Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Er is behoefte aan een betrouwbaar in vitro systeem dat nauwkeurig de fysiologische omgeving van het hart kan reproduceren voor het testen van geneesmiddelen.De beperkte beschikbaarheid van weefselkweeksystemen voor menselijk hart heeft geleid tot onnauwkeurige interpretaties van de effecten van geneesmiddelen op het hart.Hier hebben we een cardiaal weefselkweekmodel (CTCM) ontwikkeld dat elektromechanisch hartplakjes stimuleert en fysiologische rek ondergaat tijdens de systolische en diastolische fasen van de hartcyclus.Na 12 dagen kweken verbeterde deze benadering gedeeltelijk de levensvatbaarheid van hartsecties, maar behield hun structurele integriteit niet volledig.Daarom ontdekten we na screening op kleine moleculen dat de toevoeging van 100 nM triiodothyronine (T3) en 1 μM dexamethason (Dex) aan ons medium de microstructuur van de secties gedurende 12 dagen handhaafde.In combinatie met T3/Dex-behandeling handhaafde het CTCM-systeem gedurende 12 dagen transcriptieprofielen, levensvatbaarheid, metabolische activiteit en structurele integriteit op hetzelfde niveau als vers hartweefsel.Bovendien veroorzaakt overmatige uitrekking van hartweefsel in kweek hypertrofische cardiale signalering, wat bewijs levert voor het vermogen van CTCM om hypertrofische aandoeningen na te bootsen die worden veroorzaakt door hartstrekking.Concluderend kan CTCM de fysiologie en pathofysiologie van het hart gedurende lange tijd in cultuur modelleren, waardoor een betrouwbare screening van geneesmiddelen mogelijk wordt.
Voorafgaand aan klinisch onderzoek zijn betrouwbare in-vitrosystemen nodig die de fysiologische omgeving van het menselijk hart nauwkeurig kunnen reproduceren.Dergelijke systemen moeten veranderde mechanische rek, hartslag en elektrofysiologische eigenschappen nabootsen.Diermodellen worden vaak gebruikt als screeningsplatform voor cardiale fysiologie met beperkte betrouwbaarheid om de effecten van medicijnen in het menselijk hart weer te geven1,2.Uiteindelijk is het Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) een model dat zeer gevoelig en specifiek is voor verschillende therapeutische en farmacologische interventies, en dat de fysiologie en pathofysiologie van het menselijk hart nauwkeurig reproduceert3.De afwezigheid van een dergelijk systeem beperkt de ontdekking van nieuwe behandelingen voor hartfalen4,5 en heeft geleid tot cardiotoxiciteit van geneesmiddelen als een belangrijke reden om de markt te verlaten6.
In de afgelopen tien jaar zijn acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit het klinisch gebruik gehaald omdat ze verlenging van het QT-interval veroorzaken, wat leidt tot ventriculaire aritmieën en plotseling overlijden7.Er is dus een toenemende behoefte aan betrouwbare preklinische screeningstrategieën om de cardiovasculaire werkzaamheid en toxiciteit te beoordelen.Het recente gebruik van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPS-CM) bij het screenen van geneesmiddelen en het testen op toxiciteit biedt een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem.De onrijpe aard van hiPS-CM's en het gebrek aan meercellige complexiteit van hartweefsel zijn echter belangrijke beperkingen van deze methode.Recente studies hebben aangetoond dat deze beperking gedeeltelijk kan worden overwonnen door vroege hiPS-CM te gebruiken om hartweefselhydrogels te vormen kort na het begin van spontane contracties en geleidelijk toenemende elektrische stimulatie in de loop van de tijd.Deze hiPS-CM-microtissues missen echter de volwassen elektrofysiologische en contractiele eigenschappen van het volwassen myocardium.Bovendien heeft menselijk hartweefsel een complexere structuur, bestaande uit een heterogeen mengsel van verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en stromale fibroblasten, onderling verbonden door specifieke sets van extracellulaire matrixeiwitten.Deze heterogeniteit van niet-cardiomyocytenpopulaties11,12,13 in het volwassen zoogdierhart vormt een belangrijke barrière voor het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen.Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden voor het kweken van intact myocardweefsel onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Gekweekte dunne (300 µm) secties van het menselijk hart hebben bewezen een veelbelovend model te zijn van intact menselijk myocardium.Deze methode geeft toegang tot een compleet 3D meercellig systeem vergelijkbaar met menselijk hartweefsel.Tot 2019 was het gebruik van gekweekte hartsecties echter beperkt door de korte (24 uur) kweekoverleving.Dit is te wijten aan een aantal factoren, waaronder het gebrek aan fysiek-mechanische rek, de lucht-vloeistofinterface en het gebruik van eenvoudige media die de behoeften van hartweefsel niet ondersteunen.In 2019 hebben verschillende onderzoeksgroepen aangetoond dat het opnemen van mechanische factoren in cardiale weefselkweeksystemen de levensduur van de kweek kan verlengen, de cardiale expressie kan verbeteren en cardiale pathologie kan nabootsen.Twee elegante onderzoeken 17 en 18 laten zien dat uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het cardiale fenotype tijdens kweek.Deze onderzoeken maakten echter geen gebruik van de dynamische driedimensionale fysisch-mechanische belasting van de hartcyclus, aangezien hartsecties werden belast met ofwel isometrische trekkrachten 17 ofwel lineaire auxotone belasting 18 .Deze methoden van weefselstrekking resulteerden in de onderdrukking van veel hartgenen of de overexpressie van genen die geassocieerd zijn met abnormale rekreacties.Met name Pitoulis et al.19 ontwikkelde een dynamisch hartplakjes-kweekbad voor reconstructie van de hartcyclus met behulp van force transducer-feedback en spanningsaandrijvingen.Hoewel dit systeem een ​​nauwkeurigere in vitro modellering van de hartcyclus mogelijk maakt, beperkt de complexiteit en lage doorvoer van de methode de toepassing van dit systeem.Ons laboratorium heeft onlangs een vereenvoudigd kweeksysteem ontwikkeld met behulp van elektrische stimulatie en een geoptimaliseerd medium om de levensvatbaarheid van secties van varkens- en menselijk hartweefsel tot 6 dagen te behouden20,21.
In het huidige manuscript beschrijven we een cardiaal weefselkweekmodel (CTCM) met behulp van delen van het varkenshart die humorale aanwijzingen bevatten om driedimensionale cardiale fysiologie en pathofysiologische uitzetting tijdens de hartcyclus te recapituleren.Deze CTCM kan de nauwkeurigheid van de preklinische medicijnvoorspelling verhogen tot een niveau dat nog nooit eerder is bereikt door een kosteneffectief, mid-throughput hartsysteem te bieden dat de fysiologie/pathofysiologie van het zoogdierhart nabootst voor preklinische medicijntesten.
Hemodynamische mechanische signalen spelen een cruciale rol bij het in vitro handhaven van de cardiomyocytfunctie 22,23,24.In het huidige manuscript hebben we een CTCM ontwikkeld (figuur 1a) die de cardiale omgeving van een volwassene kan nabootsen door zowel elektrische als mechanische stimulatie te induceren bij fysiologische frequenties (1,2 Hz, 72 slagen per minuut).Om overmatige rek van het weefsel tijdens diastole te voorkomen, werd een 3D-printapparaat gebruikt om de weefselomvang met 25% te vergroten (figuur 1b).Elektrische stimulatie geïnduceerd door het C-PACE-systeem werd getimed om 100 ms vóór systole te starten met behulp van een data-acquisitiesysteem om de hartcyclus volledig te reproduceren.Het weefselkweeksysteem maakt gebruik van een programmeerbare pneumatische actuator (LB Engineering, Duitsland) om cyclisch een flexibel siliconenmembraan uit te zetten om uitzetting van de hartplakjes in de bovenste kamer te veroorzaken.Het systeem was aangesloten op een externe luchtleiding via een druktransducer, waardoor de druk (± 1 mmHg) en tijd (± 1 ms) nauwkeurig konden worden ingesteld (fig. 1c).
a Bevestig de weefselsectie aan de steunring van 7 mm, weergegeven in blauw, in de kweekkamer van het apparaat.De kweekkamer is gescheiden van de luchtkamer door een dun flexibel siliconenmembraan.Plaats een pakking tussen elke kamer om lekken te voorkomen.Het deksel van het apparaat bevat grafietelektroden die zorgen voor elektrische stimulatie.b Schematische weergave van het grote weefselapparaat, de geleidingsring en de steunring.De weefselcoupes (bruin) worden op het extra grote apparaat geplaatst met de geleidering in de groef aan de buitenrand van het apparaat.Plaats met behulp van de geleider voorzichtig de steunring die is gecoat met weefsel-acryllijm over het deel van het hartweefsel.c Grafiek die de tijd van elektrische stimulatie weergeeft als functie van de luchtkamerdruk die wordt geregeld door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD).Een apparaat voor gegevensverzameling werd gebruikt om elektrische stimulatie te synchroniseren met behulp van druksensoren.Wanneer de druk in de kweekkamer de ingestelde drempel bereikt, wordt een pulssignaal naar de C-PACE-EM gestuurd om elektrische stimulatie te activeren.d Afbeelding van vier CTCM's geplaatst op een plank in een incubator.Vier apparaten zijn aangesloten op één PPD via een pneumatisch circuit en er worden druksensoren in de hemostatische klep gestoken om de druk in het pneumatische circuit te bewaken.Elk apparaat bevat zes weefselcoupes.
Met behulp van een enkele pneumatische actuator konden we 4 CTCM-apparaten besturen, die elk 6 weefselsecties konden bevatten (figuur 1d).In CTCM wordt de luchtdruk in de luchtkamer omgezet in synchrone druk in de vloeistofkamer en induceert fysiologische uitzetting van de hartplak (figuur 2a en aanvullende film 1).Evaluatie van weefselrek bij 80 mm Hg.Kunst.vertoonde strekking van weefselsecties met 25% (Fig. 2b).Er is aangetoond dat dit percentage rek overeenkomt met een fysiologische sarcomeerlengte van 2,2–2,3 µm voor normale contractiliteit van het hartgedeelte17,19,25.Weefselbeweging werd beoordeeld met behulp van aangepaste camera-instellingen (aanvullend figuur 1).De amplitude en snelheid van weefselbeweging (Fig. 2c, d) kwamen overeen met rek tijdens de hartcyclus en tijd tijdens systole en diastole (Fig. 2b).Rek en snelheid van hartweefsel tijdens samentrekking en ontspanning bleven gedurende 12 dagen constant in kweek (Fig. 2f).Om het effect van elektrische stimulatie op contractiliteit tijdens kweek te evalueren, hebben we een methode ontwikkeld voor het bepalen van actieve misvorming met behulp van een schaduwalgoritme (aanvullende figuur 2a, b) en konden we onderscheid maken tussen misvormingen met en zonder elektrische stimulatie.Dezelfde sectie van het hart (fig. 2f).In het beweegbare deel van de snee (R6-9) was de spanning tijdens elektrische stimulatie 20% hoger dan bij afwezigheid van elektrische stimulatie, wat de bijdrage van elektrische stimulatie aan de contractiele functie aangeeft.
Representatieve sporen van luchtkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetingen bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofkamerdruk verandert, waardoor een overeenkomstige beweging van het weefselplakje ontstaat.b Representatieve sporen van procent rek (blauw) van weefselsecties die overeenkomen met procent rek (oranje).c De gemeten beweging van de cardiale plak komt overeen met de gemeten bewegingssnelheid.( d ) Representatieve trajecten van cyclische beweging (blauwe lijn) en snelheid (oranje stippellijn) in een deel van het hart.e Kwantificering van cyclustijd (n = 19 plakjes per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 19 plakjes per groep), relaxatietijd (n = 19 plakjes per groep, van verschillende varkens), weefselbeweging (n = 25).plakjes)/groep van verschillende varkens), systolische pieksnelheid (n = 24(D0), 25(D12) plakjes/groep van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n=24(D0), 25(D12) plakjes/groep van verschillende varkens).Tweezijdige Student's t-test toonde geen significant verschil in enige parameter.f Representatieve stamanalysesporen van weefselsecties met (rode) en zonder (blauwe) elektrische stimulatie, tien regionale gebieden van weefselsecties van dezelfde sectie.De onderste panelen tonen de kwantificering van het procentuele verschil in spanning in weefselsecties met en zonder elektrische stimulatie in tien gebieden van verschillende secties. (n = 8 plakken/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 plakken/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p <0,01, *p<0,05). (n = 8 secties/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 secties/groep, van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.
In ons vorige statische biomimetische hartplakkweeksysteem [20, 21] hebben we de levensvatbaarheid, functie en structurele integriteit van hartplakjes gedurende 6 dagen behouden door elektrische stimulatie toe te passen en de samenstelling van het medium te optimaliseren.Na 10 dagen daalden deze cijfers echter sterk.We zullen verwijzen naar secties gekweekt in ons vorige statische biomimetische kweeksysteem 20, 21 controleomstandigheden (Ctrl) en we zullen ons eerder geoptimaliseerde medium gebruiken als MC-omstandigheden en cultuur onder gelijktijdige mechanische en elektrische stimulatie (CTCM).genaamd .Eerst hebben we vastgesteld dat mechanische stimulatie zonder elektrische stimulatie onvoldoende was om de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende 6 dagen te behouden (aanvullende figuur 3a, b).Interessant is dat met de introductie van fysio-mechanische en elektrische stimulatie met behulp van STCM, de levensvatbaarheid van 12-daagse hartsecties hetzelfde bleef als in verse hartsecties onder MS-omstandigheden, maar niet onder Ctrl-omstandigheden, zoals blijkt uit MTT-analyse (Fig. 1).3a).Dit suggereert dat mechanische stimulatie en simulatie van de hartcyclus weefselsecties twee keer zo lang levensvatbaar kunnen houden als gerapporteerd in ons vorige statische kweeksysteem.Beoordeling van de structurele integriteit van weefselsecties door immunolabeling van cardiaal troponine T en connexine 43 toonde echter aan dat connexine 43-expressie significant hoger was in MC-weefsels op dag 12 dan in controles op dezelfde dag.De uniforme expressie van connexine 43 en de vorming van Z-schijven werden echter niet volledig gehandhaafd (figuur 3b).We gebruiken een raamwerk van kunstmatige intelligentie (AI) om de structurele integriteit van weefsels te kwantificeren26, een op afbeeldingen gebaseerde deep learning-pijplijn op basis van troponine-T- en connexinekleuring43 om automatisch de structurele integriteit en fluorescentie van hartplakjes te kwantificeren in termen van lokalisatiesterkte.Deze methode maakt gebruik van een convolutioneel neuraal netwerk (CNN) en een deep learning-raamwerk om de structurele integriteit van hartweefsel betrouwbaar te kwantificeren op een geautomatiseerde en onbevooroordeelde manier, zoals beschreven in de referentie.26. MC-weefsel vertoonde verbeterde structurele gelijkenis met dag 0 in vergelijking met statische controlesecties.Bovendien onthulde Masson's trichroomkleuring een significant lager percentage fibrose onder MS-omstandigheden in vergelijking met controleomstandigheden op dag 12 van de kweek (Fig. 3c).Hoewel CTCM de levensvatbaarheid van secties van hartweefsel op dag 12 verhoogde tot een niveau vergelijkbaar met dat van vers hartweefsel, verbeterde het de structurele integriteit van de secties van het hart niet significant.
een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartcoupes (D0) of hartcoupes gedurende 12 dagen in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, eenweg ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 in vergelijking met D12 Ctrl). een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartcoupes (D0) of hartcoupes gedurende 12 dagen in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, er wordt een ANOVA-test in één richting uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,0 1 vergeleken met D12 Ctrl).het histogram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid van MTT verse hartcoupes (D0) of cultuur van hartcoupes gedurende 12 dagen in statische kweek (D12-controle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-controle). ) ), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, een one-way ANOVA-test wordt uitgevoerd;####p < 0,0001 met D0 en **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12 van de MTT-serie), de D12 MC-camera en de D0-camera, ####p < 0,0001,与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ,来自不同猪的12 (D1 2 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试;与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)histogram dat de kwantificering van MTT-levensvatbaarheid toont in verse hartsecties (D0) of hartsecties gekweekt gedurende 12 dagen in statische kweek (D12-controle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-controle)), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, one-way ANOVA-test;####p < 0,0001 met D0, **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0, **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl).b Troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartsecties (D0) of hartsecties gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of CTCM-omstandigheden (MC) gedurende 12 dagen) van representatieve immunofluorescentiebeelden (blanco schaal = 100 µm). Kunstmatige intelligentie kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kunstmatige intelligentie kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakken/groep elk van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Het is mogelijk om de verschillende niveaus van de verschillende niveaus van de werking van de energie te bepalen (n = 7 (D0 ), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, однофакторный тест ANOVA; van D0 tot ****p < 0,0001 van D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel door kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groepen van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vs. met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) coupes/groep elk van verschillende varkens, one-way ANOVA-test; 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) coupes/groep elk van verschillende varkens, one-way ANOVA-test; 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Als u een van de volgende manieren van werken wilt gebruiken, is dit het geval (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) met ANOVA: ####p <0,0001 vs. D0 ля сравнения ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). Kunstmatige intelligentie om de structurele integriteit van hartweefsel te kwantificeren (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groep van elk van verschillende varkens, one-way ANOVA-test; ####p<0,0001 vs .D0 Ter vergelijking ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaal kaal = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep elk van een ander varken, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en *** p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaal bloot = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep elk van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test wordt uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *** p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Gebruik van het apparaat en het onderhoud van het apparaat, het apparaat х трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных U kunt de ANOVA gebruiken: #### p < 0,0001 met D0 en ***p < 0,001 met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (ongecoate schaal = 500 µm) (n = 10 secties/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *** p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson度 = 500 µm） （n = 10比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gebruik van het apparaat en het onderhoud van de wasmachine, het apparaat х трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от друго Hoe dan ook, het is mogelijk om de kosten van het onderzoek te verlagen; ### #p < 0,0001 van de waarde D0, ***p < 0,001 met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (blanco = 500 µm) (n = 10 secties/groep, elk van een ander varken, getest door eenzijdige variantieanalyse; ### # p < 0,0001 vergeleken met D0, *** p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl).Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.
Onze hypothese was dat door kleine moleculen aan het kweekmedium toe te voegen, de integriteit van de cardiomyocyten zou kunnen worden verbeterd en de ontwikkeling van fibrose zou kunnen worden verminderd tijdens CTCM-kweek.We hebben daarom gescreend op kleine moleculen met behulp van onze statische controleculturen vanwege het kleine aantal verstorende factoren.Voor dit scherm werden dexamethason (Dex), triiodothyronine (T3) en SB431542 (SB) gekozen.Deze kleine moleculen zijn eerder gebruikt in hiPSC-CM-culturen om rijping van cardiomyocyten te induceren door de sarcomeerlengte, T-tubuli en geleidingssnelheid te vergroten.Bovendien is bekend dat zowel Dex (een glucocorticoïde) als SB ontstekingen onderdrukken29,30.Daarom hebben we getest of de opname van één of een combinatie van deze kleine moleculen de structurele integriteit van hartsecties zou verbeteren.Voor de eerste screening werd de dosis van elke verbinding geselecteerd op basis van de concentraties die gewoonlijk worden gebruikt in celkweekmodellen (1 μM Dex27, 100 nM T327 en 2,5 μM SB31).Na 12 dagen kweken resulteerde de combinatie van T3 en Dex in optimale structurele integriteit van cardiomyocyten en minimale vezelachtige hermodellering (aanvullende figuren 4 en 5).Bovendien produceerde het gebruik van dubbele of dubbele concentraties van T3 en Dex schadelijke effecten in vergelijking met normale concentraties (aanvullende figuur 6a, b).
Na de eerste screening voerden we een onderlinge vergelijking uit van 4 kweekomstandigheden (Figuur 4a): Ctrl: hartsecties gekweekt in onze eerder beschreven statische cultuur met behulp van ons geoptimaliseerde medium;20.21 TD: T3 en Ctrl s Toegevoegd Dex op woensdag;MC: hartsecties gekweekt in CTCM met behulp van ons eerder geoptimaliseerde medium;en MT: CTCM met T3 en Dex toegevoegd aan het medium.Na 12 dagen kweken bleef de levensvatbaarheid van MS- en MT-weefsels hetzelfde als in verse weefsels beoordeeld met MTT-assay (Fig. 4b).Interessant genoeg resulteerde de toevoeging van T3 en Dex aan transwell-culturen (TD) niet in een significante verbetering van de levensvatbaarheid in vergelijking met Ctrl-condities, wat wijst op een belangrijke rol van mechanische stimulatie bij het handhaven van de levensvatbaarheid van hartsecties.
een experimenteel ontwerpdiagram dat de vier kweekomstandigheden weergeeft die worden gebruikt om de effecten van mechanische stimulatie en T3/Dex-suppletie op medium gedurende 12 dagen te evalueren. b Staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 de kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b Staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 de kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 ctrl). b Na het openen van het apparaat is het mogelijk om 12 dagen te wachten van de 4e generatie van het programma (TD, MC en MT) voor het uitvoeren van verschillende programma's сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) van ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 van D0 en **p < 0,01 van D12 Ctrl). b Het staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartsecties (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, one-way ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 vs. D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD en D1 2 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01与D12-ontwerp）。b 4 12 (D12MC) b Serie, показывающая van 4 naar культивирования (контроль, TD, MC en MT) of свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), of разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одност van ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 van D0, **p <0,01 van D12). b Histogram toont alle 4 de kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartsecties (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van verschillende varkens 12 (D12 MC) secties/groep, eenrichtings-ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controle D12). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 6 coupes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 6 coupes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test wordt uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Na het openen van het programma is het tijd om 12 dagen te wachten van 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими среза ми сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по van D0 tot ***p < 0,001 van D12 Ctrl). c Histogram toont kwantificering van glucoseflux 12 dagen na kweek onder alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 6 coupes/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 4-kanaals (Ctrl、TD、MC- en MT）与新鲜心脏切片(D0)-programma's, en 12 pagina's糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 (ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , , , , , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Als u de kosten van uw bestelling op 12-jarige leeftijd bekijkt van de 4-sterren van het type (TD, MC en MT) voor alle programma's срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ### p < 0,001 van de waarde van D0, ***p < 0,001 van de waarde van D12 (контроль). c Histogram dat de kwantificering van de glucoseflux op 12 dagen na de kweek weergeeft voor alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartsecties (D0) (n = 6 secties/groep, van verschillende varkens, unilateraal Were ANOVA-testen werden uitgevoerd, ###p < 0,001 vergeleken met D0, *** p < 0,001 vergeleken met D12 (controle).d Spanningsanalyseplots van vers (blauw), dag 12 MC (groen) en dag 12 MT (rood) weefsels op tien regionale weefselsectiepunten (n = 4 plakjes/groep, one-way ANOVA-test; er was geen significant verschil tussen groepen).e Volcano-grafiek die differentieel tot expressie gebrachte genen toont in verse hartsecties (D0) in vergelijking met hartsecties gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of onder MT-omstandigheden (MT) gedurende 10-12 dagen.f Heatmap van sarcomeergenen voor hartsecties gekweekt onder elk van de kweekomstandigheden.Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.
Metabolische afhankelijkheid van de omschakeling van vetzuuroxidatie naar glycolyse is een kenmerk van de dedifferentiatie van cardiomyocyten.Onrijpe cardiomyocyten gebruiken voornamelijk glucose voor ATP-productie en hebben hypoplastische mitochondriën met weinig cristae5,32.Glucosegebruiksanalyses toonden aan dat onder MC- en MT-omstandigheden het glucosegebruik vergelijkbaar was met dat in weefsels van dag 0 (Figuur 4c).Ctrl-monsters vertoonden echter een significante toename in glucosegebruik in vergelijking met vers weefsel.Dit geeft aan dat de combinatie van CTCM en T3/Dex de levensvatbaarheid van het weefsel verbetert en het metabolische fenotype van 12-daagse gekweekte hartsecties behoudt.Bovendien toonde spanningsanalyse aan dat spanningsniveaus hetzelfde bleven als in vers hartweefsel gedurende 12 dagen onder MT- en MS-omstandigheden (Fig. 4d).
Om de algehele impact van CTCM en T3 / Dex op het wereldwijde transcriptionele landschap van hartplakweefsel te analyseren, hebben we RNAseq uitgevoerd op hartplakjes van alle vier de verschillende kweekomstandigheden (aanvullende gegevens 1).Interessant is dat MT-secties een hoge transcriptionele gelijkenis vertoonden met vers hartweefsel, met slechts 16 differentieel tot expressie gebracht uit 13.642 genen.Zoals we eerder hebben laten zien, vertoonden Ctrl-plakjes echter 1229 differentieel tot expressie gebrachte genen na 10-12 dagen in kweek (Fig. 4e).Deze gegevens werden bevestigd door qRT-PCR van hart- en fibroblastgenen (aanvullende figuur 7a-c).Interessant genoeg toonden de Ctrl-secties neerwaartse regulatie van hart- en celcyclusgenen en activering van inflammatoire genprogramma's.Deze gegevens suggereren dat dedifferentiatie, die normaal optreedt na langdurig kweken, volledig wordt verzwakt onder MT-omstandigheden (aanvullende figuur 8a, b).Zorgvuldige studie van sarcomeergenen toonde aan dat alleen onder MT-omstandigheden de genen die coderen voor het sarcomeer (figuur 4f) en ionenkanaal (aanvullende figuur 9) behouden blijven, waardoor ze worden beschermd tegen onderdrukking onder Ctrl-, TD- en MC-omstandigheden.Deze gegevens tonen aan dat met een combinatie van mechanische en humorale stimulatie (T3/Dex), het transcriptoom van de hartschijf vergelijkbaar kan blijven met verse hartschijfjes na 12 dagen in kweek.
Deze transcriptionele bevindingen worden ondersteund door het feit dat de structurele integriteit van cardiomyocyten in hartsecties het best bewaard blijft onder MT-omstandigheden gedurende 12 dagen, zoals blijkt uit intacte en gelokaliseerde connexine 43 (Fig. 5a).Bovendien was fibrose in hartsecties onder MT-omstandigheden significant verminderd in vergelijking met Ctrl en vergelijkbaar met verse hartsecties (Fig. 5b).Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van mechanische stimulatie en T3/Dex-behandeling de hartstructuur in hartsecties in kweek effectief behoudt.
a Representatieve immunofluorescentiebeelden van troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartsecties (D0) of gedurende 12 dagen gekweekt in alle vier de kweekomstandigheden van de hartsectie (schaalbalk = 100 μm).). Kunstmatige intelligentie kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakken/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test wordt uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kunstmatige intelligentie kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test wordt uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Het is mogelijk om het apparaat te laten werken met het programma dat u nodig heeft (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; ### # p < 0,0001 met D0 en *p < 0,05 met ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep van verschillende varkens, one-way ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).对不同猪的心脏组结构完整性（n = 7(D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC en D12 MT)智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。（n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工########### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie bij verschillende varkens (n ​​= 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep) met een one-way ANOVA-test;#### p < 0,0001 met D0 en *p < 0,05 met ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve beelden en kwantificering voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, er wordt eenzijdige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0. 0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve beelden en kwantificering voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, er wordt eenzijdige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0. 0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Het gebruik van het apparaat en het onderhoud van het apparaat, het verwijderen van het apparaat расителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) Dit is de reden waarom ANOVA wordt gebruikt: ####p < 0,0001 met D0 en ***p < 0,001 met ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). b Representatieve beelden en kwantificering van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) secties/groep van verschillende varkens, uitgevoerd in één richting ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 vs .D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD Voor de D12 MC）， voor de D12 MT） voor de D12 MT） voor de D12 MT） voor de D12 MT） voor de D12 MT） van de D12 MT） 01，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） (n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td en d12 mc） foto's van 9 en d12 mt foto's foto's foto's foto's foto's foto's foto's foto's foto's foto's ####p < 0.0001 van D0,***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Het gebruik van het apparaat en het onderhoud van het apparaat, het verwijderen van de batterij (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) van verschillende niveaus / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 met D0, ***p < 0,001 met ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Representatieve beelden en kwantificering van hartsecties gekleurd met Masson's trichroom (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) secties van verschillende varkens/groep, één ANOVA-methode; ####p < 0,0001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 vergeleken met D1 2 Ctrl).Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.
Ten slotte werd het vermogen van CTCM om cardiale hypertrofie na te bootsen beoordeeld door de rek van het hartweefsel te vergroten.In CTCM nam de piekdruk in de luchtkamer toe van 80 mmHg tot 80 mmHg.Kunst.(normale rek) tot 140 mmHg Art.(Afb. 6a).Dit komt overeen met een toename van 32% in rek (figuur 6b), die eerder werd weergegeven als het overeenkomstige percentage rek dat nodig is voor hartsecties om een ​​sarcomeerlengte te bereiken die vergelijkbaar is met die bij hypertrofie.Rek en snelheid van hartweefsel tijdens samentrekking en ontspanning bleven constant gedurende zes dagen kweken (Fig. 6c).Hartweefsel van MT-condities werd gedurende zes dagen onderworpen aan normale rek (MT (Normal)) of overrekcondities (MT (OS)).Al na vier dagen in kweek was de hypertrofische biomarker NT-ProBNP significant verhoogd in het medium onder MT (OS) omstandigheden in vergelijking met MT (normale) omstandigheden (Fig. 7a).Bovendien nam na zes dagen kweken de celgrootte in MT (OS) (Fig. 7b) significant toe in vergelijking met secties van MT-hart (normaal).Bovendien was NFATC4 nucleaire translocatie significant verhoogd in overbelaste weefsels (Fig. 7c).Deze resultaten tonen de progressieve ontwikkeling van pathologische remodellering na hyperdistensie en ondersteunen het concept dat het CTCM-apparaat kan worden gebruikt als een platform om door rek geïnduceerde cardiale hypertrofiesignalering te bestuderen.
Representatieve sporen van luchtkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetingen bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofkamerdruk verandert, waardoor een overeenkomstige beweging van het weefselplakje ontstaat.b Representatieve rekpercentage- en reksnelheidscurven voor normaal uitgerekte (oranje) en overbelaste (blauwe) weefselcoupes.c Staafdiagram met de cyclustijd (n = 19 plakjes per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 18-19 plakjes per groep, van verschillende varkens), relaxatietijd (n = 19 plakjes per groep, van verschillende varkens), amplitude van weefselbeweging (n = 14 plakjes/groep, van verschillende varkens), systolische pieksnelheid (n = 14 plakjes/groep, van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n = 14 (D0), 15 (D6) ) secties/groepen) van verschillende varkens), toonde de tweezijdige Student's t-test geen significant verschil in welke parameter dan ook, wat aangeeft dat deze parameters constant bleven gedurende 6 dagen kweken met overspanning.Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.
een kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia van hartplakjes gekweekt onder MT normale rek (Norm) of overstrek (OS) condities (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, tweerichtings-ANOVA wordt uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek). een kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia van hartplakjes gekweekt onder MT normale rek (Norm) of overstrek (OS) condities (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, tweerichtings-ANOVA wordt uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek).Kwantitatief histogram van NT-ProBNP-concentratie in kweekmedium van hartplakjes gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4). MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, variantieanalyse met twee factoren wordt uitgevoerd;**p < 0,01 procent van de gemiddelde waarde). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 P < 0.01）。 a Kwantificering van NT-ProBNP-concentratie in hartplakjes gekweekt onder MT normale rek (Norm) of overrek (OS) omstandigheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) van verschillende medische hulpmiddelen; **vergeleken met normale rek ing, p < 0,01).histogram Kwantificering van NT-ProBNP-concentraties in hartplakjes gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, tweerichtingsvariantieanalyse;**p < 0,01 procent van de gemiddelde waarde). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen voor hartplakjes gekleurd met troponine-T en WGA (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep van 10 verschillende plakjes van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen voor hartplakjes gekleurd met troponine-T en WGA (links) en celgroottekwantificatie (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep van 10 verschillende plakjes van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Gebruik van het apparaat, het gebruik van het apparaat en de stroomvoorziening венного пределения размера клеток (sправа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу en 10 разных рсез van het einde van het jaar, ****p < 0,0001 van het aantal jaren мальным растяжением). b Representatieve afbeeldingen van hartsecties gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep van 10 verschillende secties van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-test werd uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale stam). b 用肌钙蛋白-T en WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验;与正常拉伸相比****p < 0,0001）。 b Representatieve afbeeldingen van hartplakjes gekleurd met calcareïne-T en WGA (links) en celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 van 10 verschillende plakjes (D6 MTNorm)) Cells/组,两方法有尾学生t-test; vergeleken met normaal uitrekken,****p < 0,0001). b Gebruik van het apparaat, het gebruik van het apparaat en de stroomvoorziening венная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) en 10 punten of 10 punten Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента;****p < 0,0001 van de waarde van de prijs m). b Representatieve afbeeldingen van hartsecties gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) van 10 verschillende secties van verschillende varkens) Cellen/groep, tweezijdig criterium Student's t;****p < 0,0001 vergeleken met normale belasting). c Representatieve beelden voor dag 0 en dag 6 MTOS-hartplakjes immunogelabeld voor troponine-T en NFATC4 en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, Tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; *p < 0,05). c Representatieve beelden voor dag 0 en dag 6 MTOS-hartplakjes immunogelabeld voor troponine-T en NFATC4 en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, Tweezijdige Student t-test wordt uitgevoerd; *p < 0,05). c Gebruik van 0 en 6 MTOS-programma's, en van het programma-Т en NFATC4 en NFATC4-programma's met NFATC4-programma's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/ Als u het apparaat gebruikt, kunt u de temperatuur van het apparaat wijzigen; *p < 0,05). c Representatieve beelden voor hartsecties op 0 en 6 dagen MTOS, immunogelabeld voor troponine-T en NFATC4, en kwantificering van NFATC4-translocatie in de kern van caverneuze cellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens) voerde tweezijdige Student's t-test uit;* p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T en NFATC4 免疫标记的第0 en 6 en MTOS 心脏切片的代表性图像,以及来自不同猪NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0.05)。 c Representatieve afbeeldingen van calcanine-T- en NFATC4-immunolabeling van 0 tot 6 tot 6 MTOS-hartplakjes en NFATC4 van verschillende NFATC4-cm-celkern-hoeveelheid (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) en 3 (D6 MTOS). en ≥*p < 0,05). c Gebruik van MTOS-programma's op 0 en 6 dagen voor elke cyclus-Т en NFATC4 en een nieuwe versie van NFATC4 in CM met een bereik van (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/групп *p < 0,05). c Representatieve beelden van MTOS-hartplakjes op dag 0 en 6 voor troponine-T- en NFATC4-immunolabeling en kwantificering van NFATC4-translocatie in de kern van CM van verschillende varkens (n ​​= 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep, tweezijdig t-criterium Student's; *p < 0,05).Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± standaarddeviatie.
Translationeel cardiovasculair onderzoek vereist cellulaire modellen die de cardiale omgeving nauwkeurig reproduceren.In deze studie werd een CTCM-apparaat ontwikkeld en gekarakteriseerd dat ultradunne delen van het hart kan stimuleren.Het CTCM-systeem omvat fysiologisch gesynchroniseerde elektromechanische stimulatie en T3- en Dex-vloeistofverrijking.Wanneer varkenshartsecties werden blootgesteld aan deze factoren, bleven hun levensvatbaarheid, structurele integriteit, metabolische activiteit en transcriptionele expressie hetzelfde als in vers hartweefsel na 12 dagen kweken.Bovendien kan overmatig uitrekken van hartweefsel hypertrofie van het hart veroorzaken, veroorzaakt door hyperextensie.Over het algemeen ondersteunen deze resultaten de cruciale rol van fysiologische kweekomstandigheden bij het handhaven van een normaal cardiaal fenotype en bieden ze een platform voor het screenen van geneesmiddelen.
Veel factoren dragen bij aan het creëren van een optimale omgeving voor het functioneren en overleven van cardiomyocyten.De meest voor de hand liggende van deze factoren zijn gerelateerd aan (1) intercellulaire interacties, (2) elektromechanische stimulatie, (3) humorale factoren en (4) metabolische substraten.Fysiologische cel-tot-cel interacties vereisen complexe driedimensionale netwerken van meerdere celtypen ondersteund door een extracellulaire matrix.Dergelijke complexe cellulaire interacties zijn in vitro moeilijk te reconstrueren door co-cultuur van individuele celtypen, maar kunnen gemakkelijk worden bereikt met behulp van de organotypische aard van hartsecties.
Mechanische rek en elektrische stimulatie van cardiomyocyten zijn cruciaal voor het behoud van het cardiale fenotype33,34,35.Hoewel mechanische stimulatie op grote schaal is gebruikt voor conditionering en rijping van hiPSC-CM, hebben verschillende elegante studies onlangs geprobeerd mechanische stimulatie van hartplakjes in cultuur met behulp van uniaxiale belasting.Deze studies tonen aan dat 2D uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het fenotype van het hart tijdens kweek.In deze onderzoeken werden delen van het hart ofwel belast met isometrische trekkrachten17, lineaire auxotone belasting18, of werd de hartcyclus nagebootst met behulp van krachttransducerfeedback en spanningsaandrijvingen.Deze methoden gebruiken echter uniaxiale weefselrek zonder omgevingsoptimalisatie, wat resulteert in de onderdrukking van veel cardiale genen of overexpressie van genen die geassocieerd zijn met abnormale rekreacties.De hier beschreven CTCM biedt een 3D-elektromechanische stimulus die de natuurlijke hartcyclus nabootst in termen van cyclustijd en fysiologische rek (25% rek, 40% systole, 60% diastole en 72 slagen per minuut).Hoewel deze driedimensionale mechanische stimulatie alleen niet voldoende is om de weefselintegriteit te behouden, is een combinatie van humorale en mechanische stimulatie met behulp van T3/Dex vereist om de levensvatbaarheid, functie en integriteit van het weefsel adequaat te behouden.
Humorale factoren spelen een belangrijke rol bij het moduleren van het volwassen hartfenotype.Dit werd benadrukt in HiPS-CM-onderzoeken waarin T3 en Dex werden toegevoegd aan kweekmedia om celrijping te versnellen.T3 kan het transport van aminozuren, suikers en calcium door celmembranen beïnvloeden36.Bovendien bevordert T3 MHC-α-expressie en MHC-β-downregulatie, waardoor de vorming van myofibrillen met snelle spiertrekkingen in volwassen cardiomyocyten wordt bevorderd in vergelijking met myofibrillen met langzame spiertrekkingen in CM van de foetus.T3-deficiëntie bij patiënten met hypothyreoïdie resulteert in het verlies van myofibrillaire banden en een verminderde tonusontwikkeling37.Dex werkt op glucocorticoïdreceptoren en het is aangetoond dat het de contractiliteit van het myocard verhoogt in geïsoleerde geperfundeerde harten;38 Aangenomen wordt dat deze verbetering verband houdt met het effect op calcium-deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Bovendien bindt Dex zich aan zijn receptoren, waardoor een brede intracellulaire respons ontstaat die de immuunfunctie en ontsteking onderdrukt30.
Onze resultaten geven aan dat fysieke mechanische stimulatie (MS) de algehele kweekprestaties verbeterde in vergelijking met Ctrl, maar de levensvatbaarheid, structurele integriteit en cardiale expressie gedurende 12 dagen in kweek niet kon behouden.Vergeleken met Ctrl verbeterde de toevoeging van T3- en Dex-culturen aan CTCM (MT)-culturen de levensvatbaarheid en behielden vergelijkbare transcriptieprofielen, structurele integriteit en metabole activiteit met vers hartweefsel gedurende 12 dagen.Door de mate van weefselrek te regelen, werd bovendien een hyperextensie-geïnduceerd cardiaal hypertrofiemodel gemaakt met behulp van STCM, wat de veelzijdigheid van het STCM-systeem illustreert.Opgemerkt moet worden dat hoewel remodellering van het hart en fibrose meestal betrekking hebben op intacte organen waarvan de circulerende cellen de juiste cytokines kunnen leveren, evenals fagocytose en andere remodelleringsfactoren, delen van het hart nog steeds het fibrotische proces kunnen nabootsen als reactie op stress en trauma.in myofibroblasten.Dit is eerder geëvalueerd in dit cardiale plakmodel.Opgemerkt moet worden dat CTCM-parameters kunnen worden gemoduleerd door de druk/elektrische amplitude en frequentie te wijzigen om veel aandoeningen te simuleren, zoals tachycardie, bradycardie en mechanische ondersteuning van de bloedsomloop (mechanisch onbelast hart).Dit maakt het systeem een ​​gemiddelde doorvoer voor drugstesten.Het vermogen van CTCM om door overbelasting veroorzaakte cardiale hypertrofie te modelleren, maakt de weg vrij voor het testen van dit systeem voor gepersonaliseerde therapie.Concluderend toont de huidige studie aan dat mechanische rek en humorale stimulatie van cruciaal belang zijn voor het behoud van de kweek van hartweefselsecties.
Hoewel de hier gepresenteerde gegevens suggereren dat CTCM een veelbelovend platform is voor het modelleren van intact myocardium, heeft deze kweekmethode enkele beperkingen.De belangrijkste beperking van CTCM-cultuur is dat het continue dynamische mechanische spanningen oplegt aan de plakjes, waardoor het niet mogelijk is om de samentrekkingen van de hartschijf tijdens elke cyclus actief te volgen.Bovendien is de mogelijkheid om de systolische functie buiten kweeksystemen te evalueren met behulp van traditionele krachtsensoren, vanwege de kleine omvang van hartsecties (7 mm), beperkt.In het huidige manuscript hebben we deze beperking gedeeltelijk overwonnen door de optische spanning te evalueren als een indicator van de contractiele functie.Deze beperking vereist echter meer werk en kan in de toekomst worden aangepakt door methoden te introduceren voor optische monitoring van de functie van hartplakjes in cultuur, zoals optische mapping met behulp van calcium en spanningsgevoelige kleurstoffen.Een andere beperking van CTCM is dat het werkmodel geen fysiologische stress (preload en afterload) manipuleert.Bij CTCM werd druk in tegengestelde richtingen geïnduceerd om 25% fysiologische rek in diastole (volledige rek) en systole (duur van samentrekking tijdens elektrische stimulatie) in zeer grote weefsels te reproduceren.Deze beperking zou in toekomstige CTCM-ontwerpen moeten worden opgeheven door voldoende druk van beide kanten op het hartweefsel en door de exacte druk-volumeverhoudingen toe te passen die in de hartkamers voorkomen.
De door overstrekking veroorzaakte hermodellering die in dit manuscript wordt gerapporteerd, is beperkt tot het nabootsen van hypertrofische hyperstretch-signalen.Dit model kan dus helpen bij de studie van door rek geïnduceerde hypertrofische signalering zonder de noodzaak van humorale of neurale factoren (die niet bestaan ​​in dit systeem).Verdere studies zijn nodig om de multipliciteit van CTCM te vergroten, bijvoorbeeld co-kweken met immuuncellen, circulerende plasma-humorale factoren en innervatie bij co-kweken met neuronale cellen zullen de mogelijkheden van ziektemodellering met CTCM verbeteren.
In dit onderzoek werden dertien varkens gebruikt.Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door de University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.De aortaboog werd afgeklemd en het hart werd geperfundeerd met 1 L steriele cardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/ml heparine, pH tot 7,4); de harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden getransporteerd, wat meestal <10 minuten is. de harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden getransporteerd, wat meestal <10 minuten is. het is belangrijk om de kosten van het programma in de winkel te controleren ja, het is mogelijk <10 maanden. harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing tot transport naar het laboratorium op ijs, wat gewoonlijk <10 minuten duurt.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室<10分钟。 Zorg ervoor dat de temperatuur van het apparaat in de lucht bij een temperatuur van <10 м en. Houd harten op ijs cardioplegie tot transport naar het laboratorium op ijs, meestal <10 min.
Het CTCM-apparaat is ontwikkeld in SolidWorks computer-aided design (CAD)-software.De kweekkamers, verdelers en luchtkamers zijn gemaakt van CNC helder acryl plastic.De steunring met een diameter van 7 mm is gemaakt van polyethyleen met hoge dichtheid (HDPE) in het midden en heeft een o-ringgroef voor de siliconen o-ring die wordt gebruikt om de onderliggende media af te dichten.Een dun membraan van silica scheidt de kweekkamer van de scheidingsplaat.Het siliconenmembraan is lasergesneden uit 0,02″ dik siliconenvel en heeft een hardheid van 35A.De onderste en bovenste siliconen pakkingen zijn met een laser gesneden uit 1/16″ dikke siliconenplaat en hebben een hardheid van 50A.316L roestvrijstalen schroeven en vleugelmoeren worden gebruikt voor het bevestigen van het blok en het creëren van een luchtdichte afsluiting.
Een speciale printplaat (PCB) is ontworpen om te worden geïntegreerd met het C-PACE-EM-systeem.De connectorsockets van de Zwitserse machine op de printplaat zijn verbonden met grafietelektroden door verzilverde koperdraden en bronzen 0-60 schroeven die in de elektroden zijn geschroefd.De printplaat wordt in het deksel van de 3D-printer geplaatst.
Het CTCM-apparaat wordt bestuurd door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD) die een gecontroleerde circulatiedruk creëert, vergelijkbaar met een hartcyclus.Naarmate de druk in de luchtkamer toeneemt, zet het flexibele siliconenmembraan uit naar boven, waardoor het medium onder het weefsel wordt gedwongen.Het weefselgebied zal dan worden uitgerekt door deze uitdrijving van vloeistof, waardoor de fysiologische uitzetting van het hart tijdens diastole wordt nagebootst.Op het hoogtepunt van ontspanning werd elektrische stimulatie toegepast via grafietelektroden, die de druk in de luchtkamer verminderden en samentrekking van weefselsecties veroorzaakten.In de leiding bevindt zich een hemostatische klep met een druksensor om de druk in het luchtsysteem te detecteren.De druk die door de druksensor wordt waargenomen, wordt toegepast op een gegevensverzamelaar die op de laptop is aangesloten.Dit maakt een continue bewaking van de druk in de gaskamer mogelijk.Toen de maximale kamerdruk was bereikt (standaard 80 mmHg, 140 mmHg OS), kreeg het data-acquisitie-apparaat de opdracht om een ​​signaal naar het C-PACE-EM-systeem te sturen om gedurende 2 ms een bifasisch spanningssignaal te genereren, ingesteld op 4 V.
Er werden hartsecties verkregen en de kweekomstandigheden in 6 putjes werden als volgt uitgevoerd: Breng de geoogste harten over van het overbrengvat naar een schaal met koude (4°C) cardioplegie.De linker ventrikel werd geïsoleerd met een steriel mesje en in stukken van 1-2 cm3 gesneden.Deze weefselblokken werden met weefselkleefmiddel aan weefseldragers bevestigd en in een vibrerend microtoomweefselbad met Tyrode's oplossing geplaatst en continu geoxygeneerd (3 g/L 2,3-butaandion monooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl2 ( 1,8 ml 1 M oplossing), tot 1 L ddH2O).De trillende microtoom was ingesteld om plakjes van 300 µm dik te snijden met een frequentie van 80 Hz, een horizontale trillingsamplitude van 2 mm en een voortgangssnelheid van 0,03 mm/s.Het weefselbad werd omgeven door ijs om de oplossing koel te houden en de temperatuur werd op 4°C gehouden.Breng weefselsecties over van het microtoombad naar een incubatiebad met continu geoxygeneerde Tyrode-oplossing op ijs totdat er voldoende secties zijn verkregen voor één kweekplaat.Voor transwell-kweken werden weefselcoupes bevestigd aan steriele 6 mm brede polyurethaansteunen en in 6 ml geoptimaliseerd medium geplaatst (199 medium, 1x ITS-supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisch en 2X antibioticum-antischimmelmiddel).Elektrische stimulatie (10 V, frequentie 1,2 Hz) werd toegepast op de weefselcoupes via de C-Pace.Voor TD-omstandigheden werden verse T3 en Dex toegevoegd bij 100 nM en 1 μM bij elke mediumverandering.Het medium wordt 3 keer per dag verzadigd met zuurstof voordat het wordt vervangen.Weefselcoupes werden gekweekt in een incubator bij 37°C en 5% CO2.
Voor CTCM-culturen werden weefselcoupes geplaatst op een op maat gemaakte 3D-printer in een petrischaal met gemodificeerde Tyrode-oplossing.Het apparaat is ontworpen om de grootte van de plak van het hart te vergroten met 25% van het oppervlak van de steunring.Dit wordt gedaan zodat de secties van het hart niet uitrekken nadat ze zijn overgebracht van Tyrode's oplossing naar het medium en tijdens diastole.Met behulp van histoacryllijm werden coupes van 300 µm dik bevestigd op een steunring met een diameter van 7 mm.Nadat de weefselcoupes aan de steunring zijn bevestigd, snijdt u de overtollige weefselcoupes af en plaatst u de bevestigde weefselcoupes terug in het bad met Tyrode-oplossing op ijs (4°C) totdat er voldoende coupes zijn voorbereid voor één apparaat.De totale verwerkingstijd voor alle apparaten mag niet langer zijn dan 2 uur.Nadat 6 weefselsecties aan hun steunringen waren bevestigd, werd het CTCM-apparaat in elkaar gezet.De CTCM-kweekkamer is voorgevuld met 21 ml voorgeoxygeneerd medium.Breng de weefselsecties over naar de kweekkamer en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen met een pipet.Het weefselgedeelte wordt vervolgens in het gat geleid en voorzichtig op zijn plaats gedrukt.Plaats ten slotte de elektrodekap op het apparaat en breng het apparaat over naar de couveuse.Sluit vervolgens de CTCM aan op de luchtslang en het C-PACE-EM-systeem.De pneumatische actuator opent en de luchtklep opent de CTCM.Het C-PACE-EM-systeem is geconfigureerd om gedurende 2 ms 4 V bij 1,2 Hz te leveren tijdens bifasische stimulatie.Het medium werd twee keer per dag vervangen en de elektroden werden één keer per dag vervangen om ophoping van grafiet op de elektroden te voorkomen.Indien nodig kunnen weefselsecties uit hun kweekputjes worden verwijderd om eventuele luchtbellen die eronder zijn gevallen te verdrijven.Voor MT-behandelingsomstandigheden werd T3 / Dex vers toegevoegd bij elke mediumverandering met 100 nM T3 en 1 μM Dex.De CTCM-apparaten werden gekweekt in een incubator bij 37°C en 5% CO2.
Om uitgerekte trajecten van hartplakjes te verkrijgen, werd een speciaal camerasysteem ontwikkeld.Een spiegelreflexcamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) werd gebruikt met een Navitar Zoom 7000 18-108 mm macrolens (Navitar, San Francisco, CA).Visualisatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur na vervanging van het medium door vers medium.De camera is in een hoek van 51° geplaatst en video wordt opgenomen met 30 frames per seconde.Eerst werd open source software (MUSCLEMOTION43) gebruikt met Image-J om de beweging van hartschijfjes te kwantificeren.Het masker is gemaakt met behulp van MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VS) om interessegebieden te definiëren voor kloppende hartplakken om ruis te voorkomen.Handmatig gesegmenteerde maskers worden toegepast op alle afbeeldingen in een reeks frames en vervolgens doorgegeven aan de MUSCLEMOTION-plug-in.Muscle Motion gebruikt de gemiddelde intensiteit van de pixels in elk frame om de beweging ten opzichte van het referentieframe te kwantificeren.Gegevens werden geregistreerd, gefilterd en gebruikt om de cyclustijd te kwantificeren en weefselrek tijdens de hartcyclus te beoordelen.De opgenomen video is nabewerkt met behulp van een eerste-orde nulfase digitaal filter.Om weefselrek (piek-tot-piek) te kwantificeren, werd piek-tot-piekanalyse uitgevoerd om onderscheid te maken tussen pieken en dalen in het geregistreerde signaal.Bovendien wordt detrending uitgevoerd met behulp van een polynoom van de 6e orde om signaaldrift te elimineren.Programmacode is ontwikkeld in MATLAB om globale weefselbeweging, cyclustijd, relaxatietijd en contractietijd te bepalen (aanvullende programmacode 44).
Voor rekanalyse hebben we, met behulp van dezelfde video's die zijn gemaakt voor mechanische rekbeoordeling, eerst twee afbeeldingen getraceerd die bewegingspieken vertegenwoordigen (de hoogste (bovenste) en laagste (onderste) bewegingspunten) volgens de MUSCLEMOTION-software.Vervolgens hebben we de weefselgebieden gesegmenteerd en een vorm van schaduwalgoritme toegepast op het gesegmenteerde weefsel (aanvullende figuur 2a).Het gesegmenteerde weefsel werd vervolgens verdeeld in tien ondergronden en de spanning op elk oppervlak werd berekend met behulp van de volgende vergelijking: Rek = (Sup-Sdown)/Sdown, waarbij Sup en Sdown de afstanden zijn van de vorm vanaf de bovenste en onderste schaduwen van respectievelijk de stof (aanvullende afbeelding .2b).
Hartsecties werden gedurende 48 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde.Gefixeerde weefsels werden gedurende 1 uur gedehydrateerd in 10% en 20% sucrose en vervolgens een nacht in 30% sucrose.De secties werden vervolgens ingebed in compound met optimale snijtemperatuur (OCT-compound) en geleidelijk ingevroren in een isopentaan/droogijsbad.Bewaar OCT-inbeddingsblokken bij -80 °C tot scheiding.Dia's werden geprepareerd als secties met een dikte van 8 μm.
Om OCT uit hartsecties te verwijderen, verwarmt u de dia's op een verwarmingsblok bij 95 °C gedurende 5 minuten.Voeg 1 ml PBS toe aan elk glaasje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, doordring vervolgens de secties door 0,1% Triton-X in PBS in te stellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Om te voorkomen dat niet-specifieke antilichamen zich aan het monster binden, voegt u 1 ml 3% BSA-oplossing toe aan de objectglaasjes en incubeert u deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.De BSA werd vervolgens verwijderd en de glaasjes werden gewassen met PBS.Markeer elk monster met een potlood.Primaire antilichamen (1:200 verdund in 1% BSA) (connexine 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponine-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) werden gedurende 90 minuten toegevoegd, daarna secundaire antilichamen (1:200 verdund in 1% BSA) tegen muis Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; # A16079), tegen konijn Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) gedurende nog eens 90 minuten 3 keer gewassen met PBS Om doelkleuring van achtergrond te onderscheiden, gebruikten we alleen het secundaire antilichaam als controle. Ten slotte werd DAPI-kernkleuring toegevoegd en werden de dia's in een vectashield (Vector Laboratories) geplaatst en verzegeld met nagellak. -x vergroting) en Keyence-microscoop met 40x vergroting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) bij 5 μg/ml in PBS werd gebruikt voor WGA-kleuring en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur aangebracht op gefixeerde secties.De glaasjes werden vervolgens gewassen met PBS en Soedanzwart werd aan elk glaasje toegevoegd en gedurende 30 minuten geïncubeerd.De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met PBS en vectashield-inbeddingsmedium werd toegevoegd.Dia's werden gevisualiseerd op een Keyence-microscoop met een vergroting van 40x.
OCT werd uit de monsters verwijderd zoals hierboven beschreven.Dompel de dia's na het verwijderen van de OCT een nacht onder in de oplossing van Bouin.De objectglaasjes werden vervolgens gedurende 1 uur gespoeld met gedestilleerd water en vervolgens gedurende 10 minuten in een Bibrich aloëzuur-fuchsine-oplossing geplaatst.Vervolgens werden de objectglaasjes gewassen met gedestilleerd water en gedurende 10 minuten in een oplossing van 5% fosfomolybdeen/5% fosfowolfraamzuur geplaatst.Breng de glaasjes zonder spoelen gedurende 15 minuten rechtstreeks in de anilineblauwe oplossing over.Vervolgens werden de objectglaasjes gewassen met gedestilleerd water en gedurende 2 minuten in een 1% azijnzuuroplossing geplaatst.Objectglaasjes werden gedroogd in 200 N ethanol en overgebracht naar xyleen.Gekleurde dia's werden gevisualiseerd met behulp van een Keyence-microscoop met een 10x objectief.Het percentage fibrosegebied werd gekwantificeerd met behulp van de Keyence Analyzer-software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalogusnummer V13154, volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen.In het bijzonder werd een chirurgische pons met een diameter van 6 mm gebruikt om een ​​uniforme weefselgrootte te garanderen tijdens de MTT-analyse.Weefsels werden afzonderlijk uitgeplaat in de putjes van een plaat met 12 putjes die MTT-substraat bevatte volgens het protocol van de fabrikant.De coupes worden 3 uur bij 37°C geïncubeerd en het levende weefsel metaboliseert het MTT-substraat om een ​​paarse formazanverbinding te vormen.Vervang de MTT-oplossing door 1 ml DMSO en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om paars formazan uit hartsecties te extraheren.Monsters werden 1:10 verdund in DMSO in platen met 96 putjes met heldere bodem en de paarse kleurintensiteit werd gemeten bij 570 nm met behulp van een Cytation-plaatlezer (BioTek).De metingen werden genormaliseerd naar het gewicht van elk deel van het hart.
Heart slice-media werden vervangen door media die 1 μCi / ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, VS) bevatten voor glucosegebruikstest zoals eerder beschreven.Voeg na 4 uur incubatie 100 µl medium toe aan een open microcentrifugebuis met 100 µl 0,2 N HCl.Vervolgens werd de buis in een scintillatiebuis met 500 μl dH2O geplaatst om [3H]20 gedurende 72 uur bij 37°C te verdampen.Haal vervolgens het microcentrifugebuisje uit het scintillatiebuisje en voeg 10 ml scintillatievloeistof toe.Scintillatietellingen werden uitgevoerd met behulp van een Tri-Carb 2900TR vloeistofscintillatieanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, VS).Glucosegebruik werd vervolgens berekend rekening houdend met [5-3H]-glucose-specifieke activiteit, onvolledig evenwicht en achtergrond, verdunning van [5-3H]- tot niet-gemerkte glucose, en scintillatie tegenefficiëntie.De gegevens zijn genormaliseerd naar de massa van secties van het hart.
Na weefselhomogenisatie in Trizol werd RNA geïsoleerd uit hartsecties met behulp van de Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 volgens het protocol van de fabrikant.De voorbereiding, sequentiebepaling en gegevensanalyse van de RNAsec-bibliotheek werden als volgt uitgevoerd:
1 μg RNA per monster werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor de bereiding van de RNA-bibliotheek.Sequentiebibliotheken werden gegenereerd met behulp van de NEBnext UltraTM RNA Library Preparation Kit voor Illumina (NEB, VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en indexcodes werden toegevoegd aan de attribuutsequenties voor elk monster.In het kort, mRNA werd gezuiverd uit totaal RNA met behulp van magnetische korrels bevestigd met poly-T-oligonucleotiden.Fragmentatie wordt uitgevoerd met behulp van divalente kationen bij hoge temperatuur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).De eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van willekeurige hexameerprimers en M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).De tweede streng cDNA wordt vervolgens gesynthetiseerd met behulp van DNA-polymerase I en RNase H. De overhangende delen worden omgezet in stompe uiteinden door exonuclease/polymerase-activiteit.Na adenylatie van het 3'-uiteinde van het DNA-fragment wordt een NEBnext-adapter met een haarspeldlusstructuur eraan vastgemaakt om het voor te bereiden op hybridisatie.Voor selectie van cDNA-fragmenten met een voorkeurslengte van 150-200 bp.bibliotheekfragmenten werden gezuiverd met behulp van het AMPure XP-systeem (Beckman Coulter, Beverly, VS).Vervolgens werd 3 μl USER Enzyme (NEB, VS) met op grootte geselecteerd cDNA geligeerd met een adapter gedurende 15 minuten bij 37 ° C en vervolgens gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór PCR gebruikt.PCR werd vervolgens uitgevoerd met Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universele PCR-primers en Index (X)-primers.Ten slotte werden PCR-producten gezuiverd (AMPure XP-systeem) en de bibliotheekkwaliteit beoordeeld op een Agilent Bioanalyzer 2100-systeem.De cDNA-bibliotheek werd vervolgens gesequenced met behulp van een Novaseq-sequencer.Raw-afbeeldingsbestanden van Illumina werden geconverteerd naar onbewerkte reads met behulp van CASAVA Base Calling.Ruwe gegevens worden opgeslagen in bestanden in FASTQ(fq)-indeling die leesreeksen en bijbehorende basiskwaliteiten bevatten.Selecteer HISAT2 om gefilterde sequencing-lezingen af ​​te stemmen op het Sscrofa11.1-referentiegenoom.Over het algemeen ondersteunt HISAT2 genomen van elke grootte, inclusief genomen groter dan 4 miljard basen, en voor de meeste parameters zijn standaardwaarden ingesteld.Splicing reads van RNA Seq-gegevens kunnen efficiënt worden uitgelijnd met behulp van HISAT2, het snelste systeem dat momenteel beschikbaar is, met dezelfde of betere nauwkeurigheid dan welke andere methode dan ook.
De overvloed aan transcripten weerspiegelt direct het niveau van genexpressie.Genexpressieniveaus worden beoordeeld aan de hand van de overvloed aan transcripten (aantal sequencing) geassocieerd met het genoom of exons.Het aantal uitlezingen is evenredig met genexpressieniveaus, genlengte en sequentiediepte.FPKM (fragmenten per duizend basenparen van transcript gesequenced per miljoen basenparen) werden berekend en P-waarden van differentiële expressie werden bepaald met behulp van het DESeq2-pakket.Vervolgens berekenden we de valse ontdekkingssnelheid (FDR) voor elke P-waarde met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode9 op basis van de ingebouwde R-functie "p.adjust".
RNA geïsoleerd uit hartsecties werd omgezet in cDNA in een concentratie van 200 ng/μl met behulp van de SuperScript IV Vilo Master-mix van Thermo (Thermo, cat.nr. 11756050).Kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van een Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparante reactieplaat (Thermo, cat.nr. 4483319) en microamp optische lijm (Thermo, cat.nr. 4311971).Het reactiemengsel bestond uit 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer en 3,5 µl H2O per putje gemengd.Standaard qPCR-cycli werden uitgevoerd en CT-waarden werden gemeten met behulp van een Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-instrument (module met 384 putjes; product # A28135).Taqman-primers werden gekocht bij Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) De CT-waarden van alle monsters werden genormaliseerd naar het huishoudgen GAPDH.
Media-release van NT-ProBNP werd beoordeeld met behulp van de NT-ProBNP-kit (pig) (cat. nr. MBS2086979, MyBioSource) volgens het protocol van de fabrikant.In het kort werd 250 µl van elk monster en elke standaard in tweevoud aan elk putje toegevoegd.Voeg onmiddellijk na het toevoegen van het monster 50 µl testreagens A toe aan elk putje.Schud de plaat voorzichtig en sluit af met afdichtmiddel.Vervolgens werden de tabletten gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd.Zuig vervolgens de oplossing op en was de putjes 4 keer met 350 µl 1X wasoplossing, waarbij de wasoplossing elke keer 1-2 minuten wordt geïncubeerd.Voeg vervolgens 100 µl testreagens B per putje toe en sluit af met plaatafdichtmiddel.De tablet werd voorzichtig geschud en gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd.Zuig de oplossing op en was de putjes 5 keer met 350 µl 1X wasoplossing.Voeg 90 µl substraatoplossing toe aan elk putje en sluit de plaat af.Incubeer de plaat gedurende 10-20 minuten bij 37°C.Voeg 50 µl stopoplossing toe aan elk putje.De plaat werd onmiddellijk gemeten met behulp van een Cytation (BioTek) plaatlezer ingesteld op 450 nm.
Er werden vermogensanalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die >80% vermogen leveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een 5% Type I foutenpercentage. Er werden vermogensanalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die >80% vermogen leveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een 5% Type I foutenpercentage. Als er een grote kans is dat er een probleem is, dan is er een stijging van >80% van de resultaten ля обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Er werd een poweranalyse uitgevoerd om groepsgroottes te selecteren die >80% vermogen zouden leveren om 10% absolute parameterverandering te detecteren met een 5% Type I foutenpercentage.Lees meer van > 80％功效以检测参数中10％绝对变化 en 5％ILees meer van > 80％功效以检测参数中10％绝对变化 en 5％I Als u meer dan 80% van de kosten van uw product ontvangt, met 10% waterdamp en 5% waterdamp I. Er werd een poweranalyse uitgevoerd om een ​​groepsgrootte te selecteren die >80% power zou bieden om 10% absolute parameterverandering en 5% type I-foutpercentage te detecteren.Weefselsecties werden willekeurig geselecteerd vóór het experiment.Alle analyses waren conditieblind en monsters werden pas gedecodeerd nadat alle gegevens waren geanalyseerd.GraphPad Prism-software (San Diego, CA) werd gebruikt om alle statistische analyses uit te voeren. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05. De gemiddelde waarde van de stroom <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05.Wat is de beste manier om te zien, p-waarde <0.05Wat is de beste manier om te zien, p-waarde <0.05 De gemiddelde waarde van de stroom <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05.Tweezijdige Student's t-toets werd uitgevoerd op de gegevens met slechts 2 vergelijkingen.Eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA werd gebruikt om de significantie tussen meerdere groepen te bepalen.Bij het uitvoeren van post-hoctests werd Tukey's correctie toegepast om rekening te houden met meerdere vergelijkingen.RNAsec-gegevens hebben speciale statistische overwegingen bij het berekenen van FDR en p.adjust zoals beschreven in de sectie Methoden.
Zie voor meer informatie over het ontwerp van de studie de samenvatting van het Nature Research Report die aan dit artikel is gekoppeld.