Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Menneskelig tarmmorfogenese etablerer krypt-villus-trekk ved 3D-epitelmikroarkitektur og romlig organisering.Denne unike strukturen er nødvendig for å opprettholde tarmhomeostase ved å beskytte stamcelle-nisjen i basalkrypten fra eksogene mikrobielle antigener og deres metabolitter.I tillegg er tarmvilli og utskillende slim tilstede funksjonelt differensiert med en beskyttende celle for epitelets overflate. Å bruke 3D-epitelstrukturer er avgjørende for konstruksjonen av in vitro-tarmmodeller. Spesielt kan den organiske mimetiske tarmen-på-en-brikke indusere spontan 3D-morfogenese av tarmepitelet med forbedrede fysiologiske funksjoner og biomekanikk. Her gir vi en reproduserbar protokoll for å godt indusere tarm- og influensa-influensa i tarmen. innebygd hybridbrikke.Vi beskriver detaljerte metoder for fabrikasjon av enheter, dyrking av Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller i konvensjonelle omgivelser så vel som på en mikrofluidisk plattform, induksjon av 3D-morfogenese og karakterisering av etablerte 3D-epitel ved bruk av flere avbildningsmodaliteter. Denne protokollen for funksjonskontroll av mikrofluid for regenerering av væsker i laterale prosesser oppnås ved hjelp av regenerering av væske. tro morfogenese-metoden benytter fysiologisk relevant skjærspenning og mekanisk bevegelse og krever ikke kompleks celleteknikk eller manipulering, som kan utkonkurrere andre eksisterende teknikker. Vi ser for oss at vår foreslåtte protokoll kan ha brede implikasjoner for det biomedisinske forskningsmiljøet, og gir en metode for å regenerere 3D intestinale epitellag in vitro for biomedisinsk, klinisk og farmasøytisk bruk.
Eksperimenter viser at tarmepitel-Caco-2-celler dyrket i gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eller tolags mikrofluidenheter6,7 kan gjennomgå spontan 3D morfogenese in vitro uten en klar forståelse av den underliggende mekanismen. thelial morfogenese in vitro, som er påvist av Caco-2 og pasientavledede intestinale organoider.Epitelceller ble validert. I denne studien fokuserte vi spesifikt på celleproduksjonen og konsentrasjonsfordelingen av en potent Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), i tarm-på-en-brikke og modifiserte mikrofluidenheter som inneholder Transwell-innlegg, kalt "Hybrid Chip". zzled-relatert protein 1, eller Soggy-1) til tarmen på brikken hemmer morfogenese eller forstyrrer det forhåndsstrukturerte 3D-epitellaget, noe som tyder på at antagonistisk stress under dyrking er ansvarlig for intestinal morfogenese in vitro. Derfor er en praktisk tilnærming for å oppnå robust morfogenese på nivået av den basontaglaterale grensesnittet til den basontag-laterale grensesnittet å fjerne eller opprettholde et minimalistisk nivå av epitel. ment ved aktiv spyling (f.eks. i gut-on-a-chip eller hybrid-on-a-chip-plattformer) eller diffusjon. Basolaterale medier (f.eks. fra Transwell-innlegg inn i store basolaterale reservoarer i brønner).
I denne protokollen gir vi en detaljert metode for fremstilling av tarm-på-en-brikke mikroenheter og Transwell-innsettbare hybridbrikker (trinn 1-5) for å dyrke tarmepitelceller på polydimetylsiloksan (PDMS)-baserte porøse membraner (trinn 6A, 7A, 8, 9) eller polyestersertmembraner, 7B-membraner, 8B-membraner, 8B-membraner, ed 3D morfogenese in vitro (trinn 10). Vi identifiserte også cellulære og molekylære trekk som indikerer vevsspesifikk histogenese og avstamningsavhengig cellulær differensiering ved å bruke flere avbildningsmodaliteter (trinn 11-24). Vi induserer morfogenese ved å bruke humane tarmepitelceller, for eksempel i pore-organ-overflate-formater, inkludert pore-organ-overflate-formater, etablering av 2D-monolag, og intestinal biokjemisk og Reproduksjon av det biomekaniske mikromiljøet.in vitro.For å indusere 3D-morfogenese fra 2D-epitel-monolag, fjernet vi morfogenantagonister i begge dyrkede former ved å strømme mediet inn i det basolaterale rommet i kulturen. Til slutt kan vi gi en representasjon av epitellaget som kan brukes som regener. å modellere morfogenavhengig epitelvekst, langsgående vert-mikrobiom ko-kulturer, patogeninfeksjon, inflammatorisk skade, epitelbarriere dysfunksjon og probiotikabaserte terapier Eksempel.påvirkninger.
Vår protokoll kan være nyttig for et bredt spekter av forskere innen grunnleggende (f.eks. tarmslimhinnebiologi, stamcellebiologi og utviklingsbiologi) og anvendt forskning (f.eks. preklinisk medikamenttesting, sykdomsmodellering, vevsteknologi og gastroenterologi) bred innvirkning. spres til publikum som studerer dynamikken i cellesignalering under tarmutvikling, regenerering eller homeostase. I tillegg er protokollen vår nyttig for å avhøre infeksjoner under ulike smittestoffer som Norovirus 8, Alvorlig Akutt Respiratorisk Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella cholera eller Vihimurio.Publikum med sykdomspatologi og patogenese er også nyttige. Bruken av et tarmmikrofysiologisystem på chip kan tillate longitudinell samkultur 10 og påfølgende vurdering av vertsforsvar, immunresponser og patogenrelatert skadereparasjon i mage-tarmkanalen (GI) 11 . Andre GI-lidelser assosiert med lekkasjesykdom, koliakksykdom, syndrom, syndrom, tykktarmssykdom, syndrom. irritabel tarmsyndrom kan simuleres når 3D intestinale epitellag er preparert ved bruk av pasientens 3D intestinale epitellag , disse sykdommene inkluderer villøs atrofi, kryptforkorting, slimhinneskade eller svekket epitelbarriere. Biopsi eller stamcelle-avledet tarm-organoider kan vurdere høyere sykdomsmodeller13-miljøet av høyere organoider12. celletyper, slik som pasientens perifere mononukleære blodceller (PBMC), til modeller som inneholder 3D intestinal villus-krypt mikroarkitekturer.vevsspesifikke immunceller, 5.
Siden 3D-epitelmikrostruktur kan fikses og visualiseres uten seksjoneringsprosessen, kan seere som jobber med romlig transkriptomikk og høyoppløselig eller superoppløsningsavbildning være interessert i vår kartlegging av den spatiotemporale dynamikken til gener og proteiner på epiteliale nisjer.Interessert i teknologi.Respons på mikrobiell eller immunstimuli. Videre kan langsgående vert-mikrobiom-krysstale 10, 14 som koordinerer tarmhomeostase etableres i 3D-tarmslimhinnelaget ved å samdyrke ulike mikrobielle arter, mikrobielle samfunn eller fecal gut-chip-on, spesielt i en avføringsmikrobiota.i plattformen.Denne tilnærmingen er spesielt attraktiv for publikum som studerer slimhinneimmunologi, gastroenterologi, humant mikrobiom, kulturomikk og klinisk mikrobiologi som ønsker å dyrke tidligere ukultiverte tarmmikrobiota i laboratoriet. Hvis vår in vitro morfogeneseprotokoll kan tilpasses til skalerbare kulturformater, som for eksempel replenisk brønn 248 eller 248 brønner. laterale rom, protokollen kan også spres til de som utvikler farmasøytiske, biomedisinske eller high-throughput screening- eller valideringsplattformer for næringsmiddelindustrien.Som et bevis på prinsippet har vi nylig demonstrert gjennomførbarheten av et multipleks high-throughput morfogenese-system som kan skaleres til et 24-brønns plate-organ-on-a-16-brikke-produkter. valideringen av vår in vitro morfogenesemetode kan akselereres og potensielt tas i bruk av mange forskningslaboratorier, industri eller myndigheter og reguleringsorganer for å forstå cellulær omprogrammering av in vitro tarmmorfogenese på transkriptomisk nivå for å teste medikamenter eller bioterapeutikk. sis prosess.
Et begrenset antall menneskerelevante eksperimentelle modeller har blitt brukt for å studere intestinal epitelial morfogenese, hovedsakelig på grunn av mangelen på implementerbare protokoller for å indusere 3D-morfogenese in vitro. Faktisk er mye av dagens kunnskap om tarmmorfogenesen basert på dyrestudier (f.eks. sebrafisk20, mus21 eller høner, 21, kan det være kostnadskrevende, 21 eller kostnadskrevende, 21). og viktigst av alt, ikke nøyaktig bestemme menneskelige utviklingsprosesser. Disse modellene er også svært begrenset i deres evne til å bli testet på en flerveis skalerbar måte. Derfor utkonkurrerer vår protokoll for regenerering av 3D-vevsstrukturer in vitro in vivo dyremodeller så vel som andre tradisjonelle statiske 2D-cellekulturmodeller.Som tidligere tillatt å undersøke lokale epitetiske celler for å undersøke ulike spa-cellestrukturer. krypt-villus-aksen som respons på ulike slimhinne- eller immunstimuli. 3D-epitellag kan gi rom for å studere hvordan mikrobielle celler konkurrerer om å danne romlige nisjer og økologisk evolusjon som respons på vertsfaktorer (f.eks. indre versus ytre slimlag, sekresjon av IgA og antimikrobielle peptider, 3D og andre mikrobiotiske peptider, 3D og andre peptider). ta strukturerer sine lokalsamfunn og produserer synergistisk mikrobielle metabolitter (f.eks. kortkjedede fettsyrer) som former cellulær organisasjon og stamcellenisjer i basalkryptene. Disse funksjonene kan bare demonstreres når 3D-epitellag er etablert in vitro.
I tillegg til vår metode for å lage 3D intestinale epitelstrukturer, finnes det flere in vitro-metoder. Intestinal organoidkultur er en toppmoderne vevsteknologisk teknikk basert på dyrking av tarmstamceller under spesifikke morfogene forhold23,24,25. Imidlertid er bruken av 3D-organoidmodeller for transportanalyser, og er ofte utfordrende for intestinale biomekaniske organismer. sed i organoiden, og derfor er introduksjonen av luminale komponenter som mikrobielle celler eller eksogene antigener begrenset.Tilgang til organoid lumen kan forbedres ved hjelp av en mikroinjektor,26,27, men denne metoden er invasiv og arbeidskrevende og krever spesialkunnskap for å utføre. Videre gjenspeiler tradisjonelle organoidkulturer som opprettholdes i hydrogelstillaser under statiske forhold ikke nøyaktig aktiv in vivo biomekanikk.
Andre tilnærminger benyttet av flere forskergrupper bruker forhåndsstrukturerte 3D hydrogelstillaser for å etterligne tarmepitelstrukturen ved å dyrke isolerte menneskelige tarmceller på geloverflaten.Fabrikér hydrogelstillaser ved å bruke 3D-printede, mikromalte eller litografisk fremstilte former.Denne metoden viser det selvorganiserte i vitrofologiske organiserte, morfologiske organiserte celle-isolerte, morfologiske organene. etablere en epitelstruktur med høyt aspektforhold og stroma-epitelial krysstale ved å inkludere stromaceller i stillaset. Imidlertid kan naturen til forhåndsstrukturerte stillaser forhindre visningen av selve den spontane morfogenetiske prosessen. Disse modellene gir heller ikke dynamisk luminal eller interstitiell strømning, og mangler den væskecelle-skjæringsspenning som nylig er nødvendig for å undersøke en hydrogel-fysisk funksjon som hydrogel-fysiske funksjoner og tarmfysiske funksjoner. stillaser i en mikrofluidisk plattform og mønstrede intestinale epitelstrukturer ved bruk av laseretsingsteknikker. Musens intestinale organoider følger etsede mønstre for å danne intestinale rørformede strukturer, og intraluminal væskestrøm kan rekapituleres ved hjelp av en mikrofluidikkmodul. Denne modellen viser imidlertid verken spontane, spontane morfogenetiske prosesser fra samme gruppe som bevegelsesteknikker, og samme gruppe kan danne bevegelsesmekanismer. miniatyrtarmrør med spontane morfogenetiske prosesser. Til tross for den komplekse fremstillingen av forskjellige tarmsegmenter i røret, mangler denne modellen også luminal væskestrøm og mekanisk deformasjon. I tillegg kan modelloperabiliteten være begrenset, spesielt etter at bioprintingsprosessen er fullført, noe som forstyrrer eksperimentelle forhold eller celle-til-celle-interaksjoner. etterligne tarmmotilitet, tilgjengelighet til uavhengige apikale og basolaterale rom, og gjenskaping av komplekse biologiske mikromiljøer av modularitet. Derfor kan vår in vitro 3D-morfogeneseprotokoll gi en komplementær tilnærming for å overvinne utfordringene med eksisterende metoder.
Protokollen vår er helt fokusert på 3D epitelial morfogenese, med bare epitelceller i kultur og ingen andre typer omkringliggende celler som mesenkymale celler, endotelceller og immunceller. Som tidligere beskrevet, er kjernen i protokollen vår induksjon av epitelial morfogenese ved å fjerne morfogenet ved den introduserte sekresjonshemmeren av den basolaterale sekresjonshemmeren. t-på-en-brikke og hybrid-på-en-brikke lar oss gjenskape det bølgende 3D-epitellaget, ytterligere biologiske kompleksiteter som epitel-mesenkymale interaksjoner33,34, ekstracellulær matrise (ECM) avsetning 35 og, i vår modell, krypt-villus-trekk som formidler stamcelle-nisjer, f.eks. senchyme spiller en nøkkelrolle i produksjonen av ECM-proteiner og regulering av intestinal morfogenese in vivo35,37,38.Tillegget av mesenkymale celler til vår modell forbedret den morfogenetiske prosessen og cellevedleggseffektiviteten.Endotellaget (dvs. kapillærer eller lymfatiske organer) spiller en viktig rolle i regulering av molekylær celletransport i gu9-rekruttering og immunrekruttering av celle4. kulturkomponenter som kan kobles mellom vevsmodeller er en forutsetning når vevsmodeller er utformet for å demonstrere interaksjoner med flere organer. Derfor kan det være nødvendig å inkludere endotelceller for å modellere mer nøyaktige fysiologiske trekk med oppløsning på organnivå. Pasientavledede immunceller er også essensielle for å vise medfødte immunresponser, antigenpresentasjon, den medfødte vevsspesifikke adaptive vevskonteksten og den mikste vevsspesifikke adaptive vevssykdommen.
Bruken av hybridbrikker er mer enkel enn tarm-på-en-brikke fordi enhetsoppsettet er enklere og bruken av Transwell-innsatser gir mulighet for skalerbar kultur av tarmepitel. Kommersielt tilgjengelige Transwell-innsatser med polyestermembraner er imidlertid ikke elastiske og kan ikke simulere peristaltisk-lignende bevegelser. Videre forblir hun ikke plassert i den apikale stasjonen i den apikale delen av brønnen. den apikale siden. Det er klart at de statiske egenskapene i det apikale rommet sjelden muliggjør langvarig bakteriell samkultur i hybridbrikker. Selv om vi robust kan indusere 3D-morfogenese i Transwell-innlegg ved bruk av hybridbrikker, kan mangelen på fysiologisk relevant biomekanikk og apikal væskestrøm begrense muligheten for potensielle applikasjonsplattformer.
Fullskala rekonstruksjoner av den menneskelige krypt-villus-aksen i tarm-på-en-brikke- og hybrid-på-en-brikke-kulturer har ikke blitt fullstendig etablert. Siden morfogenesen starter fra et epitelialt monolag, gir ikke 3D-mikroarkitekturer nødvendigvis morfologisk likhet med krypter in vivo. Selv om vi karakteriserte den proliferiske basin-d-cellepopulasjonen i den proliferiske basen-d-cellene. lium, krypten og villøse regionene var ikke tydelig avgrenset. Selv om høyere øvre kanaler på brikken fører til økt høyde på det mikrokonstruerte epitelet, er den maksimale høyden fortsatt begrenset til ~300–400 µm. Den faktiske dybden av menneskelige tarmkrypter i tynntarmen og tykktarmen er ~135 µm hhv. ~600 µm41.
Fra et avbildningssynspunkt kan in situ superoppløsningsavbildning av 3D-mikroarkitekturer være begrenset til tarmen på en brikke, siden den nødvendige arbeidsavstanden fra objektivlinsen til epitellaget er i størrelsesorden noen få millimeter. For å overvinne dette problemet kan det være nødvendig med et fjernt objektiv. Dessuten kan det lages tynne seksjoner for avbildning av prøvelaget, siden det krevende laget av PD er høy elastisk forberedelse av MS-F. bi-lags mikrofabrikasjon av tarmen på en brikke innebærer permanent adhesjon mellom hvert lag, det er ekstremt utfordrende å åpne eller fjerne det øvre laget for å undersøke overflatestrukturen til epitellaget. For eksempel ved å bruke et skanningselektronmikroskop (SEM).
Hydrofobiteten til PDMS har vært en begrensende faktor i mikrofluidbaserte studier som omhandler hydrofobe små molekyler, siden PDMS ikke spesifikt kan adsorbere slike hydrofobe molekyler. Alternativer til PDMS kan vurderes med andre polymere materialer. Alternativt kan overflatemodifisering av PDMS (f.eks. belegg med 42-glypofil) betraktes som adsorbert av 42-glypofile eller poly-3-42-42-poly-3-materialer. sorpsjon av hydrofobe molekyler.
Til slutt har metoden vår ikke vært godt karakterisert når det gjelder å gi en screening med høy gjennomstrømning eller en brukervennlig eksperimentell plattform som passer til alle. Den nåværende protokollen krever en sprøytepumpe per mikroenhet, som tar opp plass i en CO2-inkubator og forhindrer store eksperimenter. Denne begrensningen kan forbedres betydelig ved skalerbarheten til kulturformater av brønn, por-, 9- eller 4-brønn (f.eks. ous innsatser som tillater kontinuerlig etterfylling og fjerning av basolaterale medier).
For å indusere 3D-morfogenese av humant intestinalt epitel in vitro, brukte vi en mikrofluidisk chip intestinal enhet som inneholdt to parallelle mikrokanaler og en elastisk porøs membran i mellom for å lage en lumen-kapillær grensesnitt. Vi demonstrerer også bruken av en enkanals mikrofluidisk enhet (en hybrid innad i brønnen i epidermal chip) som sørger for kontinuerlig vekst i polsarlilaterale sjikt. begge plattformene kan morfogenese av forskjellige humane tarmepitelceller demonstreres ved å bruke retningsmanipulasjon av strømning for å fjerne morfogenantagonister fra det basolaterale kammeret. Hele eksperimentelle prosedyren (Figur 1) består av fem deler: (i) mikrofremstilling av tarmbrikken eller Transwell innsettbar hybrid chip (intestinal celle 1-5) (intestinal celle); Caco-2-celler) eller menneskelige intestinale organoider;boks 2-5), (iii) kultur av tarmepitelceller på tarmchips eller hybridchips (trinn 6-9), (iv) induksjon av 3D-morfogenese in vitro (trinn 10) og (v) ) for å karakterisere 3D-epitelmikrostrukturen (trinn 11-24). Til slutt ble en passende kontrollgruppe av vitrogenes under (trinn 11-24). ved å sammenligne epitelial morfogenese med romlige, tidsmessige, betingede eller prosedyrekontroller.
Vi brukte to forskjellige kulturplattformer: tarm-på-en-brikke med rette kanaler eller ikke-lineære kronglete kanaler, eller hybridbrikker som inneholder Transwell (TW)-innlegg i en mikrofluidisk enhet, fremstilt som beskrevet i boks 1, og trinn 1-5."Device Fabrication" viser hovedtrinnene i å lage en enkelt brikke eller en hybrid-celle-kilde for menneskelig intestinal. intestinale organoider) og kulturprosedyre brukt i denne protokollen."In vitro morfogenese" viser de overordnede trinnene der Caco-2 eller organoid-avledede epitelceller dyrkes på en intestinal chip eller på Transwell-innlegg av en hybrid chip, etterfulgt av induksjon av 3D-morfogenese og dannelsen av et karakterisert program for applikasjonsnummeret nedenfor viser trinnvis applikasjonsstruktur nedenfor. stinale epitellag kan for eksempel brukes i celledifferensieringskarakterisering, tarmfysiologiske studier, etablering av verts-mikrobiom-økosystemer og sykdomsmodellering.Immunofluorescensbilder i "Cell Differentiation" som viser kjerner, F-aktin og MUC2 uttrykt i 3D Caco-2-signalet i gut-2-epitel genereres på celleepitel, og celle-2-signalet i muMUC genereres. cus utskilt fra slimhinneoverflater.Fluorescerende bilder i Gut Physiology viser slim produsert ved farging for sialinsyre og N-acetylglukosaminrester ved bruk av fluorescerende hvetekimagglutinin. De to overlappende bildene i "Host-Microbe Co-Cultures" viser representativ vert-mikrobiom-kokultur på grønn ko-kultur i kokulturen. fluorescerende protein (GFP) med mikrokonstruerte 3D Caco-2-epitelceller. Det høyre panelet viser lokaliseringen av GFP E. coli samdyrket med 3D Caco-2-epitelceller, etterfulgt av immunfluorescensfarging med F-aktin (rød) og kjerner (blå gut). gens (f.eks. lipopolysakkarid, LPS) og immunceller (f.eks. PBMC;grønn). Caco-2-celler ble dyrket for å etablere et 3D-epitellag. Målestokk, 50 µm. Bilder i nederste rad: "Differensiering av celler" tilpasset med tillatelse fra referanse.2.Oxford University Press;Gjengitt med tillatelse fra Ref.5.NAS;«Host-Microbe Co-Culture» tilpasset med tillatelse fra ref.3.NAS;"Disease Modeling" tilpasset med tillatelse fra referanse.5.NAS.
Både tarm-på-brikke og hybridbrikker ble fremstilt ved bruk av PDMS-kopier som ble fjernet fra silisiumformer ved myk litografi1,44 og mønstret med SU-8. Utformingen av mikrokanalene i hver brikke bestemmes ved å ta hensyn til hydrodynamikk som skjærspenning og hydrodynamisk trykk1,4,12. Den originale tarm-på-en-en-brikke-designet, som består av parallelle tarm-på-a-brikke. rette mikrokanaler, har utviklet seg til en kompleks tarm-på-en-brikke (Extended Data Fig. 1b) som inkluderer et par buede mikrokanaler for å indusere Økt væskeoppholdstid, ikke-lineære strømningsmønstre og multiaksial deformasjon av dyrkede celler (fig. 2a–f) gut-chip-kompleksere kan biomekanikk rekonstrueres. sen.Vi har demonstrert at den kronglete tarmbrikken også sterkt induserer 3D-morfogenese i en lignende tidsramme med en lignende grad av epitelvekst sammenlignet med den originale tarmbrikken, uavhengig av den dyrkede celletypen. Derfor, for å indusere 3D-morfogenese, er lineære og komplekse tarmmønstre på brikken utvekslet med silkon-SUPD-negative mønster som kan utveksles med silkon-SUPD-negative mønster. etter avforming (fig.2a). For å fremstille tarmen på en brikke, ble det forberedte øvre PDMS-laget sekvensielt bundet til en porøs PDMS-film og deretter justert med det nedre PDMS-laget ved irreversibel binding ved bruk av en koronabehandler (fig. 2b–f). For å fremstille hybridbrikker ble herdede PDMS-replikaer bundet til enkeltkanals mikrobrønnglass som kunne lage en enkeltkanals mikrobrønn. 2t og utvidede data Fig. 2). Bindingsprosessen utføres ved å behandle overflatene til PDMS-replikaen og glasset med oksygenplasma eller koronabehandling.Etter sterilisering av den mikrofabrikerte enheten festet til silikonrøret, var enhetens oppsett klar til å utføre 3D-morfogenese av tarmepitelet (figur 2).
a, Skjematisk illustrasjon av fremstillingen av PDMS-deler fra SU-8 mønstrede silisiumformer. Den uherdede PDMS-løsningen ble helt over i en silisiumform (venstre), herdet ved 60 °C (midten) og fjernet fra formen (høyre).Den frastøpte PDMS ble kuttet i biter og renset for videre bruk.b, Photograph of the PD mold the silconigraphi. støpeform som brukes til å fremstille den porøse PDMS-membranen.d, En serie fotografier av øvre og nedre PDMS-komponenter og den sammensatte på-chip-tarmanordningen.e, Skjematisk av justeringen av øvre, membran og nedre PDMS-komponenter. Hvert lag er irreversibelt bundet av plasma- eller koronabehandling.f, skjematisk av den konvoluerte mikrobrikke-fremstilte enheten og den konvoluerte vacuposchannel-enheten. um chambers.g, Oppsett av gut-on-a-chip for mikrofluidisk cellekultur.Den fabrikerte tarmen på en chip satt sammen med et silikonrør og sprøyte ble plassert på et dekkglass.Brickanordningen ble plassert på lokket til en 150 mm petriskål for prosessering.Binderen brukes til å lukke silikonchipsene ved bruk av hybrid-chips-snapshots og hybrid-chips-snapshots-morphogene-morphos. erter fremstilt uavhengig for å dyrke 2D-monolag av tarmepitelceller ble satt inn i hybridbrikken for å indusere intestinal 3D-morfogenese. Mediet perfunderes gjennom mikrokanaler under cellelaget etablert på Transwell-innsatsen. Skala bar, 1 cm.h Gjengitt med tillatelse fra referanse.4.Elsevier.
I denne protokollen ble Caco-2-cellelinjen og intestinale organoider brukt som epitelkilder (fig. 3a). Begge celletyper ble dyrket uavhengig (boks 2 og boks 5) og brukt til å utså de ECM-belagte mikrokanalene av på-chip-tarm- eller Transwell-innlegg. en passasjer 10 og 50) i T-kolber høstes for å fremstille dissosierte cellesuspensjoner ved hjelp av trypsiniseringsvæske (boks 2). Humane intestinale organoider fra intestinale biopsier eller kirurgiske reseksjoner ble dyrket i Matrigel stillasdomer i 24-brønners plater for å støtte det strukturelle mikromiljøet som inneholder essensielle morphon, Rpon og vekst av morphon, Noggin og essensiell vekst. Faktorer fremstilt som beskrevet i boks 3 ble supplert annenhver dag inntil organoidene vokste til ~500 µm i diameter. Fullvoksne organoider høstes og dissosieres til enkeltceller for såing på tarm- eller Transwell-innlegg på en brikke (boks 5). Som vi tidligere har rapportert, kan den differensieres i henhold til sykdomstype12, tykktarmbetennelse, 12, tykktarmbetennelse. ), lesjonssted (f.eks. lesjon versus ikke-skadd område) og gastrointestinal plassering i tarmkanalen (f.eks. tolvfingertarm, jejunum, ileum, blindtarm, tykktarm eller rektum). Vi gir en optimalisert protokoll i boks 5 for dyrking av kolonorganoider (koloider) som vanligvis krever høyere konsentrasjoner av morfogener enn tynntarm.
a, Arbeidsflyt for induksjon av tarmmorfogenese i tarmbrikken. Caco-2 humant intestinalt epitel og intestinale organoider brukes i denne protokollen for å demonstrere 3D morfogenese. De isolerte epitelcellene ble sådd i den forberedte tarm-på-en-chip-enheten (chippreparat). 0 (D0), apikal (AP) strømning initieres og opprettholdes de første 2 dagene (strømning, AP, D0-D2). Basolateral (BL) strømning initieres også sammen med sykliske strekkbevegelser (stretch, flow, AP og BL) når et komplett 2D monolag dannes.Tarm 3D morfogenese dyrking oppstår etter 5 dagers mikromorfogenese spontankultur (P5 dager). kontrastbilder viser representativ morfologi av Caco-2-celler ved hvert eksperimentelt trinn eller tidspunkt (stolpediagram, 100 µm). Fire skjematiske diagrammer som illustrerer de tilsvarende kaskadene av tarmmorfogenese (øverst til høyre). De stiplede pilene i skjemaet representerer retningen til væskestrømning.b, SEM-bilde som viser overflatetopologien til Caco-left-3, som viser overflatetopologien til det etablerte caco-left-setet (fremhever den etablerte epitologien). stiplet boks) viser de regenererte mikrovilliene på 3D Caco-2-laget (høyre).c, Horisontalt frontalt syn av etablerte Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rød) og kontinuerlige børstekantmembraner merket F-aktin (grønn) og kjerner (blå) Immunfluorescens konfokale sjetonger på den midtre delen av intestinal-visualiseringen av intestinale sjetonger. fokalplan for hver konfokal visning.d, Tidsforløp for morfologiske endringer i organoider dyrket på en chip oppnådd ved fasekontrastmikroskopi på dag 3, 7, 9, 11 og 13. Innsatsen (øverst til høyre) viser den høye forstørrelsen av det oppgitte bildet.e, DIC-mikrofotografi av organoid 3D-epitel etablert i tarmen, over fluorid-markør tatt på dagen, over immunoid-markør. stamceller (LGR5;magenta), begerceller (MUC2; grønn), F-aktin (grå) og kjerner (cyan) dyrket på tarmbrikker i 3 dager, henholdsvis (venstre) og 13-dagers (midt) organoider på epitellaget. Se også utvidede data figur 3, som fremhever LGR5-signalering av bilder til høyre, uten MUC2-mikrostruktur (D) organoid epitel etablert i tarmen på en chip ved å farge plasmamembranen med CellMask-fargestoff (til høyre) på dag 13 av dyrkingen.Skala bar er 50 μm med mindre annet er angitt.b Gjengitt med tillatelse fra referanse.2.Oxford University Press;c Tilpasset med tillatelse fra Referanse.2.Oxford University Press;e og f tilpasset med tillatelse ved referanse.12 Under Creative Commons License CC BY 4.0.
I tarmen på en brikke er det nødvendig å modifisere den hydrofobe overflaten til den porøse PDMS-membranen for vellykket ECM-belegg. I denne protokollen bruker vi to forskjellige metoder for å modifisere hydrofobiteten til PDMS-membraner. For dyrking av Caco-2-celler var overflateaktivering ved UV/ozonbehandling alene tilstrekkelig for å redusere hydrofobisiteten til ECMMS-cellen og til å redusere hydrofobisiteten til Caco-2-cellene for å redusere hydrofobisiteten til ECM-2 Imidlertid krever mikrofluidisk kultur av organoidepitel kjemisk-basert overflatefunksjonalisering for å oppnå effektiv avsetning av ECM-proteiner ved sekvensiell påføring av polyetylenimin (PEI) og glutaraldehyd til PDMS-mikrokanaler. idic cellekultur starter med å perfusere bare mediet inn i den øvre mikrokanalen inntil cellene danner et komplett monolag, mens den nedre mikrokanalen opprettholder statiske forhold.Denne optimaliserte metoden for overflateaktivering og ECM-belegg muliggjør festing av organoidepitel for å indusere 3D-morfogenese på PDMS-overflaten.
Transwell-kulturer krever også ECM-belegg før cellesåing;Transwell-kulturer krever imidlertid ikke kompliserte forbehandlingstrinn for å aktivere overflaten av porøse innsatser. For dyrking av Caco-2-celler på Transwell-innsatser akselererer ECM-belegg på porøse innsatser festingen av dissosierte Caco-2-celler (<1 time) og dannelse av tett koblingsbarriere (<1-2 dager med isolerte organeroider på ECM-kulturer, er isolerte organeroider). belagte innsatser, festet til membranoverflaten (<3 timer) og vedlikeholdt til organoidene danner et komplett monolag med barriereintegritet. Transwell-kulturer utføres i 24-brønns plater uten bruk av hybridchips.
In vitro 3D morfogenese kan initieres ved å påføre væskestrøm til det basolaterale aspektet av et etablert epitellag. I tarmen på en chip begynte epitelial morfogenese når mediet ble perfusert inn i de øvre og nedre mikrokanalene (fig. 3a). Som tidligere beskrevet er det kritisk å introdusere væskestrøm i den inferioriske rehibitor-retningen for inferior-rehibitor (morfogenen) for den inferiorale rehibitor (morfogenen). For å gi tilstrekkelig med næringsstoffer og serum til celler bundet på porøse membraner og generere luminal skjærspenning, påfører vi typisk dobbel strømning i tarmen på en chip.I hybridbrikker ble Transwell-innlegg som inneholdt epiteliale monolag satt inn i hybridbrikkene. Deretter ble mediet påført under den basolaterale siden av den porøse Transwell-redisen i den porøse Transwell-redisen i 5 dager i den porøse Trans- kanalen i 5 dager. basolateral strømning i begge kulturplattformene.
De morfologiske egenskapene til mikrokonstruerte 3D-epitellag kan analyseres ved å bruke ulike avbildningsmodaliteter, inkludert fasekontrastmikroskopi, differensiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi, SEM, eller immunfluorescens konfokalmikroskopi (figur 3 og 4). Fasekontrast eller DIC-avbildning kan enkelt utføres når som helst av 3-epitel- og protheli-kulturen. optisk gjennomsiktighet av PDMS- og polyesterfilmer, både tarm-på-en-brikke- og hybridbrikke-plattformene kan gi sanntids in situ-avbildning uten behov for seksjonering eller demontering av enheten. Når du utfører immunfluorescensavbildning (figur 1, 3c, f og 4b, c), fikseres cellene typisk med 4% (PFA10de) (PFA20de) (PFA20de) (PFA10de) og % (vekt/volum) ) bovint serumalbumin (BSA), i rekkefølge. Avhengig av celletype kan forskjellige fikseringsmidler, permeabilisatorer og blokkeringsmidler brukes. Primære antistoffer som målretter avstamningsavhengige celle- eller regionmarkører brukes for å fremheve celler immobilisert in situ på brikken, etterfulgt av enten sekundære antistoffer sammen med a,′-antistoffer sammen med a,′-antistoffer (f.eks. 2-fenylen) indol, DAPI) eller F-aktin (f.eks. fluorescerende merket falloidin). Fluorescensbasert levende avbildning kan også utføres in situ for å oppdage slimproduksjon (fig.1, "Celledifferensiering" og "Tarmfysiologi"), tilfeldig kolonisering av mikrobielle celler (Fig. 1, "Vertsmikrobe co-kultur"), rekruttering av immunceller (Fig. 1, 'Sykdomsmodellering') eller konturene av 3D epitelial morfologi (fig. 3b modifisere og separere guf 4b). det øvre laget fra det nedre mikrokanallaget, som beskrevet i ref.Som vist i Fig. 2, kan 3D-epitelmorfologien samt mikrovilli på den apikale børstegrensen visualiseres ved SEM (Fig. 3b).Uttrykket av differensieringsmarkører kan vurderes ved å utføre kvantitativ PCR5 eller enkeltcellet RNA i dette tilfellet med encellet 3D-vekst. chips eller hybridchips høstes ved trypsinisering og brukes deretter til molekylær eller genetisk analyse.
a, Arbeidsflyt for induksjon av intestinal morfogenese i en hybridbrikke.Caco-2 og intestinale organoider brukes i denne protokollen for å demonstrere 3D-morfogenese i en hybridbrikkeplattform.Dissosierte epitelceller ble sådd i preparerte Transwell-innlegg (TW-prep; se figuren nedenfor). Når alle cellene ble sådd i polyesterceller ble sådd i membrankulturer (sådd) under statiske forhold (TW-kultur).Etter 7 dager ble et enkelt Transwell-innlegg som inneholdt et 2D-monolag av epitelceller integrert i en hybridbrikke for å introdusere en basolateral strømning (Flow, BL), som til slutt førte til generering av et 3D-epitellag (morfogenese). Fasekontrastmikrografer som viser normale morfologiske trekk ved menneskelig cellelinje som donert 3D-celle (morfogenese). på ved hvert eksperimentelt trinn eller tidspunkt. Skjemaene i de øvre lagene illustrerer den eksperimentelle konfigurasjonen for hvert trinn.b, Hybridbrikker (skjematisk til venstre) kan føre til 3D-morfogenese av organoide epitelceller med ovenfra og ned konfokale mikroskopiske visninger tatt ved forskjellige Z-posisjoner (øvre, midtre og nedre;se skjema til høyre og tilsvarende stiplede linjer).viste tydelige morfologiske karakteristikker.F-aktin (cyan), kjerne (grå).c, fluorescenskonfokale mikrofotografier (3D-vinklet visning) av organoid-avledede epitelceller dyrket i statisk Transwell (TW; innsatt i hvit stiplet boks) versus hybridbrikke (største fullskudd) som sammenligner 32D-vertikalskutt mot 2D-bilde mot 2D-bilder. (innsatt i øvre høyre hjørne; "XZ") viser også 2D- og 3D-funksjoner.Skalalinje, 100 µm.c Gjengitt med tillatelse fra referanse.4.Elsevier.
Kontroller kan tilberedes ved å dyrke de samme cellene (Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller) til todimensjonale monolag under konvensjonelle statiske dyrkningsforhold. Spesielt kan næringsutarming resultere på grunn av den begrensede volumkapasiteten til mikrokanalene (dvs. ~4 µL i toppkanalen på den opprinnelige tarmmorfologien, kan også sammenlignes før og etter epitheli-remorfologi-designet). .
Den myke litografiprosessen bør utføres i et rent rom. For hvert lag på brikken (øvre og nedre lag og membraner) og hybridbrikker ble forskjellige fotomasker brukt og fremstilt på separate silisiumskiver fordi høydene til mikrokanalene var forskjellige. Målhøydene til de øvre og nedre mikrokanalene i tarmen på brikken er henholdsvis µ2m, µm og hybrid kanalen. er 200 µm.
Plasser en 3-tommers silisiumwafer i en tallerken med aceton. Snurr platen forsiktig i 30 sekunder, lufttørk deretter waferen. Overfør waferen til en tallerken med IPA, og snurr deretter platen i 30 s for å rengjøre den.
En piranha-løsning (blanding av hydrogenperoksid og konsentrert svovelsyre, 1:3 (vol/vol)) kan eventuelt brukes for å maksimere fjerningen av organiske rester fra silisiumplatens overflate.
Piranha-løsningen er ekstremt etsende og genererer varme. Ytterligere sikkerhetstiltak er nødvendige. For avfallshåndtering, la løsningen avkjøles og overføres til en ren, tørr avfallsbeholder. Bruk sekundære beholdere og merk avfallsbeholdere på riktig måte. Følg anleggets sikkerhetsretningslinjer for mer detaljerte prosedyrer.
Dehydrer skivene ved å plassere dem på en 200 °C varmeplate i 10 min. Etter dehydrering ble waferen ristet fem ganger i luft for å avkjøles.
Hell ~10 g fotoresist SU-8 2100 på midten av den rengjorte silikonplaten. Bruk en pinsett til å spre fotoresisten jevnt på skiven. Plasser skiven av og til på en 65°C kokeplate for å gjøre fotoresisten mindre klebrig og lettere å spre. Ikke plasser skiven direkte på varmeplaten.
SU-8 ble jevnt fordelt på waferen ved å kjøre spinnbelegg. Programmer en innkommende rotasjon av SU-8 i 5–10 s for å forplante seg ved 500 rpm ved en akselerasjon på 100 rpm/s. Still inn hovedspinnet for 200 µm tykkelsesmønster ved 1500 rpm 50 eller for å oppnå en µm høyde 50, det øvre laget av tarmen på brikken; se "Kritiske trinn" nedenfor) satt til en akselerasjon på 300 rpm/s 30 sekunder ved 1200 rpm.
Hovedspinnhastigheten kan justeres i henhold til måltykkelsen til SU-8-mønsteret på silisiumplaten.
For å fremstille SU-8-mønstre på 500 µm høyde for det øvre laget av tarmen på brikken, ble spinnbelegget og myke bake-trinnene til denne boksen (trinn 7 og 8) gjentatt sekvensielt (se trinn 9) for å produsere to lag på 250 µm Et tykt lag av SU-8, som kan settes sammen med 1 µ-lag med 10-lag i denne boksen og sammenføyes med 1 0-lag. m høy.
Bløtbak de SU-8-belagte skivene ved å forsiktig plassere skivene på en kokeplate ved 65 °C i 5 minutter, bytt deretter innstillingen til 95 °C og inkuber i ytterligere 40 minutter.
For å oppnå en høyde på 500 μm på SU-8-mønsteret i den øvre mikrokanalen, gjenta trinn 7 og 8 for å generere to 250 μm tykke SU-8-lag.
Ved å bruke UV Mask Aligner, utfør en lampetest i henhold til produsentens instruksjoner for å beregne eksponeringstiden til waferen.(eksponeringstid, ms) = (eksponeringsdose, mJ/cm2)/(lampeeffekt, mW/cm2).
Etter å ha bestemt eksponeringstiden, plasser fotomasken på maskeholderen til UV-maskejusteringen og plasser fotomasken på den SU-8-belagte waferen.
Plasser den trykte overflaten av fotomasken direkte på den SU-8-belagte siden av silisiumplaten for å minimere UV-spredning.
Eksponer den SU-8-belagte waferen og fotomasken vertikalt for 260 mJ/cm2 UV-lys i den forhåndsbestemte eksponeringstiden (se trinn 10 i denne boksen).
Etter UV-eksponering ble SU-8-belagte silisiumskiver bakt ved 65 °C i 5 minutter og 95 °C i 15 minutter på hver varmeplate for å lage mønstre med en høyde på 200 μm. Forleng etterbaketiden ved 95 °C til 30 minutter for å lage mønstre med en høyde på 500 µm.
Fremkalleren helles i en glassform, og den bakte oblaten legges i fatet. Volumet av SU-8 fremkaller kan variere avhengig av størrelsen på glassplaten. Sørg for å bruke nok SU-8 fremkaller til å fjerne ueksponert SU-8 fullstendig. For eksempel, når du bruker en 150 mm diameter glassfat med en kapasitet på 1 L med kapasitet på 5 SU-0 mL, bruk ca 20 SU-0 mL ganger. rotasjon.
Skyll den utviklede formen med ~10 mL fersk fremkaller etterfulgt av IPA ved å spraye løsningen med en pipette.
Plasser waferen i en plasmarenser og utsett for oksygenplasma (atmosfærisk gass, måltrykk 1 × 10−5 Torr, effekt 125 W) i 1,5 min.
Plasser waferen i en vakuumekssikkator med et glassglass inni. Wafere og objektglass kan plasseres side ved side. Hvis vakuumekssikkatoren er delt i flere lag av en plate, plasser objektglassene i det nedre kammeret og skivene i det øvre kammeret. Dropp 100 μL triklor(1H, fluorsilanglassoppløsning, 1H, 1H, fluorokyl og fluorglass) vakuum for silanisering.
Tin et hetteglass med frosne Caco-2-celler i et 37°C vannbad, overfør deretter de tinte cellene til en T75-kolbe som inneholder 15 mL 37°C forvarmet Caco-2-medium.
For å passere Caco-2-celler ved ~90% konfluens, varm først Caco-2-medium, PBS og 0,25% trypsin/1 mM EDTA i et 37°C vannbad.
Aspirer mediet ved vakuumaspirasjon. Vask cellene to ganger med 5 mL varm PBS ved å gjenta vakuumaspirasjonen og tilsette fersk PBS.