Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig.Bruk Forrige og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk skyveknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Blod-hjerne-barrieren og blod-hjerne-barrieren hindrer bioterapeutiske midler i å nå sine mål i sentralnervesystemet, og hindrer derved effektiv behandling av nevrologiske sykdommer.For å oppdage nye hjernetransportører in vivo, introduserte vi et T7-fag-peptidbibliotek og serielt innsamlet blod og cerebrospinalvæske (CSF) ved å bruke en kanylert bevisst modell av rotter.Spesifikke fagkloner ble sterkt anriket i CSF etter fire runder med seleksjon.Testing av individuelle kandidatpeptider avslørte mer enn 1000 ganger anrikning i CSF.Bioaktiviteten til den peptidmedierte leveringen til hjernen ble bekreftet av en 40 % reduksjon i nivået av amyloid-β i cerebrospinalvæsken ved å bruke en BACE1-peptidhemmer koblet til det identifiserte nye transittpeptidet.Disse resultatene tyder på at peptidene identifisert ved in vivo fagseleksjonsmetoder kan være nyttige bærere for systemisk levering av makromolekyler til hjernen med en terapeutisk effekt.
Målrettet terapiforskning på sentralnervesystemet (CNS) har i stor grad fokusert på å identifisere optimaliserte legemidler og midler som viser CNS-målrettede egenskaper, med mindre innsats for å oppdage mekanismene som driver aktiv medikamentlevering til hjernen.Dette begynner å endre seg nå ettersom medikamentlevering, spesielt store molekyler, er en integrert del av moderne nevrovitenskapelig medikamentutvikling.Miljøet i sentralnervesystemet er godt beskyttet av det cerebrovaskulære barrieresystemet, som består av blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren (BCBB)1, noe som gjør det utfordrende å levere medikamenter til hjernen1,2.Det anslås at nesten alle medikamenter med store molekyler og mer enn 98 % av legemidler med små molekyler elimineres fra hjernen3.Det er derfor det er veldig viktig å identifisere nye hjernetransportsystemer som gir effektiv og spesifikk levering av terapeutiske legemidler til CNS 4,5.Imidlertid presenterer BBB og BCSFB også en utmerket mulighet for medikamentlevering da de trenger inn og kommer inn i alle strukturer i hjernen gjennom dens omfattende vaskulatur.Dermed er den nåværende innsatsen for å bruke ikke-invasive metoder for levering til hjernen i stor grad basert på mekanismen for reseptormediert transport (PMT) ved bruk av den endogene BBB6-reseptoren.Til tross for nylige nøkkelfremskritt ved bruk av transferrinreseptorveien7,8, er det nødvendig med videreutvikling av nye leveringssystemer med forbedrede egenskaper.For dette formål var målet vårt å identifisere peptider som er i stand til å mediere CSF-transport, da de i prinsippet kunne brukes til å levere makromolekyler til CNS eller til å åpne nye reseptorveier.Spesielt kan spesifikke reseptorer og transportører av det cerebrovaskulære systemet (BBB og BSCFB) tjene som potensielle mål for aktiv og spesifikk levering av bioterapeutiske legemidler.Cerebrospinalvæske (CSF) er et sekretorisk produkt av choroid plexus (CS) og er i direkte kontakt med interstitialvæsken i hjernen gjennom subaraknoidalrommet og ventrikkelrommet4.Nylig har det blitt vist at subaraknoidal cerebrospinalvæske diffunderer for mye inn i interstitium i hjernen9.Vi håper å få tilgang til det parenkymale rommet ved å bruke denne subaraknoidale innstrømningskanalen eller direkte gjennom BBB.For å oppnå dette implementerte vi en robust in vivo fagseleksjonsstrategi som ideelt sett identifiserer peptider transportert av en av disse to distinkte veiene.
Vi beskriver nå en sekvensiell in vivo fagvisningsscreeningsmetode med CSF-prøvetaking kombinert med høy gjennomstrømningssekvensering (HTS) for å overvåke innledende utvalgsrunder med det høyeste biblioteksdiversiteten.Screening ble utført på bevisste rotter med en permanent implantert stor cisterna (CM) kanyle for å unngå blodforurensning.Viktigere er at denne tilnærmingen velger både hjernemålretting og peptider med transportaktivitet over den cerebrovaskulære barrieren.Vi brukte T7-fager på grunn av deres lille størrelse (~60 nm)10 og foreslo at de er egnet for transport av vesikler som tillater transcellulær kryssing av endotel- og/eller epitel-medulla-barrieren.Etter fire runder med panorering ble fagpopulasjoner isolert og viste sterk in vivo CSF-berikelse og cerebral mikrokarassosiasjon.Viktigere, vi var i stand til å bekrefte funnene våre ved å demonstrere at de foretrukne og kjemisk syntetiserte beste kandidatpeptidene er i stand til å transportere proteinlast inn i cerebrospinalvæsken.Først ble de farmakodynamiske effektene av CNS etablert ved å kombinere et ledende transittpeptid med en hemmer av BACE1-peptidet.I tillegg til å demonstrere at in vivo funksjonelle screeningsstrategier kan identifisere nye hjernetransportpeptider som effektive proteinlastbærere, forventer vi at lignende funksjonelle seleksjonstilnærminger også blir viktige for å identifisere nye hjernetransportveier.
Basert på plakkdannende enheter (PFU), etter fagpakkingstrinnet, ble et bibliotek av tilfeldige 12-mer lineære T7 fagpeptider med en mangfoldighet på omtrent 109 designet og opprettet (se Materialer og metoder).Det er viktig å merke seg at vi nøye analyserte dette biblioteket før panorering in vivo.PCR-amplifisering av fagbiblioteksprøver ved bruk av modifiserte primere genererte amplikoner som var direkte anvendelige på HTS (tilleggsfigur 1a).På grunn av a) HTS11-sekvenseringsfeil, b) innvirkning på kvaliteten til primere (NNK)1-12, og c) tilstedeværelsen av villtype (wt) fag (skjelettinnlegg) i standby-biblioteket, ble en sekvensfiltreringsprosedyre implementert for å trekke ut kun verifisert sekvensinformasjon (tilleggsbilde 1b).Disse filtertrinnene gjelder for alle HTS-sekvenseringsbiblioteker.For standardbiblioteket ble det oppnådd totalt 233 868 avlesninger, hvorav 39 % besto filterkriteriene og ble brukt til bibliotekanalyse og seleksjon for påfølgende runder (Supplerende figur 1c–e).Lesningene var hovedsakelig multipler av 3 basepar i lengde med en topp ved 36 nukleotider (Supplerende Fig. 1c), som bekrefter bibliotekdesignet (NNK) 1-12.Spesielt inneholdt omtrent 11 % av bibliotekmedlemmene en 12-dimensjonal villtype (wt) ryggrad PAGISRELVDKL-innsetting, og nesten halvparten av sekvensene (49%) inneholdt innsettinger eller delesjoner.HTS-en til bibliotekbiblioteket bekreftet det høye mangfoldet av peptider i biblioteket: mer enn 81 % av peptidsekvensene ble funnet bare én gang og bare 1,5 % forekom i ≥4 kopier (tilleggsfigur 2a).Frekvensene av aminosyrer (aa) ved alle 12 posisjoner i repertoaret korrelerte godt med frekvensene som forventes for antall kodoner generert av det degenererte NKK-repertoaret (tilleggsfigur 2b).Den observerte frekvensen av aa-rester kodet av disse innsatsene korrelerte godt med den beregnede frekvensen (r = 0,893) (Supplerende Fig. 2c).Fremstillingen av fagbiblioteker for injeksjon inkluderer trinnene med amplifikasjon og fjerning av endotoksin.Dette har tidligere vist seg å potensielt redusere mangfoldet av fagbiblioteker12,13.Derfor sekvenserte vi et plate-amplifisert fagbibliotek som hadde gjennomgått endotoksinfjerning og sammenlignet det med det originale biblioteket for å estimere frekvensen av AA.En sterk korrelasjon (r = 0,995) ble observert mellom den opprinnelige poolen og den amplifiserte og rensede poolen (tilleggsfigur 2d), noe som indikerer at konkurranse mellom kloner amplifisert på plater ved bruk av T7-fag ikke forårsaket større skjevheter.Denne sammenligningen er basert på frekvensen av tripeptidmotiver i hvert bibliotek, siden mangfoldet av biblioteker (~ 109) ikke kan fanges fullstendig selv med HTS.Frekvensanalyse av aa ved hver posisjon avslørte en liten posisjonsavhengig skjevhet i de tre siste posisjonene av det innførte repertoaret (Supplerende Fig. 2e).Avslutningsvis konkluderte vi med at kvaliteten og mangfoldet til biblioteket var akseptabelt og bare mindre endringer i mangfoldet ble observert på grunn av amplifikasjon og klargjøring av fagbiblioteker mellom flere seleksjonsrunder.
Seriell prøvetaking av cerebrospinalvæske kan utføres ved å kirurgisk implantere en kanyle i CM av bevisste rotter for å lette identifisering av T7-fag injisert intravenøst ​​(iv) via BBB og/eller BCSFB (fig. 1a-b).Vi brukte to uavhengige seleksjonsarmer (arm A og B) i de tre første rundene med in vivo seleksjon (fig. 1c).Vi økte gradvis strengheten til seleksjonen ved å redusere den totale mengden fag som ble introdusert i de tre første seleksjonsrundene.For den fjerde panoreringsrunden kombinerte vi prøver fra grenene A og B og utførte ytterligere tre uavhengige valg.For å studere in vivo-egenskapene til T7-fagpartikler i denne modellen, ble villtypefag (PAGISRELVDKL-masterinnlegg) injisert i rotter via halevenen.Gjenvinning av fager fra cerebrospinalvæske og blod på forskjellige tidspunkter viste at relativt små T7 ikosaedriske fager hadde en rask initial clearance-fase fra blodrommet (tilleggsfig. 3).Basert på de administrerte titrene og blodvolumet til rottene, beregnet vi at bare ca. 1 vekt%.fag fra den administrerte dosen ble påvist i blodet 10 minutter etter intravenøs injeksjon.Etter denne innledende raske nedgangen ble en langsommere primær clearance målt med en halveringstid på 27,7 minutter.Viktigere, bare svært få fager ble hentet fra CSF-avdelingen, noe som indikerer en lav bakgrunn for villtype-fag-migrering inn i CSF-avdelingen (tilleggsfig. 3).I gjennomsnitt ble det kun påvist ca. 1 x 10-3 % titere av T7-fag i blodet og 4 x 10-8 % av initialt infunderte fager i cerebrospinalvæsken over hele prøveperioden (0-250 min).Spesielt var halveringstiden (25,7 min) for villtypefag i cerebrospinalvæske lik den som ble observert i blod.Disse dataene viser at barrieren som skiller CSF-rommet fra blodet er intakt i CM-kanylerte rotter, noe som tillater in vivo-seleksjon av fagbiblioteker for å identifisere kloner som lett transporteres fra blodet inn i CSF-rommet.
(a) Sette opp en metode for ny prøvetaking av cerebrospinalvæske (CSF) fra et stort basseng.(b) Diagram som viser den cellulære plasseringen av sentralnervesystembarrieren (CNS) og seleksjonsstrategien som brukes til å identifisere peptider som krysser blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren.(c) Flytskjema for screening av fagdisplay in vivo.I hver runde med seleksjon ble fager (dyreidentifikatorer inne i pilene) injisert intravenøst.To uavhengige alternative grener (A, B) holdes separat frem til 4. valgrunde.For seleksjonsrunde 3 og 4 ble hver fagklon ekstrahert fra CSF manuelt sekvensert.(d) Kinetikk av fag isolert fra blod (røde sirkler) og cerebrospinalvæske (grønne trekanter) under den første seleksjonsrunden i to kanylerte rotter etter intravenøs injeksjon av T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/dyr).Blå firkanter indikerer gjennomsnittlig startkonsentrasjon av fag i blodet, beregnet fra mengden injisert fag, tatt i betraktning det totale blodvolumet.De svarte firkantene indikerer skjæringspunktet for y-linjen ekstrapolert fra fagkonsentrasjoner i blodet.(e,f) Presenter den relative frekvensen og distribusjonen av alle mulige overlappende tripeptidmotiver funnet i peptidet.Antall motiver funnet i 1000 avlesninger er vist.Signifikant (p < 0,001) berikede motiver er markert med røde prikker.(e) Korrelasjonsspredningsdiagram som sammenligner den relative frekvensen av tripeptidmotivet til det injiserte biblioteket med blodavledet fag fra dyr #1.1 og #1.2.(f) Korrelasjonsspredningsdiagram som sammenligner de relative frekvensene til dyrefag tripeptidmotiver #1.1 og #1.2 isolert i blod og cerebrospinalvæske.(g, h) Sekvens-ID-representasjon av fag anriket på blod (g) versus injiserte biblioteker og fag anriket på CSF (h) versus blod etter en runde med in vivo-seleksjon i begge dyrene.Størrelsen på en-bokstavskoden indikerer hvor ofte den aminosyren forekommer i den posisjonen.Grønn = polar, lilla = nøytral, blå = basisk, rød = sur og svart = hydrofobe aminosyrer.Figur 1a, b ble designet og produsert av Eduard Urich.
Vi injiserte et fagpeptidbibliotek i to CM-instrumentrotter (kledde A og B) og isolerte fag fra cerebrospinalvæske og blod (Figur 1d).Den første raske clearance av biblioteket var mindre uttalt sammenlignet med villtype-fagen.Gjennomsnittlig halveringstid for det injiserte biblioteket i begge dyrene var 24,8 minutter i blod, tilsvarende villtype fag, og 38,5 minutter i CSF.Blod- og cerebrospinalvæskefagprøver fra hvert dyr ble utsatt for HTS og alle identifiserte peptider ble analysert for tilstedeværelse av et kort tripeptidmotiv.Tripeptidmotiver ble valgt fordi de gir et minimalt grunnlag for strukturdannelse og peptid-protein-interaksjoner14,15.Vi fant en god korrelasjon i fordelingen av motiver mellom det injiserte fagbiblioteket og kloner ekstrahert fra blodet til begge dyrene (fig. 1e).Dataene indikerer at sammensetningen av biblioteket bare er marginalt anriket i blodrommet.Aminosyrefrekvenser og konsensussekvenser ble videre analysert ved hver posisjon ved bruk av en tilpasning av Weblogo16-programvaren.Interessant nok fant vi en sterk berikelse i blodglysinrester (fig. 1g).Når blod ble sammenlignet med kloner valgt fra CSF, ble sterk seleksjon og noe fravalg av motiver observert (fig. lf), og visse aminosyrer var fortrinnsvis tilstede i forhåndsbestemte posisjoner i 12-medlemmet (fig. 1h).Spesielt skilte individuelle dyr seg betydelig i cerebrospinalvæske, mens blodglysinanrikning ble observert i begge dyrene (tilleggsfigur 4a–j).Etter streng filtrering av sekvensdata i cerebrospinalvæsken til dyr #1.1 og #1.2, ble totalt 964 og 420 unike 12-mer peptider oppnådd (tilleggsfigur 1d–e).De isolerte fagkloner ble amplifisert og utsatt for en andre runde med in vivo-seleksjon.Fag ekstrahert fra den andre seleksjonsrunden ble utsatt for HTS i hvert dyr og alle identifiserte peptider ble brukt som input til et motivgjenkjenningsprogram for å analysere forekomsten av tripeptidmotiver (fig. 2a, b, ef).Sammenlignet med den første syklusen av fagen gjenvunnet fra CSF, observerte vi ytterligere seleksjon og fravalg av mange motiver i CSF i grenene A og B (fig. 2).En nettverksidentifikasjonsalgoritme ble brukt for å bestemme om de representerte forskjellige mønstre av konsistent sekvens.En klar likhet ble observert mellom de 12-dimensjonale sekvensene gjenvunnet av CSF i alternativ kladde A (fig. 2c, d) og kladde B (fig. 2g, h).Den sammenslåtte analysen i hver gren avslørte forskjellige seleksjonsprofiler for 12-mer peptider (Supplerende Fig. 5c,d) og en økning i CSF/blodtiterforholdet over tid for sammenslåtte kloner etter den andre seleksjonsrunden sammenlignet med den første seleksjonsrunden (Supplerende Fig. 5e).).
Berikelse av motiver og peptider i cerebrospinalvæske ved to påfølgende runder med in vivo funksjonell fagvisningsvalg.
Alle cerebrospinalvæskefager gjenvunnet fra den første runden av hvert dyr (dyr #1.1 og #1.2) ble samlet, amplifisert, HT-sekvensert og reinjisert sammen (2 x 1010 fager/dyr) 2 SM-kanylerte rotter (#1.1 → #).2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4).(a,b,e,f) Korrelasjonsspredningsplott som sammenligner den relative frekvensen av tripeptidmotiver til alle CSF-avledede fager i den første og andre seleksjonsrunden.Relativ frekvens og distribusjon av motiver som representerer alle mulige overlappende tripeptider funnet i peptider i begge retninger.Antall motiver funnet i 1000 avlesninger er vist.Motiver som ble signifikant (p < 0,001) valgt eller ekskludert i et av de sammenlignede bibliotekene er uthevet med røde prikker.(c, d, g, h) Sekvenslogorepresentasjon av alle CSF-rike 12 aminosyrer lange sekvenser basert på runde 2 og 1 av in vivo-seleksjon.Størrelsen på en-bokstavskoden indikerer hvor ofte den aminosyren forekommer i den posisjonen.For å representere logoen sammenlignes frekvensen av CSF-sekvenser ekstrahert fra individuelle dyr mellom to seleksjonsrunder, og de berikede sekvensene i den andre runden vises: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4.De mest anrikede aminosyrene i en gitt posisjon i (c, d) dyr nr.2.1 og nr.2.2 eller (g, h) hos dyr nr.2.3 og nr.2.4 vises i farger.Grønn = polar, lilla = nøytral, blå = basisk, rød = sur og svart = hydrofobe aminosyrer.
Etter den tredje seleksjonsrunden identifiserte vi 124 unike peptidsekvenser (#3.1 og #3.2) fra 332 CSF-rekonstituerte fagkloner isolert fra to dyr (tilleggsfigur 6a).Sekvensen LGSVS (18,7 %) hadde den høyeste relative andelen, etterfulgt av villtype-innskuddene PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) og SARGSWREIVSLS (2,2 %).I den siste fjerde runden samlet vi to uavhengig utvalgte grener fra tre separate dyr (fig. 1c).Av de 925 sekvenserte fagklonene som ble utvunnet fra CSF, fant vi i den fjerde runden 64 unike peptidsekvenser (Supplerende Fig. 6b), blant disse falt den relative andelen villtypefag til 0,8 %.De vanligste CSF-klonene i fjerde runde var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) og RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).Lengdeområdet til de valgte peptidene skyldes nukleotidinnsettinger/delesjoner eller for tidlige stoppkodoner i bibliotekprimerne ved bruk av degenererte kodoner for NNK-bibliotekdesign.Premature stoppkodoner genererer kortere peptider og velges fordi de inneholder det gunstige aa-motivet.Lengre peptider kan være resultatet av innsettinger/delesjoner i primerne til de syntetiske bibliotekene.Dette plasserer det utformede stoppkodonet utenfor rammen og leser det til et nytt stoppkodon vises nedstrøms.Generelt beregnet vi berikelsesfaktorer for alle fire utvalgsrundene ved å sammenligne inngangsdataene med prøveutdataene.For den første runden med screening brukte vi villtype fagtitre som en ikke-spesifikk bakgrunnsreferanse.Interessant nok var negativ fagseleksjon veldig sterk i den første CSF-syklusen, men ikke i blod (fig. 3a), noe som kan skyldes lav sannsynlighet for passiv diffusjon av de fleste medlemmene av peptidbiblioteket inn i CSF-rommet eller relative fager har en tendens til å bli mer effektivt beholdt eller fjernet fra blodstrømmen enn bakteriofager.Imidlertid, i den andre runden med panorering, ble det observert et sterkt utvalg av fager i CSF i begge klader, noe som tyder på at forrige runde ble beriket i fager som viser peptider som fremmer CSF-opptak (fig. 3a).Igjen, uten betydelig blodanrikning.Også i den tredje og fjerde runden ble fagklonene betydelig anriket på CSF.Ved å sammenligne den relative frekvensen av hver unike peptidsekvens mellom de to siste seleksjonsrundene fant vi at sekvensene ble enda mer beriket i den fjerde seleksjonsrunden (fig. 3b).Totalt 931 tripeptidmotiver ble ekstrahert fra alle 64 unike peptidsekvenser ved bruk av begge peptidorienteringene.De mest berikede motivene i den fjerde runden ble nærmere undersøkt for deres berikelsesprofiler på tvers av alle runder sammenlignet med det injiserte biblioteket (cut-off: 10 % berikelse) (Supplerende Fig. 6c).Generelle utvelgelsesmønstre viste at de fleste av de studerte motivene ble beriket i alle tidligere runder av begge utvelgelsesgrenene.Imidlertid var noen motiver (f.eks. SGL, VSG, LGS GSV) hovedsakelig fra alternativ klasse A, mens andre (f.eks. FGW, RTN, WGF, NTR) ble beriket i alternativ klasse B.
Validering av CSF-transport av CSF-anrikede fag-fremviste peptider og biotinylerte lederpeptider konjugert til streptavidin-nyttelast.
(a) Anrikningsforhold beregnet i alle fire runder (R1-R4) basert på injiserte (inngang = I) fag-titere (PFU) og bestemte CSF-fagtitere (utgang = O).Anrikningsfaktorer for de tre siste rundene (R2-R4) ble beregnet ved sammenligning med forrige runde og første runde (R1) med vektdata.Åpne stolper er cerebrospinalvæske, skyggelagte stolper er plasma.(***p<0,001, basert på Students t-test).(b) Liste over de mest tallrike fagpeptidene, rangert i henhold til deres relative andel av alle fager samlet i CSF etter runde 4 med seleksjon.De seks vanligste fagklonene er uthevet i farge, nummerert og deres berikelsesfaktorer mellom runde 3 og 4 av seleksjon (innsett).(c,d) De seks mest anrikede fagklonene, tomme fag- og foreldrefagpeptidbibliotekene fra runde 4 ble analysert individuelt i en CSF-prøvetakingsmodell.CSF og blodprøver ble samlet på de angitte tidspunktene.(c) Like mengder av 6 kandidat-fagkloner (2 x 1010 fager/dyr), tomme fager (#1779) (2 x 1010 fager/dyr) og stamfag-peptidbiblioteker (2 x 1012 fager/dyr) Injiser minst 3 CM adskilte CM som administreres i haledyret.CSF-farmakokinetikken til hver injisert fagklon og fagpeptidbibliotek over tid er vist.(d) viser gjennomsnittlig CSF/blod-forhold for alle gjenvunnede fager/ml over prøvetakingstiden.(e) Fire syntetiske lederpeptider og en kryptert kontroll ble koblet med biotin til streptavidin gjennom deres N-terminale (tetramervisning) etterfulgt av injeksjon (halevene iv, 10 mg streptavidin/kg).Minst tre intuberte rotter (N = 3).).CSF-prøver ble samlet på de angitte tidspunktene og streptavidinkonsentrasjoner ble målt ved CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ikke påvist).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basert på ANOVA-test).(f) Sammenligning av aminosyresekvensen til den mest anrikede fagpeptidklonen #2002 (lilla) med andre utvalgte fagpeptidkloner fra den fjerde seleksjonsrunden.Identiske og lignende aminosyrefragmenter er fargekodet.
Av alle anrikede fager i den fjerde runden (fig. 3b), ble seks kandidatkloner valgt for videre individuell analyse i CSF-prøvetakingsmodellen.Like mengder av seks kandidatfag-, tomme fag- (ingen innskudd) og profagpeptidbiblioteker ble injisert i tre kanylerte CM-dyr, og farmakokinetikken ble bestemt i CSF (Fig. 3c) og blod (Supplerende Fig. 7) analyser.Alle fagkloner som ble testet målrettet CSF-avdelingen på et nivå 10-1000 ganger høyere enn nivået til den tomme kontrollfagen (#1779).For eksempel hadde kloner #2020 og #2077 omtrent 1000 ganger høyere CSF-titere enn kontrollfag.Den farmakokinetiske profilen til hvert utvalgte peptid er forskjellig, men alle har en høy CSF-søkeevne.Vi observerte en konstant nedgang over tid for kloner #1903 og #2011, mens for kloner #2077, #2002 og #2009 kan en økning i løpet av de første 10 minuttene indikere aktiv transport, men må verifiseres.Kloner #2020, #2002 og #2077 stabiliserte seg på høye nivåer, mens CSF-konsentrasjonen av klon #2009 sakte sank etter den første økningen.Vi sammenlignet deretter den relative frekvensen av hver CSF-kandidat med dens blodkonsentrasjon (fig. 3d).Korrelasjonen av gjennomsnittlig titer for hver CSF-kandidat med dens blodtiter ved alle prøvetakingstidspunkter viste at tre av de seks kandidatene var signifikant beriket i blod CSF.Interessant nok viste klon #2077 høyere blodstabilitet (tilleggsfigur 7).For å bekrefte at peptidene i seg selv er i stand til aktivt å transportere annen last enn fagpartikler inn i CSF-rommet, syntetiserte vi fire lederpeptider derivatisert med biotin ved N-terminalen der peptidene fester seg til fagpartikkelen.Biotinylerte peptider (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) ble konjugert med streptavidin (SA) for å oppnå multimere former som noe etterligner faggeometri.Dette formatet tillot oss også å måle SA-eksponering i blod og cerebrospinalvæske som lasttransporterende proteinpeptider.Det er viktig at fagdata ofte kan reproduseres når syntetiske peptider ble administrert i dette SA-konjugerte formatet (fig. 3e).De krypterte peptidene hadde mindre initial eksponering og raskere CSF-clearance med upåviselige nivåer innen 48 timer.For å få innsikt i leveringsveiene til disse peptidfagklonene inn i CSF-rommet, analyserte vi lokaliseringen av individuelle fagpeptidtreff ved bruk av immunhistokjemi (IHC) for å direkte oppdage fagpartikler 1 time etter intravenøs injeksjon in vivo.Spesielt kunne kloner #2002, #2077 og #2009 påvises ved sterk farging i hjernekapillærer, mens kontrollfag (#1779) og klon #2020 ikke ble oppdaget (tilleggsfigur 8).Dette tyder på at disse peptidene bidrar til effekten på hjernen nettopp ved å krysse BBB.Ytterligere detaljert analyse er nødvendig for å teste denne hypotesen, da BSCFB-ruten også kan være involvert.Ved sammenligning av aminosyresekvensen til den mest anrikede klonen (#2002) med andre utvalgte peptider, ble det bemerket at noen av dem har lignende aminosyreforlengelser, noe som kan indikere en lignende transportmekanisme (fig. 3f).
På grunn av sin unike plasmaprofil og betydelige økning i CSF over tid, ble fagvisningsklon #2077 videre utforsket over en lengre 48-timers periode og var i stand til å reprodusere den raske økningen i CSF observert i forbindelse med vedvarende SA-nivåer (fig. 4a).Når det gjelder andre identifiserte fagkloner, farget #2077 sterkt for hjernekapillærer og viste betydelig kolokalisering med kapillærmarkørlektin når den ble sett med høyere oppløsning og muligens noe farging i det parenkymale rommet (figur 4b).For å undersøke om peptidmedierte farmakologiske effekter kunne oppnås i CNS, utførte vi et eksperiment der biotinylerte versjoner av i) #2077 transittpeptidet og ii) BACE1-hemmerpeptidet ble blandet med SA i to forskjellige forhold.For en kombinasjon brukte vi bare BACE1-peptidhemmeren og for den andre brukte vi et 1:3-forhold mellom BACE1-peptidhemmer og #2077-peptid.Begge prøvene ble administrert intravenøst ​​og blod- og cerebrospinalvæskenivåer av beta-amyloid peptid 40 (Abeta40) ble målt over tid.Abeta40 ble målt i CSF da det reflekterer BACE1-hemming i hjerneparenkymet.Som forventet reduserte begge komplekser signifikant blodnivåer av Abeta40 (fig. 4c, d).Imidlertid er det kun prøver som inneholder en blanding av peptid nr.2077 og en hemmer av BACE1-peptidet konjugert til SA forårsaket en signifikant reduksjon i Abeta40 i cerebrospinalvæsken (fig. 4c).Dataene viser at peptidnr.2077 er i stand til å transportere SA-proteinet på 60 kDa inn i CNS og induserer også farmakologiske effekter med SA-konjugerte hemmere av BACE1-peptidet.
(a) Klonal injeksjon (2 × 10 fager/dyr) av T7-fag som viser langsiktige farmakokinetiske profiler av CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) og uinjisert kontrollfag (#1779) i minst tre CM-intuberte rotter.(b) Konfokalt mikroskopisk bilde av representative kortikale mikrokar i faginjiserte rotter (2 × 10 10 fager/dyr) som viser motfarging av peptid #2077 og kar (lektin).Disse fagklonene ble administrert til 3 rotter og fikk sirkulere i 1 time før perfusjon.Hjerner ble seksjonert og farget med polyklonale FITC-merkede antistoffer mot T7-fagkapsiden.Ti minutter før perfusjon og påfølgende fiksering ble DyLight594-merket lektin administrert intravenøst.Fluorescerende bilder som viser lektinfarging (rød) av den luminale siden av mikrokar og fager (grønn) i lumen av kapillærer og perivaskulært hjernevev.Skalalinjen tilsvarer 10 µm.(c, d) Biotinylert BACE1-hemmende peptid alene eller i kombinasjon med biotinylert transittpeptid #2077 ble koblet til streptavidin etterfulgt av intravenøs injeksjon av minst tre kanylerte CM-rotter (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptidhemmermediert reduksjon i Aβ40 ble målt ved Aβ1-40 ELISA i blod (rød) og cerebrospinalvæske (oransje) ved de angitte tidspunktene.For bedre klarhet tegnes en stiplet linje på grafen i en skala på 100 %.(c) Prosentvis reduksjon i Aβ40 i blod (røde trekanter) og cerebrospinalvæske (oransje trekanter) hos rotter behandlet med streptavidin konjugert til transittpeptid #2077 og BACE1-hemmende peptid i et 3:1-forhold.(d) Prosentvis reduksjon i blod Aβ40 (røde sirkler) og cerebrospinalvæske (oransje sirkler) hos rotter behandlet med streptavidin kun koblet til et BACE1-hemmende peptid.Aβ-konsentrasjonen i kontrollen var 420 pg/ml (standardavvik = 101 pg/ml).
Fagvisning har blitt brukt med suksess i flere områder av biomedisinsk forskning17.Denne metoden har blitt brukt for in vivo vaskulære mangfoldsstudier18,19 samt studier rettet mot cerebrale kar20,21,22,23,24,25,26.I denne studien utvidet vi bruken av denne seleksjonsmetoden ikke bare til direkte identifisering av peptider rettet mot cerebrale kar, men også til oppdagelsen av kandidater med aktive transportegenskaper for å krysse blod-hjerne-barrieren.Vi beskriver nå utviklingen av en in vivo-seleksjonsprosedyre i CM-intuberte rotter og demonstrerer dens potensial til å identifisere peptider med CSF-søkeegenskaper.Ved å bruke T7-fagen som viser et bibliotek av 12-mer tilfeldige peptider, var vi i stand til å demonstrere at T7-fagen er liten nok (omtrent 60 nm i diameter)10 til å tilpasses blod-hjerne-barrieren, og dermed direkte krysse blod-hjerne-barrieren eller choroid plexus.Vi observerte at CSF-høsting fra kanylerte CM-rotter var en godt kontrollert in vivo funksjonell screeningsmetode, og at den ekstraherte fagen ikke bare bandt seg til vaskulaturen, men også fungerte som en transportør over blod-hjerne-barrieren.Videre, ved samtidig å samle inn blod og påføre HTS til CSF og blodavledede fager, bekreftet vi at vårt valg av CSF ikke var påvirket av blodanrikning eller egnethet for utvidelse mellom seleksjonsrunder.Blodrommet er imidlertid en del av seleksjonsprosedyren, siden fager som er i stand til å nå CSF-rommet må overleve og sirkulere i blodet lenge nok til å berike seg selv i hjernen.For å trekke ut pålitelig sekvensinformasjon fra rå HTS-data, implementerte vi filtre tilpasset plattformspesifikke sekvenseringsfeil i analysearbeidsflyten.Ved å inkorporere kinetiske parametere i screeningsmetoden, bekreftet vi den raske farmakokinetikken til villtype T7-fager (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 og bestemte også deres halveringstid i cerebrospinalvæske (t½ ~ 26 min) per minutt).Til tross for lignende farmakokinetiske profiler i blod og CSF, kunne bare 0,001 % av blodkonsentrasjonen av fag påvises i CSF, noe som indikerer lav bakgrunnsmobilitet av villtype T7-fag over blod-hjerne-barrieren.Dette arbeidet fremhever viktigheten av den første seleksjonsrunden ved bruk av in vivo panoreringsstrategier, spesielt for fagsystemer som raskt fjernes fra sirkulasjonen, ettersom få kloner er i stand til å nå CNS-rommet.I første runde var således reduksjonen i biblioteksmangfold veldig stor, ettersom bare et begrenset antall kloner til slutt ble samlet inn i denne svært strenge CSF-modellen.Denne in vivo panoreringsstrategien inkluderte flere seleksjonstrinn som aktiv akkumulering i CSF-rommet, klonoverlevelse i blodrommet og rask fjerning av T7-fagkloner fra blodet i løpet av de første 10 minuttene (fig. 1d og tilleggsfig. 4M).).Således, etter den første runden, ble forskjellige fagkloner identifisert i CSF, selv om den samme første samlingen ble brukt for individuelle dyr.Dette antyder at flere strenge seleksjonstrinn for kildebibliotek med et stort antall bibliotekmedlemmer resulterer i en betydelig reduksjon i mangfoldet.Derfor vil tilfeldige hendelser bli en integrert del av den innledende utvelgelsesprosessen, og vil ha stor innflytelse på resultatet.Det er sannsynlig at mange av klonene i det originale biblioteket hadde en svært lik CSF-anrikningstilbøyelighet.Selv under de samme eksperimentelle forholdene kan imidlertid seleksjonsresultatene avvike på grunn av det lille antallet av hver bestemt klon i den første samlingen.
Motivene beriket i CSF er forskjellige fra de i blodet.Interessant nok la vi merke til det første skiftet mot glycinrike peptider i blodet til individuelle dyr.(fig. lg, tilleggsfigurer 4e, 4f).Fag som inneholder glycinpeptider kan være mer stabile og mindre sannsynlighet for å bli tatt ut av sirkulasjonen.Imidlertid ble disse glycinrike peptidene ikke påvist i cerebrospinalvæskeprøvene, noe som tyder på at de kurerte bibliotekene gikk gjennom to forskjellige seleksjonstrinn: ett i blodet og et annet tillatt å samle seg i cerebrospinalvæsken.CSF-anrikede kloner fra den fjerde seleksjonsrunden har blitt grundig testet.Nesten alle de individuelt testede klonene ble bekreftet å være anriket på CSF sammenlignet med blank kontrollfag.Ett peptidtreff (#2077) ble undersøkt mer detaljert.Den viste en lengre plasmahalveringstid sammenlignet med andre treff (figur 3d og tilleggsfigur 7), og interessant nok inneholdt dette peptidet en cysteinrest ved C-terminalen.Det har nylig blitt vist at tilsetning av cystein til peptider kan forbedre deres farmakokinetiske egenskaper ved å binde seg til albumin 29 .Dette er foreløpig ukjent for peptid #2077 og krever videre studier.Noen peptider viste en valensavhengighet i CSF-anrikning (data ikke vist), som kan være relatert til den viste overflategeometrien til T7-kapsiden.T7-systemet vi brukte viste 5-15 kopier av hvert peptid per fagpartikkel.IHC ble utført på kandidat blyfagkloner injisert intravenøst ​​i hjernebarken til rotter (tilleggsfig. 8).Dataene viste at minst tre kloner (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) interagerte med BBB.Det gjenstår å bestemme om denne BBB-interaksjonen resulterer i akkumulering av CSF eller bevegelse av disse klonene direkte til BCSFB.Det er viktig at vi viser at de utvalgte peptidene beholder sin CSF-transportkapasitet når de syntetiseres og bindes til proteinlasten.Binding av N-terminale biotinylerte peptider til SA gjentar i hovedsak resultatene oppnådd med deres respektive fagkloner i blod og cerebrospinalvæske (fig. 3e).Til slutt viser vi at blypeptid #2077 er i stand til å fremme hjernevirkningen til en biotinylert peptidhemmer av BACE1 konjugert til SA, og forårsaker uttalte farmakodynamiske effekter i CNS ved å redusere Abeta40-nivåene i CSF betydelig (fig. 4).Vi var ikke i stand til å identifisere noen homologer i databasen ved å utføre et peptidsekvenshomologisøk av alle treff.Det er viktig å merke seg at størrelsen på T7-biblioteket er omtrent 109, mens den teoretiske bibliotekstørrelsen for 12-merer er 4 x 1015. Derfor valgte vi bare en liten brøkdel av diversitetsrommet til 12-mer-peptidbiblioteket, noe som kan bety at mer optimaliserte peptider kan identifiseres ved å identifisere de tilstøtende treffevalueringene.Hypotetisk sett kan en av grunnene til at vi ikke har funnet noen naturlige homologer av disse peptidene være fravalg under evolusjon for å forhindre ukontrollert inntreden av visse peptidmotiver i hjernen.
Samlet gir resultatene våre grunnlag for fremtidig arbeid med å identifisere og karakterisere transportsystemene til den cerebrovaskulære barrieren in vivo mer detaljert.Det grunnleggende oppsettet av denne metoden er basert på en funksjonell seleksjonsstrategi som ikke bare identifiserer kloner med cerebrale vaskulære bindingsegenskaper, men inkluderer også et kritisk trinn der vellykkede kloner har iboende aktivitet for å krysse biologiske barrierer in vivo inn i CNS-rommet.er å belyse transportmekanismen for disse peptidene og deres preferanse for binding til mikrovaskulaturen som er spesifikk for hjerneregionen.Dette kan føre til oppdagelsen av nye veier for transport av BBB og reseptorer.Vi forventer at de identifiserte peptidene kan binde seg direkte til cerebrovaskulære reseptorer eller til sirkulerende ligander transportert gjennom BBB eller BCSFB.Peptidvektorene med CSF-transportaktivitet oppdaget i dette arbeidet vil bli undersøkt videre.Vi undersøker for tiden hjernespesifisiteten til disse peptidene for deres evne til å krysse BBB og/eller BCSFB.Disse nye peptidene vil være ekstremt verdifulle verktøy for potensiell oppdagelse av nye reseptorer eller veier og for utvikling av nye svært effektive plattformer for levering av makromolekyler, som biologiske stoffer, til hjernen.
Kanyler den store sisternen (CM) ved å bruke en modifikasjon av den tidligere beskrevne metoden.Bedøvede Wistar-rotter (200-350 g) ble montert på et stereotaksisk apparat og et mediansnitt ble gjort over den barberte og aseptisk preparerte hodebunnen for å eksponere skallen.Bor to hull i området av den øvre rammen og fest festeskruene i hullene.Et ekstra hull ble boret i den laterale occipitale toppen for stereotaktisk føring av en kanyle av rustfritt stål inn i CM.Påfør tannsement rundt kanylen og fest med skruer.Etter fotoherding og sementherding ble hudsåret lukket med 4/0 supramidsutur.Riktig plassering av kanylen bekreftes av spontan lekkasje av cerebrospinalvæske (CSF).Fjern rotten fra det stereotaksiske apparatet, motta passende postoperativ behandling og smertebehandling, og la den komme seg i minst en uke til tegn på blod observeres i cerebrospinalvæsken.Wistar-rotter (Crl:WI/Han) ble oppnådd fra Charles River (Frankrike).Alle rottene ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold.Alle dyreforsøk ble godkjent av veterinærkontoret i byen Basel, Sveits, og ble utført i samsvar med dyrelisens nr. 2474 (vurdering av aktiv hjernetransport ved å måle nivåer av terapeutiske kandidater i cerebrospinalvæsken og hjernen til rotter).
Hold rotten forsiktig ved bevissthet med CM-kanylen i hånden.Fjern Datura fra kanylen og samle 10 µl spontant strømmende cerebrospinalvæske.Siden åpenheten til kanylen til slutt ble kompromittert, ble bare prøver av klare cerebrospinalvæske uten tegn på blodforurensning eller misfarging inkludert i denne studien.Parallelt ble ca. 10–20 μl blod tatt fra et lite snitt på halespissen i rør med heparin (Sigma-Aldrich).CSF og blod ble samlet på forskjellige tidspunkter etter intravenøs injeksjon av T7-fag.Omtrent 5–10 μl væske ble kastet før hver CSF-prøve ble samlet, noe som tilsvarer dødvolumet til kateteret.
Biblioteker ble generert ved å bruke T7Select 10-3b-vektoren som beskrevet i T7Select-systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kort fortalt ble et tilfeldig 12-mer DNA-innskudd syntetisert i følgende format:
NNK-kodonet ble brukt for å unngå doble stoppkodoner og aminosyreoverekspresjon i innskuddet.N er et manuelt blandet ekvimolart forhold av hvert nukleotid, og K er et manuelt blandet ekvimolart forhold mellom adenin og cytosin nukleotider.Enkeltrådede regioner ble omdannet til dobbelttrådet DNA ved ytterligere inkubering med dNTP (Novagen) og Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffer (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C.Etter reaksjonen ble dobbelttrådet DNA gjenvunnet ved EtOH-utfelling.Det resulterende DNA ble spaltet med restriksjonsenzymer EcoRI og HindIII (begge fra Roche).Det spaltede og rensede (QIAquick, Qiagen)-innskuddet (T4-ligase, New England Biolabs) ble deretter ligert i rammen inn i en forhåndsspaltet T7-vektor etter aminosyre 348 i 10B-kapsidegenet.Ligeringsreaksjoner ble inkubert ved 16°C i 18 timer før in vitro-pakking.Fagpakning in vitro ble utført i henhold til instruksjonene som fulgte med T7Select 10-3b kloningssettet (Novagen), og pakkeløsningen ble amplifisert én gang til lysis ved bruk av Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysatene ble sentrifugert, titrert og frosset ved -80°C som en stamløsning av glyserol.
Direkte PCR-amplifisering av fagvariable regioner amplifisert i buljong eller plate ved bruk av proprietære 454/Roche-amplicon-fusjonsprimere.Foroverfusjonsprimeren inneholder sekvenser som flankerer den variable regionen (NNK) 12 (malspesifikk), GS FLX Titanium Adapter A, og en fire-baser biblioteknøkkelsekvens (TCAG) (tilleggsfigur 1a):
Den omvendte fusjonsprimeren inneholder også biotin festet til fangekuler og GS FLX Titanium Adapter B som kreves for klonal amplifikasjon under emulsjons-PCR:
Amplikonene ble deretter utsatt for 454/Roche pyrosekvensering i henhold til 454 GS-FLX Titanium-protokollen.For manuell Sanger-sekvensering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ble T7 fag-DNA amplifisert ved PCR og sekvensert med følgende primerpar:
Innlegg fra individuelle plakk ble utsatt for PCR-amplifisering ved bruk av Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (i henhold til produsentens instruksjoner).Utfør en varmstart (10 min ved 95 °C) og 35 boost-sykluser (50 s ved 95 °C, 1 min ved 50 °C og 1 min ved 72 °C).
Fag fra biblioteker, villtype fag, fag reddet fra CSF og blod, eller individuelle kloner ble amplifisert i Escherichia coli BL5615 i TB-buljong (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2 skåler (Thermo Scientific) i 4 timer ved 37 °C.Fag ble ekstrahert fra platene ved å skylle platene med Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) eller ved å samle opp plakkene med sterile pipettespisser.Fag ble isolert fra kultursupernatant eller ekstraksjonsbuffer med én runde polyetylenglykol (PEG 8000) utfelling (Promega) og resuspendert i Tris-EDTA-buffer.
Den amplifiserte fagen ble utsatt for 2-3 runder med endotoksinfjerning ved bruk av endotoksinfjerningskuler (Miltenyi Biotec) før intravenøs (IV) injeksjon (500 μl/dyr).I første runde ble 2×1012 fager introdusert;i den andre, 2×1010 fager;i tredje og fjerde seleksjonsrunde, 2×109 fager per dyr.Faginnhold i CSF og blodprøver samlet på de angitte tidspunktene ble bestemt ved plakktelling i henhold til produsentens instruksjoner (T7Select system manual).Fagseleksjon ble utført ved intravenøs injeksjon av rensede biblioteker i halevenen eller ved re-injeksjon av fag ekstrahert fra CSF fra forrige seleksjonsrunde, og påfølgende høstinger ble utført ved henholdsvis 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min og 240 min blodprøver.Totalt fire runder med in vivo panorering ble utført der de to utvalgte grenene ble separat lagret og analysert i løpet av de tre første seleksjonsrundene.Alle faginnskudd ekstrahert fra CSF fra de to første seleksjonsrundene ble utsatt for 454/Roche pyrosekvensering, mens alle kloner ekstrahert fra CSF fra de to siste seleksjonsrundene ble manuelt sekvensert.Alle blodfager fra den første seleksjonsrunden ble også utsatt for 454/Roche pyrosekvensering.For injeksjon av fagkloner ble utvalgte fager amplifisert i E. coli (BL5615) på 500 cm2 plater ved 37°C i 4 timer.Individuelt selekterte og manuelt sekvenserte kloner ble propagert i TB-medium.Etter fagekstraksjon, rensing og fjerning av endotoksin (som beskrevet ovenfor), ble 2×1010 fager/dyr i 300 μl injisert intravenøst ​​i en halevene.
Forbehandling og kvalitativ filtrering av sekvensdata.Rå 454/Roche-data ble konvertert fra et binært standard strømkartformat (sff) til et Pearson human readable format (fasta) ved hjelp av leverandørprogramvare.Videre prosessering av nukleotidsekvensen ble utført ved bruk av proprietære C-programmer og skript (uutgitt programvarepakke) som beskrevet nedenfor.Analysen av primærdata inkluderer strenge flertrinns filtreringsprosedyrer.For å filtrere ut avlesninger som ikke inneholdt en gyldig 12mer-innsettings-DNA-sekvens, ble avlesningene sekvensielt justert til startetikett (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppetikett (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) og bakgrunnsinnsats (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ved bruk av den globale testen Needleman-Wunsch.justering som tillater opptil 2 inkonsekvenser per justering31.Derfor ble lesinger uten start- og stopp-tagger og lesinger som inneholder bakgrunnsinnlegg, dvs. justeringer som overskrider det tillatte antallet mismatches, fjernet fra biblioteket.Når det gjelder de resterende avlesningene, ble N-mer-DNA-sekvensen som strekker seg fra startmerket og slutter før stoppmerket fjernet fra den opprinnelige lesesekvensen og viderebehandlet (heretter referert til som "innsetting").Etter translasjon av innskuddet fjernes delen etter det første stoppkodonet ved 5'-enden av primeren fra innskuddet.I tillegg ble nukleotider som fører til ufullstendige kodoner ved 3'-enden av primeren også fjernet.For å utelukke inserts som bare inneholder bakgrunnssekvenser, ble oversatte inserts som begynner med aminosyremønsteret "PAG" også fjernet.Peptider med en post-translasjonell lengde på mindre enn 3 aminosyrer ble fjernet fra biblioteket.Til slutt fjerner du redundans i innsettingsbassenget og bestemmer frekvensen for hvert unike innlegg.Resultatene av denne analysen inkluderte en liste over nukleotidsekvenser (innskudd) og deres (lese) frekvenser (tilleggsfigurer 1c og 2).
Grupper N-mer DNA-innskudd etter sekvenslikhet: For å eliminere 454/Roche-spesifikke sekvenseringsfeil (som problemer med sekvensering av homopolymerforlengelser) og fjerne mindre viktige redundanser, sorteres tidligere filtrerte N-mer DNA-sekvensinnlegg (innsettinger) etter likhet.innsettinger (opptil 2 ikke-matchende baser tillatt) ved bruk av en iterativ algoritme definert som følger: innsettinger sorteres først etter deres frekvens (høyest til lavest), og hvis de er like, etter deres sekundære sortering etter lengde (lengste til korteste) ).Dermed definerer de hyppigste og lengste innsettingene den første "gruppen".Gruppefrekvensen er satt til nøkkelfrekvensen.Deretter ble hver gjenværende innsetting i den sorterte listen forsøkt lagt til gruppen ved parvis Needleman-Wunsch-justering.Hvis antall feiltilpasninger, innsettinger eller slettinger i en justering ikke overstiger en terskel på 2, legges en innsetting til gruppen, og den totale gruppefrekvensen økes med hvor ofte innsettingen ble lagt til.Innlegg som legges til en gruppe, merkes som brukt og ekskluderes fra videre behandling.Hvis innsettingssekvensen ikke kan legges til en allerede eksisterende gruppe, brukes innsettingssekvensen til å opprette en ny gruppe med passende innsettingsfrekvens og merkes som brukt.Iterasjonen avsluttes når hver innsettingssekvens enten har blitt brukt til å danne en ny gruppe eller kan inkluderes i en allerede eksisterende gruppe.Tross alt blir grupperte inserts bestående av nukleotider til slutt oversatt til peptidsekvenser (peptidbiblioteker).Resultatet av denne analysen er et sett med innsettinger og deres korresponderende frekvenser som utgjør antallet påfølgende avlesninger (Supplerende Fig. 2).
Motivgenerering: Basert på en liste over unike peptider ble det opprettet et bibliotek som inneholder alle mulige aminosyremønstre (aa) som vist nedenfor.Hvert mulig mønster med lengde 3 ble ekstrahert fra peptidet og dets omvendte mønster ble lagt til sammen med et felles motivbibliotek som inneholder alle mønstre (tripeptider).Biblioteker med svært repeterende motiver ble sekvensert og redundans fjernet.Deretter, for hvert tripeptid i motivbiblioteket, sjekket vi for dets tilstedeværelse i biblioteket ved hjelp av beregningsverktøy.I dette tilfellet legges frekvensen til peptidet som inneholder det funnet motivtripeptidet til og tilordnes motivet i motivbiblioteket ("antall motiver").Resultatet av motivgenerering er en todimensjonal matrise som inneholder alle forekomster av tripeptider (motiver) og deres respektive verdier, som er antall sekvenseringslesninger som resulterer i det tilsvarende motivet når avlesningene filtreres, grupperes og oversettes.Beregninger som beskrevet i detalj ovenfor.
Normalisering av antall motiver og tilsvarende spredningsplott: Antall motiver for hver prøve ble normalisert vha.
hvor ni er antall lesninger som inneholder emne i.Således representerer vi den prosentvise frekvensen av avlesninger (eller peptider) som inneholder motiv i i prøven.P-verdier for det ikke-normaliserte antallet motiver ble beregnet ved å bruke Fishers eksakte test.Når det gjelder korrelogrammer av antall motiver, ble Spearmans korrelasjoner beregnet ved å bruke det normaliserte antallet motiver med R.
For å visualisere innholdet av aminosyrer i hver posisjon i peptidbiblioteket, ble weblogogrammer 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) laget.Først lagres innholdet av aminosyrer i hver posisjon av 12-mer peptidet i en 20×12 matrise.Deretter genereres et sett med 1000 peptider som inneholder det samme relative aminosyreinnholdet i hver posisjon i fasta-sekvensformat og leveres som input til weblogo 3, som genererer en grafisk representasjon av det relative aminosyreinnholdet i hver posisjon.for et gitt peptidbibliotek.For å visualisere flerdimensjonale datasett ble varmekart laget ved hjelp av et internt utviklet verktøy i R (biosHeatmap, en R-pakke som ennå ikke er utgitt).Dendrogrammene presentert i varmekartene ble beregnet ved å bruke Wards hierarkiske klyngemetode med den euklidiske avstandsmetrikken.For statistisk analyse av motivscoringsdata ble P-verdier for unormalisert skåring beregnet ved å bruke Fishers eksakte test.P-verdier for andre datasett ble beregnet i R ved hjelp av Students t-test eller ANOVA.
Utvalgte fagkloner og fager uten innlegg ble injisert intravenøst ​​via halevenen (2×1010 fager/dyr i 300 μl PBS).Ti minutter før perfusjon og påfølgende fiksering ble de samme dyrene injisert intravenøst ​​med 100 μl DyLight594-merket lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutter etter faginjeksjon ble rottene perfusert gjennom hjertet med 50 ml PBS etterfulgt av 50 ml 4% PFA/PBS.Hjerneprøver ble i tillegg fiksert over natten i 4 % PFA/PBS og bløtlagt i 30 % sukrose over natten ved 4 °C.Prøver er hurtigfryst i OCT-blandingen.Immunhistokjemisk analyse av frosne prøver ble utført ved romtemperatur på 30 µm kryosnitt blokkert med 1 % BSA og inkubert med polyklonale FITC-merkede antistoffer mot T7-fag (Novus NB 600-376A) ved 4 °C.Inkuber over natten.Til slutt ble snittene vasket 3 ganger med PBS og undersøkt med et konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alle peptider med en minimumsrenhet på 98 % ble syntetisert av GenScript USA, biotinylert og lyofilisert.Biotin er bundet via en ekstra trippel glycin spacer ved N-terminalen.Sjekk alle peptider ved hjelp av massespektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) ble blandet med et 5 ganger ekvimolart overskudd av biotinylert peptid, biotinylert BACE1-hemmende peptid, eller en kombinasjon (3:1-forhold) av biotinylert BACE1-hemmende peptid og BACE1-hemmende peptid i DMSOBS/10 %-kubert peptid.1 time ved romtemperatur før injeksjon.Streptavidin-konjugerte peptider ble injisert intravenøst ​​i en dose på 10 mg/kg i en av halevenene til rotter med et cerebralt hulrom.
Konsentrasjonen av streptavidin-peptidkomplekser ble vurdert ved ELISA.Nunc Maxisorp mikrotiterplater (Sigma) ble belagt over natten ved 4°C med 1,5 μg/ml muse-anti-streptavidin-antistoff (Thermo, MA1-20011).Etter blokkering (blokkeringsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatin, 1 % BSA) ved romtemperatur i 2 timer, vask platen med 0,05 % Tween-20/PBS (vaskebuffer) i 3 sekunder, ble CSF og brønnbuffer fortynnet 0ma tilsatt CSF og brønnbuffer 0ma (0ma fortynnet) SF 1:115).Platen ble deretter inkubert over natten ved 4°C med deteksjonsantistoff (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Etter tre vasketrinn ble streptavidin påvist ved inkubering i TMB-substratløsning (Roche) i opptil 20 minutter.Etter å ha stoppet fargeutviklingen med 1M H2SO4, mål absorbansen ved 450 nm.
Funksjonen til streptavidin-peptid-BACE1-hemmerkomplekset ble vurdert ved Aβ(1-40) ELISA i henhold til produsentens protokoll (Wako, 294-64701).Kort fortalt ble CSF-prøver fortynnet i standard fortynningsmiddel (1:23) og inkubert over natten ved 4°C i 96-brønners plater belagt med BNT77-fangstantistoff.Etter fem vasketrinn ble HRP-konjugert BA27-antistoff tilsatt og inkubert i 2 timer ved 4°C, etterfulgt av fem vasketrinn.Aβ(1–40) ble påvist ved inkubering i TMB-løsning i 30 minutter ved romtemperatur.Etter at fargeutviklingen er stoppet med stoppløsning, mål absorbansen ved 450 nm.Plasmaprøver ble utsatt for fastfaseekstraksjon før Aβ(1–40) ELISA.Plasma ble tilsatt til 0,2 % DEA (Sigma) i 96-brønners plater og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter.Etter suksessiv vask av SPE-platene (Oasis, 186000679) med vann og 100 % metanol, ble plasmaprøver tilsatt SPE-platene og all væske ble fjernet.Prøver ble vasket (først med 5 % metanol og deretter 30 % metanol) og eluert med 2 % NH4OH/90 % metanol.Etter tørking av eluatet ved 55 °C i 99 minutter ved konstant N2-strøm, ble prøvene redusert i standard fortynningsmidler og Aβ(1–40) ble målt som beskrevet ovenfor.
Hvordan sitere denne artikkelen: Urich, E. et al.Lastlevering til hjernen ved bruk av transittpeptider identifisert in vivo.vitenskapen.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Levering av makromolekylære legemidler til hjernen ved bruk av målrettet terapi.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., og Martinez-Martinez, P. Levering av peptid- og proteinmedisiner over blod-hjerne-barrieren.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjerne-barrieren: en flaskehals i utviklingen av hjernemedisin.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG og Byrd, A. Utsikter for forbedret medikamentlevering og målretting til hjernen via choroid plexus-CSF-banen.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering av biofarmasøytika med molekylære trojanske hester for hjernelevering.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor-mediert peptidtransport over blod-hjerne-barrieren.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Øk hjernepenetrasjon og effektiviteten til terapeutiske antistoffer ved å bruke monovalente molekylære skyttler.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrinreseptor (TfR) transport bestemmer hjerneopptaket av affinitetsvarianter av TfR-antistoffer.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).