Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Utviklingen av mikrobielle parasitter innebærer en motvirkning mellom naturlig seleksjon, som får parasitter til å forbedre seg, og genetisk drift, som får parasitter til å miste gener og akkumulere skadelige mutasjoner.Her, for å forstå hvordan denne motvirkningen skjer på skalaen til et enkelt makromolekyl, beskriver vi kryo-EM-strukturen til ribosomet til Encephalitozoon cuniculi, en eukaryotisk organisme med et av de minste genomene i naturen.Den ekstreme reduksjonen av rRNA i E. cuniculi-ribosomer er ledsaget av enestående strukturelle endringer, slik som utviklingen av tidligere ukjente sammensmeltede rRNA-linkere og rRNA uten buler.I tillegg overlevde E. cuniculi-ribosomet tapet av rRNA-fragmenter og proteiner ved å utvikle evnen til å bruke små molekyler som strukturelle etterligninger av nedbrutt rRNA-fragmenter og proteiner.Totalt sett viser vi at molekylære strukturer lenge antatt å være redusert, degenerert og utsatt for ødeleggende mutasjoner har en rekke kompenserende mekanismer som holder dem aktive til tross for ekstreme molekylære sammentrekninger.
Fordi de fleste grupper av mikrobielle parasitter har unike molekylære verktøy for å utnytte vertene deres, må vi ofte utvikle forskjellige terapeutiske midler for forskjellige grupper av parasitter1,2.Nye bevis tyder imidlertid på at noen aspekter ved parasittevolusjon er konvergerende og stort sett forutsigbare, noe som indikerer et potensielt grunnlag for brede terapeutiske intervensjoner i mikrobielle parasitter3,4,5,6,7,8,9.
Tidligere arbeid har identifisert en vanlig evolusjonær trend i mikrobielle parasitter kalt genomreduksjon eller genomforfall10,11,12,13.Nåværende forskning viser at når mikroorganismer gir opp sin frittlevende livsstil og blir intracellulære parasitter (eller endosymbionter), gjennomgår genomene deres langsomme, men fantastiske metamorfoser over millioner av år9,11.I en prosess kjent som genomforfall, akkumulerer mikrobielle parasitter skadelige mutasjoner som gjør mange tidligere viktige gener til pseudogener, noe som fører til gradvis tap av gen og mutasjonskollaps14,15.Denne kollapsen kan ødelegge opptil 95 % av genene i de eldste intracellulære organismene sammenlignet med nært beslektede frittlevende arter.Dermed er utviklingen av intracellulære parasitter en dragkamp mellom to motstridende krefter: Darwinistisk naturlig utvalg, som fører til forbedring av parasitter, og kollapsen av genomet, som kaster parasitter i glemmeboken.Hvordan parasitten klarte å komme ut av denne dragkampen og beholde aktiviteten til sin molekylære struktur er fortsatt uklart.
Selv om mekanismen for genomforfall ikke er fullt ut forstått, ser det ut til å skje hovedsakelig på grunn av hyppig genetisk drift.Fordi parasitter lever i små, aseksuelle og genetisk begrensede populasjoner, kan de ikke effektivt eliminere skadelige mutasjoner som noen ganger oppstår under DNA-replikasjon.Dette fører til irreversibel akkumulering av skadelige mutasjoner og reduksjon av parasittgenomet.Som et resultat mister parasitten ikke bare gener som ikke lenger er nødvendige for dens overlevelse i det intracellulære miljøet.Det er parasittpopulasjoners manglende evne til effektivt å eliminere sporadiske skadelige mutasjoner som får disse mutasjonene til å akkumulere gjennom genomet, inkludert deres viktigste gener.
Mye av vår nåværende forståelse av genomreduksjon er utelukkende basert på sammenligninger av genomsekvenser, med mindre oppmerksomhet til endringer i faktiske molekyler som utfører husholdningsfunksjoner og fungerer som potensielle medikamentmål.Sammenlignende studier har vist at byrden av skadelige intracellulære mikrobielle mutasjoner ser ut til å disponere proteiner og nukleinsyrer til feilfolding og aggregering, noe som gjør dem mer chaperoneavhengige og overfølsomme for varme19,20,21,22,23.I tillegg opplevde ulike parasitter – uavhengig evolusjon noen ganger adskilt med så mye som 2,5 milliarder år – et lignende tap av kvalitetskontrollsentre i deres proteinsyntese5,6 og DNA-reparasjonsmekanismer24.Imidlertid er lite kjent om virkningen av intracellulær livsstil på alle andre egenskaper til cellulære makromolekyler, inkludert molekylær tilpasning til en økende byrde av skadelige mutasjoner.
I dette arbeidet, for å bedre forstå utviklingen av proteiner og nukleinsyrer fra intracellulære mikroorganismer, bestemte vi strukturen til ribosomer til den intracellulære parasitten Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi er en sopplignende organisme som tilhører en gruppe parasittiske mikrosporidier som har uvanlig små eukaryote genomer og derfor brukes som modellorganismer for å studere genomforfall25,26,27,28,29,30.Nylig ble cryo-EM-ribosomstrukturen bestemt for moderat reduserte genomer av Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom).Disse strukturene antyder at noe tap av rRNA-amplifikasjon kompenseres av utviklingen av nye kontakter mellom nærliggende ribosomale proteiner eller anskaffelse av nye msL131,32 ribosomale proteiner.Arter Encephalitozoon (genom ~2,5 millioner bp), sammen med deres nærmeste slektning Ordospora, demonstrerer den ultimate graden av genomreduksjon i eukaryoter - de har mindre enn 2000 proteinkodende gener, og det forventes at deres ribosomer ikke bare er blottet for rRNA-ekspansjonsfragmenter (rRNA-fragmenter av ribosomer) som også har fire diskaryotiske ribosomer. ribosomale proteiner på grunn av deres mangel på homologer i E. cuniculi-genomet26,27,28.Derfor konkluderte vi med at E. cuniculi-ribosomet kan avsløre tidligere ukjente strategier for molekylær tilpasning til genomforfall.
Vår kryo-EM-struktur representerer det minste eukaryote cytoplasmatiske ribosomet som skal karakteriseres og gir innsikt i hvordan den ultimate graden av genomreduksjon påvirker strukturen, sammenstillingen og utviklingen av det molekylære maskineriet som er integrert i cellen.Vi fant at E. cuniculi-ribosomet bryter med mange av de vidt bevarte prinsippene for RNA-folding og ribosomsamling, og oppdaget et nytt, tidligere ukjent ribosomalt protein.Helt uventet viser vi at mikrosporidieribosomer har utviklet evnen til å binde små molekyler, og antar at trunkeringer i rRNA og proteiner utløser evolusjonære innovasjoner som til slutt kan gi nyttige egenskaper til ribosomet.
For å forbedre vår forståelse av utviklingen av proteiner og nukleinsyrer i intracellulære organismer, bestemte vi oss for å isolere E. cuniculi-sporer fra kulturer av infiserte pattedyrceller for å rense deres ribosomer og bestemme strukturen til disse ribosomene.Det er vanskelig å oppnå et stort antall parasittiske mikrosporidier fordi mikrosporidier ikke kan dyrkes i et næringsmedium.I stedet vokser og formerer de seg bare inne i vertscellen.Derfor, for å oppnå E. cuniculi-biomasse for ribosomrensing, infiserte vi pattedyrnyrecellelinjen RK13 med E. cuniculi-sporer og dyrket disse infiserte cellene i flere uker for å tillate E. cuniculi å vokse og formere seg.Ved å bruke et infisert cellemonolag på omtrent en halv kvadratmeter klarte vi å rense rundt 300 mg Microsporidia-sporer og bruke dem til å isolere ribosomer.Vi brøt deretter de rensede sporene med glasskuler og isolerte de rå ribosomer ved å bruke trinnvis polyetylenglykolfraksjonering av lysatene.Dette tillot oss å oppnå omtrent 300 µg rå E. cuniculi-ribosomer for strukturell analyse.
Vi samlet deretter cryo-EM-bilder ved å bruke de resulterende ribosomprøvene og behandlet disse bildene ved å bruke masker som tilsvarer den store ribosomale underenheten, lite underenhetshode og liten underenhet.I løpet av denne prosessen samlet vi bilder av rundt 108 000 ribosomale partikler og beregnede kryo-EM-bilder med en oppløsning på 2,7 Å (tilleggsfigurer 1-3).Vi brukte deretter cryoEM-bilder for å modellere rRNA, ribosomalt protein og dvalefaktor Mdf1 assosiert med E. cuniculi-ribosomer (fig. 1a, b).
a Struktur av E. cuniculi-ribosomet i kompleks med dvalefaktoren Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kart over dvalefaktor Mdf1 assosiert med E. cuniculi-ribosomet.c Sekundær strukturkart som sammenligner gjenvunnet rRNA i mikrosporidiske arter med kjente ribosomale strukturer.Panelene viser plasseringen av de amplifiserte rRNA-fragmentene (ES) og ribosom-aktive steder, inkludert dekodingsstedet (DC), sarcinicin-løkken (SRL) og peptidyltransferasesenteret (PTC).d Elektrontettheten som tilsvarer peptidyltransferasesenteret til E. cuniculi-ribosomet antyder at dette katalytiske stedet har samme struktur i E. cuniculi-parasitten og dens verter, inkludert H. sapiens.e, f Den tilsvarende elektrontettheten til dekodingssenteret (e) og den skjematiske strukturen til dekodingssenteret (f) indikerer at E. cuniculi har rester U1491 i stedet for A1491 (E. coli-nummerering) i mange andre eukaryoter.Denne endringen antyder at E. cuniculi kan være følsom for antibiotika som retter seg mot dette aktive stedet.
I motsetning til de tidligere etablerte strukturene til V. necatrix og P. locustae ribosomer (begge strukturer representerer den samme microsporidia familien Nosematidae og er svært like hverandre), gjennomgår 31,32 E. cuniculi ribosomer en rekke prosesser med rRNA og proteinfragmentering.Ytterligere denaturering (Supplerende figurer 4-6).I rRNA inkluderte de mest slående endringene fullstendig tap av det amplifiserte 25S rRNA-fragmentet ES12L og delvis degenerering av h39-, h41- og H18-helikser (fig. 1c, tilleggsfig. 4).Blant ribosomale proteiner inkluderte de mest slående endringene fullstendig tap av eS30-proteinet og forkorting av eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- og eS7-proteinene (tillegg 5).
Således gjenspeiles den ekstreme reduksjonen av genomene til Encephalotozoon/Ordospora-arter i deres ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer opplever det mest dramatiske tapet av proteininnhold i eukaryote cytoplasmatiske ribosomer som er underlagt strukturell karakterisering, og de har ikke engang de rRNA- og proteinfragmentene som ikke bare er mye konservert i de tre domotene, men også i de tre domotene.Strukturen til E. cuniculi-ribosomet gir den første molekylære modellen for disse endringene og avslører evolusjonære hendelser som har blitt oversett av både komparativ genomikk og studier av intracellulær biomolekylær struktur (tilleggsfigur 7).Nedenfor beskriver vi hver av disse hendelsene sammen med deres sannsynlige evolusjonære opprinnelse og deres potensielle innvirkning på ribosomfunksjonen.
Vi fant da at i tillegg til store rRNA-trunkeringer, har E. cuniculi-ribosomer rRNA-variasjoner på et av deres aktive steder.Selv om peptidyltransferasesenteret til E. cuniculi-ribosomet har samme struktur som andre eukaryote ribosomer (fig. 1d), skiller dekodingssenteret seg på grunn av sekvensvariasjon ved nukleotid 1491 (E. coli-nummerering, fig. 1e, f).Denne observasjonen er viktig fordi dekodingsstedet til eukaryote ribosomer vanligvis inneholder rester G1408 og A1491 sammenlignet med rester av bakterietype A1408 og G1491.Denne variasjonen ligger til grunn for den forskjellige følsomheten til bakterielle og eukaryote ribosomer til aminoglykosidfamilien av ribosomale antibiotika og andre små molekyler som retter seg mot dekodingsstedet.På dekodingsstedet til E. cuniculi-ribosomet ble rest A1491 erstattet med U1491, noe som potensielt skapte et unikt bindingsgrensesnitt for små molekyler som retter seg mot dette aktive stedet.Den samme A14901-varianten finnes også i andre mikrosporidier som P. locustae og V. necatrix, noe som tyder på at den er utbredt blant mikrosporidia-arter (fig. 1f).
Fordi våre E. cuniculi-ribosomprøver ble isolert fra metabolsk inaktive sporer, testet vi cryo-EM-kartet til E. cuniculi for tidligere beskrevet ribosombinding under stress- eller sultforhold.Dvalefaktorer 31,32,36,37, 38. Vi matchet den tidligere etablerte strukturen til dvaleribosomet med cryo-EM-kartet til E. cuniculi-ribosomet.For dokking ble S. cerevisiae-ribosomer brukt i kompleks med dvalefaktor Stm138, gresshoppe-ribosomer i kompleks med Lso232-faktor og V. necatrix-ribosomer i kompleks med Mdf1- og Mdf231-faktorer.Samtidig fant vi kryo-EM-tettheten tilsvarende hvilefaktoren Mdf1.I likhet med Mdf1-binding til V. necatrix-ribosomet, binder Mdf1 seg også til E. cuniculi-ribosomet, hvor det blokkerer E-stedet til ribosomet, noe som muligens bidrar til å gjøre ribosomer tilgjengelige når parasittsporer blir metabolsk inaktive ved inaktivering av kroppen (Figur 2).).
Mdf1 blokkerer E-stedet til ribosomet, som ser ut til å hjelpe til med å inaktivere ribosomet når parasittsporer blir metabolsk inaktive.I strukturen til E. cuniculi-ribosomet fant vi at Mdf1 danner en tidligere ukjent kontakt med L1-ribosomstammen, den delen av ribosomet som letter frigjøringen av deacylert tRNA fra ribosomet under proteinsyntese.Disse kontaktene antyder at Mdf1 dissosierer fra ribosomet ved å bruke samme mekanisme som deacetylert tRNA, og gir en mulig forklaring på hvordan ribosomet fjerner Mdf1 for å reaktivere proteinsyntese.
Imidlertid avslørte strukturen vår en ukjent kontakt mellom Mdf1 og L1-ribosombenet (den delen av ribosomet som hjelper til med å frigjøre deacylert tRNA fra ribosomet under proteinsyntese).Spesielt bruker Mdf1 de samme kontaktene som albuesegmentet til det deacylerte tRNA-molekylet (fig. 2).Denne tidligere ukjente molekylære modelleringen viste at Mdf1 dissosierer fra ribosomet ved å bruke samme mekanisme som deacetylert tRNA, noe som forklarer hvordan ribosomet fjerner denne dvalefaktoren for å reaktivere proteinsyntesen.
Da vi konstruerte rRNA-modellen fant vi at E. cuniculi-ribosomet har unormalt foldede rRNA-fragmenter, som vi kalte sammensmeltet rRNA (fig. 3).I ribosomer som spenner over livets tre domener, folder rRNA seg til strukturer der de fleste rRNA-baser enten basepar og folder med hverandre eller interagerer med ribosomale proteiner38,39,40.I E. cuniculi-ribosomer ser det imidlertid ut til at rRNA bryter med dette foldeprinsippet ved å konvertere noen av spiralene deres til utfoldede rRNA-regioner.
Struktur av H18 25S rRNA helix i S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi.Vanligvis, i ribosomer som spenner over de tre livsdomenene, spoler denne linkeren seg inn i en RNA-helix som inneholder 24 til 34 rester.I Microsporidia, derimot, reduseres denne rRNA-linkeren gradvis til to enkeltstrengede uridinrike linkere som inneholder bare 12 rester.De fleste av disse restene er utsatt for løsemidler.Figuren viser at parasittiske mikrosporidier ser ut til å bryte med de generelle prinsippene for rRNA-folding, der rRNA-baser vanligvis er koblet til andre baser eller involvert i rRNA-protein-interaksjoner.I mikrosporidier får noen rRNA-fragmenter en ugunstig fold, der den tidligere rRNA-helixen blir et enkeltstrenget fragment som forlenges nesten i en rett linje.Tilstedeværelsen av disse uvanlige regionene gjør at mikrosporidia rRNA kan binde fjerne rRNA-fragmenter ved å bruke et minimalt antall RNA-baser.
Det mest slående eksemplet på denne evolusjonære overgangen kan observeres i H18 25S rRNA-helixen (fig. 3).Hos arter fra E. coli til mennesker inneholder basene til denne rRNA-helixen 24-32 nukleotider, og danner en litt uregelmessig helix.I tidligere identifiserte ribosomale strukturer fra V. necatrix og P. locustae,31,32 er basene til H18-helixen delvis avviklet, men nukleotidbaseparing er bevart.I E. cuniculi blir imidlertid dette rRNA-fragmentet de korteste linkerene 228UUUGU232 og 301UUUUUUUUUUU307.I motsetning til typiske rRNA-fragmenter, kveiler ikke disse uridinrike linkere seg eller kommer i omfattende kontakt med ribosomale proteiner.I stedet tar de i bruk løsemiddelåpne og fullt utfoldede strukturer der rRNA-trådene forlenges nesten rett.Denne utstrakte konformasjonen forklarer hvordan E. cuniculi bare bruker 12 RNA-baser for å fylle gapet på 33 Å mellom H16- og H18-rRNA-heliksene, mens andre arter krever minst dobbelt så mange rRNA-baser for å fylle gapet.
Dermed kan vi demonstrere at parasittiske mikrosporidier gjennom energetisk ugunstig folding har utviklet en strategi for å trekke sammen selv de rRNA-segmentene som forblir stort sett bevart på tvers av arter i de tre livsdomenene.Tilsynelatende, ved å akkumulere mutasjoner som transformerer rRNA-helikser til korte poly-U-linkere, kan E. cuniculi danne uvanlige rRNA-fragmenter som inneholder så få nukleotider som mulig for ligering av distale rRNA-fragmenter.Dette bidrar til å forklare hvordan mikrosporidia oppnådde en dramatisk reduksjon i sin grunnleggende molekylære struktur uten å miste sin strukturelle og funksjonelle integritet.
Et annet uvanlig trekk ved E. cuniculi rRNA er utseendet til rRNA uten fortykninger (fig. 4).Bulger er nukleotider uten basepar som vrir seg ut av RNA-helixen i stedet for å gjemme seg i den.De fleste rRNA-fremspring fungerer som molekylære lim, og hjelper til med å binde tilstøtende ribosomale proteiner eller andre rRNA-fragmenter.Noen av bulene fungerer som hengsler, og lar rRNA-helixen bøye seg og foldes optimalt for produktiv proteinsyntese 41 .
a Et rRNA-fremspring (S. cerevisiae-nummerering) er fraværende i E. cuniculi-ribosomstrukturen, men finnes i de fleste andre eukaryoter b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi interne ribosomer.parasitter mangler mange av de eldgamle, høyt bevarte rRNA-bulene.Disse fortykningene stabiliserer ribosomstrukturen;derfor indikerer deres fravær i mikrosporidier en redusert stabilitet av rRNA-folding i mikrosporidia-parasitter.Sammenligning med P-stammer (L7/L12-stammer i bakterier) viser at tapet av rRNA-humper noen ganger sammenfaller med oppkomsten av nye støt ved siden av de tapte støtene.H42-helixen i 23S/28S rRNA har en eldgammel bule (U1206 i Saccharomyces cerevisiae) anslått til å være minst 3,5 milliarder år gammel på grunn av beskyttelsen i tre livsdomener.I mikrosporidia er denne bulen eliminert.Imidlertid dukket det opp en ny bule ved siden av den tapte bulen (A1306 i E. cuniculi).
Påfallende nok fant vi at E. cuniculi-ribosomer mangler de fleste rRNA-bulene som finnes i andre arter, inkludert mer enn 30 buler bevart i andre eukaryoter (fig. 4a).Dette tapet eliminerer mange kontakter mellom ribosomale underenheter og tilstøtende rRNA-helikser, noen ganger skaper det store hulrom i ribosomet, noe som gjør E. cuniculi-ribosomet mer porøst sammenlignet med mer tradisjonelle ribosomer (fig. 4b).Spesielt fant vi at de fleste av disse bulene også gikk tapt i de tidligere identifiserte V. necatrix- og P. locustae-ribosomstrukturene, som ble oversett av tidligere strukturelle analyser31,32.
Noen ganger er tapet av rRNA-buler ledsaget av utviklingen av nye buler ved siden av den tapte bulen.For eksempel inneholder den ribosomale P-stammen en U1208-bule (i Saccharomyces cerevisiae) som overlevde fra E. coli til mennesker og er derfor beregnet til å være 3,5 milliarder år gammel.Under proteinsyntese hjelper denne bulen P-stammen med å bevege seg mellom åpne og lukkede konformasjoner slik at ribosomet kan rekruttere translasjonsfaktorer og levere dem til det aktive stedet.I E. cuniculi-ribosomer er denne fortykningen fraværende;imidlertid kan en ny fortykkelse (G883) kun plassert i tre basepar bidra til å gjenopprette den optimale fleksibiliteten til P-stammen (fig. 4c).
Våre data om rRNA uten buler antyder at rRNA-minimering ikke er begrenset til tap av rRNA-elementer på overflaten av ribosomet, men kan også involvere ribosomkjernen, noe som skaper en parasittspesifikk molekylær defekt som ikke er beskrevet i frittlevende celler.levende arter observeres.
