Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een vlinderbloemige plant die wordt gebruikt voor voedselproductie en bodemverbetering. De wereldwijde uitbreiding van NLL als gewas heeft veel pathogene schimmels aangetrokken, waaronder lupine-antracnose, de veroorzaker van de verwoestende antracnoseziekte. Twee allelen, Lanr1 en AnMan, die verhoogde resistentie verlenen, zijn gebruikt in de NLL-veredeling, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. In deze studie werden de Lanr1- en AnMan-markers gebruikt om Europese NLL-monsters te screenen. Testen van het vaccin in een gecontroleerde omgeving bevestigde de werkzaamheid van beide resistente donoren. Differentiële genexpressieprofilering werd uitgevoerd op representatieve resistente en vatbare lijnen. Antracnoseresistentie werd geassocieerd met overexpressie van de genontologietermen "GO:0006952 Afweerreactie", "GO:0055114 Redoxproces" en "GO:0015979 Fotosynthese". Bovendien vertoonde de Lanr1(83A:476)-lijn een significante transcriptoomherprogrammering snel na inoculatie, terwijl de andere lijnen een vertraging in deze respons van ongeveer 42 uur lieten zien. Afweerreacties worden geassocieerd met de genen TIR-NBS, CC-NBS-LRR en NBS-LRR, 10 eiwitten betrokken bij pathogenese, lipide-transferproteïnen, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycinerijke celwandeiwitten en genen van het reactieve zuurstofpad. Vroege reacties op 83A:476, waaronder zorgvuldige onderdrukking van genen geassocieerd met fotosynthese, vielen samen met succesvolle bescherming tijdens de vegetatieve groeifase van schimmelbiologie, wat suggereert dat een effector immuniteit triggert. De Mandeloop-reactie wordt vertraagd, evenals de algehele horizontale weerstand.
De smalbladige lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een eiwitrijk graangewas dat oorspronkelijk uit het westelijke Middellandse Zeegebied komt1,2. Het wordt momenteel verbouwd als voedselgewas voor dieren en mensen. Het wordt ook beschouwd als groenbemester in vruchtwisselingsystemen vanwege de stikstofbinding door symbiotische stikstofbindende bacteriën en de algehele verbetering van de bodemstructuur. NLL heeft in de afgelopen eeuw een snelle domesticatie ondergaan en staat nog steeds onder hoge veredelingsdruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Met de wijdverbreide teelt van NLL ontwikkelde de opeenvolging van pathogene schimmels nieuwe agrarische niches en veroorzaakte nieuwe gewasvernietigende ziekten. Het meest opmerkelijke voor lupinekwekers en -veredelaars was het optreden van antracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opmerkelijke voor lupinekwekers en -veredelaars was het optreden van antracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Als u een probleem met de werking van het apparaat wilt bereiken, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Voor lupinekwekers en -veredelaars was de opkomst van antracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 films.Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Harig。1 Als u een probleem met de werking van het apparaat wilt bereiken, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Voor lupinekwekers en -veredelaars is het ontstaan ​​van antracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13, het meest opvallend.De eerste meldingen van de ziekte kwamen uit Brazilië en de Verenigde Staten, met typische symptomen die respectievelijk in 1912 en 1929 optraden. Na ongeveer 30 jaar werd de ziekteverwekker echter aangeduid als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Gerichte morfologie. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .en H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。en H. Schlenk, .Voorlopige fenotypering van ziekten, uitgevoerd halverwege de 20e eeuw, toonde enige resistentie in NLL en gele lupine (L. luteus L.) accessies, maar alle geteste witte lupine (L. albus L.) accessies waren zeer vatbaar15,16. Studies hebben aangetoond dat de ontwikkeling van anthracnose geassocieerd wordt met verhoogde neerslag (luchtvochtigheid) en temperatuur (in het bereik van 12-28°C), wat leidt tot een schending van de resistentie bij hogere temperaturen17,18. Sterker nog, de tijd die nodig was voor conidia om te ontkiemen en de ziekte om te beginnen, was vier keer korter bij 24°C (4 uur) dan bij 12°C (16 uur) onder hoge luchtvochtigheid19. De aanhoudende opwarming van de aarde heeft dus geleid tot de verspreiding van anthracnose. De ziekte werd echter in Frankrijk (1982) en Oekraïne (1983) waargenomen als een voorbode van een naderende dreiging, maar werd destijds blijkbaar genegeerd door de lupine-industrie20,21. Een paar jaar later verspreidde deze verwoestende ziekte zich over de hele wereld en trof ook belangrijke lupineproducerende landen zoals Australië, Polen en Duitsland22,23,24. Na een antracnose-uitbraak halverwege de jaren negentig resulteerde uitgebreide screening in de identificatie van verschillende resistente donoren in NLL19-monsters. NLL-resistentie tegen antracnose wordt gecontroleerd door twee afzonderlijke dominante allelen die in verschillende kiemplasmabronnen worden gevonden: Lanr1 in cultivar Tanjil en Wonga en AnMan in cultivar. Mandalay 25, 26. Deze allelen vormen een aanvulling op de moleculaire merkers die de selectie van resistent kiemplasma in fokprogramma's ondersteunen25,26,27,28,29,30. De resistente foklijn 83A:476, die het Lanr1-allel draagt, werd gekruist met de vatbare wilde lijn P27255 om een ​​RIL-populatie te verkrijgen die segregeert voor antracnoseresistentie, wat het mogelijk maakte om de Lanr1-locus toe te wijzen aan chromosoom NLL-1131, 32, 33. Uitlijning van koppelingskaartmarkers van flankerende resistentieloci voor antracnose met een genomisch raamwerk, NLL onthulde de locatie van alle drie allelen op hetzelfde chromosoom (NLL-11), maar op verschillende posities29,34,35. Vanwege het kleine aantal RIL's en de grote genetische afstand tussen markers en corresponderende allelen, kunnen er echter geen betrouwbare conclusies worden getrokken over hun onderliggende genen. Aan de andere kant is het gebruik van omgekeerde genetica bij lupinen moeilijk vanwege hun zeer lage regeneratiepotentieel, wat genetische manipulatie omslachtig maakt37.
De ontwikkeling van gedomesticeerd kiemplasma dat het gewenste allel in homozygote toestand draagt, zoals 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), heeft de deur geopend naar het bestuderen van anthracnoseresistentie in het licht van de aanwezigheid van tegengestelde combinaties van allelen in wilde populaties. Mogelijkheden van moleculaire mechanismen. Vergelijk afweerreacties gegenereerd door specifieke genotypes. Deze studie evalueerde de vroege transcriptoomrespons van NLL op C. lupini-vaccinatie. Eerst werd een Europees NLL-kiemplasmapanel met 215 lijnen gescreend met behulp van moleculaire merkers die de Lanr1- en AnMan-allelen markeren. Anthracnosefenotypering werd vervolgens uitgevoerd op 50 NLL-lijnen, die eerder waren geselecteerd op moleculaire merkers, onder gecontroleerde omstandigheden. Op basis van deze experimenten werden vier lijnen die verschilden in anthracnoseresistentie en Lanr1/AnMan-allelische samenstelling geselecteerd voor differentiële profilering van de afweergenexpressie met behulp van twee complementaire benaderingen: high-throughput RNA-sequencing en real-time PCR-kwantificering.
