Noen LC-feilsøkingsemner er aldri utdaterte, ettersom det er problemer i LC-praksis, selv om instrumentteknologien forbedres over tid. Det er mange måter problemer kan oppstå i et LC-system og ende opp i dårlig toppform. Når problemer relatert til toppform oppstår, hjelper en kort liste over mulige årsaker til disse resultatene å forenkle vår feilsøkingsopplevelse.
Det har vært morsomt å skrive denne "LC Troubleshooting"-spalten og tenke på emner hver måned, fordi noen emner aldri går av moten. Mens innen kromatografiforskning blir visse emner eller ideer foreldet ettersom de blir erstattet av nyere og bedre ideer, innen feilsøking, siden den første feilsøkingsartikkelen i LC Journal på tidspunktet dukket fortsatt opp i denne journalen (1) 983(1).I løpet av de siste årene har jeg fokusert flere LC-feilsøkingsseksjoner på moderne trender som påvirker væskekromatografi (LC) (for eksempel den relative sammenligningen av vår forståelse av effekten av trykk på retensjon [2] Nye fremskritt) Vår tolkning av LC-resultater og hvordan feilsøke med moderne LC-instrumenter som startet i denne måneden,'20m, som startet med moderne LC-instrumenter i desember1'20. , som fokuserte på noen av "liv og død"-emner for LC-feilsøking - elementer som er gode for enhver feilsøking er avgjørende, uansett alder på systemet vi bruker. Kjerneemnet i denne serien er svært relevant for LCGCs berømte "LC Troubleshooting Guide"-veggkart (4) som henger i mange laboratorier relatert til denne serien, for den tredje delen av karakteristikken, eller den tredje delen av karakteristikken. bly, veggdiagrammet viser 44 forskjellige potensielle årsaker til dårlig toppform! Vi kan ikke vurdere alle disse problemene i detalj i én artikkel, så i denne første delen om emnet vil jeg fokusere på noen av de jeg ser oftest. Jeg håper unge og gamle LC-brukere vil finne noen nyttige tips og påminnelser om dette viktige emnet.
Jeg finner meg selv i økende grad svare på feilsøkingsspørsmål med "alt er mulig". Dette svaret kan virke enkelt når jeg vurderer observasjoner som er vanskelige å tolke, men jeg finner det ofte hensiktsmessig. Med mange mulige årsaker til dårlig toppform er det viktig å ha et åpent sinn når man vurderer hva problemet kan være, og for å kunne prioritere potensielle årsaker for å begynne vår feilsøkingsarbeid, fokus på de mest vanlige mulighetene.
Et nøkkeltrinn i enhver feilsøkingsøvelse – men en som jeg tror er undervurdert – er å erkjenne at det er et problem som må løses. Å erkjenne at det er et problem betyr ofte å erkjenne at det som skjer med verktøyet er forskjellig fra våre forventninger, som er formet av teori, empirisk kunnskap og erfaring (5). "Toppformen" refererer ikke bare til toppen, ikke bare flommetrisk, her refererer til symmetrisk. y, forkant, tailing, etc.), men også til bredden.Våre forventninger til faktisk toppform er enkle.Teori (6) støtter godt lærebokens forventning om at de kromatografiske toppene i de fleste tilfeller skal være symmetriske og samsvare med formen til en gaussisk distribusjon, som vist i figur 1a.Det vi forventer av en mer kompleks artikkel i denne peakwidth-artikkelen, og vi vil diskutere i en annen peakwidth-artikkel. s i figur 1 viser noen av de andre mulighetene som kan observeres – med andre ord, noen av måtene ting kan gå galt på. I resten av denne delen vil vi bruke tid på å diskutere noen spesifikke eksempler på situasjoner som kan føre til disse formtypene.
Noen ganger observeres ikke topper i det hele tatt i kromatogrammet der de forventes å bli eluert. Veggdiagrammet ovenfor indikerer at fraværet av en topp (forutsatt at prøven faktisk inneholder målanalytten i en konsentrasjon som burde gjøre detektorresponsen tilstrekkelig til å se den over støyen) vanligvis er relatert til et instrumentproblem eller feilaktige mobilfaseforhold (hvis det observeres under alle forhold).topper, vanligvis for "svake"). En kort liste over potensielle problemer og løsninger i denne kategorien finnes i tabell I.
Som nevnt ovenfor, er spørsmålet om hvor mye topputvidelse som bør tolereres før man tar hensyn og prøver å fikse det et komplekst tema som jeg vil diskutere i en fremtidig artikkel. Min erfaring er at betydelig topputvidelse ofte er ledsaget av en betydelig endring i toppform, og topphaling er mer vanlig enn pre-peak eller splitting.
Hver av disse problemene har blitt diskutert i detalj i tidligere utgaver av Troubleshooting LC, og lesere som er interessert i disse emnene kan henvise til disse tidligere artiklene for informasjon om de grunnleggende årsakene og potensielle løsninger på disse problemene.Mer informasjon.
Peak tailing, peak fronting og splitting kan alle være forårsaket av kjemiske eller fysiske fenomener, og listen over potensielle løsninger på disse problemene varierer mye, avhengig av om vi har å gjøre med et kjemisk eller fysisk problem. Ofte, ved å sammenligne de forskjellige toppene i et kromatogram, kan du finne viktige ledetråder om hvilken som er årsaken til alle toppene som er mest sannsynlige. fysisk. Hvis bare én eller noen få topper er påvirket, men resten ser bra ut, er årsaken mest sannsynlig kjemisk.
De kjemiske årsakene til peak tailing er for komplekse til å diskutere kort her. Den interesserte leser henvises til den nylige utgaven av "LC Troubleshooting" for en mer dyptgående diskusjon (10). En enkel ting å prøve er imidlertid å redusere massen til den injiserte analytten og se om toppformen forbedres. I så fall er dette en god pekepinn på at "analysen i forhold til massen må være begrenset til massen". , eller de kromatografiske forholdene må endres slik at gode toppformer kan oppnås selv med større masser injisert.
Det er også mange potensielle fysiske årsaker til peak tailing.Lesere som er interessert i en detaljert diskusjon av mulighetene henvises til en annen fersk utgave av "LC Troubleshooting" (11). En av de mer vanlige fysiske årsakene til peak tailing er en dårlig forbindelse på et punkt mellom injektoren og detektoren (12). Et ekstremt eksempel er vist i figur 1d. ve som vi ikke hadde brukt før, og installerte en injeksjonssløyfe med lite volum med en hylse som var støpt inn på en kapillær av rustfritt stål. Etter noen innledende feilsøkingseksperimenter innså vi at portdybden i injeksjonsventilstatoren var mye dypere enn vi var vant til, noe som resulterte i et stort dødvolum i bunnen av porten, dette problemet kan enkelt løses med en annen sløyfe. til riktig posisjon for å eliminere dødvolumet i bunnen av porten.
Toppfronter som de som er vist i figur 1e kan også være forårsaket av fysiske eller kjemiske problemer. En vanlig fysisk årsak til forkanten er at partikkelsjiktet til kolonnen ikke er godt pakket, eller at partiklene har omorganisert seg over tid. Som med toppavgang forårsaket av dette fysiske fenomenet, er den beste måten å fikse dette på å erstatte søylen og fortsette å gå med en kjemisk opprinnelse. tensjonsforhold.Under ideelle (lineære) forhold er mengden analytt som holdes tilbake av den stasjonære fasen (derav retensjonsfaktoren) lineært relatert til konsentrasjonen av analytten i kolonnen. Kromatografisk betyr dette at når massen av analytt som injiseres i kolonnen øker, blir toppen høyere, men ikke bredere. Dette forholdet brytes den ikke-lineære oppførselen, men ikke bare blir bredere, men ikke bredere, men også bredere. ed.I tillegg bestemmer ikke-lineære former formen på kromatografiske topper, noe som resulterer i ledende eller bakre kanter. Som med masseoverbelastning som forårsaker peak tailing (10), kan peak-leading forårsaket av ikke-lineær retensjon også diagnostiseres ved å redusere den injiserte analyttmassen. Hvis toppformen forbedres, må metoden ikke overskride den ledende kanten til å modifiseres til min. etterligne denne oppførselen.
Noen ganger observerer vi det som ser ut til å være en "delt" topp, som vist i figur 1f. Det første trinnet i å løse dette problemet er å finne ut om toppformen skyldes delvis ko-eluering (dvs. tilstedeværelsen av to distinkte, men tett eluerende forbindelser). Hvis det faktisk er to forskjellige analytter som eluerer tett sammen, så er det en seleksjon, reduksjon, eller for eksempel deres oppløsning, eller for eksempel en plate. og de tilsynelatende "delte" toppene er relatert til fysisk Ytelse har ingenting å gjøre med selve kolonnen.Ofte er den viktigste ledetråden til denne avgjørelsen om alle toppene i kromatogrammet viser delte former, eller bare en eller to. Hvis det bare er en eller to, er det sannsynligvis et problem med samtidig eluering;hvis alle toppene er delt, er det sannsynligvis et fysisk problem, mest sannsynlig relatert til selve kolonnen.
Splittede topper relatert til de fysiske egenskapene til selve kolonnen skyldes vanligvis delvis blokkerte innløps- eller utløpsfritter, eller reorganisering av partikler i kolonnen, slik at den mobile fasen kan strømme raskere enn den mobile fasen i visse områder av kolonnekanalformasjonen .i andre regioner (11).Delvis tilstoppet fritte kan noen ganger fjernes ved å reversere strømmen gjennom kolonnen;Men etter min erfaring er dette vanligvis en kortsiktig snarere enn en langsiktig løsning. Dette er ofte fatalt med moderne kolonner hvis partiklene rekombinerer i kolonnen. På dette tidspunktet er det best å erstatte kolonnen og fortsette.
Toppen i figur 1g, også fra et nylig tilfelle i mitt eget laboratorium, indikerer vanligvis at signalet er så høyt at det har nådd den høye enden av responsområdet. For optiske absorbansdetektorer (UV-vis i dette tilfellet), når analyttkonsentrasjonen er svært høy, absorberer analytten mesteparten av lyset som passerer gjennom detektorstrømningscellen, og etterlater svært lite lys under disse forholdene som kan detekteres av forskjellige betingelser. kilder til støy, slik som støyende lys og "mørk strøm", noe som gjør signalet svært "uklar" i utseende og uavhengig av analyttkonsentrasjon.Når dette skjer, kan problemet ofte enkelt løses ved å redusere injeksjonsvolumet til analytten – redusere injeksjonsvolumet, fortynne prøven eller begge deler.
I kromatografisk skole bruker vi detektorsignalet (dvs. y-aksen i kromatogrammet) som en indikator på analyttkonsentrasjonen i prøven. Så det virker rart å se et kromatogram med et signal under null, ettersom den enkle tolkningen er at dette indikerer en negativ analytkonsentrasjon-som bruker fysisk mulig.
I dette tilfellet betyr en negativ topp ganske enkelt at molekylene som elueres fra kolonnen absorberer mindre lys enn selve den mobile fasen rett før og etter toppen. Dette kan for eksempel oppstå ved bruk av relativt lave deteksjonsbølgelengder (<230 nm) og mobilfase-tilsetningsstoffer som absorberer mesteparten av lyset ved disse bølgelengdene. Slike tilsetningsstoffer kan for eksempel være mobile fase-acetat-komponenter eller negative acetat-komponenter, som for eksempel en negativ acetat-komponent eller buffer. s å utarbeide en kalibreringskurve og få nøyaktig kvantitativ informasjon, så det er ingen grunnleggende grunn til å unngå dem i seg selv (denne metoden blir noen ganger referert til som "indirekte UV-deteksjon") (13). Men hvis vi virkelig ønsker å unngå negative topper totalt, i tilfelle av absorbansdeteksjon, er den beste løsningen å bruke en annen deteksjonsbølgelengde, slik at den mobile fasen av analyttene absorberer mindre enn den mobile fasen av analyttene absorberer eller endrer lyset til lyset. .
Negative topper kan også vises ved bruk av brytningsindeks (RI)-deteksjon når brytningsindeksen til andre komponenter enn analytten i prøven, slik som løsningsmiddelmatrisen, er forskjellig fra brytningsindeksen til den mobile fasen. Dette skjer også med UV-vis-deteksjon, men denne effekten har en tendens til å bli dempet i forhold til RI-deteksjonen. mobil fase.
I del tre om det grunnleggende temaet LC-feilsøking diskuterte jeg situasjoner der den observerte toppformen er forskjellig fra den forventede eller normale toppformen.Effektiv feilsøking av slike problemer begynner med kunnskap om forventede toppformer (basert på teori eller tidligere erfaring med eksisterende metoder), så avvik fra disse forventningene er åpenbare.I denne potensielle, potensielle haleproblemer har jeg også mange forskjellige, etc.). i detalj noen av årsakene jeg ser oftest. Å kjenne til disse detaljene gir et godt sted å starte feilsøking, men fanger ikke opp alle muligheter.Lesere som er interessert i en mer detaljert liste over årsaker og løsninger kan referere til LCGC “LC Troubleshooting Guide” veggskjema.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” veggdiagram.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.