Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
De vruchtbaarheid van vogels hangt af van hun vermogen om voldoende levensvatbaar sperma voor een langere periode op te slaan in de spermaopslagtubuli (SST).Het exacte mechanisme waarmee spermatozoa de SST binnenkomen, erin verblijven en verlaten, blijft controversieel.Het sperma van sharkasi-kippen vertoonde een sterke neiging tot agglutinatie en vormde mobiele filamenteuze bundels die veel cellen bevatten.Vanwege de moeilijkheid om de beweeglijkheid en het gedrag van spermatozoa in een ondoorzichtige eileider te observeren, gebruikten we een microfluïdisch apparaat met een microkanaaldwarsdoorsnede vergelijkbaar met die van spermatozoa om agglutinatie en motiliteit van spermatozoa te bestuderen.Deze studie bespreekt hoe spermabundels zich vormen, hoe ze bewegen en hun mogelijke rol bij het verlengen van sperma-residentie in de SST.We onderzochten de spermasnelheid en het reologische gedrag wanneer een vloeistofstroom werd gegenereerd in een microfluïdisch kanaal door hydrostatische druk (stroomsnelheid = 33 µm/s).De spermatozoa hebben de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie) en de snelheid van de spermatozoönbundel is aanzienlijk verminderd in vergelijking met enkele spermatozoa.Er is waargenomen dat spermabundels in een spiraal bewegen en in lengte en dikte toenemen naarmate er meer enkele zaadcellen worden gerekruteerd. Spermabundels werden waargenomen die de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich eraan hechtten om te voorkomen dat ze werden geveegd met een vloeistofstroomsnelheid> 33 µm/s. Spermabundels werden waargenomen die de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich eraan hechtten om te voorkomen dat ze werden geveegd met een vloeistofstroomsnelheid> 33 µm/s. Wat u moet weten, is dat u de kosten van het onderhoud en de levering van de kosten van uw bestelling kunt Als u een product koopt, kunt u het apparaat ongeveer 33 minuten per dag gebruiken. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderen en zich eraan hechten om te voorkomen dat ze worden weggevaagd bij vloeistofstroomsnelheden> 33 μm / s.33 μm/s stroomsnelheid van 33 µm/s.33 µm/s stroom Wat u moet weten, is dat u de kosten van het onderhoud en de levering van de kosten van uw bestelling kunt Als u een product koopt, kunt u het beste een hoeveelheid van > 33 ml/cm gebruiken. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van het microfluïdische kanaal naderen en zich eraan hechten om te voorkomen dat ze worden weggevaagd door een vloeistofstroom van >33 µm/s.Scanning en transmissie-elektronenmicroscopie onthulden dat de spermabundels werden ondersteund door overvloedig dicht materiaal.De verkregen gegevens tonen de unieke mobiliteit van Sharkazi-kippenspermatozoa aan, evenals het vermogen van spermatozoa om te agglutineren en mobiele bundels te vormen, wat bijdraagt ​​tot een beter begrip van de langetermijnopslag van spermatozoa in SMT.
Om bevruchting bij mensen en de meeste dieren te bereiken, moeten sperma en eieren op het juiste moment op de plaats van bevruchting aankomen.Daarom moet paring vóór of op het moment van de ovulatie plaatsvinden.Aan de andere kant slaan sommige zoogdieren, zoals honden, maar ook niet-zoogdiersoorten, zoals insecten, vissen, reptielen en vogels, sperma gedurende een langere periode op in hun voortplantingsorganen totdat hun eieren klaar zijn voor bevruchting (asynchrone bevruchting 1 ).Vogels zijn in staat om de levensvatbaarheid van spermatozoa die in staat zijn om eieren te bevruchten gedurende 2-10 weken te behouden2.
Dit is een uniek kenmerk dat vogels onderscheidt van andere dieren, omdat het een grote kans op bevruchting biedt na een enkele inseminatie gedurende meerdere weken zonder gelijktijdige paring en ovulatie.Het belangrijkste sperma-opslagorgaan, de sperma-opslagtubulus (SST) genoemd, bevindt zich in de interne mucosale plooien bij de uterovaginale overgang.Tot op heden zijn de mechanismen waarmee sperma de spermabank binnenkomt, verblijft en verlaat niet volledig begrepen.Op basis van eerdere studies zijn er veel hypothesen naar voren gebracht, maar geen ervan is bevestigd.
Forman veronderstelde dat spermatozoa hun verblijf in de SST-holte behouden door continue oscillerende beweging tegen de richting van de vloeistofstroom in door eiwitkanalen op SST-epitheelcellen (reologie).ATP is uitgeput als gevolg van de constante flagellaire activiteit die nodig is om het sperma in het SST-lumen te houden en de beweeglijkheid neemt uiteindelijk af totdat het sperma door een vloeistofstroom uit de spermabank wordt afgevoerd en een nieuwe reis door de stijgende eileider begint om het sperma te bevruchten.Ei (Forman4).Dit model van opslag van sperma wordt ondersteund door de detectie door immunocytochemie van aquaporines 2, 3 en 9 aanwezig in SST-epitheelcellen.Tot op heden ontbreken studies over de reologie van kippensperma en de rol ervan bij SST-opslag, vaginale spermaselectie en spermacompetitie.Bij kippen komt sperma de vagina binnen na natuurlijke paring, maar meer dan 80% van de spermatozoa wordt kort na paring uit de vagina geworpen.Dit suggereert dat de vagina de primaire plaats is voor spermaselectie bij vogels.Bovendien is gemeld dat minder dan 1% van de in de vagina bevruchte spermatozoa in SST's terechtkomt2.Bij kunstmatige inseminatie van kuikens in de vagina neemt het aantal spermatozoa dat SST bereikt 24 uur na inseminatie toe.Tot nu toe is het mechanisme van spermaselectie tijdens dit proces onduidelijk, en de beweeglijkheid van sperma kan een belangrijke rol spelen bij de opname van SST-sperma's.Vanwege de dikke en ondoorzichtige wanden van de eileiders is het moeilijk om de beweeglijkheid van het sperma in de eileiders van vogels direct te controleren.Daarom missen we basiskennis over hoe spermatozoa na bevruchting overgaan naar SST.
