Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Det er behov for et pålitelig in vitro-system som nøyaktig kan reprodusere det fysiologiske miljøet i hjertet for medikamenttesting.Den begrensede tilgjengeligheten av humane hjertevevskultursystemer har ført til unøyaktige tolkninger av hjertemedisineffekter.
Før klinisk forskning er det nødvendig med pålitelige in vitro-systemer som nøyaktig kan reprodusere det fysiologiske miljøet til det menneskelige hjertet.
I løpet av det siste tiåret har åtte ikke-kardiovaskulære legemidler blitt trukket tilbake fra klinisk bruk fordi de forårsaker forlengelse av QT-intervallet som fører til ventrikulære arytmier og plutselig død7.Nyere studier har vist at denne begrensningen delvis kan overvinnes ved å bruke tidlig hiPS-CM for å danne hjertevevshydrogeler kort tid etter utbruddet av spontane sammentrekninger og gradvis økende elektrisk stimulering over tid.Denne heterogeniteten til ikke-kardiomyocyttpopulasjoner11,12,13 i det voksne pattedyrhjertet er en viktig barriere for å modellere hjertevev ved bruk av individuelle celletyper.Disse hovedbegrensningene understreker viktigheten av å utvikle metoder for å dyrke intakt myokardvev under fysiologiske og patologiske forhold.
Dyrkede tynne (300 µm) seksjoner av det menneskelige hjertet har vist seg å være en lovende modell av intakt humant myokard.Denne metoden gir tilgang til et komplett 3D flercellet system som ligner på menneskelig hjertevev.Frem til 2019 var imidlertid bruken av dyrkede hjerteseksjoner begrenset av den korte (24 timer) kulturoverlevelsen.Dette skyldes en rekke faktorer, inkludert mangel på fysisk-mekanisk strekk, luft-væske-grensesnittet og bruk av enkle medier som ikke støtter behovene til hjertevev.Imidlertid brukte disse studiene ikke den dynamiske tredimensjonale fysisk-mekaniske belastningen av hjertesyklusen, siden hjerteseksjoner ble belastet med enten isometriske strekkkrefter 17 eller lineær auxotonisk belastning 18 .Disse metodene for vevsstrekking resulterte i undertrykkelse av mange hjertegener eller overuttrykk av gener assosiert med unormale strekkresponser.Spesielt Pitoulis et al.19 utviklet et dynamisk hjerteskive -kulturbad for rekonstruksjon av hjertesyklus ved bruk av maktoverføringsbackback og spenningsstasjoner.Selv om dette systemet muliggjør mer nøyaktig in vitro hjertesyklusmodellering, begrenser kompleksiteten og den lave gjennomstrømningen til metoden bruken av dette systemet.Laboratoriet vårt har nylig utviklet et forenklet kultursystem som bruker elektrisk stimulering og et optimalisert medium for å opprettholde levedyktigheten til deler av svine- og menneskelig hjertevev i opptil 6 dager20,21.
I det nåværende manuskriptet beskriver vi en hjertevevskulturmodell (CTCM) ved bruk av deler av svinehjertet som inneholder humorale signaler for å rekapitulere tredimensjonal hjertefysiologi og patofysiologisk utspiling i løpet av hjertesyklusen.Denne CTCM kan øke nøyaktigheten av preklinisk medikamentprediksjon til et nivå som aldri tidligere er oppnådd ved å tilby et kostnadseffektivt hjertesystem med middels gjennomstrømning som etterligner fysiologien/patofysiologien til pattedyrhjertet for preklinisk medikamenttesting.
Hemodynamiske mekaniske signaler spiller en kritisk rolle for å opprettholde kardiomyocyttfunksjon in vitro 22,23,24.For å unngå overdreven vevsstrekk under diastole, ble en 3D-utskriftsenhet brukt for å øke vevsstørrelsen med 25 % (fig. 1b).
Fire enheter er koblet til én PPD via en pneumatisk krets, og trykksensorer settes inn i den hemostatiske ventilen for å overvåke trykket i den pneumatiske kretsen.
I CTCM blir lufttrykket i luftkammeret omdannet til synkront trykk i væskekammeret og induserer fysiologisk utvidelse av hjerteskiven (Figur 2a og tilleggsfilm 1).Kunst.Denne prosentvise strekningen har vist seg å tilsvare en fysiologisk sarkomlengde på 2,2–2,3 um for normal hjerteseksjonskontraktilitet17,19,25.Amplituden og hastigheten på vevsbevegelse (fig. 2C, D) tilsvarte strekk under hjertesyklusen og tiden under systol og diastol (fig. 2B).For å evaluere effekten av elektrisk stimulering på kontraktilitet under kulturen, utviklet vi en metode for å bestemme aktiv deformitet ved bruk av en skyggeleggingsalgoritme (supplerende fig. 2A, B) og var i stand til å skille mellom deformiteter med og uten elektrisk stimulering.I det bevegelige området av kuttet (R6-9) var spenningen under elektrisk stimulering 20% ​​høyere enn i fravær av elektrisk stimulering, noe som indikerer bidraget til elektrisk stimulering til kontraktil funksjon.
Representative spor av luftkammertrykk, væskekammertrykk og vevsbevegelsesmålinger bekrefter at kammertrykket endrer væskekammertrykket, og forårsaker en tilsvarende bevegelse av vevsskiven.e Kvantifisering av syklustid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), sammentrekningstid (n = 19 skiver per gruppe), avspenningstid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), vevsbevegelse (n = 25 ).skiver)/gruppe fra forskjellige griser), topp systolisk hastighet (n = 24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskjellige griser) og topp relaksasjonshastighet (n=24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskjellige griser).f Representant belastningsanalyse spor av vevsseksjoner med (rød) og uten (blå) elektrisk stimulering, ti regionale områder av vevsseksjoner fra samme seksjon.Bunnpanelene viser kvantifisering av prosentvis forskjell i belastning i vevsseksjoner med og uten elektrisk stimulering i ti områder fra forskjellige seksjoner. (n = 8 skiver/gruppe fra forskjellige griser, Two-tailed Student t-test utføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skiver/gruppe fra forskjellige griser, Two-tailed Student t-test utføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, to-halet Students t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01「0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01「0,5） (n = 8 seksjoner/gruppe, fra forskjellige griser, tosidet Students t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Feilsøyler representerer gjennomsnittet ± standardavvik.
I vårt tidligere statiske biomimetiske hjerteskivekultursystem [20, 21] opprettholdt vi levedyktigheten, funksjonen og strukturell integritet av hjerteskiver i 6 dager ved å påføre elektrisk stimulering og optimalisere middels sammensetning.Etter 10 dager falt imidlertid disse tallene kraftig.Vi vil referere til seksjoner dyrket i vårt tidligere statiske biomimetiske kultursystem 20, 21 kontrollbetingelser (CTRL), og vi vil bruke vårt tidligere optimaliserte medium som MC -forhold og kultur under samtidig mekanisk og elektrisk stimulering (CTCM).kalt .Først bestemte vi at mekanisk stimulering uten elektrisk stimulering var utilstrekkelig til å opprettholde vevets levedyktighet i 6 dager (tilleggsfigur 3a,b).Interessant nok, med introduksjonen av fysio-mekanisk og elektrisk stimulering ved bruk av STCM, forble levedyktigheten til 12-dagers hjerteseksjoner den samme som i friske hjerteseksjoner under MS-forhold, men ikke under Ctrl-forhold, som vist ved MTT-analyse (fig. 1).3a).Dette antyder at mekanisk stimulering og simulering av hjertesyklusen kan holde vevsseksjoner levedyktige dobbelt så lenge som rapportert i vårt tidligere statiske kultursystem.Vurdering av den strukturelle integriteten til vevssnitt ved immunmerking av hjertetroponin T og connexin 43 viste imidlertid at konnexin 43-ekspresjon var signifikant høyere i MC-vev på dag 12 enn i kontroller samme dag.Ensartet connexin 43-ekspresjon og Z-skivedannelse ble imidlertid ikke fullt ut opprettholdt (fig. 3b).Vi bruker et rammeverk for kunstig intelligens (AI) for å kvantifisere strukturell vevsintegritet26, en bildebasert dyplæringspipeline basert på troponin-T og connexin-farging43 for å automatisk kvantifisere den strukturelle integriteten og fluorescensen til hjerteskiver når det gjelder styrken til lokalisering.Denne metoden bruker et Convolutional Neural Network (CNN) og et rammeverk for dyp læring for å pålitelig kvantifisere den strukturelle integriteten til hjertevev på en automatisert og objektiv måte, som beskrevet i referansen.26. MC-vev viste forbedret strukturell likhet med dag 0 sammenlignet med statiske kontrollseksjoner.I tillegg avslørte Massons trikromfarging en betydelig lavere prosentandel av fibrose under MS-forhold sammenlignet med kontrollforhold på dag 12 av kulturen (fig. 3c).Mens CTCM økte levedyktigheten til hjertevevsseksjoner på dag 12 til et nivå som ligner på friskt hjertevev, forbedret det ikke den strukturelle integriteten til hjerteseksjonene signifikant.
histogrammet viser kvantifiseringen av levedyktigheten til MTT friske hjerteseksjoner (D0) eller kultur av hjerteseksjoner i 12 dager i enten statisk kultur (D12 kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll). ) ), 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe utført i en VA-seksjoner/gruppe;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). Histogram som viser kvantifisering av MTT-levedyktighet i ferske hjerteseksjoner (D0) eller hjerteseksjoner dyrket i 12 dager i statisk kultur (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll)), 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe fra forskjellige svin, enveis en vei en tester; #### P <0,0001 sammenlignet med D0, ** P <0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).b Troponin-T (grønn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i nylig isolerte hjerteseksjoner (D0) eller hjerteseksjoner dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller CTCM-forhold (MC) i 12 dager) av representative immunfluorescensbilder (blank skala = 100 µm). Kunstig intelligens kvantifisering av hjertevevsstrukturell integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskjellige gris, enveis ANOVA-test utføres; #### P <0.0001 sammenlignet med D0 og **** P <0.0001 sammenlignet med D12 CTRL). Kunstig intelligens kvantifisering av hjertevevsstrukturell integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; #### P <0,0001 sammenlignet med D0 og **** P <0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Orde грз от разных свиней, проводитс/ Kvantifisering av den strukturelle integriteten til hjertevev ved kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjoner/grupper fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; ####p < 0,0001 vs. med D0 og D****01 sammenlignet med D0 og D****01).°人工 智能量化 心脏 组织 完整性 ° Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl) , 7 (D512 Ctrl) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 på сравниш12Ctrl). Kunstig intelligens for å kvantifisere den strukturelle integriteten til hjertevev (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjoner/gruppe hver av forskjellige griser, enveis ANOVA-test; #### P <0,0001 vs .D0 for sammenligning **** P <0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) for hjerteskiver farget med Massons trikromflekk (Skala bare = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og 120p < D0 og 120 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) for hjerteskiver farget med Massons trikromfarge (Skala bare = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0,0001***p < D0 og D0,0 ***p1). c Репрезентативные изображения (слева) og количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюний p.t. p. 0 ### ANOVA; D0 og ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). C Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) av hjerteseksjoner farget med Massons trikromflekk (ubelagt skala = 500 um) (n = 10 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; ### p <0 .0001 sammenlignet med D0 og *** P <0.001 C Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) av hjerteseksjoner farget med Massons trikromflekk (blank = 500 um) (n = 10 seksjoner/gruppe, hver fra en annen gris, testet ved enveis analyse av varians; #### p <0,0001 sammenlignet med d0, *** p <0,001 sammenlignet med d12 ctrlFeilsøyler representerer gjennomsnittet ± standardavvik.
Vi screenet derfor for små molekyler ved å bruke våre statiske kontrollkulturer20,21 på grunn av det lille antallet forstyrrende faktorer.Deksametason (Dex), trijodtyronin (T3) og SB431542 (SB) ble valgt for denne skjermen.I tillegg er både Dex (et glukokortikoid) og SB kjent for å undertrykke betennelse29,30.
Etter innledende screening utførte vi en sammenligning av head-to-head av 4 kulturforhold (figur 4A): CTRL: hjerteseksjoner dyrket i vår tidligere beskrevne statiske kultur ved bruk av vårt optimaliserte medium;MC: hjerteseksjoner dyrket i CTCM ved å bruke vårt tidligere optimaliserte medium;og MT: CTCM med T3 og Dex lagt til mediet.Interessant nok resulterte ikke tilsetningen av T3 og DEX til transwell -kulturer (TD) i en betydelig forbedring i levedyktighet sammenlignet med CTRL -forhold, noe som indikerer en viktig rolle som mekanisk stimulering for å opprettholde levedyktigheten til hjerteseksjoner.
et eksperimentelt designdiagram som viser de fire kulturbetingelsene som brukes til å evaluere effekten av mekanisk stimulering og T3/Dex-tilskudd på medium i 12 dager. B Bar Graph viser kvantifisering av levedyktighet 12 dager etter kultur under alle 4 kulturforhold (CTRL, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD og D12 MT, 12 (D12-testen (D12-testen er utforming av Pigograf (#pig. 0 og ** P <0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). B 4 12 (D12 MC) b гистограма, показывающая все 4 уовия ктивирования (контроо, td, mt) и ж и иц и и и и и и и и и и и и и и и к к к к к к к к к к к и и и и и и и. 0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/г0000, оррнеее1 с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с mine ** P <0,01 по сравнению сонтролем d12). C-strekkgrafen viser kvantifisering av glukosefluks 12 dager etter kultur under alle 4 kulturforhold (CTRL, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ### P <0.001, sammenlignet med D0 og *** P <0.001 sammenlignet med D1. C-strekkgrafen viser kvantifisering av glukosefluks 12 dager etter kultur under alle 4 kulturforhold (CTRL, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ### P <0.001, sammenlignet med D0 og *** P <0.001 sammenlignet med D1. C-histogram viser kvantifisering av glukosefluks 12 dager etter kultur under alle 4 kulturforhold (kontroll, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteseksjoner (D0) (n = 6 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; ### P <0,001 sammenlignet med D0 og *** P <0,001 sammenlignet med D12 CTR. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 卌 ， ， 缌 ， ， 缌 AN测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C гистограма, показывающая количественннн0 ования (контрол, TD, MC и Mt) по сравнению со свежими срезами серца (D) (6 йз й й й й й ых с й й й й й й й й й й й й и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и иAL ли проведены теты anova; ### p <0,001 по сравнению с d0, *** p <0,001 по сравнению с D12 (контрол). Feilstolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
Metabolsk avhengighet av overgangen fra fettsyreoksidasjon til glykolyse er et kjennetegn på kardiomyocytt-dedifferensiering.Umodne kardiomyocytter bruker først og fremst glukose for ATP -produksjon og har hypoplastiske mitokondrier med få cristae5,32.Glukoseutnyttelsesanalyser viste at under MC- og MT -forhold var glukoseutnyttelse lik den i dag 0 vev (figur 4C).Imidlertid viste CTRL -prøver en betydelig økning i glukoseutnyttelse sammenlignet med friskt vev.I tillegg viste belastningsanalyse at belastningsnivåene forble de samme som i friskt hjertevev i 12 dager under MT- og MS-forhold (fig. 4d).
