Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Fuglers fruktbarhet avhenger av deres evne til å lagre nok levedyktig sæd over lengre tid i sædlagringsrørene (SST). Den nøyaktige mekanismen som sædcellene går inn i, oppholder seg i og forlater SST-en gjennom, er fortsatt kontroversiell. Sædcellene fra sharkasi-høner viste en høy tendens til agglutinasjon, og dannet mobile, filamentøse bunter som inneholdt mange celler. På grunn av vanskeligheten med å observere sædcellenes bevegelighet og oppførsel i en ugjennomsiktig eggleder, brukte vi en mikrofluidisk enhet med et mikrokanaltverrsnitt som ligner på sædcellenes for å studere sædcellenes agglutinasjon og bevegelighet. Denne studien diskuterer hvordan sædcellebunter dannes, hvordan de beveger seg, og deres mulige rolle i å forlenge sædcellenes opphold i SST-en. Vi undersøkte sædcellenes hastighet og reologiske oppførsel når væskestrøm ble generert i en mikrofluidisk kanal ved hydrostatisk trykk (strømningshastighet = 33 µm/s). Sædcellene har en tendens til å svømme mot strømmen (positiv reologi), og hastigheten til sædcellebunten er betydelig redusert sammenlignet med enkeltsædceller. Det er observert at sædbunter beveger seg i en spiral og øker i lengde og tykkelse etter hvert som flere enkeltsædceller rekrutteres. Sædbunter ble observert som nærmet seg og festet seg til sideveggene til de mikrofluidiske kanalene for å unngå å bli feid med en væskestrømningshastighet > 33 µm/s. Sædbunter ble observert som nærmet seg og festet seg til sideveggene til de mikrofluidiske kanalene for å unngå å bli feid med en væskestrømningshastighet > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Det er observert at sædbunter nærmer seg og fester seg til sideveggene i mikrofluidkanalene for å unngå å bli feid bort ved væskestrømningshastigheter >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, микрожидкостног избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Det er observert at sædbunter nærmer seg og fester seg til sideveggene i den mikrofluidiske kanalen for å unngå å bli feid bort av væskestrømmen ved >33 µm/s.Skannings- og transmisjonselektronmikroskopi viste at sædbuntene ble støttet av rikelig med tett materiale. Dataene som ble innhentet demonstrerer den unike mobiliteten til Sharkazi-kyllingsædceller, samt spermatozoenes evne til å agglutinere og danne mobile bunter, noe som bidrar til en bedre forståelse av langtidslagring av spermatozoer i SMT.
For å oppnå befruktning hos mennesker og de fleste dyr, må sædceller og egg ankomme befruktningsstedet til rett tid. Derfor må paring skje før eller på eggløsningstidspunktet. På den annen side lagrer noen pattedyr, som hunder, så vel som ikke-pattedyrarter, som insekter, fisk, reptiler og fugler, sædceller i reproduksjonsorganene sine over lengre tid inntil eggene deres er klare for befruktning (asynkron befruktning 1 ). Fugler er i stand til å opprettholde levedyktigheten til sædceller som er i stand til å befrukte egg i 2–10 uker 2 .
Dette er en unik egenskap som skiller fugler fra andre dyr, ettersom den gir høy sannsynlighet for befruktning etter én enkelt inseminasjon i flere uker uten samtidig paring og eggløsning. Det viktigste sædlagringsorganet, kalt sædlagringstubuli (SST), ligger i de indre slimhinnefoldene ved uterovaginalforbindelsen. Til dags dato er mekanismene som sædceller bruker for å komme inn i, oppholde seg i og forlate sædbanken ikke fullt ut forstått. Basert på tidligere studier har mange hypoteser blitt fremmet, men ingen av dem har blitt bekreftet.
Forman4 antok at sædcellene opprettholder sin tilholdssted i SST-hulrommet gjennom kontinuerlig oscillerende bevegelse mot væskestrømmens retning gjennom proteinkanaler lokalisert på SST-epitelceller (reologi). ATP tømmes på grunn av den konstante flagellære aktiviteten som er nødvendig for å holde sædcellene i SST-lumen, og motiliteten avtar til slutt inntil sædcellene føres ut av sædbanken av væskestrøm og begynner en ny reise ned den stigende egglederen for å befrukte sædcellene. Egget (Forman4). Denne modellen for sædlagring støttes av deteksjon ved hjelp av immunocytokjemi av akvaporiner 2, 3 og 9 som er tilstede i SST-epitelceller. Til dags dato mangler studier på kyllingsædreologi og dens rolle i SST-lagring, vaginal sædseleksjon og sædkonkurranse. Hos kyllinger kommer sædcellene inn i skjeden etter naturlig paring, men mer enn 80 % av sædcellene kastes ut av skjeden kort tid etter paring. Dette antyder at skjeden er det primære stedet for sædseleksjon hos fugler. I tillegg har det blitt rapportert at mindre enn 1 % av sædcellene som befruktes i skjeden ender opp i SST-er2. Ved kunstig inseminasjon av kyllinger i skjeden, har antallet sædceller som når SST en tendens til å øke 24 timer etter inseminasjon. Så langt er mekanismen for sædseleksjon under denne prosessen uklar, og sædmotilitet kan spille en viktig rolle i sædopptaket i SST. På grunn av de tykke og ugjennomsiktige veggene i egglederne er det vanskelig å direkte overvåke sædmotiliteten i egglederne hos fugler. Derfor mangler vi grunnleggende kunnskap om hvordan sædceller overgår til SST etter befruktning.
Reologi har nylig blitt anerkjent som en viktig faktor som kontrollerer sædtransport i pattedyrs kjønnsorganer. Basert på bevegelige sædcellers evne til å migrere motstrøms, brukte Zaferani et al. et corra-mikrofluidisk system for å passivt isolere bevegelige sædceller fra innlagte sædprøver. Denne typen sædsortering er viktig for medisinsk infertilitetsbehandling og klinisk forskning, og er foretrukket fremfor tradisjonelle metoder som er tids- og arbeidskrevende og kan kompromittere sædmorfologi og strukturell integritet. Imidlertid er det til dags dato ikke utført studier på effekten av sekreter fra kyllingers kjønnsorganer på sædmotilitet.
Uavhengig av mekanismen som opprettholder sædcellene lagret i SST, har mange forskere observert at residente sædceller agglutinerer hode mot hode i SST hos kyllinger 9, 10, vaktler 2 og kalkuner 11 for å danne agglutinerte sædbunter. Forfatterne antyder at det er en sammenheng mellom denne agglutinasjonen og langtidslagring av sædceller i SST.
Tingari og Lake12 rapporterte en sterk sammenheng mellom sædceller i kyllingens sædmottakskjertel og stilte spørsmål ved om fuglesædceller agglutinerer på samme måte som pattedyrsædceller. De mener at de dype forbindelsene mellom sædceller i sædlederen kan skyldes stresset forårsaket av tilstedeværelsen av et stort antall sædceller på et lite område.
Når man evaluerer sædcellenes oppførsel på ferske, hengende objektglass, kan man se forbigående tegn på agglutinasjon, spesielt i kantene av sæddråpene. Agglutinasjonen ble imidlertid ofte forstyrret av rotasjonsbevegelsen forbundet med kontinuerlig bevegelse, noe som forklarer den forbigående naturen til dette fenomenet. Forskerne la også merke til at når fortynningsmiddelet ble tilsatt sæden, dukket det opp langstrakte "trådlignende" celleaggregater.
Tidlige forsøk på å etterligne en spermatozoon ble gjort ved å fjerne en tynn tråd fra en hengende dråpe, noe som resulterte i en langstrakt, sædlignende vesikkel som stakk ut fra sæddråpen. Spermatozoene stilte seg umiddelbart opp parallelt i vesikelen, men hele enheten forsvant raskt på grunn av 3D-begrensningen. For å studere spermatozoagglutinasjon er det derfor nødvendig å observere spermatozoenes bevegelighet og oppførsel direkte i isolerte sædlagringstubuli, noe som er vanskelig å oppnå. Derfor er det nødvendig å utvikle et instrument som etterligner spermatozoer for å støtte studier av sædmotilitet og agglutinasjonsatferd. Brillard et al.13 rapporterte at gjennomsnittslengden på sædlagringstubuli hos voksne kyllinger er 400–600 µm, men noen sædstubber kan være så lange som 2000 µm. Mero og Ogasawara14 delte sædkjertlene inn i forstørrede og ikke-forstørrede sædlagringstubuli, som begge var like lange (~500 µm) og halsbredde (~38 µm), men den gjennomsnittlige lumendiameteren til tubulene var henholdsvis 56,6 og 56,6 µm, og 11,2 µm. I den nåværende studien brukte vi en mikrofluidisk enhet med en kanalstørrelse på 200 µm × 20 µm (B × H), hvis tverrsnitt er noe nært det for den amplifiserte SST-en. I tillegg undersøkte vi sædmotilitet og agglutinasjonsatferd i strømmende væske, noe som er i samsvar med Foremans hypotese om at væske produsert av SST-epitelceller holder sædcellene i lumen i en motstrøms (reologisk) retning.
Målet med denne studien var å overvinne problemene med å observere sædcellenes bevegelighet i egglederen og å unngå vanskelighetene med å studere sædcellenes reologi og oppførsel i et dynamisk miljø. En mikrofluidisk enhet ble brukt som skaper hydrostatisk trykk for å simulere sædcellenes bevegelighet i kjønnsorganene til en kylling.
Da en dråpe av en fortynnet sædprøve (1:40) ble lastet inn i mikrokanalenheten, kunne to typer sædmotilitet identifiseres (isolert sæd og bundet sæd). I tillegg hadde sædcellene en tendens til å svømme mot strømmen (positiv reologi; video 1, 2). Selv om sædbunter hadde lavere hastighet enn enslige sædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen sædceller som viste positiv reotaksi (p < 0,001; tabell 2). Selv om sædbunter hadde lavere hastighet enn enslige sædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen sædceller som viste positiv reotaksi (p < 0,001; tabell 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливенич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Selv om spermatozoabuntene hadde en lavere hastighet enn hastigheten til enkeltsædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen spermatozoer som viste positiv reotaksi (p < 0,001; tabell 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 昧 倧倲 示 逳百分比 （p <0,001； 2。。。。。。））))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичив сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Selv om hastigheten til sædbuntene var lavere enn for enkeltsædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen spermatozoer med positiv reologi (p < 0,001; tabell 2).Positiv reologi for enkeltsædceller og tufter er estimert til henholdsvis omtrent 53 % og 85 %.