Reologie is onlangs erkend als een belangrijke factor die het spermatransport in de genitaliën van zoogdieren regelt.Op basis van het vermogen van beweeglijke spermatozoa om tegen de stroom in te migreren, gebruikten Zaferani et al8 een corra-microfluïdisch systeem om beweeglijke spermatozoa passief te isoleren uit opgesloten spermamonsters.Dit type spermasortering is essentieel voor medische onvruchtbaarheidsbehandelingen en klinisch onderzoek, en heeft de voorkeur boven traditionele methoden die tijd- en arbeidsintensief zijn en de morfologie en structurele integriteit van het sperma in gevaar kunnen brengen.Tot op heden zijn er echter geen studies uitgevoerd naar het effect van secreties van de geslachtsorganen van kippen op de beweeglijkheid van sperma.
Ongeacht het mechanisme dat het sperma in de SST bewaart, hebben veel onderzoekers waargenomen dat residente spermatozoa kop-aan-kop agglutineren in de SST van kippen 9, 10, kwartels 2 en kalkoenen 11 om geagglutineerde spermabundels te vormen.De auteurs suggereren dat er een verband bestaat tussen deze agglutinatie en langdurige opslag van spermatozoa in de SST.
Tingari en Lake12 rapporteerden een sterke associatie tussen spermatozoa in de sperma-ontvangende klier van de kip en vroegen zich af of spermatozoa van vogels op dezelfde manier agglutineren als spermatozoa van zoogdieren.Ze geloven dat de diepe verbindingen tussen sperma in de zaadleider mogelijk te wijten zijn aan de stress die wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een groot aantal sperma in een kleine ruimte.
Bij het evalueren van het gedrag van spermatozoa op vers hangende objectglaasjes, kunnen voorbijgaande tekenen van agglutinatie worden waargenomen, vooral aan de randen van de spermadruppels.Agglutinatie werd echter vaak verstoord door de roterende actie die gepaard gaat met continue beweging, wat de voorbijgaande aard van dit fenomeen verklaart.De onderzoekers merkten ook op dat wanneer het verdunningsmiddel aan het sperma werd toegevoegd, langwerpige "draadachtige" celaggregaten verschenen.
Vroege pogingen om een ​​spermatozoön na te bootsen, werden gedaan door een dunne draad van een hangende druppel te verwijderen, wat resulteerde in een langwerpig sperma-achtig blaasje dat uit de spermadruppel stak.De spermatozoa stonden onmiddellijk parallel in het blaasje, maar de hele eenheid verdween snel vanwege de 3D-beperking.Om de agglutinatie van spermatozoa te bestuderen, is het daarom noodzakelijk om de beweeglijkheid en het gedrag van spermatozoa rechtstreeks in geïsoleerde sperma-opslagtubuli te observeren, wat moeilijk te bereiken is.Daarom is het noodzakelijk om een ​​instrument te ontwikkelen dat spermatozoa nabootst om studies naar de beweeglijkheid van sperma en het agglutinatiegedrag te ondersteunen.Brillard et al13 rapporteerden dat de gemiddelde lengte van de sperma-opslagtubuli bij volwassen kuikens 400-600 µm is, maar sommige SST's kunnen wel 2000 µm lang zijn.Mero en Ogasawara14 verdeelden de zaadklieren in vergrote en niet-vergrote sperma-opslagtubuli, die beide dezelfde lengte (~500 µm) en nekbreedte (~38 µm) hadden, maar de gemiddelde lumendiameter van de tubuli was 56,6 en 56,6 µm.., respectievelijk 11,2 μm.In de huidige studie hebben we een microfluïdisch apparaat gebruikt met een kanaalgrootte van 200 µm × 20 µm (B × H), waarvan de doorsnede enigszins in de buurt komt van die van de versterkte SST.Daarnaast hebben we de beweeglijkheid en het agglutinatiegedrag van sperma in stromende vloeistof onderzocht, wat consistent is met de hypothese van Foreman dat vloeistof geproduceerd door SST-epitheelcellen sperma in het lumen houdt in een tegenstroom (reologische) richting.
Het doel van deze studie was om de problemen van het observeren van de beweeglijkheid van spermatozoa in de eileider te overwinnen en om de moeilijkheden van het bestuderen van de reologie en het gedrag van spermatozoa in een dynamische omgeving te vermijden.Er werd een microfluïdisch apparaat gebruikt dat hydrostatische druk creëert om de beweeglijkheid van het sperma in de geslachtsdelen van een kip te simuleren.
Wanneer een druppel van een verdund spermamonster (1:40) in het microkanaalapparaat werd geladen, konden twee soorten spermamotiliteit worden geïdentificeerd (geïsoleerd sperma en gebonden sperma).Bovendien hadden spermatozoa de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie; video 1, 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan die van eenzaam sperma (p < 0,001), verhoogden ze het percentage sperma dat positieve reotaxis vertoonde (p < 0,001; tabel 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan die van eenzaam sperma (p < 0,001), verhoogden ze het percentage sperma dat positieve reotaxis vertoonde (p < 0,001; tabel 2). Als u een van de volgende opties gebruikt, kunt u het beste uit de tijd halen (p < 0,001), is het mogelijk om de waarde van de waarde te bepalen (p < 0,001) ; punt 2). Hoewel de spermatozoabundels een lagere snelheid hadden dan die van enkele spermatozoa (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermatozoa dat positieve reotaxis vertoonde (p < 0,001; tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百0 （ p < 0,001 ； 2）。（p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子（p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Wat is de beste manier om de beste resultaten te behalen (p < 0,001), of de waarde van de test is afhankelijk van de waarde (p < 0,001; waarde 2). Hoewel de snelheid van spermabundels lager was dan die van enkele spermatozoa (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermatozoa met positieve reologie (p < 0,001; tabel 2).Positieve reologie voor enkele spermatozoa en bosjes wordt geschat op respectievelijk ongeveer 53% en 85%.