For å analysere den generelle innvirkningen av CTCM og T3/Dex på det globale transkripsjonslandskapet av hjerteskivevev, utførte vi RNAseq på hjerteskiver fra alle de fire forskjellige kulturforholdene (tilleggsdata 1).Interessant nok viste MT-seksjoner høy transkripsjonslikhet med friskt hjertevev, med bare 16 differensielt uttrykt av 13 642 gener.Som vi viste tidligere, viste imidlertid CTRL -skiver 1229 differensialt uttrykte gener etter 10–12 dager i kultur (fig. 4E).Interessant nok viste Ctrl-seksjonene nedregulering av hjerte- og cellesyklusgener og aktivering av inflammatoriske genprogrammer.Disse dataene antyder at dedifferensiering, som normalt skjer etter langvarig dyrking, er fullstendig svekket under MT-forhold (tilleggsfigur 8a,b).Nøye studier av sarkomergener viste at bare under MT-forhold blir genene som koder for sarkomeren (fig. 4f) og ionekanalen (tilleggsfig. 9) bevart, og beskytter dem mot undertrykkelse under Ctrl-, TD- og MC-forhold.

). Kunstig intelligens kvantifisering av hjertevevstrukturell integritet (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; #### P <0.0001 sammenlignet med D0 og*P <0.05, eller** 对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼片忇ﺛ行片忇ﺛ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，渔****p < 0,0000 Ctrl#### p <0,0001 по сравнению с d0 и*p <0,05 или **** p <0,0001 по сравнению с d12 ctrl). #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering for hjerteskiver farget med Massons trikrom-farge (Skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, sammenlignet med enveis ANO.## test er <1NO.##, sammenlignet med <1NO.##; p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering for hjerteskiver farget med Massons trikrom-farge (Skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, sammenlignet med enveis ANO.## test er <1NO.##, sammenlignet med <1NO.##; p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b репентативные изображения и количественная инейа = 500 м) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 Mt) 0 0001 по сравнению с d0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с d12 ctrl). B Representative bilder og kvantifisering av hjerteseksjoner farget med Massons trikrom (skala -bar = 500 um) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) fra forskjellige PIG -er fra D12 CTR -pigs/gruppe, ).Feilsøyler representerer gjennomsnittet ± standardavvik.
Til slutt ble CTCMs evne til å etterligne hjertehypertrofi vurdert ved å øke hjertestrekk.I CTCM økte toppluftkammertrykket fra 80 mmHg til 80 mmHg.Kunst.(Fig. 6A).Strekk og hastighet på hjertevev under sammentrekning og avslapning forble konstant i løpet av seks dager med kultur (fig. 6C).Hjertevev fra MT -forhold ble utsatt for normal strekk (MT (normal)) eller overtrekkforhold (MT (OS)) i seks dager.I tillegg, etter seks dager med dyrking, økte cellestørrelsen i MT (OS) (fig. 7B) betydelig sammenlignet med seksjoner av MT -hjerte (normal).I tillegg ble NFATC4 -kjernefysisk translokasjon betydelig økt i overstrøket vev (fig. 7C).Disse resultatene viser den progressive utviklingen av patologisk ombygging etter hyperdistensjon og støtter konseptet om at CTCM-enheten kan brukes som en plattform for å studere strekkindusert hjertehypertrofi-signalering.
B Representative strekkprosent- og strekkhastighetskurver for normalt strukket (oransje) og overtrekkede (blå) vevsseksjoner.Feilsøyler representerer gjennomsnittet ± standardavvik.