Screening van een set NLL-kiemplasma (N = 215) met de markers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) toonde aan dat slechts één lijn (95726, nabij Salamanca-b) het allel "resistentie" voor alle markers versterkt, terwijl "Aanwezigheid van 'gevoelige' allelen" het aandeel van alle markers in 158 (~73,5%) lijnen vond. Dertien lijnen produceerden twee "resistente" allelen van de Lanr1-marker, en 8 lijnen produceerden "resistente" allelen van de Lanr1-marker. Het "resistentie"-allel van de AnMan-marker (Aanvullende tabel S1). Twee lijnen waren heterozygoot voor de Anseq3-marker en één heterozygoot voor de AnManM1-marker. 42 lijnen (19,5%) vertoonden tegengestelde fases van de Anseq3- en Anseq4-allelen, wat wijst op een hoge recombinatiefrequentie tussen deze twee loci. Antracnosefenotypes onder gecontroleerde omstandigheden (aanvullende tabel S2) lieten een variatie zien in de resistentie van de geteste genotypen, wat tot uiting kwam in de ernst van de antracnose. Verschillen in gemiddelde scores varieerden van 1,8 (matig resistent) tot 6,9 (gevoelig) en de verschillen in plantgewicht varieerden van 0,62 (gevoelig) tot 4,45 g (resistent). Er was een significante correlatie tussen de waarden die werden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het gewicht van de plant, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,77, P < 0,0001). Er was een significante correlatie tussen de waarden die werden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het gewicht van de plant, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,77, P < 0,0001). Als u een kredietkaart wilt kopen, kunt u deze in uw levensonderhoud voorzien эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 en 0,61 для массы растения, P < 0,0001), en также между двумя параметрами (-0,59 en -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Er werd een significante correlatie gevonden tussen de waarden die werden waargenomen bij twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het gewicht van de plant, P < 0,0001), alsook tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Als u een kredietverzekering wilt afsluiten, kunt u dit in de toekomst doen повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 en масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. Er was een significante correlatie tussen de in duplo waargenomen waarden (ziekte-ernstscore 0,51, P = 0,00017 en plantgewicht 0,61, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typische symptomen die bij vatbare planten worden gezien, zijn onder meer knikken en verdraaien van de stengel, wat lijkt op een "herdersboog", gevolgd door ovale laesies met oranje/roze sporozoïeten (aanvullende figuur 1). Australische aanwinsten met de genen Lanr1 (83A:476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) zijn matig resistent, 0,0331 en 0,0036. Sommige lijnen die ook "resistente" Lanr1- en/of AnMan-allelen dragen, vertonen symptomen van de ziekte.
Interessant genoeg vertoonden een paar NLL-lijnen waarin geen enkel “resistent” markerallel voorkwam een ​​hoge mate van anthracnoseresistentie (vergelijkbaar met of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor score en 0,001 voor plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor score en niet-significant voor gewicht). Interessant genoeg vertoonden een paar NLL-lijnen waarin geen enkel “resistent” markerallel voorkwam een ​​hoge mate van anthracnoseresistentie (vergelijkbaar met of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor score en 0,001 voor plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor score en niet-significant voor gewicht). Als u NLL niet gebruikt, kunt u een «резистентного» аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый en более высокий, чем для генотипов Lanr1 en AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки en 0,001 для массы растения) en популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Interessant genoeg vertoonden verschillende NLL-lijnen waarin geen enkel 'resistent' merkerallel voorkwam, een hoge mate van resistentie tegen anthracnose (vergelijkbaar met of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en 0,001 voor plantgewicht) en populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en niet significant voor gewicht).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）,Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Het is interessant dat sommige NLL-systemen die geen “antigene” markers hebben, een hoge horizontale resistentie vertonen (equivalent aan Lanr1- of AnMan-genen of hoger), zoals Boregine (beide parameters P < 0,0001), Bojar (P-waarde < 0,0001, plantgewicht 0,001) en stam B-549/79b (P-waarde < 0,0001, gewicht niet significant). Als u NLL niet gebruikt, kunt u een "маркерных аллелей «резистентности» gebruiken, показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 en ли AnMan), такие какак Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) en B-549/79b (P-значение <0,0001, масса незначительна). Interessant genoeg vertoonden enkele NLL-lijnen zonder 'resistentie'-markerallelen een hoge mate van anthracnoseresistentie (vergelijkbaar met of hoger dan Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde voor beide parameters <0,0001), Bojar (P-waarde < 0,0001, plantgewicht 0,001) en populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001, gewicht niet significant).Dit fenomeen suggereert de mogelijkheid van een nieuwe genetische bron van resistentie, wat het waargenomen gebrek aan correlatie tussen markergenotypes en ziektefenotypes verklaart (p-waarden van ~0,42 tot ~0,98). Zo toonde de Kolmogorov-Smirnov-test aan dat de gegevens over anthracnoseresistentie ongeveer normaal verdeeld waren voor scores (p-waarden 0,25 en 0,11) en plantmassa (p-waarden 0,47 en 0,55), wat suggereert dat ik de hypothese heb dat er meer allelen dan Lanr1 en AnMan bij betrokken zijn.
Op basis van de resultaten van de screening op antracnoseresistentie werden 4 lijnen geselecteerd voor transcriptoomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup en populatie 22660. Deze lijnen werden opnieuw getest op antraxresistentie in inoculatie-experimenten met behulp van RNA-sequencing, mits ze dezelfde waren als in de vorige test. De scorewaarden waren als volgt: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) en populatie 22660 (6,11 ± 1,29).
Het Illumina NovaSeq 6000-protocol behaalde gemiddeld 40,5 miljoen read-paren per monster (29,7 tot 54,4 miljoen reads) (aanvullende tabel S3). De uitlijningsscores in de referentiesequentie varieerden van 75,5% tot 88,6%. De gemiddelde correlatie van read-countgegevens tussen experimentele varianten tussen biologische replicaten varieerde van 0,812 tot 0,997 (gemiddeld 0,959). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie, en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie, en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Op 35 170 apparaten in 2917 zonder benodigdheden, en op 4785 stuks экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde <5).在分析的35.170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Er zijn 35 170 apparaten in 2917, zonder specificatie, en 4785 stuks незначительную экспрессию (базовое среднее sensueel <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen kwamen 2917 niet tot expressie en de overige 4785 genen hadden een verwaarloosbare expressie (basisgemiddelde <5).Het aantal genen dat tot expressie werd gebracht (basisgemiddelde ≥ 5) tijdens het experiment bedroeg dus 27.468 (78,1%) (Aanvullende tabel S4).
Vanaf het eerste tijdstip reageerden alle NLL-lijnen op de inoculatie van C. lupini (stam Col-08) door het transcriptoom te herprogrammeren (Tabel 1). Er werden echter significante verschillen waargenomen tussen de lijnen. Zo vertoonde de resistentielijn 83A:476 (die het Lanr1-gen draagt) significante transcriptoomherprogrammering op het eerste tijdstip (6 uur na infectie) met een 31-69-voudige toename van het aantal geïsoleerde up- en down-genen vergeleken met andere tijdstippen op dit tijdstip. Bovendien was deze piek van korte duur, aangezien de expressie van slechts enkele genen significant veranderd bleef op het tweede tijdstip (12 uur na infectie). Interessant is dat Boregine, dat ook een hoge mate van resistentie vertoonde in de transplantaattest, geen dergelijke massale transcriptionele herprogrammering onderging tijdens het experiment. Het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) was echter hetzelfde voor Boregine en 83A:476 op 12 uur na infectie. Zowel Mandelup als populatie 22660 vertoonden op het laatste meetpunt DEG-pieken (48 l/s), wat duidt op een relatieve vertraging in de afweerreacties.
