Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een vlinderbloemige plant die wordt gebruikt voor voedselproductie en bodemverbetering.De wereldwijde expansie van NLL als gewas heeft veel pathogene schimmels aangetrokken, waaronder lupine anthracnose, die de verwoestende ziekte anthracnose veroorzaakt.Twee allelen, Lanr1 en AnMan, die verhoogde resistentie verlenen, zijn gebruikt bij NLL-veredeling, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend.In deze studie werden de Lanr1- en AnMan-markers gebruikt om Europese NLL-monsters te screenen.Testen van het vaccin in een gecontroleerde omgeving bevestigde de werkzaamheid van beide resistente donoren.Differentiële genexpressieprofilering werd uitgevoerd op representatieve resistente en gevoelige lijnen.Resistentie tegen anthracnose werd in verband gebracht met overexpressie van de genontologietermen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" en "GO:0015979 Photosynthesis".Bovendien vertoonde de Lanr1 (83A: 476) -lijn significante transcriptoomherprogrammering snel na inoculatie, terwijl de andere lijnen een vertraging van ongeveer 42 uur in deze respons vertoonden.Afweerreacties zijn geassocieerd met de TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- en NBS-LRR-genen, 10 eiwitten die betrokken zijn bij pathogenese, lipideoverdrachtseiwitten, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycinerijke celwandeiwitten en genen van reactief pad van zuurstof.Vroege reacties op 83A:476, waaronder zorgvuldige onderdrukking van genen geassocieerd met fotosynthese, vielen samen met succesvolle bescherming tijdens de vegetatieve groeifase van schimmelbiologie, wat suggereert dat een effector immuniteit veroorzaakt.De Mandeloop-reactie wordt vertraagd, evenals de algehele horizontale weerstand.
De smalbladige lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een eiwitrijk graan afkomstig uit het westelijke Middellandse Zeegebied1,2.Het wordt momenteel verbouwd als voedselgewas voor dieren en mensen.Het wordt ook beschouwd als groenbemester in vruchtwisselingssystemen vanwege de stikstofbinding door symbiotische stikstofbindende bacteriën en de algehele verbetering van de bodemstructuur.NLL heeft in de afgelopen eeuw een snel domesticatieproces doorgemaakt en staat nog steeds onder hoge kweekdruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Met de wijdverbreide teelt van NLL ontwikkelde de opeenvolging van pathogene schimmels nieuwe agrarische niches en veroorzaakte nieuwe gewasvernietigende ziekten. Het meest opmerkelijke voor lupinekwekers en -kwekers was het verschijnen van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opmerkelijke voor lupinekwekers en -kwekers was het verschijnen van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Controleer de werking van het apparaat en het gebruik van de wasmachine, of ызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opvallend voor lupineboeren en -kwekers was de opkomst van anthracnose veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。Het is een van de meest gebruikte soorten colletotrichum lupini (Bondar). Harig。1 Controleer de werking van het apparaat en de kosten van het onderhoud van het apparaat , вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opvallend voor lupinetelers en -kwekers is de opkomst van anthracnose veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De eerste meldingen van de ziekte kwamen uit Brazilië en de Verenigde Staten, met typische symptomen die respectievelijk in 1912 en 1929 optraden.Na ongeveer 30 jaar werd de ziekteverwekker echter aangeduid als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in het Engels. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in gerichte morfologie. & H.Schrenk,. & H.Schrenk, .en H.Schrenk. & H. 施伦克,。 & H. 施伦克,。en H. Schlenk, .Voorlopige fenotypering van de ziekte, uitgevoerd in het midden van de 20e eeuw, toonde enige resistentie in NLL en gele lupine (L. luteus L.) accessies, maar alle geteste witte lupine (L. albus L.) accessies waren zeer vatbaar15,16.Studies hebben aangetoond dat de ontwikkeling van anthracnose gepaard gaat met verhoogde neerslag (luchtvochtigheid) en temperatuur (tussen 12-28°C), wat leidt tot een schending van de weerstand bij hogere temperaturen17, 18. De tijd die conidia nodig heeft om te ontkiemen en de ziekte te beginnen, was zelfs vier keer korter bij 24°C (4 uur) dan bij 12°C (16 uur) bij hoge luchtvochtigheid19.Zo heeft de aanhoudende opwarming van de aarde geleid tot de verspreiding van anthracnose.De ziekte werd echter in Frankrijk (1982) en Oekraïne (1983) waargenomen als een voorbode van een dreigende dreiging, maar werd destijds blijkbaar genegeerd door de lupine-industrie20,21.Een paar jaar later verspreidde deze verwoestende ziekte zich over de hele wereld en trof ook grote lupineproducerende landen zoals Australië, Polen en Duitsland22,23,24.Na een uitbraak van anthracnose halverwege de jaren negentig resulteerde uitgebreide screening in de identificatie van verschillende resistente donoren in NLL19-monsters.NLL-resistentie tegen anthracnose wordt gecontroleerd door twee afzonderlijke dominante allelen die in verschillende kiemplasmabronnen worden aangetroffen: Lanr1 in cultivar Tanjil en Wonga en AnMan in cultivar.Mandalay 25, 26. Deze allelen vormen een aanvulling op de moleculaire markers die de selectie van resistent kiemplasma in fokprogramma's ondersteunen25,26,27,28,29,30.De resistente kweeklijn 83A:476 die het Lanr1-allel draagt, werd gekruist met de vatbare wilde lijn P27255 om een ​​RIL-populatie te verkrijgen die segregeerde voor anthracnoseresistentie, wat het mogelijk maakte om de Lanr1-locus toe te wijzen aan chromosoom NLL-1131, 32, 33. Uitlijning van koppelingskaartmarkers van flankerende resistentieloci naar anthracnose met een genomisch raamwerk, NLL onthulde de locatie van alle drie de allelen op hetzelfde chromosoom (NLL-11), maar in verschillende posities29,34,35.Vanwege het kleine aantal RIL's en de grote genetische afstand tussen markers en overeenkomstige allelen kunnen echter geen betrouwbare conclusies worden getrokken over hun onderliggende genen.Aan de andere kant is het gebruik van omgekeerde genetica bij lupinen moeilijk vanwege hun zeer lage regeneratiepotentieel, wat genetische manipulatie omslachtig maakt37.
De ontwikkeling van gedomesticeerd kiemplasma dat het gewenste allel in de homozygote toestand draagt, zoals 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), heeft de deur geopend voor het bestuderen van anthracnoseresistentie in het licht van de aanwezigheid van tegengestelde combinaties van allelen in wilde populaties.Mogelijkheden van moleculaire mechanismen.Vergelijk verdedigingsreacties gegenereerd door specifieke genotypen.Deze studie evalueerde de vroege transcriptoomrespons van NLL op C. lupini-vaccinatie.Eerst werd een Europees NLL-genplasmapanel met 215 lijnen gescreend met behulp van moleculaire markers die de Lanr1- en AnMan-allelen markeren.Anthracnose-fenotypering werd vervolgens uitgevoerd op 50 NLL-lijnen, eerder geselecteerd op moleculaire markers, onder gecontroleerde omstandigheden.Op basis van deze experimenten werden vier lijnen die verschillen in anthracnoseresistentie en Lanr1/AnMan-allelsamenstelling geselecteerd voor differentiële verdedigingsgenexpressieprofilering met behulp van twee complementaire benaderingen: high-throughput RNA-sequencing en real-time PCR-kwantificering.
