Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Poreuze silicadeeltjes werden bereid met behulp van de sol-gelmethode, met enkele aanpassingen om deeltjes met brede poriën te verkrijgen. Deze deeltjes werden gederivatiseerd met N-fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen via omgekeerde ketenoverdracht-fragmentatie (RAFT)-polymerisatie om N-fenylmaleïmide-geïntercaleerde polyamiden te produceren. De stationaire fase van styreen (PMP). Roestvrijstalen kolommen met smalle boring (binnendiameter 100 × 1,8 mm) werden gevuld met een slurrypakking. De chromatografische prestaties van de PMP-kolom werden geëvalueerd om een ​​mengsel van synthetische peptiden te scheiden, bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminozuur encefaline) en tryptisch hydrolysaat van humaan serumalbumine (HAS). Onder optimale elutiecondities bereikte het theoretische aantal platen met een peptidemengsel 280.000 platen/m². Bij vergelijking van de scheidingsprestaties van de ontwikkelde kolom met de commerciële Ascentis Express RP-Amide-kolom werd vastgesteld dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom zowel qua scheidingsefficiëntie als resolutie superieur was aan die van de commerciële kolom.
De biofarmaceutische industrie is een groeiende wereldwijde markt geworden met een aanzienlijk toegenomen marktaandeel in de afgelopen jaren. Door de explosieve groei van de biofarmaceutische industrie1,2,3 is er een grote behoefte aan peptide- en eiwitanalyse. Naast het doelpeptide worden tijdens de peptidesynthese diverse onzuiverheden gevormd, waardoor chromatografische zuivering vereist is om de gewenste zuiverheid van het peptide te verkrijgen. De analyse en karakterisering van eiwitten in lichaamsvloeistoffen, weefsels en cellen is een uiterst uitdagende taak vanwege het grote aantal potentieel detecteerbare soorten in één monster. Hoewel massaspectrometrie een effectief hulpmiddel is voor het sequencen van peptiden en eiwitten, zal de scheiding onbevredigend zijn als dergelijke monsters direct in de massaspectrometer worden gebracht. Dit probleem kan worden opgelost door vloeistofchromatografie (LC) uit te voeren vóór de MS-analyse, waardoor de hoeveelheid analyten die op een bepaald moment de massaspectrometer binnenkomt, wordt verminderd4,5,6. Bovendien kunnen analyten zich tijdens de scheiding van de vloeibare fase in een smal gebied concentreren, waardoor deze analyten geconcentreerd worden en de gevoeligheid van MS-detectie toeneemt. Vloeistofchromatografie (LC) heeft de afgelopen tien jaar een aanzienlijke ontwikkeling doorgemaakt en is een veelgebruikte methode geworden voor proteomische analyse7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) wordt veel gebruikt om peptidemengsels te zuiveren en te scheiden met behulp van octadecyl-gemodificeerd silica (ODS) als stationaire fase11,12,13. Vanwege hun complexe structuur en amfotere aard14,15 kunnen stationaire RP-fasen echter geen bevredigende scheiding van peptiden en eiwitten bieden. Daarom vereist de analyse van peptiden en eiwitten met polaire en apolaire fragmenten speciaal ontworpen stationaire fasen om deze analyten te laten interageren en te behouden16. Gemengde chromatografie, die multimodale interacties biedt, kan een alternatief zijn voor RP-LC voor het scheiden van peptiden, eiwitten en andere complexe mengsels. Verschillende stationaire fasen van het gemengde type werden bereid en kolommen gevuld met deze stationaire fasen werden gebruikt om peptiden en eiwitten te scheiden17,18,19,20,21. Vanwege de aanwezigheid van polaire en niet-polaire groepen zijn mixed mode stationaire fasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaire intercalatie/RPLC) geschikt voor de scheiding van peptiden en eiwitten22,23,24,25,26,27,28. , polaire geïntercaleerde stationaire fasen met covalent gebonden polaire groepen vertonen goede scheidingsmogelijkheden en unieke selectiviteit voor polaire en niet-polaire analyten omdat de scheiding afhankelijk is van de interactie tussen de analyt en de stationaire fase Multimodale interacties29,30,31,32. Onlangs verkregen Zhang et al.30 behenyl-getermineerde stationaire fasen van polyaminen en scheidden met succes koolwaterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nucleosiden, oestrogenen en enkele andere analyten. Het polaire ingebedde stationaire materiaal heeft zowel polaire als niet-polaire groepen, dus het kan worden gebruikt om peptiden en eiwitten te scheiden in hydrofobe en hydrofiele delen. Polaire inline-kolommen (bijvoorbeeld C18-kolommen met amide-inline) zijn verkrijgbaar onder de handelsnaam Ascentis Express RP-Amide-kolommen, maar deze kolommen zijn alleen gebruikt voor de analyse van amine 33.
