Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Ukontrollert blødning er en av de viktigste dødsårsakene.Oppnåelse av rask hemostase sikrer overlevelse av motivet som førstehjelp under kamp, ​​trafikkulykker og dødsreduksjonsoperasjoner.Nanoporøst fiberforsterket komposittstillas (NFRCS) avledet fra en enkel hemostatisk filmdannende sammensetning (HFFC) som en kontinuerlig fase kan utløse og forbedre hemostase.Utviklingen av NFRCS er basert på utformingen av øyenstikkerens vinge.Øyenstikkervingestrukturen består av tverrgående og langsgående vinger, og vingemembranene er forbundet med hverandre for å opprettholde integriteten til mikrostrukturen.HFFC dekker overflaten av fiberen jevnt med en film av nanometer tykkelse og forbinder den tilfeldig fordelte bomullstykkelsen (Ct) (dispergert fase) for å danne en nanoporøs struktur.Kombinasjonen av kontinuerlige og dispergerte faser reduserer kostnadene for produktet med ti ganger sammenlignet med kommersielt tilgjengelige produkter.Modifisert NFRCS (tamponger eller armbånd) kan brukes i en rekke biomedisinske applikasjoner.In vivo-studier har konkludert med at den utviklede Cp NFRCS utløser og forbedrer koagulasjonsprosessen på applikasjonsstedet.NFRCS kan modulere mikromiljøet og virke på cellenivå på grunn av dens nanoporøse struktur, noe som resulterer i bedre sårheling i eksisjonssårmodellen.
Ukontrollerte blødninger under kamp, ​​intraoperative og nødsituasjoner kan utgjøre en alvorlig trussel mot såredes liv1.Disse forholdene fører videre til en generell økning i perifer vaskulær motstand, noe som fører til hemorragisk sjokk.Hensiktsmessige tiltak for å kontrollere blødninger under og etter operasjonen anses som potensielt livstruende2,3.Skader på store kar fører til massivt blodtap, noe som resulterer i en dødelighet på ≤ 50 % i kamp og 31 % under operasjon1.Massivt blodtap fører til en reduksjon i kroppsvolum, noe som reduserer hjertevolum.En økning i total perifer vaskulær motstand og en progressiv svekkelse av mikrosirkulasjonen fører til hypoksi i de livsstøttende organene.Blødningssjokk kan oppstå hvis tilstanden fortsetter uten effektiv intervensjon1,4,5.Andre komplikasjoner inkluderer progresjon av hypotermi og metabolsk acidose, samt en koagulasjonsforstyrrelse som hindrer koagulasjonsprosessen.Alvorlig hemorragisk sjokk er assosiert med høyere risiko for død6,7,8.Ved grad III (progressivt) sjokk er blodtransfusjon avgjørende for pasientens overlevelse under intraoperativ og postoperativ morbiditet og dødelighet.For å overvinne alle de ovennevnte livstruende situasjonene, har vi utviklet et nanoporøst fiberforsterket komposittstillas (NFRCS) som bruker en minimal polymerkonsentrasjon (0,5%) ved bruk av en kombinasjon av vannløselige hemostatiske polymerer.
Ved bruk av fiberarmering kan kostnadseffektive produkter utvikles.De tilfeldig arrangerte fibrene ligner strukturen til en øyenstikkervinge, balansert av de horisontale og vertikale stripene på vingene.De tverrgående og langsgående venene til vingen kommuniserer med vingemembranen (fig. 1).NFRCS består av forsterket Ct som et stillassystem med bedre fysisk og mekanisk styrke (Figur 1).På grunn av rimeligheten og håndverket foretrekker kirurger å bruke bomullstrådmålere (Ct) under operasjoner og dressinger. Derfor, med tanke på de mange fordelene, inkludert > 90 % krystallinsk cellulose (medvirker til forbedring av hemostatisk aktivitet), ble Ct brukt som et skjelettsystem av NFRCS9,10. Derfor, med tanke på de mange fordelene, inkludert > 90 % krystallinsk cellulose (medvirker til forbedring av hemostatisk aktivitet), ble Ct brukt som et skjelettsystem av NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристаллической целюческой целюлоз статической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Derfor, gitt de mange fordelene, inkludert >90 % krystallinsk cellulose (involvert i økt hemostatisk aktivitet), ble Ct brukt som NFRCS-skjelettsystemet9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增强止血洉 助于增强止血ﴉ ,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Derfor, gitt sine mange fordeler, inkludert over 90 % krystallinsk cellulose (hjelper med å forbedre hemostatisk aktivitet), ble Ct brukt som et stillas for NFRCS9,10.Ct ble overfladisk belagt (nano-tykk filmdannelse ble observert) og sammenkoblet med en hemostatisk filmdannende sammensetning (HFFC).HFFC fungerer som en matrigel, og holder tilfeldig plassert Ct sammen.Den utviklede designen overfører stress innenfor den dispergerte fasen (forsterkende fibre).Det er vanskelig å oppnå nanoporøse strukturer med god mekanisk styrke ved å bruke minimale polymerkonsentrasjoner.I tillegg er det ikke lett å tilpasse ulike former for ulike biomedisinske bruksområder.
Figuren viser et diagram av NFRCS-designet basert på øyenstikkervingestrukturen (A).Dette bildet viser en sammenlignende analogi av vingestrukturen til en øyenstikker (de kryssende og langsgående venene i vingen er sammenkoblet) og et tverrsnittsmikrografi av Cp NFRCS (B).Skjematisk representasjon av NFRCS.
NFRC-er ble utviklet ved å bruke HFFC som en kontinuerlig fase for å adressere begrensningene ovenfor.HFFC er sammensatt av forskjellige filmdannende hemostatiske polymerer inkludert kitosan (som den viktigste hemostatiske polymeren) med metylcellulose (MC), hydroksypropylmetylcellulose (HPMC 50 cp) og polyvinylalkohol (PVA)) (125 kDa) som en støttepolymer som fremmer trombedannelse.formasjon.Tilsetningen av polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) forbedret fuktighetsabsorpsjonskapasiteten til NFRCS.Polyetylenglykol 400 (PEG 400) ble tilsatt for å forbedre polymertverrbinding i bundne polymerblandinger.Tre forskjellige hemostatiske sammensetninger av HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC og Cp HFFC), nemlig kitosan med MC (Cm), kitosan med HPMC (Ch) og kitosan med PVA (Cp), ble påført Ct.Ulike in vitro og in vivo karakteriseringsstudier har bekreftet den hemostatiske og sårhelende aktiviteten til NFRCS.Komposittmaterialer som tilbys av NFRCS kan brukes til å tilpasse ulike former for stillas for å møte spesifikke behov.
I tillegg kan NFRCS modifiseres som en bandasje eller rull for å dekke hele skadeområdet i underekstremitetene og andre deler av kroppen.Spesielt for kamplemmerskader, kan den utformede NFRCS-designen endres til en halv arm eller et helt ben (tilleggsfigur S11).NFRCS kan gjøres til et armbånd med vevslim, som kan brukes til å stoppe blødninger fra alvorlige suicidale håndleddsskader.Vårt hovedmål er å utvikle en NFRCS med så lite polymer som mulig som kan leveres til en stor befolkning (under fattigdomsgrensen) og som kan plasseres i et førstehjelpsutstyr.Enkel, effektiv og økonomisk i design, NFRCS er til fordel for lokalsamfunn og kan ha en global innvirkning.
Kitosan (molekylvekt 80 kDa) og amarant ble kjøpt fra Merck, India.Hydroksypropylmetylcellulose 50 Cp, polyetylenglykol 400 og metylcellulose ble kjøpt fra Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polyvinylalkohol (molekylvekt 125 kDa) (87-90 % hydrolysert) ble kjøpt fra National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidin K30 ble kjøpt fra Molychem, Mumbai, sterile vattpinner ble kjøpt fra Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q vann (Direct-Q3 vannrensingssystem, Merck, India) som bærer.
NFRCS ble utviklet ved hjelp av en frysetørkingsmetode11,12.Alle HFFC-sammensetninger (tabell 1) ble fremstilt ved bruk av en mekanisk rører.Forbered en 0,5 % løsning av kitosan ved bruk av 1 % eddiksyre i vann ved kontinuerlig omrøring ved 800 rpm på en mekanisk rører.Den nøyaktige vekten av den ladede polymeren angitt i tabell 1 ble tilsatt til kitosanløsningen og omrørt inntil en klar polymerløsning ble oppnådd.PVP K30 og PEG 400 ble tilsatt til den resulterende blandingen i de mengder som er angitt i tabell 1, og omrøringen ble fortsatt inntil en klar viskøs polymerløsning ble oppnådd.Det resulterende badet med polymerløsning ble sonikert i 60 minutter for å fjerne innestengte luftbobler fra polymerblandingen.Som vist i tilleggsfigur S1(b), ble Ct jevnt fordelt i hver brønn på en 6-brønns plate (form) supplert med 5 ml HFFC.
Seks-brønnsplaten ble sonikert i 60 minutter for å oppnå jevn fukting og fordeling av HFFC i Ct-nettverket.Frys deretter seks-brønnsplaten ved -20°C i 8-12 timer.Fryseplater ble lyofilisert i 48 timer for å oppnå forskjellige formuleringer av NFRCS.Den samme prosedyren brukes til å produsere forskjellige former og strukturer, for eksempel tamponger eller sylindriske tamponger, eller en hvilken som helst annen form for forskjellige bruksområder.
Nøyaktig veid kitosan (80 kDa) (3 %) oppløses i 1 % eddiksyre ved bruk av en magnetrører.Til den resulterende løsningen av kitosan ble det tilsatt 1 % PEG 400 og omrørt i 30 minutter.Hell den resulterende løsningen i en firkantet eller rektangulær beholder og frys ved -80°C i 12 timer.Frosne prøver ble lyofilisert i 48 timer for å oppnå porøs Cs13.
Den utviklede NFRCS ble utsatt for eksperimenter ved bruk av Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) for å bekrefte den kjemiske kompatibiliteten til kitosan med andre polymerer14,15.FTIR-spektrene (bredden av spektralområdet fra 400 til 4000 cm-1) av alle testede prøver ble oppnådd ved å utføre 32 skanninger.
Blodabsorpsjonshastigheten (BAR) for alle formuleringer ble evaluert ved å bruke metoden beskrevet av Chen et al.16 med små modifikasjoner.De utviklede NFRK-ene av alle sammensetningene ble tørket i en vakuumovn ved 105°C over natten for å fjerne gjenværende løsningsmiddel.30 mg NFRCS (startprøvevekt – W0) og 30 mg Ct (positiv kontroll) ble plassert i separate skåler som inneholdt en forblanding av 3,8 % natriumsitrat.Ved forhåndsbestemte tidsintervaller, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 og 60 sekunder, ble NFRCS fjernet og overflatene deres renset for uabsorbert blod ved å plassere prøvene på Ct i 30 sekunder.Den endelige vekten av blod absorbert av NFRCS 16 ble vurdert (W1) på hvert tidspunkt.Beregn BAR-prosenten ved å bruke følgende formel:
Blodkoaguleringstid (BCT) ble bestemt som rapportert av Wang et al.17.Tiden som kreves for fullblod (rotteblod forhåndsblandet med 3,8 % natriumsitrat) til å koagulere i nærvær av NFRCS ble beregnet som BCT for testprøven.De forskjellige NFRCS-komponentene (30 mg) ble plassert i 10 ml hetteglass med skrukork og inkubert ved 37°C.Blod (0,5 ml) ble tilsatt hetteglasset og 0,3 ml 0,2 M CaCl2 ble tilsatt for å aktivere blodkoagulering.Snu til slutt hetteglasset hvert 15. sekund (opptil 180°) til det dannes en fast koagel.BCT for prøven er estimert ved antall vendinger vails17,18.Basert på BCT ble to optimale sammensetninger fra NFRCS Cm, Ch og Cp valgt for videre karakteriseringsstudier.
BCT av Ch NFRCS og Cp NFRCS sammensetninger ble bestemt ved å implementere metoden beskrevet av Li et al.19.Plasser 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs (positiv kontroll) i separate petriskåler (37 °C).Blod som inneholdt 3,8 % natriumsitrat ble blandet med 0,2 M CaCl2 i et volumforhold på 10:1 for å starte blodkoagulasjonsprosessen.20 ul av 0,2 M CaCl2-rotteblodblanding ble påført prøveoverflaten og plassert i en tom petriskål.Kontrollen var blod hellet i tomme petriskåler uten Ct.Med faste intervaller på 0, 3 og 5 minutter, stopp koaguleringen ved å tilsette 10 ml avionisert (DI) vann til prøven som inneholder skålen uten å forstyrre koaguleringen.Ukoagulerte erytrocytter (erytrocytter) gjennomgår hemolyse i nærvær av avionisert vann og frigjør hemoglobin.Hemoglobin ved forskjellige tidspunkter (HA(t)) ble målt ved 540 nm (λmax hemoglobin) ved bruk av et UV-Vis spektrofotometer.Den absolutte absorpsjonen av hemoglobin (AH(0)) i 0 min av 20 µl blod i 10 ml avionisert vann ble tatt som referansestandard.Det relative hemoglobinopptaket (RHA) av koagulert blod ble beregnet fra forholdet HA(t)/HA(0) ved bruk av samme blodmengde.
Ved å bruke en teksturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), ble NFRKs adhesive egenskaper til skadet vev bestemt.Trykk en sylindrisk form med åpen bunn mot innsiden av svineskinnet (uten fettlaget).Prøver (Ch NFRCS og Cp NFRCS) ble påført via kanyle i sylindriske former for å skape adhesjon til huden til grisen.Etter en 3 minutters inkubering ved romtemperatur (RT) (25°C), ble NFRCS-klebestyrken registrert ved en konstant hastighet på 0,5 mm/sek.
Hovedtrekket til kirurgiske tetningsmidler er å øke blodpropp samtidig som blodtap reduseres.Tapsfri koagulasjon i NFRCS ble evaluert ved hjelp av en tidligere publisert metode med små modifikasjoner 19 .Lag et mikrosentrifugerør (2 ml) (innvendig diameter 10 mm) med et 8 × 5 mm2 hull på den ene siden av sentrifugerøret (som representerer et åpent sår).NFRCS brukes til å lukke åpningen og tape brukes til å forsegle ytterkantene.Tilsett 20 µl 0,2 M CaCl2 til mikrosentrifugerøret som inneholder 3,8 % natriumsitrat-premix.Etter 10 minutter ble mikrosentrifugerørene fjernet fra skålene og økningen i massen til skålene ble bestemt på grunn av utstrømning av blod fra NFRK (n = 3).Blodtap Ch NFRCS og Cp NFRCS ble sammenlignet med Cs.
Våtintegriteten til NFRCS ble bestemt basert på metoden beskrevet av Mishra og Chaudhary21 med mindre modifikasjoner.Plasser NFRCS i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe med 50 ml vann og virvl i 60 s uten å danne en topp.Visuell inspeksjon og prioritering av prøver for fysisk integritet basert på innsamling.
Bindingsstyrken til HFFC til Ct ble studert ved bruk av tidligere publiserte metoder med mindre modifikasjoner.Overflatebeleggets integritet ble vurdert ved å eksponere NFRK for akustiske bølger (ekstern stimulus) i nærvær av milliQ vann (Ct).De utviklede NFRCS Ch NFRCS og Cp NFRCS ble plassert i et beger fylt med vann og sonikert i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 30 minutter.Etter tørking ble den prosentvise forskjellen mellom start- og sluttvekten til NFRCS brukt for å beregne prosent tap av materiale (HFFC).In vitro BCT støttet ytterligere bindingsstyrken eller tapet av overflatematerialer.Effektiviteten av HFFC-binding til Ct gir blodkoagulasjon og et elastisk belegg på overflaten av Ct22.
Homogeniteten til den utviklede NFRCS ble bestemt av BCT av prøver (30 mg) tatt fra tilfeldig utvalgte generelle steder i NFRCS.Følg den tidligere nevnte BCT-prosedyren for å fastslå NFRCS-samsvar.Nærhet mellom alle fem prøvene sikrer jevn overflatedekning og HFFC-avsetning i Ct-nettet.
Det nominelle blodkontaktområdet (NBCA) ble bestemt som tidligere rapportert med noen modifikasjoner.Koaguler blodet ved å klemme 20 µl blod mellom de to overflatene til Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs.Etter 1 time ble de to delene av stenten separert og man målte området av koaguleringen manuelt.Gjennomsnittsverdien av tre repetisjoner ble ansett som NBCA NFRCS19.
Dynamic Vapor Sorption (DVS)-analyse ble brukt for å evaluere effektiviteten til NFRCS for å absorbere vann fra det ytre miljøet eller fra skadestedet som er ansvarlig for å starte koagulering.DVS evaluerer eller registrerer dampopptaket og tapet i en prøve gravimetrisk ved å bruke en ultrasensitiv balanse med en masseoppløsning på ±0,1 µg.Et partielt damptrykk (relativ fuktighet) genereres av en elektronisk massestrømskontroller rundt prøven ved å blande mettede og tørre bæregasser. I henhold til retningslinjene for European Pharmacopeia, basert på prosentandelen av fuktighetsopptak av prøvene, ble prøvene kategorisert i 4 kategorier (0–0,012 % w/w– ikke-hygroskopiske, 0,2–2 % w/w svakt hygroskopiske, 2–15 % moderat hygroskopiske og > 15 % hygroskopiske %23). I henhold til retningslinjene for European Pharmacopeia, basert på prosentandelen av fuktighetsopptak i prøvene, ble prøvene kategorisert i 4 kategorier (0–0,012 % vekt/vekt- ikke-hygroskopiske, 0,2–2 % vekt/vekt lett hygroskopiske, 2–15 % moderat hygroskopiske og > 15 % hygroskopiske)23 %.I samsvar med anbefalingene fra European Pharmacopoeia, avhengig av prosentandelen av fuktighetsabsorpsjon av prøvene, ble prøvene delt inn i 4 kategorier (0–0,012 % w/w – ikke-hygroskopisk, 0,2–2 % w/w svakt hygroskopisk, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat hygroskopisk og > 15 % svært hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（鈁0-0,012% w/w-2% w/w. /w 轻微吸湿性、2–15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 刱＆为 .2% 0＆为.湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23.I samsvar med anbefalingene i den europeiske farmakopéen er prøvene delt inn i 4 klasser avhengig av prosentandelen fuktighet som absorberes av prøven (0-0,012 vekt-% – ikke-hygroskopisk, 0,2-2 vekt-% svakt hygroskopisk, 2-15 vekt-%).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat hygroskopisk, > 15 % svært hygroskopisk) 23.Den hygroskopiske effektiviteten til NFCS X NFCS og TsN NFCS ble bestemt på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA.Under denne prosessen ble kjøretid, relativ fuktighet (RH) og prøvevekt i sanntid ved 25°C24 oppnådd.Fuktighetsinnholdet beregnes ved nøyaktig NFRCS-masseanalyse ved å bruke følgende ligning:
MC er NFRCS-fuktighet.m1 – tørrvekt av NSAIDs.m2 er NFRCS-massen i sanntid ved en gitt RF.
Det totale overflatearealet ble estimert ved å bruke et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter tømming av prøvene ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Det totale overflatearealet ble estimert ved å bruke et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter tømming av prøvene ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азоперимента при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Det totale overflatearealet ble estimert ved å bruke et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空 样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计怂觯逢硝+25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азоц ов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Det totale overflatearealet ble estimert ved bruk av nitrogenadsorpsjonsforsøk med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt i 10 timer ved 25°C (< 7 x 10-3 torr).Totalt overflateareal, porevolum og NFRCS-porestørrelse ble bestemt med en Quantachrome fra NOVA 1000e, Østerrike ved bruk av RS 232-programvare.
Forbered 5 % RBC (saltvann som fortynningsmiddel) fra fullblod.Overfør deretter en alikvot av HFFC (0,25 ml) til en 96-brønners plate og 5 % RBC-masse (0,1 ml).Inkuber blandingen ved 37°C i 40 minutter.En blanding av røde blodlegemer og serum ble ansett som en positiv kontroll, og en blanding av saltvann og røde blodlegemer som en negativ kontroll.Hemagglutinasjon ble bestemt i henhold til Stajitzky-skalaen.De foreslåtte skalaene er som følger: + + + + tette granulære aggregater;+ + + glatte bunnputer med buede kanter;+ + glatte bunnputer med revne kanter;+ smale røde ringer rundt kantene på de glatte putene;– (negativ) diskret rød knapp 12 i midten av den nedre brønnen.
Hemokompatibiliteten til NFRCS ble studert i henhold til metoden til International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Den gravimetriske metoden beskrevet av Singh et al.Mindre modifikasjoner ble gjort for å vurdere trombedannelse i nærvær av eller på overflaten av NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS ble inkubert i fosfatbufret saltvann (PBS) i 24 timer ved 37°C.Etter 24 timer ble PBS fjernet og NFRCS ble behandlet med 2 ml blod inneholdende 3,8 % natriumsitrat.På overflaten av NFRCS, tilsett 0,04 ml 0,1 M CaCl2 til de inkuberte prøvene.Etter 45 minutter ble 5 ml destillert vann tilsatt for å stoppe koaguleringen.Koagulert blod på overflaten av NFRK ble behandlet med 36-38 % formaldehydløsning.Klumpene fiksert med formaldehyd ble tørket og veid.Prosentandelen av trombose ble estimert ved å beregne vekten av glasset uten blod og prøve (negativ kontroll) og glasset med blod (positiv kontroll).
Som en første bekreftelse ble prøvene visualisert under et optisk mikroskop for å forstå evnen til HFFC-overflatebelegget, Ct-sammenkoblet og Ct-nettverket til å danne porer.Tynne seksjoner av Ch og Cp fra NFRCS ble trimmet med et skalpellblad.Den resulterende delen ble plassert på et glassglass, dekket med et dekkglass, og kantene ble festet med lim.De forberedte lysbildene ble sett under et optisk mikroskop og fotografier ble tatt med forskjellige forstørrelser.
Polymeravsetning i Ct-nettverk ble visualisert ved bruk av fluorescensmikroskopi basert på metoden beskrevet av Rice et al.29. HFFC-sammensetningen som ble brukt for formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant), og NFRCS (Ch & Cp) ble fremstilt i henhold til metoden nevnt tidligere. HFFC-sammensetningen som ble brukt for formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant), og NFRCS (Ch & Cp) ble fremstilt i henhold til metoden nevnt tidligere.HFFC-sammensetningen som ble brukt for formulering ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant) og NFRCS (Ch og Cp) ble oppnådd i henhold til den tidligere nevnte metoden.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到缄方提到缄。CS（CFR将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到缄方提到缄。CS（CFRHFFC-sammensetningen brukt i formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (Amaranth) og mottok NFRCS (Ch og Cp), som nevnt tidligere.Tynne snitt av NFRK ble kuttet fra de oppnådde prøvene, lagt på glass og dekket med dekkglass.Observer de forberedte objektglassene under et fluorescerende mikroskop ved bruk av et grønt filter (310-380 nm).Bilder ble tatt med 4x forstørrelse for å forstå Ct-forhold og overflødig polymeravsetning i Ct-nettverket.
Overflatetopografien til NFRCS Ch og Cp ble bestemt ved å bruke et atomkraftmikroskop (AFM) med en ultraskarp TESP utkraging i tappemodus: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Overflateruhet ble bestemt ved root mean square (RMS) ved bruk av programvare (Scanning Probe Image Processor).Ulike NFRCS-plasseringer ble gjengitt på 3D-bilder for å sjekke overflateensartethet.Standardavviket til poengsummen for et gitt område er definert som overflateruheten.RMS-ligningen ble brukt til å kvantifisere overflateruheten til NFRCS31.
FESEM-baserte studier ble utført ved bruk av FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, for å forstå overflatemorfologien til Ch NFRCS og Cp NFRCS, som viste bedre BCT enn Cm NFRCS.FESEM-studien ble utført i henhold til metoden beskrevet av Zhao et al.32 med mindre modifikasjoner.NFRCS 20 til 30 mg Ch NFRCS og Cp NFRCS ble forhåndsblandet med 20 ul 3,8 % natriumsitrat forhåndsblandet med rotteblod.20 μl 0,2 M CaCl2 ble tilsatt de blodbehandlede prøvene for å sette i gang koagulering og prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter.I tillegg ble overflødige erytrocytter fjernet fra NFRCS-overflaten ved å skylle med saltvann.
Etterfølgende prøver ble behandlet med 0,1 % glutaraldehyd og deretter tørket i en varmluftovn ved 37°C for å fjerne fuktighet.De tørkede prøvene ble belagt og analysert 32 .Andre bilder oppnådd under analysen var koageldannelse på overflaten av individuelle bomullsfibre, polymeravsetning mellom Ct, erytrocyttmorfologi (form), koagelintegritet og erytrocyttmorfologi i nærvær av NFRCS.Ubehandlede NFRCS-områder og Ch- og Cp-behandlede NFRCS-områder inkubert med blod ble skannet for elementære ioner (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, sink, kobber og selen)33.Sammenlign andeler av elementære ioner mellom behandlede og ubehandlede prøver for å forstå akkumulering av elementære ioner under koageldannelse og koagelhomogenitet.
Tykkelsen av Cp HFFC-overflatebelegget på Ct-overflaten ble bestemt ved bruk av FESEM.Tverrsnittene av Cp NFRCS ble kuttet fra rammeverket og sputterbelagt.De resulterende sputterbeleggprøvene ble observert av FESEM og tykkelsen på overflatebelegget ble målt 34, 35, 36.
Røntgenmikro-CT gir høyoppløselig 3D ikke-destruktiv bildebehandling og lar deg studere det interne strukturelle arrangementet til NFRK.Micro-CT bruker en røntgenstråle som passerer gjennom prøven for å registrere den lokale lineære dempningskoeffisienten til røntgenstrålene i prøven, noe som hjelper til med å få morfologisk informasjon.Den interne plasseringen av Ct i Cp NFRCS og blodbehandlet Cp NFRCS ble undersøkt med mikro-CT for å forstå absorpsjonseffektivitet og blodpropp i nærvær av NFRCS37,38,39.3D-strukturene til blodbehandlede og ubehandlede Cp NFRCS-prøver ble rekonstruert ved bruk av mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland).Ved å bruke VG STUDIO-MAX programvareversjon 2.2 ble flere røntgenbilder tatt fra forskjellige vinkler (ideelt sett 360° dekning) for å utvikle 3D-bilder for NFRCS.De innsamlede projeksjonsdataene ble rekonstruert til 3D volumetriske bilder ved å bruke den tilsvarende enkle 3D ScanIP Academic-programvaren.
I tillegg, for å forstå fordelingen av koagel, ble 20 µl forhåndsblandet sitratblod og 20 µl 0,2 M CaCl2 tilsatt til NFRCS for å initiere blodkoagulering.De tilberedte prøvene får herde.NFRK-overflaten ble behandlet med 0,5 % glutaraldehyd og tørket i varmluftovn ved 30–40°C i 30 min.Blodproppen dannet på NFRCS ble skannet, rekonstruert og et 3D-bilde av blodproppen ble visualisert.
Antibakterielle analyser ble utført på Cp NFRCS (best sammenlignet med Ch NFRCS) ved bruk av den tidligere beskrevne metoden med mindre modifikasjoner.Den antibakterielle aktiviteten til Cp NFRCS og Cp HFFC ble bestemt ved å bruke tre forskjellige testmikroorganismer [S.aureus (gram-positive bakterier), E.coli (gram-negative bakterier) og hvit Candida (C.albicans)] som vokste på agar i petriskåler i en inkubator.Inokuler jevnt 50 ml av den fortynnede bakteriekultursuspensjonen i en konsentrasjon på 105-106 CFU ml-1 på agarmediet.Hell mediet i en petriskål og la det stivne.Brønner ble laget på overflaten av agarplaten for å fylle med HFFC (3 brønner for HFFC og 1 for negativ kontroll).Tilsett 200 µl HFFC til 3 brønner og 200 µl pH 7,4 PBS til den fjerde brønnen.På den andre siden av petriskålen, plasser en 12 mm Cp NFRCS-skive på den størknede agaren og fukt med PBS (pH 7,4).Ciprofloksacin, ampicillin og flukonazol tabletter regnes som referansestandarder for Staphylococcus aureus, Escherichia coli og Candida albicans.Mål hemningssonen manuelt og ta et digitalt bilde av hemningssonen.
Etter institusjonell etisk godkjenning ble studien utført ved Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i Sør-India.In vitro TEG-eksperimentprotokollen er gjennomgått og godkjent av den institusjonelle etiske komiteen ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Forsøkspersonene ble rekruttert fra frivillige blodgivere (i alderen 18 til 55 år) fra sykehusets blodbank.I tillegg ble det innhentet et informert samtykkeskjema fra de frivillige for innsamling av blodprøver.Native TEG (N-TEG) ​​ble brukt til å studere effekten av Cp HFFC-formuleringen på fullblod forhåndsblandet med natriumcitrat.N-TEG er allment anerkjent for sin rolle i gjenoppliving på stedet, noe som skaper problemer for klinikere på grunn av potensialet for klinisk signifikant forsinkelse i resultater (rutinemessige koagulasjonstester).N-TEG-analyse ble utført ved bruk av fullblod.Informert samtykke og detaljert sykehistorie ble innhentet fra alle deltakerne.Studien inkluderte ikke deltakere med hemostatiske eller trombotiske komplikasjoner som graviditet/postpartum eller leversykdom.Forsøkspersoner som tok legemidler som påvirker koagulasjonskaskaden ble også ekskludert fra studien.Grunnleggende laboratorietester (hemoglobin, protrombintid, aktivert tromboplastin og antall blodplater) ble utført på alle deltakerne i henhold til standardprosedyrer.N-TEG bestemmer blodproppviskoelastisitet, initial koagelstruktur, partikkelinteraksjon, koagelforsterkning og koagellyse.N-TEG-analysen gir grafiske og numeriske data om de kollektive effektene av flere cellulære elementer og plasma.N-TEG-analyse ble utført på to forskjellige volumer av Cp HFFC (10 µl og 50 µl).Som et resultat ble 1 ml fullblod med sitronsyre tilsatt 10 μl Cp HFFC.Tilsett 1 ml (Cp HFFC + sitratblod), 340 µl blandet blod til 20 µl 0,2 M CaCl2-holdig TEG-skål.Deretter ble TEG-skåler lastet inn i TEG® 5000, US for å måle R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % av blodprøvene i nærvær av Cp HFFC41.
In vivo-studieprotokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med anbefalingene fra komiteen for kontroll og tilsyn med dyreforsøk (CPCSEA).Alle in vivo NFRCS-studier (2 × 2 cm2) ble utført på Wistar hunnrotter (vekt 200 til 250 g).Alle dyrene ble akklimatisert ved en temperatur på 24-26°C, dyrene hadde fri tilgang til standard mat og vann ad libitum.Alle dyrene ble tilfeldig delt inn i ulike grupper, hver gruppe besto av tre dyr.Alle studier ble utført i samsvar med dyrestudier: rapport om in vivo-eksperimenter 43 .Før studien ble dyrene bedøvet ved intraperitoneal (ip) administrering av en blanding av 20-50 mg ketamin (per 1 kg kroppsvekt) og 2-10 mg xylazin (per 1 kg kroppsvekt).Etter studien ble blødningsvolumet beregnet ved å evaluere forskjellen mellom start- og sluttvekten av prøvene, gjennomsnittsverdien oppnådd fra de tre testene ble tatt som prøvens blødningsvolum.
Rottehaleamputasjonsmodellen ble implementert for å forstå potensialet til NFRCS for å modulere blødning i traumer, kamp eller trafikkulykker (skademodell).Klipp av 50 % av halen med et skalpellblad og plasser i luften i 15 s for å sikre normal blødning.I tillegg ble testprøver plassert på halen til en rotte ved å påføre trykk (Ct, Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS).Blødning og PCT ble rapportert for testprøver (n = 3)17,45.
Effektiviteten av NFRCS-trykkkontroll i kamp ble undersøkt på en modell av den overfladiske lårarterien.Lårarterien eksponeres, punkteres med en 24G trokar og bløder innen 15 sekunder.Etter at ukontrollert blødning er observert, plasseres testprøven på stikkstedet med trykk påført.Umiddelbart etter påføring av testprøven ble koaguleringstiden registrert og hemostatisk effektivitet ble observert i de neste 5 minuttene.Den samme prosedyren ble gjentatt med Cs og Ct46.
Dowling et al.47 foreslo en leverskademodell for å vurdere det hemostatiske potensialet til hemostatiske materialer i sammenheng med intraoperativ blødning.BCT ble registrert for Ct-prøver (negativ kontroll), Cs-rammeverk (positiv kontroll), Ch NFRCS-prøver og Cp NFRCS-prøver.Den suprahepatiske vena cava til rotten ble eksponert ved å utføre en median laparotomi.Etter det ble den distale delen av venstre lapp kuttet ut med saks.Lag et snitt i leveren med et skalpellblad og la det blø i noen sekunder.Nøyaktig veide Ch NFRCS og Cp NFRCS testprøver ble plassert på den skadede overflaten uten noe positivt trykk og BCT ble registrert.Kontrollgruppen (Ct) påførte deretter press etterfulgt av Cs 30 s47 uten å bryte skaden.
In vivo sårhelingsanalyser ble utført ved bruk av en eksisjonssårmodell for å evaluere sårhelingsegenskapene til de utviklede polymerbaserte NFRCS-ene.Modeller av eksisjonssår ble valgt og utført i henhold til tidligere publiserte metoder med mindre modifikasjoner19,32,48.Alle dyr ble bedøvet som tidligere beskrevet.Bruk en biopsistanse (12 mm) for å lage et sirkulært dypt snitt i huden på ryggen.Forberedte sårsteder ble kledd med Cs (positiv kontroll), Ct (som erkjenner at bomullsputer forstyrrer tilheling), Ch NFRCS og Cp NFRCS (eksperimentell gruppe) og en negativ kontroll uten noen behandling.På hver dag av studien ble sårområdet målt i alle rotter.Bruk et digitalkamera til å ta et bilde av sårområdet og ta på en ny bandasje.Prosentandelen av sårlukking ble målt med følgende formel:
Basert på prosentandelen av sårlukking på den 12. dagen av studien, ble rottehuden til den beste gruppen skåret ut ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) og studert ved H&E-farging og Massons trikromfarging. Basert på prosentandelen av sårlukking på den 12. dagen av studien, ble rottehuden til den beste gruppen skåret ut ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) og studert ved H&E-farging og Massons trikromfarging.Basert på prosentandelen av sårlukking på 12. dag av studien, ble huden til rottene i den beste gruppen ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) skåret ut og undersøkt ved farging med hematoksylin-eosin og Massons trikrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雤嚌的大雤硌Main三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雤嚌的大雤嚌的大雤皌眳组）Rotter i den beste gruppen ((Cp NFRCS) og kontrollgruppene) ble skåret ut for hematoxylin-eosin-farging og Massons trikrom-farging basert på prosent sårlukking på dag 12 av studien.Den implementerte fargingsprosedyren ble utført i henhold til tidligere beskrevne metoder49,50.Kort fortalt, etter fiksering i 10 % formalin, ble prøvene dehydrert ved bruk av en serie graderte alkoholer.Bruk en mikrotom for å få tynne deler (5 µm tykke) av det utskårne vevet.Tynne seriesnitt av kontroller og Cp NFRCS ble behandlet med hematoxylin og eosin for å studere histopatologiske endringer.Massons trikromfarge ble brukt til å oppdage dannelsen av kollagenfibriller.Resultatene som ble oppnådd ble blindt studert av patologer.
Stabiliteten til Cp NFRCS-prøver ble studert ved romtemperatur (25 °C ± 2 °C/60 % RH ± 5 %) i 12 måneder51.Cp NFRCS (overflatemisfarging og mikrobiell vekst) ble visuelt inspisert og testet for foldslitasjemotstand og BCT i henhold til metodene ovenfor skissert i avsnittet Materialer og metoder.
Skalerbarheten og reproduserbarheten til Cp NFRCS ble undersøkt ved å lage Cp NFRCS med en størrelse på 15×15 cm2.I tillegg ble 30 mg prøver (n = 5) skåret ut fra forskjellige Cp NFRCS-fraksjoner og BCT for de studerte prøvene ble evaluert som beskrevet tidligere i Metode-delen.
Vi har forsøkt å utvikle forskjellige former og strukturer ved å bruke Cp NFRCS-sammensetninger for forskjellige biomedisinske anvendelser.Slike former eller konfigurasjoner inkluderer koniske vattpinner for neseblod, tannprosedyrer og sylindriske vattpinner for vaginal blødning.
Alle datasett er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik og ble analysert med ANOVA ved bruk av Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) etterfulgt av Bonferronis multiple sammenligningstest (*p<0,05).
Alle prosedyrer utført i menneskelige studier var i samsvar med standardene til instituttet og det nasjonale forskningsrådet, samt Helsinki-erklæringen 1964 og dens påfølgende endringer, eller lignende etiske standarder.Alle deltakerne ble informert om egenskapene til studien og dens frivillige natur.Deltakerdata forblir konfidensielle når de er samlet inn.In vitro TEG-eksperimentprotokollen er gjennomgått og godkjent av den institusjonelle etiske komiteen ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Frivillige signerte informert samtykke til å ta blodprøver.
Alle prosedyrer utført i dyrestudier ble utført i samsvar med Kastuba Fakultet for medisin, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle dyreforsøk designet ble utført i samsvar med retningslinjene til komiteen for kontroll og tilsyn med dyreforsøk (CPCSEA).Alle forfattere følger ARRIVE-retningslinjene.
FTIR-spektrene til alle NFRCS ble analysert og sammenlignet med kitosanspekteret vist i figur 2A.Karakteristiske spektrale topper av kitosan (registrert) ved 3437 cm-1 (OH- og NH-strekking, overlapping), 2945 og 2897 cm-1 (CH-strekking), 1660 cm-1 (NH2-stamme), 1589 cm-1 (N-H-bøyning ), 1157 cm-1 C (brostrekning 6,7 cm-1 C), 1157 cm-1 C hydroksyl), 993 cm-1 (strekk CO, Bo-OH) 52.53.54.Tilleggstabell S1 viser FTIR NFRCS absorpsjonsspektrumverdier for kitosan (reporter), ren kitosan, Cm, Ch og Cp.FTIR-spektrene til alle NFRCS (Cm, Ch og Cp) viste de samme karakteristiske absorpsjonsbåndene som rent kitosan uten noen signifikante endringer (fig. 2A).FTIR-resultatene bekreftet fraværet av kjemiske eller fysiske interaksjoner mellom polymerene som ble brukt til å utvikle NFRCS, noe som indikerer at polymerene som brukes er inerte.
In vitro karakterisering av Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs.(A) representerer de kombinerte FTIR-spektrene til sammensetningene av kitosan og Cm NFRCS, Ch NFRCS og Cp NFRCS under kompresjon.(B) a) Fullblodsopptakshastighet av NFRCS Cm, Ch, Cp og Cg (n = 3);Ct-prøvene viste en høyere BAR fordi bomullspinnen har en høyere absorpsjonseffektivitet;b) Blod etter blodabsorpsjon Illustrasjon av den absorberte prøven.Grafisk representasjon av BCT for testprøve C (Cp NFRCS hadde den beste BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E og G ble vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​feilstrekene representerer SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E og G ble vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​feilstrekene representerer SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляю *** 0,0001. Data i C, D, E og G presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik, og feilstolper representerer standardavvik, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предютставля*** p <0,0001. Data i C, D, E og G vises som gjennomsnitt ± standardavvik, feilstolper representerer standardavvik, ***p<0,0001.