Screening van een set NLL kiemplasma (N = 215) met markers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) toonde aan dat slechts één lijn (95726, nabij Salamanca-b) het "resistentie" allel voor alle markers versterkt, terwijl "Aanwezigheid van 'gevoelige' allelen" het aandeel van alle markers vond in 158 (~73,5 %) regels.Dertien lijnen produceerden twee "resistente" allelen van de Lanr1-marker en 8 lijnen produceerden "resistente" allelen van Lanr1.markeerstift.Het "resistentie" -allel van de AnMan-marker (aanvullende tabel S1).Twee lijnen waren heterozygoot voor de Anseq3-marker en één heterozygoot voor de AnManM1-marker.42 lijnen (19,5%) droegen tegengestelde fasen van de Anseq3- en Anseq4-allelen, wat wijst op een hoge frequentie van recombinatie tussen deze twee loci.Anthracnose-fenotypes onder gecontroleerde omstandigheden (aanvullende tabel S2) onthulden variabiliteit in de resistentie van de geteste genotypen, wat tot uiting kwam in de ernst van anthracnose.Verschillen in gemiddelde scores varieerden van 1,8 (matig resistent) tot 6,9 (vatbaar) en verschillen in plantgewicht varieerden van 0,62 (vatbaar) tot 4,45 g (resistent). Er was een significante correlatie tussen waarden waargenomen in twee replicaties van het experiment (0,51 voor ziekte-ernstscores, P = 0,00017 en 0,61 voor plantgewicht, P <0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,77, P <0,0001). Er was een significante correlatie tussen waarden waargenomen in twee replicaties van het experiment (0,51 voor ziekte-ernstscores, P = 0,00017 en 0,61 voor plantgewicht, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (- 0,59 en - 0,77, P < 0,0001). Het is belangrijk om de kosten van het gebruik van de wasmachine te controleren, om de kosten van het gebruik van de wasmachine te verhogen. эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 en 0,61 для массы растения, P < 0,0001), en также U kunt de kosten van het aantal (-0,59 en -0,77, Р < 0,0001) 0,0001) wijzigen. Er werd een significante correlatie gevonden tussen de waarden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor ziekte-ernstscores, P = 0,00017 en 0,61 voor plantgewicht, P < 0,0001), evenals tussen deze twee parameters (- 0,59 en -0,77, P < 0,0001) 0,0001).0,51 p = 0,00017 p = 0,00017 Vergelijking met 0,61, P < 0,0001) en met een gemiddelde van (- 0,59 en - 0,77, P < 0,0001).0.5 1 ， p = 0.00017 ， van 0.61 ， p <0.0001和– 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。 Het is belangrijk om de kosten van het gebruik van de wasmachines, de kosten voor het opslaan van de kosten стях (van 0,51, P = 0,00017 en 0,61 van 0,61, P <0,0001), en meer van de kosten waarden (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. Er was een significante correlatie tussen de waarden die in duplo werden waargenomen (ziekte-ernstscore 0,51, P = 0,00017 en plantgewicht 0,61, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Typische symptomen die worden waargenomen bij vatbare planten zijn onder meer knikken en draaien van de stengel die lijkt op een "herdersboog" -structuur, gevolgd door ovale laesies met oranje / roze sporozoïeten (aanvullende figuur 1).Australische accessies die de genen Lanr1 (83A: 476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) dragen, zijn matig resistent, 0,0331 en 0,0036).Sommige lijnen die ook "resistente" Lanr1- en/of AnMan-allelen dragen, vertonen symptomen van de ziekte.
Interessant is dat een paar NLL-lijnen zonder enig "resistent" markerallel een hoog niveau van anthracnoseresistentie onthulden (vergelijkbaar of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypes), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor score en 0,001 voor plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor score en niet-teken belangrijk voor het gewicht). Interessant is dat een paar NLL-lijnen zonder enig "resistent" markerallel een hoog niveau van anthracnoseresistentie onthulden (vergelijkbaar of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypes), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor score en 0,001 voor plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor score en niet-teken belangrijk voor het gewicht). Als u een NLL-programma gebruikt, kunt u het programma downloaden Als u de kosten van het programma wilt wijzigen, kunt u het beste van alles doen van Lanr1 en AnMan), van Boregine (P < 0,0001 procent van de waarde), Bojar (P < 0,0001 van de waarde) van 0,001 van de kosten) en van de B-549/79b (P <0,0001 van de waarden en van de laagste waarde) áссы). Interessant is dat verschillende NLL-lijnen zonder enig 'resistent' markerallel een hoge mate van resistentie tegen anthracnose vertoonden (vergelijkbaar met of hoger dan voor Lanr1- of AnMan-genotypes), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en 0,001 voor plantgewicht) en populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en niet significant voor gewicht).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P < 0.0001）、Bojar（P 值< 得分为0.0001，植物重量为0.00 1）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Het is interessant dat sommige NLL-systemen die geen "antigene" markers hebben een hoge horizontale resistentie vertonen (equivalent aan Lanr1- of AnMan-genen of hoger), zoals Boregine (beide parameters P < 0,0001), Bojar (P-waarde < 0,0001, plantgewicht 0,001) en stam B-549/79b (P-waarde < 0,0001, gewicht niet significant). Als u een NLL-programma gebruikt, kunt u het programma voor het downloaden van een «programma» downloaden. Er zijn verschillende functies voor het downloaden van apparaten (zoals een Lanr1 of AnMan), en Boregine (P-waarde van <0,0001), Bojar (P-waarde van <0,0001, maximale waarde van 0,001) en meer B-549/79b (P-waarde <0,0001, vrij vertaald). Interessant is dat sommige NLL-lijnen zonder 'resistentie'-markerallelen hoge niveaus van anthracnoseresistentie vertoonden (vergelijkbaar met of hoger dan Lanr1- of AnMan-genotypes), zoals Boregine (P-waarde voor beide parameters <0,0001), Bojar (P-waarde <0,0001, plantgewicht 0,001) en populatie B-549/79b (P-waarde <0,0001, gewicht niet significant).Dit fenomeen suggereert de mogelijkheid van een nieuwe genetische bron van resistentie, wat het waargenomen gebrek aan correlatie tussen markergenotypes en ziektefenotypes verklaart (P-waarden van ~0,42 tot ~0,98).Zo toonde de Kolmogorov-Smirnov-test aan dat de gegevens over anthracnoseresistentie ongeveer normaal verdeeld waren voor scores (P-waarden 0,25 en 0,11) en plantenmassa (P-waarden 0,47 en 0,55), wat suggereert dat ik vermoed dat er meer allelen dan Lanr1 en AnMan bij betrokken zijn.
Op basis van de resultaten van anthracnoseresistentiescreening werden 4 lijnen geselecteerd voor transcriptoomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup en Population 22660. Deze lijnen werden opnieuw getest op miltvuurresistentie in inoculatie-experimenten door middel van RNA-sequencing, op voorwaarde dat ze hetzelfde waren als in de vorige test.De scorewaarden waren als volgt: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) en populatie 22660 (6,11 ± 1,29).
Het Illumina NovaSeq 6000-protocol bereikte een gemiddelde van 40,5 Mread-paren per monster (29,7 tot 54,4 Mreads) (aanvullende tabel S3).Afstemmingsscores in de referentiereeks varieerden van 75,5% tot 88,6%.De gemiddelde correlatie van gelezen telgegevens tussen experimentele varianten tussen biologische replicatieonderzoeken varieerde van 0,812 tot 0,997 (gemiddeld 0,959). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie en de andere 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie en de andere 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Ongeveer 35 170 jaar geleden 2917 met een aantal van 4785 jaar geleden zet de machine op de juiste waarde (volgorde <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde <5).van 35.170 jaar geleden, van 2917 tot 2917, van 4785 jaar geleden.值< 5）。35.170 van 35 170 проанализированных 2917 met 4785 генов имели незна чительную экспрессию (volgens pagina <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen werden er 2917 niet tot expressie gebracht en de resterende 4785 genen hadden een verwaarloosbare expressie (basisgemiddelde <5).Het aantal genen dat tijdens het experiment tot expressie werd gebracht (basisgemiddelde ≥ 5) was dus 27.468 (78, 1%) (aanvullende tabel S4).
Vanaf het eerste tijdstip reageerden alle NLL-lijnen op de inoculatie van C. lupini (stam Col-08) door het transcriptoom te herprogrammeren (Tabel 1), maar er werden significante verschillen waargenomen tussen de lijnen.De weerstandslijn 83A:476 (die het Lanr1-gen draagt) vertoonde dus significante herprogrammering van het transcriptoom op het eerste tijdstip (6 hpi) met een 31-69-voudige toename van het aantal geïsoleerde op- en neerwaartse genen in vergelijking met andere tijdstippen op dit tijdstip.Bovendien was deze piek van korte duur, aangezien de expressie van slechts een paar genen significant veranderd bleef op het tweede tijdstip (12 hpi).Interessant is dat Boregine, dat ook een hoge mate van resistentie vertoonde in de transplantaattest, tijdens het experiment niet zo'n massale transcriptionele herprogrammering onderging.Het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) was echter hetzelfde voor Boregine en 83A:476 bij 12 HPI.Zowel Mandelup als populatie 22660 vertoonden DEG-pieken op het laatste tijdstip (48 l/s), wat wijst op een relatieve vertraging in verdedigingsreacties.
Omdat 83A:476 massale transcriptoomherprogrammering onderging als reactie op C. lupini bij 6 HPI in vergelijking met alle andere lijnen, was ~91% van de DEG's die op dit tijdstip werden waargenomen afstammingsspecifiek (Fig. 1).Er was echter enige overlap in vroege reacties tussen onderzoekslijnen, aangezien respectievelijk 68,5%, 50,9% en 52,6% DEG in Boregine, Mandelup en populatie 22660 overlapten met die gevonden in 83A:476 op bepaalde tijdstippen.Deze DEG's waren echter goed voor slechts een klein deel (0,97–1,70%) van alle DEG's die momenteel worden gedetecteerd met 83A:476.Bovendien waren 11 DEG's van alle lijnen op dit moment coherent (aanvullende tabellen S4-S6), inclusief gemeenschappelijke componenten van afweerreacties van planten: lipideoverdrachtseiwit (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside-enzym (TanjilG_23384), twee stress-induceerbare eiwitten zoals SAM22 (TanjilG_31528 en TanjilG_31531), basisch latexeiwit ( TanjilG_32352), en twee glycinerijke structurele celwandeiwitten (TanjilG_19701 en TanjilG_19702).Er was ook een relatief hoge overlap in transcriptoomresponsen tussen 83A:476 en Boregine bij 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tussen Mandelup en Populatie 22660 bij 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram dat het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) toont in lijnen van smalbladige lupine (NLL) geïnoculeerd met Colletotrichum lupini (stam Col-08 verkregen uit lupinevelden in Wierzhenice, Polen, 1999).De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, drager van het Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, drager van het AnMan-allel) en populatie 22660 (zeer vatbaar).De afkorting hpi staat voor uren na vaccinatie.Nulwaarden zijn verwijderd om de grafiek te vereenvoudigen.
De set van tot overexpressie gebrachte genen bij 6 hpi werd geanalyseerd op de aanwezigheid van canonieke R-gendomeinen (aanvullende tabel S7).Deze studie onthulde alleen transcriptoominductie van klassieke ziekteresistentiegenen met NBS-LRR-domeinen op 83A:476.Deze set bestond uit één TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), vijf CC-NBS-LRR-genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 en tanjilg_16162), en vier NBS-LR, Tanjilg_16162) en vier NBS-LRRE (tanjilg_16162) evenals Vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) en Vier NBS-LRR (TANJILG_16162).Al deze genen hebben canonieke domeinen die zijn gerangschikt in geconserveerde sequenties.Naast de NBS-LRR-domeingenen werden verschillende RLL-kinasen geactiveerd bij 6 hpi, namelijk één in Boregine (TanjilG_19877), twee in Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en in populatie 22660 (TanjilG_09014 en TanjilG_10361) en twee in 83A 27:47 6.
Genen met significant veranderde expressie als reactie op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) werden onderworpen aan Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse (aanvullende tabel S8). De meest oververtegenwoordigde biologische procesterm was "GO: 0006952 verdedigingsrespons" die verscheen in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties met hoge significantie (P-waarde <0, 001) (Fig. 2). De meest oververtegenwoordigde biologische procesterm was "GO: 0006952 verdedigingsrespons" die verscheen in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties met hoge significantie (P-waarde <0, 001) (Fig. 2). Vraag het volgende aan als u een e-mail wilt sturen naar «GO: 0006952 защит Als je eenmaal klaar bent, kun je tussen de 6 en 16 (uit × линия) van het scherm naar de tegen P <0,001) (punt 2). De meest oververtegenwoordigde biologische procesterm was 'GO: 0006952 verdedigingsrespons', die verscheen in 6 van de 16 (tijd × afstamming) combinaties met hoge significantie (P-waarde <0, 001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 De meest representatieve biologische procesterm is "GO:0006952 verdedigingsreactie", die voorkomt in 6 van de 16 (时间×线) combinaties, met hoge significantie (P-waarde < 0,001) (图2) . Klik op de knop «GO: 0006952 Defense Response», of van 6 naar 16 комбинаций (время × линия) met высокой значимостью (P <0,001) (р en 2). De meest oververtegenwoordigde biologische procesterm was 'GO:0006952 Defense Response', die verscheen in 6 van de 16 combinaties (tijd × lijn) met hoge significantie (P-waarde <0,001) (fig. 2).Deze term was oververtegenwoordigd op twee tijdstippen in 83A: 476 en Boregine (6 en 24 hpi) en op een bepaald tijdstip in Mandelup en Population 22660 (respectievelijk 12 en 6 hpi).Dit is een verwacht resultaat, wat de antischimmelreactie van de resistente lijnen benadrukt.Bovendien reageerde 83A:476 op C. lupini door snel genen te induceren die verband houden met de oxidatieve uitbarsting die wordt weergegeven door de term "GO:0055114 redoxproces", wat duidt op een specifieke afweerreactie, terwijl Boregine specifieke afweerreacties onthulde, gerelateerd aan de term 'GO'.:0006950 Stressreactie”.Populatie 22660 activeerde de horizontale resistentierespons waarbij secundaire metabolieten betrokken waren, wat het buitensporige aantal termen "GO:0016104 Proces van triterpeenbiosynthese" en "GO:0006722 Proces van triterpeenmetabolisme" benadrukte (beide termen behoren tot dezelfde reeks genen), rekening houdend met de resultaten van de GO-termverrijkingsanalyse, was de Mandelup-reactiestabiliteit tussen Boregine en Populatie 22660. Bovendien vroege reactie 83 A: 476 (6 hpi) en vertraagde reactie Mandelup en Population 22660 bevatten de term GO: 0015979 'fotosynthese' en andere gerelateerde biologische processen.
De termen voor bioprocesgenontologie die zijn geselecteerd in de annotatie van differentieel tot expressie gebrachte genen tijdens transcriptoomreacties van smalbladige lupine (NLL) geïnoculeerd met miltvuurlupine (Col-08-stam verkregen uit lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999) zijn sterk overdreven.De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel) en populatie 22660 (vatbaar).
Omdat deze studie gericht was op het identificeren van genen die bijdragen aan anthracnoseresistentie, werden de genen die waren toegewezen aan de termen GO "GO: 0006952 Defensive responses" en "GO: 0055114 Redoxprocessen" geanalyseerd met cut-offs aangezien basislijngemiddelden ≥ 30 met ten minste één regel.× tijdstip dat statistisch significante waarden van log2 combineert (vouwverandering).Het aantal genen dat aan deze criteria voldeed was 65 voor GO:0006952 en 524 voor GO:0055114.
83A:476 onthulde twee DEG-pieken geannoteerd met de term GO:0006952, de eerste bij 6 genen per inch (64 genen, opwaartse en neerwaartse regulatie) en de tweede bij 24 genen per inch (15 genen, alleen opwaartse regulatie).Boregine toonde ook aan dat GO:0006952 piekte op hetzelfde tijdstip, maar met minder DEG (11 en 8) en preferentiële activering.Mandeloop vertoonde twee pieken van GO:0006952 bij 12 en 48 HPI, beide met 12 genen (de eerste met activerende genen en de tweede met alleen onderdrukkende genen), terwijl de 22660-populatie bij 6 HPI (13 genen) een grotere overheersing had van de stijgingspiek.regulatie.Opgemerkt moet worden dat 96,4% van GO:0006952 DEG in deze pieken hetzelfde type respons had (omhoog of omlaag), wat wijst op een significante overlap in afweerreacties ondanks verschillen in het aantal betrokken genen.De grootste groep sequenties gerelateerd aan de term GO:0006952 codeert voor de Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-achtig), die behoort tot de klasse 10 pathogenese-geassocieerde proteïne (PR-10) eiwitclade en de kernproteïnelatex.vergelijkbaar (MLP-achtig) eiwit) eiwit (fig. 3).De twee groepen verschilden in de aard van de expressie en de richting van de reactie.De genen die coderen voor SAM22-achtige eiwitten vertoonden consistente en significante inductie op vroege tijdstippen (6 of 12 hpi) en reageerden over het algemeen niet aan het einde van het experiment (48 hpi), terwijl MLP-achtige eiwitten coördinatie vertoonden bij 6 hpi.hpi.83A:476 en Mandelup met 48 pk/in, bijna alle andere gegevenspunten reageerden niet.Bovendien volgden verschillen in expressieprofielen van SAM22-achtige eiwitgenen de waargenomen variabiliteit in anthracnoseresistentie, aangezien meer resistente lijnen meer tijdspunten hadden die deze genen significant induceren dan meer gevoelige genen.Een ander LlR18A/B-achtig PR-10-gen vertoonde een zeer vergelijkbaar expressiepatroon als het SAM22-achtige eiwitgen.
De belangrijkste componenten van de biologische procesterm "GO:0006952 Defense Response" en de expressiepatronen van kandidaat-genen van de Lanr1- en AnMan-allelen werden geïdentificeerd.De Log2-schaal vertegenwoordigt log2-waarden (vouwverandering) tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden, Wizhenica, Polen, 1999) en controle (sham-geïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip.De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
Bovendien werden de expressieprofielen van RNA-seq-kandidaatgenen Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) geëvalueerd (Fig. 3).Het TanjilG_05042-gen vertoonde een significante respons (activering) bij 83A:476 alleen op het eerste tijdstip (6 hpi), terwijl TanjilG_12861 alleen significant was in Mandeloop op twee tijdstippen: 6 hpi (neerwaartse regulatie) en 24 hpi (6 hpi).Met.).verstelbaar) ).
De meest tot overexpressie gebrachte genen in de term GO: 0055114 "redoxproces" waren genen die coderen voor cytochroom P450-eiwitten en peroxidase (Fig. 4).Voor monsters geïsoleerd uit 83A:476 bij 6 HPI, werden over het algemeen maximale of minimale log2 (voudige verandering) waarden (voor 86,6% van de genen) waargenomen tussen geïnoculeerde en controleplanten, wat de hoge respons van dit genotype op inoculerende seks benadrukt.83A:476 toonde de meest significante GO: 0055114 DEG bij 6 hpi (503 genen), terwijl de rest van de lijnen bij 48 hpi (Boregine, 31 genen; Mandelup, 85 genen; en Populatie 22660, 78 genen)).In de meeste genen van de GO:0055114-familie werden twee soorten reacties op vaccinatie waargenomen (activering en remming).Interessant is dat tot 97,6% van de DEG's geïdentificeerd voor de term GO: 0055114 in Mandelupe bij 48 pk. Deze waarnemingen suggereren dat, ondanks de aanzienlijk kleinere schaal (dwz het aantal gemuteerde redoxgenen, 85 versus 503), het patroon van vertraagde transcriptoomreacties van mandeloup op anthracnose is vergelijkbaar met de vroege reactie van 83A: 476.In Boregine en Populatie 22660 is deze convergentie lager met respectievelijk 51,6% en 75,6%.
De uitdrukkingspatronen van de belangrijkste componenten van de term van het biologische proces "GO:0055114 Redoxproces" werden onthuld.De Log2-schaal vertegenwoordigt log2-waarden (vouwverandering) tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden, Wizhenica, Polen, 1999) en controle (sham-geïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip.De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
83A:476 Transcriptomische reacties op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) omvatten ook gecoördineerde uitschakeling van genen toegeschreven aan de term GO:0015979 "fotosynthese" en andere verwante biologische processen (FIG. 5).Deze GO:0015979 DEG-set bevatte 105 genen die significant werden onderdrukt bij 6 hpi bij 83A:476.In deze subset werden 37 genen ook neerwaarts gereguleerd in Mandelup op 48 HPI en 35 op hetzelfde tijdstip in de populatie van 22660, inclusief 19 DEG's die beide genotypen gemeen hebben.Er zijn geen DEG's gerelateerd aan term GO: 0015979 significant geactiveerd in welke combinatie dan ook (regel x tijd).
De uitdrukkingspatronen van de belangrijkste componenten van de term van het biologische proces "GO:0015979 Fotosynthese" werden onthuld.De Log2-schaal vertegenwoordigt log2-waarden (vouwverandering) tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden, Wizhenica, Polen, 1999) en controle (sham-geïnoculeerde) planten op hetzelfde tijdstip.De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel) en Populatie 22660 (gevoelig).
Op basis van de resultaten van differentiële expressie-analyse en vermoedelijk betrokken bij afweerreacties tegen pathogene schimmels, werd deze set van zeven genen geselecteerd voor kwantificering van expressieprofielen door middel van real-time PCR (aanvullende tabel S9).
Het vermeende eiwitgen TanjilG_10657 werd significant geïnduceerd in alle bestudeerde lijnen en tijdstippen in vergelijking met controle (nabootsende) planten (aanvullende tabellen S10, S11).Bovendien vertoonde het expressieprofiel van TanjilG_10657 voor alle lijnen een stijgende trend in de loop van het experiment.Populatie 22660 vertoonde de hoogste gevoeligheid van TanjilG_10657 voor inoculatie met 114-voudige activering en het hoogste relatieve expressieniveau (4,4 ± 0,4) bij 24 HPI (figuur 6a).Het PR10 LlR18A-eiwitgen TanjilG_27015 vertoonde ook activering over alle lijnen en tijdstippen, met statistische significantie op de meeste datapunten (figuur 6b).Vergelijkbaar met TanjilG_10657, werd het hoogste relatieve expressieniveau van TanjilG_27015 waargenomen in de 22660 geïnoculeerde populatie bij 24 HPI (19,5 ± 2,4).Het zure endochitinase-gen TanjilG_04706 was significant opgereguleerd in alle lijnen en op alle tijdstippen behalve Boregine 6 hpi (figuur 6c).Het werd sterk geïnduceerd op het eerste tijdstip (6 HPI) bij 83A:476 (met 10,5 keer) en matig verhoogd in andere lijnen (met 6,6-7,5 keer).Tijdens het experiment bleef de expressie van TanjilG_04706 op vergelijkbare niveaus in 83A:476 en Boregine, terwijl deze in Mandelup en Population 22660 aanzienlijk toenam en relatief hoge waarden bereikte (respectievelijk 5,9 ± 1,5 en 6,2 ± 1,5).Het endoglucan-1,3-β-glucosidase-achtige gen TanjilG_23384 vertoonde hoge activering op de eerste twee tijdstippen (6 en 12 hpi) in alle lijnen behalve populatie 22660 (figuur 6d).De hoogste relatieve expressieniveaus van TanjilG_23384 werden waargenomen op het tweede tijdstip (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) en 83A:476 (1,5 ± 0,1).Bij 24 HPI was de TanjilG_23384-expressie relatief laag in alle bestudeerde lijnen (van 0,04 ± 0,009 tot 0,44 ± 0,12).
