Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer). In de tussentijd zullen we de site zonder stijlen en JavaScript weergeven om voortdurende ondersteuning te garanderen.
Poreuze silicadeeltjes werden bereid met een sol-gel-methode met enkele modificaties om macroporeuze deeltjes te verkrijgen. Deze deeltjes werden gederivatiseerd door reversibele additie-fragmentatieketenoverdracht (RAFT)-polymerisatie met N-fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen om N-fenylmaleïmide-intercalatie van polystyreen (PMP) stationaire fase te bereiden. Roestvrijstalen kolommen met smalle boring (100 × 1,8 mm id) werden gepakt door slurrypakking.Eval PMP-kolomscheiding van een peptidenmengsel bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkefaline) chromatografische prestatie) en trypsinedigestie van humaan serumalbumine (HAS). scheidingsprestaties van de ontwikkelde kolom met de commerciële Ascentis Express RP-Amide-kolom, werd waargenomen dat de scheidingsprestaties van de PMP-kolom superieur waren aan de commerciële kolom in termen van scheidingsefficiëntie en resolutie.
In de afgelopen jaren is de biofarmaceutische industrie een groeiende wereldmarkt geworden met een substantiële toename van het marktaandeel. Met de explosieve groei van de biofarmaceutische industrie1,2,3 is de analyse van peptiden en eiwitten zeer gewenst. Naast het doelpeptide worden tijdens de peptidesynthese verschillende onzuiverheden gegenereerd, waardoor chromatografische zuivering nodig is om peptiden van de gewenste zuiverheid te verkrijgen. De analyse en karakterisering van eiwitten in lichaamsvloeistoffen, weefsels en cellen is een uiterst uitdagende taak vanwege het grote aantal potentieel detecteerbare soorten in Hoewel massaspectrometrie een effectief hulpmiddel is voor peptide- en eiwitsequencing, zal de scheiding niet ideaal zijn als dergelijke monsters in één keer in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Vloeistofchromatografie (LC) is het afgelopen decennium aanzienlijk vooruitgegaan en is een populaire techniek geworden in proteomische analyse7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) wordt veel gebruikt voor de zuivering en scheiding van peptidemengsels met behulp van octadecyl-gemodificeerde silica (ODS) als de stationaire fase11,12,13. Stationaire RP-fasen bieden echter geen bevredigende scheiding van peptiden en eiwitten vanwege hun complexe structuur en amfifiele aard14,15. Daarom zijn speciaal ontworpen stationaire fasen vereist om peptiden en eiwitten met polaire en niet-polaire delen te analyseren om te interageren chromatografie met gemengde modus, die multimodale interacties biedt, kan een alternatief zijn voor RP-LC voor de scheiding van peptiden, eiwitten en andere complexe mengsels. Er zijn verschillende stationaire fasen met gemengde modus voorbereid en kolommen vol met deze fasen zijn gebruikt voor scheidingen van peptiden en eiwitten 17,18,19,20,21. ation/RPLC) zijn geschikt voor peptide- en eiwitscheidingen vanwege de aanwezigheid van zowel polaire als niet-polaire groepen22,23,24,25,26,27,28. Evenzo vertonen polaire intercalerende stationaire fasen met covalent gebonden polaire groepen een goed scheidingsvermogen en unieke selectiviteit voor polaire en niet-polaire analyten, aangezien de scheiding afhangt van de interactie tussen analyt en stationaire fase.Multimodale interacties 29, 30, 31, 32. Onlangs hebben Zhang et al.30 bereidde een dodecyl-getermineerde polyamine stationaire fase en scheidde met succes koolwaterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nucleosiden, oestrogenen en verschillende andere analyten. De polaire intercalator heeft zowel polaire als niet-polaire groepen, dus het kan worden gebruikt om peptiden en eiwitten te scheiden die zowel hydrofobe als hydrofiele delen hebben. In polair ingebedde kolommen (bijv. In amide ingebedde C18-kolommen) zijn in de handel verkrijgbaar onder de handelsnaam Ascentis Express RP-Amide-kolommen, maar deze kolommen worden alleen gebruikt voor de analyse van amine 33.
In de huidige studie werd een polair ingebedde stationaire fase (N-fenylmaleïmide-ingebed polystyreen) bereid en geëvalueerd voor scheiding van peptiden en trypsinedigesten van HSA. De stationaire fase werd bereid met behulp van de volgende strategie. Poreuze silicadeeltjes werden bereid volgens de procedure gegeven in onze vorige publicatie met enkele wijzigingen in het bereidingsprotocol. De verhouding van ureum, polyethyleenglycol (PEG), TMOS, waterazijnzuur werd aangepast om silicadeeltjes met grote poriegrootte te bereiden. , werd een nieuw ligand, fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat, gesynthetiseerd en gebruikt om silicadeeltjes te derivatiseren om een ​​polair ingebedde stationaire fase te bereiden. De resulterende stationaire fase werd gepakt in een roestvrijstalen kolom (100 × 1,8 mm id) met behulp van het geoptimaliseerde pakkingschema. De kolompakking wordt ondersteund door mechanische trillingen om ervoor te zorgen dat er een homogeen bed wordt gevormd in de kolom. Evalueer gepakte kolomscheiding van peptidemengsels bestaande uit vijf peptiden;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) en trypsinedigest van humaan serumalbumine (HAS). Er werd waargenomen dat het peptidemengsel en trypsinedigest van HSA scheiden met een goede resolutie en efficiëntie. De scheidingsprestaties van de PMP-kolom werden vergeleken met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. goed opgelost en efficiënt op de PMP-kolom, die efficiënter was dan de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), ureum, azijnzuur, trimethoxyorthosilicaat (TMOS), trimethylchloorsilaan (TMCS), trypsine, humaan serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, ureum, hexaanmethyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), HPLC-kwaliteit acetonitril (ACN), M ethanol, 2-propanol en aceton Gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS).
Een mengsel van ureum (8 g), polyethyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N azijnzuur werd 10 minuten geroerd en vervolgens werd 24 ml TMOS daaraan toegevoegd onder ijskoude omstandigheden. Het reactiemengsel werd 6 uur verwarmd op 40°C en vervolgens 8 uur op 120°C in een roestvrijstalen autoclaaf. Het water werd afgegoten en het resterende materiaal werd 12 uur gedroogd bij 70°C. gedroogde zachte massa werd gladgemalen in een oven en 12 uur gecalcineerd bij 550°C. Er werden drie batches bereid en gekarakteriseerd om de reproduceerbaarheid in deeltjesgrootte, poriegrootte en oppervlak te onderzoeken.
Door oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes met vooraf gesynthetiseerd ligand fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PCMP) gevolgd door radiale polymerisatie met styreen, werd een polaire groep bevattende verbinding bereid.Stationaire fase voor toeslagmaterialen en polystyreenketens. Hieronder wordt het bereidingsproces beschreven.
N-fenylmaleïmide (200 mg) en methylvinylisocyanaat (100 mg) werden opgelost in droog tolueen en 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) werd aan de reactiekolf toegevoegd om fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatcopolymeer (PMCP) te bereiden. Het mengsel werd 3 uur verwarmd op 60°C, gefiltreerd en gedroogd in een oven bij 40°C gedurende 3 uur.
Gedroogde silicadeeltjes (2 g) werden gedispergeerd in droge tolueen (100 ml), geroerd en gesoniceerd in een rondbodemkolf van 500 ml gedurende 10 min. PMCP (10 mg) werd opgelost in tolueen en druppelsgewijs toegevoegd aan de reactiekolf via een druppeltrechter. Het mengsel werd 8 uur gerefluxt bij 100°C, gefiltreerd en gewassen met aceton en gedroogd bij 60°C gedurende 3 uur. Daarna PMCP-gebonden silica deeltjes (100 g) werden opgelost in tolueen (200 ml) en 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) werd toegevoegd in aanwezigheid van 100 µl dibutyltindilauraat als katalysator. Het mengsel werd 8 uur geroerd bij 50°C, gefiltreerd en 3 uur gedroogd bij 50°C.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide BPO (0,5 ml) en aan TEMPO-PMCP gehechte silicadeeltjes (1,5 g) werden gedispergeerd in tolueen en gespoeld met stikstof. De polymerisatie van styreen werd uitgevoerd bij 100°C gedurende 12 uur. Het resulterende product werd gewassen met methanol en een nacht gedroogd bij 60°C. Het algemene reactieschema wordt weergegeven in figuur 1.
De monsters werden ontgast bij 393 K gedurende 1 uur om een ​​restdruk van minder dan 10-3 Torr te verkrijgen. De hoeveelheid N2 geadsorbeerd bij een relatieve druk van P/P0 = 0,99 werd gebruikt om het totale porievolume te bepalen. De morfologie van kale en ligand-gebonden silicadeeltjes werd onderzocht met scanning-elektronenmicroscopie (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Gedroogde monsters (kale silica en ligand-gebonden silicadeeltjes) werden met behulp van zelfklevende koolstoftape. Er werd goud op de monsters geplateerd met behulp van een Q150T sputtercoater en een 5 nm Au-laag werd op de monsters afgezet. Dit verbetert de procesefficiëntie met behulp van lage spanningen en zorgt voor fijnkorrelig, koud sputteren. Een Thermo Electron (Waltham, MA, VS) Flash EA1112 elementanalysator werd gebruikt voor elementanalyse. Een Malvern (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 deeltjesgrootte-analysator werd gebruikt om de deeltjesgrootteverdeling te verkrijgen. ed silicadeeltjes en ligand-gebonden silicadeeltjes (elk 5 mg) werden gedispergeerd in 5 ml isopropanol, 10 minuten gesoniceerd, 5 minuten gevortext en op de optische bank van de Mastersizer geplaatst. Thermogravimetrische analyse werd uitgevoerd met een snelheid van 5 ° C per minuut over een temperatuurbereik van 30 tot 800 ° C.
Met glas beklede roestvrijstalen kolommen met smalle boring met afmetingen (100 × 1,8 mm id) werden gepakt met behulp van de slurryverpakkingsmethode, waarbij dezelfde procedure werd toegepast die werd gebruikt in Ref.31. Een roestvrijstalen kolom (met glas bekleed, 100 x 1,8 mm id) met een uitlaatfitting die een frit van 1 µm bevatte, werd verbonden met een slurrypacker (Alltech Deerfield, IL, VS). Bereid een stationaire fase slurry door 150 mg stationaire fase in 1,2 ml methanol te suspenderen en naar de opslagkolom te sturen. door een druk uit te oefenen van 100 MP gedurende 10 minuten, 80 MP gedurende 15 minuten en 60 MP gedurende 30 minuten. Tijdens het vullen werden mechanische trillingen toegepast met twee GC-kolomschudders (Alltech, Deerfield, IL, VS) om een ​​gelijkmatige vulling van de kolom te garanderen. Sluit de slurrypacker en laat de druk langzaam ontsnappen om schade in de kolom te voorkomen.
Een LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), injector (Valco (VS) C14 W.05) met 50nL injectielus, membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS capillairvenster werd geconstrueerd. Speciale µLC-apparaatdetector (UV-2075) en met glas beklede microkolommen. Gebruik zeer smalle en korte verbindingsslangen om het effect van extra kolombandverbreding te minimaliseren. mid 365 en capillairen met reducerende verbinding (50 μm) werden geïnstalleerd bij de 1/16 "uitlaat van de reducerende verbinding. Gegevensverzameling en chromatografische verwerking werden gedaan met behulp van Multichro 2000-software. Monitoring bij 254 nm Analyten werden getest op UV-absorptie. Chromatografische gegevens werden geanalyseerd door OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine uit humaan serum, gelyofiliseerd poeder, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemengd met trypsine (1,5 mg), 4,0 M ureum (1 ml) en 0,2 M ammoniumbicarbonaat (1 ml). De oplossing werd 10 minuten geroerd en gedurende 6 uur in een waterbad bij 37°C gehouden, vervolgens geblust met 1 ml 0,1% TFA.Filter de oplossing en bewaar beneden 4°C .
Scheiding van peptidemengsels en HSA-trypsinedigesten werden afzonderlijk geëvalueerd op PMP-kolommen. Controleer de scheiding van het peptidemengsel en trypsinedigest van HSA door de PMP-kolom en vergelijk de resultaten met de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Het theoretische plaatnummer wordt als volgt berekend:
SEM-afbeeldingen van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden getoond in FIG.2. SEM-afbeeldingen van kale silicadeeltjes (A, B) laten zien dat, in tegenstelling tot onze eerdere studies, deze deeltjes bolvormig zijn waarin de deeltjes langwerpig zijn of een onregelmatige symmetrie hebben. Het oppervlak van de ligandgebonden silicadeeltjes (C, D) is gladder dan dat van de kale silicadeeltjes, wat mogelijk te wijten is aan de coating van polystyreenketens op het oppervlak van de silicadeeltjes.
Scanning-elektronenmicroscoopbeelden van kale silicadeeltjes (A, B) en ligandgebonden silicadeeltjes (C, D).
De deeltjesgrootteverdelingen van kale silicadeeltjes en ligand-gebonden silicadeeltjes worden weergegeven in figuur 3(A). Op volume gebaseerde deeltjesgrootteverdelingscurven toonden aan dat de grootte van de silicadeeltjes toenam na chemische modificatie (Fig. 3A). De gegevens over de deeltjesgrootteverdeling van de silicadeeltjes uit de huidige studie en de vorige studie worden vergeleken in tabel 1(A). De volumegebaseerde deeltjesgrootte, d(0,5), van PMP is 3,36 μm, vergeleken met onze vorige studie met een 3,05 μm (polystyreen-gebonden silicadeeltjes) 34. Deze batch had een smallere deeltjesgrootteverdeling in vergelijking met onze vorige studie vanwege de variërende verhoudingen van PEG, ureum, TMOS en azijnzuur in het reactiemengsel. De deeltjesgrootte van de PMP-fase is iets groter dan die van de polystyreen-gebonden silicadeeltjesfase die we eerder bestudeerden. terwijl in de PMP-fase de laagdikte 1,38 µm was.
Deeltjesgrootteverdeling (A) en poriegrootteverdeling (B) van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes.
De poriegrootte, het porievolume en het oppervlak van de silicadeeltjes van het huidige onderzoek worden gegeven in tabel 1(B). De PSD-profielen van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in figuur 3(B). De resultaten zijn vergelijkbaar met onze vorige studie. De poriegroottes van de kale en ligandgebonden silicadeeltjes zijn respectievelijk 310 en 241, wat aangeeft dat de poriegrootte afneemt met 69 na chemische modificatie, zoals weergegeven in tabel 1(B), en de verandering van de curve wordt getoond in Fig. 3(B). Evenzo nam het porievolume van de silicadeeltjes af van 0,67 tot 0,58 cm3/g na chemische modificatie. Het specifieke oppervlak van de momenteel bestudeerde silicadeeltjes is 116 m2/g, wat vergelijkbaar is met onze vorige studie (124 m2/g). 5 m2/g na chemische modificatie.
De resultaten van de elementaire analyse van de stationaire fase worden getoond in tabel 2. De koolstofbelading van de huidige stationaire fase is 6,35%, wat lager is dan de koolstofbelading van onze vorige studie (polystyreengebonden silicadeeltjes, respectievelijk 7,93%35 en 10,21%) 42. De koolstofbelading van de huidige stationaire fase is laag, omdat bij de bereiding van de huidige SP, naast styreen, sommige polaire liganden zoals fenylmaleïmide-methylvinyl isocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO werden gebruikt. Het stikstofgewichtspercentage van de huidige stationaire fase is 2,21%, vergeleken met respectievelijk 0,1735 en 0,85 gewichtsprocent stikstof in eerdere studies. Dit betekent dat het gewichtspercentage stikstof hoger is in de huidige stationaire fase vanwege fenylmaleïmide. Evenzo waren de koolstofbeladingen van producten (4) en (5) respectievelijk 2,7% en 2,9%, terwijl de koolstofbelading van het eindproduct (6) was 6,35%, zoals weergegeven in tabel 2. Het gewichtsverlies werd gecontroleerd met PMP stationaire fase, en de TGA-kromme wordt getoond in figuur 4. De TGA-kromme toont een gewichtsverlies van 8,6%, wat in goede overeenstemming is met de koolstofbelading (6,35%) omdat de liganden niet alleen C maar ook N, O en H bevatten.
De fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatligand werd gekozen voor oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes omdat het polaire fenylmaleïmidegroepen en vinylisocyanaatgroepen heeft. Vinylisocyanaatgroepen kunnen verder reageren met styreen door levende radicaalpolymerisatie. De tweede reden is om een ​​groep in te voegen die een matige interactie heeft met de analyt en geen sterke elektrostatische interactie tussen de analyt en de stationaire fase, aangezien de fenylmaleïmidegroep geen virtuele lading heeft bij normale pH. De polariteit van de stationaire fase kan worden gecontroleerd door de optimale hoeveelheid styreen en de reactietijd van polymerisatie met vrije radicalen. De laatste stap van de reactie (polymerisatie met vrije radicalen) is van cruciaal belang en kan de polariteit van de stationaire fase veranderen. Elementaire analyse werd uitgevoerd om de koolstofbelading van deze stationaire fasen te controleren. Er werd waargenomen dat het verhogen van de hoeveelheid styreen en de reactietijd de koolstofbelading van de stationaire fase verhoogde en vice versa. SP's bereid met verschillende concentraties styreen hebben verschillende koolstofbeladingen. Laad deze stationaire fasen opnieuw in roestvrijstalen kolommen en controleer hun chromatografische prestaties (selectiviteit, resolutie, N-waarde, enz.). Op basis van deze experimenten werd een geoptimaliseerde formulering geselecteerd om de PMP-stationaire fase voor te bereiden om gecontroleerde polariteit en goede retentie van analyt te garanderen.
Vijf peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkefaline) werden ook geëvalueerd met behulp van een PMP-kolom met behulp van een mobiele fase;60/40 (v/v) acetonitril/water (0,1% TFA) bij een stroomsnelheid van 80 μL/min. Onder optimale elutieomstandigheden is het theoretische plaatnummer (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 platen/m²). Tabel 3 geeft de N-waarden voor de drie PMP-kolommen en de chromatogrammen worden getoond in Figuur 5 A. Snelle analyse op een PMP-kolom met hoge stroomsnelheid (700 μL/min), vijf peptiden werden binnen één minuut geëlueerd, N-waarden waren zeer goed, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), komt overeen met 135.000 platen/m (Figuur 5B). Drie identieke kolommen (100 × 1,8 mm id) werden verpakt met drie verschillende partijen PMP stationair fase om de reproduceerbaarheid te controleren. De analytconcentratie voor elke kolom werd geregistreerd met behulp van de optimale elutieomstandigheden en het aantal theoretische platen N en retentietijd om hetzelfde testmengsel op elke kolom te scheiden. De reproduceerbaarheidsgegevens voor de PMP-kolommen worden weergegeven in tabel 4. De reproduceerbaarheid van de PMP-kolom correleert goed met zeer lage %RSD-waarden, zoals weergegeven in tabel 3.
Scheiding van het peptidemengsel op PMP-kolom (B) en Ascentis Express RP-Amide-kolom (A);mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP-kolomafmetingen (100 × 1,8 mm id);analytisch De elutievolgorde van de verbindingen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucinezuur enkefaline)).
Een PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) werd beoordeeld op scheiding van tryptische digesties van humaan serumalbumine in hogedrukvloeistofchromatografie. Het chromatogram in figuur 6 laat zien dat het monster goed gescheiden is en de resolutie zeer goed is. is opgesplitst in 17 pieken die overeenkomen met 17 peptiden. De scheidingsefficiëntie van elke piek in de HSA-digestie werd berekend en de waarden worden gegeven in tabel 5.
Een tryptische digestie van HSA (100 x 1,8 mm id) werd gescheiden op een PMP-kolom;stroomsnelheid (100 µL/min), mobiele fase 60/40 acetonitril/water met 0,1% TFA.
waarbij L de kolomlengte is, η de viscositeit van de mobiele fase is, ΔP de kolomtegendruk is en u de lineaire snelheid van de mobiele fase is. De doorlaatbaarheid van de PMP-kolom was 2,5 x 10-14 m2, het debiet was 25 μL/min en er werd 60/40 v/v ACN/water gebruikt. De doorlaatbaarheid van de PMP-kolom (100 x 1,8 mm id) was vergelijkbaar met die van onze vorige studie Ref.34. De doorlaatbaarheid van de kolom gepakt met oppervlakkig poreuze deeltjes is: 1,7 × 10-15 voor deeltjes van 1,3 μm, 3,1 × 10-15 voor deeltjes van 1,7 μm, 5,2 × 10-15 en 2,5 × 10-14 m2 voor deeltjes van 2,6 μm Voor deeltjes van 5 μm 43. Daarom is de doorlaatbaarheid van de PMP-fase is vergelijkbaar met die van 5 μm core-shell-deeltjes.
