Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Vloeibare biopsie (LB) is een concept dat snel aan populariteit wint in de biomedische wereld.Het concept is voornamelijk gebaseerd op de detectie van fragmenten van circulerend extracellulair DNA (ccfDNA), die na celdood voornamelijk als kleine fragmenten vrijkomen in verschillende weefsels.Een klein deel van deze fragmenten is afkomstig uit vreemde (vreemde) weefsels of organismen.In het huidige werk hebben we dit concept toegepast op mosselen, een schildwachtsoort die bekend staat om hun hoge zeewaterfiltratiecapaciteit.We gebruiken het vermogen van mosselen om te fungeren als natuurlijke filters om omgevings-DNA-fragmenten uit verschillende bronnen op te vangen om informatie te verschaffen over de biodiversiteit van mariene kustecosystemen.Onze resultaten laten zien dat mosselhemolymfe DNA-fragmenten bevat die sterk variëren in grootte, van 1 tot 5 kb.Shotgun-sequencing toonde aan dat een groot aantal DNA-fragmenten van vreemde microbiële oorsprong is.Onder hen vonden we DNA-fragmenten van bacteriën, archaea en virussen, waaronder virussen waarvan bekend is dat ze een verscheidenheid aan gastheren infecteren die vaak worden aangetroffen in mariene ecosystemen aan de kust.Concluderend toont onze studie aan dat het concept van LB toegepast op mosselen een rijke maar tot nu toe onontgonnen bron van kennis vertegenwoordigt over microbiële diversiteit in mariene kustecosystemen.
De impact van klimaatverandering (CC) op de biodiversiteit van mariene ecosystemen is een snel groeiend onderzoeksgebied.De opwarming van de aarde veroorzaakt niet alleen belangrijke fysiologische spanningen, maar verlegt ook de evolutionaire grenzen van de thermische stabiliteit van mariene organismen, waardoor het leefgebied van een aantal soorten wordt aangetast, waardoor ze op zoek gaan naar gunstigere omstandigheden [1, 2].Naast het beïnvloeden van de biodiversiteit van metazoans, verstoort CC het delicate evenwicht van gastheer-microbiële interacties.Deze microbiële dysbacteriose vormt een ernstige bedreiging voor mariene ecosystemen omdat het mariene organismen vatbaarder maakt voor besmettelijke ziekteverwekkers [3, 4].Er wordt aangenomen dat SS een belangrijke rol speelt bij massale sterfgevallen, wat een serieus probleem is voor het beheer van wereldwijde mariene ecosystemen [5, 6].Dit is een belangrijke kwestie gezien de economische, ecologische en nutritionele gevolgen van veel mariene soorten.Dit geldt met name voor tweekleppige dieren die in de poolgebieden leven, waar de effecten van CK directer en ernstiger zijn [6, 7].Tweekleppige dieren zoals Mytilus spp.worden veel gebruikt om de effecten van CC op mariene ecosystemen te monitoren.Het is niet verrassend dat er een relatief groot aantal biomarkers is ontwikkeld om hun gezondheid te monitoren, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van een tweeledige benadering met functionele biomarkers op basis van enzymatische activiteit of cellulaire functies zoals cellevensvatbaarheid en fagocytische activiteit [8].Deze methoden omvatten ook de meting van de concentratie van specifieke drukindicatoren die zich ophopen in zachte weefsels na de opname van grote hoeveelheden zeewater.De hoge filtratiecapaciteit en het halfopen bloedsomloopsysteem van tweekleppige dieren bieden echter de mogelijkheid om nieuwe hemolymfe-biomarkers te ontwikkelen met behulp van het concept van vloeibare biopsie (LB), een eenvoudige en minimaal invasieve benadering van patiëntbeheer.bloedmonsters [9, 10].Hoewel er verschillende soorten circulerende moleculen kunnen worden gevonden in menselijk LB, is dit concept voornamelijk gebaseerd op DNA-sequentieanalyse van circulerende extracellulaire DNA-fragmenten (ccfDNA) in plasma.In feite is de aanwezigheid van circulerend DNA in menselijk plasma al bekend sinds het midden van de 20e eeuw [11], maar pas de laatste jaren heeft de komst van high-throughput sequencing-methoden geleid tot klinische diagnose op basis van ccfDNA.De aanwezigheid van deze circulerende DNA-fragmenten is gedeeltelijk het gevolg van de passieve afgifte van genomisch DNA (nucleair en mitochondriaal) na celdood. Bij gezonde individuen is de concentratie van ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml), maar deze kan 5 tot 10 keer verhoogd zijn bij patiënten die lijden aan verschillende pathologieën of die aan stress worden blootgesteld, wat resulteert in weefselbeschadiging. Bij gezonde individuen is de concentratie van ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml), maar deze kan 5 tot 10 keer verhoogd zijn bij patiënten die lijden aan verschillende pathologieën of die aan stress worden blootgesteld, wat resulteert in weefselbeschadiging. Als u het apparaat op een normale temperatuur (<10 dagen/maanden) wilt gebruiken, moet u een 5–10 minuten voordat u een onderhoudsbeurt krijgt, is het tijd om te koken het apparaat. Bij gezonde mensen is de concentratie van cccDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml), maar deze kan 5 tot 10 keer toenemen bij patiënten met verschillende pathologieën of onder stress die leidt tot weefselbeschadiging.ccfDNA-testprogramma (<10 ng/mL) van 5 tot 10 jaar, een aantal van de meest recente foto's.ccfdna-methode voor ccfdna (<10 ng/ml) van 5 tot 10 jaar, van 5 tot 10 jaar, van 5 tot 10 jaar.De ccfDNA-testen (<10 maanden) in de vorm van een ccfDNA-test, in de vorm van een 5- 10 minuten voordat u het apparaat gebruikt om het apparaat schoon te maken. ccfDNA-concentraties zijn meestal laag (<10 ng/ml) bij gezonde individuen, maar kunnen 5- tot 10-voudig verhoogd zijn bij patiënten met verschillende pathologieën of stress, wat resulteert in weefselbeschadiging.De grootte van ccfDNA-fragmenten varieert sterk, maar varieert meestal van 150 tot 200 bp.[12].Analyse van zelf-afgeleid ccfDNA, dwz ccfDNA van normale of getransformeerde gastheercellen, kan worden gebruikt om genetische en epigenetische veranderingen in het nucleaire en/of mitochondriale genoom te detecteren, waardoor clinici worden geholpen bij het selecteren van specifieke moleculair gerichte therapieën [13].Echter, ccfDNA kan worden verkregen uit vreemde bronnen zoals ccfDNA uit foetale cellen tijdens de zwangerschap of uit getransplanteerde organen [14,15,16,17].ccfDNA is ook een belangrijke bron van informatie voor het detecteren van de aanwezigheid van nucleïnezuren van een infectieus agens (vreemd), waardoor niet-invasieve detectie mogelijk is van wijdverbreide infecties die niet worden geïdentificeerd door bloedkweken, waardoor invasieve biopsie van geïnfecteerd weefsel wordt vermeden [18].Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat menselijk bloed een rijke bron van informatie bevat die kan worden gebruikt om virale en bacteriële pathogenen te identificeren, en dat ongeveer 1% van het ccfDNA dat in menselijk plasma wordt aangetroffen, van buitenlandse oorsprong is [19].Deze onderzoeken tonen aan dat de biodiversiteit van het circulerende microbioom van een organisme kan worden beoordeeld met behulp van ccfDNA-analyse.Tot voor kort werd dit concept echter uitsluitend gebruikt bij mensen en, in mindere mate, bij andere gewervelde dieren [20, 21].