Omdat 83A:476 een enorme transcriptoomherprogrammering onderging als reactie op C. lupini op 6 HPI vergeleken met alle andere lijnen, was ~91% van de op dit tijdstip waargenomen DEG's lijnspecifiek (Fig. 1). Er was echter enige overlap in vroege responsen tussen de onderzoekslijnen, aangezien 68,5%, 50,9% en 52,6% DEG in respectievelijk Boregine, Mandelup en populatie 22660 overlapten met die gevonden in 83A:476 op bepaalde tijdstippen. Deze DEG's vertegenwoordigden echter slechts een klein deel (0,97-1,70%) van alle DEG's die momenteel met 83A:476 werden gedetecteerd. Bovendien waren 11 DEG's van alle lijnen op dit moment coherent (aanvullende tabellen S4-S6), inclusief gemeenschappelijke componenten van de afweerreacties van planten: lipide-overdrachtsproteïne (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside-enzym (TanjilG_23384), twee stress-induceerbare proteïnen zoals SAM22 (TanjilG_31528 en TanjilG_31531), basisch latex-proteïne (TanjilG_32352) en twee glycine-rijke structurele celwandproteïnen (TanjilG_19701 en TanjilG_19702). Er was ook een relatief hoge overlap in transcriptoomreacties tussen 83A:476 en Boregine op 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tussen Mandelup en Populatie 22660 op 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram met het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) in smalbladige lupinelijnen (NLL) geënt met Colletotrichum lupini (stam Col-08, verkregen van lupinevelden in Wierzhenice, Polen, 1999). De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, met het Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het AnMan-allel) en populatie 22660 (zeer vatbaar). De afkorting hpi staat voor uren na vaccinatie. Nulwaarden zijn verwijderd om de grafiek te vereenvoudigen.
De set overgeëxprimeerde genen op 6 uur na infectie werd geanalyseerd op de aanwezigheid van canonieke R-gendomeinen (aanvullende tabel S7). Deze studie toonde transcriptoominductie aan van klassieke ziekteresistentiegenen met NBS-LRR-domeinen alleen op 83A:476. Deze set bestond uit één TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), vijf CC-NBS-LRR-genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 en tanjilg_16162), en vier NBS-LR, Tanjilg_16162, en vier NBS-LRRE (tanjilg_16162), evenals vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) en vier NBS-LRR (TANJILG_16162). Al deze genen hebben canonieke domeinen die in geconserveerde sequenties gerangschikt zijn. Naast de NBS-LRR-domeingenen werden verschillende RLL-kinases geactiveerd op 6 uur na infectie, namelijk één in Boregine (TanjilG_19877), twee in Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en in populatie 22660 (TanjilG_09014 en TanjilG_10361) en twee in 83A 27:476.
Genen met een significant veranderde expressie als reactie op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) werden onderworpen aan een Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse (aanvullende tabel S8). De meest frequent oververtegenwoordigde biologische procesterm was “GO:0006952 verdedigingsreactie”, die in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties voorkwam met een hoge significantie (P-waarde < 0,001) (Figuur 2). De meest frequent oververtegenwoordigde biologische procesterm was “GO:0006952 verdedigingsreactie”, die in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties voorkwam met een hoge significantie (P-waarde < 0,001) (Figuur 2). Meer informatie over het gebruik van uw mobiele telefoon «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся in 6 of 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). De meest frequent oververtegenwoordigde biologische procesterm was 'GO:0006952 afweerreactie', die in 6 van de 16 (tijd × afstammingslijn) combinaties voorkwam met een hoge significantie (P-waarde < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 De meest representatieve biologische procesterm is “GO:0006952 verdedigingsreactie”, die in 6 van de 16 (时间×线) combinaties voorkomt, met hoge significantie (P-waarde < 0,001) (图2). Meer informatie over het antwoord op de vraag "GO: 0006952 Defense Response", который появлялся in 6 en 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). De meest frequent oververtegenwoordigde biologische procesterm was 'GO:0006952 Defense Response', die in 6 van de 16 combinaties (tijd × lijn) voorkwam met een hoge significantie (P-waarde < 0,001) (Fig. 2).Deze term was oververtegenwoordigd op twee tijdstippen in 83A: 476 en Boregine (respectievelijk 6 en 24 uur na infectie) en op één tijdstip in Mandelup en populatie 22660 (respectievelijk 12 en 6 uur na infectie). Dit is een verwacht resultaat, dat de antischimmelreactie van de resistente lijnen benadrukt. Bovendien reageerde 83A:476 op C. lupini door snelle inductie van genen gerelateerd aan de oxidatieve uitbarsting die wordt gerepresenteerd door de term "GO:0055114 redoxproces", wat wijst op een specifieke afweerreactie, terwijl Boregine specifieke afweerreacties vertoonde, gerelateerd aan de term 'GO'. :0006950 Stressrespons”. Populatie 22660 activeerde de horizontale resistentierespons met secundaire metabolieten, wat het overmatige aantal termen “GO:0016104 Proces van triterpeenbiosynthese” en “GO:0006722 Proces van triterpeenmetabolisme” benadrukt (beide termen behoren tot dezelfde set genen). Rekening houdend met de resultaten van de GO-termverrijkingsanalyse, was de reactiestabiliteit van Mandelup tussen Boregine en Populatie 22660. Bovendien omvatten vroege reactie 83A:476 (6 uur na infectie) en vertraagde reactie Mandelup en Populatie 22660 de term GO:0015979 'fotosynthese' en andere gerelateerde biologische processen.
De termen voor bioprocesgenontologie die geselecteerd zijn in de annotatie van differentieel tot expressie gebrachte genen tijdens transcriptoomreacties van smalbladige lupine (NLL) geïnoculeerd met miltvuurlupine (Col-08-stam verkregen uit lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999), zijn sterk overdreven. De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en populatie 22660 (gevoelig).
Omdat deze studie gericht was op het identificeren van genen die bijdragen aan anthracnoseresistentie, werden de genen die aan de termen GO werden toegewezen (GO: 0006952 Defensieve reacties) en GO: 0055114 Redoxprocessen geanalyseerd met cut-offs, aangezien de baselinegemiddelden ≥ 30 waren met ten minste één regel. × tijdstip gecombineerd met statistisch significante log2-waarden (voudige verandering). Het aantal genen dat aan deze criteria voldeed, was 65 voor GO:0006952 en 524 voor GO:0055114.