et søylediagram kvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjon i dyrkingsmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal strekk (Norm) eller overstrekk (OS) forhold (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser, < 0-veis strekk, < 0-veis strekk er utført. et søylediagram kvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjon i kulturmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal strekk (Norm) eller overstrekking (OS) forhold (n​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige A**NO-griser, < 0-veis sammenlignet med strekk).Kvantitativt histogram av NT-ProBNP-konsentrasjon i kulturmedium fra hjerteskiver dyrket under forhold med normal MT-strekk (norm) eller overstrekk (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) skiver /gruppe fra forskjellige griser, tofaktoranalyse av varians er utført; En kvantifisering av NT-proBNP-konsentrasjon i hjerteskiver dyrket under MT normal strekk (norm) eller overstretch (OS) forhold (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM 和 D4 MTOS) fra forskjellige 猪 切片 切片 切片/组 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 和 和 和 *P <0,05). c Representative bilder av MTOS-hjerteskiver på dag 0 og 6 for troponin-T- og NFATC4-immunmerking og kvantifisering av NFATC4-translokasjon i kjernen til CM fra forskjellige griser (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe, to-halet t-kriterium <' -s;5p;Feilsøyler representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
Når svinehjerteseksjoner ble utsatt for disse faktorene, forble deres levedyktighet, strukturelle integritet, metabolske aktivitet og transkripsjonsuttrykk de samme som i friskt hjertevev etter 12 dagers dyrking.Samlet sett støtter disse resultatene den kritiske rollen til fysiologiske kulturforhold for å opprettholde en normal hjertefenotype og gir en plattform for medikamentscreening.
Slike komplekse cellulære interaksjoner er vanskelige å rekonstruere in vitro ved co-kultur av individuelle celletyper, men kan lett oppnås ved å bruke den organotypiske naturen til hjerteseksjoner.
I disse studiene ble deler av hjertet enten belastet med isometriske strekkkrefter17, lineær auxotonisk belastning18, eller hjertesyklusen ble gjenskapt ved hjelp av krafttransdusertilbakemelding og spenningsdrift.Imidlertid bruker disse metodene enakset vevsstrekk uten miljøoptimalisering, noe som resulterer i undertrykkelse av mange hjertegener eller overuttrykk av gener assosiert med unormale strekkresponser.CTCM beskrevet her gir en 3D elektromekanisk stimulus som etterligner den naturlige hjertesyklusen når det gjelder syklustid og fysiologisk strekk (25 % strekk, 40 % systole, 60 % diastole og 72 slag per minutt).Selv om denne tredimensjonale mekaniske stimuleringen alene ikke er tilstrekkelig for å opprettholde vevsintegritet, er en kombinasjon av humoral og mekanisk stimulering ved bruk av T3/Dex nødvendig for å opprettholde vevets levedyktighet, funksjon og integritet tilstrekkelig.
I tillegg fremmer T3 MHC-α-ekspresjon og MHC-β-nedregulering, og fremmer dannelsen av myofibriller med raske rykninger i modne kardiomyocytter sammenlignet med myofibriller med langsomme rykninger i føtal CM.Dex virker på glukokortikoidreseptorer og har vist seg å øke myokardiell kontraktilitet i isolerte perfuserte hjerter;
Sammenlignet med Ctrl, forbedret tilsetning av T3 og Dex til CTCM (MT) kulturer levedyktigheten og opprettholdt lignende transkripsjonsprofiler, strukturell integritet og metabolsk aktivitet med friskt hjertevev i 12 dager.Det skal bemerkes at selv om hjerteremodellering og fibrose vanligvis involverer intakte organer hvis sirkulerende celler kan gi de passende cytokinene samt fagocytose og andre remodelleringsfaktorer, kan deler av hjertet fortsatt etterligne den fibrotiske prosessen som respons på stress og traumer.inn i myofibroblaster.Det skal bemerkes at CTCM-parametere kan moduleres ved å endre trykk/elektrisk amplitude og frekvens for å simulere mange tilstander som takykardi, bradykardi og mekanisk sirkulasjonsstøtte (mekanisk ubelastet hjerte).Dette gjør systemet til en middels gjennomstrømming for narkotikatesting.Avslutningsvis viser denne studien at mekanisk strekk og humoral stimulering er avgjørende for å opprettholde kulturen av hjertevevsseksjoner.
Selv om dataene som presenteres her tyder på at CTCM er en veldig lovende plattform for modellering av intakt myokard, har denne kulturmetoden noen begrensninger.Hovedbegrensningen til CTCM-kultur er at den pålegger skivene kontinuerlige dynamiske mekaniske belastninger, noe som utelukker muligheten til aktivt å overvåke hjerteskivens sammentrekninger under hver syklus.I tillegg, på grunn av den lille størrelsen på hjerteseksjonene (7 mm), er muligheten til å evaluere systolisk funksjon utenfor kultursystemer ved bruk av tradisjonelle kraftsensorer begrenset.Denne begrensningen vil imidlertid kreve ytterligere arbeid og kan løses i fremtiden ved å introdusere metoder for optisk overvåking av funksjonen til hjerteskiver i kultur, for eksempel optisk kartlegging ved bruk av kalsium og spenningsfølsomme fargestoffer.I CTCM ble trykk indusert i motsatte retninger for å reprodusere 25 % fysiologisk strekk i diastole (full strekk) og systole (lengde på sammentrekning under elektrisk stimulering) i svært store vev.