In de huidige studie werd een polaire ingebedde stationaire fase (N-fenylmaleïmide, ingebed polystyreen) bereid en geëvalueerd op peptidescheiding en tryptische HSA-splitsing. De volgende strategie werd gebruikt om de stationaire fase te bereiden. Poreuze silicadeeltjes werden bereid volgens de procedures beschreven in onze eerdere publicaties, met enkele wijzigingen in de bereidingsschema's 31, 34, 35, 36, 37, 38 en 39. De verhoudingen van ureum, polyethyleenglycol (PEG), TMOS en waterig azijnzuur werden aangepast om silicadeeltjes met grote poriën te verkrijgen. Ten tweede werd een nieuwe fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatligand gesynthetiseerd en werden de gederivatiseerde silicadeeltjes gebruikt om polaire ingebedde stationaire fasen te bereiden. De verkregen stationaire fase werd gepakt in een roestvrijstalen kolom (binnendiameter 100 × 1,8 mm) volgens een geoptimaliseerd pakkingsschema. De pakking van de kolom wordt ondersteund door mechanische trillingen om een ​​uniforme laag binnen de kolom te garanderen. De gepakte kolom werd geëvalueerd op de scheiding van een peptidemengsel bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefalinepeptide) en tryptische hydrolysaten van humaan serumalbumine (HSA). Er werd waargenomen dat het peptidemengsel en het HSA-tryptische digest met een goede resolutie en efficiëntie scheidden. De scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom werd vergeleken met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Er werd waargenomen dat peptiden en eiwitten een goede resolutie en hoge scheidingsefficiëntie hebben op de PMP-kolom, en dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom hoger is dan die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), ureum, azijnzuur, trimethoxyorthosilicaat (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsine, humaan serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, ureum, hexamethylmethacryloyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), acetonitril (ACN) voor HPLC, methanol, 2-propanol en aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, VS).
Een mengsel van ureum (8 g), polyethyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N azijnzuur werd 10 minuten geroerd, waarna 24 ml TMOS onder ijskoeling werd toegevoegd. Het reactiemengsel werd 6 uur verwarmd tot 40 °C en vervolgens 8 uur tot 120 °C in een roestvrijstalen autoclaaf. Het water werd afgeschonken en het residu werd 12 uur gedroogd bij 70 °C. De gedroogde zachte blokken werden fijngemalen en 12 uur gecalcineerd in een oven bij 550 °C. Drie batches werden bereid en gekarakteriseerd om de reproduceerbaarheid van deeltjesgroottes, poriegrootte en oppervlakte te testen.
Polaire groep en stationaire fase voor polystyreenketens. De bereidingsprocedure wordt hieronder beschreven.
N-fenylmaleïmide (200 mg) en methylvinylisocyanaat (100 mg) werden opgelost in watervrije tolueen, waarna 0,1 ml 2,2′-azoisobutyronitril (AIBN) aan de reactiekolf werd toegevoegd om een ​​copolymeer van fenylmaleïmide en methylvinylisocyanaat (PMCP) te verkrijgen.) Het mengsel werd gedurende 3 uur verhit tot 60°C, gefiltreerd en gedurende 3 uur in een oven bij 40°C gedroogd.