83A:476 onthulde twee DEG-pieken, geannoteerd met de term GO:0006952, de eerste met 6 genen per inch (64 genen, op- en neerwaartse regulatie) en de tweede met 24 genen per inch (15 genen, alleen opwaartse regulatie). Boregine toonde ook aan dat GO:0006952 op hetzelfde tijdstip piekte, maar met minder DEG (11 en 8) en preferentiële activering. Mandeloop toonde twee pieken van GO:0006952 op 12 en 48 HPI, beide met 12 genen (de eerste met activerende genen en de tweede met alleen suppressieve genen), terwijl de 22660-populatie op 6 HPI (13 genen) een grotere overheersing van de toenamepiekregulatie had. Opgemerkt dient te worden dat 96,4% van GO:0006952 DEG in deze pieken hetzelfde type respons vertoonde (omhoog of omlaag), wat duidt op een significante overlap in afweerreacties ondanks verschillen in het aantal betrokken genen. De grootste groep sequenties gerelateerd aan de term GO:0006952 codeert voor het Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-achtig), dat behoort tot de klasse 10 pathogenese-geassocieerde proteïne (PR-10) eiwitclade en het kerneiwit latex. vergelijkbaar (MLP-achtig) eiwit) eiwit (Fig. 3). De twee groepen verschilden in de aard van de expressie en de richting van de respons. De genen die coderen voor SAM22-achtige eiwitten vertoonden een consistente en significante inductie op vroege tijdstippen (6 of 12 uur na infectie) en waren over het algemeen niet-responsief aan het einde van het experiment (48 uur na infectie), terwijl MLP-achtige eiwitten coördinatie vertoonden op 6 uur na infectie. 83A:476 en Mandelup bij 48 hp/in, waren bijna alle andere datapunten niet responsief. Bovendien volgden verschillen in expressieprofielen van SAM22-achtige eiwitgenen de waargenomen variabiliteit in anthracnoseresistentie, aangezien resistentere lijnen meer tijdpunten hadden die deze genen significant induceren dan vatbare genen. Een ander LlR18A/B-achtig PR-10-gen vertoonde een zeer vergelijkbaar expressiepatroon als het SAM22-achtige eiwitgen.
De belangrijkste componenten van het biologische proces, de term "GO:0006952 Defense Response", en de expressiepatronen van kandidaatgenen van de Lanr1- en AnMan-allelen werden geïdentificeerd. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (voudige verandering) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Wizhenica, Polen, 1999) en controle (schijngeïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
Daarnaast werden de expressieprofielen van de RNA-seq-kandidaatgenen Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) geëvalueerd (fig. 3). Het TanjilG_05042-gen vertoonde een significante respons (activering) bij 83A:476 alleen op het eerste tijdstip (6 uur na infectie), terwijl TanjilG_12861 in Mandeloop alleen significant was op twee tijdstippen: 6 uur na infectie (downregulatie) en 24 uur na infectie (6 uur na infectie). (Met.). (instelbaar) ).
De meest overgeëxprimeerde genen in de term GO:0055114 "redoxproces" waren genen die coderen voor cytochroom P450-eiwitten en peroxidase (Fig. 4). Voor monsters geïsoleerd uit 83A:476 op 6 HPI werden over het algemeen maximale of minimale log2-waarden (voudige verandering) (voor 86,6% van de genen) waargenomen tussen geïnoculeerde en controleplanten, wat de hoge respons van dit genotype op inoculatie van het geslacht benadrukt. 83A:476 vertoonde de meest significante GO:0055114 DEG op 6 HPI (503 genen), terwijl de rest van de lijnen op 48 HPI (Boregine, 31 genen; Mandelup, 85 genen; en Populatie 22660, 78 genen) vertoonden. In de meeste genen van de GO:0055114-familie werden twee soorten reacties op vaccinatie waargenomen (activering en remming). Interessant is dat tot 97,6% van de DEG's die voor de term GO:0055114 werden geïdentificeerd in Mandelupe op 48 uur. Deze observaties suggereren dat, ondanks de aanzienlijk kleinere schaal (d.w.z. het aantal gemuteerde redoxgenen, 85 versus 503), het patroon van vertraagde transcriptoomreacties van Mandeloupe op anthracnose vergelijkbaar is met de vroege reactie van 83A:476. In Boregine en Populatie 22660 is deze convergentie lager, namelijk respectievelijk 51,6% en 75,6%.
De expressiepatronen van de belangrijkste componenten van de term "GO:0055114 Redoxproces" werden onthuld. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (voudige verandering) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Wizhenica, Polen, 1999) en controle (schijngeïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
83A:476 Transcriptomische reacties op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) omvatten ook gecoördineerde uitschakeling van genen die worden toegeschreven aan de term GO:0015979 "fotosynthese" en andere gerelateerde biologische processen (FIG. 5). Deze GO:0015979 DEG-set bevatte 105 genen die significant werden onderdrukt op 6 uur na infectie (HIP) op 83A:476. In deze subset waren 37 genen ook neerwaarts gereguleerd in Mandelup op 48 uur na infectie en 35 op hetzelfde tijdstip in de populatie 22660, waaronder 19 DEG's die gemeenschappelijk zijn voor beide genotypes. Geen van de DEG's gerelateerd aan de term GO:0015979 werden significant geactiveerd in welke combinatie dan ook (lijn x tijd).
De expressiepatronen van de belangrijkste componenten van de term "GO:0015979 Fotosynthese" werden onthuld. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (voudige verandering) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Wizhenica, Polen, 1999) en controle (schijngeïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
Op basis van de resultaten van differentiële expressieanalyse en de vermoedelijke betrokkenheid bij afweerreacties tegen pathogene schimmels, werd deze set van zeven genen geselecteerd voor kwantificering van expressieprofielen door real-time PCR (aanvullende tabel S9).
Het veronderstelde proteïnegen TanjilG_10657 werd significant geïnduceerd in alle bestudeerde lijnen en tijdpunten vergeleken met controleplanten (nabootsing) (aanvullende tabellen S10, S11). Bovendien vertoonde het expressieprofiel van TanjilG_10657 een stijgende trend gedurende het experiment voor alle lijnen. Populatie 22660 vertoonde de hoogste gevoeligheid van TanjilG_10657 voor inoculatie met een 114-voudige activering en het hoogste relatieve expressieniveau (4,4 ± 0,4) op 24 HPI (Fig. 6a). Het PR10 LlR18A-proteïnegen TanjilG_27015 vertoonde eveneens activering in alle lijnen en tijdpunten, met statistische significantie op de meeste datapunten (Fig. 6b). Net als bij TanjilG_10657 werd het hoogste relatieve expressieniveau van TanjilG_27015 waargenomen in de geënte populatie 22660 op 24 HPI (19,5 ± 2,4). Het gen voor zure endochitinase, TanjilG_04706, was significant verhoogd in alle lijnen en op alle tijdstippen, behalve in Boregine op 6 HPI (Fig. 6c). Het werd sterk geïnduceerd op het eerste tijdstip (6 HPI) op 83A:476 (met 10,5 keer) en matig verhoogd in andere lijnen (met 6,6-7,5 keer). Tijdens het experiment bleef de expressie van TanjilG_04706 op een vergelijkbaar niveau in 83A:476 en Boregine, terwijl deze in Mandelup en populatie 22660 significant toenam en relatief hoge waarden bereikte (respectievelijk 5,9 ± 1,5 en 6,2 ± 1,5). Het endoglucan-1,3-β-glucosidase-achtige gen TanjilG_23384 vertoonde een hoge activatie op de eerste twee tijdstippen (6 en 12 uur na infectie) in alle lijnen, behalve populatie 22660 (fig. 6d). De hoogste relatieve expressieniveaus van TanjilG_23384 werden waargenomen op het tweede tijdstip (12 uur na infectie) in Mandelup (2,7 ± 0,3) en 83A:476 (1,5 ± 0,1). Op 24 uur na infectie was de expressie van TanjilG_23384 relatief laag in alle bestudeerde lijnen (van 0,04 ± 0,009 tot 0,44 ± 0,12).
Expressieprofielen van geselecteerde genen (ag) onthuld door kwantitatieve PCR. De getallen 6, 12 en 24 geven de uren na vaccinatie weer. De genen LanDExH7 en LanTUB6 werden gebruikt voor normalisatie en LanTUB6 voor interseriekalibratie. De foutbalken geven de standaarddeviatie weer op basis van drie biologische replicaten, die elk het gemiddelde zijn van drie technische replicaten. De statistische significantie van de verschillen in expressieniveaus tussen de geënte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit het lupineveld in Wierzenica, Polen) en de controle (schijngeënte) planten worden boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). De statistische significantie van de verschillen in expressieniveaus tussen de geënte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit het lupineveld in Wierzenica, Polen) en de controle (schijngeënte) planten worden boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). Colletotrichum lupini, van Col-08, geboren in 1999 in Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Boven de datapunten zijn statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geënte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit een lupineveld in Wierzhenice, Polen) en controleplanten (schijngeënt) opgemerkt (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 (colletotrichum lupini, kleur-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 (接种 植物)之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина in Верженице, Sinds 1999 en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Boven de datapunten zijn statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geënte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Verzhenice, Polen, in 1999) en controle (schijngeënte) planten opgemerkt (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond) en populatie 22660 (gevoelig).
Het kandidaatgen TanjilG_05042 op de Lanr1-locus vertoonde een opvallend ander expressiepatroon dan de profielen verkregen uit RNA-seq-studies (Fig. 6e). Significante activering van dit gen werd waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie (respectievelijk tot 39,7 en 11,7 keer), resulterend in relatief hoge expressieniveaus (respectievelijk tot 1,4 ± 0,14 en 7,2 ± 1,3). 83A:476 toonde ook enige opregulatie van het TanjilG_05042-gen (tot 3,8 keer), maar de bereikte relatieve expressieniveaus (0,044 ± 0,002) waren meer dan 30 keer lager dan die waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie. Uit analyses met qPCR bleek dat er significante verschillen waren in expressieniveaus tussen genotypen in schijngevaccineerde (controle)varianten, met een verschil van 58 keer tussen de populaties 22660 en 83A:476, en tussen de populaties 22660 en 22660. Er werd een verschil van twee keer bereikt tussen Boregine en Mandalup.
Het kandidaatgen op de AnMan-locus, TanjilG_12861, werd geactiveerd als reactie op vaccinatie in 83A:476 en Mandelup, was neutraal in de populatie 22660 en was neerwaarts gereguleerd in Boregine (Fig. 6f). De relatieve expressie van het TanjilG_12861-gen was het hoogst in de geënte 83A:476 (0,14 ± 0,01). Het 17,4 kDa klasse I heat shock-eiwitgen TanjilG_05080 HSP17.4 vertoonde lagere relatieve expressieniveaus in alle bestudeerde stammen en op alle tijdstippen (Fig. 6g). De hoogste waarde werd waargenomen op 24 HPI in de populatie 22660 (0,14 ± 0,02, een achtvoudige toename in de respons op vaccinatie).
Vergelijking van genexpressieprofielen (fig. 7) toonde een hoge correlatie tussen TanjilG_10657 en vier andere genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) en TanjilG_04706 (r = 0,79). Deze resultaten kunnen wijzen op coregulatie van deze genen tijdens afweerreacties. De genen TanjilG_12861 en TanjilG_23384 vertoonden verschillende expressieprofielen met lagere Pearson-correlatiecoëfficiënten (respectievelijk van 0,08 tot 0,43 en -0,19 tot 0,28) in vergelijking met andere genen.
Correlaties tussen genexpressieprofielen werden gedetecteerd met behulp van kwantitatieve PCR. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend) en Populatie 22660 (gevoelig). Er werden drie tijdpunten berekend (6, 12 en 24 uur na inoculatie), waaronder geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999) en controle (schijngeïnoculeerde) planten. De schaal geeft de waarde van de Pearson-correlatiecoëfficiënt weer.
Op basis van gegevens verkregen bij 6 pk per inch werd WGCNA uitgevoerd op 9981 DEG, geïdentificeerd door geënte en controleplanten te vergelijken, om te focussen op vroege afweerreacties (aanvullende tabel S12). Er werden 22 genmodules (clusters) gevonden met gecorreleerde (positieve of negatieve) expressieprofielen tussen genotypen en experimentele varianten. Gemiddeld genomen namen de genexpressieniveaus af in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker bij controlegroepen). Gemiddeld genomen namen de genexpressieniveaus af in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker bij controlegroepen). De gegevens over het land in порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in de regio, dan, dit is wat je wilt контрольных растений). Gemiddeld genomen namen de genexpressieniveaus af in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker bij controlegroepen).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> Boregine> bevolking 22660 的 顺序 下降 ， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (однако в обоих het is een goed idee om dit te doen (Russisch). Gemiddeld genomen namen de genexpressieniveaus af in de reeks 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker bij controleplanten).Vaccinatie resulteerde in een opregulatie van de genexpressie, met name in de modules 18, 19, 14, 6 en 1 (in aflopende volgorde van effect), negatieve regulatie (bijv. modules 9 en 20) of met neutrale effecten (bijv. modules 11, 22, 8 en 13). GO-termverrijkingsanalyse (aanvullende tabel S13) toonde "GO: 0006952 beschermende responsen" aan voor de geïnoculeerde module (18) met maximale activering, inclusief genen geanalyseerd door qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015), evenals veel geïnoculeerde, meest onderdrukte fotosynthesemodules (9). Module 18 concentrator (fig. 8) werd geïdentificeerd als het TanjilG_26536-gen dat codeert voor het PR-10-achtige LlR18B-eiwit, en module 9 concentrator werd geïdentificeerd als het TanjilG_28955-gen dat codeert voor het fotosysteem II PsbQ-eiwit. Een kandidaat-anthracnoseresistentiegen Lanr1, TanjilG_05042, werd gevonden in module 22 (fig. 9) en is geassocieerd met de termen "GO:0044260 Cellulaire macromoleculaire metabole processen" en "GO:0006355 Transcriptionele regulatie, DNA-templating" met de TanjilG_01212-hub. Het gen codeert voor hittestresstranscriptiefactor A-4a (HSFA4a).
Gewogen netwerkanalyse van genco-expressie van modules met oververtegenwoordigde biologische procestermen "GO: 0006952 Defense Responses". Ligatie werd vereenvoudigd om de vier genen te markeren die met qPCR werden geanalyseerd (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015).
Gewogen netwerkanalyse van genco-expressie van een module met een oververtegenwoordigde biologische procesterm "GO: 0006355: Transcriptionele regulatie, DNA-templating" en drager van een kandidaat-anthracnoseresistentiegen Lanr1 TanjilG_05042. Ligatie werd vereenvoudigd om het TanjilG_05042-gen en het centrale TanjilG_01212-gen te isoleren.
Anthracnoseresistentiescreening uitgevoerd in Australië toonde aan dat de meeste van de vroeg uitgebrachte cultivars vatbaar waren; Kalya, Coromup en Mandelup zijn beschreven als matig resistent, terwijl Wonga, Tanjil en 83A:476 zijn beschreven als zeer resistent26,27,31. hadden hetzelfde resistentieallel, aangeduid als Lanr1, en Coromup en Mandelup hadden een ander allel, aangeduid als AnMan10,26,39, terwijl Kalya een ander allel doorgaf, Lanr2. Screening op anthracnoseresistentie in Duitsland resulteerde in de identificatie van een resistente lijn Bo7212 met een ander kandidaatallel dan Lanr1, aangeduid als LanrBo36.
