Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Fruktbarheten til fugler avhenger av deres evne til å lagre nok levedyktig sperm i en lengre periode i spermlagringsrørene (SST).Den nøyaktige mekanismen som spermatozoer kommer inn i, oppholder seg i og forlater med SST er fortsatt kontroversiell.Sædcellene fra sharkasi-høner viste en høy tendens til agglutinasjon, og dannet mobile filamentøse bunter som inneholdt mange celler.På grunn av vanskeligheten med å observere bevegeligheten og oppførselen til sædceller i et ugjennomsiktig eggleder, brukte vi en mikrofluidisk enhet med et mikrokanaltverrsnitt som ligner på sædceller for å studere agglutinasjon og motilitet av sædceller.Denne studien diskuterer hvordan sædbunter dannes, hvordan de beveger seg og deres mulige rolle i å forlenge sædopphold i SST.Vi undersøkte spermhastighet og reologisk oppførsel når væskestrøm ble generert i en mikrofluidisk kanal ved hydrostatisk trykk (strømningshastighet = 33 µm/s).Sædceller har en tendens til å svømme mot strømmen (positiv reologi) og hastigheten til sædcellene er betydelig redusert sammenlignet med enkelt sæd.Det er observert at sædbunter beveger seg i en spiral og øker i lengde og tykkelse etter hvert som flere enkeltspermier rekrutteres. Spermbunter ble observert nærme seg og festet seg til sideveggene til mikrofluidkanalene for å unngå å bli feid med væskestrømningshastighet > 33 µm/s. Spermbunter ble observert nærme seg og festet seg til sideveggene til mikrofluidkanalene for å unngå å bli feid med væskestrømningshastighet > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, микрофлюидных етания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Det er observert at sædbunter nærmer seg og fester seg til sideveggene til mikrofluidkanalene for å unngå å bli feid bort ved væskestrømningshastigheter >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, боковым стенкам микрожидкостног метания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Spermbunter har blitt observert å nærme seg og feste seg til sideveggene til mikrofluidkanalen for å unngå å bli feid bort av væskestrøm ved >33 µm/s.Skanning og transmisjonselektronmikroskopi avslørte at sædbuntene ble støttet av rikelig tett materiale.Dataene som er oppnådd demonstrerer den unike mobiliteten til Sharkazi kyllingspermatozoer, samt evnen til sædceller til å agglutinere og danne mobile bunter, noe som bidrar til en bedre forståelse av langtidslagring av sædceller i SMT.
For å oppnå befruktning hos mennesker og de fleste dyr, må sæd og egg ankomme befruktningsstedet til rett tid.Derfor må paring skje før eller på tidspunktet for eggløsning.På den annen side lagrer enkelte pattedyr, for eksempel hunder, samt ikke-pattedyrarter, som insekter, fisk, krypdyr og fugler, sædceller i sine reproduksjonsorganer i lengre tid til eggene deres er klare for befruktning (asynkron befruktning 1 ).Fugler er i stand til å opprettholde levedyktigheten til sædceller som er i stand til å befrukte egg i 2-10 uker2.
Dette er et unikt trekk som skiller fugler fra andre dyr, da det gir stor sannsynlighet for befruktning etter en enkelt inseminasjon i flere uker uten samtidig parring og eggløsning.Det viktigste spermlagringsorganet, kalt spermlagringsrøret (SST), er lokalisert i de indre slimhinnefoldene ved uterovaginalkrysset.Til dags dato er mekanismene som gjør at sæd kommer inn, oppholder seg og går ut av sædbanken ikke fullt ut forstått.Basert på tidligere studier er det fremsatt mange hypoteser, men ingen av dem er bekreftet.
Forman4 antok at spermatozoer opprettholder sin bolig i SST-hulen gjennom kontinuerlig oscillerende bevegelse mot retningen av væskestrøm gjennom proteinkanaler lokalisert på SST-epitelceller (reologi).ATP er utarmet på grunn av den konstante flagellaraktiviteten som er nødvendig for å holde sædcellene i SST-lumen og bevegeligheten avtar til slutt inntil sædcellene blir ført ut av sædbanken ved væskestrøm og begynner en ny reise nedover den stigende egglederen for å befrukte sædcellene.Egg (Forman4).Denne modellen for spermlagring støttes av påvisning ved immuncytokjemi av aquaporin 2, 3 og 9 tilstede i SST-epitelceller.Til dags dato mangler studier på kyllingsædreologi og dens rolle i SST-lagring, vaginal sædseleksjon og sædkonkurranse.Hos kyllinger kommer sædceller inn i skjeden etter naturlig parring, men mer enn 80 % av sædcellene blir kastet ut av skjeden kort tid etter parring.Dette tyder på at skjeden er det primære stedet for sædseleksjon hos fugler.I tillegg er det rapportert at mindre enn 1 % av sædceller befruktet i skjeden ender opp i SSTs2.Ved kunstig inseminasjon av kyllinger i skjeden har antallet sædceller som når SST en tendens til å øke 24 timer etter inseminering.Så langt er mekanismen for spermseleksjon under denne prosessen uklar, og spermmotilitet kan spille en viktig rolle i SST-spermopptak.På grunn av de tykke og ugjennomsiktige veggene til egglederne, er det vanskelig å direkte overvåke sædmotiliteten i egglederne til fugler.Derfor mangler vi grunnleggende kunnskap om hvordan sædceller går over til SST etter befruktning.
Reologi har nylig blitt anerkjent som en viktig faktor som kontrollerer sædtransport i pattedyrs kjønnsorganer.Basert på evnen til bevegelige spermatozoer til å migrere motstrøm, brukte Zaferani et al8 et corra mikrofluidsystem for passivt å isolere bevegelige spermatozoer fra innlagte sædprøver.Denne typen sædsortering er avgjørende for medisinsk infertilitetsbehandling og klinisk forskning, og foretrekkes fremfor tradisjonelle metoder som er tid- og arbeidskrevende og kan kompromittere sædmorfologi og strukturell integritet.Til dags dato er det imidlertid ikke utført studier på effekten av sekret fra kjønnsorganene til kyllinger på sædmotiliteten.
Uavhengig av mekanismen som opprettholder sperm lagret i SST, har mange etterforskere observert at fastboende spermatozoer agglutinerer head-to-head i SST av kyllinger 9, 10, vaktel 2 og kalkuner 11 for å danne agglutinerte spermbunter.Forfatterne antyder at det er en sammenheng mellom denne agglutinasjonen og langtidslagring av spermatozoer i SST.
Tingari og Lake12 rapporterte en sterk assosiasjon mellom sædceller i den sædmottakende kjertelen til kyllingen og stilte spørsmål ved om fuglespermatozoer agglutinerer på samme måte som pattedyrspermatozoer.De tror at de dype forbindelsene mellom sædceller i vas deferens kan skyldes stress forårsaket av tilstedeværelsen av et stort antall sædceller på et lite rom.
Ved evaluering av spermatozoers oppførsel på ferske hengende glassglass, kan man se forbigående tegn på agglutinasjon, spesielt i kantene av sæddråpene.Imidlertid ble agglutinasjon ofte forstyrret av rotasjonsvirkningen forbundet med kontinuerlig bevegelse, noe som forklarer den forbigående naturen til dette fenomenet.Forskerne la også merke til at når fortynningsmidlet ble tilsatt til sæden, dukket det opp langstrakte "trådlignende" celleaggregater.
Tidlige forsøk på å etterligne en spermatozoon ble gjort ved å fjerne en tynn tråd fra en hengende dråpe, noe som resulterte i en langstrakt sædlignende vesikkel som stakk ut fra sæddråpen.Spermatozoene stilte seg umiddelbart opp på en parallell måte i vesikkelen, men hele enheten forsvant raskt på grunn av 3D-begrensningen.Derfor, for å studere spermatozoagglutinasjon, er det nødvendig å observere bevegeligheten og oppførselen til spermatozoer direkte i isolerte spermatubuli, noe som er vanskelig å oppnå.Derfor er det nødvendig å utvikle et instrument som etterligner sædceller for å støtte studier av sædmotilitet og agglutinasjonsatferd.Brillard et al13 rapporterte at den gjennomsnittlige lengden på spermlagringsrør hos voksne kyllinger er 400–600 µm, men noen SST-er kan være så lange som 2000 µm.Mero og Ogasawara14 delte sædkjertlene inn i forstørrede og ikke-forstørrede spermlagringstubuli, som begge var like lange (~500 µm) og halsbredde (~38 µm), men den gjennomsnittlige lumendiameteren til tubuli var 56,6 og 56,6 µm.., henholdsvis 11,2 μm.I den nåværende studien brukte vi en mikrofluidisk enhet med en kanalstørrelse på 200 µm × 20 µm (B × H), hvis tverrsnitt er noe nær det for den forsterkede SST.I tillegg undersøkte vi sædmotilitet og agglutinasjonsadferd i flytende væske, noe som stemmer overens med Foremans hypotese om at væske produsert av SST-epitelceller holder sædceller i lumen i en motstrøms (reologisk) retning.
Målet med denne studien var å overvinne problemene med å observere spermatozoers bevegelighet i egglederen og å unngå vanskelighetene med å studere reologien og oppførselen til spermatozoer i et dynamisk miljø.En mikrofluidisk enhet ble brukt som skaper hydrostatisk trykk for å simulere sædmotilitet i kjønnsorganene til en kylling.
Når en dråpe av en fortynnet spermprøve (1:40) ble lastet inn i mikrokanalenheten, kunne to typer spermmotilitet identifiseres (isolert sperm og bundet sperm).I tillegg hadde sædceller en tendens til å svømme mot strømmen (positiv reologi; video 1, 2). Selv om sædbunter hadde lavere hastighet enn ensomme sædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen av sædceller som viste positiv reotaksi (p < 0,001; Tabell 2). Selv om sædbunter hadde lavere hastighet enn ensomme sædceller (p < 0,001), økte de prosentandelen av sædceller som viste positiv reotaksi (p < 0,001; Tabell 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), липвецич озоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Selv om spermatozobuntene hadde en lavere hastighet enn enkeltspermatozoer (p < 0,001), økte de prosentandelen spermatozoer som viste positiv reotakse (p < 0,001; Tabell 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显羵阳分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 澧 倧 倲 示 逳分比 （p <0,001； 2。。。。。。））)) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичов положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Selv om hastigheten til spermatozoer var lavere enn for enkelt spermatozoer (p < 0,001), økte de prosentandelen spermatozoer med positiv reologi (p < 0,001; Tabell 2).Positiv reologi for enkeltspermatozoer og tuer er estimert til henholdsvis ca. 53 % og 85 %.
Det har blitt observert at spermatozoene til sharkasi-kyllinger umiddelbart etter utløsning danner lineære bunter, bestående av dusinvis av individer.Disse tottene øker i lengde og tykkelse over tid og kan forbli in vitro i flere timer før de forsvinner (video 3).Disse filamentøse buntene er formet som echidna spermatozoer som dannes i enden av epididymis.Sharkashi-hønesæd har vist seg å ha en høy tendens til å agglutinere og danne en nettformet bunt på mindre enn ett minutt etter innsamling.Disse bjelkene er dynamiske og kan feste seg til vegger eller statiske objekter i nærheten.Selv om sædbunter reduserer hastigheten til sædceller, er det klart at makroskopisk sett øker lineariteten deres.Lengden på buntene varierer avhengig av antall sædceller samlet i bunter.To deler av bunten ble isolert: den første delen, inkludert det frie hodet til den agglutinerte spermien, og den terminale delen, inkludert halen og hele den distale enden av spermien.Ved hjelp av et høyhastighetskamera (950 fps) ble frie hoder av agglutinerte sædceller observert i den innledende delen av bunten, ansvarlig for bevegelsen av bunten på grunn av deres oscillerende bevegelse, og drar de resterende inn i bunten med en spiralformet bevegelse (video 4).Men i lange tuer har det blitt observert at noen frie sædhoder festet seg til kroppen og den ende delen av tuften fungerer som skovler for å hjelpe til med å drive tuften.
Mens i en langsom flyt av væske, beveger sædbuntene seg parallelt med hverandre, men de begynner å overlappe og feste seg til alt som er stille, for ikke å bli vasket bort av strømstrømmen når strømningshastigheten øker.Buntene dannes når en håndfull sædceller nærmer seg hverandre, de begynner å bevege seg synkront og vikler seg rundt hverandre, for så å holde seg til et klebrig stoff.Figur 1 og 2 viser hvordan sædcellene nærmer seg hverandre, og danner et kryss når halene vikler seg rundt hverandre.
Forskerne brukte hydrostatisk trykk for å skape væskestrøm i en mikrokanal for å studere spermreologi.En mikrokanal med en størrelse på 200 µm × 20 µm (B × H) og en lengde på 3,6 µm ble brukt.Bruk mikrokanaler mellom beholderne med sprøyter montert i endene.Matfarge ble brukt for å gjøre kanalene mer synlige.
Fest sammenkoblingskabler og tilbehør til veggen.Videoen er tatt med fasekontrastmikroskop.Med hvert bilde presenteres fasekontrastmikroskopi og kartleggingsbilder.(A) Forbindelsen mellom to strømmer motstår strømmen på grunn av spiralformet bevegelse (rød pil).(B) Forbindelsen mellom rørbunten og kanalveggen (røde piler), samtidig kobles de til to andre bunter (gule piler).(C) Spermbunter i mikrofluidkanalen begynner å koble seg til hverandre (røde piler), og danner et nett av sædbunter.(D) Dannelse av et nettverk av sædbunter.
Når en dråpe fortynnet sperm ble lastet inn i den mikrofluidiske enheten og en strømning ble opprettet, ble det observert at spermstrålen beveget seg mot strømningsretningen.Buntene passer tett mot veggene til mikrokanalene, og de frie hodene i den innledende delen av buntene passer tett mot dem (video 5).De holder seg også til eventuelle stasjonære partikler i deres vei, for eksempel rusk, for å motstå å bli feid med strømmen.Over tid blir disse tottene lange filamenter som fanger andre enkeltspermatozoer og kortere totter (video 6).Når strømmen begynner å avta, begynner lange linjer med sædceller å danne et nettverk av sædlinjer (video 7; figur 2).
Ved høy strømningshastighet (V > 33 µm/s) økes spiralbevegelsene til trådene som et forsøk på å fange opp mange individuelle sæddannende bunter bedre motstå strømmens drivkraft. Ved høy strømningshastighet (V > 33 µm/s) økes spiralbevegelsene til trådene som et forsøk på å fange opp mange individuelle sæddannende bunter bedre motstå strømmens drivkraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку оспони поскольку отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Ved høye strømningshastigheter (V > 33 µm/s) øker de spiralformede bevegelsene til strengene når de prøver å fange opp mange individuelle sædceller som danner bunter som er bedre i stand til å motstå strømmens drivkraft.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形戲束的在高流速好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形仲 坟 形仲 坟 形仲 坟更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке зохтель захние сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ved høye strømningshastigheter (V > 33 µm/s) øker den spiralformede bevegelsen til filamentene i et forsøk på å fange opp mange individuelle spermatozodannende bunter for bedre å motstå strømmens drivkrefter.De prøvde også å feste mikrokanaler til sideveggene.
Spermbunter ble identifisert som klynger av sædhoder og krøllete haler ved bruk av lysmikroskopi (LM).Spermbunter med forskjellige aggregater har også blitt identifisert som vridde hoder og flagellære aggregater, flere smeltede spermhaler, spermhoder festet til en hale, og spermhoder med bøyde kjerner som flere smeltede kjerner.transmisjonselektronmikroskopi (TEM).Skanneelektronmikroskopi (SEM) viste at spermbuntene var omhyllede aggregater av spermhoder og spermaggregatene viste et festet nettverk av innviklede haler.
Morfologien og ultrastrukturen til spermatozoer, dannelsen av spermatozobunter ble studert ved bruk av lysmikroskopi (halvt snitt), skanningselektronmikroskopi (SEM) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), spermutstryk ble farget med akridinoransje og undersøkt ved bruk av epifluorescensmikroskopi.
Farging av sædflekker med akridinoransje (Fig. 3B) viste at sædhodene var klistret sammen og dekket med sekretorisk materiale, noe som førte til dannelse av store tuer (Fig. 3D).Sædbuntene besto av sædaggregater med et nettverk av festede haler (fig. 4A-C).Sædbunter er sammensatt av halene til mange sædceller som sitter sammen (fig. 4D).Hemmeligheter (fig. 4E,F) dekket hodene til spermatozobunter.
Dannelse av spermatozobunten Ved bruk av fasekontrastmikroskopi og spermutstryk farget med akridinoransje, viste det seg at hodene på spermatozoer kleber sammen.(A) Tidlig dannelse av sæddusk begynner med en sædcelle (hvit sirkel) og tre sædceller (gul sirkel), med spiralen som starter ved halen og ender ved hodet.(B) Mikrofotografi av et spermutstryk farget med akridinoransje som viser vedhengende spermhoder (piler).Utslippet dekker hodet/hodene.Forstørrelse × 1000. (C) Utvikling av en stor stråle som transporteres ved strømning i en mikrofluidisk kanal (ved hjelp av et høyhastighetskamera ved 950 fps).(D) Mikrofotografi av en sædcelle farget med akridinoransje som viser store tuer (piler).Forstørrelse: ×200.
Skanneelektronmikrofotografi av en spermstråle og et spermutstryk farget med akridinoransje.(A, B, D, E) er digitale fargeskanningselektronmikrofotografier av sædceller, og C og F er mikrofotografier av akridin-oransje-fargede sædceller som viser feste av flere sædceller som pakker den kaudale banen.(AC) Spermaggregater er vist som et nettverk av festede haler (piler).(D) Adhesjon av flere sædceller (med selvklebende substans, rosa kontur, pil) som vikler seg rundt halen.(E og F) Spermhodeaggregater (pekere) dekket med klebende materiale (pekere).Sædcellene dannet bunter med flere virvellignende strukturer (F).(C) ×400 og (F) ×200 forstørrelser.
Ved å bruke transmisjonselektronmikroskopi fant vi at sædbunter hadde festede haler (fig. 6A, C), hoder festet til haler (fig. 6B), eller hoder festet til haler (fig. 6D).Hodene til sædceller i bunten er buede, og presenterer i snitt to kjernefysiske områder (fig. 6D).I snittbunten hadde spermatozoene et vridd hode med to kjerneområder og flere flagellområder (fig. 5A).
Digitalt fargeelektronmikrofotografi som viser forbindelseshalene i sædbunten og det agglutinerende materialet som forbinder sædhodene.(A) Festet hale av et stort antall sædceller.Legg merke til hvordan halen ser ut i både stående (pil) og liggende (pil) projeksjoner.(B) Spermens hode (pil) er koblet til halen (pil).(C) Flere sædhaler (piler) er festet.(D) Agglutinasjonsmateriale (AS, blå) forbinder fire spermhoder (lilla).
Skanneelektronmikroskopi ble brukt til å oppdage spermhoder i spermbunter dekket med sekreter eller membraner (Figur 6B), noe som indikerer at spermbuntene var forankret av ekstracellulært materiale.Det agglutinerte materialet ble konsentrert i sædhodet (manethodelignende enhet; fig. 5B) og ekspandert distalt, noe som ga et strålende gult utseende under fluorescensmikroskopi når det ble farget med akridinoransje (fig. 6C).Dette stoffet er godt synlig under et skanningsmikroskop og regnes som et bindemiddel.Halvtynne seksjoner (fig. 5C) og spermutstryk farget med akridinoransje viste spermbunter som inneholdt tettpakkede hoder og krøllede haler (fig. 5D).
Ulike mikrofotografier som viser aggregering av sædhoder og foldede haler ved hjelp av ulike metoder.(A) Tverrsnitt digitalt fargeoverføring elektronmikrofotografi av en sædbunt som viser et opprullet sædhode med en todelt kjerne (blå) og flere flagellære deler (grønn).(B) Digital fargeskanningselektronmikrograf som viser en klynge av manetlignende sædhoder (piler) som ser ut til å være dekket.(C) Halvtynt snitt som viser aggregerte spermhoder (piler) og krøllede haler (piler).(D) Mikrofotografi av et spermutstryk farget med akridinoransje som viser aggregater av spermhoder (piler) og krøllede vedhengende haler (piler).Legg merke til at et klebrig stoff (S) dekker hodet til sædcellene.(D) × 1000 forstørrelse.
Ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi (Fig. 7A) ble det også bemerket at sædhodene var vridd og kjernene hadde en spiralform, som bekreftet av spermutstryk farget med akridinoransje og undersøkt ved bruk av fluorescensmikroskopi (Fig. 7B).
(A) Digital fargeoverføring elektronmikrograf og (B) Akridin oransje farget sperm utstryk som viser opprullede hoder og vedlegg av sperm hoder og haler (piler).(B) × 1000 forstørrelse.
Et interessant funn er at Sharkazis sædceller samler seg for å danne mobile filamentøse bunter.Egenskapene til disse buntene tillater oss å forstå deres mulige rolle i absorpsjon og lagring av spermatozoer i SST.
Etter parring kommer sædcellene inn i skjeden og gjennomgår en intens seleksjonsprosess, noe som resulterer i at bare et begrenset antall sædceller kommer inn i SST15,16.Til dags dato er mekanismene som spermier kommer inn og ut av SST med uklare.Hos fjørfe lagres sædceller i SST i en lengre periode på 2 til 10 uker, avhengig av art6.Kontrovers gjenstår om tilstanden til sæden under lagring i SST.Er de i bevegelse eller i ro?Med andre ord, hvordan opprettholder sædcellene sin posisjon i SST så lenge?
Forman4 foreslo at SST-residens og ejeksjon kunne forklares i form av spermmotilitet.Forfatterne antar at sædceller opprettholder sin posisjon ved å svømme mot væskestrømmen skapt av SST-epitelet og at sædceller blir kastet ut fra SST når hastigheten faller under punktet der de begynner å bevege seg bakover på grunn av mangel på energi.Zaniboni5 bekreftet tilstedeværelsen av akvaporiner 2, 3 og 9 i den apikale delen av SST-epitelceller, som indirekte kan støtte Foremans spermlagringsmodell.I den nåværende studien fant vi at nesten halvparten av Sharkashis spermatozoer viser positiv reologi i den flytende væsken, og at agglutinerte sædbunter øker antallet spermatozoer som viser positiv reologi, selv om agglutinasjon bremser dem.Hvordan sædceller beveger seg opp fuglens eggleder til stedet for befruktning er ikke fullt ut forstått.Hos pattedyr trekker follikkelvæsken til seg sædceller.Imidlertid antas kjemoattraktanter å lede sædceller til å nærme seg lange avstander7.Derfor er andre mekanismer ansvarlige for sædtransport.Evnen til sædceller til å orientere seg og strømme mot eggledervæsken som frigjøres etter parring, er rapportert å være en viktig faktor for å målrette sædceller hos mus.Parker 17 foreslo at sædceller krysser egglederne ved å svømme mot ciliærstrømmen hos fugler og krypdyr.Selv om det ikke er eksperimentelt påvist i fugler, var Adolphi18 den første som fant ut at fuglesæd gir positive resultater når et tynt lag med væske mellom et dekkglass og objektglass lages med en stripe med filterpapir.Reologi.Hino og Yanagimachi [19] plasserte et museovarie-tubal-uterin-kompleks i en perfusjonsring og injiserte 1 µl blekk i isthmus for å visualisere væskestrømmen i egglederne.De la merke til en veldig aktiv bevegelse av sammentrekning og avslapning i egglederen, der alle blekkkulene beveget seg jevnt mot egglederens ampulla.Forfatterne understreker viktigheten av strømmen av tubal væske fra de nedre til de øvre egglederne for sædløfting og befruktning.Brillard20 rapporterte at hos kyllinger og kalkuner migrerer sædceller ved aktiv bevegelse fra vaginalinngangen, hvor de er lagret, til utero-vaginale overgangen, hvor de er lagret.Denne bevegelsen er imidlertid ikke nødvendig mellom uterovaginal junction og infundibulum fordi spermatozoene transporteres ved passiv forskyvning.Med kjennskap til disse tidligere anbefalingene og resultatene oppnådd i den nåværende studien, kan det antas at spermatozoers evne til å bevege seg oppstrøms (reologi) er en av egenskapene som seleksjonsprosessen er basert på.Dette bestemmer passasjen av sædceller gjennom skjeden og deres inntreden i CCT for lagring.Som Forman4 foreslo, kan dette også lette prosessen med at sædceller kommer inn i SST og dens habitat i en periode og deretter går ut når hastigheten begynner å avta.
På den annen side antydet Matsuzaki og Sasanami 21 at fuglespermatozoer gjennomgår motilitetsendringer fra dvale til motilitet i mannlige og kvinnelige reproduktive kanaler.Hemming av bosatt spermmotilitet i SST har blitt foreslått for å forklare den lange lagringstiden til sperm og deretter foryngelse etter at SST har forlatt.Under hypoksiske forhold, Matsuzaki et al.1 rapporterte høy produksjon og frigjøring av laktat i SST, noe som kan føre til hemming av bosatt spermmotilitet.I dette tilfellet gjenspeiles betydningen av spermreologi i seleksjon og absorpsjon av spermatozoer, og ikke i lagringen av dem.
Sæd-agglutinasjonsmønsteret anses som en plausibel forklaring på den lange lagringsperioden for sæd i SST, da dette er et vanlig mønster av sædoppbevaring hos fjærfe2,22,23.Bakst et al.2 observerte at de fleste spermatozoer festet seg til hverandre og dannet fascikulære aggregater, og enkelte spermatozoer ble sjelden funnet i vaktel CCM.På den annen side, Wen et al.24 observerte flere spredte spermatozoer og færre spermatozoer i SST-lumen hos kyllinger.Basert på disse observasjonene kan det antas at tilbøyeligheten til spermagglutinasjon er forskjellig mellom fugler og mellom spermatozoer i samme ejakulat.I tillegg har Van Krey et al.9 antydet at tilfeldig dissosiasjon av agglutinerte spermatozoer er ansvarlig for gradvis penetrasjon av spermatozoer inn i lumen av egglederen.I følge denne hypotesen bør sædceller med lavere agglutinasjonskapasitet utvises fra SST først.I denne sammenhengen kan sædcellers evne til å agglutinere være en faktor som påvirker utfallet av sædkonkurranse hos skitne fugler.I tillegg, jo lenger den agglutinerte spermien dissosierer, jo lenger opprettholdes fruktbarheten.
Selv om spermatozoaggregering og aggregering til bunter har blitt observert i flere studier2,22,24, har de ikke blitt beskrevet i detalj på grunn av kompleksiteten til deres kinematiske observasjon i SST.Det er gjort flere forsøk på å studere spermagglutinasjon in vitro.Omfattende men forbigående aggregering ble observert når den tynne tråden ble fjernet fra den dinglende frødråpen.Dette fører til det faktum at en langstrakt boble stikker ut fra dråpen, og imiterer sædkjertelen.På grunn av 3D-begrensninger og korte drypptørketider falt hele blokken raskt i forfall9.I den nåværende studien, ved å bruke Sharkashi-kyllinger og mikrofluidchips, var vi i stand til å beskrive hvordan disse tuftene dannes og hvordan de beveger seg.Spermbunter dannet seg umiddelbart etter sædoppsamling og ble funnet å bevege seg i en spiral, og viste positiv reologi når de var til stede i strømmen.Videre, når makroskopisk sett, har sædbunter blitt observert å øke lineariteten av motilitet sammenlignet med isolerte sædceller.Dette antyder at spermagglutinasjon kan forekomme før SST-penetrasjon og at sædproduksjonen ikke er begrenset til et lite område på grunn av stress som tidligere foreslått (Tingari og Lake12).Under tuftdannelse svømmer sædcellene synkront til de danner et kryss, deretter vikler halene seg rundt hverandre og spermatozoens hode forblir fritt, men halen og den distale delen av spermatozoen holder seg sammen med et klebrig stoff.Derfor er det frie hodet til ligamentet ansvarlig for bevegelsen, og drar resten av ligamentet.Skanneelektronmikroskopi av spermbuntene viste festede spermhoder dekket med mye klebrig materiale, noe som tyder på at spermhodene var festet i hvilebunter, noe som kan ha skjedd etter at de nådde lagringsstedet (SST).
Når en sædcelle er farget med akridinoransje, kan ekstracellulært klebemateriale rundt sædcellene sees under et fluorescerende mikroskop.Dette stoffet lar sædbunter feste seg til og klamre seg til eventuelle omkringliggende overflater eller partikler slik at de ikke driver med den omkringliggende strømmen.Dermed viser våre observasjoner rollen til spermatozoadhesjon i form av mobile bunter.Deres evne til å svømme mot strømmen og holde seg til nærliggende overflater gjør at sædceller kan bli lenger i SST.
Rothschild25 brukte et hemocytometrikamera for å studere den flytende fordelingen av bovin sæd i en dråpe suspensjon, og tok mikrofotografier gjennom et kamera med både vertikal og horisontal optisk akse av mikroskopet.Resultatene viste at spermatozoene ble tiltrukket av overflaten av kammeret.Forfatterne foreslår at det kan være hydrodynamiske interaksjoner mellom sædcellene og overflaten.Tatt i betraktning, sammen med Sharkashi-kyllingsædens evne til å danne klissete tuer, kan det øke sannsynligheten for at sæd vil feste seg til SST-veggen og lagres i lange perioder.
Bccetti og Afzeliu26 rapporterte at sperm glycocalyx er nødvendig for gamete-gjenkjenning og agglutinasjon.Forman10 observerte at hydrolyse av a-glykosidbindinger i glykoprotein-glykolipidbelegg ved å behandle fuglesæd med neuraminidase resulterte i redusert fruktbarhet uten å påvirke sædmotiliteten.Forfatterne antyder at effekten av neuraminidase på glykokalyxen svekker spermsekvestrering ved utero-vaginale overgangen, og reduserer dermed fruktbarheten.Deres observasjoner kan ikke ignorere muligheten for at neuraminidasebehandling kan redusere sæd- og oocyttgjenkjenning.Forman og Engel10 fant at fertiliteten ble redusert når høner ble inseminert intravaginalt med sæd behandlet med neuraminidase.IVF med neuraminidasebehandlet sæd påvirket imidlertid ikke fertiliteten sammenlignet med kontrollkyllinger.Forfatterne konkluderte med at endringer i glykoprotein-glykolipidbelegget rundt sædmembranen reduserte sædcellens evne til å befrukte ved å svekke sekvestrering av sæd i utero-vaginale overgangen, noe som igjen økte spermatap på grunn av hastigheten til utero-vaginale overgangen, men ikke påvirker spermie og egggjenkjenning.
Hos kalkuner fant Bakst og Bauchan 11 små vesikler og membranfragmenter i lumen av SST og observerte at noen av disse granulene hadde smeltet sammen med sædmembranen.Forfatterne foreslår at disse forholdene kan bidra til langtidslagring av sædceller i SST.Forskerne spesifiserte imidlertid ikke kilden til disse partiklene, enten de skilles ut av CCT-epitelceller, produseres og skilles ut av det mannlige reproduksjonssystemet, eller produseres av sædcellene selv.Disse partiklene er også ansvarlige for agglutinasjon.Grützner et al27 rapporterte at epididymale epitelceller produserer og skiller ut et spesifikt protein som er nødvendig for dannelsen av enkeltpore sædkanaler.Forfatterne rapporterer også at spredningen av disse buntene avhenger av interaksjonen mellom epididymale proteiner.Nixon et al28 fant at adnexa skiller ut et protein, det sure cysteinrike osteonectin;SPARC er involvert i dannelsen av sædtopper i kortnebb echidnas og platypuses.Spredningen av disse strålene er assosiert med tapet av dette proteinet.
I den nåværende studien viste ultrastrukturell analyse ved bruk av elektronmikroskopi at spermatozoene festet seg til en stor mengde tett materiale.Disse stoffene antas å være ansvarlige for agglutinasjonen som kondenserer mellom og rundt de adherende hodene, men ved lavere konsentrasjoner i haleregionen.Vi antar at dette agglutinerende stoffet skilles ut fra det mannlige reproduksjonssystemet (epididymis eller vas deferens) sammen med sæd, siden vi ofte observerer sæd som skiller seg fra lymfe- og sædplasma under ejakulasjon.Det er rapportert at når fuglespermatozoer passerer gjennom epididymis og vas deferens, gjennomgår de modningsrelaterte endringer som støtter deres evne til å binde proteiner og tilegne seg plasmalemma-assosierte glykoproteiner.Vedvaren av disse proteinene på bosatte sædmembraner i SST antyder at disse proteinene kan påvirke oppkjøpet av sædmembranstabilitet 30 og bestemme deres fruktbarhet 31 .Ahammad et al32 rapporterte at spermatozoer hentet fra ulike deler av det mannlige reproduksjonssystemet (fra testiklene til distale vas deferens) viste en progressiv økning i levedyktighet under væskelagringsforhold, uavhengig av lagringstemperatur, og levedyktigheten hos kyllinger øker også i egglederne etter kunstig inseminasjon.
Sharkashi-kylling-spermtufter har andre egenskaper og funksjoner enn andre arter som echidnas, platypuses, skogmus, hjorterotter og marsvin.Hos sharkasi-kyllinger reduserte dannelsen av spermatozobunter svømmehastigheten deres sammenlignet med enkeltspermatozoer.Imidlertid økte disse buntene prosentandelen av reologisk positive sædceller og økte sædcellenes evne til å stabilisere seg i et dynamisk miljø.Dermed bekrefter resultatene våre det tidligere antydningen om at spermagglutinasjon i SST er assosiert med langvarig lagring av sæd.Vi antar også at tilbøyeligheten til sædceller til å danne tuer kan kontrollere frekvensen av spermatap i SST, noe som kan endre utfallet av spermkonkurranse.I følge denne antagelsen frigjør sædceller med lav agglutinasjonskapasitet SST først, mens sædceller med høy agglutinasjonsevne produserer mesteparten av avkommet.Dannelsen av enkeltpore sædbunter er fordelaktig og påvirker forholdet mellom foreldre og barn, men bruker en annen mekanisme.Hos echidnas og nebbdyr er spermatozoene anordnet parallelt med hverandre for å øke strålens foroverhastighet.Bunter av echidnas beveger seg omtrent tre ganger raskere enn enkeltspermatozoer.Det antas at dannelsen av slike sædtopper i echidnas er en evolusjonær tilpasning for å opprettholde dominans, siden hunnene er promiskuøse og vanligvis parer seg med flere hanner.Derfor konkurrerer sædceller fra forskjellige ejakulater hardt om befruktningen av egget.
Agglutinerte spermatozoer fra sharkasi-kyllinger er enkle å visualisere ved bruk av fasekontrastmikroskopi, noe som anses som fordelaktig fordi det gjør det enkelt å studere spermatozoers oppførsel in vitro.Mekanismen som dannelsen av sædtufter fremmer reproduksjonen hos sharkasi-kyllinger er også forskjellig fra den som sees hos noen morkakepattedyr som representerer samarbeidende sædoppførsel som skogmus, der noen sædceller når eggene, og hjelper andre relaterte individer å nå og skade eggene sine.å bevise deg selv.altruistisk oppførsel.Selvbefruktning 34. Et annet eksempel på samarbeidsatferd hos sædceller ble funnet hos hjortemus, der sædceller var i stand til å identifisere og kombinere med de mest genetisk beslektede sædceller og danne samarbeidsgrupper for å øke hastigheten sammenlignet med ikke-relaterte sædceller35.
Resultatene oppnådd i denne studien motsier ikke Fomans teori om langtidslagring av spermatozoer i SWS.Forskerne rapporterer at sædceller fortsetter å bevege seg i strømmen av epitelceller som ligger langs SST i en lengre periode, og etter en viss tidsperiode er energilagrene til sædcellene oppbrukt, noe som resulterer i en reduksjon i hastigheten, som tillater utstøting av stoffer med liten molekylvekt.energi av spermatozoer med flyten av væske fra lumen av SST. Kaviteten til egglederen.I den nåværende studien observerte vi at halvparten av enkeltspermiene viste evnen til å svømme mot flytende væsker, og deres adhesjon i bunten økte deres evne til å vise positiv reologi.Videre er våre data i samsvar med dataene til Matsuzaki et al.1 som rapporterte at økt laktatsekresjon i SST kan hemme bosatt spermmotilitet.Imidlertid beskriver resultatene våre dannelsen av spermbevegelige leddbånd og deres reologiske oppførsel i nærvær av et dynamisk miljø i en mikrokanal i et forsøk på å belyse deres oppførsel i SST.Fremtidig forskning kan fokusere på å bestemme den kjemiske sammensetningen og opprinnelsen til agglutineringsmidlet, noe som utvilsomt vil hjelpe forskere med å utvikle nye måter å lagre flytende sæd på og øke fruktbarhetens varighet.
Femten 30 uker gamle barnakkede hannsharkasi (homozygot dominant; Na Na) ble valgt som sæddonorer i studien.Fuglene ble oppdrettet ved Research Poultry Farm ved Fakultet for landbruk, Ashit University, Ashit Governorate, Egypt.Fugler ble holdt i individuelle bur (30 x 40 x 40 cm), utsatt for et lysprogram (16 timer lys og 8 timer mørke) og matet med en diett som inneholdt 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g kalsium hver.5 gram tilgjengelig fosfor per kilo kosthold.
I følge data 36, ​​37 ble sæd samlet inn fra menn ved magemassasje.Det ble samlet inn 45 sædprøver fra 15 menn over 3 dager.Sæd (n = 15/dag) ble umiddelbart fortynnet 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som inneholder kaliumdifosfat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fruktose (0,5 d) vannfritt natrium.acetat (0,43 g), tris(hydroksymetyl)aminometan (0,195 g), kaliumsitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonofosfat (0,065 g), magnesiumklorid (0,034 g) og H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 3 kg/m3kg mOsm3kg.Fortynnede sædprøver ble først undersøkt i lysmikroskop for å sikre god sædkvalitet (fuktighet) og deretter oppbevart i vannbad ved 37°C frem til bruk innen en halvtime etter oppsamling.
Kinematikken og reologien til sædceller er beskrevet ved hjelp av et system av mikrofluidiske enheter.Sædprøver ble ytterligere fortynnet til 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, lastet inn i en mikrofluidisk enhet (se nedenfor), og kinetiske parametere ble bestemt ved å bruke et datastyrt sædanalysesystem (CASA) som tidligere er utviklet for karakterisering av mikrofluidik.om mobiliteten til sædceller i flytende medier (Department of Mechanical Engineering, Fakultet for ingeniørvitenskap, Assiut University, Egypt).Programtillegget kan lastes ned på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Kurvehastighet (VCL, μm/s), lineær hastighet (VSL, μm/s) og gjennomsnittlig banehastighet (VAP, μm/s) ble målt.Videoer av sædceller ble tatt med et omvendt Optika XDS-3 fasekontrastmikroskop (med 40x objektiv) koblet til et Tucson ISH1000-kamera ved 30 fps i 3 s.Bruk CASA-programvaren til å studere minst tre områder og 500 sædbaner per prøve.Den innspilte videoen ble behandlet med en hjemmelaget CASA.Definisjonen av motilitet i CASA plug-in er basert på svømmehastigheten til sædcellene sammenlignet med strømningshastigheten, og inkluderer ikke andre parametere som side-til-side-bevegelse, da dette har vist seg å være mer pålitelig i væskestrøm.Reologisk bevegelse beskrives som bevegelsen av sædceller mot væskestrømmens retning.Spermatozoer med reologiske egenskaper ble delt på antall bevegelige sædceller;spermatozoer som var i ro og konvektivt bevegelige spermatozoer ble ekskludert fra tellingen.
Alle kjemikalier som ble brukt ble hentet fra Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egypt) med mindre annet er angitt.Anordningen ble produsert som beskrevet av El-sherry et al.40 med noen modifikasjoner.Materialene som ble brukt til å fremstille mikrokanalene inkluderer glassplater (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativ resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) og polyaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanaler er fremstilt ved hjelp av myk litografi.Først ble en klar, beskyttende ansiktsmaske med ønsket mikrokanaldesign skrevet ut på en høyoppløselig skriver (Prismatic, Cairo, Egypt og Pacific Arts and Design, Markham, ON).Mesterne ble laget med glassplater som underlag.Platene ble renset i aceton, isopropanol og avionisert vann og deretter belagt med et 20 µm lag av SU8-25 ved spinnbelegg (3000 rpm, 1 min).SU-8-lagene ble deretter forsiktig tørket (65°C, 2 min og 95°C, 10 min) og utsatt for UV-stråling i 50 s.Stek etter eksponering ved 65 °C og 95 °C i 1 min og 4 minutter for å kryssbinde eksponerte SU-8-lag, etterfulgt av utvikling i diacetonalkohol i 6,5 minutter.Stek vaflene hardt (200°C i 15 min) for å størkne SU-8-laget ytterligere.
PDMS ble fremstilt ved å blande monomeren og herderen i et vektforhold på 10:1, deretter avgasset i en vakuumekssikkator og helt på SU-8 hovedrammen.PDMS ble herdet i en ovn (120°C, 30 min), deretter ble kanalene kuttet ut, separert fra masteren og perforert for å tillate at rør festes ved innløpet og utløpet av mikrokanalen.Til slutt ble PDMS-mikrokanaler permanent festet til objektglass ved bruk av en bærbar koronaprosessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) som beskrevet andre steder.Mikrokanalen brukt i denne studien måler 200 µm × 20 µm (B × H) og er 3,6 cm lang.
Væskestrømmen indusert av hydrostatisk trykk inne i mikrokanalen oppnås ved å holde væskenivået i innløpsreservoaret over høydeforskjellen Δh39 i utløpsreservoaret (fig. 1).
hvor f er friksjonskoeffisienten, definert som f = C/Re for laminær strømning i en rektangulær kanal, hvor C er en konstant avhengig av sideforholdet til kanalen, L er lengden på mikrokanalen, Vav er gjennomsnittshastigheten inne i mikrokanalen, Dh er den hydrauliske diameteren til kanalen, g – tyngdeakselerasjon.Ved å bruke denne ligningen kan den gjennomsnittlige kanalhastigheten beregnes ved å bruke følgende ligning: