Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Ongecontroleerde bloedingen zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken.Het bereiken van een snelle hemostase verzekert de overleving van het onderwerp als eerste hulp tijdens gevechten, verkeersongevallen en operaties om het aantal doden te verminderen.Nanoporeuze vezelversterkte composietsteiger (NFRCS) afgeleid van een eenvoudige hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC) als een continue fase kan hemostase activeren en verbeteren.De ontwikkeling van de NFRCS is gebaseerd op het ontwerp van de libelvleugel.De libelvleugelstructuur bestaat uit dwarse en longitudinale vleugels en de vleugelmembranen zijn met elkaar verbonden om de integriteit van de microstructuur te behouden.HFFC bedekt het oppervlak van de vezel gelijkmatig met een film van nanometerdikte en verbindt de willekeurig verdeelde katoendikte (Ct) (gedispergeerde fase) om een ​​nanoporeuze structuur te vormen.De combinatie van continue en gedispergeerde fasen verlaagt de kosten van het product tien keer in vergelijking met in de handel verkrijgbare producten.Gemodificeerde NFRCS (tampons of polsbandjes) kunnen worden gebruikt in verschillende biomedische toepassingen.In vivo-onderzoeken hebben geconcludeerd dat de ontwikkelde Cp-NFRCS het stollingsproces op de plaats van aanbrengen in gang zet en verbetert.NFRCS kan de micro-omgeving moduleren en op cellulair niveau werken vanwege de nanoporeuze structuur, wat resulteert in een betere wondgenezing in het excisiewondmodel.
Ongecontroleerd bloeden tijdens gevechten, intraoperatieve en noodsituaties kan een ernstige bedreiging vormen voor het leven van de gewonden1.Deze aandoeningen leiden verder tot een algehele toename van de perifere vasculaire weerstand, wat leidt tot hemorragische shock.Passende maatregelen om bloedingen tijdens en na de operatie onder controle te houden, worden als potentieel levensbedreigend beschouwd2,3.Schade aan grote bloedvaten leidt tot massaal bloedverlies, resulterend in een sterftecijfer van ≤ 50% tijdens gevechten en 31% tijdens operaties1.Massaal bloedverlies leidt tot een afname van het lichaamsvolume, waardoor het hartminuutvolume afneemt.Een toename van de totale perifere vasculaire weerstand en een progressieve verslechtering van de microcirculatie leiden tot hypoxie in de levensondersteunende organen.Hemorragische shock kan optreden als de aandoening aanhoudt zonder effectieve interventie1,4,5.Andere complicaties zijn onder meer de progressie van hypothermie en metabole acidose, evenals een stollingsstoornis die het stollingsproces belemmert.Ernstige hemorragische shock gaat gepaard met een hoger risico op overlijden6,7,8.Bij graad III (progressieve) shock is bloedtransfusie essentieel voor het overleven van de patiënt tijdens intraoperatieve en postoperatieve morbiditeit en mortaliteit.Om alle bovenstaande levensbedreigende situaties het hoofd te bieden, hebben we een nanoporeuze vezelversterkte composietsteiger (NFRCS) ontwikkeld die een minimale polymeerconcentratie (0,5%) gebruikt met behulp van een combinatie van in water oplosbare hemostatische polymeren.
Met het gebruik van vezelversterking kunnen kosteneffectieve producten worden ontwikkeld.De willekeurig gerangschikte vezels lijken op de structuur van een libelvleugel, in evenwicht gehouden door de horizontale en verticale strepen op de vleugels.De dwars- en lengteaders van de vleugel staan ​​in verbinding met het vleugelmembraan (fig. 1).NFRCS bestaat uit versterkt Ct als een steigersysteem met betere fysieke en mechanische sterkte (figuur 1).Vanwege de betaalbaarheid en het vakmanschap geven chirurgen de voorkeur aan katoenen draadmeters (Ct) tijdens operaties en verbanden. Gezien de vele voordelen ervan, waaronder > 90% kristallijne cellulose (bevordert de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als een skeletsysteem van NFRCS9,10. Gezien de vele voordelen ervan, waaronder > 90% kristallijne cellulose (bevordert de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als een skeletsysteem van NFRCS9,10. Er zijn verschillende manieren om de kosten te verlagen, met een rendement van > 90%. Ct-testen in de lucht gebruik van NFCS9,10. Gezien de vele voordelen ervan, waaronder >90% kristallijne cellulose (betrokken bij verhoogde hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als het NFRCS-skeletsysteem9,10.Ct-code van NFCS9 ,10 maanden geleden.50% van de 90%Gezien de vele voordelen ervan, waaronder meer dan 90% kristallijne cellulose (helpt de hemostatische activiteit te verbeteren), werd Ct daarom gebruikt als een steiger voor NFRCS9,10.Ct was oppervlakkig gecoat (er werd nano-dikke filmvorming waargenomen) en onderling verbonden met een hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC).HFFC werkt als een matrigel en houdt willekeurig geplaatste Ct bij elkaar.Het ontwikkelde ontwerp brengt spanning over binnen de verspreide fase (versterkende vezels).Het is moeilijk om nanoporeuze structuren met een goede mechanische sterkte te verkrijgen met minimale polymeerconcentraties.Bovendien is het niet eenvoudig om verschillende matrijzen op maat te maken voor verschillende biomedische toepassingen.