Onze studie toonde een zeer lage frequentie (ongeveer 6%) van het Lanr1-allel aan in het geteste kiemplasma. Deze observatie komt overeen met de resultaten van screening van Oost-Europees kiemplasma met behulp van de Anseq3- en Anseq4-markers, waaruit bleek dat het Lanr1-allel slechts in twee Wit-Russische lijnen aanwezig is. Dit suggereert dat het Lanr1-allel nog niet wijdverbreid wordt gebruikt door lokale fokprogramma's, in tegenstelling tot Australië, waar het een van de belangrijkste allelen is voor marker-ondersteunde veredeling. Dit kan te wijten zijn aan de lagere resistentie die het Lanr1-allel biedt onder Europese veldomstandigheden in vergelijking met het Australische rapport. Bovendien hebben studies naar antracnose in gebieden met veel regenval in Australië aangetoond dat resistentiereacties gemedieerd door het Lanr1-allel mogelijk niet effectief zijn onder weersomstandigheden die de groei en snelle ontwikkeling van de ziekteverwekker bevorderen19,42. Sterker nog, in de huidige studie werden enkele symptomen van antracnose ook waargenomen bij genotypen die het Lanr1-allel dragen, wat suggereert dat resistentie kan verdwijnen onder optimale omstandigheden voor de ontwikkeling van C. lupini. Bovendien zijn vals-positieve interpretaties van de aanwezigheid van Anseq3- en Anseq4-markers, die zich ongeveer 1 cM van de Lanr1-locus bevinden, mogelijk 28,30,43 .
Onze studie toonde aan dat 83A:476, met het Lanr1-allel, reageerde op C. lupini-inoculatie met grootschalige transcriptoomherprogrammering op het eerste geanalyseerde tijdstip (6 uur na infectie), terwijl in Mandelup, met het AnMan-allel, transcriptoomreacties veel later werden waargenomen (van 24 tot 48 uur na infectie). Deze temporele variaties in afweerreacties hangen samen met verschillen in ziektesymptomen, wat het belang benadrukt van vroege herkenning van pathogenen voor een succesvolle reactie op resistentie. Om plantenweefsel te infecteren, moeten miltvuursporen verschillende ontwikkelingsstadia doorlopen op het oppervlak van de gastheer, waaronder kieming, celdeling en de vorming van een appressorium. Een aanhangsel is een infectieuze structuur die zich hecht aan het oppervlak van de gastheer en de penetratie in de gastheerweefsels vergemakkelijkt. Nederlands Dus, sporen van C. gloeosporioides in erwtenextract vertoonden de eerste deling van de kern na 75-90 minuten incubatie, de vorming van een kiembuis na 90-120 minuten en onderdrukking na 4 uur 45. Mango C. gloeosporioides vertoonde meer dan 40% conidiale kieming na 3 uur incubatie en ongeveer 20% vorming van appressoren na 4 uur. Het virulentie-geassocieerde CAP20-gen van C. gloeosporioides vertoonde transcriptionele activiteit in epifytvormende conidia na 3,5 uur incubatie in avocado-oppervlaktewas met hoge concentraties CAP20-eiwit na 4 uur 46 minuten. Op soortgelijke wijze werd de activiteit van melaninebiosynthesegenen in C. trifolii geïnduceerd tijdens een incubatie van 2 uur gevolgd door de vorming van een appressorium na 1 uur. Studies van bladweefsels hebben aangetoond dat aardbeien die zijn geïnoculeerd met C. acutatum een ​​eerste onderdrukking hebben op 8 uur na infectie, terwijl tomaten die zijn geïnoculeerd met C. coccodes een eerste onderdrukking hebben op 4 uur na infectie48,49. Dit komt grotendeels overeen met de tijdschaal van het infectieproces van Colletotrichum spp. Snelle afweerreacties op 83A:476 suggereren de betrokkenheid van genen voor plantresistentie en effector-getriggerde immuniteit (ETI) in deze lijn, terwijl de vertraagde reacties van Mandelup de hypothese van micro-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuniteit (MTI) ondersteunen50. Vroege reacties op 83A:476 en Mandelup. De gedeeltelijke overlap tussen op- of neergereguleerde genen bij een vertraagde reactie ondersteunt dit concept ook, aangezien ETI vaak wordt beschouwd als een versnelde en versterkte MTI-reactie die culmineert in geprogrammeerde celdood op de plaats van infectie, bekend als anafylactische shock51,52.
De meeste genen die worden toegeschreven aan de oververtegenwoordigde term Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" zijn de 11 homologen van het stress-induced fasting message 22-eiwit (vergelijkbaar met SAM22) en de zeven belangrijke latex-eiwitachtige (MLP's). De SAM22-achtige eiwitten 31, 34, 43 en 423 vertoonden sequentieovereenkomst. SAM22-achtige genen vertoonden significante activering die langer aanhield, wat wijst op verhoogde niveaus van anthracnoseresistentie (83A:476 en Boregine). MLP-achtige genen werden echter alleen onderdrukt in lijnen die het kandidaat-resistentieallel dragen (83A:476/Lanr1 na 6 uur 's nachts en Mandelup/AnMan na 24 uur 's nachts). Opgemerkt dient te worden dat alle geïdentificeerde SAM22-achtige homologen afkomstig zijn uit een gencluster van ongeveer 105 kb, terwijl MLP-achtige genen afkomstig zijn uit afzonderlijke regio's van het genoom. Gecoördineerde activering van dergelijke SAM22-achtige genen werd ook gevonden in onze eerdere studie naar NLL-resistentie tegen Diaporthetoxica-inoculatie, wat suggereert dat ze betrokken zijn bij de horizontale componenten van de afweerreactie. Deze conclusie wordt ook ondersteund door meldingen van een positieve respons van SAM22-achtige genen op letsel of behandeling met salicylzuur, schimmelinductoren of waterstofperoxide.
MLP-achtige genen blijken te reageren op diverse abiotische en biotische stressfactoren, waaronder bacteriële, virale en pathogene schimmelinfecties bij veel plantensoorten55. De respons op bepaalde interacties tussen planten en pathogenen varieerde van sterk toenemend (bijv. tijdens een besmetting van katoen met Verticillium dahliae) tot significant afnemend (bijv. na infectie van een appelboom met Alternaria spp.)56,57. Er is een significante downregulatie van het MLP-achtige 423-gen waargenomen tijdens de verdediging van avocado tegen F. niger-infectie en tijdens infectie van de appelboom. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola en Alternaria alternata zijn appelpathotypen58,59. Bovendien hadden appelcalli met overexpressie van het MLP-achtige 423-gen een lagere expressie van resistentiegeassocieerde genen en waren ze gevoeliger voor schimmelinfectie59. Na Fusarium oxysporum f werd het MLP-achtige gen 423 ook onderdrukt in resistente kiemplasma van gewone bonen. cn. Booninfectie 60.