Er is waargenomen dat de spermatozoa van sharkasi-kippen onmiddellijk na de ejaculatie lineaire bundels vormen, bestaande uit tientallen individuen.Deze bosjes worden in de loop van de tijd langer en dikker en kunnen enkele uren in vitro blijven voordat ze verdwijnen (video 3).Deze filamenteuze bundels hebben de vorm van echidna spermatozoa die zich vormen aan het einde van de epididymis.Er is gevonden dat sperma van Sharkashi-kippen een sterke neiging heeft om te agglutineren en een netvormige bundel te vormen in minder dan een minuut na verzameling.Deze stralen zijn dynamisch en kunnen zich hechten aan nabijgelegen muren of statische objecten.Hoewel spermabundels de snelheid van spermacellen verminderen, is het duidelijk dat ze macroscopisch hun lineariteit vergroten.De lengte van de bundels varieert afhankelijk van het aantal sperma dat in bundels is verzameld.Twee delen van de bundel werden geïsoleerd: het eerste deel, inclusief de vrije kop van het geagglutineerde sperma, en het laatste deel, inclusief de staart en het gehele distale uiteinde van het sperma.Met behulp van een hogesnelheidscamera (950 fps) werden vrije koppen van geagglutineerde spermatozoa waargenomen in het eerste deel van de bundel, verantwoordelijk voor de beweging van de bundel als gevolg van hun oscillerende beweging, waarbij de resterende koppen met een spiraalvormige beweging in de bundel werden gesleept (video 4).Bij lange plukjes is echter waargenomen dat enkele vrije spermakoppen aan het lichaam hechtten en dat het eindgedeelte van de pluk als schoepen fungeert om het plukje voort te stuwen.
Terwijl ze zich in een langzame vloeistofstroom bevinden, bewegen de spermabundels evenwijdig aan elkaar, maar ze beginnen elkaar te overlappen en vast te kleven aan alles wat stil is, om niet weggespoeld te worden door de stroom naarmate de stroomsnelheid toeneemt.De bundels vormen zich wanneer een handvol zaadcellen elkaar naderen, ze beginnen synchroon te bewegen en om elkaar heen te wikkelen, en plakken dan aan een kleverige substantie.Figuren 1 en 2 laten zien hoe de zaadcellen elkaar naderen en een kruising vormen terwijl de staarten om elkaar heen wikkelen.
De onderzoekers pasten hydrostatische druk toe om een ​​vloeistofstroom in een microkanaal te creëren om de reologie van sperma te bestuderen.Er werd een microkanaal gebruikt met een afmeting van 200 µm × 20 µm (B × H) en een lengte van 3,6 µm.Gebruik microkanalen tussen containers met aan de uiteinden injectiespuiten.Kleurstof voor levensmiddelen werd gebruikt om de kanalen beter zichtbaar te maken.
Bind verbindingskabels en accessoires aan de muur.De video is gemaakt met een fasecontrastmicroscoop.Bij elk beeld worden fasecontrastmicroscopie en mappingbeelden gepresenteerd.(A) De verbinding tussen twee stromen weerstaat de stroming als gevolg van spiraalvormige beweging (rode pijl).(B) De verbinding tussen de buizenbundel en de kanaalwand (rode pijlen), tegelijkertijd zijn ze verbonden met twee andere bundels (gele pijlen).(C) Spermabundels in het microfluïdische kanaal beginnen met elkaar te verbinden (rode pijlen) en vormen een netwerk van spermabundels.(D) Vorming van een netwerk van spermabundels.
Toen een druppel verdund sperma in het microfluïdische apparaat werd geladen en er een stroom werd gecreëerd, werd waargenomen dat de spermastraal tegen de richting van de stroom in bewoog.De bundels passen precies tegen de wanden van de microkanalen en de vrije koppen in het eerste deel van de bundels passen er precies tegenaan (video 5).Ze houden zich ook vast aan stilstaande deeltjes op hun pad, zoals puin, om te voorkomen dat ze door de stroming worden weggevaagd.Na verloop van tijd worden deze plukjes lange filamenten die andere afzonderlijke spermatozoa en kortere plukjes vasthouden (video 6).Terwijl de stroom begint te vertragen, beginnen lange spermalijnen een netwerk van spermalijnen te vormen (video 7; afbeelding 2).
Bij hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) worden de spiraalvormige bewegingen van de draden vergroot in een poging om veel individuele spermavormende bundels te vangen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroom. Bij hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) worden de spiraalvormige bewegingen van de draden vergroot in een poging om veel individuele spermavormende bundels te vangen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroom. Controleer de temperatuur (V > 33 мкм/с) Als u de kosten van het gebruik van uw apparaat wilt wijzigen, kunt u uw geld verdienen gebruik het apparaat niet. Bij hoge stroomsnelheden (V > 33 µm/s) nemen de spiraalvormige bewegingen van de strengen toe, omdat ze veel individuele spermatozoa proberen te vangen die bundels vormen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroom.stroomverbruik (V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力。De temperatuur van het apparaat (v> 33 µm/s) is het enige dat u hoeft te doen om het apparaat te laten werken. 。。。。。。。。。。 Controleer de temperatuur (V > 33 мкм/с) Als u een apparaat gebruikt, kunt u het beste een product kopen verwijder het apparaat. Bij hoge stroomsnelheden (V > 33 µm/s) neemt de spiraalvormige beweging van de filamenten toe in een poging om veel individuele spermatozoa-vormende bundels te vangen om de driftkrachten van de stroom beter te weerstaan.Ze probeerden ook microkanalen aan de zijwanden te bevestigen.
Spermabundels werden geïdentificeerd als clusters van spermakoppen en krullende staarten met behulp van lichtmicroscopie (LM).Spermabundels met verschillende aggregaten zijn ook geïdentificeerd als gedraaide koppen en flagellar-aggregaten, meerdere gefuseerde spermastaarten, spermakoppen bevestigd aan een staart en spermakoppen met gebogen kernen als meerdere gefuseerde kernen.transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) toonde aan dat de spermabundels omhulde aggregaten van spermakoppen waren en dat de sperma-aggregaten een aangehecht netwerk van gewikkelde staarten vertoonden.
De morfologie en ultrastructuur van spermatozoa, de vorming van spermatozoabundels werden bestudeerd met behulp van lichtmicroscopie (halve sectie), scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), sperma-uitstrijkjes werden gekleurd met acridine-oranje en onderzocht met epifluorescentiemicroscopie.
Sperma-uitstrijkkleuring met acridine-sinaasappel (fig. 3B) toonde aan dat de spermakoppen aan elkaar plakten en bedekt waren met secretoir materiaal, wat leidde tot de vorming van grote plukjes (fig. 3D).De spermabundels bestonden uit sperma-aggregaten met een netwerk van aangehechte staarten (Fig. 4A-C).Spermabundels zijn samengesteld uit de staarten van vele aan elkaar geplakte spermatozoa (fig. 4D).Geheimen (Fig. 4E, F) bedekten de hoofden van spermatozoabundels.
Vorming van de spermatozoabundel Met behulp van fasecontrastmicroscopie en sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridine-oranje, bleek dat de koppen van spermatozoa aan elkaar kleven.(A) De vroege vorming van zaadcellen begint met een zaadcel (witte cirkel) en drie zaadcellen (gele cirkel), waarbij de spiraal begint bij de staart en eindigt bij de kop.(B) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje met aanhangende spermakoppen (pijlen).De afscheiding bedekt de kop(pen).Vergroting × 1000. (C) Ontwikkeling van een grote bundel getransporteerd door stroming in een microfluïdisch kanaal (met behulp van een hogesnelheidscamera met 950 fps).(D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje met grote plukjes (pijlen).Vergroting: ×200.
Scanning-elektronenmicrofoto van een spermastraal en een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje.(A, B, D, E) zijn digitale kleurenscanning-elektronenmicrofoto's van spermatozoa, en C en F zijn microfoto's van met acridine-oranje gekleurde sperma-uitstrijkjes die de hechting tonen van meerdere spermatozoa die het staartweb omwikkelen.(AC) Sperma-aggregaten worden weergegeven als een netwerk van aangehechte staarten (pijlen).(D) Hechting van verschillende spermatozoa (met kleefstof, roze omtrek, pijl) die zich om de staart wikkelen.(E en F) Spermakopaggregaten (pointers) bedekt met klevend materiaal (pointers).De spermatozoa vormden bundels met verschillende wervelachtige structuren (F).(C) ×400 en (F) ×200 vergrotingen.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie ontdekten we dat spermabundels staarten hadden (Fig. 6A, C), koppen die aan staarten waren bevestigd (Fig. 6B) of koppen die aan staarten waren bevestigd (Fig. 6D).De koppen van de spermatozoa in de bundel zijn gebogen en presenteren in sectie twee nucleaire gebieden (Fig. 6D).In de incisiebundel hadden de spermatozoa een gedraaide kop met twee nucleaire gebieden en meerdere flagellaire gebieden (Fig. 5A).
Digitale kleurenelektronenmicrofoto die de verbindingsstaarten in de spermabundel en het agglutinerende materiaal dat de spermakoppen verbindt, laat zien.(A) Bijgevoegde staart van een groot aantal spermatozoa.Merk op hoe de staart eruitziet in zowel staande (pijl) als liggende (pijl) projecties.(B) De kop (pijl) van het sperma is verbonden met de staart (pijl).(C) Verschillende spermastaarten (pijlen) zijn bevestigd.(D) Agglutinatiemateriaal (AS, blauw) verbindt vier spermakoppen (paars).
Scanning-elektronenmicroscopie werd gebruikt om spermakoppen te detecteren in spermabundels bedekt met secreties of membranen (Figuur 6B), wat aangeeft dat de spermabundels waren verankerd door extracellulair materiaal.Het geagglutineerde materiaal werd geconcentreerd in de spermakop (kwallenkopachtig samenstel; Fig. 5B) en distaal geëxpandeerd, wat een schitterend geel uiterlijk gaf onder fluorescentiemicroscopie wanneer gekleurd met acridine-oranje (Fig. 6C).Deze stof is duidelijk zichtbaar onder een scanmicroscoop en wordt beschouwd als een bindmiddel.Halfdunne secties (fig. 5C) en sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridine-oranje toonden spermabundels met dicht opeengepakte koppen en gekrulde staarten (fig. 5D).
Verschillende microfoto's die aggregatie van spermakoppen en gevouwen staarten laten zien met behulp van verschillende methoden.(A) Dwarsdoorsnede digitale kleurentransmissie-elektronenmicrofoto van een spermabundel met een opgerolde spermakop met een tweedelige kern (blauw) en verschillende flagellaire delen (groen).(B) Digitale kleurenscanning-elektronenmicroscoop met een cluster van kwallenachtige spermakoppen (pijlen) die bedekt lijken te zijn.(C) Halfdunne sectie met geaggregeerde spermakoppen (pijlen) en gekrulde staarten (pijlen).(D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-sinaasappel met aggregaten van spermakoppen (pijlen) en gekrulde aanhangende staarten (pijlen).Merk op dat een kleverige substantie (S) de kop van het spermatozoön bedekt.(D) × 1000 vergroting.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 7A) werd ook opgemerkt dat de spermakoppen gedraaid waren en dat de kernen een spiraalvorm hadden, zoals bevestigd door sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridine-oranje en onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie (Fig. 7B).
(A) Digitale kleurentransmissie-elektronenmicrofoto en (B) Acridine-oranje gekleurd sperma-uitstrijkje met opgerolde koppen en bevestiging van spermakoppen en -staarten (pijlen).(B) × 1000 vergroting.
Een interessante bevinding is dat het sperma van Sharkazi zich samenvoegt om mobiele filamenteuze bundels te vormen.De eigenschappen van deze bundels stellen ons in staat om hun mogelijke rol in de absorptie en opslag van spermatozoa in de SST te begrijpen.
Na de paring komt het sperma de vagina binnen en ondergaat een intens selectieproces, waardoor slechts een beperkt aantal spermacellen de SST binnenkomt15,16.Tot op heden zijn de mechanismen waarmee sperma de SST binnenkomt en verlaat onduidelijk.Bij pluimvee worden spermatozoa gedurende een langere periode van 2 tot 10 weken in de SST bewaard, afhankelijk van de soort6.Er blijft controverse bestaan ​​over de toestand van het sperma tijdens de bewaring in de SST.Zijn ze in beweging of in rust?Met andere woorden, hoe behouden zaadcellen zo lang hun positie in de SST?
Forman4 suggereerde dat SST-verblijf en -ejectie verklaard kunnen worden in termen van spermamotiliteit.De auteurs veronderstellen dat spermacellen hun positie behouden door tegen de vloeistofstroom in te zwemmen die wordt gecreëerd door het SST-epitheel en dat spermacellen worden uitgeworpen uit de SST wanneer hun snelheid daalt tot onder het punt waarop ze achteruit beginnen te bewegen vanwege gebrek aan energie.Zaniboni5 bevestigde de aanwezigheid van aquaporines 2, 3 en 9 in het apicale deel van SST-epitheelcellen, wat indirect het Foreman's spermaopslagmodel kan ondersteunen.In de huidige studie ontdekten we dat bijna de helft van de spermatozoa van Sharkashi een positieve reologie vertonen in de stromende vloeistof, en dat geagglutineerde spermabundels het aantal spermatozoa met een positieve reologie vergroten, hoewel agglutinatie ze vertraagt.Hoe zaadcellen door de eileider van de vogel naar de plaats van bevruchting reizen, is niet helemaal duidelijk.Bij zoogdieren trekt de folliculaire vloeistof chemo aan spermatozoa.Er wordt echter aangenomen dat chemoattractanten spermatozoa sturen om lange afstanden te naderen7.Daarom zijn andere mechanismen verantwoordelijk voor het transport van sperma.Het vermogen van sperma om zich te oriënteren en tegen de eileidervloeistof te stromen die vrijkomt na het paren, is naar verluidt een belangrijke factor bij het richten van sperma bij muizen.Parker 17 suggereerde dat spermatozoa de eileiders passeren door tegen de ciliaire stroom in te zwemmen bij vogels en reptielen.Hoewel het niet experimenteel is aangetoond bij vogels, was Adolphi18 de eerste die ontdekte dat vogelsperma positieve resultaten geeft wanneer een dunne laag vloeistof tussen een dekglaasje en een glaasje wordt gemaakt met een strook filtreerpapier.Reologie.Hino en Yanagimachi [19] plaatsten een eierstok-eileider-baarmoedercomplex van een muis in een perfusiering en injecteerden 1 µl inkt in de landengte om de vloeistofstroom in de eileiders zichtbaar te maken.Ze merkten een zeer actieve beweging van samentrekking en ontspanning op in de eileider, waarbij alle inktballetjes gestaag naar de ampulla van de eileider bewogen.De auteurs benadrukken het belang van de eileidersvloeistofstroom van de onderste naar de bovenste eileiders voor de opheffing en bevruchting van het sperma.Brillard20 meldde dat spermatozoa bij kippen en kalkoenen migreren door actieve beweging van de vaginale ingang, waar ze worden opgeslagen, naar de utero-vaginale overgang, waar ze worden opgeslagen.Deze beweging is echter niet vereist tussen de uterovaginale overgang en het infundibulum omdat de spermatozoa worden getransporteerd door passieve verplaatsing.Deze eerdere aanbevelingen kennende en de resultaten verkregen in de huidige studie, kan worden aangenomen dat het vermogen van spermatozoa om stroomopwaarts te bewegen (reologie) een van de eigenschappen is waarop het selectieproces is gebaseerd.Dit bepaalt de doorgang van spermatozoa door de vagina en hun binnenkomst in de CCT voor opslag.Zoals Forman4 suggereerde, kan dit ook het proces vergemakkelijken waarbij sperma de SST en zijn habitat gedurende een bepaalde tijd binnengaat en vervolgens verlaat wanneer hun snelheid begint te vertragen.
Aan de andere kant suggereerden Matsuzaki en Sasanami 21 dat aviaire spermatozoa motiliteitsveranderingen ondergaan van rusttoestand naar motiliteit in de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen.Remming van de beweeglijkheid van ingezeten sperma in de SST is voorgesteld om de lange bewaartijd van sperma en vervolgens verjonging na het verlaten van de SST te verklaren.Onder hypoxische omstandigheden, Matsuzaki et al.1 rapporteerde een hoge productie en afgifte van lactaat in de SST, wat kan leiden tot remming van de beweeglijkheid van het sperma.In dit geval wordt het belang van spermareologie weerspiegeld in de selectie en absorptie van spermatozoa, en niet in hun opslag.
Het patroon van sperma-agglutinatie wordt beschouwd als een plausibele verklaring voor de lange opslagperiode van sperma in de SST, aangezien dit een veelvoorkomend patroon is van spermaretentie bij pluimvee2,22,23.Bakst et al.2 merkte op dat de meeste spermatozoa aan elkaar hechtten en fasciculaire aggregaten vormden, en enkele spermatozoa werden zelden gevonden in CCM van kwartels.Aan de andere kant, Wen et al.24 waargenomen meer verspreide spermatozoa en minder spermatozoa-bosjes in het SST-lumen bij kippen.Op basis van deze waarnemingen kan worden aangenomen dat de neiging tot agglutinatie van sperma verschilt tussen vogels en tussen spermatozoa in hetzelfde ejaculaat.Daarnaast hebben Van Krey et al.9 suggereerde dat willekeurige dissociatie van geagglutineerde spermatozoa verantwoordelijk is voor de geleidelijke penetratie van spermatozoa in het lumen van de eileider.Volgens deze hypothese moeten spermatozoa met een lagere agglutinatiecapaciteit eerst uit de SST worden verwijderd.In deze context kan het vermogen van spermatozoa om te agglutineren een factor zijn die de uitkomst van spermacompetitie bij vuile vogels beïnvloedt.Bovendien, hoe langer het geagglutineerde sperma dissocieert, hoe langer de vruchtbaarheid behouden blijft.
Hoewel aggregatie en aggregatie van spermatozoa in verschillende onderzoeken2,22,24 zijn waargenomen, zijn ze niet in detail beschreven vanwege de complexiteit van hun kinematische observatie binnen de SST.Er zijn verschillende pogingen gedaan om sperma-agglutinatie in vitro te bestuderen.Uitgebreide maar voorbijgaande aggregatie werd waargenomen toen de dunne draad uit de bungelende zaaddruppel werd verwijderd.Dit leidt ertoe dat een langwerpige luchtbel uit de druppel steekt en de zaadklier imiteert.Door 3D-beperkingen en korte droogtijden raakte het hele blok al snel in verval9.In de huidige studie, met behulp van Sharkashi-kippen en microfluïdische chips, konden we beschrijven hoe deze plukjes zich vormen en hoe ze bewegen.Spermabundels vormden zich onmiddellijk na spermaverzameling en bleken in een spiraal te bewegen, waarbij ze een positieve reologie vertoonden wanneer ze in de stroom aanwezig waren.Bovendien is waargenomen dat spermabundels, wanneer ze macroscopisch worden bekeken, de lineariteit van de beweeglijkheid verhogen in vergelijking met geïsoleerde spermatozoa.Dit suggereert dat sperma-agglutinatie kan optreden voorafgaand aan SST-penetratie en dat spermaproductie niet beperkt is tot een klein gebied als gevolg van stress, zoals eerder werd gesuggereerd (Tingari en Lake12).Tijdens de vorming van plukjes zwemmen de spermatozoa synchroon totdat ze een knooppunt vormen, dan wikkelen hun staarten zich om elkaar heen en blijft de kop van het spermatozoon vrij, maar de staart en het distale deel van het spermatozoon plakken aan elkaar met een kleverige substantie.Daarom is de vrije kop van het ligament verantwoordelijk voor de beweging en sleept het de rest van het ligament mee.Scanning-elektronenmicroscopie van de spermabundels toonde aangehechte spermakoppen bedekt met veel kleverig materiaal, wat suggereert dat de spermakoppen vastzaten in rustende bundels, wat mogelijk is gebeurd na het bereiken van de opslagplaats (SST).
Wanneer een sperma-uitstrijkje wordt gekleurd met acridine-oranje, kan onder een fluorescentiemicroscoop extracellulair kleefmateriaal rond de spermacellen worden gezien.Deze stof zorgt ervoor dat spermabundels zich kunnen hechten aan omringende oppervlakken of deeltjes, zodat ze niet meedrijven met de omringende stroom.Onze waarnemingen tonen dus de rol van adhesie van spermatozoa in de vorm van mobiele bundels.Hun vermogen om tegen de stroom in te zwemmen en zich aan nabijgelegen oppervlakken te hechten, zorgt ervoor dat sperma langer in de SST kan blijven.
Rothschild25 gebruikte een hemocytometrische camera om de zwevende verdeling van rundersperma in een druppel suspensie te bestuderen, waarbij microfoto's werden gemaakt door een camera met zowel de verticale als de horizontale optische as van de microscoop.De resultaten toonden aan dat de spermatozoa werden aangetrokken door het oppervlak van de kamer.De auteurs suggereren dat er mogelijk hydrodynamische interacties zijn tussen het sperma en het oppervlak.Hiermee rekening houdend, samen met het vermogen van Sharkashi-kuikensperma om kleverige plukjes te vormen, kan het de kans vergroten dat sperma aan de SST-wand zal hechten en voor lange tijd zal worden opgeslagen.
Bccetti en Afzeliu26 meldden dat de glycocalyx van het sperma vereist is voor gameetherkenning en agglutinatie.Forman10 merkte op dat hydrolyse van α-glycosidische bindingen in glycoproteïne-glycolipide-coatings door vogelsperma te behandelen met neuraminidase resulteerde in verminderde vruchtbaarheid zonder de beweeglijkheid van het sperma te beïnvloeden.De auteurs suggereren dat het effect van neuraminidase op de glycocalyx de sekwestratie van sperma op de utero-vaginale overgang schaadt, waardoor de vruchtbaarheid wordt verminderd.Hun observaties kunnen de mogelijkheid niet negeren dat behandeling met neuraminidase de herkenning van sperma en eicellen kan verminderen.Forman en Engel10 ontdekten dat de vruchtbaarheid afnam wanneer hennen intravaginaal werden geïnsemineerd met sperma dat was behandeld met neuraminidase.IVF met met neuraminidase behandeld sperma had echter geen invloed op de vruchtbaarheid in vergelijking met controlekippen.De auteurs concludeerden dat veranderingen in de glycoproteïne-glycolipide-coating rond het spermamembraan het vermogen van sperma om te bevruchten verminderden door de sekwestratie van sperma bij de utero-vaginale overgang te verminderen, wat op zijn beurt het spermaverlies verhoogde als gevolg van de snelheid van de uterovaginale overgang, maar heeft geen invloed op de herkenning van sperma en eicellen.
Bij kalkoenen vonden Bakst en Bauchan 11 kleine blaasjes en membraanfragmenten in het lumen van de SST en stelden vast dat sommige van deze korrels waren versmolten met het spermamembraan.De auteurs suggereren dat deze relaties kunnen bijdragen aan de langdurige opslag van spermatozoa in SST.De onderzoekers specificeerden echter niet de bron van deze deeltjes, of ze nu worden uitgescheiden door CCT-epitheelcellen, geproduceerd en uitgescheiden door het mannelijke voortplantingssysteem, of geproduceerd door het sperma zelf.Ook zijn deze deeltjes verantwoordelijk voor agglutinatie.Grützner et al. rapporteerden dat epididymale epitheelcellen een specifiek eiwit produceren en afscheiden dat nodig is voor de vorming van zaadkanalen met één porie.De auteurs melden ook dat de verspreiding van deze bundels afhangt van de interactie van epididymale eiwitten.Nixon et al vonden dat de adnexen een eiwit afscheiden, het zure cysteïnerijke osteonectine;SPARC is betrokken bij de vorming van zaadplukjes bij kortsnavelige echidna's en vogelbekdieren.De verstrooiing van deze bundels wordt geassocieerd met het verlies van dit eiwit.