Gedroogde silicadeeltjes (2 g) werden gedispergeerd in droge tolueen (100 ml), geroerd en gedurende 10 minuten gesoniceerd in een rondbodemkolf van 500 ml. PMCP (10 mg) werd opgelost in tolueen en via een vultrechter druppelsgewijs aan de reactiekolf toegevoegd. Het mengsel werd 8 uur verwarmd onder terugvloeikoeling bij 100 °C, gefiltreerd, gewassen met aceton en 3 uur gedroogd bij 60 °C. Vervolgens werden de aan PMCP gebonden silicadeeltjes (100 g) opgelost in tolueen (200 ml) en werd 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) hieraan toegevoegd in aanwezigheid van 100 μl dibutyltindilauraat als katalysator. Het mengsel werd 8 uur geroerd bij 50 °C, gefiltreerd en 3 uur gedroogd bij 50 °C.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide (BPO) (0,5 ml) en silicadeeltjes gebonden aan TEMPO-PMCP (1,5 g) werden gedispergeerd in tolueen en gespoeld met stikstof. De polymerisatie van styreen werd gedurende 12 uur uitgevoerd bij 100 °C. Het resulterende product werd gewassen met methanol en een nacht gedroogd bij 60 °C. Het algemene schema van de reactie is weergegeven in figuur 1.
De monsters werden gedurende 1 uur ontgast bij 393 K totdat een restdruk van minder dan 10–3 Torr werd bereikt. De hoeveelheid N2 die werd geadsorbeerd bij een relatieve druk P/P0 = 0,99 werd gebruikt om het totale poriënvolume te bepalen. De morfologie van zuivere en ligandgebonden silicadeeltjes werd onderzocht met een scanning elektronenmicroscoop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Droge monsters (zuivere silica en ligandgebonden silicadeeltjes) werden met koolstoftape op aluminiumstaven geplaatst. Goud werd op het monster afgezet met een Q150T-sputterapparaat en een 5 nm dikke Au-laag werd op het monster afgezet. Dit verbetert de efficiëntie van het laagspanningsproces en zorgt voor een fijne koude verneveling. Elementanalyse werd uitgevoerd met een Thermo Electron (Waltham, MA, VS) Flash EA1112 elementaire compositie-analysator. Een Malvern-deeltjesgrootte-analysator (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 werd gebruikt om de deeltjesgrootteverdeling te verkrijgen. Ongecoate silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes (elk 5 mg) werden gedispergeerd in 5 ml isopropanol, 10 minuten gesoniceerd, 5 minuten geschud en op een Mastersizer optische tafel geplaatst. Thermogravimetrische analyse wordt uitgevoerd met een snelheid van 5 °C per minuut in het temperatuurbereik van 30 tot 800 °C.
Glasvezel beklede smalle roestvrijstalen kolommen met afmetingen (ID 100 × 1,8 mm) werden gevuld door middel van slurry-vulmethode volgens dezelfde procedure als in referentie 31. Roestvrijstalen kolom (glasgevoerd, ID 100 × 1,8 mm) en een uitlaat met een 1 µm frit werden aangesloten op een slurry-verpakkingsmachine (Alltech Deerfield, IL, VS). Bereid een suspensie van de stationaire fase door 150 mg van de stationaire fase te suspenderen in 1,2 ml methanol en dit in een reservoirkolom te voeren. Methanol werd gebruikt als slurry-oplosmiddel en controle-oplosmiddel. Vul de kolom door een druksequentie van 100 MP gedurende 10 min, 80 MP gedurende 15 min en 60 MP gedurende 30 min toe te passen. Het pakkingsproces gebruikte twee gaschromatografiekolomvibrators (Alltech, Deerfield, IL, VS) voor mechanische trillingen om uniforme kolompakking te garanderen. Sluit de slurrypacker en laat de druk langzaam ontsnappen om schade aan de slurrybuis te voorkomen. De kolom werd losgekoppeld van de slurrysproeier en een andere fitting werd op de inlaat bevestigd en aangesloten op het LC-systeem om de werking te testen.
Een aangepaste MLC werd geconstrueerd met behulp van een LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), een sampler met een injectielus van 50 nL (Valco (VS) C14 W.05), een membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A) en een UV-VIS capillair venster. Detector (UV-2075) en geëmailleerde microkolom. Gebruik zeer smalle en korte verbindingsbuizen om het effect van extra kolomexpansie te minimaliseren. Nadat de kolom is gevuld, installeert u een capillair (50 µm id 365) bij de uitlaat van de 1/16″ reducerende junctie en installeert u een capillair (50 µm) van de reducerende junctie. Gegevensverzameling en chromatogramverwerking worden uitgevoerd met behulp van de Multichro 2000-software. Bij 254 nm werd de UV-absorptie van de proefpersonen gemeten op 0. Chromatografische gegevens werden geanalyseerd met OriginPro8 (Northampton, MA).
Humaan serumalbumine, gelyofiliseerd poeder, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemengd met trypsine (1,5 mg), 4,0 M ureum (1 ml) en 0,2 M ammoniumbicarbonaat (1 ml). De oplossing werd 10 minuten geroerd en 6 uur in een waterbad van 37 °C bewaard, waarna werd geblust met 1 ml 0,1% TFA. Filtreer de oplossing en bewaar beneden 4 °C.
De scheiding van een mengsel van peptiden en tryptisch verteerd HSA op een PMP-kolom werd afzonderlijk geëvalueerd. Controleer de tryptische hydrolyse van een mengsel van peptiden en HSA gescheiden door een PMP-kolom en vergelijk de resultaten met een Ascentis Express RP-Amide-kolom. Het aantal theoretische platen wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
SEM-beelden van zuivere silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Figuur 2. SEM-beelden van zuivere silicadeeltjes (A, B) tonen een bolvorm waarbij de deeltjes langwerpig zijn of een onregelmatige symmetrie hebben vergeleken met onze eerdere studies. Het oppervlak van de door de ligand gebonden silicadeeltjes (C, D) is gladder dan dat van zuivere silicadeeltjes, wat mogelijk te wijten is aan de polystyreenketens die het oppervlak van de silicadeeltjes bedekken.
Scannende elektronenmicroscoopfoto's van zuivere silicadeeltjes (A, B) en ligandgebonden silicadeeltjes (C, D).
De deeltjesgrootteverdeling van zuivere silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes wordt weergegeven in figuur 2.3(A). De curven van de volumetrische deeltjesgrootteverdeling lieten zien dat de silicadeeltjesgrootte toenam na chemische modificatie (figuur 3A). De gegevens over de silicadeeltjesgrootteverdeling uit de huidige studie en de vorige studie worden vergeleken in tabel 1(A). De volumetrische deeltjesgrootte d(0,5) van PMP was 3,36 µm, vergeleken met de ad(0,5)-waarde van 3,05 µm in onze vorige studie (polystyreengebonden silicadeeltjes)34. Door de verandering in de verhouding van PEG, ureum, TMOS en azijnzuur in het reactiemengsel was de deeltjesgrootteverdeling van deze batch smaller in vergelijking met onze vorige studie. De deeltjesgrootte van de PMP-fase is iets groter dan die van de polystyreengebonden silicadeeltjesfase die we eerder bestudeerden. Dit betekent dat bij de oppervlaktefunctionalisering van silicadeeltjes met styreen alleen een polystyreenlaag (0,97 µm) op het silicaoppervlak werd afgezet, terwijl in de PMP-fase de laagdikte 1,38 µm bedroeg.
Deeltjesgrootteverdeling (A) en poriegrootteverdeling (B) van zuivere silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes.
De poriegrootte, het porievolume en het oppervlak van de silicadeeltjes die in deze studie zijn gebruikt, worden weergegeven in Tabel 1 (B). De PSD-profielen van pure silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Fig. 3 (B). De resultaten waren vergelijkbaar met onze vorige studie34. De poriegroottes van pure en ligandgebonden silicadeeltjes waren respectievelijk 310 Å en 241 Å, wat aangeeft dat de poriegrootte na chemische modificatie met 69 Å afnam, zoals weergegeven in Tabel 1 (B), en de verschuivingscurve wordt weergegeven in Fig. Het specifieke oppervlak van silicadeeltjes in de huidige studie is 116 m²/g, wat vergelijkbaar is met onze vorige studie (124 m²/g). Zoals weergegeven in Tabel 1 (B), nam het oppervlak (m²/g) van silicadeeltjes na chemische modificatie ook af van 116 m²/g naar 105 m²/g.
De resultaten van de elementanalyse van de stationaire fase worden weergegeven in tabel 2. Het koolstofgehalte van de huidige stationaire fase is 6,35%, wat lager is dan in onze vorige studie (silicadeeltjes geassocieerd met polystyreen, respectievelijk 7,93%35 en 10,21%)42. Het koolstofgehalte van de huidige stationaire fase is hieronder te zien, aangezien er naast styreen ook enkele polaire liganden zoals fenylmaleïmidemethylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO zijn gebruikt bij de bereiding van SP. Het gewichtspercentage stikstof in de huidige stationaire fase is 2,21%, vergeleken met 0,1735 en 0,85% in eerdere studies42. Dit betekent dat de huidige stationaire fase een hoog gewichtspercentage stikstof heeft vanwege het fenylmaleïmide. Op dezelfde manier hebben producten (4) en (5) een koolstofgehalte van respectievelijk 2,7% en 2,9%, terwijl het eindproduct (6) een koolstofgehalte heeft van 6,35%, zoals weergegeven in Tabel 2. Thermogravimetrische analyse (TGA) werd gebruikt op de stationaire fase van PMP om te testen op gewichtsverlies, en de TGA-curve wordt weergegeven in Figuur 4. De TGA-curve toont een gewichtsverlies van 8,6%, wat in goede overeenstemming is met het koolstofgehalte (6,35%), aangezien de liganden niet alleen C bevatten, maar ook N, O en H.
De ligand fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat werd gekozen om het oppervlak van de silicadeeltjes te modificeren vanwege zijn polaire fenylmaleïmide- en vinylisocyanaatgroepen. Vinylisocyanaatgroepen kunnen verder reageren met styreen door middel van levende radicaalpolymerisatie. De tweede reden is om een ​​groep in te voegen die matige interacties heeft met de analyt en geen sterke elektrostatische interacties tussen de analyt en de stationaire fase, aangezien de fenylmaleïmidegroep geen virtuele lading heeft bij een normale pH. De polariteit van de stationaire fase kan worden gecontroleerd door de optimale hoeveelheid styreen en de reactietijd van de vrije radicaalpolymerisatie. De laatste stap van de reactie (vrije radicaalpolymerisatie) is cruciaal omdat deze de polariteit van de stationaire fase verandert. Elementanalyse werd uitgevoerd om het koolstofgehalte in deze stationaire fasen te controleren. Er is waargenomen dat het verhogen van de hoeveelheid styreen en de reactietijd het koolstofgehalte van de stationaire fase verhoogt en vice versa. SP's bereid met verschillende styreenconcentraties hebben verschillende koolstofladingen. Op vergelijkbare wijze werden deze stationaire fasen op roestvrijstalen kolommen geplaatst en werden hun chromatografische kenmerken (selectiviteit, resolutie, N-waarde, enz.) gecontroleerd. Op basis van deze experimenten werd een geoptimaliseerde samenstelling voor de bereiding van de PMP-stationaire fase gekozen om een ​​gecontroleerde polariteit en een goede retentie van de analyt te garanderen.
De PMP-kolom werd ook geëvalueerd voor de analyse van vijf peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) met behulp van de capaciteit van de mobiele fase. 60/40 (v/v) ACN/water (0,1% TFA) bij een stroomsnelheid van 80 µl/min. Onder optimale elutiecondities (200.000 platen/m) bedraagt ​​het aantal theoretische platen (N) per kolom (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. De N-waarden voor de drie PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 3 en de chromatogrammen worden weergegeven in Figuur 5A. Snelle analyse met een hoge stroomsnelheid (700 µl/min) op een PMP-kolom, vijf peptiden elueerden binnen één minuut, uitstekende N-waarde van 13.500 ± 330 per kolom (diameter 100 x 1,8 mm), equivalent aan 135.000 platen/m (Fig. 5B). Drie kolommen van dezelfde grootte (binnendiameter 100 x 1,8 mm) werden gevuld met drie verschillende batches PMP-stationaire fase om de reproduceerbaarheid te testen. De analyten werden voor elke kolom geregistreerd door hetzelfde testmengsel op elke kolom te scheiden met behulp van optimale elutiecondities, aantal theoretische platen N en retentietijd. De reproduceerbaarheidsgegevens voor de PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 4. De reproduceerbaarheid van de PMP-kolom correleerde goed met zeer lage %RSD-waarden, zoals weergegeven in Tabel 3.