Andere leden van de PR-10-familie die in onze RNA-seq-studie werden geïdentificeerd, waren de genen LlR18A en LlR18B als reactie op opregulatie, evenals het opgereguleerde (1 gen) of neergereguleerde (3 genen) gen voor het lipidetransferproteïne DIR1. Bovendien benadrukt WGCNA het LlR18B-gen als een hub in deze module, die zeer gevoelig is voor vaccinatie en verschillende beschermende responsgenen draagt. De genen LlR18A en LlR18B werden geïnduceerd in gele lupinebladeren als reactie op pathogene bacteriën, evenals in NLL-stengels na inoculatie met D. toxica, terwijl de rijsthomoloog van deze genen, RSOsPR10, snel werd geïnduceerd door een schimmelinfectie die vermoedelijk betrokken is bij de jasmonzuursignaalroute53,61, 62. Het DIR1-gen codeert voor niet-specifieke lipidetransporteiwitten die nodig zijn voor het ontstaan ​​van systemische verworven resistentie (SAR). Met de ontwikkeling van beschermende reacties wordt het DIR1-eiwit vanuit de infectiehaard door het floëem getransporteerd om SAR in afgelegen organen te induceren. Interessant is dat het TanjilG_02313 DIR1-gen significant werd geïnduceerd op het eerste tijdstip in lijn 84A:476 en populatie 22660, maar dat anthracnoseresistentie zich alleen succesvol ontwikkelde in lijn 84A:476. Dit kan wijzen op enige subfunctionalisatie van het DIR1-gen in NLL, aangezien de overige drie homologen alleen in lijn 83A:476 op 6 uur na infectie reageerden op inoculatie, en deze respons was neerwaarts gericht.
In onze studie waren de meest voorkomende componenten die corresponderen met het biologische proces genaamd "GO:0055114 Redoxproces" cytochroom P450-eiwit, peroxidase, linolzuur 9S-/13S-lipoxygenase en 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuuroxidase. Daarnaast definieert onze WGCNA de HSFA4a-homoloog als een hub die modules draagt, zoals de Lanr1-resistentiegenkandidaat TanjilG_05042. HSFA4a is een component van de redoxafhankelijke regulatie van de nucleaire transcriptie in planten.
Cytochroom P450-eiwitten zijn oxidoreductasen die NADPH- en/of O2-afhankelijke hydroxylatiereacties katalyseren in het primaire en secundaire metabolisme, waaronder het metabolisme van xenobiotica, evenals hormonen, vetzuren, sterolen, celwandcomponenten, biopolymeren en de biosynthese van beschermende verbindingen 69. In onze studie werd de variabiliteit in de functie van cytochroom P450 in planten verminderd van -10,6 log2 (voudige verandering) tot 5,7 als gevolg van een groot aantal gewijzigde homologen (37) en verschillen in responspatronen tussen specifieke genen, wat een opwaartse revisie weerspiegelt. . Het alleen gebruiken van RNA-seq-gegevens om de veronderstelde biologische functie van de NLL-genen in zo'n grote eiwitsuperfamilie te verduidelijken, zou zeer speculatief zijn. Het is echter vermeldenswaard dat sommige cytochroom P450-genen geassocieerd zijn met verhoogde resistentie tegen pathogene schimmels of bacteriën, inclusief een bijdrage aan allergische reacties69,70,71.
Klasse III-peroxidasen zijn multifunctionele plantenzymen die betrokken zijn bij een breed scala aan metabolische processen tijdens de groei en ontwikkeling van planten, en bij de reactie op omgevingsstress zoals zoutgehalte, droogte, hoge lichtintensiteit en aanvallen van pathogenen72. Peroxidasen zijn betrokken bij de interactie van verschillende plantensoorten met Anthracis, waaronder Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76. De respons is zeer snel, soms zelfs al na 4 uur na infectie, voordat de schimmel het plantenweefsel binnendringt73. Het peroxidasegen reageerde ook op D. toxica NLL-inoculatie. Naast hun typische functies om oxidatieve uitbarstingen te reguleren of oxidatieve stress te elimineren, kunnen peroxidasen de groei van pathogenen verstoren door fysieke barrières te creëren op basis van celwandversterking tijdens lignificatie, subeenheidvorming of crosslinking van specifieke verbindingen. Deze functie kan in silico worden toegeschreven aan het TanjilG_03329-gen dat codeert voor een vermoedelijk ligninevormende anionperoxidase die in onze studie significant verhoogd was in de 83A:476-resistente lijn op 6 HPI, maar niet in andere stammen en tijdspunten die niet reageerden.
9S-/13S-lipoxygenase van linolzuur is de eerste stap in de oxidatieve route van lipidebiosynthese78. De producten van deze route hebben meerdere functies in de plantenverdediging, waaronder celwandversterking door de vorming van callose- en pectineafzettingen, en regulering van oxidatieve stress door de productie van reactieve zuurstofsoorten79,80,81,82,83. In de huidige studie was de expressie van linolzuur-9S-/13S-lipoxygenase in alle stammen veranderd, maar in de gevoelige populatie 22660 overheerste opregulatie op verschillende tijdstippen, terwijl het in stammen met het resistente Lanr1- en het AnMan-allel de diversificatie van de oxylipinelaag in beschermende anthraxreacties tussen deze genotypes benadrukt.
De homoloog van 1-aminocyclopropaan-1-carboxylaatoxidase (ACO) werd significant opgereguleerd (9 genen) of neergereguleerd (2 genen) na inoculatie met lupine. Op twee uitzonderingen na vonden al deze reacties plaats bij 6 hp. bij 83A:476. De enzymatische reactie gemedieerd door ACO-eiwitten is de snelheidsbeperkende stap in de ethyleenproductie en wordt daarom sterk gereguleerd84. Ethyleen is een plantenhormoon dat verschillende rollen speelt bij het reguleren van de ontwikkeling van planten en hun reactie op abiotische en biotische stress. De inductie van ACO-transcriptie en activering van de ethyleensignaalroute spelen een rol bij het verhogen van de resistentie van rijst tegen de hemibiotrofe schimmel oryzae oryzae door de productie van reactieve zuurstofsoorten en fytoalexinen te reguleren. Een zeer vergelijkbaar bladinfectieproces dat werd gevonden tussen M. oryzae en C. lupini88,89, tegen de achtergrond van een significante opregulatie van ACO-homologen in de 83A:476-lijn die in deze studie werd gerapporteerd, verschuift de mogelijkheid om resistentie te verlenen tegen NLL-anthracnose. Ethyleen is een centrale schakel in de signalering van moleculaire routes.
In de huidige studie werd grootschalige onderdrukking van veel genen die geassocieerd zijn met fotosynthese waargenomen op 6 uur na infectie in 83A:476 en op 48 uur na infectie in Mandeloop en de 22660-populatie. De omvang en progressie van deze veranderingen is evenredig met het niveau. In dit experiment werd anthracnoseresistentie waargenomen. Recentelijk is sterke en vroege onderdrukking van fotosynthesegerelateerde transcripten gerapporteerd in verschillende modellen van plant-pathogeeninteracties, waaronder pathogene bacteriën en schimmels. Haste (vanaf 2 uur na infectie in sommige interacties) en globale onderdrukking van genen die geassocieerd zijn met fotosynthese als reactie op infectie kunnen de immuniteit van planten activeren op basis van de inzet van reactieve zuurstofsoorten en hun interactie met de salicylzuurroute om allergische reacties te mediëren 90,94.