In de huidige studie toonde ultrastructurele analyse met behulp van elektronenmicroscopie aan dat de spermatozoa zich hechtten aan een grote hoeveelheid dicht materiaal.Aangenomen wordt dat deze stoffen verantwoordelijk zijn voor de agglutinatie die condenseert tussen en rond de aanhangende koppen, maar in lagere concentraties in het staartgebied.We nemen aan dat deze agglutinerende substantie wordt uitgescheiden door het mannelijke voortplantingssysteem (epididymis of zaadleider) samen met sperma, aangezien we vaak zien dat sperma zich afscheidt van lymfe en zaadplasma tijdens ejaculatie.Er is gemeld dat wanneer aviaire spermatozoa door de epididymis en zaadleider gaan, ze rijpinggerelateerde veranderingen ondergaan die hun vermogen ondersteunen om eiwitten te binden en plasma-lemma-geassocieerde glycoproteïnen te verwerven.De persistentie van deze eiwitten op residente spermamembranen in de SST suggereert dat deze eiwitten de verwerving van spermamembraanstabiliteit kunnen beïnvloeden 30 en hun vruchtbaarheid kunnen bepalen 31 .Ahammad et al32 rapporteerden dat spermatozoa verkregen uit verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem (van de teelballen tot de distale zaadleider) een progressieve toename in levensvatbaarheid vertoonden onder vloeibare opslagomstandigheden, ongeacht de opslagtemperatuur, en dat de levensvatbaarheid bij kippen ook toenam in de eileiders na kunstmatige inseminatie.
Spermatoefjes van Sharkashi-kippen hebben andere kenmerken en functies dan andere soorten zoals echidna's, vogelbekdieren, bosmuizen, hertenratten en cavia's.Bij sharkasi-kippen verminderde de vorming van spermatozoabundels hun zwemsnelheid in vergelijking met enkele spermatozoa.Deze bundels verhoogden echter het percentage reologisch positieve spermatozoa en verhoogden het vermogen van spermatozoa om zichzelf te stabiliseren in een dynamische omgeving.Onze resultaten bevestigen dus de eerdere suggestie dat sperma-agglutinatie in SST geassocieerd is met langdurige opslag van sperma.We veronderstellen ook dat de neiging van sperma om plukjes te vormen, de snelheid van spermaverlies in SST kan beheersen, wat de uitkomst van spermacompetitie kan veranderen.Volgens deze aanname geven spermatozoa met een lage agglutinatiecapaciteit eerst SST vrij, terwijl spermatozoa met een hoge agglutinatiecapaciteit de meeste nakomelingen voortbrengen.De vorming van spermabundels met één porie is gunstig en beïnvloedt de ouder-kindratio, maar gebruikt een ander mechanisme.Bij echidna's en vogelbekdieren zijn de spermatozoa evenwijdig aan elkaar gerangschikt om de voorwaartse snelheid van de straal te vergroten.Bundels echidna's bewegen ongeveer drie keer sneller dan afzonderlijke spermatozoa.Er wordt aangenomen dat de vorming van dergelijke zaadplukjes in echidna's een evolutionaire aanpassing is om de dominantie te behouden, aangezien vrouwtjes promiscue zijn en meestal paren met meerdere mannetjes.Daarom strijden spermatozoa van verschillende ejaculaten fel om de bevruchting van de eicel.
Geagglutineerde spermatozoa van sharkasi-kippen zijn gemakkelijk te visualiseren met behulp van fasecontrastmicroscopie, wat als voordelig wordt beschouwd omdat het een gemakkelijke studie van het gedrag van spermatozoa in vitro mogelijk maakt.Het mechanisme waarmee de vorming van zaadstrengen de voortplanting bij sharkasi-kippen bevordert, verschilt ook van het mechanisme dat wordt gezien bij sommige placenta-zoogdieren die coöperatief spermagedrag vertegenwoordigen, zoals bosmuizen, waar sommige spermatozoa de eieren bereiken en andere verwante individuen helpen hun eieren te bereiken en te beschadigen.om jezelf te bewijzen.altruïstisch gedrag.Zelfbevruchting 34. Een ander voorbeeld van coöperatief gedrag in spermatozoa werd gevonden bij hertenmuizen, waar spermatozoa zich konden identificeren en combineren met de meest genetisch verwante spermatozoa en coöperatieve groepen vormden om hun snelheid te verhogen in vergelijking met niet-verwante spermatozoa35.
De resultaten die in deze studie zijn verkregen, zijn niet in tegenspraak met de theorie van Foman over langdurige opslag van spermatozoa in SWS.De onderzoekers melden dat spermacellen gedurende een langere periode blijven bewegen in de stroom van epitheelcellen langs de SST, en na een bepaalde periode raken de energievoorraden van de spermacellen uitgeput, wat resulteert in een afname van de snelheid, wat de uitdrijving van stoffen met een klein molecuulgewicht mogelijk maakt.energie van spermatozoa met de vloeistofstroom uit het lumen van de SST De holte van de eileider.In de huidige studie hebben we waargenomen dat de helft van het enkele sperma het vermogen toonde om tegen stromende vloeistoffen in te zwemmen, en hun hechting in de bundel verhoogde hun vermogen om positieve reologie te vertonen.Bovendien komen onze gegevens overeen met die van Matsuzaki et al.1 die meldde dat verhoogde lactaatsecretie bij SST de beweeglijkheid van ingezeten sperma kan remmen.Onze resultaten beschrijven echter de vorming van beweeglijke ligamenten van het sperma en hun reologisch gedrag in de aanwezigheid van een dynamische omgeving binnen een microkanaal in een poging hun gedrag in SST op te helderen.Toekomstig onderzoek kan zich richten op het bepalen van de chemische samenstelling en oorsprong van het agglutinerende middel, wat onderzoekers ongetwijfeld zal helpen nieuwe manieren te ontwikkelen om vloeibaar sperma op te slaan en de duur van de vruchtbaarheid te verlengen.
Vijftien 30 weken oude mannelijke sharkasi met blote hals (homozygoot dominant; Na Na) werden geselecteerd als spermadonoren in het onderzoek.De vogels werden gefokt op de Research Poultry Farm van de Faculteit Landbouw, Ashit University, Ashit Governorate, Egypte.De vogels werden gehuisvest in individuele kooien (30 x 40 x 40 cm), onderworpen aan een lichtprogramma (16 uur licht en 8 uur donker) en kregen een dieet dat 160 g ruw eiwit, 2800 kcal metaboliseerbare energie en elk 35 g calcium bevatte.5 gram beschikbare fosfor per kilogram voeding.
Volgens gegevens 36, 37 werd sperma van mannen verzameld door buikmassage.Er werden in totaal 45 spermamonsters verzameld van 15 mannen gedurende 3 dagen.Sperma (n = 15/dag) werd onmiddellijk 1:1 (v:v) verdund met Belsville Poultry Semen Diluent, dat kaliumdifosfaat (1,27 g), mononatriumglutamaatmonohydraat (0,867 g), fructose (0,5 d) watervrij natrium bevat.acetaat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethaan (0,195 g), kaliumcitraatmonohydraat (0,064 g), kaliummonofosfaat (0,065 g), magnesiumchloride (0,034 g) en H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolariteit 333 mOsm/kg38.Verdunde spermamonsters werden eerst onder een lichtmicroscoop onderzocht om een ​​goede spermakwaliteit (vocht) te garanderen en vervolgens in een waterbad bij 37°C bewaard tot gebruik binnen een half uur na afname.
De kinematica en reologie van spermatozoa worden beschreven met behulp van een systeem van microfluïdische apparaten.Spermamonsters werden verder verdund tot 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, geladen in een microfluïdisch apparaat (zie hieronder), en kinetische parameters werden bepaald met behulp van een Computerized Semen Analysis (CASA)-systeem dat eerder was ontwikkeld voor microfluïdische karakterisering.over de mobiliteit van spermatozoa in vloeibare media (Departement Werktuigbouwkunde, Faculteit Ingenieurswetenschappen, Universiteit van Assiut, Egypte).De plug-in kan worden gedownload op: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Curvesnelheid (VCL, μm/s), lineaire snelheid (VSL, μm/s) en gemiddelde baansnelheid (VAP, μm/s) werden gemeten.Video's van spermatozoa werden gemaakt met behulp van een omgekeerde Optika XDS-3 fasecontrastmicroscoop (met 40x objectief) aangesloten op een Tucson ISH1000-camera met 30 fps gedurende 3 seconden.Gebruik de CASA-software om ten minste drie gebieden en 500 spermatrajecten per monster te bestuderen.De opgenomen video is verwerkt met behulp van een zelfgemaakte CASA.De definitie van beweeglijkheid in de CASA-plug-in is gebaseerd op de zwemsnelheid van het sperma in vergelijking met de stroomsnelheid, en omvat geen andere parameters zoals zijwaartse beweging, aangezien dit betrouwbaarder is bevonden in vloeistofstroom.Reologische beweging wordt beschreven als de beweging van zaadcellen tegen de richting van de vloeistofstroom in.Spermatozoa met reologische eigenschappen werden gedeeld door het aantal beweeglijke spermatozoa;spermatozoa die in rust waren en convectief bewegende spermatozoa werden uitgesloten van de telling.
Alle gebruikte chemicaliën werden verkregen van Elgomhoria Pharmaceuticals (Caïro, Egypte), tenzij anders vermeld.Het apparaat is vervaardigd zoals beschreven door El-sherry et al.40 met enkele aanpassingen.De materialen die werden gebruikt om de microkanalen te fabriceren, omvatten glasplaten (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatieve resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalcohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland) en polyaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Microkanalen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie.Eerst werd een doorzichtig beschermend gezichtsmasker met het gewenste microkanaalontwerp geprint op een hoge resolutie printer (Prismatic, Cairo, Egypte en Pacific Arts and Design, Markham, ON).De masters zijn gemaakt met glasplaten als ondergrond.De platen werden gereinigd in aceton, isopropanol en gedeïoniseerd water en vervolgens bekleed met een 20 urn laag SU8-25 door middel van spincoaten (3000 rpm, 1 min).De SU-8-lagen werden vervolgens voorzichtig gedroogd (65°C, 2 min en 95°C, 10 min) en gedurende 50 s blootgesteld aan UV-straling.Na blootstelling bakken bij 65°C en 95°C gedurende 1 min en 4 min om blootgestelde SU-8-lagen te verknopen, gevolgd door ontwikkeling in diacetonalcohol gedurende 6,5 min.Bak de wafels hard (200°C gedurende 15 min) om de SU-8 laag verder te laten stollen.
PDMS werd bereid door het monomeer en de verharder te mengen in een gewichtsverhouding van 10:1, vervolgens ontgast in een vacuümexsiccator en op het SU-8 hoofdframe gegoten.Het PDMS werd uitgehard in een oven (120°C, 30 min), vervolgens werden de kanalen uitgesneden, gescheiden van de master en geperforeerd om buizen aan de inlaat en uitlaat van het microkanaal te kunnen bevestigen.Ten slotte werden PDMS-microkanalen permanent bevestigd aan microscoopglaasjes met behulp van een draagbare coronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) zoals elders beschreven.Het microkanaal dat in deze studie wordt gebruikt, meet 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3,6 cm lang.
De vloeistofstroom veroorzaakt door hydrostatische druk in het microkanaal wordt bereikt door het vloeistofniveau in het inlaatreservoir boven het hoogteverschil Δh39 in het uitlaatreservoir te houden (fig. 1).
waarbij f de wrijvingscoëfficiënt is, gedefinieerd als f = C/Re voor laminaire stroming in een rechthoekig kanaal, waarbij C een constante is die afhangt van de beeldverhouding van het kanaal, L de lengte is van het microkanaal, Vav de gemiddelde snelheid binnen het microkanaal, Dh de hydraulische diameter van het kanaal, g - versnelling van de zwaartekracht.Met behulp van deze vergelijking kan de gemiddelde kanaalsnelheid worden berekend met behulp van de volgende vergelijking: