Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Flytende biopsi (LB) er et konsept som raskt øker i popularitet innen det biomedisinske feltet.Konseptet er hovedsakelig basert på påvisning av fragmenter av sirkulerende ekstracellulært DNA (ccfDNA), som hovedsakelig frigjøres som små fragmenter etter celledød i ulike vev.En liten andel av disse fragmentene stammer fra fremmede (fremmede) vev eller organismer.I dagens arbeid har vi brukt dette konseptet på blåskjell, en vaktholdsart kjent for sin høye filtreringskapasitet for sjøvann.Vi bruker blåskjells evne til å fungere som naturlige filtre for å fange opp miljømessige DNA-fragmenter fra en rekke kilder for å gi informasjon om det biologiske mangfoldet i marine kystøkosystemer.Våre resultater viser at blåskjellhemolymfe inneholder DNA-fragmenter som varierer mye i størrelse, fra 1 til 5 kb.Haglesekvensering viste at et stort antall DNA-fragmenter er av fremmed mikrobiell opprinnelse.Blant dem fant vi DNA-fragmenter fra bakterier, archaea og virus, inkludert virus som er kjent for å infisere en rekke verter som vanligvis finnes i kystnære marine økosystemer.Avslutningsvis viser vår studie at konseptet LB brukt på blåskjell representerer en rik, men ennå uutforsket kilde til kunnskap om mikrobielt mangfold i marine kystøkosystemer.
Virkningen av klimaendringer (CC) på det biologiske mangfoldet i marine økosystemer er et raskt voksende forskningsområde.Global oppvarming forårsaker ikke bare viktige fysiologiske påkjenninger, men presser også de evolusjonære grensene for den termiske stabiliteten til marine organismer, og påvirker habitatet til en rekke arter, og får dem til å søke etter mer gunstige forhold [1, 2].I tillegg til å påvirke biodiversiteten til metazoer, forstyrrer CC den delikate balansen mellom vert-mikrobielle interaksjoner.Denne mikrobielle dysbakteriose utgjør en alvorlig trussel mot marine økosystemer siden den gjør marine organismer mer utsatt for smittsomme patogener [3, 4].Det antas at SS spiller en viktig rolle i massedødsfall, som er et alvorlig problem for forvaltningen av globale marine økosystemer [5, 6].Dette er en viktig sak gitt de økonomiske, økologiske og ernæringsmessige konsekvensene av mange marine arter.Dette gjelder spesielt for muslinger som lever i polarområdene, hvor effektene av CK er mer umiddelbare og alvorlige [6, 7].Faktisk skal muslinger som Mytilus spp.brukes mye for å overvåke effekten av CC på marine økosystemer.Ikke overraskende har et relativt stort antall biomarkører blitt utviklet for å overvåke helsen deres, ofte ved bruk av en to-lags tilnærming som involverer funksjonelle biomarkører basert på enzymatisk aktivitet eller cellulære funksjoner som cellelevedyktighet og fagocytisk aktivitet [8].Disse metodene inkluderer også måling av konsentrasjonen av spesifikke trykkindikatorer som akkumuleres i bløtvev etter absorpsjon av store mengder sjøvann.Imidlertid gir den høye filtreringskapasiteten og det halvåpne sirkulasjonssystemet til muslinger en mulighet til å utvikle nye hemolymfebiomarkører ved å bruke konseptet flytende biopsi (LB), en enkel og minimalt invasiv tilnærming til pasientbehandling.blodprøver [9, 10].Selv om flere typer sirkulerende molekyler kan finnes i humant LB, er dette konseptet først og fremst basert på DNA-sekvenseringsanalyse av sirkulerende ekstracellulære DNA (ccfDNA) fragmenter i plasma.Faktisk har tilstedeværelsen av sirkulerende DNA i humant plasma vært kjent siden midten av 1900-tallet [11], men det er først de siste årene at fremkomsten av high-throughput sekvenseringsmetoder har ført til klinisk diagnose basert på ccfDNA.Tilstedeværelsen av disse sirkulerende DNA-fragmentene skyldes delvis passiv frigjøring av genomisk DNA (kjerne- og mitokondrie) etter celledød. Hos friske individer er konsentrasjonen av ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan økes med 5–10 ganger hos pasienter som lider av ulike patologier eller er utsatt for stress, noe som resulterer i vevsskade. Hos friske individer er konsentrasjonen av ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan økes med 5–10 ganger hos pasienter som lider av ulike patologier eller er utsatt for stress, noe som resulterer i vevsskade. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), ikke может повышаться в 5–10 mellom 5–10 p. логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos friske mennesker er konsentrasjonen av cccDNA normalt lav (<10 ng/mL), men den kan øke med 5–10 ganger hos pasienter med ulike patologier eller under stress som fører til vevsskade.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理戅嚏嚏嚏嚗嚏嚏嚏加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 扅理 刖 手可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 распаци. логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsentrasjoner er vanligvis lave (<10 ng/ml) hos friske individer, men kan økes 5-10 ganger hos pasienter med ulike patologier eller stress, noe som resulterer i vevsskade.Størrelsen på ccfDNA-fragmenter varierer mye, men varierer vanligvis fra 150 til 200 bp.[12].Analyse av selvavledet ccfDNA, dvs. ccfDNA fra normale eller transformerte vertsceller, kan brukes til å oppdage genetiske og epigenetiske endringer som er tilstede i det kjernefysiske og/eller mitokondrielle genomet, og derved hjelpe klinikere med å velge spesifikke molekylærmålrettede terapier [13].Imidlertid kan ccfDNA fås fra fremmede kilder som ccfDNA fra fosterceller under graviditet eller fra transplanterte organer [14,15,16,17].ccfDNA er også en viktig informasjonskilde for å oppdage tilstedeværelsen av nukleinsyrer av et smittestoff (fremmed), som tillater ikke-invasiv påvisning av utbredte infeksjoner som ikke er identifisert av blodkulturer, og unngår invasiv biopsi av infisert vev [18].Nyere studier har faktisk vist at menneskelig blod inneholder en rik kilde av informasjon som kan brukes til å identifisere virale og bakterielle patogener, og at omtrent 1 % av ccfDNA som finnes i humant plasma er av utenlandsk opprinnelse [19].Disse studiene viser at biodiversiteten til en organismes sirkulerende mikrobiom kan vurderes ved hjelp av ccfDNA-analyse.Men inntil nylig ble dette konseptet utelukkende brukt hos mennesker og, i mindre grad, hos andre virveldyr [20, 21].
I denne artikkelen bruker vi LB-potensialet til å analysere ccfDNA til Aulacomya atra, en sørlig art som vanligvis finnes på de subantarktiske Kerguelen-øyene, en gruppe øyer på toppen av et stort platå som ble dannet for 35 millioner år siden.vulkanutbrudd.Ved hjelp av et in vitro eksperimentelt system fant vi at DNA-fragmenter i sjøvann raskt tas opp av blåskjell og kommer inn i hemolymfe-rommet.Haglesekvensering har vist at blåskjellhemolymfe ccfDNA inneholder DNA-fragmenter av sin egen og ikke-selv-opprinnelse, inkludert symbiotiske bakterier og DNA-fragmenter fra biomer som er typiske for kalde vulkanske marine kystøkosystemer.Hemolymph ccfDNA inneholder også virale sekvenser avledet fra virus med forskjellige vertsområder.Vi fant også DNA-fragmenter fra flercellede dyr som benfisk, sjøanemoner, alger og insekter.Avslutningsvis viser vår studie at LB-konseptet med hell kan brukes på marine virvelløse dyr for å generere et rikt genomisk repertoar i marine økosystemer.
Voksne (55-70 mm lange) Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) ble samlet fra de steinete kystområdene i Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kerguelen-øyene i desember 2018. Andre voksne blåskjell (Mytilus spp.) ble hentet fra en kommersiell leverandør (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) og plassert i en temperaturkontrollert (4°C) luftet tank som inneholdt 10–20 L 32‰ kunstig saltlake.(kunstig havsalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).For hvert eksperiment ble lengden og vekten av individuelle skjell målt.
En gratis åpen tilgangsprotokoll for dette programmet er tilgjengelig online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kort fortalt ble LB-hemolymfe samlet fra abduktormuskler som beskrevet [22].Hemolymfen ble klaret ved sentrifugering ved 1200 xg i 3 minutter, supernatanten ble frosset (-20°C) inntil bruk.For isolering og rensing av cfDNA ble prøver (1,5-2,0 ml) tint og behandlet ved bruk av NucleoSnap cfDNA-settet (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) i henhold til produsentens instruksjoner.ccfDNA ble lagret ved -80°C inntil videre analyse.I noen eksperimenter ble ccfDNA isolert og renset ved bruk av QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Renset DNA ble kvantifisert ved å bruke en standard PicoGreen-analyse.Fragmentfordelingen til det isolerte ccfDNA ble analysert ved kapillærelektroforese ved bruk av en Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ved bruk av et High Sensitivity DNA Kit.Analysen ble utført ved bruk av 1 ul av ccfDNA-prøven i henhold til produsentens instruksjoner.
For sekvensering av hemolymfe ccfDNA-fragmenter forberedte Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) haglebiblioteker ved å bruke Illumina DNA Mix-settet til Illumina MiSeq PE75-settet.En standard adapter (BioO) ble brukt.Rådatafiler er tilgjengelige fra NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809).Grunnleggende lesekvalitet ble vurdert ved hjelp av FastQC [23].Trimmomatic [24] har blitt brukt til klippeadaptere og avlesninger av dårlig kvalitet.Hagleavlesninger med parede ender ble FLASH slått sammen til lengre enkeltavlesninger med en minimumsoverlapping på 20 bp for å unngå uoverensstemmelser [25]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av en toskallet NCBI Taxonomy-database (e-verdi < 1e−3 og 90% homologi), og maskering av lavkompleksitetssekvenser ble utført ved bruk av DUST [26]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av en toskallet NCBI Taxonomy-database (e-verdi < 1e−3 og 90% homologi), og maskering av lavkompleksitetssekvenser ble utført ved bruk av DUST [26]. (Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорче 1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av NCBI toskallet taksonomidatabase (e-verdi < 1e-3 og 90 % homologi), og sekvensmaskering med lav kompleksitet ble utført ved bruk av DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的缿唌DUST 6低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輿濹 2 读濹 ]行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двиNCов ( е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использов [26]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av NCBI toskallet taksonomisk database (e-verdi <1e-3 og 90 % homologi), og sekvensmaskering med lav kompleksitet ble utført ved bruk av DUST [26].Lesninger ble delt inn i to grupper: relatert til muslingesekvenser (her kalt selvlesninger) og urelaterte (ikke-selvlesninger).To grupper ble satt sammen separat ved å bruke MEGAHIT for å generere contigs [27].I mellomtiden ble den taksonomiske distribusjonen av fremmede mikrobiomlesninger klassifisert ved bruk av Kraken2 [28] og grafisk representert ved et Krona-kakediagram på Galaxy [29, 30].De optimale kmers ble bestemt til å være kmers-59 fra våre foreløpige eksperimenter. Selvkontiger ble deretter identifisert ved justering med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-verdi <1e−10 og 60% homologi) for en endelig merknad. Selvkontiger ble deretter identifisert ved justering med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-verdi <1e−10 og 60% homologi) for en endelig merknad. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатированы с BLASTN) и гомология 60%) for окончательной аннотации. Self-contigs ble deretter identifisert ved å matche mot BLASTN (NCBI toskallet database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi) for endelig merknad.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐齐饿识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BiNC х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Selvkontiger ble deretter identifisert for endelig merknad ved å matche mot BLASTN (NCBI toskallet database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi). Parallelt ble ikke-selv-gruppe-kontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi <1e−10 og 60% homologi). Parallelt ble ikke-selv-gruppe-kontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi <1e−10 og 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (på grunn av NCBI, md <10 %). Parallelt ble utenlandske gruppekontiger annotert med BLASTN (NT NCBI-database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (e. 1. 1. 1. 2010) og гомология 60 %). Parallelt ble ikke-selv-gruppe-kontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi). BLASTX ble også utført på ikke-selv-kontiger ved bruk av nr- og RefSeq-protein NCBI-databasene (e-verdi <1e−10 og 60% homologi). BLASTX ble også utført på ikke-selv-kontiger ved bruk av nr- og RefSeq-protein NCBI-databasene (e-verdi <1e−10 og 60% homologi). BLASTX er tilgjengelig på несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr. и RefSeq NCBI (f. 6. 0. 0. 1. juni %). BLASTX ble også utført på ikke-selv-kontiger ved bruk av nr- og RefSeq NCBI-proteindatabasene (e-verdi < 1e-10 og 60 % homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 Blastx тже выолняли на несамостоятелных контигах с и и и с с с с с с с с с с с и с с с с с с с с с с с с и и и и и и и и и и с с с с с с с и с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с. . BLASTX ble også utført på ikke-selv-kontiger ved bruk av nr og RefSeq NCBI proteindatabaser (e-verdi <1e-10 og 60 % homologi).BLASTN- og BLASTX-poolene av ikke-selv-kontiger representerer de endelige contigs (se tilleggsfil).
Primerne som brukes til PCR er oppført i tabell S1.Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ble brukt til å forsterke ccfDNA-målgenene.Følgende reaksjonsbetingelser ble brukt: denaturering ved 95°C i 3 minutter, 95°C i 1 minutt, innstilt annealingstemperatur i 1 minutt, forlengelse ved 72°C i 1 minutt, 35 sykluser og til slutt 72°C innen 10 minutter..PCR-produkter ble separert ved elektroforese i agarosegeler (1,5%) som inneholdt SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ved 95 V.
Blåskjell (Mytilus spp.) ble akklimatisert i 500 ml oksygenert sjøvann (32 PSU) i 24 timer ved 4°C.Plasmid-DNA inneholdende et innskudd som koder for den humane galectin-7-cDNA-sekvensen (NCBI-aksessnummer L07769) ble tilsatt hetteglasset i en sluttkonsentrasjon på 190 μg/μl.Blåskjell inkubert under de samme betingelser uten DNA-tilsetning var kontroll.Den tredje kontrolltanken inneholdt DNA uten blåskjell.For å overvåke kvaliteten på DNA i sjøvann ble det tatt sjøvannsprøver (20 μl; tre repetisjoner) fra hver tank på angitt tidspunkt.For plasmid-DNA-sporbarhet ble LB-muslinger høstet på de angitte tidspunktene og analysert med qPCR og ddPCR.På grunn av det høye saltinnholdet i sjøvann ble alikvoter fortynnet i PCR-kvalitetsvann (1:10) før alle PCR-analyser.
Digital droplet PCR (ddPCR) ble utført ved bruk av BioRad QX200-protokollen (Mississauga, Ontario, Canada).Bruk temperaturprofilen for å bestemme den optimale temperaturen (tabell S1).Dråper ble generert ved hjelp av en QX200 dråpegenerator (BioRad).ddPCR ble utført som følger: 95°C i 5 minutter, 50 sykluser på 95°C i 30 s og en gitt annealingstemperatur i 1 min og 72°C i 30 s, 4°C i 5 minutter og 90°C innen 5 minutter.Antall dråper og positive reaksjoner (antall kopier/µl) ble målt med en QX200 dråpeleser (BioRad).Prøver med mindre enn 10 000 dråper ble avvist.Mønsterkontroll ble ikke utført hver gang ddPCR ble kjørt.
qPCR ble utført ved bruk av Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) og LGALS7 spesifikke primere.Alle kvantitative PCRer ble utført i 20 µl ved bruk av QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR ble startet med en 15 minutters inkubering ved 95 °C etterfulgt av 40 sykluser ved 95 °C i 10 sekunder og ved 60 °C i 60 sekunder med én datainnsamling.Smeltekurver ble generert ved bruk av suksessive målinger ved 95 °C i 5 s, 65 °C i 60 s og 97 °C ved slutten av qPCR.Hver qPCR ble utført i tre eksemplarer, bortsett fra kontrollprøver.
Siden blåskjell er kjent for sin høye filtreringshastighet, undersøkte vi først om de kunne filtrere og beholde DNA-fragmenter som finnes i sjøvann.Vi var også interessert i om disse fragmentene akkumuleres i deres halvåpne lymfesystem.Vi løste dette problemet eksperimentelt ved å spore skjebnen til løselige DNA-fragmenter lagt til blåskjelltanker.For å lette sporing av DNA-fragmenter brukte vi fremmed (ikke selv) plasmid-DNA som inneholder det humane galectin-7-genet.ddPCR sporer plasmid-DNA-fragmenter i sjøvann og blåskjell.Våre resultater viser at dersom mengden av DNA-fragmenter i sjøvann holdt seg relativt konstant over tid (opptil 7 dager) i fravær av blåskjell, så forsvant dette nivået i nærvær av blåskjell nesten helt i løpet av 8 timer (fig. 1a,b).Fragmenter av eksogent DNA ble lett oppdaget innen 15 minutter i intravalvulær væske og hemolymfe (fig. 1c).Disse fragmentene kunne fortsatt oppdages opptil 4 timer etter eksponering.Denne filtreringsaktiviteten med hensyn til DNA-fragmenter er sammenlignbar med filtreringsaktiviteten til bakterier og alger [31].Disse resultatene tyder på at blåskjell kan filtrere og samle fremmed DNA i væskerommene.
Relative konsentrasjoner av plasmid-DNA i sjøvann i nærvær (A) eller fravær (B) av blåskjell, målt ved ddPCR.I A er resultatene uttrykt som prosenter, med kantene til boksene som representerer 75. og 25. persentil.Den tilpassede logaritmiske kurven vises i rødt, og området som er skyggelagt i grått representerer 95 % konfidensintervall.I B representerer den røde linjen gjennomsnittet og den blå linjen representerer 95 % konfidensintervall for konsentrasjonen.C Akkumulering av plasmid-DNA i blåskjells hemolymfe og klaffevæske til ulike tidspunkt etter tilsetning av plasmid-DNA.Resultatene presenteres som absolutte kopier påvist/ml (±SE).
Deretter undersøkte vi opprinnelsen til ccfDNA i blåskjell samlet inn fra blåskjellsenger på Kerguelen-øyene, en avsidesliggende gruppe øyer med begrenset menneskeskapt påvirkning.For dette formålet ble cccDNA fra blåskjellhemolymfer isolert og renset ved metoder som vanligvis brukes for å rense humant cccDNA [32, 33].Vi fant at gjennomsnittlige hemolymfe ccfDNA-konsentrasjoner i blåskjell er i det lave mikrogram per ml hemolymfe-området (se tabell S2, tilleggsinformasjon).Dette konsentrasjonsområdet er mye større enn hos friske mennesker (lave nanogram per milliliter), men i sjeldne tilfeller, hos kreftpasienter, kan nivået av ccfDNA nå flere mikrogram per milliliter [34, 35].En analyse av størrelsesfordelingen til hemolymfe ccfDNA viste at disse fragmentene varierer sterkt i størrelse, fra 1000 bp til 1000 bp.opptil 5000 bp (fig. 2).Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av det silikabaserte QIAamp Investigator Kit, en metode som vanligvis brukes i rettsmedisin for raskt å isolere og rense genomisk DNA fra lavkonsentrasjons-DNA-prøver, inkludert ccfDNA [36].
Representativt ccfDNA-elektroforegram av blåskjellhemolymfe.Ekstrahert med NucleoSnap Plasma Kit (øverst) og QIAamp DNA Investigator Kit.B Fiolinplott som viser fordelingen av hemolymfe ccfDNA-konsentrasjoner (±SE) i blåskjell.De svarte og røde linjene representerer henholdsvis medianen og den første og tredje kvartilen.
Omtrent 1 % av ccfDNA hos mennesker og primater har en fremmed kilde [21, 37].Gitt det halvåpne sirkulasjonssystemet til muslinger, mikrobielt rikt sjøvann og størrelsesfordelingen av musling-ccfDNA, antok vi at blåskjellhemolymfe-ccfDNA kan inneholde en rik og mangfoldig pool av mikrobiell DNA.For å teste denne hypotesen sekvenserte vi hemolymfe ccfDNA fra Aulacomya atra-prøver samlet fra Kerguelen-øyene, og ga over 10 millioner avlesninger, hvorav 97,6 % besto kvalitetskontroll.Avlesningene ble deretter klassifisert i henhold til egne og ikke-selvkilder ved å bruke BLASTN og NCBI toskallete databaser (fig. S1, tilleggsinformasjon).
Hos mennesker kan både kjernefysisk og mitokondrielt DNA frigjøres i blodet [38].I denne studien var det imidlertid ikke mulig å beskrive det nukleære genomiske DNAet til blåskjell i detalj, gitt at A. atra-genomet ikke er sekvensert eller beskrevet.Imidlertid var vi i stand til å identifisere en rekke ccfDNA-fragmenter av vår egen opprinnelse ved hjelp av muslingebiblioteket (fig. S2, tilleggsinformasjon).Vi bekreftet også tilstedeværelsen av DNA-fragmenter av vår egen opprinnelse ved rettet PCR-amplifisering av de A. atra-genene som ble sekvensert (fig. 3).På samme måte, gitt at mitokondriegenomet til A. atra er tilgjengelig i offentlige databaser, kan man finne bevis for tilstedeværelsen av mitokondrielle ccfDNA-fragmenter i hemolymfen til A. atra.Tilstedeværelsen av mitokondrielle DNA-fragmenter ble bekreftet ved PCR-amplifikasjon (fig. 3).
Ulike mitokondrielle gener var tilstede i hemolymfen til A. atra (røde prikker – lagernummer: SRX5705969) og M. platensis (blå prikker – lagernummer: SRX5705968) forsterket ved PCR.Figur tilpasset fra Breton et al., 2011 B Amplifikasjon av hemolymfesupernatant fra A. atra Lagret på FTA-papir.Bruk en 3 mm stanse for å legge direkte til PCR-røret som inneholder PCR-blandingen.
Gitt det rikelig mikrobielle innholdet i sjøvann, fokuserte vi først på karakteriseringen av mikrobielle DNA-sekvenser i hemolymfe.For å gjøre dette bruker vi to ulike strategier.Den første strategien brukte Kraken2, et algoritmebasert sekvensklassifiseringsprogram som kan identifisere mikrobielle sekvenser med en nøyaktighet som kan sammenlignes med BLAST og andre verktøy [28].Mer enn 6719 avlesninger ble bestemt til å være av bakteriell opprinnelse, mens 124 og 64 var fra henholdsvis archaea og virus (fig. 4).De mest tallrike bakterielle DNA-fragmentene var Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) og Bacteroidetes (17%) (fig. 4a).Denne fordelingen samsvarer med tidligere studier av det marine blåskjellmikrobiomet [39, 40].Gammaproteobacteria var hovedklassen av Proteobacteria (44 %), inkludert mange Vibrionales (fig. 4b).ddPCR-metoden bekreftet tilstedeværelsen av Vibrio DNA-fragmenter i ccfDNA til A. atra hemolymph (fig. 4c) [41].For å få mer informasjon om den bakterielle opprinnelsen til ccfDNA, ble en ekstra tilnærming tatt (fig. S2, tilleggsinformasjon). I dette tilfellet ble avlesninger som overlappet satt sammen som parede endeavlesninger og ble klassifisert som av selv- (muslinger) eller ikke-selv-opprinnelse ved bruk av BLASTN og en e-verdi på 1e−3 og en cutoff med >90 % homologi. I dette tilfellet ble avlesninger som overlappet satt sammen som parede endeavlesninger og ble klassifisert som av selv- (muslinger) eller ikke-selv-opprinnelse ved bruk av BLASTN og en e-verdi på 1e−3 og en cutoff med >90 % homologi. ( В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN og значения e 1e-3 og отсечениол с гого%. I dette tilfellet ble overlappende avlesninger samlet inn som parede avlesninger og ble klassifisert som native (toskallet) eller ikke-originale ved bruk av BLASTN og e-verdien 1e-3 og cutoff med >90 % homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倧暒倌嚒值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使缄 的 的用 的 用 的和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 ( В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицович ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 og порога гои> 90%. I dette tilfellet ble overlappende avlesninger samlet inn som parede avlesninger og klassifisert som egne (muslinger) eller ikke-originale ved bruk av e BLASTN- og 1e-3-verdier og en homologiterskel >90 %.Siden A. atra-genomet ennå ikke er sekvensert, brukte vi de novo monteringsstrategien til MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Totalt 147 188 contigs er identifisert som avhengige (muslinger) av opprinnelse.Disse contigs ble deretter eksplodert med e-verdier på 1e-10 ved bruk av BLASTN og BLASTX.Denne strategien tillot oss å identifisere 482 ikke-bivalve fragmenter tilstede i A. atra ccfDNA.Mer enn halvparten (57 %) av disse DNA-fragmentene ble hentet fra bakterier, hovedsakelig fra gjellesymbionter, inkludert sulfotrofe symbionter, og fra gjellesymbionter Solemya velum (fig. 5).
Relativ overflod på typenivå.B Mikrobiell mangfold av to hovedfila (Firmicutes og Proteobacteria).Representativ amplifikasjon av ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenter av 16S rRNA-genet (blått) i tre atra-hemolymfer.
Totalt 482 innsamlede contigs ble analysert.Generell profil av den taksonomiske fordelingen av metagenomiske contig-annoteringer (prokaryoter og eukaryoter).B Detaljert fordeling av bakterielle DNA-fragmenter identifisert av BLASTN og BLASTX.
Kraken2-analyse viste også at musling-ccfDNA inneholdt arkeale DNA-fragmenter, inkludert DNA-fragmenter av Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) og Thaurmarcheota (11 %) (fig. 6a).Tilstedeværelsen av DNA-fragmenter avledet fra Euryarchaeota og Crenarchaeota, tidligere funnet i det mikrobielle samfunnet av kaliforniske blåskjell, burde ikke komme som en overraskelse [42].Selv om Euryarchaeota ofte er assosiert med ekstreme forhold, er det nå anerkjent at både Euryarchaeota og Crenarcheota er blant de vanligste prokaryotene i det marine kryogene miljøet [43, 44].Tilstedeværelsen av metanogene mikroorganismer i blåskjell er ikke overraskende, gitt nyere rapporter om omfattende metanlekkasjer fra bunnlekkasjer på Kerguelen-platået [45] og mulig mikrobiell metanproduksjon observert utenfor kysten av Kerguelen-øyene [46].
Vår oppmerksomhet skiftet deretter til avlesninger fra DNA-virus.Så vidt vi vet er dette den første studien utenfor mål av virusinnholdet i blåskjell.Som forventet fant vi DNA-fragmenter av bakteriofager (Caudovirales) (Fig. 6b).Imidlertid kommer det vanligste virale DNA fra en filum av nukleocytovirus, også kjent som det nukleære cytoplasmatiske store DNA-viruset (NCLDV), som har det største genomet av alle virus.Innenfor denne filumen tilhører de fleste DNA-sekvensene familiene Mimimidoviridae (58%) og Poxviridae (21%), hvis naturlige verter inkluderer virveldyr og leddyr, mens en liten andel av disse DNA-sekvensene tilhører kjente virologiske alger.Infiserer marine eukaryote alger.Sekvensene ble også hentet fra Pandora-viruset, det gigantiske viruset med den største genomstørrelsen av noen kjente virale slekter.Interessant nok var utvalget av verter kjent for å være infisert med viruset, bestemt ved hemolymfe ccfDNA-sekvensering, relativt stort (figur S3, tilleggsinformasjon).Det inkluderer virus som infiserer insekter som Baculoviridae og Iridoviridae, samt virus som infiserer amøber, alger og virveldyr.Vi fant også sekvenser som matcher Pithovirus sibericum-genomet.Pitovirus (også kjent som «zombievirus») ble først isolert fra 30 000 år gammel permafrost i Sibir [47].Dermed er resultatene våre i samsvar med tidligere rapporter som viser at ikke alle moderne arter av disse virusene er utdødd [48] og at disse virusene kan være tilstede i fjerntliggende subarktiske marine økosystemer.
Til slutt testet vi for å se om vi kunne finne DNA-fragmenter fra andre flercellede dyr.Totalt 482 utenlandske contigs ble identifisert av BLASTN og BLASTX med nt, nr og RefSeq biblioteker (genomisk og protein).Våre resultater viser at blant de fremmede fragmentene av ccfDNA fra flercellede dyr dominerer DNA fra beinbein (fig. 5).Det er også funnet DNA-fragmenter fra insekter og andre arter.En relativt stor del av DNA-fragmentene er ikke identifisert, muligens på grunn av underrepresentasjonen av et stort antall marine arter i genomiske databaser sammenlignet med terrestriske arter [49].
I denne artikkelen bruker vi LB-konseptet på blåskjell, og argumenterer for at sekvensering av hemolymfe ccfDNA-skudd kan gi innsikt i sammensetningen av marine kystøkosystemer.Spesielt fant vi at 1) blåskjellhemolymfe inneholder relativt høye konsentrasjoner (mikrogramnivåer) av relativt store (~1-5 kb) sirkulerende DNA-fragmenter;2) disse DNA-fragmentene er både uavhengige og ikke-uavhengige 3) Blant de fremmede kildene til disse DNA-fragmentene fant vi bakterie-, arkealt og viralt DNA, samt DNA fra andre flercellede dyr;4) Akkumuleringen av disse fremmede ccfDNA-fragmentene i hemolymfen skjer raskt og bidrar til den interne filtreringsaktiviteten til blåskjell.Avslutningsvis viser vår studie at konseptet LB, som så langt har blitt brukt hovedsakelig innen biomedisin, koder for en rik, men uutforsket kilde til kunnskap som kan brukes til å bedre forstå samspillet mellom vaktpostarter og deres miljø.
I tillegg til primater har ccfDNA-isolasjon blitt rapportert hos pattedyr, inkludert mus, hunder, katter og hester [50, 51, 52].Så vidt vi vet er studien vår den første som rapporterer påvisning og sekvensering av ccfDNA i marine arter med åpent sirkulasjonssystem.Denne anatomiske egenskapen og filtreringsevnen til blåskjell kan, i det minste delvis, forklare de forskjellige størrelsesegenskapene til sirkulerende DNA-fragmenter sammenlignet med andre arter.Hos mennesker er de fleste DNA-fragmenter som sirkulerer i blodet små fragmenter som varierer i størrelse fra 150 til 200 bp.med en maksimal topp på 167 bp [34, 53].En liten, men betydelig del av DNA-fragmentene er mellom 300 og 500 bp i størrelse, og omtrent 5 % er lengre enn 900 bp.[54].Årsaken til denne størrelsesfordelingen er at hovedkilden til ccfDNA i plasma oppstår som et resultat av celledød, enten på grunn av celledød eller på grunn av nekrose av sirkulerende hematopoietiske celler hos friske individer eller på grunn av apoptose av tumorceller hos kreftpasienter (kjent som sirkulerende tumor-DNA)., ctDNA).Størrelsesfordelingen av hemolymph ccfDNA som vi fant i blåskjell varierte fra 1000 til 5000 bp, noe som tyder på at blåskjell ccfDNA har en annen opprinnelse.Dette er en logisk hypotese, siden blåskjell har et halvåpent karsystem og lever i marine vannmiljøer som inneholder høye konsentrasjoner av mikrobiell genomisk DNA.Faktisk har laboratorieeksperimentene våre med eksogent DNA vist at blåskjell akkumulerer DNA-fragmenter i sjøvann, i hvert fall etter noen timer brytes de ned etter cellulært opptak og/eller frigjøres og/eller lagres i ulike organisasjoner.Gitt sjeldenheten til celler (både prokaryote og eukaryote), vil bruk av intravalvulære rom redusere mengden ccfDNA fra egenkilder så vel som fra utenlandske kilder.Tatt i betraktning viktigheten av toskallet medfødt immunitet og det store antallet sirkulerende fagocytter, antok vi videre at selv fremmed ccfDNA er beriket i sirkulerende fagocytter som akkumulerer fremmed DNA ved inntak av mikroorganismer og/eller cellulært rusk.Samlet viser resultatene våre at toskallet hemolymfe ccfDNA er et unikt depot av molekylær informasjon og forsterker deres status som en vaktpostart.
Våre data indikerer at sekvensering og analyse av bakterieavledede hemolymfe ccfDNA-fragmenter kan gi nøkkelinformasjon om vertsbakteriefloraen og bakteriene som er tilstede i det omkringliggende marine økosystemet.Skuddsekvenseringsteknikker har avslørt sekvenser av den kommensale bakterien A. atra gjelle som ville blitt savnet hvis konvensjonelle 16S rRNA-identifikasjonsmetoder hadde blitt brukt, delvis på grunn av en referansebibliotekskjevhet.Faktisk viste vår bruk av LB-data samlet inn fra M. platensis i samme blåskjelllag ved Kerguelen at sammensetningen av gjelleassosierte bakteriesymbionter var den samme for begge blåskjellartene (fig. S4, tilleggsinformasjon).Denne likheten mellom to genetisk forskjellige blåskjell kan gjenspeile sammensetningen av bakteriesamfunn i de kalde, svovelholdige og vulkanske forekomstene i Kerguelen [55, 56, 57, 58].Høyere nivåer av svovelreduserende mikroorganismer er godt beskrevet ved høsting av blåskjell fra bioturberte kystområder [59], som kysten av Port-au-France.En annen mulighet er at den kommensale blåskjellfloraen kan bli påvirket av horisontal overføring [60, 61].Mer forskning er nødvendig for å fastslå sammenhengen mellom havmiljøet, havbunnens overflate og sammensetningen av symbiotiske bakterier i blåskjell.Disse studiene pågår for tiden.
Lengden og konsentrasjonen av hemolymfe ccfDNA, dens enkle rensing og høy kvalitet for å tillate rask haglesekvensering er noen av de mange fordelene ved å bruke blåskjell ccfDNA for å vurdere biologisk mangfold i marine kystøkosystemer.Denne tilnærmingen er spesielt effektiv for å karakterisere virale samfunn (viromer) i et gitt økosystem [62, 63].I motsetning til bakterier, archaea og eukaryoter, inneholder ikke virale genomer fylogenetisk konserverte gener som 16S-sekvenser.Resultatene våre indikerer at flytende biopsier fra indikatorarter som blåskjell kan brukes til å identifisere relativt store antall ccfDNA-virusfragmenter som er kjent for å infisere verter som typisk bor i kystnære marine økosystemer.Dette inkluderer virus som er kjent for å infisere protozoer, leddyr, insekter, planter og bakterielle virus (f.eks. bakteriofager).En lignende fordeling ble funnet da vi undersøkte hemolymfe ccfDNA-viromet til blåskjell (M. platensis) samlet i det samme blåskjelllaget ved Kerguelen (tabell S2, tilleggsinformasjon).Haglesekvensering av ccfDNA er virkelig en ny tilnærming som får fart i studiet av viromet til mennesker eller andre arter [21, 37, 64].Denne tilnærmingen er spesielt nyttig for å studere dobbelttrådet DNA-virus, siden intet enkelt gen er bevart blant alle dobbelttrådete DNA-virus, som representerer den mest mangfoldige og brede klassen av virus i Baltimore [65].Selv om de fleste av disse virusene forblir uklassifisert og kan inkludere virus fra en helt ukjent del av den virale verden [66], fant vi at viromene og vertsområdene til blåskjellene A. atra og M. platensis faller mellom de to artene.tilsvarende (se figur S3, tilleggsinformasjon).Denne likheten er ikke overraskende, da den kan reflektere mangel på selektivitet i opptak av DNA som er tilstede i miljøet.Fremtidige studier som bruker renset RNA er for tiden nødvendig for å karakterisere RNA-viromet.
I vår studie brukte vi en svært streng pipeline tilpasset fra arbeidet til Kowarski og kolleger [37], som brukte en totrinns sletting av sammenslåtte lesninger og contigs før og etter sammenstilling av naturlig ccfDNA, noe som resulterte i en høy andel ikke-kartlagte lesninger.Derfor kan vi ikke utelukke at noen av disse ukartlagte avlesningene fortsatt kan ha sin egen opprinnelse, først og fremst fordi vi ikke har et referansegenom for denne blåskjellarten.Vi brukte også denne rørledningen fordi vi var bekymret for kimærene mellom selv- og ikke-selvlesninger og leselengdene generert av Illumina MiSeq PE75.En annen grunn til flertallet av ukjente målinger er at mye av de marine mikrobene, spesielt i avsidesliggende områder som Kerguelen, ikke har blitt kommentert.Vi brukte Illumina MiSeq PE75, forutsatt ccfDNA-fragmentlengder som ligner på humant ccfDNA.For fremtidige studier, gitt våre resultater som viser at hemolymfe ccfDNA har lengre lesninger enn mennesker og/eller pattedyr, anbefaler vi å bruke en sekvenseringsplattform som er mer egnet for lengre ccfDNA-fragmenter.Denne praksisen vil gjøre det mye lettere å identifisere flere indikasjoner for dypere analyser.Å skaffe den for øyeblikket utilgjengelige fullstendige A. atra kjernegenomsekvensen vil også i stor grad lette diskrimineringen av ccfDNA fra egne og ikke-selvkilder.Gitt at vår forskning har fokusert på muligheten for å anvende konseptet flytende biopsi på blåskjell, håper vi at ettersom dette konseptet brukes i fremtidig forskning, vil nye verktøy og rørledninger bli utviklet for å øke potensialet til denne metoden for å studere det mikrobielle mangfoldet av blåskjell.marine økosystem.
Som en ikke-invasiv klinisk biomarkør er forhøyede humane plasmanivåer av ccfDNA assosiert med ulike sykdommer, vevsskade og stresstilstander [67,68,69].Denne økningen er assosiert med frigjøring av DNA-fragmenter av egen opprinnelse etter vevsskade.Vi tok opp dette problemet ved å bruke akutt varmestress, der blåskjell ble kortvarig utsatt for en temperatur på 30 °C.Vi utførte denne analysen på tre forskjellige typer blåskjell i tre uavhengige eksperimenter.Imidlertid fant vi ingen endring i ccfDNA-nivåer etter akutt varmestress (se figur S5, tilleggsinformasjon).Denne oppdagelsen kan forklare, i det minste delvis, det faktum at blåskjell har et halvåpent sirkulasjonssystem og akkumulerer store mengder fremmed DNA på grunn av deres høye filtreringsaktivitet.På den annen side kan blåskjell, som mange virvelløse dyr, være mer motstandsdyktige mot stressindusert vevsskade, og dermed begrense frigjøringen av ccfDNA i hemolymfen deres [70, 71].
Til dags dato har DNA-analyse av biologisk mangfold i akvatiske økosystemer hovedsakelig fokusert på miljø-DNA (eDNA) metabarcoding.Imidlertid er denne metoden vanligvis begrenset i biodiversitetsanalyse når primere brukes.Bruken av haglesekvensering omgår begrensningene ved PCR og det partiske utvalget av primersett.Dermed er metoden vår på en måte nærmere den nylig brukte high-throughput eDNA Shotgun-sekvenseringsmetoden, som er i stand til å sekvensere fragmentert DNA direkte og analysere nesten alle organismer [72, 73].Imidlertid er det en rekke grunnleggende problemer som skiller LB fra standard eDNA-metoder.Selvfølgelig er hovedforskjellen mellom eDNA og LB bruken av naturlige filterverter.Bruk av marine arter som svamper og muslinger (Dresseina spp.) som et naturlig filter for å studere eDNA er rapportert [74, 75].Dreissenas studie brukte imidlertid vevsbiopsier som DNA ble ekstrahert fra.Analyse av ccfDNA fra LB krever ikke vevsbiopsi, spesialisert og noen ganger kostbart utstyr og logistikk knyttet til eDNA eller vevsbiopsi.Faktisk rapporterte vi nylig at ccfDNA fra LB kan lagres og analyseres med FTA-støtte uten å opprettholde en kjølekjede, noe som er en stor utfordring for forskning i fjerntliggende områder [76].Ekstraksjonen av ccfDNA fra flytende biopsier er også enkel og gir høykvalitets DNA for haglesekvensering og PCR-analyse.Dette er en stor fordel gitt noen av de tekniske begrensningene knyttet til eDNA-analyse [77].Enkelheten og den lave kostnaden ved prøvetakingsmetoden er også spesielt egnet for langsiktige overvåkingsprogrammer.I tillegg til deres høye filtreringsevne, er et annet velkjent trekk ved muslinger den kjemiske mukopolysakkaridsammensetningen av deres slim, som fremmer absorpsjon av virus [78, 79].Dette gjør muslinger til et ideelt naturlig filter for å karakterisere biologisk mangfold og virkningen av klimaendringer i et gitt akvatisk økosystem.Selv om tilstedeværelsen av vertsavledede DNA-fragmenter kan sees på som en begrensning av metoden sammenlignet med eDNA, er kostnadene forbundet med å ha et slikt naturlig ccfDNA sammenlignet med eDNA samtidig forståelig for den enorme mengden informasjon som er tilgjengelig for helsestudier.offset vert.Dette inkluderer tilstedeværelsen av virale sekvenser integrert i genomet til vertsverten.Dette er spesielt viktig for blåskjell, gitt tilstedeværelsen av horisontalt overførte leukemiske retrovirus i muslinger [80, 81].En annen fordel med LB fremfor eDNA er at den utnytter den fagocytiske aktiviteten til sirkulerende blodceller i hemolymfen, som oppsluker mikroorganismer (og deres genomer).Fagocytose er hovedfunksjonen til blodceller i muslinger [82].Til slutt utnytter metoden den høye filtreringskapasiteten til blåskjell (gjennomsnittlig 1,5 l/t sjøvann) og to-dagers sirkulasjon, som øker blandingen av forskjellige lag med sjøvann, og tillater fangst av heterologt eDNA.[83, 84].Dermed er ccfDNA-analyse av blåskjell en interessant vei gitt de ernæringsmessige, økonomiske og miljømessige konsekvensene av blåskjell.I likhet med analysen av LB samlet inn fra mennesker, åpner denne metoden også for muligheten for å måle genetiske og epigenetiske endringer i verts-DNA som respons på eksogene stoffer.For eksempel kan tredje generasjons sekvenseringsteknologier tenkes å utføre genomomfattende metyleringsanalyse i naturlig ccfDNA ved bruk av nanopore-sekvensering.Denne prosessen bør forenkles av det faktum at lengden på musling-ccfDNA-fragmentene er ideelt forenlig med lang-avleste sekvenseringsplattformer som tillater genomomfattende DNA-metyleringsanalyse fra en enkelt sekvenseringskjøring uten behov for kjemiske transformasjoner.85,86] Dette er en interessant mulighet, siden det har vist seg at DNA-respons-metylering over mange miljømessige stress- og vedvarende mønstre gjenspeiler en.Derfor kan det gi verdifull innsikt i de underliggende mekanismene som styrer respons etter eksponering for klimaendringer eller forurensninger [87].Bruken av LB er imidlertid ikke uten begrensninger.Det er unødvendig å si at dette krever tilstedeværelse av indikatorarter i økosystemet.Som nevnt ovenfor krever bruk av LB for å vurdere biologisk mangfold til et gitt økosystem også en streng bioinformatikkrørledning som tar hensyn til tilstedeværelsen av DNA-fragmenter fra kilden.Et annet stort problem er tilgjengeligheten av referansegenomer for marine arter.Det er å håpe at initiativer som Marine Mammal Genomes Project og det nylig etablerte Fish10k-prosjektet [88] vil legge til rette for slik analyse i fremtiden.Anvendelsen av LB-konseptet på marine filtermatende organismer er også kompatibel med de siste fremskrittene innen sekvenseringsteknologi, noe som gjør det godt egnet for utvikling av multi-ohm biomarkører for å gi viktig informasjon om helsen til marine habitater som svar på miljøstress.
Genomsekvenseringsdata er deponert i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Effekten av klimaendringer på marint liv og økosystemer.Cole biologi.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Vurder de kombinerte virkningene av klimaendringer og andre lokale stressfaktorer på det marine miljøet.generelt vitenskapelig miljø.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Vitenskap fra første mars.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Redusert varmetoleranse under gjentatte varmestressforhold forklarer den høye sommerdødeligheten til blåskjell.Vitenskapelig rapport 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nylige endringer i hyppighet, årsaker og omfang av dyredødsfall.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Flere ikke-artsspesifikke patogener kan ha forårsaket massedødelighet av Pinna nobilis.Liv.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensiell innvirkning av klimaendringer på arktiske zoonotiske sykdommer.Int J Sirkumpolar helse.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blåskjell (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer i kystforurensningsovervåking: en gjennomgang.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasjon av flytende biopsi i kreftbehandling.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Modning av flytende biopsi: Lar tumor-DNA sirkulere.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyrer i humant plasma.Møtereferater for Soc Biols datterselskaper.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny rolle for cellefritt DNA som en molekylær markør for kreftbehandling.Kvantifisering av biomolar analyse.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flytende biopsi kommer inn på klinikken – implementeringsproblemer og fremtidige utfordringer.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW og andre.Foster-DNA er tilstede i mors plasma og serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie av svangerskapsforløpet og dets komplikasjoner ved bruk av sirkulerende ekstracellulært RNA i blodet til kvinner under graviditet.Dopediatri.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Væskebiopsi: donorcellefritt DNA brukes til å oppdage allogene lesjoner i et nyretransplantat.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovasjoner i prenatal diagnostikk: mors plasmagenomsekvensering.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Rask patogendeteksjon med neste generasjons metagenomisk sekvensering av infiserte kroppsvæsker.Nat Medicine.2021;27:115-24.