Concluderend omvatten de voorgestelde afweermechanismen voor de meest resistente afstammingslijn (83A:476) snelle herkenning van pathogenen door het R-gen (vermoedelijk TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en door allergische reacties gemedieerde salicylzuur- en ethyleensignalering, gevolgd door het ontstaan ​​van een langeafstands-SAR. De werking wordt ondersteund door het DIR-1-eiwit. Opgemerkt dient te worden dat de biotrofe periode voor C. lupini-infectie zeer kort is (ongeveer 2 dagen), gevolgd door necrotische groei95. De overgang tussen deze stadia kan gepaard gaan met necrose en de expressie van ethyleen-induceerbare eiwitten die fungeren als triggers voor overgevoeligheidsreacties in waardplanten. Daarom is het tijdsbestek voor succesvolle vangst van C. lupini in het biotrofe stadium zeer kort. De herprogrammering van genen geassocieerd met redox en fotosynthese, waargenomen in 83A:476 op 6 uur na infectie, komt overeen met de progressie van schimmeldraden en luidt de ontwikkeling in van een succesvolle beschermende respons in het biotrofe stadium. De transcriptoomresponsen van Mandelup en de 22660-populatie zijn mogelijk te vertraagd om de schimmel te vangen voordat ze overgaan op necrotische groei. Mandelup is echter mogelijk effectiever dan de 22660-populatie, omdat de relatief snelle regulatie van het PR-10-eiwit horizontale resistentie bevordert.
ETI, aangestuurd door het canonieke R-gen, lijkt een veelvoorkomend mechanisme te zijn voor resistentie tegen antracnose in bonen. Zo wordt in de modelvlinder Medicago truncatula resistentie tegen antracnose verleend door het RCT1-gen, een lid van de TIR-NBS-LRR97 planten-R-genklasse. Dit gen verleent ook breedspectrum antracnoseresistentie in alfalfa wanneer het wordt overgedragen op vatbare planten. In de gewone boon (P. vulgaris) zijn tot nu toe meer dan twee dozijn antracnoseresistentiegenen geïdentificeerd. Sommige van deze genen worden gevonden in regio's zonder canonieke R-genen, maar vele andere bevinden zich aan de randen van chromosomen met het NBS-LRR-gencluster, waaronder TIR-NBS-LRRs99. De genoombrede SSR-studie bevestigde ook de associatie van het NBS-LRR-gen met antracnoseresistentie in de gewone boon. Het canonieke R-gen werd ook aangetroffen in de genomische regio met de belangrijkste locus voor antracnoseresistentie in witte lupine 101.
Ons werk toont aan dat een onmiddellijke resistentiereactie, geactiveerd in een vroeg stadium van planteninfectie (bij voorkeur uiterlijk 12 uur na infectie), smalbladige lupine effectief beschermt tegen antracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Collelotrichum lupini. Met behulp van high-throughput sequencing hebben we differentiële expressieprofielen aangetoond van antracnoseresistentiegenen in NLL-planten, gemedieerd door de Lanr1- en AnMan-resistentiegenen. Een succesvolle verdediging vereist het zorgvuldig ontwerpen van de genen voor eiwitten die betrokken zijn bij redox, fotosynthese en pathogenese binnen enkele uren na het eerste contact van de plant met een pathogeen. Vergelijkbare beschermende reacties, maar vertraagd in de tijd, zijn veel minder effectief in het beschermen van planten tegen ziekten. Antraxresistentie gemedieerd door het Lanr1-gen lijkt op de typische snelle respons van het R-gen (effector-getriggerde immuniteit), terwijl het AnMan-gen hoogstwaarschijnlijk een horizontale respons (immuniteit getriggerd door een microbe-geassocieerd moleculair patroon) biedt, wat een matige mate van duurzaamheid oplevert.
De 215 NLL-lijnen die gebruikt werden om te screenen op antracnosemarkers bestonden uit 74 cultivars, 60 lijnen verkregen door kruising of veredeling, 5 mutanten en 76 wilde of originele kiemplasma's. De lijnen waren afkomstig uit 17 landen, voornamelijk uit Polen (58), Spanje (47), Duitsland (27), Australië (26), Rusland (19), Wit-Rusland (7), Italië (5) en andere lijnen uit 10 landen. De set bevat ook referentieresistente lijnen: 83A:476, Tanjil, Wonga met het Lanr1-allel en Mandelup met het AnMan-allel. De lijnen zijn verkregen uit de European Lupine Genetic Resource Database, beheerd door Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (aanvullende tabel S1).
Planten werden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden (fotoperiode 16 uur, temperatuur 25 ° C overdag en 18 ° C 's nachts). Twee biologische replicaten werden geanalyseerd. DNA werd geïsoleerd uit drie weken oude bladeren met behulp van de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens het protocol. De kwaliteit en concentratie van het geïsoleerde DNA werd beoordeeld met behulp van spectrofotometrische methoden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). De AnManM1-marker die het anthracnose-resistentiegen AnMan markeert (afgeleid van cv. Mandelup) en de markers Anseq3 en Anseq4 die het gen Lanr1 flankeren (afgeleid van cv. Tanjil) werden geanalyseerd 11,26,28. Homozygoten voor het resistente allel werden gescoord als "1", vatbaar - als "0" en heterozygoten - als 0,5.
Op basis van de resultaten van de screening op de markers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en de beschikbaarheid van zaden voor de laatste vervolgexperimenten, werden 50 NLL-lijnen geselecteerd voor anthracnoseresistentiefenotypering. De analyse werd in duplo uitgevoerd in een computergestuurde kas met een fotoperiode van 14 uur en een temperatuurbereik van 22 °C overdag en 19 °C 's nachts. De zaden worden vóór het zaaien gekrast (het zaadvlies aan de andere kant van het embryo wordt met een scherp mesje afgesneden) om te voorkomen dat de zaden in rust raken door een te harde zaadhuid en om een ​​gelijkmatige kieming te garanderen. De planten werden gekweekt in potten (11 × 11 × 21 cm) met steriele grond (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen). De inoculatie werd uitgevoerd met de Colletotrichum lupini Col-08-stam, gekweekt in 1999 uit de stengels van smalbladige lupineplanten die groeiden in een veld in Verzhenitsa, Groot-Polen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Zoek een gebied. De isolaten werden 21 dagen gekweekt in SNA-medium bij 20° C onder zwart licht om sporulatie te induceren. Vier weken na het zaaien, toen de planten het 4-6 bladstadium hadden bereikt, werd de inoculatie uitgevoerd door te bespuiten met een suspensie van conidia in een concentratie van 0,5 x 106 conidia per ml. Na de inoculatie werden de planten 24 uur in het donker gehouden bij een vochtigheid van ongeveer 98% en een temperatuur van 25°C om de kieming van conidia en het infectieproces te vergemakkelijken. De planten werden vervolgens gekweekt onder een fotoperiode van 14 uur bij 22 °C overdag/19 °C 's nachts en een luchtvochtigheid van 70%. De ziektescore werd 22 dagen na inoculatie bepaald en varieerde van 0 (immuun) tot 9 (zeer vatbaar), afhankelijk van de aan- of afwezigheid van necrotische laesies op stengels en bladeren. Na de score werd ook het gewicht van de planten gemeten. Relaties tussen markergenotypen en ziektefenotypen werden berekend als punt-twee-sequentiecorrelaties (afwezigheid van heterozygote markers in de set lijnen voor analyse van het antracnoseresistentiefenotype).