In dit artikel gebruiken we het LB-potentieel om het ccfDNA van Aulacomya atra te analyseren, een zuidelijke soort die veel voorkomt op de subantarctische Kerguelen-eilanden, een groep eilanden bovenop een groot plateau dat 35 miljoen jaar geleden werd gevormd.vulkaanuitbarsting.Met behulp van een in vitro experimenteel systeem ontdekten we dat DNA-fragmenten in zeewater snel door mosselen worden opgenomen en het hemolymfecompartiment binnendringen.Shotgun-sequencing heeft aangetoond dat mosselhemolymfe ccfDNA DNA-fragmenten van zijn eigen en niet-zelfoorsprong bevat, inclusief symbiotische bacteriën en DNA-fragmenten van biomen die typisch zijn voor koude vulkanische mariene kustecosystemen.Hemolymph ccfDNA bevat ook virale sequenties die zijn afgeleid van virussen met verschillende gastheerbereiken.Ook vonden we DNA-fragmenten van meercellige dieren zoals beenvissen, zeeanemonen, algen en insecten.Concluderend toont onze studie aan dat het LB-concept met succes kan worden toegepast op ongewervelde zeedieren om een ​​rijk genomisch repertoire in mariene ecosystemen te genereren.
Volwassen (55-70 mm lang) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) werden verzameld van de intergetijde rotskusten van Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kerguelen-eilanden in december 2018. Andere volwassen blauwe mosselen (Mytilus spp.) werden verkregen van een commerciële leverancier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) en in een beluchte tank met temperatuurregeling (4 ° C) met 10-20 L kunstmatige pekel van 32 ‰ geplaatst.(kunstmatig zeezout Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, VS).Voor elk experiment werden de lengte en het gewicht van individuele schelpen gemeten.
Een gratis open access protocol voor dit programma is online beschikbaar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).In het kort werd LB-hemolymfe verzameld uit abductorspieren zoals beschreven [22].De hemolymfe werd geklaard door centrifugatie bij 1200xg gedurende 3 minuten, het supernatant werd bevroren (-20°C) tot gebruik.Voor isolatie en zuivering van cfDNA werden monsters (1,5-2,0 ml) ontdooid en verwerkt met behulp van de NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) volgens de instructies van de fabrikant.ccfDNA werd bewaard bij -80°C tot verdere analyse.In sommige experimenten werd ccfDNA geïsoleerd en gezuiverd met behulp van de QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Gezuiverd DNA werd gekwantificeerd met behulp van een standaard PicoGreen-assay.De fragmentverdeling van het geïsoleerde ccfDNA werd geanalyseerd door capillaire elektroforese met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) met behulp van een High Sensitivity DNA Kit.De assay werd uitgevoerd met 1 µl van het ccfDNA-monster volgens de instructies van de fabrikant.
Voor het sequentiëren van hemolymfe ccfDNA-fragmenten heeft Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) shotgun-bibliotheken voorbereid met behulp van de Illumina DNA Mix-kit van de Illumina MiSeq PE75-kit.Er werd een standaardadapter (BioO) gebruikt.Bestanden met onbewerkte gegevens zijn verkrijgbaar bij het NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809).De basisleeskwaliteit werd beoordeeld met behulp van FastQC [23].Trimmomatic [24] is gebruikt voor het knippen van adapters en lezen van slechte kwaliteit.Shotgun reads met gepaarde uiteinden werden FLASH samengevoegd tot langere enkele reads met een minimale overlap van 20 bp om mismatches te voorkomen [25]. Samengevoegde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een tweekleppige NCBI Taxonomy-database (e-waarde <1e−3 en 90% homologie), en maskering van sequenties met een lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. Samengevoegde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een tweekleppige NCBI Taxonomy-database (e-waarde <1e−3 en 90% homologie), en maskering van sequenties met een lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. Gebruik de functies van BLASTN om de kosten van het programma te verlengen van de NCBI (score e < 1e-3 en 90% score), en een hogere score De stof kan stof bevatten [26]. Gepoolde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI tweekleppige taxonomiedatabase (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en sequentiemaskering met lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数, 并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 dust [26] 进行复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽Gebruik de functies van BLASTN voor het uitvoeren van de kosten van het programma van de nationale NCBI (1e-3 en 90% winst), en een hogere prijs Het is mogelijk om stof te verwijderen uit stof [26]. Gepoolde uitlezingen werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI tweekleppige taxonomische database (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en sequentiemaskering met lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26].Reads werden verdeeld in twee groepen: gerelateerd aan tweekleppige sequenties (hier self-reads genoemd) en niet-gerelateerd (non-self-reads).Twee groepen werden afzonderlijk samengesteld met behulp van MEGAHIT om contigs te genereren [27].Ondertussen werd de taxonomische verdeling van uitlezingen van buitenaards microbioom geclassificeerd met behulp van Kraken2 [28] en grafisch weergegeven door een Krona-cirkeldiagram op Galaxy [29, 30].Op basis van onze voorlopige experimenten werd vastgesteld dat de optimale kmers kmers-59 zijn. Zelfcontigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (tweekleppige NCBI-database, e-waarde <1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. Zelfcontigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (tweekleppige NCBI-database, e-waarde <1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. Gebruik de programma's van de programma's voor BLASTN-programma's van de NCBI, die <1e-10 en een verlies van 60%) heeft gekregen. Self-contigs werden vervolgens geïdentificeerd door te matchen met BLASTN (NCBI tweekleppige database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie) voor definitieve