Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Nylig er det utviklet en kjemikaliefri antimikrobiell plattform basert på nanoteknologi som bruker kunstige vann-nanostrukturer (EWNS). EWNS har en høy overflateladning og er mettet med reaktive oksygenarter (ROS) som kan samhandle med og inaktivere en rekke mikroorganismer, inkludert matbårne patogener. Her vises det at egenskapene deres under syntese kan finjusteres og optimaliseres for ytterligere å forbedre deres antibakterielle potensial. EWNS-laboratorieplattformen ble designet for å finjustere egenskapene til EWNS ved å endre synteseparametrene. Karakterisering av EWNS-egenskaper (ladning, størrelse og innhold av ROS) ved hjelp av moderne analytiske metoder. I tillegg ble de evaluert for deres mikrobielle inaktiveringspotensial mot matbårne mikroorganismer som Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum og Saccharomyces cerevisiae. Resultatene som presenteres her viser at egenskapene til EWNS kan finjusteres under syntese, noe som resulterer i en eksponentiell økning i inaktiveringseffektivitet. Spesielt økte overflateladningen med en faktor på fire, og de reaktive oksygenartene økte. Fjerningshastigheten for mikrober var mikrobielt avhengig og varierte fra 1,0 til 3,8 log etter 45 minutters eksponering for en aerosoldose på 40 000 #/cc EWNS.
Mikrobiell forurensning er hovedårsaken til matbårne sykdommer forårsaket av inntak av patogener eller deres giftstoffer. Bare i USA forårsaker matbårne sykdommer omtrent 76 millioner sykdommer, 325 000 sykehusinnleggelser og 5000 dødsfall hvert år1. I tillegg anslår det amerikanske landbruksdepartementet (USDA) at økt forbruk av ferske råvarer er ansvarlig for 48 % av alle rapporterte matbårne sykdommer i USA2. Kostnaden for sykdom og død forårsaket av matbårne patogener i USA er svært høy, anslått av Centers for Disease Control and Prevention (CDC) til mer enn 15,6 milliarder amerikanske dollar per år3.
For tiden utføres kjemiske4, strålings5 og termiske6 antimikrobielle tiltak for å sikre mattrygghet stort sett på begrensede kritiske kontrollpunkter (KKP-er) langs produksjonskjeden (vanligvis etter innhøsting og/eller under pakking) i stedet for kontinuerlig. Dermed er de utsatt for krysskontaminering. 7. Bedre kontroll av matbårne sykdommer og matforringelse krever antimikrobielle tiltak som potensielt kan brukes på tvers av hele gård-til-bord-kontinuumet, samtidig som miljøpåvirkningen og kostnadene reduseres.
Nylig er det utviklet en kjemikaliefri, nanoteknologibasert antimikrobiell plattform som kan inaktivere overflatebakterier og luftbårne bakterier ved hjelp av kunstige vann-nanostrukturer (EWNS). EWNS ble syntetisert ved hjelp av to parallelle prosesser, elektrospray og vannionisering (fig. 1a). Tidligere studier har vist at EWNS har et unikt sett med fysiske og biologiske egenskaper8,9,10. EWNS har et gjennomsnitt på 10 elektroner per struktur og en gjennomsnittlig nanoskalastørrelse på 25 nm (fig. 1b,c)8,9,10. I tillegg viste elektronspinnresonans (ESR) at EWNS inneholder en stor mengde reaktive oksygenarter (ROS), hovedsakelig hydroksylradikaler (OH•) og superoksidradikaler (O2-) (fig. 1c)8. EVNS er i luften i lang tid og kan kollidere med mikroorganismer som er suspendert i luften og tilstede på overflaten, og dermed levere ROS-nyttelasten sin og forårsake inaktivering av mikroorganismer (fig. 1d). Disse tidlige studiene viste også at EWNS kan samhandle med og inaktivere ulike gramnegative og grampositive bakterier, inkludert mykobakterier, på overflater og i luften. Transmisjonselektronmikroskopi viste at inaktiveringen var forårsaket av forstyrrelse av cellemembranen. I tillegg har studier av akutt inhalasjon vist at høye doser av EWNS ikke forårsaker lungeskade eller betennelse 8.
(a) Elektrospray oppstår når en høy spenning påføres mellom et kapillarrør som inneholder væske og en motelektrode. (b) Påføring av høyt trykk resulterer i to forskjellige fenomener: (i) elektrospraying av vann og (ii) dannelse av reaktive oksygenarter (ioner) fanget i EWNS. (c) Den unike strukturen til EWNS. (d) På grunn av sin nanoskala-natur er EWNS svært mobile og kan samhandle med luftbårne patogener.
Evnen til EWNS antimikrobielle plattform til å inaktivere matbårne mikroorganismer på overflaten av fersk mat har også nylig blitt demonstrert. Det har også blitt vist at overflateladningen til EWNS i kombinasjon med et elektrisk felt kan brukes til å oppnå målrettet levering. Dessuten var foreløpige resultater for økologiske tomater etter 90 minutters eksponering ved en EWNS på omtrent 50 000 #/cm3 oppmuntrende, med observasjon av ulike matbårne mikroorganismer som E. coli og Listeria 11. I tillegg viste foreløpige organoleptiske tester ingen sensoriske effekter sammenlignet med kontrolltomater. Selv om disse innledende inaktiveringsresultatene er oppmuntrende for mattrygghetsapplikasjoner, selv ved svært lave EWNS-doser på 50 000 #/cc. se, er det tydelig at et høyere inaktiveringspotensial ville være mer fordelaktig for å ytterligere redusere risikoen for infeksjon og forringelse.
Her vil vi fokusere forskningen vår på utviklingen av en EWNS-genereringsplattform for å muliggjøre finjustering av synteseparametere og optimalisering av de fysisk-kjemiske egenskapene til EWNS for å forbedre deres antibakterielle potensial. Spesielt har optimaliseringen fokusert på å øke overflateladningen (for å forbedre målrettet levering) og ROS-innholdet (for å forbedre inaktiveringseffektiviteten). Karakterisere optimaliserte fysisk-kjemiske egenskaper (størrelse, ladning og ROS-innhold) ved hjelp av moderne analytiske metoder og bruke vanlige matmikroorganismer som E. .
EVNS ble syntetisert ved samtidig elektrospraying og ionisering av vann med høy renhet (18 MΩ cm–1). Den elektriske forstøveren 12 brukes vanligvis til forstøvning av væsker og syntese av polymer- og keramiske partikler 13 og fibre 14 med kontrollert størrelse.
Som beskrevet i tidligere publikasjoner 8, 9, 10, 11, ble det i et typisk eksperiment påført en høy spenning mellom en metallkapillær og en jordet motelektrode. Under denne prosessen oppstår to forskjellige fenomener: i) elektrospray og ii) vannionisering. Et sterkt elektrisk felt mellom de to elektrodene forårsaker at negative ladninger bygger seg opp på overflaten av det kondenserte vannet, noe som resulterer i dannelsen av Taylor-kjegler. Som et resultat dannes det høyt ladede vanndråper, som fortsetter å brytes opp i mindre partikler, som i Rayleigh-teorien16. Samtidig forårsaker sterke elektriske felt at noen vannmolekyler splittes og stripper av elektroner (ioniserer), noe som fører til dannelsen av en stor mengde reaktive oksygenarter (ROS)17. Samtidig generert ROS18 ble innkapslet i EWNS (fig. 1c).
Figur 2a viser EWNS-genereringssystemet som er utviklet og brukt i EWNS-syntesen i denne studien. Renset vann lagret i en lukket flaske ble matet gjennom et teflonrør (2 mm indre diameter) inn i en 30G nål i rustfritt stål (metallkapillær). Vannstrømmen styres av lufttrykket inne i flasken, som vist i figur 2b. Nålen er montert på en teflonkonsoll og kan manuelt justeres til en viss avstand fra motelektroden. Motelektroden er en polert aluminiumsskive med et hull i midten for prøvetaking. Under motelektroden er det en prøvetakingstrakt i aluminium, som er koblet til resten av det eksperimentelle oppsettet via en prøvetakingsport (figur 2b). For å unngå ladningsoppbygging som kan forstyrre prøvetakerens drift, er alle prøvetakerkomponenter elektrisk jordet.
(a) Konstruert vann-nanostrukturgenereringssystem (EWNS). (b) Tverrsnitt av prøvetakeren og elektrosprayen, som viser de viktigste parameterne. (c) Eksperimentelt oppsett for bakterieinaktivering.
EWNS-genereringssystemet beskrevet ovenfor er i stand til å endre viktige driftsparametere for å legge til rette for finjustering av EWNS-egenskapene. Juster den påførte spenningen (V), avstanden mellom nålen og motelektroden (L) og vannstrømmen (φ) gjennom kapillærrøret for å finjustere EWNS-karakteristikkene. Symbol brukt for å representere forskjellige kombinasjoner: [V (kV), L (cm)]. Juster vannstrømmen for å få en stabil Taylor-kjegle med et visst sett [V, L]. I denne studien ble åpningsdiameteren til motelektroden (D) holdt på 0,5 tommer (1,29 cm).
På grunn av begrenset geometri og asymmetri kan ikke den elektriske feltstyrken beregnes ut fra grunnprinsipper. I stedet ble QuickField™-programvaren (Svendborg, Danmark)19 brukt til å beregne det elektriske feltet. Det elektriske feltet er ikke ensartet, så verdien av det elektriske feltet på spissen av kapillærrøret ble brukt som referanseverdi for ulike konfigurasjoner.
I løpet av studien ble flere kombinasjoner av spenning og avstand mellom nålen og motelektroden evaluert med tanke på Taylor-kjegledannelse, Taylor-kjeglestabilitet, EWNS-produksjonsstabilitet og reproduserbarhet. Ulike kombinasjoner er vist i tilleggstabell S1.
Utgangen fra EWNS-genereringssystemet ble koblet direkte til en Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, modell 3936, TSI, Shoreview, MN) for måling av partikkelantallkonsentrasjon, samt til et Aerosol Faraday-elektrometer (TSI, modell 3068B, Shoreview, MN). ) for aerosolstrømmer ble målt som beskrevet i vår tidligere publikasjon. Både SMPS og aerosolelektrometeret tok prøver med en strømningshastighet på 0,5 L/min (total prøvestrøm 1 L/min). Antall partikkelkonsentrasjoner og aerosolstrømmen ble målt i 120 sekunder. Målingen gjentas 30 ganger. Basert på strømmålinger beregnes den totale aerosolladningen, og den gjennomsnittlige EWNS-ladningen estimeres for et gitt totalt antall utvalgte EWNS-partikler. Den gjennomsnittlige kostnaden for EWNS kan beregnes ved hjelp av ligning (1):
der IEl er den målte strømmen, NSMPS er den digitale konsentrasjonen målt med SMPS, og φEl er strømningshastigheten per elektrometer.
Fordi relativ fuktighet (RH) påvirker overflateladningen, ble temperatur og (RH) holdt konstante under eksperimentet på henholdsvis 21 °C og 45 %.
Atomkraftmikroskopi (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) og AC260T-probe (Olympus, Tokyo, Japan) ble brukt til å måle størrelsen og levetiden til EWNS. AFM-skanningsfrekvensen var 1 Hz, skanneområdet var 5 μm × 5 μm og 256 skannelinjer. Alle bildene ble utsatt for 1. ordens bildejustering ved hjelp av Asylum-programvare (maskeområde 100 nm, terskel 100 pm).
Testtrakten ble fjernet, og glimmeroverflaten ble plassert i en avstand på 2,0 cm fra motelektroden i en gjennomsnittstid på 120 sekunder for å unngå partiklagglomerering og dannelse av uregelmessige dråper på glimmeroverflaten. EWNS ble sprayet direkte på overflaten av nyskåret glimmer (Ted Pella, Redding, CA). Bilde av glimmeroverflaten umiddelbart etter AFM-sputtering. Kontaktvinkelen til overflaten av nyskåret umodifisert glimmer er nær 0°, så EVNS er fordelt på glimmeroverflaten i form av en kuppel. Diameteren (a) og høyden (h) på de diffuserende dråpene ble målt direkte fra AFM-topografien og brukt til å beregne EWNS' kuppelformede diffusjonsvolum ved hjelp av vår tidligere validerte metode. Forutsatt at de innebygde EWNS har samme volum, kan den ekvivalente diameteren beregnes ved hjelp av ligning (2):
Basert på vår tidligere utviklede metode ble en elektronspinnresonans (ESR) spinnfelle brukt til å detektere tilstedeværelsen av kortlivede radikalmellomprodukter i EWNS. Aerosoler ble boblet gjennom en 650 μm Midget-spreder (Ace Glass, Vineland, NJ) som inneholdt en 235 mM løsning av DEPMPO(5-(dietoksyfosforyl)-5-metyl-1-pyrrolin-N-oksid) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Alle ESR-målinger ble utført ved hjelp av et Bruker EMX-spektrometer (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) og en flatskjermcelle. Acquisit-programvaren (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ble brukt til å samle inn og analysere dataene. Bestemmelse av egenskapene til ROS ble kun utført for et sett med driftsforhold [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av SMPS etter å ha tatt hensyn til EWNS-tap i impaktoren.
Ozonnivåene ble overvåket ved hjelp av en 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
For alle EWNS-egenskaper brukes middelverdien som måleverdi, og standardavviket brukes som målefeil. T-tester ble utført for å sammenligne verdiene til de optimaliserte EWNS-attributtene med de tilsvarende verdiene til basis-EWNS.
Figur 2c viser et tidligere utviklet og karakterisert elektrostatisk utfellingssystem (EPES) som kan brukes til målrettet levering av EWNS på overflaten. EPES bruker EVNS-ladninger som kan "styres" direkte til overflaten av målet under påvirkning av et sterkt elektrisk felt. Detaljer om EPES-systemet presenteres i en nylig publikasjon av Pyrgiotakis et al. 11. EPES består dermed av et 3D-printet PVC-kammer med koniske ender og inneholder to parallelle metallplater i rustfritt stål (304 rustfritt stål, speilbelagt) i midten, 15,24 cm fra hverandre. Kortene var koblet til en ekstern høyspenningskilde (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), bunnplaten var alltid koblet til positiv spenning, og topplaten var alltid koblet til jord (flytende jord). Kammerveggene er dekket med aluminiumsfolie, som er elektrisk jordet for å forhindre partikkeltap. Kammeret har en forseglet frontdør som gjør at testflater kan plasseres på plaststativer som hever dem over bunnmetallplaten for å unngå høyspenningsforstyrrelser.
Avsetningseffektiviteten til EWNS i EPES ble beregnet i henhold til en tidligere utviklet protokoll beskrevet i tilleggsfigur S111.
Som kontrollkammer ble et andre sylindrisk strømningskammer koblet i serie til EPES-systemet, der et mellomliggende HEPA-filter ble brukt til å fjerne EWNS. Som vist i figur 2c ble EWNS-aerosolen pumpet gjennom to innebygde kamre. Filteret mellom kontrollrommet og EPES fjerner eventuelle gjenværende EWNS, noe som resulterer i samme temperatur (T), relativ fuktighet (RH) og ozonnivåer.
Viktige matbårne mikroorganismer har vist seg å forurense fersk mat, som E. coli (ATCC #27325), fekal indikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), matbåren patogen, Listeria harmless (ATCC #33090), surrogat for patogen Listeria monocytogenes, avledet fra ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), en erstatning for fordervelsesgjær, og en mer resistent inaktivert bakterie, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kjøp tilfeldige esker med økologiske cherrytomater fra ditt lokale marked og oppbevar dem i kjøleskap ved 4 °C frem til bruk (opptil 3 dager). Eksperimenttomatene var alle like store, omtrent 1,25 cm i diameter.
Protokollene for kultur, inokulering, eksponering og kolonitelling er detaljert beskrevet i vår tidligere publikasjon og detaljert i tilleggsdataene. Effektiviteten til EWNS ble evaluert ved å eksponere inokulerte tomater for 40 000 #/cm3 i 45 minutter. Kort fortalt ble tre tomater brukt til å evaluere de overlevende mikroorganismene ved tid t = 0 min. Tre tomater ble plassert i EPES og eksponert for EWNS ved 40 000 #/cc (EWNS-eksponerte tomater), og de resterende tre ble plassert i kontrollkammeret (kontrolltomater). Ytterligere bearbeiding av tomater i begge gruppene ble ikke utført. EWNS-eksponerte tomater og kontrolltomater ble fjernet etter 45 minutter for å evaluere effekten av EWNS.
Hvert eksperiment ble utført i tre eksemplarer. Dataanalyse ble utført i henhold til protokollen beskrevet i tilleggsdata.
Inaktiveringsmekanismer ble vurdert ved sedimentering av eksponerte EWNS-prøver (45 min ved 40 000 #/cm3 EWNS-aerosolkonsentrasjon) og ikke-bestrålte prøver av ufarlige bakterier E. coli, Salmonella enterica og Lactobacillus. Partiklene ble fiksert i 2,5 % glutaraldehyd, 1,25 % paraformaldehyd og 0,03 % pikrinsyre i 0,1 M natriumkakodylatbuffer (pH 7,4) i 2 timer ved romtemperatur. Etter vask, etterfikser med 1 % osmiumtetroksid (OsO4)/1,5 % kaliumferrocyanid (KFeCN6) i 2 timer, vaskes 3 ganger i vann og inkuberes i 1 % uranylacetat i 1 time, deretter vaskes to ganger i vann, og deretter dehydreres i 10 minutter i 50 %, 70 %, 90 % og 100 % alkohol. Prøvene ble deretter plassert i propylenoksid i 1 time og impregnert med en 1:1 blanding av propylenoksid og TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Prøvene ble innstøpt i TAAB Epon og polymerisert ved 60 °C i 48 timer. Den herdede granulære harpiksen ble kuttet og visualisert ved TEM ved bruk av et konvensjonelt transmisjonselektronmikroskop JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japan) utstyrt med et AMT 2k CCD-kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Alle eksperimentene ble utført i tre eksemplarer. For hvert tidspunkt ble bakterievasker sådd i tre eksemplarer, noe som resulterte i totalt ni datapunkter per punkt, hvor gjennomsnittet ble brukt som bakteriekonsentrasjon for den aktuelle mikroorganismen. Standardavviket ble brukt som målefeil. Alle poeng teller.
Logaritmen til reduksjonen i bakteriekonsentrasjonen sammenlignet med t = 0 min ble beregnet ved hjelp av følgende formel:
hvor C0 er bakteriekonsentrasjonen i kontrollprøven ved tid 0 (dvs. etter at overflaten har tørket, men før den plasseres i kammeret) og Cn er bakteriekonsentrasjonen på overflaten etter n minutters eksponering.
For å ta hensyn til den naturlige nedbrytningen av bakterier i løpet av 45-minutters eksponering, ble logaritmisk reduksjon sammenlignet med kontrollen etter 45 minutter også beregnet som følger:
hvor Cn er konsentrasjonen av bakterier i kontrollprøven ved tidspunkt n og Cn-kontroll er konsentrasjonen av kontrollbakterier ved tidspunkt n. Data presenteres som en logaritmisk reduksjon sammenlignet med kontroll (ingen EWNS-eksponering).
I løpet av studien ble flere kombinasjoner av spenning og avstand mellom nålen og motelektroden evaluert med tanke på Taylor-kjegledannelse, Taylor-kjeglestabilitet, EWNS-produksjonsstabilitet og reproduserbarhet. Ulike kombinasjoner er vist i tilleggstabell S1. To tilfeller som viser stabile og reproduserbare egenskaper (Taylor-kjegle, EWNS-generering og stabilitet over tid) ble valgt ut for en omfattende studie. Figur 3 viser resultatene for ladning, størrelse og innhold av ROS i begge tilfeller. Resultatene er også oppsummert i tabell 1. Som referanse inkluderer både figur 3 og tabell 1 egenskapene til den tidligere syntetiserte ikke-optimaliserte EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Statistiske signifikansberegninger ved bruk av en tosidig t-test er publisert på nytt i tilleggstabell S2. I tillegg inkluderer tilleggsdata studier av effekten av motelektrodens prøvetakingshulldiameter (D) og avstand mellom jordelektrode og spiss (L) (tilleggsfigurer S2 og S3).
(ac) Størrelsesfordeling målt med AFM. (df) Overflateladningskarakteristikk. (g) ROS-karakterisering av EPR.
Det er også viktig å merke seg at for alle de ovennevnte forholdene var den målte ioniseringsstrømmen mellom 2 og 6 μA og spenningen mellom -3,8 og -6,5 kV, noe som resulterte i et strømforbruk på mindre enn 50 mW for denne enkeltgenererte EWNS-kontaktmodulen. Selv om EWNS ble syntetisert under høyt trykk, var ozonnivåene svært lave og oversteg aldri 60 ppb.
Tilleggsfigur S4 viser de simulerte elektriske feltene for henholdsvis [-6,5 kV, 4,0 cm] og [-3,8 kV, 0,5 cm] scenarioene. For [-6,5 kV, 4,0 cm] og [-3,8 kV, 0,5 cm] scenarioene er feltberegningene henholdsvis 2 × 105 V/m og 4,7 × 105 V/m. Dette er forventet, siden spenning-avstandsforholdet er mye høyere i det andre tilfellet.
Figur 3a og 3b viser EWNS-diameteren målt med AFM8. De beregnede gjennomsnittlige EWNS-diametrene var henholdsvis 27 nm og 19 nm for [-6,5 kV, 4,0 cm] og [-3,8 kV, 0,5 cm]-skjemaene. For scenariene [-6,5 kV, 4,0 cm] og [-3,8 kV, 0,5 cm] er de geometriske standardavvikene for fordelingene henholdsvis 1,41 og 1,45, noe som indikerer en smal størrelsesfordeling. Både gjennomsnittsstørrelsen og det geometriske standardavviket er svært nær baseline-EWNS, ved henholdsvis 25 nm og 1,41. Figur 3c viser størrelsesfordelingen til base-EWNS målt med samme metode under de samme forholdene.
Figur 3d viser e resultatene av ladningskarakteriseringen. Dataene er gjennomsnittsmålinger av 30 samtidige målinger av konsentrasjon (#/cm3) og strøm (I). Analysen viser at den gjennomsnittlige ladningen på EWNS er 22 ± 6 e- og 44 ± 6 e- for henholdsvis [-6,5 kV, 4,0 cm] og [-3,8 kV, 0,5 cm]. De har betydelig høyere overflateladninger sammenlignet med baseline EWNS (10 ± 2 e-), to ganger større enn [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenariet og fire ganger større enn [-3,8 kV, 0,5 cm]. Figur 3f viser ladningsdataene for Baseline-EWNS.
Fra konsentrasjonskartene for EWNS-tallet (tilleggsfigurene S5 og S6) kan man se at [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenariet har betydelig flere partikler enn [-3,8 kV, 0,5 cm]-scenariet. Det er også verdt å merke seg at EWNS-tallkonsentrasjonen ble overvåket i opptil 4 timer (tilleggsfigurene S5 og S6), hvor EWNS-generasjonsstabiliteten viste de samme nivåene av partikkeltallkonsentrasjon i begge tilfeller.
Fig. 3g viser EPR-spekteret etter subtraksjon av den optimaliserte EWNS-kontrollen (bakgrunn) ved [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS-spektrene ble også sammenlignet med Baseline-EWNS-scenariet i et tidligere publisert arbeid. Antallet EWNS som reagerte med spinnfeller ble beregnet til å være 7,5 × 104 EWNS/s, noe som tilsvarer den tidligere publiserte Baseline-EWNS8. EPR-spektrene viste tydelig tilstedeværelsen av to typer ROS, hvor O2- var den dominerende arten og OH• var mindre rikelig. I tillegg viste en direkte sammenligning av toppintensitetene at den optimaliserte EWNS hadde et betydelig høyere ROS-innhold sammenlignet med baseline-EWNS.
Figur 4 viser avsetningseffektiviteten til EWNS i EPES. Dataene er også oppsummert i tabell I og sammenlignet med de opprinnelige EWNS-dataene. For begge tilfeller av EUNS er avsetningen nær 100 % selv ved en lav spenning på 3,0 kV. Typisk er 3,0 kV tilstrekkelig for 100 % avsetning, uavhengig av endring i overflateladning. Under de samme forholdene var avsetningseffektiviteten til Baseline-EWNS bare 56 % på grunn av deres lavere ladning (gjennomsnittlig 10 elektroner per EWNS).
Figur 5 og tabell 2 oppsummerer inaktiveringsverdien av mikroorganismer inokulert på overflaten av tomater etter eksponering for omtrent 40 000 #/cm3 EWNS i 45 minutter ved optimal modus [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulert E. coli og Lactobacillus innocuous viste en signifikant reduksjon på 3,8 log i løpet av 45 minutters eksponering. Under de samme forholdene hadde S. enterica en reduksjon på 2,2 log, mens S. cerevisiae og M. parafortutum hadde en reduksjon på 1,0 log.
Elektronmikrofotografiene (figur 6) viser de fysiske endringene indusert av EWNS på ufarlige Escherichia coli-, Streptococcus- og Lactobacillus-celler som fører til inaktivering av dem. Kontrollbakteriene hadde intakte cellemembraner, mens de eksponerte bakteriene hadde skadede ytre membraner.
Elektronmikroskopisk avbildning av kontroll- og eksponerte bakterier avdekket membranskader.
Dataene om de fysisk-kjemiske egenskapene til de optimaliserte EWNS-ene viser samlet sett at egenskapene (overflateladning og ROS-innhold) til EWNS-ene ble betydelig forbedret sammenlignet med de tidligere publiserte EWNS-basislinjedataene8,9,10,11. På den annen side forble størrelsen deres i nanometerområdet, veldig likt resultatene som tidligere er rapportert, slik at de kan forbli i luften over lengre tid. Den observerte polydispersiteten kan forklares med endringer i overflateladningen som bestemmer størrelsen på EWNS, tilfeldigheten til Rayleigh-effekten og potensiell koalesens. Imidlertid, som beskrevet av Nielsen et al.22, reduserer høy overflateladning fordampning ved effektivt å øke overflateenergien/spenningen til vanndråpen. I vår tidligere publikasjon8 ble denne teorien eksperimentelt bekreftet for mikrodråper22 og EWNS. Tap av ladning over tid kan også påvirke størrelsen og bidra til den observerte størrelsesfordelingen.
I tillegg er ladningen per struktur omtrent 22–44 e-, avhengig av situasjonen, noe som er betydelig høyere sammenlignet med den grunnleggende EWNS, som har en gjennomsnittlig ladning på 10 ± 2 elektroner per struktur. Det bør imidlertid bemerkes at dette er den gjennomsnittlige ladningen til EWNS. Seto et al. Det har blitt vist at ladningen er inhomogen og følger en log-normalfordeling21. Sammenlignet med vårt tidligere arbeid, dobler en dobling av overflateladningen avsetningseffektiviteten i EPES-systemet til nesten 100 %11.