Det har blitt observert at sædcellene til sharkashikyllinger umiddelbart etter ejakulasjon danner lineære bunter, bestående av dusinvis av individer. Disse tuftene øker i lengde og tykkelse over tid og kan forbli in vitro i flere timer før de forsvinner (video 3). Disse filamentøse buntene er formet som echidna-spermatozoer som dannes på enden av bitestikkelen. Sharkashi-hønesæd har vist seg å ha en høy tendens til å agglutinere og danne en nettformet bunt på mindre enn ett minutt etter innsamling. Disse strålene er dynamiske og i stand til å feste seg til nærliggende vegger eller statiske gjenstander. Selv om sædcellebunter reduserer hastigheten til sædcellene, er det tydelig at de makroskopisk øker lineariteten deres. Lengden på buntene varierer avhengig av antall sædceller samlet i buntene. To deler av bunten ble isolert: den første delen, inkludert det frie hodet til den agglutinerte sædcellen, og den terminale delen, inkludert halen og hele den distale enden av sædcellen. Ved hjelp av et høyhastighetskamera (950 fps) ble frie hoder av agglutinerte spermatozoer observert i den første delen av bunten. Disse hodene var ansvarlige for buntens bevegelse på grunn av deres oscillerende bevegelse, og trakk de resterende inn i bunten med en spiralbevegelse (Video 4). I lange tufter har det imidlertid blitt observert at noen frie sædhoder festet seg til kroppen, og den ende delen av tuften fungerer som vinger for å hjelpe til med å drive tuften fremover.
Mens sædcellene er i en langsom væskestrøm, beveger de seg parallelt med hverandre, men de begynner å overlappe hverandre og feste seg til alt som står stille, slik at de ikke blir vasket bort av strømmen når strømningshastigheten øker. Buntene dannes når en håndfull sædceller nærmer seg hverandre. De begynner å bevege seg synkront og vikles rundt hverandre, og fester seg deretter til et klebrig stoff. Figur 1 og 2 viser hvordan sædcellene nærmer seg hverandre og danner et knutepunkt når halene vikles rundt hverandre.
Forskerne brukte hydrostatisk trykk for å skape væskestrøm i en mikrokanal for å studere sædreologi. En mikrokanal med en størrelse på 200 µm × 20 µm (B × H) og en lengde på 3,6 µm ble brukt. Det ble brukt mikrokanaler mellom beholdere med sprøyter montert i endene. Konditorfarge ble brukt for å gjøre kanalene mer synlige.
Knyt sammenkoblingskabler og tilbehør til veggen. Videoen ble tatt med et fasekontrastmikroskop. Med hvert bilde presenteres fasekontrastmikroskopi- og kartleggingsbilder. (A) Forbindelsen mellom to strømmer motstår strømningen på grunn av spiralbevegelse (rød pil). (B) Forbindelsen mellom rørbunten og kanalveggen (røde piler), samtidig som de er koblet til to andre bunter (gule piler). (C) Sædbunter i den mikrofluidiske kanalen begynner å koble seg til hverandre (røde piler) og danner et nett av sædbunter. (D) Dannelse av et nettverk av sædbunter.
Da en dråpe fortynnet sæd ble lastet inn i den mikrofluidiske enheten og en strøm ble opprettet, ble det observert at sædstrålen beveget seg mot strømningsretningen. Buntene sitter tett inntil veggene i mikrokanalene, og de frie hodene i den første delen av buntene sitter tett inntil dem (video 5). De fester seg også til eventuelle stasjonære partikler i veien, for eksempel rusk, for å motstå å bli feid bort av strømmen. Over tid blir disse tuftene til lange filamenter som fanger andre enkeltsædceller og kortere tufter (video 6). Etter hvert som strømningen begynner å avta, begynner lange linjer med sædceller å danne et nettverk av sædlinjer (video 7; figur 2).
Ved høy strømningshastighet (V > 33 µm/s) økes spiralbevegelsene til trådene som et forsøk på å fange mange individuelle sæddannende bunter for bedre å motstå strømningens drivende kraft. Ved høy strømningshastighet (V > 33 µm/s) økes spiralbevegelsene til trådene som et forsøk på å fange mange individuelle sæddannende bunter for bedre å motstå strømningens drivende kraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. Ved høye strømningshastigheter (V > 33 µm/s) øker trådenes spiralbevegelser når de prøver å fange mange individuelle sædceller og danne bunter som er bedre i stand til å motstå strømningens drivende kraft.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缾坟 形成 徍从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захть отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ved høye strømningshastigheter (V > 33 µm/s) øker filamentenes spiralbevegelse i et forsøk på å fange opp mange individuelle spermatozoer som danner bunter for bedre å motstå strømningens drivkrefter.De prøvde også å feste mikrokanaler til sideveggene.
Sædbunter ble identifisert som klynger av sædhoder og krøllete haler ved hjelp av lysmikroskopi (LM). Sædbunter med forskjellige aggregater har også blitt identifisert som vridde hoder og flagellære aggregater, flere sammenvokste sædhaler, sædhoder festet til en hale, og sædhoder med bøyde kjerner som flere sammenvokste kjerner. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Skanningselektronmikroskopi (SEM) viste at sædbuntene var omsluttende aggregater av sædhoder, og sædaggregatene viste et festet nettverk av innpakkede haler.
Morfologien og ultrastrukturen til spermatozoer, dannelsen av spermatozoabunter ble studert ved hjelp av lysmikroskopi (halvsnitt), skanningselektronmikroskopi (SEM) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), sædutstryk ble farget med akridinoransje og undersøkt ved hjelp av epifluorescensmikroskopi.
Sædprøvefarging med akridinoransje (fig. 3B) viste at sædhodene var limt sammen og dekket med sekretorisk materiale, noe som førte til dannelsen av store tufter (fig. 3D). Sædbuntene besto av sædaggregater med et nettverk av festede haler (fig. 4A-C). Sædbuntene er satt sammen av halene til mange sædceller som er limt sammen (fig. 4D). Hemmeligheter (fig. 4E, F) dekket hodene til sædcellebuntene.
Dannelse av spermatozoabunten Ved bruk av fasekontrastmikroskopi og sædutstryk farget med akridinoransje viste det seg at hodene på spermatozoene kleber seg sammen. (A) Tidlig dannelse av sædtuster begynner med en sædcelle (hvit sirkel) og tre sædceller (gul sirkel), med spiralen som starter ved halen og slutter ved hodet. (B) Fotomikrografi av et sædutstryk farget med akridinoransje som viser vedhengende sædcellehoder (piler). Utskillelsen dekker hodet/hodene. Forstørrelse × 1000. (C) Utvikling av en stor stråle transportert av strømning i en mikrofluidisk kanal (ved bruk av et høyhastighetskamera ved 950 fps). (D) Mikrograf av et sædutstryk farget med akridinoransje som viser store tuer (piler). Forstørrelse: ×200.
Skanningselektronmikrografi av en sædstråle og et sæduttrekk farget med akridinoransje. (A, B, D, E) er digitale fargeskanningselektronmikrografier av sædceller, og C og F er mikrografer av akridinoransje-fargede sæduttrekk som viser feste av flere sædceller som omslutter haleveven. (AC) Sædaggregater vises som et nettverk av festede haler (piler). (D) Adhesjon av flere sædceller (med klebende stoff, rosa omriss, pil) som omslutter halen. (E og F) Sædhodeaggregater (pekere) dekket med klebende materiale (pekere). Sædcellene dannet bunter med flere virvellignende strukturer (F). (C) ×400 og (F) ×200 forstørrelser.
Ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi fant vi at sædbuntene hadde festede haler (fig. 6A, C), hoder festet til haler (fig. 6B) eller hoder festet til haler (fig. 6D). Hodene til sædcellene i bunten er buede, og presenteres i snitt to kjerneområder (fig. 6D). I snittbunten hadde sædcellene et vridd hode med to kjerneområder og flere flagellære områder (fig. 5A).
Digitalt fargeelektronmikrografi som viser de sammenkoblede halene i sædcellebunten og det agglutinerende materialet som forbinder sædcellehodene. (A) Festet hale av et stort antall sædceller. Legg merke til hvordan halen ser ut i både portrett- (pil) og landskaps- (pil) projeksjoner. (B) Sædcellens hode (pil) er koblet til halen (pil). (C) Flere sædcellehaler (piler) er festet. (D) Agglutinasjonsmateriale (AS, blått) forbinder fire sædcellehoder (lilla).
Skanningselektronmikroskopi ble brukt til å detektere sædhoder i sædbunter dekket med sekreter eller membraner (figur 6B), noe som indikerer at sædbuntene var forankret av ekstracellulært materiale. Det agglutinerte materialet var konsentrert i sædhodet (manethodelignende samling; figur 5B) og ekspanderte distalt, noe som ga et strålende gult utseende under fluorescensmikroskopi når det ble farget med akridinoransje (figur 6C). Dette stoffet er tydelig synlig under et skanningsmikroskop og regnes som et bindemiddel. Halvtynne snitt (figur 5C) og sæduttrykk farget med akridinoransje viste sædbunter som inneholdt tettpakkede hoder og krøllete haler (figur 5D).
Ulike fotomikrografer som viser aggregering av sædhoder og brettede haler ved bruk av ulike metoder. (A) Tverrsnitts digitalt fargetransmisjonselektronmikrografi av en sædcellebunt som viser et kveilet sædhode med en todelt kjerne (blå) og flere flagellære deler (grønn). (B) Digitalt fargeskanningselektronmikrografi som viser en klynge av manetlignende sædhoder (piler) som ser ut til å være dekket. (C) Halvtynt snitt som viser aggregerte sædhoder (piler) og krøllete haler (piler). (D) Mikrograf av et sæduttrykk farget med akridinoransje som viser aggregater av sædhoder (piler) og krøllete, vedhengende haler (piler). Merk at et klebrig stoff (S) dekker hodet til sædcellen. (D) × 1000 forstørrelse.
Ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (fig. 7A) ble det også observert at sædhodene var vridd og at kjernene hadde en spiralform, noe som ble bekreftet av sædutstryk farget med akridinoransje og undersøkt ved hjelp av fluorescensmikroskopi (fig. 7B).
(A) Digitalt fargetransmisjonselektronmikrografi og (B) Akridinoransjefarget sæduttrekk som viser kveilede hoder og feste av sædhoder og -haler (piler). (B) × 1000 forstørrelse.
Et interessant funn er at Sharkazis sædceller aggregerer og danner mobile, filamentøse bunter. Egenskapene til disse buntene lar oss forstå deres mulige rolle i absorpsjon og lagring av sædceller i sædcellene.
Etter paring går sædcellene inn i skjeden og gjennomgår en intens seleksjonsprosess, noe som resulterer i at bare et begrenset antall sædceller kommer inn i SST15,16. Til dags dato er mekanismene som sædceller går inn i og ut av SST gjennom uklare. Hos fjørfe lagres sædceller i SST i en lengre periode på 2 til 10 uker, avhengig av art6. Det er fortsatt uenighet om sædens tilstand under lagring i SST. Er de i bevegelse eller i ro? Med andre ord, hvordan opprettholder sædcellene sin posisjon i SST så lenge?
Forman4 antydet at SST-residens og -utstøting kunne forklares med sædmotilitet. Forfatterne antar at sædceller opprettholder sin posisjon ved å svømme mot væskestrømmen skapt av SST-epitelet, og at sædceller kastes ut fra SST når hastigheten deres faller under punktet der de begynner å bevege seg bakover på grunn av mangel på energi. Zaniboni5 bekreftet tilstedeværelsen av akvaporiner 2, 3 og 9 i den apikale delen av SST-epitelceller, noe som indirekte kan støtte Foremans sædlagringsmodell. I den nåværende studien fant vi at nesten halvparten av Sharkashis sædceller viser positiv reologi i den strømmende væsken, og at agglutinerte sædbunter øker antallet sædceller som viser positiv reologi, selv om agglutinasjon bremser dem. Hvordan sædceller beveger seg opp i fuglens eggleder til befruktningsstedet er ikke fullt ut forstått. Hos pattedyr tiltrekker follikulærvæsken seg sædceller som cellegift. Imidlertid antas det at kjemoattraktanter styrer spermatozoer mot lange avstander7. Derfor er andre mekanismer ansvarlige for sædtransport. Sædcellenes evne til å orientere seg og strømme mot eggledervæsken som frigjøres etter paring, har blitt rapportert å være en viktig faktor for å målrette sædceller hos mus. Parker17 foreslo at spermatozoer krysser egglederne ved å svømme mot ciliærstrømmen hos fugler og reptiler. Selv om det ikke har blitt eksperimentelt demonstrert hos fugler, var Adolphi18 den første som fant at fuglesæd gir positive resultater når et tynt lag med væske mellom et dekkglass og et objektglass lages med en strimmel filterpapir. Reologi. Hino og Yanagimachi [19] plasserte et museeggstokk-tubal-livmor-kompleks i en perfusjonsring og injiserte 1 µl blekk i isthmus for å visualisere væskestrømmen i egglederne. De la merke til en veldig aktiv bevegelse av sammentrekning og avslapning i egglederen, der alle blekkkulene beveget seg jevnt mot egglederampullen. Forfatterne understreker viktigheten av at væsken i egglederne strømmer fra de nedre til de øvre egglederne for sædcellenes løft og befruktning. Brillard20 rapporterte at hos kyllinger og kalkuner migrerer sædcellene ved aktiv bevegelse fra vaginalinngangen, hvor de lagres, til den utero-vaginale overgangen, hvor de lagres. Denne bevegelsen er imidlertid ikke nødvendig mellom den utero-vaginale overgangen og infundibulum fordi sædcellene transporteres ved passiv forskyvning. Kjent med disse tidligere anbefalingene og resultatene oppnådd i den nåværende studien, kan det antas at sædcellenes evne til å bevege seg oppstrøms (reologi) er en av egenskapene som seleksjonsprosessen er basert på. Dette bestemmer spermatozoers passasje gjennom vaginaen og deres inntreden i CCT for lagring. Som Forman4 antydet, kan dette også legge til rette for at sædcellene kommer inn i SST og dens habitat i en periode, og deretter forlater den når hastigheten begynner å avta.
På den annen side antydet Matsuzaki og Sasanami21 at fuglespermatozoer gjennomgår motilitetsendringer fra dvale til motilitet i de hannlige og hunnlige reproduksjonskanalene. Hemming av resident sædmotilitet i SST har blitt foreslått for å forklare den lange lagringstiden for sædceller og deretter foryngelse etter at de forlater SST. Under hypoksiske forhold rapporterte Matsuzaki et al.1 høy produksjon og frigjøring av laktat i SST, noe som kan føre til hemming av resident sædmotilitet. I dette tilfellet gjenspeiles viktigheten av sædreologi i seleksjon og absorpsjon av sædceller, og ikke i lagringen av dem.
Sædcellenes agglutinasjonsmønster anses som en plausibel forklaring på den lange lagringsperioden for sædceller i SST, da dette er et vanlig mønster for sædretensjon hos fjærfe2,22,23. Bakst et al.2 observerte at de fleste sædcellene festet seg til hverandre og dannet fascikulære aggregater, og enkeltstående sædceller ble sjelden funnet i vaktel-CCM. På den annen side observerte Wen et al.24 flere spredte sædceller og færre sædcelletuber i SST-lumen hos kyllinger. Basert på disse observasjonene kan det antas at tilbøyeligheten til sædcelleagglutinasjon varierer mellom fugler og mellom sædceller i samme ejakulat. I tillegg foreslo Van Krey et al.9 at tilfeldig dissosiasjon av agglutinerte sædceller er ansvarlig for den gradvise penetrasjonen av sædceller inn i egglederens lumen. I følge denne hypotesen bør sædceller med lavere agglutinasjonskapasitet utstøtes fra SST først. I denne sammenhengen kan spermatozoenes evne til å agglutinere være en faktor som påvirker resultatet av sædkonkurranse hos skitne fugler. I tillegg, jo lenger den agglutinerte sædcellen dissosierer, desto lenger opprettholdes fruktbarheten.
Selv om spermatozoaggregering og aggregering til bunter har blitt observert i flere studier2,22,24, har de ikke blitt beskrevet i detalj på grunn av kompleksiteten i deres kinematiske observasjon i SST. Flere forsøk har blitt gjort på å studere spermagglutinasjon in vitro. Omfattende, men forbigående aggregering ble observert da den tynne tråden ble fjernet fra den dinglende frødråpen. Dette fører til at en langstrakt boble stikker ut fra dråpen og imiterer sædkjertelen. På grunn av 3D-begrensninger og korte drypptørketider forfalt hele blokken raskt9. I den nåværende studien, ved bruk av Sharkashi-kyllinger og mikrofluidiske brikker, kunne vi beskrive hvordan disse tuftene dannes og hvordan de beveger seg. Sædbunter dannet seg umiddelbart etter sædinnsamling og ble funnet å bevege seg i en spiral, noe som viste positiv reologi når de var tilstede i strømmen. Videre, når det ses makroskopisk, har sædbunter blitt observert å øke lineariteten i motiliteten sammenlignet med isolerte spermatozoer. Dette tyder på at sædagglutinasjon kan forekomme før SST-penetrering, og at sædproduksjonen ikke er begrenset til et lite område på grunn av stress, slik tidligere antydet (Tingari og Lake12). Under tuftdannelse svømmer sædcellene synkront inntil de danner en forbindelse, deretter vikles halene deres rundt hverandre, og spermatozoens hode forblir fritt, men halen og den distale delen av spermatozoen kleber seg sammen med et klebrig stoff. Derfor er det frie hodet på ligamentet ansvarlig for bevegelsen, og drar resten av ligamentet med seg. Skanningselektronmikroskopi av sædbuntene viste festede sædhoder dekket med mye klebrig materiale, noe som tyder på at sædhodene var festet i hvilebunter, noe som kan ha skjedd etter at de nådde lagringsstedet (SST).
Når et sædutstryk farges med akridinoransje, kan ekstracellulært klebemiddel rundt sædcellene sees under et fluorescerende mikroskop. Dette stoffet gjør at sædbunter kan feste seg til og klamre seg til omkringliggende overflater eller partikler, slik at de ikke driver med den omkringliggende strømmen. Våre observasjoner viser dermed hvilken rolle spermatozoa-adhesjon spiller i form av mobile bunter. Deres evne til å svømme mot strømmen og feste seg til nærliggende overflater gjør at sædcellene kan holde seg lenger i sædcellene.
Rothschild25 brukte et hemocytometrikamera for å studere den flytende fordelingen av bovin sæd i en dråpe suspensjon, og tok fotomikrografer gjennom et kamera med både vertikal og horisontal optisk akse i mikroskopet. Resultatene viste at sædcellene ble tiltrukket av overflaten av kammeret. Forfatterne antyder at det kan være hydrodynamiske interaksjoner mellom sædcellene og overflaten. Med tanke på dette, sammen med Sharkashi-kyllingesædens evne til å danne klebrige tuer, kan det øke sannsynligheten for at sæd fester seg til SST-veggen og lagres over lengre tid.
Bccetti og Afzeliu26 rapporterte at sædcellenes glykokalyx er nødvendig for kjønnscellegjenkjenning og agglutinering. Forman10 observerte at hydrolyse av α-glykosidbindinger i glykoprotein-glykolipidbelegg ved behandling av fuglesæd med neuraminidase resulterte i redusert fruktbarhet uten å påvirke sædmotiliteten. Forfatterne antyder at effekten av neuraminidase på glykokalyxen svekker sædopptaket ved utero-vaginal-overgangen, og dermed reduserer fruktbarheten. Observasjonene deres kan ikke ignorere muligheten for at neuraminidasebehandling kan redusere sæd- og oocyttgjenkjenning. Forman og Engel10 fant at fruktbarheten ble redusert når høner ble inseminert intravaginalt med sæd behandlet med neuraminidase. IVF med neuraminidasebehandlet sæd påvirket imidlertid ikke fruktbarheten sammenlignet med kontrollkyllinger. Forfatterne konkluderte med at endringer i glykoprotein-glykolipidbelegget rundt sædmembranen reduserte sædcellenes evne til å befruktes ved å svekke bindingen av sædceller ved utero-vaginal-overgangen, noe som igjen økte sædtap på grunn av hastigheten på utero-vaginal-overgangen, men ikke påvirker gjenkjenningen av sædceller og egg.
Hos kalkuner fant Bakst og Bauchan 11 små vesikler og membranfragmenter i lumen til SST og observerte at noen av disse granulene hadde smeltet sammen med sædmembranen. Forfatterne antyder at disse forholdene kan bidra til langtidslagring av sædceller i SST. Forskerne spesifiserte imidlertid ikke kilden til disse partiklene, om de skilles ut av CCT-epitelceller, produseres og skilles ut av det mannlige reproduksjonssystemet, eller produseres av selve sædcellene. Disse partiklene er også ansvarlige for agglutinasjon. Grützner et al.27 rapporterte at epididymale epitelceller produserer og utskiller et spesifikt protein som er nødvendig for dannelsen av sædkanaler med én pore. Forfatterne rapporterer også at spredningen av disse buntene avhenger av samspillet mellom epididymale proteiner. Nixon et al.28 fant at adnexa utskiller et protein, det sure cysteinrike osteonektinet; SPARC er involvert i dannelsen av sædtuster hos kortnebbede echidnaer og nebbdyr. Spredningen av disse strålene er assosiert med tapet av dette proteinet.
I den nåværende studien viste ultrastrukturell analyse ved hjelp av elektronmikroskopi at spermatozoene festet seg til en stor mengde tett materiale. Disse stoffene antas å være ansvarlige for agglutinasjonen som kondenserer mellom og rundt de festende hodene, men i lavere konsentrasjoner i haleregionen. Vi antar at dette agglutinerende stoffet skilles ut fra det mannlige reproduksjonssystemet (bistiklene eller sædlederen) sammen med sæd, siden vi ofte observerer sæd som separerer fra lymfe og sædplasma under ejakulasjon. Det har blitt rapportert at når fuglespermatozoer passerer gjennom bistiklene og sædlederen, gjennomgår de modningsrelaterte endringer som støtter deres evne til å binde proteiner og tilegne seg plasmalemma-assosierte glykoproteiner. Persistensen av disse proteinene på residente sædmembraner i SST antyder at disse proteinene kan påvirke tilegnelsen av sædmembranstabilitet 30 og bestemme deres fruktbarhet 31. Ahammad et al32 rapporterte at sædceller hentet fra ulike deler av det mannlige reproduksjonssystemet (fra testiklene til den distale sædlederen) viste en progressiv økning i levedyktighet under flytende lagringsforhold, uavhengig av lagringstemperatur, og levedyktigheten hos kyllinger øker også i egglederne etter kunstig inseminasjon.
Sharkashi-høns sædbunter har andre egenskaper og funksjoner enn andre arter som piggsvin, nebbdyr, skogmus, hjorterotter og marsvin. Hos sharkashikyllinger reduserte dannelsen av sædbunter svømmehastigheten deres sammenlignet med enkeltsædceller. Imidlertid økte disse buntene prosentandelen reologisk positive sædceller og økte sædcellenes evne til å stabilisere seg i et dynamisk miljø. Dermed bekrefter resultatene våre det tidligere antydningen om at sædagglutinasjon i SST er assosiert med langsiktig sædlagring. Vi antar også at sædcellenes tilbøyelighet til å danne tufter kan kontrollere hastigheten på sædtap i SST, noe som kan endre utfallet av sædkonkurranse. I følge denne antagelsen frigjør sædceller med lav agglutinasjonskapasitet SST først, mens sædceller med høy agglutinasjonskapasitet produserer mesteparten av avkommet. Dannelsen av enkeltporede sædbunter er gunstig og påvirker foreldre-barn-forholdet, men bruker en annen mekanisme. Hos echidnaer og platypuser er sædcellene arrangert parallelt med hverandre for å øke strålens fremoverhastighet. Bunter av echidnaer beveger seg omtrent tre ganger raskere enn enkeltstående sædceller. Det antas at dannelsen av slike sædtuster hos echidnaer er en evolusjonær tilpasning for å opprettholde dominans, siden hunnene er promiskuøse og vanligvis parer seg med flere hanner. Derfor konkurrerer sædceller fra forskjellige ejakulater heftig om befruktning av egget.
Agglutinerte spermatozoer fra sharkasi-kyllinger er enkle å visualisere ved hjelp av fasekontrastmikroskopi, noe som anses som fordelaktig fordi det muliggjør enkel studier av spermatozoenes oppførsel in vitro. Mekanismen som dannelsen av sædtuster fremmer reproduksjon hos sharkasi-kyllinger er også forskjellig fra den som sees hos noen placentale pattedyr som representerer samarbeidende sædoppførsel, som for eksempel tremus, hvor noen spermatozoer når eggene, og hjelper andre beslektede individer med å nå og skade eggene sine. å bevise seg selv. altruistisk oppførsel. Selvbefruktning 34. Et annet eksempel på samarbeidende oppførsel hos spermatozoer ble funnet hos hjortemus, hvor spermatozoer var i stand til å identifisere og kombinere med de mest genetisk beslektede spermatozoene og danne samarbeidende grupper for å øke hastigheten sammenlignet med ubeslektede spermatozoer 35.
Resultatene fra denne studien motsier ikke Fomans teori om langtidslagring av spermatozoer i SWS. Forskerne rapporterer at sædceller fortsetter å bevege seg i strømmen av epitelceller som kler SST over en lengre periode, og etter en viss tidsperiode tømmes sædcellenes energilagre, noe som resulterer i en reduksjon i hastighet, noe som tillater utstøting av stoffer med lav molekylvekt med væskestrømmen fra SST-lumen til egglederhulen. I den nåværende studien observerte vi at halvparten av de enkelte sædcellene viste evnen til å svømme mot strømmende væsker, og deres adhesjon i bunten økte deres evne til å vise positiv reologi. Videre er dataene våre konsistente med dataene til Matsuzaki et al.1 som rapporterte at økt laktattresjon i SST kan hemme resident sædmotilitet. Imidlertid beskriver resultatene våre dannelsen av sædcellebevegelige ligamenter og deres reologiske oppførsel i nærvær av et dynamisk miljø i en mikrokanal i et forsøk på å belyse deres oppførsel i SST. Fremtidig forskning kan fokusere på å bestemme den kjemiske sammensetningen og opprinnelsen til agglutinasjonsmidlet, noe som utvilsomt vil hjelpe forskere med å utvikle nye måter å lagre flytende sæd på og øke fruktbarhetsvarigheten.
Femten 30 uker gamle hann-sharkasi med bar hals (homozygot dominant; NaNa) ble valgt som sæddonorer i studien. Fuglene ble oppdrettet på forskningsfjørfegården ved Fakultetet for landbruk, Ashit University, Ashit Governorate, Egypt. Fuglene ble plassert i individuelle bur (30 x 40 x 40 cm), utsatt for et lysprogram (16 timer med lys og 8 timer med mørke) og fôret med en diett som inneholdt 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g kalsium hver og 5 gram tilgjengelig fosfor per kilogram diett.
I følge data 36, ​​37 ble sæd samlet inn fra hanner ved hjelp av magemassasje. Totalt 45 sædprøver ble samlet inn fra 15 menn over 3 dager. Sæd (n = 15/dag) ble umiddelbart fortynnet 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som inneholder kaliumdifosfat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fruktose (0,5 d), vannfritt natriumacetat (0,43 g), tris(hydroksymetyl)aminometan (0,195 g), kaliumsitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonofosfat (0,065 g), magnesiumklorid (0,034 g) og H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 333 mOsm/kg38. Fortynnede sædprøver ble først undersøkt under et lysmikroskop for å sikre god sædkvalitet (fuktighet), og deretter oppbevart i et vannbad ved 37 °C inntil bruk innen en halvtime etter innsamling.
Kinematikken og reologien til spermatozoer beskrives ved hjelp av et system av mikrofluidiske enheter. Sædprøver ble ytterligere fortynnet til 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, lastet inn i en mikrofluidisk enhet (se nedenfor), og kinetiske parametere ble bestemt ved hjelp av et Computerized Semen Analysis (CASA) system som tidligere var utviklet for mikrofluidisk karakterisering, om mobiliteten til spermatozoer i flytende medier (Institutt for maskinteknikk, Fakultet for ingeniørfag, Assiut University, Egypt). Plugin-modulen kan lastes ned på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kurvehastighet (VCL, μm/s), lineær hastighet (VSL, μm/s) og gjennomsnittlig banehastighet (VAP, μm/s) ble målt. Videoer av spermatozoer ble tatt med et invertert Optika XDS-3-fase kontrastmikroskop (med 40x objektiv) koblet til et Tucson ISH1000-kamera ved 30 fps i 3 sekunder. Bruk CASA-programvaren til å studere minst tre områder og 500 sædbaner per prøve. Den innspilte videoen ble behandlet med en hjemmelaget CASA. Definisjonen av motilitet i CASA-plugin-modulen er basert på sædcellenes svømmehastighet sammenlignet med strømningshastigheten, og inkluderer ikke andre parametere som side-til-side-bevegelse, da dette har vist seg å være mer pålitelig i væskestrømning. Reologisk bevegelse beskrives som bevegelsen av sædceller mot væskestrømmens retning. Sædceller med reologiske egenskaper ble delt på antall bevegelige sædceller; sædceller som var i ro og konvektivt bevegelige sædceller ble ekskludert fra tellingen.
Alle kjemikalier som ble brukt, ble hentet fra Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egypt) med mindre annet er angitt. Enheten ble produsert som beskrevet av El-sherry et al. 40 med noen modifikasjoner. Materialene som ble brukt til å lage mikrokanalene inkluderte glassplater (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativ resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) og polyaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalene er produsert ved hjelp av myk litografi. Først ble en klar beskyttende ansiktsmaske med ønsket mikrokanaldesign trykket på en høyoppløselig skriver (Prismatic, Cairo, Egypt og Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterne ble laget med glassplater som substrat. Platene ble renset i aceton, isopropanol og avionisert vann og deretter belagt med et 20 µm lag med SU8-25 ved spinnbelegg (3000 rpm, 1 min). SU-8-lagene ble deretter forsiktig tørket (65 °C, 2 min og 95 °C, 10 min) og eksponert for UV-stråling i 50 sekunder. Ettereksponering: Stek ved 65 °C og 95 °C i 1 min og 4 min for å tverrbinde de eksponerte SU-8-lagene, etterfulgt av fremkalling i diacetonalkohol i 6,5 min. Hardstek vaflene (200 °C i 15 min) for å størkne SU-8-laget ytterligere.
PDMS ble fremstilt ved å blande monomeren og herderen i et vektforhold på 10:1, deretter avgasset i en vakuumeksikkator og helt på SU-8-hovedrammen. PDMS-en ble herdet i en ovn (120 °C, 30 min), deretter ble kanalene kuttet ut, separert fra masteren og perforert for å tillate at rørene kunne festes ved innløpet og utløpet til mikrokanalen. Til slutt ble PDMS-mikrokanaler permanent festet til objektglass ved hjelp av en bærbar koronaprosessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) som beskrevet andre steder. Mikrokanalen som ble brukt i denne studien måler 200 µm × 20 µm (B × H) og er 3,6 cm lang.
Væskestrømmen indusert av hydrostatisk trykk inne i mikrokanalen oppnås ved å opprettholde væskenivået i innløpsreservoaret over høydeforskjellen Δh39 i utløpsreservoaret (fig. 1).
hvor f er friksjonskoeffisienten, definert som f = C/Re for laminær strømning i en rektangulær kanal, hvor C er en konstant avhengig av kanalens sideforhold, L er lengden på mikrokanalen, Vav er gjennomsnittshastigheten inne i mikrokanalen, Dh er kanalens hydrauliske diameter, g – tyngdeakselerasjonen. Ved å bruke denne ligningen kan den gjennomsnittlige kanalhastigheten beregnes ved hjelp av følgende ligning: