Næringsinnsamling og -distribusjon integrerer insektfôring og livshistorietrekk. For å kompensere for mangler i spesifikke næringsstoffer i forskjellige livsstadier, kan insekter få tak i disse næringsstoffene gjennom tilleggsfôring, for eksempel ved å spise av virveldyrsekreter i en prosess kjent som sølepytter. Myggen Anopheles ser derfor ut til å være både malentrisk og arabiansk metabolisme. reproduksjon. Målet med denne studien var å vurdere om An.arabiensis agitasjon på kuurin for næringsopptak forbedrer livshistoriekarakteristika.
Sørg for at det er trygt.arabiensis ble tiltrukket av lukten av fersk, 24-timers, 72-timers og 168-timers gammel kuurin, og vertssøkende og blodmatet (48 timer etter blodmåltid) hunner ble målt i et Y-rør olfaktometer, og gravide kvinner ble deretter brukt for å identifisere bioaktive kjemiske forbindelser og elektroaktive hunner ble analysert for å identifisere en biologisk fysiologisk kjemisk analyse. kuurin i alle fire aldersklasser.Syntetiske blandinger av bioaktive forbindelser ble evaluert i Y-rør og feltforsøk.For å undersøke kuurin og dens viktigste nitrogenholdige sammensetning urea som potensielle tilleggsdietter for malariavektorer, ble fôringsparametere og livshistoriekarakteristika målt.Andelen av hunnmyggabsorberte urin og mengden av hunnmygg som ble absorbert, og mengden av hunnmygg som ble absorbert, ble vurdert av hunnurin og absorbert urin. overlevelse, bundet flukt og reproduksjon.
Søk etter vertens blod og næring. I laboratorie- og feltstudier ble araberne tiltrukket av den naturlige og syntetiske duften av fersk og gammel kuurin. Gravide kvinner var likegyldige til kuurinresponser på gytesteder. Vertsøkende og blodsugende hunner absorberer aktivt kuurin og histourea i henhold til disse fysiologiske ressurser og liv-survi-tilstander, som en funksjon av fysiologisk flukt og liv. val, eller reproduksjon.
Anopheles arabinis oppsamling og distribusjon av kuurin for forbedrede livshistoriekarakteristikker. Supplerende fôring av kuurin påvirker vektorkapasiteten direkte ved å øke daglig overlevelse og vektortetthet, og indirekte ved å endre flyaktivitet og bør derfor vurderes i fremtidige modeller.
Næringsinnsamling og -distribusjon integrerer insektfôring og livshistoriekarakteristikker [1,2,3].Insekter er i stand til å velge og tilegne seg mat og utføre kompenserende fôring basert på mattilgjengelighet og næringsbehov [1, 3]. Fordelingen av næringsstoffer avhenger av livshistorieprosessen og kan føre til ulike krav til kostholdskvalitet og -mengde i ulike livsstadier [1]. Når det gjelder spesifikke næringsstoffer, kan insekter få tak i disse næringsstoffene gjennom tilleggsfôring, som for eksempel på gjørme, ulike ekskrementer og sekresjoner fra virveldyr, og åtsler, en prosess kjent som sølepytter [2]. Selv om en rekke sommerfugl- og møllarter primært er beskrevet, forekommer vannhull også i andre disse typer insekter av fôr og helse, og kan ha betydelig effekt på andre insekttyper av fôr og ressurser. 2, 4, 5, 6] ,7].Malariamyggen Anopheles gambiae sensu lato (sl) fremstår som en "underernært" voksen [8], så vanning kan spille en viktig rolle i dens livshistoriekarakteristikker, men denne atferden har så langt blitt neglisjert. Bruken av agitasjon som et middel til å øke oppmerksomheten i dette kan ha viktige konsekvenser for epidemien.
Nitrogeninntak hos voksne kvinnelige Anopheles-mygg er begrenset på grunn av lave kalorireserver fraktet fra larvestadiet og ineffektiv utnyttelse av blodmel [9]. Kvinne Ann.gambiae sl kompenserer typisk for dette ved å supplere med supplerende blodmåltider [10, 11], og dermed sette flere mennesker i fare for å pådra seg sykdommen og øke myggtilskuddet i stor grad. utskillelse av virveldyr for å tilegne seg nitrogenholdige forbindelser som forbedrer tilpasning og fluktmanøvrerbarhet, som demonstrert av andre insekter [2]. I denne forbindelse er den sterke og distinkte tiltrekningen til en av søskenartene i An. Det gambiske sl-artskomplekset, Anopheles arabinis, fersk og gammel kuurin [12,13, er interessant dens preferens [12,13, er interessant for dens anisporter], og er interessant i dens preferens. å assosiere seg med og fôre på storfe. Kuurin er en ressurs rik på nitrogenholdige forbindelser, med urea som står for 50-95 % av det totale nitrogenet i fersk urin [15, 16]. Når kuurin eldes, bruker mikroorganismer disse ressursene til å redusere kompleksiteten til nitrogenholdige forbindelser innen 24 timer, med en rask økning i 24 timer, 15 timer i organiske mengder. kalofile mikroorganismer (hvorav mange produserer forbindelser som er giftige for mygg) trives [15], som kan være kvinnelige Ann.arabiensis er fortrinnsvis tiltrukket av urin i alderen 24 timer eller mindre [13, 14].
I denne studien ble det søkt etter verts- og blodmatede Ans. I løpet av sin første gonadotropin-syklus ble arabiensis vurdert for erverv av nitrogenholdige forbindelser, inkludert urea, ved urinblanding. Deretter ble det utført en serie eksperimenter for å vurdere hvordan hunnmygg allokerer denne potensielle næringsressursen, for å forbedre overlevelse og å gjenskape urinen for å gjenskape friske lukter og gi frisk urin. e ble vurdert for å avgjøre om disse ga pålitelige ledetråder for verts- og blodmatede An. I deres søk etter denne potensielle ernæringsressursen, oppdaget arabiensis kjemiske korrelasjoner bak den observerte differensielle attraktiviteten. Syntetiske luktblandinger av flyktige organiske forbindelser (VOC) identifisert i 24-timers aldret urin ble ytterligere evaluert under laboratorie- og luktforhold på urin- og laboratorieforhold. forskjellige fysiologiske tilstander.Myggattraksjon. De oppnådde resultatene bekrefter at An.arabiensis tilegner seg og distribuerer nitrogenholdige forbindelser som finnes i virveldyrsurin for å påvirke livshistoriekarakteristika. Disse resultatene diskuteres i sammenheng med potensielle epidemiologiske konsekvenser og hvordan de kan brukes til vektorovervåking og kontroll.
Anopheles arabicans (Dongola-stamme) ble holdt ved 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RF og en 12:12 timers lys:mørke-syklus. Larvene ble oppdrettet i plastbakker (20 cm × 18 cm × 7 cm) fylt med destillert vann og matet med Tetramin® ® med Tetramin® . 0 ml kopper (Nolato Hertila, Åstorp, SE) og deretter overført til Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) for å tillate voksen oppvekst. Voksne ble forsynt med en 10 % sukroseløsning ad libitum inntil 4 dager etter oppkomsten ble tilbudt fra verts- eller natteksperimentet, som ble tilbudt fra verts- eller natt. bearbeidet vann før eksperimentet, som beskrevet nedenfor. Hunnene som ble brukt til flyrørseksperimenter ble sultet i bare 4-6 timer med vann ad libitum. For å forberede blodsugende mygg for påfølgende bioassays, ble 4 dpe hunner forsynt med defibrotisk saueblod (Håtunalab, Bro, SE) ved hjelp av et membranfôringssystem (Hemotekyccrington, UK ble deretter konstruert til overføring av hunner, UK). individuelle bur og ga diett direkte, som beskrevet nedenfor, eller 10 % sukrose ad libitum i 3 dager før forsøkene beskrevet nedenfor. Sistnevnte hunner ble brukt til flyrørsbioanalyser og overført til laboratoriet, og hadde deretter destillert vann ad libitum i 4-6 timer før eksperimentet.
Fôringsanalyser ble brukt til å kvantifisere urin- og ureaforbruk hos voksne An.Arab hunner. Vertsøkende og blodmatede hunner ble gitt en diett som inneholdt 1 % fortynnet fersk og gammel kuurin, ulike konsentrasjoner av urea og to kontroller (10 % sukrose og vann) i 48 timer. I tillegg 5 mg mlani-12 xylen 12 xylen 12 xylen 12 xylen; -1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ble lagt til dietten og levert i en 4 × 4 matrise i 250 µl mikrosentrifugerør (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Figur 1A) Fyll til kanten (~300 µl). For å unngå konkurranse mellom mygg og potensielle farger på 1 cm i diameter på mygg og 1 cm store mygg (d2 cm) 6 cm i høyden; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figur 1A) i fullstendig mørke ved 25 ± 2 cm °C og 65 ± 5 % relativ fuktighet. Disse eksperimentene ble gjentatt 5 til 10 ganger. Etter eksponering for diett ble mygg plassert ved -20 °C inntil videre analyse.
Se etter bovin urin og urea absorbert av verten og den blodsugende hunnen Anopheles arabianus. I fôringsforsøk (A) fikk hunnmygg en diett bestående av fersk og gammel kuurin, ulike konsentrasjoner av urea, sukrose (10%) og destillert vann (H2O). Vertsøkende blod som ble absorbert (B) ikke suget til mer (B) suget til blod. te at vertssøkende hunner absorberte 72 timers kuurin mindre enn 168 timers kuurin (B).Den gjennomsnittlige totale nitrogeninnholdet (± standardavvik) i urinen er representert i innlegget.Vertssøkende (D, F) og blodsugende (E, G) hunner tar opp urea i et doseavhengige volum fra hver av hverandre (D-anordnede) forskjellige (D-anordnede) volum (D-en annen signifikant). måte ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Feilstolper representerer standardfeil for gjennomsnittet (BE). Den rette stiplede linjen representerer den log-lineære regresjonslinjen (F, G)
For å frigjøre absorbert mat ble myggene plassert individuelt i 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 230 µl destillert vann, og vevet ble ødelagt ved bruk av en engangsstøter og batteridrevet motor (VWR International, Lund, SE), etterfulgt av sentrifugering ved 10 krpm i 10 minutter. rik) og absorbans (λ620) ble bestemt ved bruk av en spektrofotometer-basert mikroplateleser (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativt ble myggen malt i 1 ml destillert vann, hvorav 900 µl ble overført til en kyvette2-analyse for λ,0m, 0, 0, 0, 0 , Kista, SE). For å kvantifisere diettinntaket ble det utarbeidet en standardkurve ved seriefortynning for å gi 0,2 µl til 2,4 µl 1 mg ml-1 xylencyanid. Deretter ble den optiske tettheten til kjente fargestoffkonsentrasjoner brukt til å bestemme mengden mat hver mygg inntok.
Volumdata ble analysert ved bruk av enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc parvise sammenligninger (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Lineære regresjonsanalyser beskrev konsentrasjonsavhengige ureainntak og sammenlignet mosquis-sucking responser mellom prism-Graads-hosts. 0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Omtrent 20 µl urinprøver fra hver aldersgruppe ble bundet på Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) og innkapslet i tinnkapsler (8 mm × 5 mm). Kapslene ble satt inn i forbrenningskammeret til en 0,0-, MA-, Scientificer Fish, CHNS/O, Scientificer, Fish0. , USA) for å bestemme nitrogeninnholdet i fersk og modnet urin i henhold til produsentens protokoll. Totalt nitrogen (g N l-1) ble kvantifisert basert på kjente ureakonsentrasjoner brukt som standard.
For å vurdere effekten av kosthold på vertssøkende og blodsugende kvinnelige overlevelse, ble myggene plassert individuelt i store petriskåler (12 cm i diameter og 6 cm i høyden; Semadeni) med et nettingdekket hull i lokket (3 cm i diameter) med For ventilasjon og matforsyning. Dietter ble gitt direkte etter 4 dpe og inkluderte 1 % fortynnet urin, 1 konsentrasjon av urin og 1 % fortynnet 1 urin. 0 % sukrose og vann. Hver diett ble pipettert på en tanntampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) satt inn i en 5 ml sprøyte (Thermo Fisher Scientific, Gøteborg, SE), stempelet ble fjernet og plassert på toppen av en petriskål (figur 1).1A). to ganger om dagen, mens døde mygg ble kastet til den siste myggen døde (n = 40 per behandling). Overlevelse av mygg matet på ulike dietter ble statistisk analysert ved bruk av Kaplan-Meyer overlevelseskurver og log-rank tester for å sammenligne overlevelsesfordeling mellom dietter (IBM SPSS Statistics 0.004).
En tilpasset myggflyvende mølle basert på Attisano et al.[17], laget av 5 mm tykke klare akrylpaneler (10 cm brede x 10 cm lange x 10 cm høye) uten front- og bakpaneler (fig. 3: topp). En dreiemontering med et vertikalt rør laget av en gasskromatografikolonne (0,275 mm) suspendert en ende i L; et par neodymmagneter 9 cm fra hverandre. Et horisontalt rør laget av samme materiale (6,5 cm L) delte det vertikale røret for å danne en tjoret arm og en arm som bar et lite stykke aluminiumsfolie som et lysavbrytende signal.
24-timers sultede hunner ble gitt ovennevnte diett i 30 minutter før båndtvang. Fullmatede hunnmygg ble deretter individuelt bedøvet på is i 2-3 minutter og festet til insektnåler med bivoks (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) og deretter bundet til armene til en horisontal mølle. r, deretter lagret og vist ved bruk av PC-Lab 2000™-programvare (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Flymøllen ble plassert i et klimaregulert rom (12 t:12 t, lys: mørkt, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RF).
For å visualisere flyaktivitetsmønsteret ble den totale flydistansen (m) og det totale antallet påfølgende flyaktiviteter beregnet per time over en 24-timers periode. I tillegg ble de gjennomsnittlige avstandene fløyet av individuelle kvinner sammenlignet på tvers av behandlinger og analysert ved hjelp av enveis ANOVA og Tukeys post hoc-analyse (JMP Pro, v14.0.0), der en avhengig avstand i instituttet var avhengig av instituttet, Inc. , beregnes gjennomsnittlig antall runder i intervaller på 10 minutter.
For å vurdere effekten av diett på reproduksjonsevnen til An.arabiensis, ble seks hunner (4 dpe) overført direkte til Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm) etter blodprøvetaking og deretter gitt den eksperimentelle dietten i 48 timer som beskrevet ovenfor. Dietter ble deretter fjernet og gytekopper (30 ml; Nolato ble destillert med 8 timer i 8 timer) , skiftes hver 24. time. Gjenta hver diettkur 20-50 ganger. Egg ble talt og registrert for hvert forsøksbur. Delprøver av egg ble brukt til å vurdere gjennomsnittlig størrelse og lengdevariasjon av individuelle egg (n ≥ 200 per diett) ved bruk av et Dialux-20 mikroskop (WeFC a Letzlar, Ernstz a Letzlar, DM1000, DE) 20 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). De gjenværende eggene ble oppbevart i et klimakontrollert rom under standard oppdrettsforhold i 24 timer, og en delprøve av nylig fremkomne larver i første stadium (n ≥ 200 per diett) ble målt, som beskrevet ovenfor. Antall egg og størrelsen på egg og larver ble sammenlignet med en-veis-behandlinger AJNO, ho og tukey'NO, og pro v4c. 0.0, SAS Institute Inc.).
Flyktige stoffer i headspace fra fersk (1 time etter prøvetaking), 24 timers, 72 timers og 168 timers gammel urin ble samlet inn fra prøver samlet fra Zebu storfe, Arsi raser. For enkelhets skyld ble urinprøver tatt tidlig om morgenen mens kyrne fortsatt var i fjøset. Urinprøver ble samlet inn fra 000 ml individuelle prøver av polyamid til hver enkelt prøve. ing-poser (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) i 3 l polyamid med lokk I vinylklorid plastfat. Headspace-flyktige stoffer fra hver bovin urinprøve ble samlet enten direkte (fersk) eller etter modning ved romtemperatur i 24 timer, 72 timer og 168 timers representativ urinprøve i hver urinprøve.
For oppsamling av flyktige stoffer i headspace ble et lukket sløyfesystem brukt til å sirkulere en aktivert karbonfiltrert gasstrøm (100 ml min-1) gjennom en polyamidpose til adsorpsjonskolonnen i 2,5 timer ved å bruke en membranvakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg, DE).Som en kontroll ble headspace-oppsamlingen utført fra en tom polyamidpose med 5 mm teflon. id) inneholdende 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mellom glassullplugger. Før bruk ble kolonnen spylt med 1 ml redestillert n-heksan (Merck, Darmstadt, DE) og 1 ml pentan (99,0 % kvalitet, rene løsemiddel-0 syreholdige GC). μl pentan. Headspace-samlinger ble slått sammen og deretter lagret ved -20 °C til de ble brukt for videre analyse.
Atferdsreaksjoner fra vertssøkende og blodspisende An.Headspace-flyktige ekstrakter samlet fra fersk, 24-timers, 72-timers og 168-timers gammel urin ble analysert for flyktige ekstrakter fra Arabidopsis-mygg ved hjelp av et rett glassrør olfaktometer [18]. Eksperimentene ble utført i løpet av 13-1 timers aktivitet i løpet av Z5-1-aktiviteten. [19].Et glassrørolfaktometer (80 cm × 9,5 cm id) ble opplyst med 3 ± 1 lx rødt lys ovenfra. Trekullfiltrert og fuktet luftstrøm (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativ fuktighet) passerte bioanalysen ved 30 cm s-1 s-1 skjerm, og skapte en serie av stål. ensartet plymstruktur.Dental tampondispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), opphengt i en 5 cm spiral på vindsiden av olfaktometeret, med stimulatorskift hvert 5. minutt.For analyse ble 10 μl av hvert headspace-ekstrakt, fortynnet 1:10, brukt som en verts-stimulus eller pentan. ucking mygg ble plassert i individuelle utløsningsbur 2-3 timer før starten av eksperimentet. Utløserburet ble plassert på motvindssiden av olfaktometeret, og myggen fikk akklimatisere seg i 1 min, og deretter ble sommerfuglventilen til buret åpnet for å frigjøres.Tiltrekning til behandling eller kontroll ble analysert som andelen av hode-ekstraktet i kontakt med 5 minutter av mygg-ekstraktet. ble replikert minst 30 ganger, og for å unngå virkningene av en dag, ble det samme antall behandlinger og kontroller testet på hver eksperimentell dag. Søk svar fra verts- og blodmatede Ans. Arabic versus headspace-sett ble analysert ved bruk av nominell logistisk regresjon etterfulgt av parvise sammenligninger for odde-forhold (JMP.0 Institute Inc.01, v4).
Ans gyterespons. Headspace-ekstrakter fra fersk og gammel kuurin ble analysert i Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastkopper (30 mL; Nolato Hertila) fylt med 20 mL destillert vann ga gytesubstratet og ble plassert i det motsatte hjørnet av hverandre, og ble plassert i det motsatte hjørnet. med 10 μl av hvert headspace-ekstrakt i en 1:10 fortynning. En lik mengde pentan ble brukt til å justere kontrollkoppen. Behandlings- og kontrollkopper ble byttet ut mellom hvert eksperiment for å kontrollere for posisjonseffekter. Ti blodmatede hunner ble sluppet ut i eksperimentelle bur ved ZT 9-11 og egg i kopper ble beregnet for telling av 24 timer etter egg: lagt i behandlingskoppen – antall egg lagt i kontrollkoppen)/(totalt antall egg lagt). Hver behandling ble gjentatt 8 ganger.
Gasskromatografisk og elektronantennemønsterdeteksjon (GC-EAD)-analyse av kvinnelige An.arabiensis ble utført som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt ble friske headspace-flyktige ekstrakter separert ved bruk av en Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) utstyrt med en HP-5-søyle (305 m. 2 id Technologies, μ 205 mm × 5 0 tykkelse). ).og aldrende urin. Hydrogen ble brukt som den mobile fasen med en gjennomsnittlig lineær strømningshastighet på 45 cm s-1. Hver prøve (2 μl) ble injisert i 30 sekunder i splittfri modus med en innløpstemperatur på 225 °C. GC-ovnstemperaturen ble programmert fra 35 °C (3 minutters hold) til 300 minutter hold °C ved 10 min. °C ved 10 min. 4 psi nitrogen ble tilsatt og delt 1:1 i et Gerstel 3D/2 lavt dødvolumkryss (Gerstel, Mülheim, DE) mellom flammeioniseringsdetektoren og EAD. GC-avløpskapillæren for EAD ble ført gjennom en Gerstel ODP-2 overføringsledning, som sporer GC-ovnstemperaturen pluss 5 °C,- karbontemperatur pluss 5 °C, - 1 mm. fuktet luft (1,5 l min−1). Antennen ble plassert 0,5 cm fra utløpet av røret. Hver enkelt mygg utgjorde ett replikat, og for vertssøkende mygg ble det utført minst tre replikater på urinprøver i hver alder.
Identifikasjon av bioaktive forbindelser i headspace-samlinger av fersk og aldret bovin urin ved bruk av et kombinert GC- og massespektrometer (GC-MS; 6890 GC og 5975 MS; Agilent Technologies) for å fremkalle antenneresponser i GC-EAD-analyse, som opererer i elektronstøt-ioniseringsmodus ved 70 HP-søyle- 5 caps eV. (60 m × 0,25 mm indre diameter, 0,25 μm filmtykkelse) ved bruk av helium som den mobile fasen med en gjennomsnittlig lineær strømningshastighet på 35 cm s-1. En prøve på 2 μl ble injisert med samme injektorinnstillinger og ovnstemperatur som for GC-EAD-analysen. Forbindelsene ble identifisert basert på deres spesifikasjonsindeks og liIST-reensjonsindeksen og sammenlignet med den egendefinerte liIST-indeksen for libr. ary (Agilent).Identifiserte forbindelser ble bekreftet ved å injisere autentiske standarder (Tilleggsfil 1: Tabell S2). For kvantifisering ble heptylacetat (10 ng, 99,8 % kjemisk renhet, Aldrich) injisert som en ekstern standard.
Evaluering av effektiviteten til en syntetisk luktblanding bestående av bioaktive forbindelser identifisert i fersk og modnet urin for å tiltrekke seg vertssøkende og blodsugende Ans.arabiensis, ved å bruke samme olfaktometer og protokoll som ovenfor. Syntetiske blandinger etterlignet sammensetningen og proporsjonene av forbindelser i blandede headspace flyktige ekstrakter av ferske, 4-8 timer, 8 timer, 8 timer, 8 timer -timeeldet urin (Figur 5D-G; Tilleggsfil 1: Tabell S2). For analyse, bruk 10 μl av en 1:100 fortynning av den helsyntetiske blandingen, med en total frigjøringshastighet som varierer fra ca. enkeltforbindelser av den komplette blandingen fjernes. Søk svar fra vert og blodmatet Ans. Arab vs syntetiske og subtraktive blandinger ble analysert ved bruk av nominell logistisk regresjon etterfulgt av parvise sammenligninger for odde forhold (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
For å vurdere om kuurin kunne tjene som vertshabitat-cue for malariamygg, ble fersk og gammel kuurin, samlet som beskrevet ovenfor, og vann plassert i maskede 3 l bøtter (100 ml) og satt i vertslokk.(BG-HDT versjon; BioGents, Regensburg, DE). Ti feller plassert 50 m fra hverandre på beite, 400 m fra landsbysamfunnet (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) og ingen storfe, på permanente hekkeplasser og landsbyer. roteres nattlig i totalt fem netter. Myggtall fanget i feller agnet med urin av forskjellige aldre ble sammenlignet ved bruk av logistisk regresjon med en beta binomial fordeling (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I en malaria-endemisk landsby nær byen Maki, Oromia-regionen, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figur 6A). Studien ble utført mellom midten av august og midten av september før den årlige innendørs gjenværende sprøytingssesongen, sammen med 50 m lang regntid fra hverandre på 50 m fra hverandre. utkanten av landsbyen ble valgt ut for studien (Fig. 6A). Kriteriene som ble brukt for å velge husene var: ingen dyr tillatt i huset, ingen innendørs matlaging (tegning ved eller kull) var tillatt (i hvert fall i prøveperioden), og hus med maksimalt to innbyggere, som sov i insektmidler.under det behandlede myggnettet.Etisk godkjenning har blitt gitt av Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) ved Fakultet for naturvitenskap (CNS-IRB), Addis Abeba University, i samsvar med retningslinjene fastsatt av World Medical Association Declaration of Helsinki.Samtykke fra hver leder av helsevesenet ble innhentet av den lokale distriktsadministrasjonen, og hele distriktsadministrasjonen ble innhentet (Den lokale avdelingen for helsevesenet ble avsluttet. 'kebele') nivå. Den eksperimentelle utformingen fulgte en 2 × 2 latinsk kvadratisk design, der syntetiske blandinger og kontroller ble tilordnet til sammenkoblede hus den første natten og byttet mellom hus på neste eksperimentelle natt. Denne prosessen ble gjentatt ti ganger. I tillegg, for å estimere myggaktiviteten i utvalgte hus, ble CDC-fellene satt til å kjøre fem på samme tid på samme dag, midten av dagen og slutten av dagen.
En syntetisk blanding som inneholdt seks bioaktive forbindelser ble oppløst i heptan (97,0 % løsemiddel GC-kvalitet, Sigma Aldrich) og frigjort ved 140 ng h-1 ved bruk av en bomullsvekedispenser [20]. Vekedispenseren tillot at alle forbindelser ble frigjort i konstante proporsjoner gjennom hele 12 timers eksperimentet. Kontroll og forebygging (CDC) lysfelle (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Figur 6A). Fellene ble hengt 0,8 – 1 m over bakken, nær fotenden av sengen, og en frivillig sov under et ubehandlet myggnett og operert mellom kl. 18.00 og 06.30. , og gravide [21] ble deretter screenet ved bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR)-analyse for å identifisere arten morfologisk identifisert som A. gambiae sl. Medlemmer av komplekset [23]. I feltstudien ble fellefangst av parrede hus analysert ved hjelp av en nominell logistisk tilpasningsmodell, der tiltrekning var den avhengige variabelen v/behandling (J. ® var den avhengige variabelen og behandlingen (J.)0. SAS Institute Inc.).Her rapporterer vi χ2- og p-verdiene fra sannsynlighetsforholdstesten.
Evaluer om det er trygt.arabiensis var i stand til å skaffe urin, dens viktigste nitrogenkilde, urea, ved direkte fôring, innen 48 timer etter administrering i 4 dager etter (dpe) vertssøkende og blodmatet kvinnelig matingsforsøk (Fig. 1A). Både vertssøkende og blodsugende hunner absorberte signifikant mer diett, 426 F (5 p, 426 F) = noen annen diett eller vann. henholdsvis 0,0001 og F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Fig. 1B,C). Videre spiste vertssøkende hunner mindre i urin etter 72 timer sammenlignet med urin etter 168 timer (Fig. 1B).Når de ble tilbudt et kosthold som inneholdt 6 M urea, absorberte hun en betydelig mengde 6 M urea. sammenlignet med alle andre konsentrasjoner og vann, mens det ikke kan skilles fra 10 % sukrose (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; figur 1D). Dette var i motsetning til responsen til kvinner som ble matet med blod, som typisk absorberte signifikant mer ureaholdig diett enn 50 % sukrose, om enn 50 % sukrose (71 % mindre enn vann). 5, p < 0,0001; Figur 1).1E). Videre, ved sammenligning mellom de to fysiologiske tilstandene, absorberte flebotomiserte hunner mer urea enn vertssøkende hunner ved de laveste konsentrasjonene, og disse hunnene absorberte tilsvarende mengder urea ved høyere konsentrasjoner (F(1,953,08)= 01,08;Fig. 1F, G). Mens inntak fra en ureaholdig diett så ut til å ha optimale verdier (fig. 1D,E), var kvinner i begge fysiologiske tilstander i stand til å modulere mengden urea som ble absorbert over hele området av ureakonsentrasjoner på en log-lineær måte (Fig. 1F,G).).Tilsvarende ser mygg ut til å kontrollere nitrogenopptaket ved å regulere mengden urin som absorberes, ettersom mengden nitrogen i urinen reflekteres i mengden som absorberes (figur 1B, C og B-innlegg).
For å vurdere effekten av urin og urea på vertssøkende og blodsugende myggoverlevelse, ble hunner matet med urin i alle fire aldre (fersk, 24 timer, 72 timer og 168 timer etter avsetning) og en rekke ureakonsentrasjoner, samt destillert vann og 10 % sukrose fungerte som en 2A-effekt som hadde en signifikant effekt på overlevelse av analysen (Figuren fungerte som en 2A). vival hos vertssøkende kvinner (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) og blodmatede hunner (urin: χ.02, d = 9.02, p. χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figur 2D,E).I alle eksperimenter hadde kvinner som ble matet med urin, urea og vann signifikant lavere overlevelsesrater sammenlignet med kvinner som ble matet med en sukrosediett (Figur 2B-E). h foreldet urin (p = 0,016) med den laveste overlevelsessannsynligheten (fig. 2B). Videre overlevde vertssøkende hunner matet med 135 mM urea lenger enn vannkontroller (p < 0,04) (fig.2C). Sammenlignet med vann overlevde kvinner matet med frisk urin og 24-timers urin lenger (henholdsvis p = 0,001 og p = 0,012; Figur 2D), mens kvinner matet med 72-timers urin overlevde lenger enn de som fikk kvinnelig kort fersk urin og 24-timers < 1,0 p. e 2D). Når de ble matet med 135 mM urea, overlevde blodmatede hunner lenger enn alle andre konsentrasjoner av urea og vann (p < 0,013; figur 2E).
Overlevelse av verts- og blodsugende hunner Anopheles arabinis som spiser kuurin og urea. I bioanalysen (A) fikk hunnmygg en diett bestående av fersk og gammel kuurin, ulike konsentrasjoner av urea, sukrose (10 %) og destillert vann (H2O). Overlevelsen av vertssøkende (B, C) og blodsøkende (E) blod (E-D) 2 timer til alle hunner matet med urin (B, D) og urea (C, E), og kontroller, sukrose og vann, er døde
Den totale avstanden og antall runder bestemt i flymølletesten over en 24-timers periode var forskjellig mellom vertssøkende og blodsugende mygg, som viste mindre flyaktivitet totalt sett (fig. 3). Vertsøkende mygg som ga frisk og aldret urin eller sukrose og vann viste tydelige flyvemønstre mens de som fôret av hunner var mer aktive ved dawn (fig. 2). 4- og 168-timers gamle mygg som forsynte seg med urin viste forskjellige flymønstre og var primært daglige. Hunnmygg som ga sukrose eller 72-timers urin viste aktivitet gjennom hele 24-timersperioden, mens hunner som ga vann var mer aktive i midten av perioden. Mygg viste seg tidlig på morgenen og høyest om morgenen og på de høyeste aktivitetene om morgenen og om morgenen. 72-timers gammel urin opplevde en jevn nedgang i aktivitet over 24 timer (Figur 3).
Flyytelse av jegersøkende blodsugende hunn Anopheles arabinis som spiser kuurin og urea.I flykverntesten ble hunnmygg fôret med fersk og gammel kuurin, ulike konsentrasjoner av urea, sukrose (10%) og destillert vann (H2O) bundet til horisontalt, fritt roterende blod av kvinnelige armer (for fritt roterende armer) (for fritt roterende armer). , ble den totale avstanden og antall flyreiser per time for hver diett over en 24-timers periode registrert (mørk: grå; lys: hvit). Gjennomsnittlig avstand og gjennomsnittlig antall kamper vises til høyre for døgnaktivitetsgrafen. Feilstolper representerer standardfeil for gjennomsnittet. Statistisk analyse se tekst
Generelt fulgte den samlede flyaktiviteten til vertssøkende hunner et mønster som ligner flydistansen over en 24-timers periode. Gjennomsnittlig flyavstand ble signifikant påvirket av diett som ble inntatt (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), og vertssøkende hunner inntok 72 timer med urin og fløy signifikant lengere urinavstander (<0-sup). fôret mygg fløy lenger enn ferske (p = 0,022) og 24-timers aldrende urin- (p = 0,022)-matede mygg. I motsetning til flyaktivitetsmønsteret beskrevet av urindietten, viste urea-matede vertssøkende hunner vedvarende flyaktivitet over en 24-timers periode i den andre halvparten av den mørke perioden, var vertsaktiviteten tilsvarende (Fig. søker hunner matet med urea økte signifikant gjennomsnittlig flyavstand avhengig av den absorberte konsentrasjonen (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Vertssøkende hunner matet med en hvilken som helst konsentrasjon av urea fløy lenger enn hunner som fikk enten vann eller sukrose (p < 0,03).
Den generelle flyaktiviteten til blodsugende mygg var stabil og opprettholdt over 24 timer på tvers av alle dietter, med økt urinaktivitet i andre halvdel av mørkeperioden for kvinner som ble matet på vann, så vel som hos kvinner som ble matet med ferske og 24 timer gamle (bilde 3). Mens urindietten signifikant påvirket gjennomsnittlig flytavstand hos hunner som ble matet med blod (38(5, 0), dør = 38(5, 0a). t gjorde det ikke (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24).
Effekten av urin- og ureaforing på reproduksjonsparametere ble vurdert i eggleggingsbioassays (Figur 4A) og ble undersøkt i henhold til antall egg lagt av hver hunn, eggstørrelse og nyklekkede larver i første stadium. Antall egg lagt.Urinfôrede arabiske hunner varierte etter kosthold. (Fig. 4B). Kvinner som ble matet med 24-timers urin, blodmel la betydelig flere egg enn hunner som ble fôret med andre urindietter og var lik de som ble fôret med sukrose (fig. 4B). Likeledes varierte størrelsen på egg lagt av urinfôrede hunner etter kosthold (F(5, 209) = 120. 0,-2, 0, 0, 0, 0,-2, 128. urin. fôrede hunner som la signifikant større egg enn vannfôrede hunner, mens eggene til hunner fôret med 168 t urin var signifikant mindre (fig. 4C). I tillegg påvirket urindiett larvestørrelsen signifikant (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), med signifikante 4-2 larva og 4-2 larve. gamle urinfôrede hunner enn fra egg lagt fra egglarver.Vannfôrede og 168-timers urinfôrede hunner (Figur 4D).
Reproduksjonsevnen til kvinnelige Anopheles arabinis som fôret med kuurin og urea. Blodfôrede hunnmygg ble fôret med dietter bestående av fersk og gammel kuurin, ulike konsentrasjoner av urea, sukrose (10%) og destillert vann (H2O) i 48 timer før de ble plassert i bioassays (Egg-størrelse A, 4 timer, eggstørrelse A, B). , F) og larvestørrelsen (D, G) ble signifikant påvirket av kostholdet som ble gitt (kuurin: BD; urea: EG). Middelverdier for hver parameter målt ved bruk av forskjellige bokstavnavn var signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Feilstolper representerer standardfeil for gjennomsnittet
Som den viktigste nitrogenholdige komponenten i urin, urea, når det ble gitt som en diett til blodmatede hunner, påvirket reproduksjonsparametrene signifikant i alle studier. Antall egg lagt av hunner som ble matet med urea, etter et blodmåltid, avhengig av ureakonsentrasjon (F(11, 360) = 4,69; p < 0,00 s mellom 0,00 hunner, 3M og 1,00. 34 mM la flere egg (Figur 4E). Hunner fôret med ureakonsentrasjoner på 134 µM eller høyere legger større egg enn hunner fôret med vann (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figur 4F), og larvestørrelser på (30. urea) mor, selv om de er påvirket av (30. F.) p < 0,0001) var mer variabel (fig. 4G).
Generell attraktivitet for vertssøkende bovin urin headspace flyktige ekstrakter. Arabiensis vurdert i glassrørets olfaktometer (fig. 5A) ble signifikant påvirket av urinalder (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; fig. 5B viste signifikant høyere urinverdi ved 24 timers analyse). sammenlignet med alle andre behandlinger (72 timer: p = 0,0060, 168 timer: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), Bortsett fra lukten av frisk urin (p = 0,13; Figur 5B). 0,067; Fig. 5C), ble disse hunnene funnet å være betydelig mer attraktive for headspace-flyktige ekstrakter sammenlignet med 72-timers gammel urin sammenlignet med kontroller (p = 0,0066; Figur 5C).
Atferdsreaksjoner på naturlige og syntetiske lukter av kuurin i jakten på verts- og blodmatede Anopheles arabianus. Skjematisk av glassrørets olfaktometer (A).Tiltrekning av headspace flyktige ekstrakter fra fersk og eldre kuurin til vert (B) og blodsugende (C) mygg.Finn den ferske tentekstrakten (D-reaksjon). -time (E), 72-timers (F) og 168-timers (G) gammel kuurin er vist. Elektronantennedeteksjon (EAD) spor viser spenningsendringer som respons på bioaktive forbindelser i headspace eluert fra gasskromatografen og oppdaget av en flammeioniseringsdetektor bar (FID). s (µg h-1) av de biologisk aktive forbindelsene er vist.En enkelt stjerne (*) indikerer en konsistent lavamplituderespons.Dobbeltstjerner (**) indikerer ureproduserbare responser.Finn verten (H) og den blodsugende (I) An.arabiensis har forskjellige appeller til syntetiske blandinger av urin gjennomsnittlig og aldrende mygg navn forskjellige bokstaver av urin og aldrende navn fra mygg til aldrende. hverandre (enveis ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc analyse;p < 0,05). Feilstolper representerer standardfeil på skalaen
Kvinne Ann.arabiensis, 72 timer og 120 timer etter blodmåltid, under gyting, ble det ikke vist noen preferanse for headspace-flyktige ekstrakter fra fersk og gammel kuurin sammenlignet med pentankontroller (χ2 = 3,07, p > 0,05; tilleggsfil 1: Fig. S1).
For kvinnelige Ann.arabiensis, GC-EAD og GC-MS analyser identifiserte åtte, seks, tre og tre bioaktive forbindelser (figur 5D-G). Selv om det ble observert forskjeller i antall forbindelser som utløste elektrofysiologiske responser, var de fleste av disse forbindelsene tilstede i hvert headspace flyktige ekstrakt samlet inn fra fersk og aldret urin, for hver antenna som kun produserte den kvinnelige responsen ovenfor. terskelen ble inkludert i videre analyser.
Den totale flyktige frigjøringshastigheten av bioaktive forbindelser i headspace-samlingen økte fra 29 µg h-1 i fersk urin til 242 µg h-1 i 168 timers gammel urin, hovedsakelig på grunn av p-kresol og m-formaldehyd. alder, som korrelerte med den observerte reduksjonen i signalintensitet (overflod) i kromatogrammet (fig. 5D)-G venstre panel) og fysiologiske responser på disse forbindelsene (fig. 5D-G høyre panel).
Totalt sett hadde den syntetiske blandingen et lignende naturlig forhold mellom bioaktive forbindelser identifisert i flyktige ekstrakter av friske og aldrende urin-headspaces (fig. 5D–G) og så ikke ut til å fremkalle signifikant appell i søket etter en vert (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; fig. 5H) = χ, 2, 4, mosquitoe, 4,9 = 0,30; Fig. 5I). Post hoc parvise sammenligninger mellom behandlinger viste imidlertid at vertssøkende mygg var signifikant attraktive for den syntetiske blandingen av 24-timers gammel urin sammenlignet med pentankontroller (p = 0,0086; figur 5H).
For å vurdere rollen til individuelle komponenter i syntetiske blandinger av 24-timers gammel urin, ble seks subtraktive blandinger evaluert mot komplette blandinger i Y-røranalysen, der individuelle forbindelser ble fjernet. For vertssøkende mygg, hadde subtrahering av individuelle forbindelser fra den komplette blandingen en signifikant effekt på atferdsresponser (χ2, = 19.60, χ2, = 19.60. 2A), var alle subtraktive blandinger mer attraktive enn mindre enn fullstendig blandet. Derimot påvirket ikke fjerning av individuelle forbindelser fra den helsyntetiske blandingen atferdsresponsene til blodsugende mygg (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), med unntak av dekanalnivået, som resulterte i lavere dekanalnivåer, sammenlignet med 20-filen: 2. B).
I en malaria-endemisk landsby i Etiopia ble effekten av en syntetisk blanding av 24-timers kuurin for å tiltrekke mygg under feltforhold evaluert i ti netter (fig. 6A). Totalt 4 861 mygg ble fanget og identifisert, hvorav 45,7 % var Anthropus, 3 %, 8 % anthropus og 5 % anthropus. ,4 % var Culex spp.(Tilleggsfil 1: Tabell S1). Anopheles arabinis er det eneste medlemmet av An.Gambian-artskomplekset identifisert ved PCR-analyse.I gjennomsnitt ble 320 mygg fanget per natt, i løpet av denne tiden fanget feller med syntetisk blanding av agn mer mygg enn sammenkoblede feller uten blanding, (χ,06,06) = . ) .Feller uten agn ble satt ut på hver av de fem kontrollnettene i begynnelsen, midten og slutten av forsøket. Lignende antall mygg ble fanget i hvert fellepar, noe som indikerer ingen skjevhet mellom husene (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05 med populasjon av mygg, 0,05-kontrollert antall mygg. fanget i fellene som inneholdt den syntetiske blandingen ble betydelig økt: vertssøking (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nylig blodmating (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) og graviditet (χ2,0,0, 26,0;Tilleggsfil 1: Tabell S1). Dette gjenspeiles også i det totale antallet mygg som fanges: vert søker > blodsugende > gravid > halvgravid > hann.
Feltevaluering av effektiviteten til en 24-timers syntetisk kuurinluktblanding. Feltforsøk ble utført i det sør-sentrale Etiopia (kart), nær byen Maki (innlegg), ved bruk av en Centers for Disease Control (CDC) lysfelle (til høyre) i parrede hus, med en latinsk firkantet design (luftbilde tiltrukket av CD'en) (Aerial image) (Aerial image capshel) (A-foto-spiratur). besques (B), men ikke Anopheles farroes (C), på en annen måte, en fysiologisk tilstandsavhengig effekt. I tillegg fanget disse fellene et betydelig økt antall av verts-Culex-myggen.(D) Sammenlignet med kontroll. Stolpene til venstre representerer den gjennomsnittlige seleksjonsindeksen for mygg fanget i par med luktfelle og kontroll (åpne grønn) utvalget av luktstoff og kontroll (1) indeks i par med kontrollfeller (åpne; N = 5).).Stjerner indikerer statistiske signifikansnivåer (*p = 0,01 og ***p < 0,0001)
De tre artene ble fanget forskjellig i feller som inneholdt syntetiske blandinger. Ser etter vert (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blodmating (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) og graviditet (χ181,01,0) = 612(0,01,0) = χ181,0. .arabiensis ble fanget i fellen som frigjorde den syntetiske blandingen (Fig. 6B), mens mengden av An ikke var forskjellig. Pharoensis i forskjellige fysiologiske tilstander ble funnet (Fig. 6C). For Culex ble det kun funnet en signifikant økning i antall myggsøkende verter i feller agnet med den syntetiske blandingen (13129(13129) (13129(13.0,0;0;0; .6D), sammenlignet med kontrollfeller.
Verts-agnfeller plassert utenfor potensielle verter mellom hekkeplasser og landlige samfunn i Etiopia ble brukt for å vurdere om malariamygg bruker kuurinlukt som vertshabitatsignal. I fravær av vertssignaler, varme og med eller uten tilstedeværelse av kuurinlukt, ble ingen mygg fanget (Figurverd av kvinnelig temperatur i tilstedeværelse av kuurin S31: høy urintemperatur, høy urin, S31). ariamygg ble tiltrukket og fanget, om enn i små antall, uavhengig av urinalder (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Tilleggsfil 1: Figur S3). I motsetning fanget vannkontroller ikke malariamygg ved høye temperaturer (tilleggsfil 1: figur S3).
Malariamygg tilegner seg og distribuerer nitrogenholdige forbindelser gjennom kompenserende fôring av kuurin (dvs. sølepytter) for å forbedre livshistoriske egenskaper, lik andre insekter [2, 4, 24, 25, 26]. Kuurin er en lett tilgjengelig fornybar ressurs som er nært knyttet til malariamygg og rastesteder for malaria og høye planter. Hunnmygg lokaliserer denne ressursen ved å lukte og er i stand til å regulere opptaket av nitrogenholdige forbindelser i urinen, inkludert urea, den viktigste nitrogenholdige komponenten i urinen [15, 16]. Avhengig av hunnmyggens fysiologiske tilstand, tildeles næringsstoffer i urinen for å øke vertsflukten og overlevelsesaktiviteten og overlevelse av hunnmygg, samt overlevelse av hunnmygg. kjennetegn ved blodmatede individer i løpet av den første gonadotrope syklusen. Derfor spiller urinblanding en viktig ernæringsmessig rolle for malariavektorer som er lukket som underernærte voksne [8], siden det gir hunnmygg evnen til å tilegne seg viktige nitrogenholdige forbindelser ved å delta i lavrisikofôring. Dette funnet har betydelige livsepideologiske konsekvenser, som har en betydelig effekt på kvinnelige utganger og vektorer. kapasitet. Videre kan denne oppførselen være målet for fremtidige vektorstyringsprogrammer.