Etter modellering av kanoniske ribosomale proteiner og rRNA fant vi at konvensjonelle ribosomale komponenter ikke kan forklare de tre delene av kryo-EM-bildet.To av disse fragmentene er små molekyler i størrelse (fig. 5, tilleggsfig. 8).Det første segmentet er klemt mellom de ribosomale proteinene uL15 og eL18 i en posisjon som vanligvis er okkupert av C-terminalen til eL18, som er forkortet i E. cuniculi.Selv om vi ikke kan bestemme identiteten til dette molekylet, er størrelsen og formen på denne tetthetsøya godt forklart av tilstedeværelsen av spermidinmolekyler.Bindingen til ribosomet stabiliseres av mikrosporidia-spesifikke mutasjoner i uL15-proteinene (Asp51 og Arg56), som ser ut til å øke affiniteten til ribosomet for dette lille molekylet, da de lar uL15 pakke det lille molekylet inn i en ribosomal struktur.Supplerende figur 2).8, tilleggsdata 1, 2).
Cryo-EM-avbildning som viser tilstedeværelsen av nukleotider utenfor ribosen bundet til E. cuniculi-ribosomet.I E. cuniculi-ribosomet opptar dette nukleotidet samme plass som 25S rRNA A3186-nukleotidet (Saccharomyces cerevisiae-nummerering) i de fleste andre eukaryote ribosomer.b I den ribosomale strukturen til E. cuniculi ligger dette nukleotidet mellom de ribosomale proteinene uL9 og eL20, og stabiliserer dermed kontakten mellom de to proteinene.cd eL20-sekvenskonserveringsanalyse blant mikrosporidia-arter.Det fylogenetiske treet til Microsporidia-arter (c) og multippelsekvensjustering av eL20-proteinet (d) viser at nukleotidbindende rester F170 og K172 er bevart i de fleste typiske Microsporidia, med unntak av S. lophii, med unntak av tidlig forgrenende Microsporidia, som beholdt ES39L-forlengelsen.e Denne figuren viser at nukleotidbindende rester F170 og K172 bare er tilstede i eL20 i det sterkt reduserte mikrosporidia-genomet, men ikke i andre eukaryoter.Totalt sett antyder disse dataene at mikrosporidiske ribosomer har utviklet et nukleotidbindingssted som ser ut til å binde AMP-molekyler og bruke dem til å stabilisere protein-protein-interaksjoner i den ribosomale strukturen.Den høye bevaringen av dette bindingsstedet i Microsporidia og dets fravær i andre eukaryoter antyder at dette stedet kan gi en selektiv overlevelsesfordel for Microsporidia.Dermed ser ikke den nukleotidbindende lommen i mikrosporidia-ribosomet ut til å være et degenerert trekk eller sluttform for rRNA-nedbrytning som tidligere beskrevet, men snarere en nyttig evolusjonær innovasjon som lar mikrosporidia-ribosomet direkte binde små molekyler, ved å bruke dem som molekylære byggesteiner.byggesteiner for ribosomer.Denne oppdagelsen gjør mikrosporidia-ribosomet til det eneste ribosomet som er kjent for å bruke et enkelt nukleotid som dets strukturelle byggestein.f Hypotetisk evolusjonsvei avledet fra nukleotidbinding.
Den andre lavmolekylære tettheten er lokalisert ved grensesnittet mellom ribosomale proteiner uL9 og eL30 (fig. 5a).Dette grensesnittet ble tidligere beskrevet i strukturen til Saccharomyces cerevisiae-ribosomet som et bindingssted for 25S-nukleotidet til rRNA A3186 (del av ES39L rRNA-forlengelsen)38.Det ble vist at i degenererte P. locustae ES39L ribosomer, binder dette grensesnittet et ukjent enkelt nukleotid 31, og det antas at dette nukleotidet er en redusert endelig form av rRNA, hvor lengden på rRNA er ~130-230 baser.ES39L er redusert til et enkelt nukleotid 32.43.Våre kryo-EM-bilder støtter ideen om at tetthet kan forklares med nukleotider.Den høyere oppløsningen av strukturen vår viste imidlertid at dette nukleotidet er et ekstraribosomalt molekyl, muligens AMP (fig. 5a, b).
Vi spurte så om nukleotidbindingssetet dukket opp i E. cuniculi-ribosomet eller om det eksisterte tidligere.Siden nukleotidbinding hovedsakelig medieres av Phe170- og Lys172-restene i eL30-ribosomproteinet, vurderte vi bevaringen av disse restene i 4396 representative eukaryoter.Som i tilfellet med uL15 ovenfor fant vi at Phe170- og Lys172-restene er svært konserverte bare i typiske Microsporidia, men fraværende i andre eukaryoter, inkludert atypiske Microsporidia Mitosporidium og Amphiamblys, hvor ES39L rRNA-fragmentet ikke er redusert 44, 45, 45, 45, 45).-e).
Til sammen støtter disse dataene ideen om at E. cuniculi og muligens andre kanoniske mikrosporidier har utviklet evnen til effektivt å fange opp et stort antall små metabolitter i ribosomstrukturen for å kompensere for nedgangen i rRNA- og proteinnivåer.Ved å gjøre dette har de utviklet en unik evne til å binde nukleotider utenfor ribosomet, noe som viser at parasittiske molekylære strukturer kompenserer ved å fange opp rikelig med små metabolitter og bruke dem som strukturelle etterligninger av nedbrutt RNA og proteinfragmenter..
