplantatie) werden geïnduceerd met 5% isofluraananesthesie en intraoperatief verdoofd met 1-3% isofluraan. De dieren werden in een stereotactisch frame (Kopf) geplaatst en er werd subcutaan buprenorfine met verlengde afgifte (SR) geïnjecteerd. De schedel werd vrijgelegd, gereinigd en er werden 3-5 botschroeven ingebracht. Om t-hCO te bepalen, genereerden we stereotactische coördinaten op basis van MRI-beelden. Op de gewenste locatie werd een boorgat geboord en vezels (400 µm diameter, NA 0,48, Dorisch) werden 100 µm onder het hCO-oppervlak gebracht en met UV-uithardend tandheelkundig cement (Relyx) aan de schedel bevestigd.
Vezelfotometrische opnamen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven42. Om spontane activiteit vast te leggen, werden ratten in een schone kooi geplaatst en werd een glasvezelpatchkabel (Doric) met een diameter van 400 µm, aangesloten op een glasvezelfotometrisch data-acquisitiesysteem, aangesloten op de geïmplanteerde glasvezelkabel. Tijdens de 10 minuten durende opname van motorische activiteit waren de dieren vrij om de kooi te verkennen. Om de opgewekte activiteit vast te leggen, werden ratten (meer dan 140 dagen na transplantatie) verdoofd met 5% isofluraan voor inductie en 1-3% isofluraan voor onderhoud. Plaats het dier in een stereotactisch frame (Kopf) en de snorharen aan de andere kant van de t-hCO worden bijgesneden tot ongeveer 2 cm en door een gaas geleid dat is verbonden met een piëzo-elektrische actuator (PI). Een glasvezelpatchkabel (Doric) met een diameter van 400 µm werd aangesloten op de geïmplanteerde vezel en verbonden met het data-acquisitiesysteem. De snorharen aan de andere kant van t-hCO werden vervolgens 50 keer (2 mm bij 20 Hz, 2 s per presentatie) op willekeurige tijdstippen afgebogen door een piëzo-elektrische aandrijving gedurende een opnameperiode van 20 minuten. Gebruik het Arduino MATLAB Support Package om de afbuigtijd te regelen met aangepaste MATLAB-code. Gebeurtenissen worden gesynchroniseerd met de data-acquisitiesoftware met behulp van transistor-transistorlogica (TTL)-pulsen.
Ratten (meer dan 140 dagen na transplantatie) werden geïnduceerd met 5% isofluraananesthesie en intraoperatief verdoofd met 1-3% isofluraan. De dieren werden in een stereotactisch frame (Kopf) geplaatst en buprenorfine SR en dexamethason werden subcutaan geïnjecteerd. De schedel werd vrijgelegd, gereinigd en er werden 3-5 botschroeven ingebracht. Om t-hCO2 te bepalen, genereerden we stereotactische coördinaten uit MRI-beelden. Een circulaire craniotomie (ongeveer 1 cm in diameter) werd uitgevoerd met een hogesnelheidsboor direct boven de getransplanteerde hCO2. Zodra het bot zo dun mogelijk is, maar voordat er door het hele bot wordt geboord, wordt met een tang de resterende intacte bekkenschijf verwijderd om de onderliggende t-hCO2 zichtbaar te maken. De craniotomie werd gevuld met steriele zoutoplossing en een dekglaasje en een speciale kopspeld werden met UV-uithardend tandheelkundig cement (Relyx) aan de schedel bevestigd.
Tweefotonbeeldvorming werd uitgevoerd met een Bruker multifotonmicroscoop met een Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objectief. GCaMP6-beeldvorming werd uitgevoerd bij 920 nm met een 1,4x enkele z-vlak vergroting en een 8x gemiddelde van 7,5 fps. Ratten werden geïnduceerd met 5% isofluraan anesthesie en onderhouden met 1-3% isofluraan. De ratten werden in een speciaal gemaakte kopbevestiging geplaatst en onder de lens gepositioneerd. Er werd een achtergrondopname van 3 minuten van motorische activiteit gemaakt. Gedurende 20 minuten opname werden 50 pufjes (elke presentatie 100 ms lang) willekeurig toegediend aan het snorhaarkussentje tegenover t-hCO met behulp van een picospricer. Gebruik het Arduino MATLAB Support Package om de bursttijd te regelen met aangepaste MATLAB-code. Synchroniseer gebeurtenissen met data-acquisitiesoftware (PrairieView 5.5) met behulp van TTL-pulsen. Voor analyse werden de beelden gecorrigeerd voor xy-beweging met behulp van affiene correctie in het MoCo-programma dat op Fiji werd gelanceerd. Extractie van fluorescerende sporen uit individuele cellen met behulp van CNMF-E43. Fluorescentie werd voor elk interessegebied geëxtraheerd, omgezet naar dF/F-curven en vervolgens omgezet naar z-scores.
Ratten (meer dan 140 dagen na transplantatie) werden geïnduceerd met 5% isofluraananesthesie en intraoperatief verdoofd met 1-3% isofluraan. De dieren werden in een stereotactisch frame (Kopf) geplaatst en buprenorfine SR en dexamethason werden subcutaan geïnjecteerd. De snorharen aan de andere kant van de t-hCO werden afgesneden tot ongeveer 2 cm en door een gaas geleid dat verbonden was met een piëzo-elektrische actuator. De schedel werd vrijgelegd en gereinigd. Een roestvrijstalen aardingsschroef werd aan de schedel bevestigd. Om de t-hCO te bepalen, genereerden we stereotactische coördinaten uit MRI-beelden. Voer een circulaire craniotomie uit (ongeveer 1 cm in diameter) met een hogesnelheidsboor net boven de t-hCO. Zodra het bot zo dun mogelijk is, maar voordat het hele bot wordt doorboord, gebruikt u een tang om de resterende intacte bekkenschijf te verwijderen om de onderliggende t-hCO te onthullen. Individuele cellen werden opgenomen met behulp van 32-kanaals of 64-kanaals high-density silicium probes (Cambridge Neurotech), geaard aan aardingsschroeven en voorversterkt met RHD-versterkers (Intan). Gebruik de manipulator om de elektroden via de craniotomie, die gevuld is met steriele zoutoplossing, naar de doellocatie te laten zakken. De gegevensverzameling werd uitgevoerd met een frequentie van 30 kHz met behulp van het Open Ephys data-acquisitiesysteem. De opname werd pas voortgezet toen we sterk gecorreleerde ritmische spontane activiteit in meer dan 10 kanalen detecteerden, wat suggereert dat de elektroden zich in het transplantaat bevonden (gebaseerd op tweefotonen calciumbeeldvormingsgegevens). Er werd een achtergrondopname van 10 minuten van motorische activiteit gemaakt. De snorharen aan de tegenovergestelde zijde van t-hCO werden vervolgens 50 keer (2 mm bij 20 Hz, 2 s per presentatie) op willekeurige tijdstippen afgebogen door een piëzo-elektrische aandrijving gedurende een opnameperiode van 20 minuten. Met behulp van het MATLAB Support Package voor Arduino (MATLAB 2019b) kunt u de afbuigingstijd regelen met aangepaste MATLAB-code. Gebruik TTL-pulsen om gebeurtenissen te synchroniseren met data-acquisitiesoftware.
Voor optische markeringsexperimenten werd een optische patchkabel van 200 µm (Doric), verbonden met een 473 nm laser (Omicron), verbonden met een optische vezel van 200 µm, die boven de craniotomie geplaatst was. Stel direct hiervoor het jumpervermogen in op 20 mW. Gebruik de manipulator om de elektroden via de craniotomie, die gevuld is met steriele zoutoplossing, naar de doellocatie te laten zakken. Aan het begin van de opname werden tien lichtpulsen van 473 nm (frequentie 2 Hz, pulsduur 10 ms) uitgezonden. Lichtgevoelige cellen werden gedefinieerd als cellen die in 70% of meer van de experimenten binnen 10 ms een spikerespons vertoonden.