waarbij Wx het gewicht is van de kolom gevuld met chloroform, Wy het gewicht is van de kolom gevuld met methanol en ρ de dichtheid van het oplosmiddel. Dichtheden van methanol (ρ = 0,7866) en chloroform (ρ = 1,484). 0,63 en 0,55, respectievelijk. Dit betekent dat de aanwezigheid van ureumliganden de permeabiliteit van de stationaire fase vermindert. Aan de andere kant is de totale porositeit van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) 0,60. De permeabiliteit van PMP-kolommen is lager dan die van kolommen gepakt met C18-gebonden silicadeeltjes omdat in C18-type stationaire fasen de C18-liganden als lineaire ketens aan de silicadeeltjes zijn bevestigd, terwijl in stationaire fasen van het polystyreentype de relatief dikke polymeerlaag eromheen wordt gevormd. In een typisch experiment wordt de kolomporositeit berekend als:
Figuur 7A,B tonen de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) en de Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id) met dezelfde elutieomstandigheden (dwz 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA).) van het perceel van Deemter.Geselecteerde peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) werden bereid in 20 µL/ De minimale stroomsnelheid voor beide kolommen is 800 µL/min. De minimale HETP-waarden bij de optimale stroomsnelheid (80 µL/min) voor de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom waren 2. respectievelijk 6 µm en 3,9 µm. De HETP-waarden geven aan dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) veel beter is dan de in de handel verkrijgbare Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id). 0,8 mm id) in vergelijking met de Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseerd op verbeteringen in deeltjesvorm, -grootte en complexe kolompakkingprocedures die in het huidige werk worden gebruikt34.
(A) van Deemter-plot (HETP versus mobiele fase lineaire snelheid) verkregen met behulp van een PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA. (B) van Deemter-plot (HETP versus mobiele fase lineaire snelheid) verkregen met behulp van een Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA .
Een stationaire fase van polair ingebed polystyreen werd bereid en geëvalueerd voor de scheiding van synthetische peptidemengsels en trypsine-digesten van humaan serumalbumine (HAS) in hogedrukvloeistofchromatografie. De chromatografische prestaties van PMP-kolommen voor peptidemengsels zijn uitstekend wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie. De verbeterde scheidingsprestaties van PMP-kolommen zijn te danken aan verschillende redenen, zoals de deeltjesgrootte en poriegrootte van de silicadeeltjes, gecontroleerde synthese van de stationaire fase en complexe kolompakking. Naast hoge scheidingsefficiëntie, lage kolomrug druk bij hoge stroomsnelheden is een ander voordeel van deze stationaire fase. PMP-kolommen vertonen een goede reproduceerbaarheid en kunnen worden gebruikt voor de analyse van peptidemengsels en trypsine-digestie van verschillende eiwitten. We zijn van plan deze kolom te gebruiken voor de scheiding van natuurlijke producten, bioactieve stoffen van medicinale planten en schimmelextracten in vloeistofchromatografie. In de toekomst zullen PMP-kolommen ook worden geëvalueerd voor de scheiding van eiwitten en monoklonale antilichamen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptidescheidingssystemen door omgekeerde fasechromatografie Deel I: Ontwikkeling van een kolomkarakteriseringsprotocol.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Verbeterde actieve peptiden ontworpen voor de behandeling van infectieziekten.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en de markt. Drugsontdekking.15 (1-2) vandaag, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie.J.Chromatografie.A 1261, 78-90 (2012).
Liu, W. et al. Geavanceerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt de integratie mogelijk van breed gerichte metabolomics en proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89-97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol van UHPLC bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van vloeistofchromatografie onder ultrahoge druk voor snelle scheidingen.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Toepassing van vloeistofchromatografie met ultrahoge prestaties bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolithische macroporeuze hydrogels bereid uit olie-in-water emulsies met hoge interne fase voor efficiënte zuivering van enterovirussen.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Opkomende trends in vloeistofchromatografiescheidingen met omgekeerde fase van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen.J.Farmacie.Biomedische Wetenschap.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van een RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensies.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. De massaoverdrachtskarakteristieken en kinetische prestaties van zeer efficiënte chromatografische kolommen gepakt met C18 sub-2 μm volledig en oppervlakkig poreuze deeltjes werden onderzocht.J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Recente trends en analytische uitdagingen bij de isolatie, identificatie en validatie van bioactieve peptiden van planten.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al.Het proteomische landschap van het koninkrijk van het leven.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Stroomafwaartse verwerking van therapeutische peptiden door preparatieve vloeistofchromatografie.Molecule (Basel, Zwitserland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren.J.Chromatografie.A 1218(49), 8813-8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Liganden voor mixed-mode eiwitchromatografie: principe, karakterisering en ontwerp.J.Biotechnologie.144(1), 3-11 (2009).