Den tredje usimulerte delen av cryo-EM-kartet vårt, funnet i den store ribosomale underenheten.Den relativt høye oppløsningen (2,6 Å) på kartet vårt antyder at denne tettheten tilhører proteiner med unike kombinasjoner av store sidekjederester, noe som tillot oss å identifisere denne tettheten som et tidligere ukjent ribosomalt protein som vi identifiserte som Det ble kalt msL2 (Microsporidia-spesifikt protein L2) (metoder, figur 6).Vårt homologisøk viste at msL2 er bevart i Microsporidia-kladen av slekten Encephaliter og Orosporidium, men fraværende i andre arter, inkludert andre Microsporidia.I den ribosomale strukturen opptar msL2 et gap dannet ved tap av det utvidede ES31L rRNA.I dette tomrommet hjelper msL2 med å stabilisere rRNA-folding og kan kompensere for tapet av ES31L (Figur 6).
en elektrontetthet og modell av det Microsporidia-spesifikke ribosomale proteinet msL2 funnet i E. cuniculi-ribosomer.b De fleste eukaryote ribosomer, inkludert 80S-ribosomet til Saccharomyces cerevisiae, har tapt ES19L rRNA-amplifikasjon i de fleste mikrosporidiske arter.Den tidligere etablerte strukturen til V. necatrix microsporidia-ribosomet antyder at tapet av ES19L i disse parasittene kompenseres av utviklingen av det nye ribosomale msL1-proteinet.I denne studien fant vi at E. cuniculi-ribosomet også utviklet et ekstra ribosomalt RNA-lignende protein som en tilsynelatende kompensasjon for tapet av ES19L.Imidlertid har msL2 (for tiden annotert som det hypotetiske ECU06_1135-proteinet) og msL1 forskjellig strukturell og evolusjonær opprinnelse.c Denne oppdagelsen av generering av evolusjonært urelaterte msL1 og msL2 ribosomale proteiner antyder at hvis ribosomer akkumulerer skadelige mutasjoner i rRNA, kan de oppnå enestående nivåer av komposisjonsmangfold i selv en liten undergruppe av nært beslektede arter.Denne oppdagelsen kan bidra til å avklare opprinnelsen og utviklingen til mitokondrieribosomet, som er kjent for sitt sterkt reduserte rRNA og unormale variasjoner i proteinsammensetning på tvers av arter.
Vi sammenlignet deretter msL2-proteinet med det tidligere beskrevne msL1-proteinet, det eneste kjente mikrosporidia-spesifikke ribosomale proteinet som finnes i V. necatrix-ribosomet.Vi ønsket å teste om msL1 og msL2 er evolusjonært relatert.Vår analyse viste at msL1 og msL2 okkuperer samme hulrom i ribosomstrukturen, men har forskjellige primære og tertiære strukturer, noe som indikerer deres uavhengige evolusjonære opprinnelse (fig. 6).Dermed gir vår oppdagelse av msL2 bevis på at grupper av kompakte eukaryote arter uavhengig kan utvikle strukturelt distinkte ribosomale proteiner for å kompensere for tapet av rRNA-fragmenter.Dette funnet er bemerkelsesverdig ved at de fleste cytoplasmatiske eukaryote ribosomer inneholder et invariant protein, inkludert den samme familien på 81 ribosomale proteiner.Utseendet til msL1 og msL2 i forskjellige klader av mikrosporidier som svar på tapet av utvidede rRNA-segmenter antyder at nedbrytning av parasittens molekylære arkitektur får parasitter til å søke kompenserende mutasjoner, noe som til slutt kan føre til at de blir anskaffet i forskjellige parasittpopulasjoner.strukturer.
Til slutt, da modellen vår var fullført, sammenlignet vi sammensetningen av E. cuniculi-ribosomet med den som ble forutsagt fra genomsekvensen.Flere ribosomale proteiner, inkludert eL14, eL38, eL41 og eS30, ble tidligere antatt å mangle fra E. cuniculi-genomet på grunn av det tilsynelatende fraværet av deres homologer fra E. cuniculi-genomet.Tap av mange ribosomale proteiner er også spådd i de fleste andre sterkt reduserte intracellulære parasitter og endosymbionter.For eksempel, selv om de fleste frittlevende bakterier inneholder den samme familien på 54 ribosomale proteiner, har bare 11 av disse proteinfamiliene påvisbare homologer i hvert analysert genom av vertsbegrensede bakterier.Til støtte for denne forestillingen har et tap av ribosomale proteiner blitt observert eksperimentelt i V. necatrix og P. locustae microsporidia, som mangler proteinene eL38 og eL4131,32.
Imidlertid viser strukturene våre at bare eL38, eL41 og eS30 faktisk går tapt i E. cuniculi-ribosomet.eL14-proteinet ble bevart og vår struktur viste hvorfor dette proteinet ikke ble funnet i homologisøket (fig. 7).I E. cuniculi-ribosomer går det meste av eL14-bindingssetet tapt på grunn av nedbrytning av rRNA-amplifisert ES39L.I fravær av ES39L mistet eL14 det meste av sin sekundære struktur, og bare 18 % av eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi og S. cerevisiae.Denne dårlige sekvensbevaringen er bemerkelsesverdig fordi selv Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens – organismer som utviklet seg med 1,5 milliarder år fra hverandre – deler mer enn 51 % av de samme restene i eL14.Dette unormale tapet av konservering forklarer hvorfor E. cuniculi eL14 for tiden er annotert som det antatte M970_061160-proteinet og ikke som det ribosomale proteinet eL1427.
og Microsporidia-ribosomet mistet ES39L rRNA-forlengelsen, noe som delvis eliminerte eL14-ribosomproteinbindingsstedet.I fravær av ES39L gjennomgår eL14 mikrosporeproteinet et tap av sekundær struktur, der den tidligere rRNA-bindende α-helixen degenererer til en løkke med minimal lengde.b Multippelsekvensjustering viser at eL14-proteinet er sterkt konservert i eukaryote arter (57 % sekvensidentitet mellom gjær- og humane homologer), men dårlig konservert og divergerende i mikrosporidier (hvor ikke mer enn 24 % av restene er identiske med eL14-homologen).fra S. cerevisiae eller H. sapiens).Denne dårlige sekvensbevaringen og sekundære strukturvariabiliteten forklarer hvorfor eL14-homologen aldri har blitt funnet i E. cuniculi og hvorfor dette proteinet antas å ha gått tapt i E. cuniculi.I motsetning til dette ble E. cuniculi eL14 tidligere merket som et antatt M970_061160-protein.Denne observasjonen antyder at mikrosporidia-genomdiversiteten for tiden er overvurdert: noen gener som i dag antas å være tapt i mikrosporidier er faktisk bevart, om enn i svært differensierte former;i stedet antas noen å kode for mikrosporidia-gener for ormespesifikke proteiner (f.eks. det hypotetiske proteinet M970_061160) som faktisk koder for de svært forskjellige proteinene som finnes i andre eukaryoter.
Dette funnet antyder at rRNA-denaturering kan føre til et dramatisk tap av sekvensbevaring i tilstøtende ribosomale proteiner, noe som gjør disse proteinene uoppdagelige for homologisøk.Dermed kan vi overvurdere den faktiske graden av molekylær nedbrytning i små genomorganismer, siden noen proteiner som antas å gå tapt faktisk vedvarer, om enn i svært endrede former.
Hvordan kan parasitter beholde funksjonen til sine molekylære maskiner under forhold med ekstrem genomreduksjon?Vår studie svarer på dette spørsmålet ved å beskrive den komplekse molekylstrukturen (ribosomet) til E. cuniculi, en organisme med et av de minste eukaryote genomene.
Det har vært kjent i nesten to tiår at protein- og RNA-molekyler i mikrobielle parasitter ofte skiller seg fra sine homologe molekyler i frittlevende arter fordi de mangler kvalitetskontrollsentre, er redusert til 50 % av størrelsen i frittlevende mikrober, etc. .mange svekkende mutasjoner som svekker folding og funksjon.For eksempel forventes ribosomene til små genomorganismer, inkludert mange intracellulære parasitter og endosymbionter, å mangle flere ribosomale proteiner og opptil en tredjedel av rRNA-nukleotider sammenlignet med frittlevende arter 27, 29, 30, 49. Imidlertid studerte måten disse molekylene fungerer på i hovedsak i mystery, gjennom store genomiske rester.
Vår studie viser at strukturen til makromolekyler kan avsløre mange aspekter ved evolusjon som er vanskelige å trekke ut fra tradisjonelle komparative genomiske studier av intracellulære parasitter og andre vertsbegrensede organismer (Supplerende Fig. 7).Eksempelet med eL14-proteinet viser for eksempel at vi kan overvurdere den faktiske nedbrytningsgraden av det molekylære apparatet hos parasittiske arter.Encefalittparasitter antas nå å ha hundrevis av mikrosporidia-spesifikke gener.Imidlertid viser resultatene våre at noen av disse tilsynelatende spesifikke genene faktisk bare er veldig forskjellige varianter av gener som er vanlige i andre eukaryoter.Dessuten viser eksemplet med msL2-proteinet hvordan vi overser nye ribosomale proteiner og undervurderer innholdet i parasittiske molekylmaskiner.Eksemplet med små molekyler viser hvordan vi kan overse de mest geniale nyvinningene i parasittiske molekylstrukturer som kan gi dem ny biologisk aktivitet.
Til sammen forbedrer disse resultatene vår forståelse av forskjellene mellom de molekylære strukturene til vertsbegrensede organismer og deres motstykker i frittlevende organismer.Vi viser at molekylære maskiner, som lenge har vært antatt å være redusert, degenerert og utsatt for ulike ødeleggende mutasjoner, i stedet har et sett med systematisk oversett uvanlige strukturelle trekk.
På den annen side antyder de ikke-voluminøse rRNA-fragmentene og sammensmeltede fragmentene som vi fant i ribosomene til E. cuniculi at genomreduksjon kan endre selv de delene av det grunnleggende molekylære maskineriet som er bevart i livets tre domener – etter nesten 3,5 milliarder år .uavhengig utvikling av arter.
De bulefrie og sammensmeltede rRNA-fragmentene i E. cuniculi-ribosomer er av spesiell interesse i lys av tidligere studier av RNA-molekyler i endosymbiotiske bakterier.For eksempel, i bladlusendosymbiont Buchnera aphidicola, har rRNA- og tRNA-molekyler vist seg å ha temperaturfølsomme strukturer på grunn av A+T-sammensetningsskjevhet og en høy andel ikke-kanoniske basepar20,50.Disse endringene i RNA, så vel som endringer i proteinmolekyler, antas nå å være ansvarlige for endosymbionters overavhengighet av partnere og manglende evne til endosymbionter til å overføre varme 21, 23 .Selv om parasittisk mikrosporidia rRNA har strukturelt distinkte endringer, antyder arten av disse endringene at redusert termisk stabilitet og høyere avhengighet av chaperoneproteiner kan være vanlige trekk ved RNA-molekyler i organismer med redusert genom.
På den annen side viser strukturene våre at parasittmikrosporidier har utviklet en unik evne til å motstå bredt konserverte rRNA- og proteinfragmenter, og utvikler evnen til å bruke rikelig og lett tilgjengelige små metabolitter som strukturelle etterligninger av degenererte rRNA- og proteinfragmenter.Nedbrytning av molekylær struktur..Denne oppfatningen støttes av det faktum at små molekyler som kompenserer for tapet av proteinfragmenter i rRNA og ribosomer av E. cuniculi binder seg til mikrosporidia-spesifikke rester i proteinene uL15 og eL30.Dette antyder at binding av små molekyler til ribosomer kan være et produkt av positiv seleksjon, der Microsporidia-spesifikke mutasjoner i ribosomale proteiner er valgt for deres evne til å øke affiniteten til ribosomer for små molekyler, noe som kan føre til mer effektive ribosomale organismer.Oppdagelsen avslører en smart innovasjon i den molekylære strukturen til mikrobielle parasitter og gir oss en bedre forståelse av hvordan parasittmolekylære strukturer opprettholder sin funksjon til tross for reduktiv evolusjon.
For tiden er identifiseringen av disse små molekylene uklar.Det er ikke klart hvorfor utseendet til disse små molekylene i den ribosomale strukturen er forskjellig mellom mikrosporidia-arter.Spesielt er det ikke klart hvorfor nukleotidbinding observeres i ribosomene til E. cuniculi og P. locustae, og ikke i ribosomene til V. necatrix, til tross for tilstedeværelsen av F170-resten i eL20- og K172-proteinene til V. necatrix.Denne delesjonen kan være forårsaket av rest 43 uL6 (plassert ved siden av nukleotidbindingslommen), som er tyrosin i V. necatrix og ikke treonin i E. cuniculi og P. locustae.Den klumpete aromatiske sidekjeden til Tyr43 kan forstyrre nukleotidbinding på grunn av sterisk overlapping.Alternativt kan den tilsynelatende nukleotidslettingen skyldes den lave oppløsningen av kryo-EM-avbildning, som hindrer modelleringen av V. necatrix ribosomale fragmenter.
På den annen side antyder vårt arbeid at prosessen med genomforfall kan være en oppfinnerkraft.Spesielt antyder strukturen til E. cuniculi-ribosomet at tapet av rRNA- og proteinfragmenter i mikrosporidia-ribosomet skaper et evolusjonært trykk som fremmer endringer i ribosomstrukturen.Disse variantene forekommer langt fra det aktive stedet til ribosomet og ser ut til å bidra til å opprettholde (eller gjenopprette) optimal ribosomsammenstilling som ellers ville blitt forstyrret av redusert rRNA.Dette antyder at en stor innovasjon av mikrosporidia-ribosomet ser ut til å ha utviklet seg til et behov for å buffere gendrift.
Kanskje illustreres dette best ved nukleotidbinding, som aldri har blitt observert i andre organismer så langt.Det faktum at nukleotidbindende rester er tilstede i typiske mikrosporidier, men ikke i andre eukaryoter, antyder at nukleotidbindende steder ikke bare er relikvier som venter på å forsvinne, eller det endelige stedet for rRNA som skal gjenopprettes til form av individuelle nukleotider.I stedet virker denne siden som en nyttig funksjon som kunne ha utviklet seg over flere runder med positiv seleksjon.Nukleotidbindingssteder kan være et biprodukt av naturlig seleksjon: når ES39L er degradert, blir mikrosporidier tvunget til å søke kompensasjon for å gjenopprette optimal ribosombiogenese i fravær av ES39L.Siden dette nukleotidet kan etterligne de molekylære kontaktene til A3186-nukleotidet i ES39L, blir nukleotidmolekylet en byggestein i ribosomet, hvis binding forbedres ytterligere ved mutasjon av eL30-sekvensen.
Når det gjelder den molekylære utviklingen av intracellulære parasitter, viser vår studie at kreftene til darwinistisk naturlig seleksjon og genetisk drift av genomforfall ikke opererer parallelt, men svinger.For det første eliminerer genetisk drift viktige egenskaper ved biomolekyler, noe som gjør kompensasjon sårt nødvendig.Først når parasitter tilfredsstiller dette behovet gjennom darwinistisk naturlig utvalg, vil makromolekylene deres ha en sjanse til å utvikle sine mest imponerende og innovative egenskaper.Viktigere er at utviklingen av nukleotidbindingsseter i E. cuniculi-ribosomet antyder at dette tap-til-vinnende mønsteret for molekylær evolusjon ikke bare amortiserer skadelige mutasjoner, men noen ganger gir helt nye funksjoner til parasittiske makromolekyler.
Denne ideen er forenlig med Sewell Wrights bevegelige likevektsteori, som sier at et strengt system med naturlig utvalg begrenser organismenes evne til å innovere51,52,53.Men hvis genetisk drift forstyrrer naturlig seleksjon, kan disse driftene produsere endringer som ikke i seg selv er adaptive (eller til og med skadelige), men som fører til ytterligere endringer som gir høyere kondisjon eller ny biologisk aktivitet.Rammeverket vårt støtter denne ideen ved å illustrere at den samme typen mutasjon som reduserer folden og funksjonen til et biomolekyl ser ut til å være hovedutløseren for forbedringen.I tråd med vinn-vinn evolusjonsmodellen viser vår studie at genomforfall, tradisjonelt sett på som en degenerativ prosess, også er en viktig drivkraft for innovasjon, og noen ganger og kanskje til og med ofte lar makromolekyler tilegne seg nye parasittiske aktiviteter.kan bruke dem.