annotatie.BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Het is mogelijk om de kosten van het programma te wijzigen. met BLASTN (van de NCBI in de VS, tussen de 1e-10 en de 60%). Self-contigs werden vervolgens geïdentificeerd voor definitieve annotatie door te matchen met BLASTN (NCBI tweekleppige database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). Parallel werden contigs van niet-zelfgroepen geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde <1e−10 en 60% homologie). Parallel werden contigs van niet-zelfgroepen geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde <1e−10 en 60% homologie). Het is belangrijk om de kosten van het programma voor BLASTN (van de NCBI, значение e <1e-10 en гомология 60%). Tegelijkertijd werden contigs van buitenlandse groepen geannoteerd met BLASTN (NT NCBI-database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Als u een aanvraag indient, kunt u een aanvraag indienen bij BLASTN (een tegen de NCBI, ongeveer 1e-10 en 60%. Tegelijkertijd werden contigs van niet-zelfgroepen geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelfcontigs met behulp van de nr- en RefSeq-eiwit NCBI-databases (e-waarde <1e−10 en 60% homologie). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelfcontigs met behulp van de nr- en RefSeq-eiwit NCBI-databases (e-waarde <1e−10 en 60% homologie). BLASTX heeft een brander met de mogelijkheid om het nummer van het nummer en RefSe te wijzigen q NCBI (gemiddeld e <1e-10 en gemiddeld 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf-contigs met behulp van de nr- en RefSeq NCBI-eiwitdatabases (e-waarde <1e-10 en 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX zorgt ervoor dat de machine de status van het nummer en RefSeq NCBI kan wijzigen (Standaard e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf-contigs met behulp van de nr- en RefSeq NCBI-eiwitdatabases (e-waarde <1e-10 en 60% homologie).De BLASTN- en BLASTX-pools van niet-zelf-contigs vertegenwoordigen de uiteindelijke contigs (zie aanvullend bestand).
De primers die voor PCR worden gebruikt, staan ​​vermeld in tabel S1.Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) werd gebruikt om de ccfDNA-doelgenen te amplificeren.De volgende reactieomstandigheden werden gebruikt: denaturatie bij 95°C gedurende 3 minuten, 95°C gedurende 1 minuut, ingestelde annealingstemperatuur gedurende 1 minuut, rek bij 72°C gedurende 1 minuut, 35 cycli en uiteindelijk 72°C binnen 10 minuten..PCR-producten werden gescheiden door elektroforese in agarosegels (1,5%) die SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) bij 95 V bevatten.
Mosselen (Mytilus spp.) werden geacclimatiseerd in 500 ml geoxygeneerd zeewater (32 PSU) gedurende 24 uur bij 4°C.Plasmide-DNA dat een insert bevat dat codeert voor de menselijke galectine-7-cDNA-sequentie (NCBI-inschrijvingsnummer L07769) werd aan het flesje toegevoegd in een eindconcentratie van 190 ug/pl.Mosselen geïncubeerd onder dezelfde omstandigheden zonder toevoeging van DNA waren de controle.De derde controletank bevatte DNA zonder mosselen.Om de kwaliteit van DNA in zeewater te controleren, werden op het aangegeven tijdstip zeewatermonsters (20 μl; drie herhalingen) uit elke tank genomen.Voor traceerbaarheid van plasmide-DNA werden LB-mosselen op de aangegeven tijdstippen geoogst en geanalyseerd met qPCR en ddPCR.Vanwege het hoge zoutgehalte van zeewater werden aliquots voorafgaand aan alle PCR-assays verdund in water van PCR-kwaliteit (1:10).
Digitale druppel-PCR (ddPCR) werd uitgevoerd met behulp van het BioRad QX200-protocol (Mississauga, Ontario, Canada).Gebruik het temperatuurprofiel om de optimale temperatuur te bepalen (Tabel S1).Druppels werden gegenereerd met behulp van een QX200 druppelgenerator (BioRad).ddPCR werd als volgt uitgevoerd: 95°C gedurende 5 minuten, 50 cycli van 95°C gedurende 30 seconden en een gegeven annealingstemperatuur gedurende 1 minuut en 72°C gedurende 30 seconden, 4°C gedurende 5 minuten en 90°C binnen 5 minuten.Het aantal druppels en positieve reacties (aantal kopieën/µl) werden gemeten met behulp van een QX200 druppellezer (BioRad).Monsters met minder dan 10.000 druppels werden afgekeurd.Er werd niet elke keer dat ddPCR werd uitgevoerd patrooncontrole uitgevoerd.
qPCR werd uitgevoerd met behulp van Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australië) en LGALS7-specifieke primers.Alle kwantitatieve PCR's werden uitgevoerd in 20 µl met behulp van de QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR werd gestart met een incubatie van 15 minuten bij 95°C gevolgd door 40 cycli bij 95°C gedurende 10 seconden en bij 60°C gedurende 60 seconden met één gegevensverzameling.Smeltkrommen werden gegenereerd met opeenvolgende metingen bij 95 °C gedurende 5 seconden, 65 °C gedurende 60 seconden en 97 °C aan het einde van de qPCR.Elke qPCR werd in drievoud uitgevoerd, behalve controlemonsters.
Omdat mosselen bekend staan ​​om hun hoge filtratiesnelheid, hebben we eerst onderzocht of ze in zeewater aanwezige DNA-fragmenten kunnen filteren en vasthouden.We waren ook geïnteresseerd in de vraag of deze fragmenten zich ophopen in hun halfopen lymfestelsel.We hebben dit probleem experimenteel opgelost door het lot te volgen van oplosbare DNA-fragmenten toegevoegd aan blauwe mosseltanks.Om het volgen van DNA-fragmenten te vergemakkelijken, gebruikten we vreemd (niet zelf) plasmide-DNA dat het menselijke galectine-7-gen bevat.ddPCR spoort plasmide-DNA-fragmenten op in zeewater en mosselen.Onze resultaten laten zien dat als de hoeveelheid DNA-fragmenten in zeewater relatief constant bleef in de tijd (tot 7 dagen) in de afwezigheid van mosselen, dit niveau in de aanwezigheid van mosselen binnen 8 uur bijna volledig verdween (Fig. 1a,b).Fragmenten van exogeen DNA werden gemakkelijk gedetecteerd binnen 15 minuten in intravalvulaire vloeistof en hemolymfe (figuur 1c).Deze fragmenten konden tot 4 uur na blootstelling nog worden gedetecteerd.Deze filteractiviteit ten aanzien van DNA-fragmenten is vergelijkbaar met de filteractiviteit van bacteriën en algen [31].Deze resultaten suggereren dat mosselen vreemd DNA kunnen filteren en ophopen in hun vloeistofcompartimenten.
Relatieve concentraties van plasmide-DNA in zeewater in aanwezigheid (A) of afwezigheid (B) van mosselen, gemeten met ddPCR.In A worden de resultaten uitgedrukt als percentages, waarbij de randen van de vakken het 75e en 25e percentiel vertegenwoordigen.De ingerichte logaritmische curve wordt in rood weergegeven en het grijs gearceerde gebied vertegenwoordigt het 95%-betrouwbaarheidsinterval.In B vertegenwoordigt de rode lijn het gemiddelde en de blauwe lijn vertegenwoordigt het 95% betrouwbaarheidsinterval voor de concentratie.C Accumulatie van plasmide-DNA in de hemolymfe en klepvloeistof van mosselen op verschillende tijdstippen na toevoeging van plasmide-DNA.Resultaten worden gepresenteerd als absolute kopieën gedetecteerd/ml (±SE).
Vervolgens onderzochten we de oorsprong van ccfDNA in mosselen verzameld uit mosselbanken op de Kerguelen-eilanden, een afgelegen groep eilanden met beperkte antropogene invloed.Voor dit doel werd cccDNA uit hemolymfen van mosselen geïsoleerd en gezuiverd met methoden die gewoonlijk worden gebruikt om menselijk cccDNA te zuiveren [32, 33].We ontdekten dat de gemiddelde hemolymfe ccfDNA-concentraties in mosselen in het lage microgram per ml hemolymfebereik liggen (zie tabel S2, aanvullende informatie).Dit bereik van concentraties is veel groter dan bij gezonde mensen (lage nanogram per milliliter), maar in zeldzame gevallen, bij kankerpatiënten, kan het niveau van ccfDNA enkele microgram per milliliter bereiken [34, 35].Een analyse van de grootteverdeling van hemolymph ccfDNA toonde aan dat deze fragmenten sterk variëren in grootte, variërend van 1000 bp tot 1000 bp.tot 5000 bp (fig. 2).Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van de op silica gebaseerde QIAamp Investigator Kit, een methode die gewoonlijk wordt gebruikt in de forensische wetenschap om snel genomisch DNA te isoleren en te zuiveren uit DNA-monsters met een lage concentratie, waaronder ccfDNA [36].
Representatief ccfDNA-elektroforegram van hemolymfe van mosselen.Geëxtraheerd met NucleoSnap Plasma Kit (boven) en QIAamp DNA Investigator Kit.B Vioolgrafiek die de verdeling van hemolymfe ccfDNA-concentraties (±SE) in mosselen laat zien.De zwarte en rode lijnen vertegenwoordigen respectievelijk de mediaan en het eerste en derde kwartiel.
Ongeveer 1% van het ccfDNA bij mensen en primaten heeft een vreemde bron [21, 37].Gezien de halfopen bloedsomloop van tweekleppigen, microbieel rijk zeewater en de grootteverdeling van mossel-ccfDNA, veronderstelden we dat mossel-hemolymfe ccfDNA een rijke en diverse pool van microbieel DNA zou kunnen bevatten.Om deze hypothese te testen, hebben we hemolymph ccfDNA gesequenced van Aulacomya atra-monsters verzameld op de Kerguelen-eilanden, wat meer dan 10 miljoen metingen opleverde, waarvan 97,6% de kwaliteitscontrole doorstond.De metingen werden vervolgens geclassificeerd op basis van zelf- en niet-zelfbronnen met behulp van de BLASTN- en NCBI-tweekleppige databases (Fig. S1, aanvullende informatie).
Bij mensen kan zowel nucleair als mitochondriaal DNA vrijkomen in de bloedbaan [38].In de huidige studie was het echter niet mogelijk om het nucleaire genomische DNA van mosselen in detail te beschrijven, aangezien het A. atra-genoom niet is gesequenced of beschreven.We waren echter in staat om een ​​aantal ccfDNA-fragmenten van onze eigen oorsprong te identificeren met behulp van de tweekleppige bibliotheek (figuur S2, aanvullende informatie).We bevestigden ook de aanwezigheid van DNA-fragmenten van onze eigen oorsprong door gerichte PCR-amplificatie van die A. atra-genen waarvan de sequentie was bepaald (Fig. 3).Evenzo, aangezien het mitochondriale genoom van A. atra beschikbaar is in openbare databases, kan men bewijs vinden voor de aanwezigheid van mitochondriale ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe van A. atra.De aanwezigheid van mitochondriale DNA-fragmenten werd bevestigd door PCR-amplificatie (Fig. 3).
Verschillende mitochondriale genen waren aanwezig in de hemolymfe van A. atra (rode stippen - voorraadnummer: SRX5705969) en M. platensis (blauwe stippen - voorraadnummer: SRX5705968) versterkt door PCR.Figuur aangepast van Breton et al., 2011 B Amplificatie van hemolymfesupernatant van A. atra Opgeslagen op FTA-papier.Gebruik een pons van 3 mm om rechtstreeks toe te voegen aan de PCR-buis met de PCR-mix.
Gezien het overvloedige microbiële gehalte in zeewater, hebben we ons aanvankelijk gericht op de karakterisering van microbiële DNA-sequenties in hemolymfe.Hiervoor gebruiken we twee verschillende strategieën.De eerste strategie gebruikte Kraken2, een op algoritmen gebaseerd sequentieclassificatieprogramma dat microbiële sequenties kan identificeren met een nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met die van BLAST en andere tools [28].Van meer dan 6719 aflezingen werd vastgesteld dat ze van bacteriële oorsprong waren, terwijl 124 en 64 respectievelijk afkomstig waren van archaea en virussen (fig. 4).De meest voorkomende bacteriële DNA-fragmenten waren Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (figuur 4a).Deze verdeling komt overeen met eerdere studies van het mariene blauwe mosselmicrobioom [39, 40].Gammaproteobacteriën waren de hoofdklasse van Proteobacteriën (44%), waaronder veel Vibrionales (Fig. 4b).De ddPCR-methode bevestigde de aanwezigheid van Vibrio-DNA-fragmenten in het ccfDNA van A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Om meer informatie te verkrijgen over de bacteriële oorsprong van ccfDNA, werd een aanvullende benadering gevolgd (Fig. S2, aanvullende informatie). In dit geval werden overlappende reads geassembleerd als paired-end reads en werden geclassificeerd als van zelf (tweekleppige) of niet-zelf-oorsprong met behulp van BLASTN en een e-waarde van 1e−3 en een grenswaarde met> 90% homologie. In dit geval werden overlappende reads geassembleerd als paired-end reads en werden geclassificeerd als van zelf (tweekleppige) of niet-zelf-oorsprong met behulp van BLASTN en een e-waarde van 1e−3 en een grenswaarde met> 90% homologie. Als u een van de beste manieren vindt om uw geld te verdienen met het kopen van een telefoon of tablet лассифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) en de inhoud van het programma van BLASTN en van de 1e-3 tot de score van meer dan 90%. In dit geval werden overlappende aflezingen verzameld als aflezingen met gepaarde uiteinden en geclassificeerd als natief (tweekleppig) of niet-origineel met behulp van BLASTN en e-waarde van 1e-3 en afsnijding met> 90% homologie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。Als je een foto hebt gemaakt, kun je een foto maken van blastn en 1e-3 van de serie. > 90% Als u een van de beste manieren vindt om de kosten van het onderhoud en de kosten te verlagen de beste manier om het probleem op te lossen ьзованием значений e BLASTN en 1e-3 и порога гомологии> 90%. In dit geval werden overlappende uitlezingen verzameld als gepaarde uitlezingen en geclassificeerd als eigen (tweekleppige) of niet-origineel met behulp van e BLASTN- en 1e-3-waarden en een homologiedrempel> 90%.Omdat het A. atra-genoom nog niet is gesequenced, hebben we de de novo-assemblagestrategie van de MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) -assembler gebruikt.In totaal zijn 147.188 contigs geïdentificeerd als afhankelijke (tweekleppigen) van oorsprong.Deze contigs werden vervolgens geëxplodeerd met e-waarden van 1e-10 met behulp van BLASTN en BLASTX.Met deze strategie konden we 482 niet-tweekleppige fragmenten identificeren die aanwezig zijn in A. atra ccfDNA.Meer dan de helft (57%) van deze DNA-fragmenten werd verkregen uit bacteriën, voornamelijk uit kieuwsymbionten, waaronder sulfotrofe symbionten, en uit kieuwsymbionten Solemya velum (fig. 5).
Relatieve overvloed op typeniveau.B Microbiële diversiteit van twee belangrijke phyla (Firmicutes en Proteobacteria).Representatieve amplificatie van ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenten van het 16S rRNA-gen (blauw) in drie atra-hemolymfen.
In totaal werden 482 verzamelde contigs geanalyseerd.Algemeen profiel van de taxonomische verdeling van metagenomische aaneengesloten annotaties (prokaryoten en eukaryoten).B Gedetailleerde distributie van bacteriële DNA-fragmenten geïdentificeerd door BLASTN en BLASTX.
Kraken2-analyse toonde ook aan dat mossel-ccfDNA archaeale DNA-fragmenten bevatte, waaronder DNA-fragmenten van Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (figuur 6a).De aanwezigheid van DNA-fragmenten afkomstig van Euryarchaeota en Crenarchaeota, eerder gevonden in de microbiële gemeenschap van Californische mosselen, zou geen verrassing moeten zijn [42].Hoewel Euryarchaeota vaak wordt geassocieerd met extreme omstandigheden, wordt nu erkend dat zowel Euryarchaeota als Crenarcheota behoren tot de meest voorkomende prokaryoten in de mariene cryogene omgeving [43, 44].De aanwezigheid van methanogene micro-organismen in mosselen is niet verwonderlijk, gezien recente rapporten van uitgebreide methaanlekken uit bodemlekken op het Kerguelen-plateau [45] en mogelijke microbiële methaanproductie waargenomen voor de kust van de Kerguelen-eilanden [46].
Onze aandacht verschoof toen naar metingen van DNA-virussen.Voor zover ons bekend is dit de eerste off-target studie naar het virusgehalte van mosselen.Zoals verwacht vonden we DNA-fragmenten van bacteriofagen (Caudovirales) (figuur 6b).Het meest voorkomende virale DNA is echter afkomstig van een stam van nucleocytovirussen, ook bekend als het nucleair cytoplasmatisch groot DNA-virus (NCLDV), dat het grootste genoom van elk virus heeft.Binnen dit phylum behoren de meeste DNA-sequenties tot de families Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), waarvan de natuurlijke gastheren gewervelde dieren en geleedpotigen zijn, terwijl een klein deel van deze DNA-sequenties tot bekende virologische algen behoort.Infecteert mariene eukaryote algen.De sequenties werden ook verkregen van het Pandora-virus, het gigantische virus met de grootste genoomgrootte van alle bekende virale geslachten.Interessant is dat het bereik van gastheren waarvan bekend was dat ze met het virus waren geïnfecteerd, zoals bepaald door hemolymph ccfDNA-sequencing, relatief groot was (figuur S3, aanvullende informatie).Het omvat virussen die insecten zoals Baculoviridae en Iridoviridae infecteren, evenals virussen die amoeben, algen en gewervelde dieren infecteren.We hebben ook sequenties gevonden die overeenkomen met het Pithovirus sibericum-genoom.Pitovirussen (ook bekend als "zombievirussen") werden voor het eerst geïsoleerd uit 30.000 jaar oude permafrost in Siberië [47].Onze resultaten komen dus overeen met eerdere rapporten die aantonen dat niet alle moderne soorten van deze virussen zijn uitgestorven [48] en dat deze virussen aanwezig kunnen zijn in afgelegen subarctische mariene ecosystemen.
Ten slotte hebben we getest of we DNA-fragmenten van andere meercellige dieren konden vinden.In totaal werden 482 vreemde contigs geïdentificeerd door BLASTN en BLASTX met nt-, nr- en RefSeq-bibliotheken (genomisch en eiwit).Onze resultaten laten zien dat onder de vreemde fragmenten van ccfDNA van meercellige dieren DNA van benige botten overheerst (Fig. 5).Ook zijn er DNA-fragmenten gevonden van insecten en andere soorten.Een relatief groot deel van de DNA-fragmenten is niet geïdentificeerd, mogelijk door de ondervertegenwoordiging van een groot aantal mariene soorten in genomische databases in vergelijking met terrestrische soorten [49].
In dit artikel passen we het LB-concept toe op mosselen, met het argument dat hemolymfe ccfDNA-opnamesequencing inzicht kan verschaffen in de samenstelling van mariene kustecosystemen.In het bijzonder vonden we dat 1) hemolymfe van mosselen relatief hoge concentraties (microgramniveaus) van relatief grote (~1-5 kb) circulerende DNA-fragmenten bevat;2) deze DNA-fragmenten zijn zowel onafhankelijk als niet-onafhankelijk 3) Onder de vreemde bronnen van deze DNA-fragmenten vonden we bacterieel, archaeaal en viraal DNA, evenals DNA van andere meercellige dieren;4) De accumulatie van deze vreemde ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe vindt snel plaats en draagt ​​bij aan de interne filteractiviteit van mosselen.Concluderend toont onze studie aan dat het concept van LB, dat tot nu toe voornamelijk is toegepast op het gebied van biogeneeskunde, codeert voor een rijke maar onontgonnen bron van kennis die kan worden gebruikt om de interactie tussen schildwachtsoorten en hun omgeving beter te begrijpen.
Naast primaten is ccfDNA-isolatie gemeld bij zoogdieren, waaronder muizen, honden, katten en paarden [50, 51, 52].Voor zover wij weten, is onze studie echter de eerste die melding maakt van de detectie en sequentiebepaling van ccfDNA in mariene soorten met een open circulatiesysteem.Dit anatomische kenmerk en filtervermogen van mosselen kan, althans gedeeltelijk, de verschillende groottekenmerken van circulerende DNA-fragmenten verklaren in vergelijking met andere soorten.Bij mensen zijn de meeste DNA-fragmenten die in het bloed circuleren, kleine fragmenten variërend in grootte van 150 tot 200 bp.met een maximale piek van 167 bp [34, 53].Een klein maar significant deel van de DNA-fragmenten is tussen de 300 en 500 bp groot en ongeveer 5% is langer dan 900 bp.[54].De reden voor deze grootteverdeling is dat de belangrijkste bron van ccfDNA in plasma optreedt als gevolg van celdood, ofwel als gevolg van celdood of als gevolg van necrose van circulerende hematopoëtische cellen bij gezonde personen of als gevolg van apoptose van tumorcellen bij kankerpatiënten (bekend als circulerend tumor-DNA)., ctDNA).De grootteverdeling van hemolymfe ccfDNA die we vonden in mosselen varieerde van 1000 tot 5000 bp, wat suggereert dat mossel ccfDNA een andere oorsprong heeft.Dit is een logische hypothese, aangezien mosselen een halfopen vasculair systeem hebben en leven in mariene aquatische omgevingen met hoge concentraties microbieel genomisch DNA.Onze laboratoriumexperimenten met exogeen DNA hebben zelfs aangetoond dat mosselen DNA-fragmenten ophopen in zeewater, in ieder geval na een paar uur worden afgebroken na cellulaire opname en/of vrijgegeven en/of opgeslagen in verschillende organisaties.Gezien de zeldzaamheid van cellen (zowel prokaryote als eukaryote), zal het gebruik van intravalvulaire compartimenten de hoeveelheid ccfDNA uit eigen bronnen en uit buitenlandse bronnen verminderen.Gezien het belang van tweekleppige aangeboren immuniteit en het grote aantal circulerende fagocyten, veronderstelden we verder dat zelfs vreemd ccfDNA is verrijkt met circulerende fagocyten die vreemd DNA accumuleren na inname van micro-organismen en / of celresten.Alles bij elkaar laten onze resultaten zien dat tweekleppige hemolymfe ccfDNA een unieke opslagplaats van moleculaire informatie is en hun status als schildwachtsoort versterkt.
Onze gegevens geven aan dat sequentiëring en analyse van hemolymfe-ccfDNA-fragmenten van bacteriën afgeleide belangrijke informatie kan verschaffen over de gastheerbacterieflora en de bacteriën die aanwezig zijn in het omringende mariene ecosysteem.Shot-sequencing-technieken hebben sequenties van de commensale bacterie A. atra-kieuw onthuld die zouden zijn gemist als conventionele 16S rRNA-identificatiemethoden waren gebruikt, gedeeltelijk als gevolg van een voorkeur voor de referentiebibliotheek.Ons gebruik van LB-gegevens verzameld van M. platensis in dezelfde mossellaag in Kerguelen toonde zelfs aan dat de samenstelling van kieuw-geassocieerde bacteriële symbionten hetzelfde was voor beide mosselsoorten (Fig. S4, aanvullende informatie).Deze gelijkenis van twee genetisch verschillende mosselen kan een weerspiegeling zijn van de samenstelling van bacteriegemeenschappen in de koude, zwavelhoudende en vulkanische afzettingen van Kerguelen [55, 56, 57, 58].Hogere niveaus van zwavelreducerende micro-organismen zijn goed beschreven bij het oogsten van mosselen uit bioturbated kustgebieden [59], zoals de kust van Port-au-France.Een andere mogelijkheid is dat de commensale mosselflora wordt aangetast door horizontale transmissie [60, 61].Er is meer onderzoek nodig om de correlatie tussen het mariene milieu, het zeebodemoppervlak en de samenstelling van symbiotische bacteriën in mosselen te bepalen.Deze studies zijn momenteel aan de gang.
De lengte en concentratie van hemolymph ccfDNA, het gemak van zuivering en hoge kwaliteit om snelle shotgun-sequencing mogelijk te maken, zijn enkele van de vele voordelen van het gebruik van mossel-ccfDNA om de biodiversiteit in mariene kustecosystemen te beoordelen.Deze aanpak is vooral effectief voor het karakteriseren van virale gemeenschappen (viromen) in een bepaald ecosysteem [62, 63].In tegenstelling tot bacteriën, archaea en eukaryoten bevatten virale genomen geen fylogenetisch geconserveerde genen zoals 16S-sequenties.Onze resultaten geven aan dat vloeibare biopsieën van indicatorsoorten zoals mosselen kunnen worden gebruikt om relatief grote aantallen ccfDNA-virusfragmenten te identificeren waarvan bekend is dat ze gastheren infecteren die doorgaans in mariene kustecosystemen leven.Dit omvat virussen waarvan bekend is dat ze protozoa, geleedpotigen, insecten, planten en bacteriële virussen (bijv. bacteriofagen) infecteren.Een vergelijkbare verdeling werd gevonden toen we het hemolymfe ccfDNA-viroom van blauwe mosselen (M. platensis) onderzochten, verzameld in dezelfde mossellaag in Kerguelen (tabel S2, aanvullende informatie).Shotgun-sequencing van ccfDNA is inderdaad een nieuwe benadering die aan kracht wint in de studie van het viroom van mensen of andere soorten [21, 37, 64].Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bestuderen van dubbelstrengige DNA-virussen, aangezien geen enkel gen bewaard is gebleven onder alle dubbelstrengige DNA-virussen, die de meest diverse en brede klasse van virussen in Baltimore vertegenwoordigen [65].Hoewel de meeste van deze virussen ongeclassificeerd blijven en mogelijk virussen bevatten uit een volledig onbekend deel van de virale wereld [66], ontdekten we dat de viromen en gastheerreeksen van de mosselen A. atra en M. platensis tussen de twee soorten vallen.op dezelfde manier (zie figuur S3, aanvullende informatie).Deze gelijkenis is niet verrassend, aangezien het een gebrek aan selectiviteit kan weerspiegelen bij de opname van DNA dat in de omgeving aanwezig is.Toekomstige studies met gezuiverd RNA zijn momenteel nodig om het RNA-viroom te karakteriseren.
In onze studie gebruikten we een zeer rigoureuze pijplijn die was aangepast aan het werk van Kowarski en collega's [37], die een tweestaps verwijdering van gepoolde reads en contigs voor en na de assemblage van native ccfDNA gebruikten, wat resulteerde in een groot aantal niet-toegewezen reads.Daarom kunnen we niet uitsluiten dat sommige van deze niet in kaart gebrachte reads nog steeds hun eigen oorsprong hebben, voornamelijk omdat we geen referentiegenoom hebben voor deze mosselsoort.We hebben deze pijplijn ook gebruikt omdat we ons zorgen maakten over de chimaera's tussen zelf- en niet-zelf-lezingen en de leeslengtes gegenereerd door de Illumina MiSeq PE75.Een andere reden voor de meeste niet in kaart gebrachte metingen is dat veel van de mariene microben, vooral in afgelegen gebieden zoals Kerguelen, niet zijn geannoteerd.We gebruikten Illumina MiSeq PE75, uitgaande van ccfDNA-fragmentlengtes vergelijkbaar met menselijk ccfDNA.Voor toekomstige studies, gezien onze resultaten die aantonen dat hemolymfe ccfDNA langere aflezingen heeft dan mensen en/of zoogdieren, raden we aan een sequencing-platform te gebruiken dat geschikter is voor langere ccfDNA-fragmenten.Deze praktijk zal het veel gemakkelijker maken om meer indicaties te identificeren voor een diepere analyse.Het verkrijgen van de momenteel niet beschikbare volledige A. atra nucleaire genoomsequentie zou ook de discriminatie van ccfDNA van eigen en niet-eigen bronnen aanzienlijk vergemakkelijken.Aangezien ons onderzoek zich heeft gericht op de mogelijkheid om het concept van vloeibare biopsie op mosselen toe te passen, hopen we dat wanneer dit concept in toekomstig onderzoek wordt gebruikt, nieuwe hulpmiddelen en pijplijnen zullen worden ontwikkeld om het potentieel van deze methode om de microbiële diversiteit van mosselen te bestuderen, te vergroten.marien ecosysteem.
Als een niet-invasieve klinische biomarker worden verhoogde menselijke plasmaspiegels van ccfDNA in verband gebracht met verschillende ziekten, weefselbeschadiging en stresstoestanden [67,68,69].Deze toename hangt samen met het vrijkomen van DNA-fragmenten van eigen oorsprong na weefselbeschadiging.Dit hebben we aangepakt met acute hittestress, waarbij mosselen kort werden blootgesteld aan een temperatuur van 30 °C.We hebben deze analyse uitgevoerd op drie verschillende soorten mosselen in drie onafhankelijke experimenten.We vonden echter geen verandering in ccfDNA-niveaus na acute hittestress (zie figuur S5, aanvullende informatie).Deze ontdekking kan, althans gedeeltelijk, het feit verklaren dat mosselen een halfopen bloedsomloop hebben en grote hoeveelheden vreemd DNA ophopen vanwege hun hoge filteractiviteit.Aan de andere kant kunnen mosselen, zoals veel ongewervelde dieren, beter bestand zijn tegen door stress veroorzaakte weefselbeschadiging, waardoor de afgifte van ccfDNA in hun hemolymfe wordt beperkt [70, 71].
Tot op heden heeft DNA-analyse van biodiversiteit in aquatische ecosystemen zich voornamelijk gericht op metabarcodering van omgevings-DNA (eDNA).Deze methode is echter meestal beperkt in biodiversiteitsanalyse wanneer primers worden gebruikt.Het gebruik van shotgun-sequencing omzeilt de beperkingen van PCR en de vooringenomen selectie van primersets.Onze methode ligt dus in zekere zin dichter bij de recent gebruikte high-throughput eDNA Shotgun-sequencingmethode, die in staat is om gefragmenteerd DNA direct te sequensen en bijna alle organismen te analyseren [72, 73].Er zijn echter een aantal fundamentele zaken die LB onderscheiden van standaard eDNA-methoden.Het belangrijkste verschil tussen eDNA en LB is natuurlijk het gebruik van natuurlijke filtergastheren.Er is melding gemaakt van het gebruik van mariene soorten zoals sponzen en tweekleppigen (Dresseina spp.) als een natuurlijk filter voor het bestuderen van eDNA [74, 75].In de studie van Dreissena werden echter weefselbiopten gebruikt waaruit DNA werd geëxtraheerd.Analyse van ccfDNA van LB vereist geen weefselbiopsie, gespecialiseerde en soms dure apparatuur en logistiek in verband met eDNA of weefselbiopsie.We hebben onlangs zelfs gemeld dat ccfDNA van LB kan worden opgeslagen en geanalyseerd met FTA-ondersteuning zonder een koelketen te onderhouden, wat een grote uitdaging is voor onderzoek in afgelegen gebieden [76].De extractie van ccfDNA uit vloeibare biopsieën is ook eenvoudig en biedt DNA van hoge kwaliteit voor shotgun-sequencing en PCR-analyse.Dit is een groot voordeel gezien enkele van de technische beperkingen die gepaard gaan met eDNA-analyse [77].De eenvoud en lage kosten van de bemonsteringsmethode zijn ook bijzonder geschikt voor monitoringprogramma's op lange termijn.Naast hun hoge filtervermogen is een ander bekend kenmerk van tweekleppige dieren de chemische samenstelling van mucopolysacchariden van hun slijm, die de opname van virussen bevordert [78, 79].Dit maakt tweekleppigen tot een ideaal natuurlijk filter voor het karakteriseren van de biodiversiteit en de impact van klimaatverandering in een bepaald aquatisch ecosysteem.Hoewel de aanwezigheid van van de gastheer afkomstige DNA-fragmenten kan worden gezien als een beperking van de methode in vergelijking met eDNA, zijn de kosten die gepaard gaan met het hebben van zo'n native ccfDNA in vergelijking met eDNA tegelijkertijd begrijpelijk voor de enorme hoeveelheid informatie die beschikbaar is voor gezondheidsonderzoeken.offset gastheer.Dit omvat de aanwezigheid van virale sequenties die zijn geïntegreerd in het genoom van de gastheergastheer.Dit is vooral belangrijk voor mosselen, gezien de aanwezigheid van horizontaal overgedragen leukemische retrovirussen in tweekleppigen [80, 81].Een ander voordeel van LB ten opzichte van eDNA is dat het gebruik maakt van de fagocytische activiteit van circulerende bloedcellen in de hemolymfe, die micro-organismen (en hun genomen) overspoelt.Fagocytose is de belangrijkste functie van bloedcellen in tweekleppigen [82].Ten slotte maakt de methode gebruik van de hoge filtercapaciteit van mosselen (gemiddeld 1,5 l/u zeewater) en tweedaagse circulatie, waardoor de vermenging van verschillende lagen zeewater toeneemt, waardoor heteroloog eDNA kan worden opgevangen.[83, 84].Mossel-ccfDNA-analyse is dus een interessante weg gezien de nutritionele, economische en milieueffecten van mosselen.Vergelijkbaar met de analyse van LB verzameld bij mensen, opent deze methode ook de mogelijkheid om genetische en epigenetische veranderingen in gastheer-DNA te meten als reactie op exogene stoffen.Er kunnen bijvoorbeeld sequentietechnologieën van de derde generatie worden overwogen om genoombrede methyleringsanalyse uit te voeren in natief ccfDNA met behulp van nanopore-sequencing.Dit proces zou moeten worden vergemakkelijkt door het feit dat de lengte van de mossel-ccfDNA-fragmenten ideaal compatibel is met long-read sequencing-platforms die genoombrede DNA-methylatieanalyse mogelijk maken uit een enkele sequencing-run zonder de noodzaak van chemische transformaties.85,86] Dit is een interessante mogelijkheid, aangezien is aangetoond dat DNA-methylatiepatronen een reactie op omgevingsstress weerspiegelen en vele generaties aanhouden.Daarom kan het waardevol inzicht verschaffen in de onderliggende mechanismen die de reactie bepalen na blootstelling aan klimaatverandering of verontreinigende stoffen [87].Het gebruik van LB is echter niet zonder beperkingen.Uiteraard vereist dit de aanwezigheid van indicatorsoorten in het ecosysteem.Zoals hierboven vermeld, vereist het gebruik van LB om de biodiversiteit van een bepaald ecosysteem te beoordelen ook een rigoureuze bioinformatica-pijplijn die rekening houdt met de aanwezigheid van DNA-fragmenten van de bron.Een ander groot probleem is de beschikbaarheid van referentiegenomen voor mariene soorten.Het is te hopen dat initiatieven zoals het Marine Mammal Genomes Project en het onlangs opgerichte Fish10k-project [88] dergelijke analyses in de toekomst zullen vergemakkelijken.De toepassing van het LB-concept op mariene filtervoedende organismen is ook compatibel met de nieuwste ontwikkelingen op het gebied van sequencingtechnologie, waardoor het zeer geschikt is voor de ontwikkeling van multi-ohm biomarkers om belangrijke informatie te verschaffen over de gezondheid van mariene habitats als reactie op omgevingsstress.
Genoomsequencinggegevens zijn gedeponeerd in het NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 onder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impact van klimaatverandering op het leven in zee en ecosystemen.Cole Biologie.2009;19: P602-P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Overweeg de gecombineerde effecten van klimaatverandering en andere lokale stressoren op het mariene milieu.algemene wetenschappelijke omgeving.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Wetenschap van 1 maart.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Verminderde hittetolerantie onder herhaalde hittestressomstandigheden verklaart de hoge zomersterfte van blauwe mosselen.Wetenschappelijk rapport 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Recente veranderingen in de frequentie, oorzaken en omvang van sterfgevallen bij dieren.Proc Natl Acad Sci VS.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Meerdere niet-soortspecifieke pathogenen kunnen massale sterfte van Pinna nobilis hebben veroorzaakt.Leven.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potentiële impact van klimaatverandering op Arctische zoönotische ziekten.Int J Circumpolaire gezondheid.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blauwe mosselen (Mytilus edulis spp.) Als signaalorganismen bij monitoring van kustverontreiniging: een overzicht.Mar Omgeving Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integratie van vloeibare biopsie bij de behandeling van kanker.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Vloeibare biopsierijping: laat tumor-DNA circuleren.Nat Rev Kanker.2017;17:223-38.
Mandel P., Metais P. Nucleïnezuren in menselijk plasma.Vergadernotulen van dochterondernemingen van Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Een nieuwe rol voor celvrij DNA als moleculaire marker voor de behandeling van kanker.Kwantificering van biomolaire analyse.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vloeibare biopsie komt de kliniek binnen - implementatieproblemen en toekomstige uitdagingen.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en anderen.Foetaal DNA is aanwezig in maternaal plasma en serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie van het verloop van de zwangerschap en de complicaties ervan met behulp van circulerend extracellulair RNA in het bloed van vrouwen tijdens de zwangerschap.Dopediatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Vloeibare biopsie: donorcelvrij DNA wordt gebruikt om allogene laesies in een niertransplantaat te detecteren.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaties in prenatale diagnostiek: maternale plasma-genoomsequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Snelle detectie van ziekteverwekkers met metagenomische sequencing van de volgende generatie van geïnfecteerde lichaamsvloeistoffen.Nat geneeskunde.2021;27:115-24.