De afbeelding toont een diagram van het NFRCS-ontwerp op basis van de libelvleugelstructuur (A).Deze afbeelding toont een vergelijkende analogie van de vleugelstructuur van een libel (de kruisende en longitudinale aders van de vleugel zijn met elkaar verbonden) en een microfoto in dwarsdoorsnede van Cp NFRCS (B).Schematische weergave van NFRCS.
NFRC's zijn ontwikkeld met behulp van HFFC als een continue fase om de bovenstaande beperkingen aan te pakken.HFFC is samengesteld uit verschillende filmvormende hemostatische polymeren, waaronder chitosan (als het belangrijkste hemostatische polymeer) met methylcellulose (MC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC 50 cp) en polyvinylalcohol (PVA)) (125 kDa) als een ondersteunend polymeer dat trombusvorming bevordert.vorming.De toevoeging van polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) verbeterde het vochtopnamevermogen van de NFRCS.Polyethyleenglycol 400 (PEG 400) werd toegevoegd om de polymeerverknoping in gebonden polymeermengsels te verbeteren.Drie verschillende HFFC-hemostatische samenstellingen (Cm HFFC, Ch HFFC en Cp HFFC), namelijk chitosan met MC (Cm), chitosan met HPMC (Ch) en chitosan met PVA (Cp), werden aangebracht op Ct.Verschillende in vitro en in vivo karakterisatiestudies hebben de hemostatische en wondgenezende activiteit van NFRCS bevestigd.Composietmaterialen aangeboden door NFRCS kunnen worden gebruikt om verschillende vormen van steigers aan te passen aan specifieke behoeften.
Bovendien kan NFRCS worden aangepast als verband of rol om het gehele letselgebied van de onderste ledematen en andere delen van het lichaam te bedekken.Specifiek voor verwondingen aan gevechtsledematen kan het ontworpen NCRCS-ontwerp worden gewijzigd in een halve arm of een volledig been (aanvullend figuur S11).Van de NFRCS kan met weefsellijm een ​​polsband worden gemaakt, die kan worden gebruikt om bloedingen door ernstig suïcidaal polsletsel te stoppen.Ons belangrijkste doel is om met zo min mogelijk polymeer een NFRCS te ontwikkelen die aan een grote bevolking (onder de armoedegrens) kan worden geleverd en die in een EHBO-doos kan worden geplaatst.Eenvoudig, efficiënt en zuinig in ontwerp, NFCS komt ten goede aan lokale gemeenschappen en kan een wereldwijde impact hebben.
Chitosan (molecuulgewicht 80 kDa) en amarant werden gekocht bij Merck, India.Hydroxypropylmethylcellulose 50 Cp, polyethyleenglycol 400 en methylcellulose werden gekocht bij Loba Chemie Pvt.LLC, Bombay.Polyvinylalcohol (molecuulgewicht 125 kDa) (87-90% gehydrolyseerd) werd gekocht bij National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidine K30 werd gekocht bij Molychem, Mumbai, steriele wattenstaafjes werden gekocht bij Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, met Milli Q water (Direct-Q3 waterzuiveringssysteem, Merck, India) als drager.
NFRCS is ontwikkeld met behulp van een vriesdroogmethode11,12.Alle HFFC-samenstellingen (tabel 1) werden bereid met behulp van een mechanische roerder.Bereid een 0,5% oplossing van chitosan met behulp van 1% azijnzuur in water door continu te roeren bij 800 rpm op een mechanische roerder.Het exacte gewicht van het beladen polymeer aangegeven in tabel 1 werd toegevoegd aan de chitosanoplossing en geroerd totdat een heldere polymeeroplossing was verkregen.PVP K30 en PEG 400 werden aan het resulterende mengsel toegevoegd in de hoeveelheden aangegeven in Tabel 1, en het roeren werd voortgezet totdat een heldere viskeuze polymeeroplossing was verkregen.Het resulterende bad van polymeeroplossing werd gedurende 60 minuten gesoniceerd om ingesloten luchtbellen uit het polymeermengsel te verwijderen.Zoals weergegeven in aanvullende figuur S1 (b), werd Ct gelijkmatig verdeeld in elk putje van een plaat met 6 putjes (schimmel) aangevuld met 5 ml HFFC.
De plaat met zes putjes werd gedurende 60 minuten gesoniceerd om uniforme bevochtiging en verdeling van HFFC in het Ct-netwerk te bereiken.Vries vervolgens de plaat met zes wells in bij -20°C gedurende 8-12 uur.Vriesplaten werden gedurende 48 uur gelyofiliseerd om verschillende formuleringen van NFRCS te verkrijgen.Dezelfde procedure wordt gebruikt om verschillende vormen en structuren te produceren, zoals tampons of cilindrische tampons, of elke andere vorm voor verschillende toepassingen.
Nauwkeurig gewogen chitosan (80 kDa) (3%) wordt opgelost in 1% azijnzuur met behulp van een magnetische roerder.Aan de resulterende oplossing van chitosan werd 1% PEG 400 toegevoegd en 30 minuten geroerd.Giet de resulterende oplossing in een vierkante of rechthoekige container en bevries bij -80°C gedurende 12 uur.Bevroren monsters werden gedurende 48 uur gelyofiliseerd om poreus Cs13 te verkrijgen.
De ontwikkelde NFRCS werd onderworpen aan experimenten met behulp van Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) om de chemische compatibiliteit van chitosan met andere polymeren te bevestigen.De FTIR-spectra (breedte van het spectrale bereik van 400 tot 4000 cm-1) van alle geteste monsters werden verkregen door 32 scans uit te voeren.