Expressieprofielen van geselecteerde genen (ag) onthuld door kwantitatieve PCR.De cijfers 6, 12 en 24 staan ​​voor uren na vaccinatie.De LanDExH7- en LanTUB6-genen werden gebruikt voor normalisatie en LanTUB6 werd gebruikt voor kalibratie tussen series.Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie op basis van drie biologische replica's, die elk het gemiddelde zijn van drie technische replica's. De statistische significantie van verschillen in de expressieniveaus tussen de geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit het lupineveld in Wierzenica, Polen) en controle (nep-geïnoculeerde) planten zijn aangegeven boven gegevenspunten (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). De statistische significantie van verschillen in de expressieniveaus tussen de geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit het lupineveld in Wierzenica, Polen) en controle (nep-geïnoculeerde) planten zijn aangegeven boven gegevenspunten (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш van Col-08, geboren in 1999, met een releasedatum in het land, China) en andere (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 uit een lupineveld in Wierzhenice, Polen) en controle (sham-geïnoculeerde) planten worden vermeld boven de datapunten (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 (colletotrichum lupini, color-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штам In Col-08, die is gepubliceerd in de Verenigde Staten, in 1999 en in de Verenigde Staten (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значен ие ≤ 0,001). Statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Verzhenice, Polen, in 1999) en controle (sham-geïnoculeerde) planten worden vermeld boven de datapunten (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond) en populatie 22660 (vatbaar).
Het kandidaat-gen TanjilG_05042 op de Lanr1-locus vertoonde een duidelijk ander expressiepatroon dan de profielen verkregen uit RNA-seq-onderzoeken (figuur 6e).Significante activering van dit gen werd waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie (respectievelijk tot 39,7 en 11,7 keer), resulterend in relatief hoge expressieniveaus (respectievelijk tot 1,4 ± 0,14 en 7,2 ± 1,3).83A:476 onthulde ook enige opwaartse regulatie van het TanjilG_05042-gen (tot 3,8-voudig), maar de bereikte relatieve expressieniveaus (0,044 ± 0,002) waren meer dan 30-voudig lager dan die waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie.geanalyseerd door qPCR vertoonden significante verschillen in expressieniveaus tussen genotypen in nep-gevaccineerde (controle) varianten, waarbij een 58-voudig verschil werd bereikt tussen populaties 22660 en 83A:476, evenals tussen populaties 22660 en 22660. Een tweevoudig verschil werd bereikt tussen Boregine en Mandalup.
Het kandidaat-gen op de AnMan-locus, TanjilG_12861, werd geactiveerd als reactie op vaccinatie in 83A:476 en Mandelup, was neutraal in de 22660-populatie en werd neerwaarts gereguleerd in Boregine (figuur 6f).De relatieve expressie van het TanjilG_12861-gen was het hoogst in geïnoculeerd 83A: 476 (0,14 ± 0,01).Het 17,4 kDa klasse I heat shock-eiwitgen TanjilG_05080 HSP17.4 vertoonde lagere relatieve expressieniveaus in alle bestudeerde stammen en tijdstippen (Fig. 6g).De hoogste waarde werd waargenomen bij 24 HPI in de 22660 populatie (0,14 ± 0,02, een achtvoudige toename in reactie op vaccinatie).
Vergelijking van genexpressieprofielen (figuur 7) onthulde een hoge correlatie tussen TanjilG_10657 en vier andere genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) en TanjilG_04706 (r = 0,79).Dergelijke resultaten kunnen duiden op co-regulatie van deze genen tijdens afweerreacties.De genen TanjilG_12861 en TanjilG_23384 vertoonden verschillende expressieprofielen met lagere Pearson-correlatiecoëfficiëntwaarden (respectievelijk van 0,08 tot 0,43 en -0,19 tot 0,28) in vergelijking met andere genen.
Correlaties tussen genexpressieprofielen werden gedetecteerd met behulp van kwantitatieve PCR.De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, drager van het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, drager van het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend) en Populatie 22660 (gevoelig).Er werden drie tijdstippen berekend (6, 12 en 24 uur na inoculatie), inclusief geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen uit lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999) en controle (sham-geïnoculeerde) planten.De schaal toont de waarde van de Pearson-correlatiecoëfficiënt.
Op basis van gegevens verkregen met 6 pk per inch, werd WGCNA uitgevoerd op 9981 ° geïdentificeerd door geïnoculeerde en controleplanten te vergelijken om zich te concentreren op vroege afweerreacties (aanvullende tabel S12).Tweeëntwintig genmodules (clusters) werden gevonden met gecorreleerde (positieve of negatieve) expressieprofielen tussen genotypen en experimentele varianten. Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker in controleplanten). Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker in controleplanten). In de buurt van de stad 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (vanaf вариантах, Als u dit doet, moet u het apparaat opnieuw installeren). Genexpressieniveaus daalden gemiddeld in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker in controleplanten).83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populatie 22660 的 顺序 下降 (， 在 种 中 ， 这 种 在。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 In de buurt van de stad 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 bij het openen van het apparaat). Genexpressieniveaus daalden gemiddeld in de serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in beide varianten was deze trend echter sterker in controleplanten).Vaccinatie resulteerde in opregulatie van genexpressie, vooral in modules 18, 19, 14, 6 en 1 (in afnemende volgorde van effect), negatieve regulatie (bijv. modules 9 en 20) of met neutrale effecten (bijv. modules 11, 22, 8 en 13).GO-termverrijkingsanalyse (aanvullende tabel S13) onthulde "GO: 0006952 beschermende reacties" voor de geïnoculeerde module (18) met maximale activering, inclusief genen geanalyseerd door qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015), evenals vele Inoculate meest onderdrukte fotosynthesemodules (9).Module 18-concentrator (Fig. 8) werd geïdentificeerd als het TanjilG_26536-gen dat codeert voor het PR-10-achtige LlR18B-eiwit, en module 9-concentrator werd geïdentificeerd als het TanjilG_28955-gen dat codeert voor het fotosysteem II PsbQ-eiwit.Een kandidaat-antracnoseresistentiegen Lanr1, TanjilG_05042, werd gevonden in module 22 (Fig. 9) en wordt geassocieerd met de termen "GO:0044260 Cellulaire macromoleculaire metabole processen" en "GO:0006355 Transcriptionele regulatie, DNA-templating" met de TanjilG_01212-hub.het gen codeert voor hittestress-transcriptiefactor A-4a (HSFA4a).
Gewogen netwerkanalyse van gen-co-expressie van modules met oververtegenwoordigde biologische procestermen "GO: 0006952 Defensiereacties".Ligatie werd vereenvoudigd om de vier genen te markeren die werden geanalyseerd door qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015).
Gewogen netwerkanalyse van genco-expressie van een module met een oververtegenwoordigde biologische procesterm "GO: 0006355: Transcriptionele regulatie, DNA-templating" en die een kandidaat-antracnoseresistentiegen Lanr1 TanjilG_05042 draagt.Ligatie werd vereenvoudigd om het TanjilG_05042-gen en het centrale TanjilG_01212-gen te isoleren.
Anthracnose-resistentiescreening verzameld in Australië toonde aan dat de meeste vroeg uitgezette cultivars vatbaar waren;Kalya, Coromup en Mandelup zijn beschreven als matig resistent, terwijl Wonga, Tanjil en 83A:476 zijn beschreven als zeer resistent26,27,31.had hetzelfde resistentie-allel, genaamd Lanr1, en Coromup en Mandelup hadden een ander allel, genaamd AnMan10, 26, 39, terwijl Kalya een ander allel doorgaf., Lanr2.Screening op anthracnoseresistentie in Duitsland resulteerde in de identificatie van een resistente lijn Bo7212 met een kandidaat-allel anders dan Lanr1, genaamd LanrBo36.
Onze studie onthulde een zeer lage frequentie (ongeveer 6%) van het Lanr1-allel in het geteste kiemplasma.Deze waarneming komt overeen met de resultaten van het screenen van Oost-Europees kiemplasma met behulp van de Anseq3- en Anseq4-markers, waaruit bleek dat het Lanr1-allel slechts in twee Wit-Russische lijnen aanwezig is.Dit suggereert dat het Lanr1-allel nog niet veel wordt gebruikt door lokale fokprogramma's, in tegenstelling tot Australië, waar het een van de belangrijkste allelen is voor marker-ondersteund fokken.Dit kan te wijten zijn aan het lagere resistentieniveau van het Lanr1-allel in Europese veldomstandigheden in vergelijking met het Australische rapport.Bovendien hebben onderzoeken naar anthracnose in gebieden met veel regenval in Australië aangetoond dat resistentiereacties gemedieerd door het Lanr1-allel mogelijk niet effectief zijn in weersomstandigheden die de groei en snelle ontwikkeling van de ziekteverwekker bevorderen19,42.In de huidige studie werden zelfs enkele symptomen van anthracnose waargenomen in genotypen die het Lanr1-allel dragen, wat suggereert dat resistentie kan verdwijnen onder optimale omstandigheden voor de ontwikkeling van C. lupini.Bovendien zijn vals-positieve interpretaties van de aanwezigheid van Anseq3- en Anseq4-markers, die ongeveer 1 cM van de Lanr1-locus verwijderd zijn, mogelijk 28,30,43.
Onze studie toonde aan dat 83A:476, met het Lanr1-allel, reageerde op C. lupini-inoculatie met grootschalige transcriptoomherprogrammering op het eerste geanalyseerde tijdstip (6 hpi), terwijl in Mandelup, met het AnMan-allel, transcriptomische responsen veel later werden waargenomen.(van 24 tot 48 pk).Deze temporele variaties in afweerreacties worden geassocieerd met verschillen in ziektesymptomen, wat het belang benadrukt van vroege herkenning van pathogenen voor een succesvolle reactie op resistentie.Om plantenweefsel te infecteren, moeten miltvuursporen verschillende ontwikkelingsstadia op het gastheeroppervlak doorlopen, waaronder ontkieming, celdeling en vorming van een appressorium.Een aanhangsel is een infectieuze structuur die zich hecht aan het oppervlak van de gastheer en de penetratie in de gastheerweefsels vergemakkelijkt.Zo vertoonden sporen van C. gloeosporioides in erwtenextract de eerste deling van de kern na 75-90 minuten incubatie, de vorming van een kiembuis na 90-120 minuten en onderdrukking na 4 uur 45 .Mango C. gloeosporioides vertoonde meer dan 40% conidiale ontkieming na 3 uur incubatie en ongeveer 20% vorming van appressors na 4 uur.Het virulentie-geassocieerde CAP20-gen van C. gloeosporioides vertoonde transcriptionele activiteit in epifytvormende conidia na 3,5 uur incubatie in avocado-oppervlakwas met hoge concentraties CAP20-eiwit na 4 uur en 46 minuten.Evenzo werd de activiteit van melaninebiosynthesegenen in C. trifolii geïnduceerd tijdens een incubatie van 2 uur, gevolgd door de vorming van een appressorium na 1 uur.Studies van bladweefsels hebben aangetoond dat aardbeien die zijn geïnoculeerd met C. acutatum de eerste onderdrukking hebben bij 8 hpi, terwijl tomaten die zijn geïnoculeerd met C. coccodes de eerste onderdrukking hebben bij 4 hpi48,49.grotendeels consistent met de tijdschaal van Colletotrichum spp.besmettelijk proces.Snelle afweerreacties op 83A:476 suggereren betrokkenheid van plantresistentie- en effector-getriggerde immuniteitsgenen (ETI) in deze lijn, terwijl de vertraagde reacties van Mandelup de micro-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuniteitshypothese (MTI) 50 ondersteunen. Vroege reacties op 83A: 476 en Mandelup.De gedeeltelijke overlap tussen op- of neerwaarts gereguleerde genen in vertraagde respons ondersteunt ook dit concept, aangezien ETI vaak wordt beschouwd als een versnelde en verbeterde MTI-respons die culmineert in geprogrammeerde celdood op de plaats van infectie, bekend als anafylactische shock 51,52.
De meeste genen die worden toegeschreven aan de oververtegenwoordigde term Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" zijn de 11 homologen van het door stress geïnduceerde vasten boodschap 22-eiwit (vergelijkbaar met SAM22) en de zeven belangrijkste latex-eiwit-likes (MLP's).-achtige eiwitten 31, 34, 43 en 423 vertoonden sequentieovereenkomst.SAM22-achtige genen vertoonden een significante activatie die langer aanhield, met verhoogde niveaus van anthracnoseresistentie (83A:476 en Boregine).MLP-achtige genen werden echter alleen gedownreguleerd in lijnen die het kandidaat-resistentie-allel droegen (83A:476/Lanr1 bij 6 hpi en Mandelup/AnMan bij 24 hpi).Opgemerkt moet worden dat alle geïdentificeerde SAM22-achtige homologen afkomstig zijn uit een gencluster van ongeveer 105 kb, terwijl MLP-achtige genen afkomstig zijn uit afzonderlijke regio's van het genoom.Gecoördineerde activering van dergelijke SAM22-achtige genen werd ook gevonden in onze eerdere studie van NLL-resistentie tegen Diaporthetoxica-inoculatie, wat suggereert dat ze betrokken zijn bij de horizontale componenten van de afweerreactie.Deze conclusie wordt ook ondersteund door meldingen van een positieve reactie van SAM22-achtige genen op letsel of behandeling met salicylzuur, schimmelinductoren of waterstofperoxide.
Van MLP-achtige genen is aangetoond dat ze reageren op verschillende abiotische en biotische stress, waaronder bacteriële, virale en pathogene schimmelinfecties in veel plantensoorten55.De reactierichtingen op bepaalde interacties tussen planten en ziekteverwekkers varieerden van sterk toenemend (dwz tijdens aantasting van katoen met Verticillium dahliae) tot significant afnemend (dwz na infectie van appelboom met Alternaria spp.)56,57.Significante neerwaartse regulatie van het MLP-achtige 423-gen is waargenomen tijdens de verdediging van avocado's tegen F. niger-infectie en tijdens infectie van de appelboom Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola en Alternaria alternata zijn appelpathotypen58,59.Bovendien hadden appelcalli die het MLP-achtige 423-gen tot overexpressie brachten een lagere expressie van resistentie-geassocieerde genen en waren ze vatbaarder voor schimmelinfectie59.Na Fusarium oxysporum f werd het MLP-achtige 423-gen ook onderdrukt in resistent kiemplasma van gewone bonen.cn.Boneninfectie 60.