Scheiding van peptidemengsels op een PMP-kolom (B) en een Ascentis Express RP-Amide-kolom (A), mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), afmetingen van de PMP-kolom (100 x 1,8 mm id), analyse Elutievolgorde van verbindingen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 ( leucinezuur enkefaline).
Een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) werd geëvalueerd voor de scheiding van het tryptisch hydrolysaat van humaan serumalbumine door middel van HPLC. Het chromatogram in figuur 6 laat zien dat de monsters goed gescheiden zijn met een zeer goede resolutie. HSA-oplossingen werden geanalyseerd met een stroomsnelheid van 100 μl/min, een mobiele fase van 70/30 acetonitril/water en 0,1% TFA. De splitsing van HSA werd verdeeld in 17 pieken, zoals weergegeven in het chromatogram (figuur 6), overeenkomend met 17 peptiden. De scheidingsefficiëntie van individuele pieken van het HSA-hydrolysaat werd berekend en de waarden worden weergegeven in tabel 5.
HSA tryptische hydrolysaten werden gescheiden op een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm), stroomsnelheid (100 μl/min), mobiele fase 60/40 acetonitril/water en 0,1% TFA.
waarbij L de kolomlengte is, η de viscositeit van de mobiele fase, ΔP de tegendruk van de kolom en u de lineaire snelheid van de mobiele fase. De permeabiliteit van de PMP-kolom was 2,5 × 10–14 m2, de stroomsnelheid was 25 µl/min, 60/40 v/v werd gebruikt. ACN/water. De permeabiliteit van de PMP-kolom (ID 100 × 1,8 mm) was vergelijkbaar met die van onze eerdere Ref.34-studie. De permeabiliteit van een kolom gevuld met oppervlakkig poreuze deeltjes is 1,7 × 10 ,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 voor deeltjes van 5 µm43. Daarom is de permeabiliteit van de PMP-fase vergelijkbaar met de permeabiliteit van kern-schildeeltjes met een grootte van 5 μm.
Waarbij Wx de massa is van de kolom gevuld met chloroform, Wy de massa van de kolom gevuld met methanol en ρ de dichtheid van het oplosmiddel. Dichtheid van methanol (ρ = 0,7866) en chloroform (ρ = 1,484). De totale porositeit van de silica-C18-deeltjeskolom (100 × 1,8 mm ID)34 en onze eerder bestudeerde C18-ureum31-kolom was respectievelijk 0,63 en 0,55. Dit betekent dat de aanwezigheid van ureumliganden de permeabiliteit van de stationaire fase vermindert. De totale porositeit van de PMP-kolom (binnendiameter 100 × 1,8 mm) is daarentegen 0,60. PMP-kolommen zijn minder permeabel dan kolommen gevuld met C18-gebonden silicadeeltjes, omdat in stationaire fasen van het C18-type de C18-liganden in lineaire ketens aan de silicadeeltjes zijn gebonden, terwijl in stationaire fasen van het polystyreentype een relatief dik polymeer rond de deeltjes wordt gevormd. Laag A. In een typisch experiment wordt de porositeit van de kolom als volgt berekend:
In figuur 7A en B worden Van Deemter-grafieken weergegeven voor een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) en een Ascentis Express RP-Amide-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) onder dezelfde elutieomstandigheden: 60/40 ACN/H₂O en 0,1% TFA, 20 µl/min tot 800 µl/min op beide kolommen. De minimale HETP-waarden bij de optimale stroomsnelheid (80 µl/min) waren respectievelijk 2,6 µm en 3,9 µm voor de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom. De HETP-waarden tonen aan dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) aanzienlijk hoger is dan die van de commercieel verkrijgbare Ascentis Express RP-Amide-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm). De Van Deemter-grafiek in Fig. 7(A) laat zien dat de daling van de N-waarde niet significant hoger is bij toenemende stroming vergeleken met onze vorige studie. De hogere scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (id 100 × 1,8 mm) in vergelijking met de Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseerd op de verbeterde deeltjesvorm en -grootte en de geavanceerde kolompakkingsprocedure die in het huidige onderzoek wordt gebruikt34.
(A) Van Deemter-diagram (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen op een PMP-kolom (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA. (B) Van Deemter-diagram (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen op een Ascentis Express RP-Amide-kolom (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA.
Een polaire stationaire fase van geïntercaleerd polystyreen werd bereid en geëvalueerd voor de scheiding van een mengsel van synthetische peptiden en tryptisch hydrolysaat van humaan serumalbumine (HSA) in hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De chromatografische prestaties van PMP-kolommen voor peptidemengsels zijn uitstekend wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie. De verbeterde scheidingsefficiëntie van PMP-kolommen is te danken aan verschillende factoren, zoals de deeltjesgrootte en poriegrootte van silica, gecontroleerde synthese van stationaire fasen en complexe kolompakkingsmaterialen. Naast de hoge scheidingsefficiëntie is een ander voordeel van deze stationaire fase de lage kolomtegendruk bij hoge stroomsnelheden. PMP-kolommen zijn zeer reproduceerbaar en kunnen worden gebruikt voor de analyse van peptidemengsels en tryptische vertering van diverse eiwitten. We zijn van plan deze kolom te gebruiken voor de scheiding van bioactieve stoffen uit natuurlijke producten, extracten van medicinale planten en paddenstoelen in vloeistofchromatografie. In de toekomst zullen PMP-kolommen ook worden geëvalueerd voor de scheiding van eiwitten en monoklonale antilichamen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen met omgekeerde fasechromatografie deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen met omgekeerde fasechromatografie deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen door middel van omgekeerde-fasechromatografie, deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen met omgekeerde fasechromatografie deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakteristieken. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen met omgekeerde fasechromatografie deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakteristieken.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen door middel van omgekeerde-fasechromatografie, deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Methoden voor het creëren van verbeterde actieve peptiden voor de behandeling van infectieziekten. Biotechnologie. Prestaties 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Chreschatyski M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Khreschatsky M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt. Geneesmiddelenontdekking. Today 15 (1-2), 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie.Zie F., Smith RD en Shen Yu. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde eiwitsamenstelling.Zie F., Smith RD en Shen Yu. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie.J. Chromatografie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Geavanceerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie kan brede metabolomics en proteomics combineren. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling. Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ. De rol van UHPLC in geneesmiddelenontwikkeling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheidingen. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheidingen.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van hogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheiding. Wu, N. & Clausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Basis- en praktische aspecten van ultrahogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheiding.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van hogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheiding.J. Sept. Wetenschap. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-prestatie vloeistofchromatografie bij farmaceutische ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-prestatie vloeistofchromatografie bij farmaceutische ontwikkeling.Ren, SA en Chelischeff, P. Het gebruik van ultrahogeprestatievloeistofchromatografie bij farmaceutische ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Wren, SA en Tchelitcheff, P.Ren, SA en Chelischeff, P. Toepassing van ultraprestatie vloeistofchromatografie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.J. Chromatografie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Een monolithische macroporeuze hydrogel afgeleid van een olie-in-water-emulsie met een hoge interne fase voor efficiënte zuivering van enterovirus 71. Chemical. project. Tijdschrift 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics.J. Chromatografie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nieuwe trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografische scheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. Nieuwe trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografische scheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. хроматографии с обращенной фазой: теория en prostituee. & Guillarme, D. Nieuwe trends in de scheiding van therapeutische peptiden en eiwitten door omgekeerde fase vloeistofchromatografie: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. & Guillarme, D.en Guillarmé, D. Nieuwe trends in de scheiding van therapeutische peptiden en eiwitten door omgekeerde fase vloeistofchromatografie: theorie en toepassingen.J. Pharm. Biomedische Wetenschappen. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Onderzoek naar de massaoverdracht en kinetische eigenschappen van hogedrukchromatografiekolommen gevuld met volledig poreuze en oppervlakkig poreuze C18-deeltjes kleiner dan 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Recente trends en analytische uitdagingen in de isolatie, identificatie en validatie van bioactieve peptiden in planten. anus. Creature anaal. Chemisch. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomisch landschap van het koninkrijk des levens. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Nabehandeling van therapeutische peptiden met behulp van preparatieve vloeistofchromatografie. Molecules (Bazel, Zwitserland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en toepassingen op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en toepassingen op biopolymeren.Yang, Yu. en Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassing ervan in biopolymeren.Yang, Yu. en Gene, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren.J. Chromatografie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).