Den overstretch-induserte ombyggingen rapportert i dette manuskriptet er begrenset til å etterligne hypertrofiske hyperstretch-signaler.Dermed kan denne modellen hjelpe i studiet av strekkindusert hypertrofisk signalering uten behov for humorale eller nevrale faktorer (som ikke eksisterer i dette systemet).Ytterligere studier er nødvendig for å øke mangfoldet av CTCM, for eksempel vil samdyrking med immunceller, sirkulerende plasmahumorale faktorer og innervering når samdyrking med nevronceller forbedre mulighetene for sykdomsmodellering med CTCM.
Tretten griser ble brukt i denne studien.Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.Aortabuen ble klemt fast og hjertet ble perfusert med 1 L steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/mL heparin, pH opp til 7,4); сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. 将 心脏 保存 在 的 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 冰上 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。。。。。。。。将 心脏 保存 在 的 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 冰上 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。。。。。。。。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min.
En tynn silikamembran skiller kulturkammeret fra separasjonsplaten.Silikonmembranen er laserskåret fra 0,02 ″ tykt silikonark og har en hardhet på 35a.Bunn- og topp silikonpakningene er laserskåret fra 1/16 ″ tykt silikonark og har en hardhet på 50A.316L rustfrie stålskruer og vingemuttere brukes til å feste blokken og skape en lufttett forsegling.
De sveitsiske maskinkontaktene på PCB er koblet til grafittelektroder med sølvbelagte kobbertråder og bronse 0-60 skruer skrudd inn i elektrodene.Det trykte kretskortet er plassert i dekselet til 3D -skriveren.
Når trykket inne i luftkammeret øker, utvides den fleksible silikonmembranen oppover, og tvinger mediet under vevstedet.Vevsområdet vil deretter bli strukket ved denne utvisningen av væske, og etterligne den fysiologiske ekspansjonen av hjertet under diastol.På toppen av avslapning ble elektrisk stimulering påført gjennom grafittelektroder, noe som reduserte trykket i luftkammeret og forårsaket sammentrekning av vevssnitt.Inne i røret er en hemostatisk ventil med en trykksensor for å oppdage trykket i luftsystemet.Trykket som føles av trykksensoren påføres en datasamler koblet til den bærbare datamaskinen.Dette tillater kontinuerlig overvåking av trykket inne i gasskammeret.Da det maksimale kammertrykket ble nådd (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), ble datainnsamlingsenheten beordret til å sende et signal til C-PACE-EM-systemet for å generere et bifasisk spenningssignal i 2 ms, satt til 4 V.
Hjerteseksjoner ble oppnådd og dyrkingsbetingelser i 6 brønner ble utført som følger: Overfør de høstede hjertene fra overføringskaret til et brett som inneholder kald (4°C) kardioplegi.Den venstre ventrikkelen ble isolert med et sterilt blad og kuttet i biter av 1-2 cm3.Disse vevsblokkene ble festet til vevsstøtter med vevslim og plassert i et vibrerende mikrotomvevsbad som inneholdt Tyroudes løsning og kontinuerlig oksygenert (3 g/l 2,3-butanedion monooxime (BLCL (0,4 mm (0,3 mm), 6 mm), 6 mm (0,4 mm (0,4 mm (0,4 mm (0,3 mm (0,6 g). 8 g), 1 mM Mgcl2 (1 ml 1 m løsning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 m løsning), opptil 1 L DDH2O).Den vibrerende mikrotomen ble satt til å kutte 300 µm tykke skiver med en frekvens på 80 Hz, en horisontal vibrasjonsamplitude på 2 mm og en fremdriftshastighet på 0,03 mm/s.Vevsbadet ble omgitt av is for å holde løsningen kjølig og temperaturen ble holdt ved 4°C.For transwellkulturer ble vevsseksjoner festet til sterile 6 mM brede polyuretanstøtter og plassert i 6 ml optimalisert medium (199 medium, 1x dets supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin og 2x antibiotisk-antifungal).Elektrisk stimulering (10 V, frekvens 1,2 Hz) ble påført vevsseksjonene gjennom C-Pace.For TD-forhold ble fersk T3 og Dex tilsatt ved 100 nM og 1 μM ved hvert mediumskifte.Mediet er mettet med oksygen før utskifting 3 ganger om dagen.Vevsseksjoner ble dyrket i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
For CTCM-kulturer ble vevsseksjoner plassert på en skreddersydd 3D-skriver i en petriskål som inneholder modifisert Tyroudes løsning.Enheten er designet for å øke størrelsen på hjertets skive med 25% av området for støtten.Dette gjøres for at delene av hjertet ikke skal strekke seg etter å ha blitt overført fra Tyrodes løsning til mediet og under diastole.Den totale behandlingstiden for alle enheter bør ikke overstige 2 timer.Etter at 6 vevsseksjoner var festet til støtteringene, ble CTCM-enheten satt sammen.CTCM-kulturkammeret er ferdigfylt med 21 ml pre-oksygenert medium.Overfør vevsseksjonene til kulturkammeret og fjern forsiktig eventuelle luftbobler med en pipette.Vevsseksjonen føres deretter inn i hullet og presses forsiktig på plass.Til slutt setter du elektrodehetten på enheten og overfører enheten til inkubatoren.Koble deretter CTCM til luftslangen og C-PACE-EM-systemet.C-PACE-EM-systemet ble konfigurert til å levere 4 V ved 1,2 Hz under bifasisk pacing i 2 ms.Mediet ble skiftet to ganger om dagen og elektrodene ble skiftet en gang om dagen for å unngå akkumulering av grafitt på elektrodene.Om nødvendig kan vevsseksjoner fjernes fra kulturbrønnene for å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha falt under dem.For MT-behandlingsforhold ble T3/Dex tilsatt frisk med hver mediumbytte med 100 nM T3 og 1 μM Dex.CTCM-enhetene ble dyrket i en inkubator ved 37°C og 5 % CO2.
For å få strukket bane av hjerteskiver ble et spesielt kamerasystem utviklet.Et SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ble brukt med en Navitar Zoom 7000 18-108mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA).Visualisering ble utført ved romtemperatur etter å ha erstattet mediet med friskt medium.Først ble open source-programvare (Musclemotion43) brukt med Image-J for å kvantifisere bevegelsen til hjerteskiver.Manuelt segmenterte masker brukes på alle bilder i en rammesekvens og deretter ført til Musclemotion-plugin-modulen.Muskelbevegelse bruker den gjennomsnittlige intensiteten til pikslene i hver ramme for å kvantifisere bevegelsen i forhold til referanserammen.Data ble registrert, filtrert og brukt til å kvantifisere syklustid og vurdere vevstrekk under hjertesyklusen.Den innspilte videoen ble etterbehandlet ved hjelp av et førsteordens nullfase digitalt filter.For å kvantifisere vevsstrekning (topp-til-topp), ble topp-til-topp-analyse utført for å skille mellom topper og bunner i det registrerte signalet.I tillegg utføres detrending ved å bruke et 6. ordens polynom for å eliminere signaldrift.
Vi segmenterte deretter vevsregionene og påførte en form for skyggeleggingsalgoritme på det segmenterte vevet (supplementær fig. 2A).
Fast vev ble dehydrert i 10% og 20% ​​sukrose i 1 time, deretter i 30% sukrose over natten.Oppbevar OCT-innstøpingsblokker ved -80 °C til separering.
For å fjerne OCT fra hjerteseksjoner, varm lysbildene på en varmeblokk ved 95 ° C i 5 minutter.BSA ble deretter fjernet og lysbildene ble vasket med PBS.Merk hver prøve med en blyant.

OCT ble fjernet fra prøvene som beskrevet ovenfor.Etter å ha fjernet OCT, dypp objektglassene i Bouins løsning over natten.Lysbildene ble deretter skylt med destillert vann i 1 time og deretter plassert i en Bibrich aloe acid fuchsin -løsning i 10 minutter.Deretter ble lysbildene vasket med destillert vann og plassert i en løsning av 5% fosfomolybden/5% fosfotungsyre i 10 minutter.Overfør objektglassene direkte i den blå anilinløsningen i 15 minutter uten å skylle dem.Deretter ble objektglassene vasket med destillert vann og plassert i en 1% eddiksyreløsning i 2 minutter.Objektglassene ble tørket i 200 N etanol og overført til xylen.Fargede objektglass ble visualisert ved hjelp av et Keyence-mikroskop med et 10x objektiv.Fibrosearealprosent ble kvantifisert ved bruk av Keyence Analyzer-programvare.
Spesielt ble en kirurgisk stans med en diameter på 6 mM brukt for å sikre ensartet vevsstørrelse under MTT -analyse.Seksjonene blir inkubert ved 37 ° C i 3 timer, og det levende vevet metaboliserer MTT -underlaget for å danne en lilla formazanforbindelse.Bytt ut MTT -løsningen med 1 ml DMSO og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter for å trekke ut lilla formazan fra hjerteseksjoner.Avlesningene ble normalisert til vekten av hver skive av hjertet.
Deretter ble røret plassert i et scintillasjonsrør som inneholdt 500 ul DH2O for å fordampe [3H] 2O i 72 timer ved 37 ° C.Fjern deretter mikrosentrifugerøret fra scintillasjonsrøret og tilsett 10 ml scintillasjonsvæske.Scintillasjonstall ble utført ved bruk av en Tri-Carb 2900TR Liquid Scintillation Analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Glukoseutnyttelsen ble deretter beregnet under hensyntagen til [5-3H]-glukosespesifikk aktivitet, ufullstendig likevekt og bakgrunn, fortynning av [5-3H]-til umerket glukose og scintillasjonstellereffektivitet.Dataene normaliseres til massen av seksjoner av hjertet.
RNASEC -bibliotekforberedelse, sekvensering og dataanalyse ble utført som følger:
1 μg RNA per prøve ble brukt som startmateriale for fremstilling av RNA -biblioteket.Kort fortalt ble mRNA renset fra totalt RNA ved bruk av magnetiske kuler festet med poly-T-oligonukleotider.Fragmentering utføres ved bruk av toverdige kationer ved høy temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).First Strand cDNA ble syntetisert ved bruk av tilfeldige heksamerprimere og M-MULV omvendt transkriptase (RNase H-).For valg av cDNA-fragmenter av foretrukket lengde 150-200 bp.bibliotekfragmenter ble renset ved å bruke AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA).PCR ble deretter utført ved bruk av PHUSJON-DNA-polymerase, universelle PCR-primere og indeks (X) primere.Til slutt ble PCR-produkter renset (AMPure XP-system) og bibliotekkvalitet vurdert på et Agilent Bioanalyzer 2100-system.Rå bildefiler fra Illumina ble konvertert til råavlesninger ved hjelp av CASAVA Base Calling.Rådata lagres i FASTQ(fq)-formatfiler som inneholder lesesekvenser og tilsvarende basekvaliteter.Velg HISAT2 for å matche filtrerte sekvenseringsavlesninger til Sscrofa11.1-referansegenomet.Spleising avlesninger fra RNA SEQ -data kan justeres effektivt ved hjelp av HISAT2, det raskeste systemet som er tilgjengelig for øyeblikket, med samme eller bedre nøyaktighet enn noen annen metode.
Overfloden av transkripsjoner gjenspeiler direkte nivået av genuttrykk.Genekspresjonsnivåer blir vurdert av overflod av transkripsjoner (sekvenseringstall) assosiert med genomet eller eksonene.Antall leser er proporsjonalt med genuttrykknivåer, genslengde og sekvenseringsdybde.FPKM (fragmenter per tusen basepar av transkript sekvensert per million basepar) ble beregnet og P-verdier av differensialekspresjon ble bestemt ved å bruke DESeq2-pakken.
Kvantitativ RT-PCR ble utført ved bruk av en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brønns transparent reaksjonsplate (Thermo, kat.nr. 4483319) og mikroamp optisk lim (Thermo, kat.nr. 4311971).Reaksjonsblandingen besto av 5 µl Taqman Fast Advanced Master-blanding (Thermo, kat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer og 3,5 µl H2O blandet per brønn.
Medieutgivelse av NT-ProBNP ble vurdert ved bruk av NT-ProBNP-settet (gris) (kat.nr. MBS2086979, MyBioSource) i henhold til produsentens protokoll.Kort fortalt ble 250 ul av hver prøve og standard tilsatt i duplikat til hver brønn.Umiddelbart etter å ha tilsatt prøven, tilsett 50 ul analysreagens A til hver brønn.Rist platen forsiktig og forsegle med fugemasse.Deretter ble tablettene inkubert ved 37°C i 1 time.Aspirer deretter løsningen og vask brønnene 4 ganger med 350 µl 1X vaskeløsning, inkuber vaskeløsningen i 1-2 minutter hver gang.Tilsett deretter 100 µl analysereagens B per brønn og forsegl med plateforsegling.Tabletten ble ristet forsiktig og inkubert ved 37°C i 30 minutter.Aspirer løsningen og vask brønnene 5 ganger med 350 µl 1X vaskeløsning.Tilsett 90 ul substratoppløsning til hver brønn og forsegle platen.Inkuber platen ved 37 ° C i 10-20 minutter.Tilsett 50 ul stoppløsning til hver brønn.Platen ble umiddelbart målt ved bruk av en cytasjon (biotek) plateleser satt til 450 nm.
Effektanalyser ble utført for å velge gruppestørrelsene som vil gi >80 % kraft for å oppdage en 10 % absolutt endring i parameteren med en 5 % Type I feilrate. Анализ мощности ы ыонен дя выора разеров рру, кототорые оеюатизччатизчатизчатизчатизчатизатататататизататизататчатчата 8ччаY %ynnib еия параметра с 5% частотой шибок типа I. 进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 中 10 ％ 绝对 变化 和 5 ％ I 型 的 组。。进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 中 10 ％ 绝对 变化 和 5 ％ I 型 的 组。。 Ы провеnen ееения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En effektanalyse ble utført for å velge en gruppestørrelse som ville gi >80 % kraft for å oppdage 10 % absolutt parameterendring og 5 % type I feilrate.Vevsseksjoner ble tilfeldig valgt før eksperimentet.Alle analysene var tilstandsblinde og prøver ble dekodet bare etter at alle data hadde blitt analysert.GraphPad Prism Software (San Diego, CA) ble brukt til å utføre alle statistiske analyser. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05. Дя всей статистики p-зачения читалис значиыи при значениях <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05.对于 所有 统计 ， P 值 在值 <0,05 时 被 是 显着 的。对于 所有 统计 ， P 值 在值 <0,05 时 被 是 显着 的。 Дя всей статистики p-зачения читалис значиыи при значениях <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05.Enveis eller toveis ANOVA ble brukt for å bestemme betydning mellom flere grupper.
For mer informasjon om studiedesign, se naturforskningsrapporten som er knyttet til denne artikkelen.