De bloedabsorptiesnelheid (BAR) voor alle formuleringen werd geëvalueerd met behulp van de methode beschreven door Chen et al.16 met kleine aanpassingen.De ontwikkelde NFRK's van alle samenstellingen werden overnacht in een vacuümoven bij 105°C gedroogd om achtergebleven oplosmiddel te verwijderen.30 mg NFRCS (aanvankelijk monstergewicht - W0) en 30 mg Ct (positieve controle) werden in afzonderlijke schalen geplaatst die een voormengsel van 3,8% natriumcitraat bevatten.Op vooraf bepaalde tijdsintervallen, dwz 5, 10, 20, 30, 40 en 60 seconden, werden de NFRCS verwijderd en werden hun oppervlakken ontdaan van niet-geabsorbeerd bloed door de monsters gedurende 30 seconden op Ct te plaatsen.Het uiteindelijke gewicht van het bloed dat werd geabsorbeerd door NFRCS 16 werd op elk tijdstip in aanmerking genomen (W1).Bereken het BAR-percentage met behulp van de volgende formule:
Bloedstollingstijd (BCT) werd bepaald zoals gerapporteerd door Wang et al.17 .De tijd die nodig is om volledig bloed (rattenbloed voorgemengd met 3,8% natriumcitraat) te laten stollen in aanwezigheid van NFRCS werd berekend als de BCT van het testmonster.De verschillende NFRCS-componenten (30 mg) werden in flesjes met schroefdop van 10 ml geplaatst en bij 37°C geïncubeerd.Bloed (0,5 ml) werd aan het flesje toegevoegd en 0,3 ml 0,2 M CaCl2 werd toegevoegd om bloedstolling te activeren.Keer ten slotte de injectieflacon elke 15 seconden om (tot 180°) totdat zich een stevig stolsel vormt.De BCT van de steekproef wordt geschat op basis van het aantal flips vails17,18.Op basis van BCT werden twee optimale samenstellingen van NFRCS Cm, Ch en Cp geselecteerd voor verdere karakterisatiestudies.
De BCT van Ch NFRCS- en Cp NFRCS-samenstellingen werd bepaald door de methode beschreven door Li et al. te implementeren.19 .Plaats 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs (positieve controle) in afzonderlijke petrischalen (37 °C).Bloed met 3,8% natriumcitraat werd gemengd met 0,2 M CaCl2 in een volumeverhouding van 10:1 om het bloedstollingsproces op gang te brengen.20 µl 0,2 M CaCl2-rattenbloedmengsel werd op het monsteroppervlak aangebracht en in een lege petrischaal geplaatst.De controle was bloed dat zonder Ct in lege petrischalen werd gegoten.Stop de stolling met vaste tussenpozen van 0, 3 en 5 minuten door 10 ml gedeïoniseerd (DI) water toe te voegen aan het monster dat de schaal bevat zonder de stolling te verstoren.Niet-gecoaguleerde erytrocyten (erytrocyten) ondergaan hemolyse in aanwezigheid van gedeïoniseerd water en geven hemoglobine af.Hemoglobine op verschillende tijdstippen (HA(t)) werd gemeten bij 540 nm (λmax hemoglobine) met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.De absolute absorptie van hemoglobine (AH(0)) in 0 min van 20 µl bloed in 10 ml gedeïoniseerd water werd als referentiestandaard genomen.De relatieve hemoglobine-opname (RHA) van gecoaguleerd bloed werd berekend uit de verhouding HA(t)/HA(0) met gebruikmaking van dezelfde partij bloed.
Met behulp van een textuuranalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, VS) werden de hechtende eigenschappen van NFRK aan beschadigd weefsel bepaald.Druk een cilindrische schaal met open bodem tegen de binnenkant van de varkenshuid (zonder vetlaag).Monsters (Ch NFRCS en Cp NFRCS) werden via een canule in cilindrische mallen aangebracht om hechting aan de huid van het varken te creëren.Na een incubatie van 3 minuten bij kamertemperatuur (KT) (25°C) werd de NFRCS-kleefkracht geregistreerd met een constante snelheid van 0,5 mm/sec.
Het belangrijkste kenmerk van chirurgische kitten is het verhogen van de bloedstolling en het verminderen van bloedverlies.Lossless coagulatie in NFRCS werd geëvalueerd met behulp van een eerder gepubliceerde methode met kleine aanpassingen 19 .Maak een microcentrifugebuisje (2 ml) (binnendiameter 10 mm) met een gat van 8 × 5 mm2 aan één kant van het centrifugebuisje (dat een open wond voorstelt).NFCS wordt gebruikt om de opening af te sluiten en tape wordt gebruikt om de buitenranden af ​​te dichten.Voeg 20 µl 0,2 M CaCl2 toe aan de microcentrifugebuis met het 3,8% natriumcitraatvoormengsel.Na 10 minuten werden de microcentrifugebuisjes uit de schalen verwijderd en werd de toename van de massa van de schalen bepaald door de uitstroom van bloed uit de NFRK (n = 3).Bloedverlies Ch NFRCS en Cp NFRCS werden vergeleken met Cs.
Natte integriteit van NFRCS werd bepaald op basis van de methode beschreven door Mishra en Chaudhary21 met kleine aanpassingen.Plaats de NFRCS in een erlenmeyer van 100 ml met 50 ml water en roer gedurende 60 seconden zonder een top te vormen.Visuele inspectie en prioritering van monsters op fysieke integriteit op basis van verzameling.
De bindingssterkte van HFFC aan Ct werd bestudeerd met behulp van eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen.De integriteit van de oppervlaktecoating werd beoordeeld door NFRK bloot te stellen aan akoestische golven (externe stimulus) in aanwezigheid van milliQ water (Ct).De ontwikkelde NFRCS Ch NFRCS en Cp NFRCS werden in een met water gevuld bekerglas geplaatst en gedurende respectievelijk 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 en 30 min gesoniceerd.Na droging werd het procentuele verschil tussen het begin- en eindgewicht van de NFRCS gebruikt om het percentage materiaalverlies (HFFC) te berekenen.In vitro BCT ondersteunde verder de bindingssterkte of het verlies van oppervlaktematerialen.De efficiëntie van HFFC-binding aan Ct zorgt voor bloedstolling en een elastische coating op het oppervlak van Ct22.
De homogeniteit van de ontwikkelde NFRCS werd bepaald door de BCT van monsters (30 mg) genomen van willekeurig geselecteerde algemene locaties van de NFRCS.Volg de eerder genoemde BCT-procedure om de NFCS-conformiteit te bepalen.Nabijheid tussen alle vijf monsters zorgt voor uniforme oppervlaktedekking en HFFC-afzetting in de Ct-mesh.
Het nominale bloedcontactgebied (NBCA) werd bepaald zoals eerder gerapporteerd met enkele aanpassingen.Stolling van het bloed door 20 µl bloed tussen de twee oppervlakken van Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs te klemmen.Na 1 uur werden de twee delen van de stent gescheiden en werd het gebied van het stolsel handmatig gemeten.De gemiddelde waarde van drie herhalingen werd beschouwd als NBCA NFRCS19.
Dynamic Vapor Sorption (DVS)-analyse werd gebruikt om de effectiviteit van NFRCS te evalueren om water te absorberen uit de externe omgeving of uit de verwondingsplaats die verantwoordelijk is voor het initiëren van coagulatie.De DVS evalueert of registreert de dampopname en het verlies in een monster gravimetrisch met behulp van een ultragevoelige balans met een massaresolutie van ±0,1 µg.Een partiële dampdruk (relatieve vochtigheid) wordt gegenereerd door een elektronische massastroomregelaar rond het monster door verzadigde en droge draaggassen te mengen. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee, op basis van het percentage vochtopname door de monsters, werden de monsters ingedeeld in 4 categorieën (0–0,012% w/w − niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15% matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee, op basis van het percentage vochtopname door de monsters, werden de monsters ingedeeld in 4 categorieën (0–0,012% w/w − niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15 % matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.In overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Farmacopee werden de monsters, afhankelijk van het percentage vochtopname door de monsters, verdeeld in 4 categorieën (0–0,012% w/w – niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2– vijftien%).% omzetbelasting en > 15% omzetbelasting)23. % matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比,样品分为4 类(0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南, 根据 吸收 的 百分比 样品 分为 分为 类 ((0-0.012% W/w- 吸Hoeveelheid 、 、 、 、 0.2-2% W/w Verdunning 、 2-15% Voedingswaarde ，> 15 % Hoeveelheid 23。In overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Farmacopee worden monsters verdeeld in 4 klassen, afhankelijk van het percentage vocht dat door het monster wordt opgenomen (0-0,012 gewichtsprocent – ​​niet-hygroscopisch, 0,2-2 gewichtsprocent licht hygroscopisch, 2-15 gewichtsprocent).% belasting, > 15 % belasting) 23. % matig hygroscopisch, > 15% zeer hygroscopisch) 23.De hygroscopische efficiëntie van NFCS X NFCS en TsN NFCS werd bepaald op een analysator DVS TA TGA Q5000 SA.Tijdens dit proces werden looptijd, relatieve vochtigheid (RV) en real-time monstergewicht bij 25°C24 verkregen.Het vochtgehalte wordt berekend door nauwkeurige NFRCS-massaanalyse met behulp van de volgende vergelijking:
MC is NFRCS-vochtigheid.m1 - droog gewicht van NSAID's.m2 is de realtime NFRCS-massa bij een gegeven RV.
Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof na het legen van de monsters bij 25 ° C gedurende 10 uur (<7 × 10–3 Torr). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof na het legen van de monsters bij 25 ° C gedurende 10 uur (<7 × 10–3 Torr). Het is belangrijk dat u de kosten van het gebruik van het programma voor het afhandelen van de kosten kunt verlagen. bij een temperatuur van 25 °С tot 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25°C waren geleegd (<7 × 10–3 Torr).Bij 25°C bij 10°C（< 7 × 10-3 Torr）bij 25°C Houd rekening met de kosten van het maken van een offerte Verwarm de oven voor 10 dagen bij 25°C (< 7 × 10-3 graden). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van stikstofadsorptie-experimenten met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur waren geleegd bij 25°C (< 7 x 10-3 torr).Het totale oppervlak, het porievolume en de NFRCS-poriegrootte werden bepaald met een Quantachrome van NOVA 1000e, Oostenrijk met behulp van RS 232-software.
Bereid 5% RBC's (zoutoplossing als verdunningsmiddel) uit volbloed.Breng vervolgens een hoeveelheid HFFC (0,25 ml) over naar een plaat met 96 putjes en 5% RBC-massa (0,1 ml).Incubeer het mengsel gedurende 40 minuten bij 37°C.Een mengsel van rode bloedcellen en serum werd beschouwd als een positieve controle en een mengsel van zoutoplossing en rode bloedcellen als een negatieve controle.Hemagglutinatie werd bepaald volgens de Stajitzky-schaal.De voorgestelde schalen zijn als volgt: + + + + dichte granulaire aggregaten;+ + + gladde bodemkussens met gebogen randen;+ + gladde onderkussens met gescheurde randen;+ smalle rode ringen rond de randen van de gladde kussentjes;– (negatief) discrete rode knop 12 in het midden van de onderste put.
De hemocompatibiliteit van NFRCS werd bestudeerd volgens de methode van de International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.De gravimetrische methode beschreven door Singh et al.Er zijn kleine wijzigingen aangebracht om trombusvorming te beoordelen in aanwezigheid van of op het oppervlak van NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS werden gedurende 24 uur bij 37°C geïncubeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).Na 24 uur werd PBS verwijderd en werd NFRCS behandeld met 2 ml bloed dat 3,8% natriumcitraat bevatte.Voeg op het oppervlak van de NFRCS 0,04 ml 0,1 M CaCl2 toe aan de geïncubeerde monsters.Na 45 minuten werd 5 ml gedestilleerd water toegevoegd om coagulatie te stoppen.Gecoaguleerd bloed op het oppervlak van NFRK werd behandeld met 36-38% formaldehyde-oplossing.De met formaldehyde gefixeerde stolsels werden gedroogd en gewogen.Het percentage trombose werd geschat door het gewicht van het glas zonder bloed en monster (negatieve controle) en het glas met bloed (positieve controle) te berekenen.
Als eerste bevestiging werden de monsters gevisualiseerd onder een optische microscoop om het vermogen van de HFFC-oppervlaktecoating, het onderling verbonden Ct en het Ct-netwerk om poriën te vormen te begrijpen.Dunne secties van Ch en Cp van NFRCS werden getrimd met een scalpelmes.Het resulterende gedeelte werd op een glasplaatje geplaatst, bedekt met een dekglaasje, en de randen werden met lijm gefixeerd.De voorbereide dia's werden bekeken onder een optische microscoop en er werden foto's genomen met verschillende vergrotingen.
Polymeerafzetting in Ct-netwerken werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie op basis van de methode beschreven door Rice et al.29. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amarant) en NFRCS (Ch & Cp) werd bereid volgens de eerder genoemde methode. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amarant) en NFRCS (Ch & Cp) werd bereid volgens de eerder genoemde methode.De voor formulering gebruikte HFFC-samenstelling werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amarant) en NFRCS (Ch en Cp) werd verkregen volgens de eerder genoemde methode.De HFFC-versie van de nieuwe versie van de HFFC-versie en de nieuwe versie van de NFRCS-code (Ch & Cp).De HFFC-versie van de nieuwe versie van de HFFC-versie en de nieuwe versie van de NFRCS-code (Ch & Cp).De HFFC-samenstelling die in de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (Amaranth) en kreeg NFRCS (Ch en Cp), zoals eerder vermeld.Dunne secties van NFRK werden uit de verkregen monsters gesneden, op glasplaatjes geplaatst en bedekt met dekglaasjes.Observeer de voorbereide dia's onder een fluorescentiemicroscoop met een groen filter (310-380 nm).Beelden werden genomen met een vergroting van 4x om Ct-relaties en overtollige polymeerafzetting in het Ct-netwerk te begrijpen.
De oppervlaktetopografie van NFRCS Ch en Cp werd bepaald met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) met een ultrascherpe TESP-cantilever in tapmodus: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Oppervlakteruwheid werd bepaald door root mean square (RMS) met behulp van software (Scanning Probe Image Processor).Verschillende NFRCS-locaties werden weergegeven op 3D-beelden om te controleren op oppervlakte-uniformiteit.De standaarddeviatie van de score voor een bepaald gebied wordt gedefinieerd als de oppervlakteruwheid.De RMS-vergelijking werd gebruikt om de oppervlakteruwheid van NFRCS31 te kwantificeren.
Op FESEM gebaseerde onderzoeken werden uitgevoerd met behulp van FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, om de oppervlaktemorfologie van Ch NFRCS en Cp NFRCS te begrijpen, die betere BCT vertoonden dan Cm NFRCS.Het FESEM-onderzoek is uitgevoerd volgens de methode beschreven door Zhao et al.32 met kleine aanpassingen.NFRCS 20 tot 30 mg Ch NFRCS en Cp NFRCS werden voorgemengd met 20 µl 3,8% natriumcitraat voorgemengd met rattenbloed.Aan de met bloed behandelde monsters werd 20 µl 0,2 M CaCl2 toegevoegd om coagulatie op gang te brengen en de monsters werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.Bovendien werden overtollige erytrocyten van het NFRCS-oppervlak verwijderd door spoelen met zoutoplossing.
Daaropvolgende monsters werden behandeld met 0,1% glutaaraldehyde en vervolgens gedroogd in een heteluchtoven bij 37°C om vocht te verwijderen.De gedroogde monsters werden gecoat en geanalyseerd 32 .Andere afbeeldingen die tijdens de analyse werden verkregen, waren stolselvorming op het oppervlak van individuele katoenvezels, polymeerafzetting tussen Ct, erytrocytenmorfologie (vorm), stollingsintegriteit en erytrocytenmorfologie in aanwezigheid van NFRCS.Onbehandelde NFRCS-gebieden en met Ch en Cp behandelde NFRCS-gebieden geïncubeerd met bloed werden gescand op elementaire ionen (natrium, kalium, stikstof, calcium, magnesium, zink, koper en selenium)33.Vergelijk de percentages elementaire ionen tussen behandelde en onbehandelde monsters om de accumulatie van elementaire ionen tijdens stolselvorming en stollingshomogeniteit te begrijpen.
De dikte van de Cp HFFC-oppervlaktecoating op het Ct-oppervlak werd bepaald met behulp van FESEM.De dwarsdoorsneden van Cp NFRCS werden uit het raamwerk gesneden en door sputteren bekleed.De resulterende monsters van de sputtercoating werden waargenomen door FESEM en de dikte van de oppervlaktecoating werd gemeten 34 , 35 , 36 .
X-ray micro-CT biedt 3D niet-destructieve beeldvorming met hoge resolutie en stelt u in staat de interne structurele opstelling van NFRK te bestuderen.Micro-CT gebruikt een röntgenstraal die door het monster gaat om de lokale lineaire verzwakkingscoëfficiënt van de röntgenstralen in het monster vast te leggen, wat helpt om morfologische informatie te verkrijgen.De interne locatie van Ct in Cp NFRCS en met bloed behandeld Cp NFRCS werd onderzocht met micro-CT om de absorptie-efficiëntie en bloedstolling in de aanwezigheid van NFRCS37,38,39 te begrijpen.De 3D-structuren van met bloed behandelde en onbehandelde Cp-NFRCS-monsters werden gereconstrueerd met behulp van micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Duitsland).Met behulp van VG STUDIO-MAX softwareversie 2.2 werden verschillende röntgenfoto's gemaakt vanuit verschillende hoeken (idealiter 360° dekking) om 3D-beelden voor NFRCS te ontwikkelen.De verzamelde projectiegegevens werden gereconstrueerd in 3D volumetrische beelden met behulp van de bijbehorende eenvoudige 3D ScanIP Academic-software.
Bovendien werden, om de verdeling van het stolsel te begrijpen, 20 µl voorgemengd gecitreerd bloed en 20 µl 0,2 M CaCl2 toegevoegd aan de NFRCS om bloedstolling op gang te brengen.De voorbereide monsters laten uitharden.Het NFRK-oppervlak werd behandeld met 0,5% glutaaraldehyde en gedurende 30 minuten gedroogd in een heteluchtoven bij 30-40°C.Het bloedstolsel gevormd op de NFRCS werd gescand, gereconstrueerd en er werd een 3D-beeld van het bloedstolsel gevisualiseerd.
Antibacteriële assays werden uitgevoerd op Cp NFRCS (beste vergeleken met Ch NFRCS) met behulp van de eerder beschreven methode met kleine aanpassingen.De antibacteriële activiteit van Cp NFRCS en Cp HFFC werd bepaald met behulp van drie verschillende testmicro-organismen [S.aureus (grampositieve bacteriën), E.coli (gramnegatieve bacteriën) en witte Candida (C.albicans)] die groeiden op agar in petrischalen in een incubator.Ent gelijkmatig 50 ml van de verdunde bacteriecultuursuspensie in een concentratie van 105-106 CFU ml-1 op het agarmedium.Giet het medium in een petrischaal en laat het stollen.Er werden putjes gemaakt op het oppervlak van de agarplaat om te vullen met HFFC (3 putjes voor HFFC en 1 voor negatieve controle).Voeg 200 µl HFFC toe aan 3 putjes en 200 µl pH 7,4 PBS aan het 4e putje.Plaats aan de andere kant van de petrischaal een 12 mm Cp NFRCS-schijf op de gestolde agar en bevochtig met PBS (pH 7,4).Ciprofloxacine, ampicilline en fluconazol tabletten worden beschouwd als referentiestandaarden voor Staphylococcus aureus, Escherichia coli en Candida albicans.Meet de remmingszone handmatig en maak een digitale afbeelding van de remmingszone.
Na institutionele ethische goedkeuring werd de studie uitgevoerd aan het Kasturba Medical College of Education and Research in Manipal, Karnataka, in Zuid-India.Het in vitro TEG-experimentele protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Ethics Committee van Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Proefpersonen werden gerekruteerd uit vrijwillige bloeddonoren (18 tot 55 jaar) van de bloedbank van het ziekenhuis.Daarnaast werd van de vrijwilligers een toestemmingsformulier verkregen voor het afnemen van bloedmonsters.Native TEG (N-TEG) ​​​​werd gebruikt om het effect van de Cp HFFC-formulering op volbloed voorgemengd met natriumcitraat te bestuderen.N-TEG wordt algemeen erkend vanwege zijn rol bij reanimatie op het zorgpunt, wat problemen veroorzaakt voor clinici vanwege de mogelijkheid van klinisch significante vertraging in resultaten (routinematige stollingstesten).N-TEG-analyse werd uitgevoerd met volbloed.Geïnformeerde toestemming en gedetailleerde medische geschiedenis werden verkregen van alle deelnemers.De studie omvatte geen deelnemers met hemostatische of trombotische complicaties zoals zwangerschap/postpartum of leverziekte.Proefpersonen die medicijnen gebruikten die de stollingscascade beïnvloeden, werden ook uitgesloten van het onderzoek.Basislaboratoriumtests (hemoglobine, protrombinetijd, geactiveerde tromboplastine en aantal bloedplaatjes) werden uitgevoerd op alle deelnemers volgens standaardprocedures.N-TEG bepaalt de visco-elasticiteit van het bloedstolsel, de initiële structuur van het stolsel, de deeltjesinteractie, de versterking van het stolsel en de lysis van het stolsel.De N-TEG-analyse biedt grafische en numerieke gegevens over de collectieve effecten van verschillende cellulaire elementen en plasma.N-TEG-analyse werd uitgevoerd op twee verschillende volumina Cp HFFC (10 µl en 50 µl).Als resultaat werd 1 ml volbloed met citroenzuur toegevoegd aan 10 μl Cp HFFC.Voeg 1 ml (Cp HFFC + citraatbloed), 340 µl gemengd bloed toe aan 20 µl 0,2 M CaCl2-bevattende TEG-schaal.Daarna werden TEG-schalen in TEG® 5000, US geladen om R, K, alfahoek, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% van de bloedmonsters te meten in aanwezigheid van Cp HFFC41.
Het in vivo studieprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van het Comité voor de controle en het toezicht op dierproeven (CPCSEA).Alle in vivo NFRCS-onderzoeken (2 × 2 cm2) werden uitgevoerd op vrouwelijke Wistar-ratten (met een gewicht van 200 tot 250 g).Alle dieren werden geacclimatiseerd bij een temperatuur van 24-26°C, de dieren hadden ad libitum vrije toegang tot standaard voer en water.Alle dieren werden willekeurig verdeeld in verschillende groepen, elke groep bestond uit drie dieren.Alle studies werden uitgevoerd in overeenstemming met Animal Studies: Report of In Vivo Experiments43.Voorafgaand aan het onderzoek werden de dieren verdoofd door intraperitoneale (ip) toediening van een mengsel van 20-50 mg ketamine (per 1 kg lichaamsgewicht) en 2-10 mg xylazine (per 1 kg lichaamsgewicht).Na het onderzoek werd het bloedingsvolume berekend door het verschil tussen het aanvankelijke en het uiteindelijke gewicht van de monsters te evalueren, de gemiddelde waarde verkregen uit de drie tests werd genomen als het bloedingsvolume van het monster.
Het amputatiemodel van de rattenstaart werd geïmplementeerd om het potentieel van NFRCS te begrijpen om bloedingen bij trauma, gevecht of verkeersongeval te moduleren (letselmodel).Snijd 50% van de staart af met een scalpelmes en plaats 15 s in de lucht om een ​​normale bloeding te garanderen.Daarnaast werden proefmonsters op de staart van een rat geplaatst door druk uit te oefenen (Ct, Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS).Bloedingen en PCT werden gemeld voor testmonsters (n = 3)17,45.
De effectiviteit van NFRCS-drukcontrole in gevechten werd onderzocht op een model van de oppervlakkige dijbeenslagader.De dijbeenslagader wordt blootgelegd, doorboord met een 24G-trocart en binnen 15 seconden bloedt het.Nadat een ongecontroleerde bloeding is waargenomen, wordt het testmonster onder druk op de prikplaats geplaatst.Onmiddellijk na het aanbrengen van het testmonster werd de stollingstijd geregistreerd en werd de hemostatische efficiëntie waargenomen gedurende de volgende 5 minuten.Dezelfde procedure werd herhaald met Cs en Ct46.
Dowling et al.47 stelde een leverbeschadigingsmodel voor om het hemostatische potentieel van hemostatische materialen in de context van intraoperatieve bloedingen te beoordelen.BCT werd geregistreerd voor Ct-monsters (negatieve controle), Cs-raamwerk (positieve controle), Ch-NFRCS-monsters en Cp-NFRCS-monsters.De suprahepatische vena cava van de rat werd blootgelegd door middel van een mediane laparotomie.Daarna werd het distale deel van de linkerkwab met een schaar uitgesneden.Maak met een scalpel een incisie in de lever en laat deze een paar seconden bloeden.Nauwkeurig gewogen Ch NFRCS- en Cp NFRCS-testmonsters werden zonder enige positieve druk op het beschadigde oppervlak geplaatst en BCT werd geregistreerd.De controlegroep (Ct) oefende vervolgens druk uit gevolgd door Cs 30 s47 zonder de blessure te breken.
In vivo wondgenezingstesten werden uitgevoerd met behulp van een excisie-wondmodel om de wondgenezingseigenschappen van de ontwikkelde op polymeren gebaseerde NFRCS's te evalueren.Modellen van excisiewonden werden geselecteerd en uitgevoerd volgens eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen19,32,48.Alle dieren werden verdoofd zoals eerder beschreven.Maak met een biopsiepons (12 mm) een cirkelvormige diepe incisie in de huid van de rug.Geprepareerde wondplaatsen werden bekleed met Cs (positieve controle), Ct (erkennend dat wattenschijfjes de genezing belemmeren), Ch NFRCS en Cp NFRCS (experimentele groep) en een negatieve controle zonder enige behandeling.Op elke dag van het onderzoek werd bij alle ratten het gebied van de wond gemeten.Gebruik een digitale camera om een ​​foto te maken van het wondgebied en breng een nieuw verband aan.Het percentage wondsluiting werd gemeten met de volgende formule:
Gebaseerd op het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek, werd de rattenhuid van de beste groep weggesneden ((Cp NFRCS) en de controlegroep) en bestudeerd door middel van H&E-kleuring en Masson's trichroomkleuring. Gebaseerd op het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek, werd de rattenhuid van de beste groep weggesneden ((Cp NFRCS) en de controlegroep) en bestudeerd door middel van H&E-kleuring en Masson's trichroomkleuring.Op basis van het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek werd de huid van de ratten van de beste groep ((Cp NFRCS) en de controlegroep) uitgesneden en onderzocht door kleuren met hematoxyline-eosine en Masson's trichroom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Mas zoonDe 12-jarige versie van de serie ((Cp NFRCS) en de foto's van de H&E-serie, de H&E-versie van het programma眳组）Ratten in de beste groep ((Cp NFRCS) en controlegroepen) werden uitgesneden voor hematoxyline-eosinekleuring en Masson's trichroomkleuring op basis van het percentage wondsluiting op dag 12 van het onderzoek.De geïmplementeerde kleuringsprocedure werd uitgevoerd volgens eerder beschreven methoden49,50.In het kort, na fixatie in 10% formaline werden de monsters gedehydrateerd met behulp van een reeks gegradeerde alcoholen.Gebruik een microtoom om dunne secties (5 µm dik) van het uitgesneden weefsel te verkrijgen.Dunne seriële secties van controles en Cp NFRCS werden behandeld met hematoxyline en eosine om histopathologische veranderingen te bestuderen.Masson's trichroomkleuring werd gebruikt om de vorming van collageenfibrillen te detecteren.De verkregen resultaten werden blind bestudeerd door pathologen.
De stabiliteit van Cp-NFRCS-monsters werd bestudeerd bij kamertemperatuur (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) gedurende 12 maanden51.Cp NFRCS (oppervlakteverkleuring en microbiële groei) werd visueel geïnspecteerd en getest op vouwslijtageweerstand en BCT volgens de bovenstaande methoden beschreven in de sectie Materialen en methoden.
De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Cp NFRCS werd onderzocht door Cp NFRCS te bereiden met een afmeting van 15×15 cm2.Bovendien werden monsters van 30 mg (n = 5) uit verschillende Cp-NFRCS-fracties gesneden en werd de BCT van de bestudeerde monsters geëvalueerd zoals eerder beschreven in de sectie Methoden.
We hebben geprobeerd verschillende vormen en structuren te ontwikkelen met behulp van Cp NFRCS-samenstellingen voor verschillende biomedische toepassingen.Dergelijke vormen of configuraties omvatten conische wattenstaafjes voor neusbloedingen, tandheelkundige ingrepen en cilindrische wattenstaafjes voor vaginale bloedingen.
Alle gegevenssets worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en werden geanalyseerd door ANOVA met behulp van Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, VS) gevolgd door Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest (* p <0,05).
Alle procedures die werden uitgevoerd in menselijke studies waren in overeenstemming met de normen van het Instituut en de National Research Council, evenals de Verklaring van Helsinki 1964 en de daaropvolgende wijzigingen, of vergelijkbare ethische normen.Alle deelnemers werden geïnformeerd over de kenmerken van het onderzoek en het vrijwillige karakter ervan.Gegevens van deelnemers blijven vertrouwelijk zodra ze zijn verzameld.Het in vitro TEG-experimentele protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Ethics Committee van Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Vrijwilligers ondertekenden geïnformeerde toestemming om bloedmonsters te verzamelen.
Alle procedures uitgevoerd in dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de Kastuba Faculteit der Geneeskunde, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle ontworpen dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Comité voor de controle en het toezicht op dierproeven (CPCSEA).Alle auteurs volgen de ARRIVE-richtlijnen.
De FTIR-spectra van alle NFRCS werden geanalyseerd en vergeleken met het chitosan-spectrum weergegeven in figuur 2A.Karakteristieke spectrale pieken van chitosan (geregistreerd) bij 3437 cm-1 (OH- en NH-strekking, overlap), 2945 en 2897 cm-1 (CH-strekking), 1660 cm-1 (NH2-stam), 1589 cm-1 (N-H-buiging), 1157 cm-1 (brugrek O-), 1067 cm-1 (rek C-O, secundaire hydroxyl), 993 cm- 1 (strek CO, Bo-OH) 52.53.54.Aanvullende tabel S1 toont de FTIR NFCS-absorptiespectrumwaarden voor chitosan (reporter), pure chitosan, Cm, Ch en Cp.De FTIR-spectra van alle NFRCS (Cm, Ch en Cp) vertoonden dezelfde karakteristieke absorptiebanden als puur chitosan zonder significante veranderingen (Fig. 2A).De FTIR-resultaten bevestigden de afwezigheid van chemische of fysische interacties tussen de polymeren die werden gebruikt om de NFRCS te ontwikkelen, wat aangeeft dat de gebruikte polymeren inert zijn.
In vitro karakterisering van Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs.(A) vertegenwoordigt de gecombineerde FTIR-spectra van de composities van chitosan en Cm NFRCS, Ch NFRCS en Cp NFRCS onder compressie.(B) a) Volbloedopnamesnelheid van NFRCS Cm, Ch, Cp en Cg (n = 3);De Ct-monsters vertoonden een hogere BAR omdat het wattenstaafje een hogere absorptie-efficiëntie heeft;b) Bloed na bloedabsorptie Illustratie van het geabsorbeerde monster.Grafische weergave van de BCT van testmonster C (Cp NFRCS had de beste BCT (15 s, n = 3)). Gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken vertegenwoordigen SD, ***p < 0,0001. Gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken vertegenwoordigen SD, ***p < 0,0001. Schakel de C, D, E en G-schakelaars in of uit, en de verschillende opties van de waarde, ***p <0,0001. Gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie, ***p<0,0001. C、D、E en G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E en G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 De opties voor C, D, E en G kunnen worden aangepast of gewijzigd, afhankelijk van de levering van de kosten, ***p <0,0001. Gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie, ***p<0,0001.