Andere leden van de PR-10-familie die in onze RNA-seq-studie werden geïdentificeerd, waren de LlR18A- en LlR18B-genen als reactie op opwaartse regulatie, evenals het opwaarts gereguleerde (1 gen) of neerwaarts gereguleerde (3 genen) gen voor het lipideoverdrachtseiwit DIR1..Bovendien benadrukt WGCNA het LlR18B-gen als een hub in deze module, dat zeer vatbaar is voor vaccinatie en verschillende beschermende responsgenen draagt.De LlR18A- en LlR18B-genen werden geïnduceerd in gele lupinebladeren als reactie op pathogene bacteriën, evenals in NLL-stengels na D. toxica-inoculatie, terwijl de rijsthomoloog van deze genen, RSOsPR10, snel werd geïnduceerd door een schimmelinfectie die vermoedelijk betrokken is bij de signaalroute van jasmonzuur53,61,62. Het DIR1-gen codeert voor niet-specifieke lipidetransporteiwitten die nodig zijn voor het ontstaan ​​van systemisch verworven resistentie (SAR).Met de ontwikkeling van beschermende reacties wordt het DIR1-eiwit getransporteerd van de focus van infectie door het floëem om SAR te induceren in verre organen.Interessant is dat het TanjilG_02313 DIR1-gen significant werd geïnduceerd op het eerste tijdstip in regels 84A:476 en populatie 22660, maar anthracnoseresistentie ontwikkelde zich alleen met succes in lijn 84A:476.Dit kan duiden op enige subfunctionalisatie van het DIR1-gen in NLL, aangezien de resterende drie homologen alleen reageerden op inoculatie in de 83A:476-lijn bij 6 hpi, en deze respons was naar beneden gericht.
In onze studie waren de meest voorkomende componenten die overeenkomen met het biologische proces genaamd "GO: 0055114 Redoxproces" cytochroom P450-eiwit, peroxidase, linolzuur 9S-/13S-lipoxygenase en 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuuroxidase.Bovendien definieert onze WGCNA de HSFA4a-homoloog als een hub die modules draagt, zoals de Lanr1-resistentiegenkandidaat TanjilG_05042.HSFA4a is een onderdeel van de redoxafhankelijke regulatie van nucleaire transcriptie in planten.
Cytochroom P450-eiwitten zijn oxidoreductasen die NADPH- en/of O2-afhankelijke hydroxyleringsreacties in het primaire en secundaire metabolisme katalyseren, waaronder het metabolisme van xenobiotica, evenals hormonen, vetzuren, sterolen, celwandcomponenten, biopolymeren en de biosynthese van beschermende verbindingen 69. In ons onderzoek werd de variabiliteit in cytochroom P450-functie van planten verminderd van -10,6 log2 (voudige verandering) tot 5. 7 vanwege een groot aantal gewijzigde homologen (37) en verschillen in responspatronen tussen specifieke genen, wat een opwaartse herziening weerspiegelt..Het zou zeer speculatief zijn om alleen RNA-seq-gegevens te gebruiken om de vermeende biologische functie van de NLL-genen in zo'n grote eiwitsuperfamilie op te helderen.Het is echter vermeldenswaard dat sommige cytochroom P450-genen geassocieerd zijn met verhoogde weerstand tegen pathogene schimmels of bacteriën, waaronder een bijdrage aan allergische reacties69,70,71.
Klasse III peroxidasen zijn multifunctionele plantenenzymen die betrokken zijn bij een breed scala aan metabolische processen tijdens de groei en ontwikkeling van planten, maar ook als reactie op omgevingsstress zoals zoutgehalte, droogte, hoge lichtintensiteit en aanval door pathogenen72.Peroxidasen zijn betrokken bij de interactie van verschillende plantensoorten met Anthracis, waaronder Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76.De respons is zeer snel, soms zelfs bij 4 HPI, voordat de schimmel het plantenweefsel binnendringt73.Het peroxidase-gen reageerde ook op D. toxica NLL-inoculatie.Naast hun typische functies om oxidatieve burst te reguleren of oxidatieve stress te elimineren, kunnen peroxidasen de groei van pathogenen verstoren door fysieke barrières te creëren op basis van celwandversterking tijdens lignificatie, subeenheid of verknoping van specifieke verbindingen.Deze functie kan in silico worden toegeschreven aan het TanjilG_03329-gen dat codeert voor een vermeend ligninevormend anionperoxidase dat significant werd opgereguleerd in onze studie in de 83A:476-resistente lijn bij 6 HPI, maar niet in andere stammen en tijdstippen die niet reageerden.
9S-/13S-lipoxygenase van linolzuur is de eerste stap in de oxidatieve route van de biosynthese van lipiden78.De producten van deze route hebben meerdere functies bij de afweer van planten, waaronder versterking van de celwand door de vorming van callose- en pectine-afzettingen, en regulering van oxidatieve stress door de productie van reactieve zuurstofspecies79,80,81,82,83.In de huidige studie was de expressie van linolzuur 9S-/13S-lipoxygenase veranderd in alle stammen, maar in de vatbare populatie 22660 heerste opwaartse regulatie op verschillende tijdstippen, terwijl in stammen die resistent Lanr1 en het AnMan-allel dragen, het de diversificatie benadrukt van de oxylipinelaag in beschermende miltvuurreacties tussen deze genotypen.
De 1-aminocyclopropaan-1-carboxylaatoxidase (ACO)-homoloog was significant opgereguleerd (9 genen) of gedownreguleerd (2 genen) wanneer geïnoculeerd met lupine.Op twee uitzonderingen na vonden al deze reacties plaats bij 6 pk.op 83A:476.De enzymatische reactie die wordt gemedieerd door ACO-eiwitten is de snelheidsbeperkende stap in de ethyleenproductie en is daarom sterk gereguleerd84.Ethyleen is een plantenhormoon dat verschillende rollen speelt bij het reguleren van de ontwikkeling van planten en de reactie op abiotische en biotische stressomstandigheden.De inductie van ACO-transcriptie en activering van de ethyleensignaleringsroute zijn betrokken bij het verhogen van de weerstand van rijst tegen de hemibiotrofe schimmel oryzae oryzae door de productie van reactieve zuurstofspecies en fytoalexinen te reguleren.Een zeer vergelijkbaar bladinfectieproces gevonden tussen M. oryzae en C. lupini88,89, tegen de achtergrond van een significante verhoging van ACO-homologen in de 83A:476-lijn die in deze studie wordt gerapporteerd, verschuift de mogelijkheid om resistentie tegen NLL-antracnose-ethyleen een signaalcentrale stap in moleculaire routes te verlenen .
In de huidige studie werd grootschalige onderdrukking van veel genen geassocieerd met fotosynthese waargenomen bij 6 hpi in 83A:476 en bij 48 hpi in Mandeloop en de 22660-populatie.De omvang en het verloop van deze veranderingen is evenredig met het niveau.In dit experiment werd anthracnoseresistentie waargenomen.Onlangs is sterke en vroege onderdrukking van fotosynthese-gerelateerde transcripten gerapporteerd in verschillende modellen van plant-pathogene interacties, waaronder pathogene bacteriën en schimmels.Haast (van 2 HPI in sommige interacties) en globale onderdrukking van genen geassocieerd met fotosynthese als reactie op infectie kan plantimmuniteit opwekken op basis van de inzet van reactieve zuurstofsoorten en hun interactie met de salicylzuurroute om allergische reacties te mediëren 90,94.
Concluderend, afweerreactiemechanismen die zijn voorgesteld voor de meest resistente afstamming (83A:476) omvatten snelle herkenning van pathogenen door het R-gen (vermoedelijk TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en door allergische reacties gemedieerde salicylzuur- en ethyleensignalering, gevolgd door het instellen van SAR op lange afstand.actie wordt ondersteund door het DIR-1-eiwit.Opgemerkt moet worden dat de biotrofe periode voor C. lupini-infectie zeer kort is (ongeveer 2 dagen), gevolgd door necrotische groei95.De overgang tussen deze stadia kan in verband worden gebracht met necrose en expressie van ethyleen-induceerbare eiwitten die fungeren als triggers voor overgevoeligheidsreacties in waardplanten.Daarom is het tijdvenster voor het succesvol vangen van C. lupini in het biotrofe stadium erg smal.De herprogrammering van genen geassocieerd met redox en fotosynthese waargenomen in 83A:476 bij 6 hpi is consistent met de progressie van schimmelhyfen en kondigt de ontwikkeling aan van een succesvolle beschermende respons in het biotrofe stadium.De transcriptomische reacties van Mandelup en de 22660-populatie zijn mogelijk te vertraagd om de schimmel te vangen voordat ze overgaan op necrotische groei, maar Mandelup is mogelijk effectiever dan de 22660-populatie omdat de relatief snelle regulatie van het PR-10-eiwit horizontale weerstand bevordert.
ETI, aangedreven door het canonieke R-gen, lijkt een algemeen mechanisme te zijn voor resistentie van bonen tegen anthracnose.In de modelpeulvrucht Medicago truncatula wordt resistentie tegen anthracnose dus verleend door het RCT1-gen, een lid van de TIR-NBS-LRR97 plant R-genklasse.Dit gen verleent ook breed-spectrum anthracnoseresistentie in luzerne wanneer het wordt overgebracht naar vatbare planten.In de gewone boon (P. vulgaris) zijn tot nu toe meer dan twee dozijn anthracnoseresistentiegenen geïdentificeerd.Sommige van deze genen worden gevonden in regio's zonder canonieke R-genen, maar vele andere bevinden zich aan de randen van chromosomen die het NBS-LRR-gencluster dragen, waaronder TIR-NBS-LRRs99.De genoombrede SSR-studie bevestigde ook de associatie van het NBS-LRR-gen met anthracnoseresistentie in de gewone boon.Het canonieke R-gen werd ook gevonden in het genomische gebied dat de belangrijkste anthracnose-resistentielocus in witte lupine 101 draagt.
Ons werk toont aan dat een onmiddellijke resistentiereactie, geactiveerd in een vroeg stadium van plantinfectie (bij voorkeur niet later dan 12 hpi), smalbladige lupine effectief beschermt tegen anthracnose veroorzaakt door de pathogene schimmel Collelotrichum lupini.Met behulp van sequencing met hoge doorvoer hebben we differentiële expressieprofielen van anthracnoseresistentiegenen in NLL-planten aangetoond, gemedieerd door de Lanr1- en AnMan-resistentiegenen.Succesvolle verdediging omvat het zorgvuldig ontwerpen van de genen voor eiwitten die betrokken zijn bij redox, fotosynthese en pathogenese binnen enkele uren na het eerste contact van de plant met een ziekteverwekker.Soortgelijke beschermende reacties, maar vertraagd in de tijd, zijn veel minder effectief in het beschermen van planten tegen ziekten.Miltvuurresistentie gemedieerd door het Lanr1-gen lijkt op de typische snelle respons van het R-gen (effector-getriggerde immuniteit), terwijl het AnMan-gen hoogstwaarschijnlijk een horizontale respons geeft (immuniteit veroorzaakt door een microbe-geassocieerd moleculair patroon), wat een matig niveau van duurzaamheid oplevert.
De 215 NLL-lijnen die werden gebruikt om te screenen op anthracnose-markers bestonden uit 74 cultivars, 60 lijnen verkregen door kruisen of fokken, 5 mutanten en 76 wilde of originele kiemplasma's.De lijnen kwamen uit 17 landen, voornamelijk uit Polen (58), Spanje (47), Duitsland (27), Australië (26), Rusland (19), Wit-Rusland (7), Italië (5) en andere lijnen.uit 10 landen.De set bevat ook referentieresistente lijnen: 83A:476, Tanjil, Wonga met het Lanr1-allel en Mandelup met het AnMan-allel.De lijnen zijn verkregen uit de European Lupine Genetic Resource Database die wordt onderhouden door Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (aanvullende tabel S1).
Planten werden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden (fotoperiode 16 uur, temperatuur overdag 25°C en 's nachts 18°C).Twee biologische replica's werden geanalyseerd.DNA werd geïsoleerd uit bladeren van drie weken oud met behulp van de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens het protocol.De kwaliteit en concentratie van het geïsoleerde DNA werd beoordeeld met spectrofotometrische methoden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS).De AnManM1-marker die het anthracnose-resistentiegen AnMan markeert (afgeleid van cv. Mandelup) en de markers Anseq3 en Anseq4 die het gen Lanr1 flankeren (afgeleid van cv. Tanjil) werden geanalyseerd 11,26,28.Homozygoten voor het resistente allel werden gescoord als "1", vatbaar - als "0", en heterozygoten - als 0,5.
Op basis van de resultaten van screening op markers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en de beschikbaarheid van zaden voor laatste vervolgexperimenten, werden 50 NLL-lijnen geselecteerd voor fenotypering van anthracnoseresistentie.De analyse is in tweevoud uitgevoerd in een computergestuurde kas met een fotoperiode van 14 uur bij een temperatuurbereik van 22°C overdag en 19°C 's nachts.Zaden worden gekrast (het zaadvlies aan de andere kant van het embryo wordt met een scherp mes afgesneden) voordat het wordt gezaaid om kiemrust te voorkomen doordat het zaadvlies te hard is en om een ​​uniforme kieming te garanderen.Planten werden gekweekt in potten (11 x 11 x 21 cm) met steriele grond (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen).Inoculatie werd uitgevoerd met de Colletotrichum lupini Col-08-stam, gekweekt in 1999 uit de stengels van smalbladige lupineplanten gekweekt in een veld in Verzjenitsa, Groot-Polen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Krijg een gebied.De isolaten werden gekweekt in SNA-medium bij 20°C onder zwart licht gedurende 21 dagen om sporulatie te induceren.Vier weken na het zaaien, toen de planten het 4-6-bladstadium hadden bereikt, werd geënt door besproeiing met een suspensie van conidia in een concentratie van 0,5 x 106 conidia per ml.Na inoculatie werden de planten 24 uur in het donker bewaard bij een vochtigheid van ongeveer 98% en een temperatuur van 25°C om de kieming van conidia en het infectieproces te vergemakkelijken.De planten werden vervolgens gekweekt onder een fotoperiode van 14 uur bij 22°C dag/19°C nacht en 70% vochtigheid.De ziektescore werd 22 dagen na inoculatie gemaakt en varieerde van 0 (immuun) tot 9 (zeer gevoelig), afhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van necrotische laesies op stengels en bladeren.Daarnaast werd na het scoren het gewicht van de planten gemeten.Relaties tussen markergenotypes en ziektefenotypes werden berekend als punt-twee-sequentiecorrelaties (afwezigheid van heterozygote markers in de reeks lijnen voor analyse van het anthracnoseresistentiefenotype).