Zikomo pochezera Nature.com.Mtundu wa msakatuli womwe mukugwiritsa ntchito uli ndi chithandizo chochepa cha CSS.Kuti mudziwe zambiri, tikupangira kuti mugwiritse ntchito msakatuli wosinthidwa (kapena kuletsa Compatibility Mode mu Internet Explorer).Pakadali pano, kuti tithandizire kupitilizabe, tidzapereka tsambalo popanda masitayilo ndi JavaScript.
Liquid biopsy (LB) ndi lingaliro lomwe likukula mwachangu m'munda wa zamankhwala.Lingaliroli makamaka limachokera ku kuzindikira kwa zidutswa za DNA ya extracellular (ccfDNA), yomwe imatulutsidwa makamaka ngati tiziduswa tating'ono pambuyo pa imfa ya selo muzinthu zosiyanasiyana.Gawo laling'ono la tizidutswa timeneti limachokera ku minyewa yakunja (yachilendo) kapena zamoyo.M’ntchito yamakono, tagwiritsa ntchito mfundo imeneyi kwa mbalame za mussel, zamtundu wa sentinel zomwe zimadziwika kuti zimatha kusefa kwambiri m’madzi a m’nyanja.Timagwiritsa ntchito luso la mussels kuti likhale ngati zosefera zachilengedwe kuti tigwire zidutswa za DNA zachilengedwe kuchokera kuzinthu zosiyanasiyana kuti tidziwitse zamoyo zosiyanasiyana za m'mphepete mwa nyanja.Zotsatira zathu zikuwonetsa kuti mussel hemolymph ili ndi zidutswa za DNA zomwe zimasiyana kwambiri kukula kwake, kuyambira 1 mpaka 5 kb.Kutsatizana kwa mfuti kunawonetsa kuti zidutswa zambiri za DNA ndizochokera kunja kwa tizilombo toyambitsa matenda.Pakati pawo, tidapeza zidutswa za DNA kuchokera ku mabakiteriya, archaea, ndi ma virus, kuphatikiza ma virus omwe amadziwika kuti amapatsira makamu osiyanasiyana omwe amapezeka m'mphepete mwa nyanja zam'mphepete mwa nyanja.Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB lomwe limagwiritsidwa ntchito kwa mussels limayimira chidziwitso chochuluka koma chomwe sichinazindikiridwebe chokhudza kusiyanasiyana kwa tizilombo tating'onoting'ono m'mphepete mwa nyanja.
Zotsatira za kusintha kwa nyengo (CC) pamitundu yosiyanasiyana yazamoyo zam'madzi ndi gawo lomwe likukula mwachangu la kafukufuku.Kutentha kwapadziko lonse sikungoyambitsa zovuta zakuthupi, komanso kumakankhira malire a kukhazikika kwa kutentha kwa zamoyo zam'madzi, zomwe zimakhudza malo okhala mitundu ingapo, kuwapangitsa kufunafuna mikhalidwe yabwino [1, 2].Kuphatikiza pa kukhudza zamoyo zosiyanasiyana za metazoans, CC imasokoneza kusamalidwa bwino kwa kuyanjana kwa tizilombo toyambitsa matenda.Tizilombo tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono tating'ono ta dysbacteriosis timayambitsa chiwopsezo chachikulu cha zamoyo zam'madzi [3, 4].Amakhulupirira kuti SS imagwira ntchito yofunika kwambiri pakufa kwa anthu ambiri, lomwe ndi vuto lalikulu pakuwongolera zachilengedwe zapadziko lonse lapansi [5, 6].Iyi ndi nkhani yofunika kwambiri poganizira momwe zamoyo zambiri zam'madzi zimakhudzira zachuma, zachilengedwe komanso zakudya.Izi ndizowona makamaka kwa ma bivalves omwe amakhala m'madera a polar, komwe zotsatira za CK zimakhala zachangu komanso zowopsa [6, 7].M'malo mwake, ma bivalves monga Mytilus spp.amagwiritsidwa ntchito kwambiri kuyang'anira zotsatira za CC pazamoyo zam'madzi.N'zosadabwitsa kuti ma biomarker ambiri apangidwa kuti aziyang'anira thanzi lawo, nthawi zambiri amagwiritsa ntchito njira ziwiri zomwe zimagwiritsa ntchito ma biomarkers okhudzana ndi ntchito za enzymatic kapena ma cell a cell, monga ma cell ndi phagocytic ntchito [8].Njirazi zimaphatikizansopo kuyeza kwa kuchuluka kwa zizindikiro za kupanikizika kwapadera komwe kumaunjikana m'minofu yofewa pambuyo pa kuyamwa kwa madzi ambiri a m'nyanja.Komabe, kusefera kwapamwamba kwambiri komanso mawonekedwe otseguka ozungulira a bivalves amapereka mwayi wopanga ma biomarker atsopano a hemolymph pogwiritsa ntchito lingaliro la madzi amadzimadzi (LB), njira yosavuta komanso yocheperako yowongolera odwala.zitsanzo za magazi [9, 10].Ngakhale mitundu ingapo ya mamolekyu ozungulira imatha kupezeka mu LB yamunthu, lingaliro ili limakhazikitsidwa makamaka pakuwunika kwa DNA kwa zidutswa za DNA (ccfDNA) zozungulira mu plasma.Ndipotu, kupezeka kwa DNA yozungulira mu plasma yaumunthu kwadziwika kuyambira pakati pa zaka za m'ma 20 [11], koma ndi zaka zaposachedwa pomwe kubwera kwa njira zotsatizana zapamwamba kwachititsa kuti adziwe matenda okhudzana ndi ccfDNA.Kukhalapo kwa tizidutswa ta DNA tozungulira kameneka ndi chifukwa cha kutulutsidwa kwa DNA ya genomic (nyukiliya ndi mitochondrial) pambuyo pa kufa kwa selo. Mwa anthu athanzi, kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kotsika (<10 ng/mL) koma kumatha kuonjezedwa nthawi 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena opsinjika, zomwe zimapangitsa kuwonongeka kwa minofu. Mwa anthu athanzi, kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kotsika (<10 ng/mL) koma kumatha kuonjezedwa nthawi 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena opsinjika, zomwe zimapangitsa kuwonongeka kwa minofu. Mu здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может вышаться pa 5–10 раз у больных песни правди стрессу, приводящему к повреждению тканей. Mwa anthu athanzi, kuchuluka kwa cccDNA nthawi zambiri kumakhala kotsika (<10 ng/mL), koma kumatha kuwonjezeka ndi 5-10 nthawi kwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena kupsinjika komwe kumabweretsa kuwonongeka kwa minofu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者者 中致组织损伤.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 病理 或 承叅 压承叅 压 1从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентоный что приводит к повреждению тканей. Kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kotsika (<10 ng/ml) mwa anthu athanzi, koma kumatha kuwonjezeka 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena kupsinjika, zomwe zimapangitsa kuwonongeka kwa minofu.Kukula kwa zidutswa za ccfDNA kumasiyana mosiyanasiyana, koma nthawi zambiri kumakhala kuyambira 150 mpaka 200 bp.[12].Kusanthula kwa ccfDNA yodzipangira yokha, mwachitsanzo, ccfDNA kuchokera ku maselo abwinobwino kapena osinthidwa, angagwiritsidwe ntchito kuti azindikire kusintha kwa majini ndi epigenetic komwe kulipo mu nyukiliya ndi / kapena mitochondrial genome, potero kuthandiza azachipatala kuti asankhe mankhwala ochiritsira omwe amapangidwa ndi maselo [13].Komabe, ccfDNA ingapezeke kuchokera kuzinthu zakunja monga ccfDNA kuchokera ku maselo a fetus pa nthawi ya mimba kapena ku ziwalo zoikidwa [14,15,16,17].ccfDNA ndiyonso gwero lofunikira la chidziwitso chodziwira kukhalapo kwa ma nucleic acid a wothandizira matenda (akunja), omwe amalola kuti asazindikire matenda ofala omwe sanazindikiridwe ndi zikhalidwe zamagazi, kupewa biopsy ya minofu yomwe ili ndi kachilombo [18].Kafukufuku waposachedwa wasonyeza kuti magazi a munthu ali ndi chidziwitso chochuluka chomwe chingagwiritsidwe ntchito kuzindikira tizilombo toyambitsa matenda ndi tizilombo toyambitsa matenda, komanso kuti pafupifupi 1% ya ccfDNA yomwe imapezeka mu plasma yaumunthu ndi yochokera kunja [19].Kafukufukuyu akuwonetsa kuti zamoyo zosiyanasiyana zamoyo zomwe zimazungulira ma microbiome zitha kuyesedwa pogwiritsa ntchito kusanthula kwa ccfDNA.Komabe, mpaka posachedwapa, lingaliroli linkagwiritsidwa ntchito mwa anthu okha, komanso, pang'ono, mu zinyama zina [20, 21].
Mu pepala lomwe lilipo, timagwiritsa ntchito mphamvu ya LB kusanthula ccfDNA ya Aulacomya atra, mitundu yakumwera yomwe imapezeka ku subantarctic Kerguelen Islands, gulu la zisumbu zomwe zili pamtunda waukulu womwe unapanga zaka 35 miliyoni zapitazo.kuphulika kwa mapiri.Pogwiritsa ntchito makina oyesera a in vitro, tinapeza kuti zidutswa za DNA m'madzi a m'nyanja zimatengedwa mwamsanga ndi mussels ndikulowa m'chipinda cha hemolymph.Kutsatizana kwa mfuti kwawonetsa kuti mussel hemolymph ccfDNA ili ndi zidutswa za DNA zake zokha komanso zomwe sizinali zokha, kuphatikiza mabakiteriya a symbiotic ndi zidutswa za DNA zochokera ku biomes monga momwe zimakhalira m'mphepete mwa nyanja zam'madzi ozizira.Hemolymph ccfDNA ilinso ndi ma virus omwe amachokera ku ma virus omwe ali ndi magulu osiyanasiyana.Tidapezanso zidutswa za DNA kuchokera ku nyama zokhala ndi maselo ambiri monga nsomba za mafupa, anemones am'nyanja, algae ndi tizilombo.Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB litha kugwiritsidwa ntchito bwino kwa zamoyo zam'madzi zam'madzi kuti apange zochulukirapo zama genomic repertoire muzamoyo zam'madzi.
Akuluakulu (utali wa 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) ndi Aulacomya atra (A. atra) anasonkhanitsidwa kuchokera kumphepete mwa nyanja yamwala ya Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Zilumba za Kerguelen mu December 2018. Ena akuluakulu amtundu wa buluu (Mytilus spp.) Anapezedwa kuchokera kwa wogulitsa malonda (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ndipo anayikidwa mu kutentha (4 ° C) aerated tank yomwe ili ndi 10-20 L ya 32 ‰ brine yokumba.(mchere wa mchere wopangidwa ndi nyanja Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Pa kuyesa kulikonse, kutalika ndi kulemera kwa zipolopolo payekha zimayesedwa.
Protocol yaulere ya pulogalamuyi ikupezeka pa intaneti (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Mwachidule, LB hemolymph inasonkhanitsidwa kuchokera ku minofu ya abductor monga momwe tafotokozera [22].The hemolymph inafotokozedwa ndi centrifugation pa 1200 × g kwa mphindi 3, supernatant anali atazizira (-20 ° C) mpaka ntchito.Pofuna kudzipatula komanso kuyeretsa cfDNA, zitsanzo (1.5-2.0 ml) zidasungunuka ndikusinthidwa pogwiritsa ntchito NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) molingana ndi malangizo a wopanga.ccfDNA inasungidwa pa -80 ° C mpaka kusanthula kwina.Muzoyesera zina, ccfDNA idapatulidwa ndikuyeretsedwa pogwiritsa ntchito QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).DNA yoyeretsedwa idayesedwa pogwiritsa ntchito kuyesa kwa PicoGreen.Kugawa kwachidutswa kwa ccfDNA yakutali kudawunikidwa ndi capillary electrophoresis pogwiritsa ntchito Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) pogwiritsa ntchito High Sensitivity DNA Kit.Kuyesaku kunachitika pogwiritsa ntchito 1 µl ya ccfDNA chitsanzo molingana ndi malangizo a wopanga.
Posanjikiza zidutswa za hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) adakonza malaibulale amfuti pogwiritsa ntchito zida za Illumina DNA Mix za Illumina MiSeq PE75 kit.Adapter yokhazikika (BioO) idagwiritsidwa ntchito.Mafayilo amtundu wa Raw akupezeka mu NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ndi SRR8924809).Kuwerenga koyambira kunayesedwa pogwiritsa ntchito FastQC [23].Trimmomatic [24] yakhala ikugwiritsidwa ntchito podulira ma adapter komanso kuwerenga kosawerengeka.Shotgun yowerengedwa ndi malekezero awiri awiri anali FLASH ophatikizidwa muzowerenga zazitali zazitali ndikuphatikizana kochepa kwa 20 bp kuti apewe zolakwika [25]. Zowerengera zophatikizidwa zidafotokozedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito nkhokwe ya bivalve NCBI Taxonomy (e value <1e-3 ndi 90% homology), ndipo kubisala movutikira kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26]. Zowerengera zophatikizidwa zidafotokozedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito nkhokwe ya bivalve NCBI Taxonomy (e value <1e-3 ndi 90% homology), ndipo kubisala movutikira kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26]. BLASTN BLASTN ndi BLASTN базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI-0, 9 маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Zowerengera zophatikizidwa zidafotokozedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito nkhokwe ya NCBI bivalve taxonomy (e value <1e-3 ndi 90% homology), komanso kuyika movutikira kocheperako kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使强特强 [26]掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 (（（<1e-3                                        掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩BLASTN ndi BLASTN, mwachitsanzo, BLASTN ndi BLASTN, ndi zina zambiri, <9> (9) а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Zowerengera zophatikizidwa zidafotokozedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito nkhokwe ya NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 ndi 90% homology), komanso kuyika movutikira kocheperako kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26].Kuwerenga kunagawidwa m'magulu awiri: okhudzana ndi machitidwe a bivalve (pano amatchedwa kudziwerengera) ndi osagwirizana (osadziwerengera okha).Magulu awiri adasonkhanitsidwa padera pogwiritsa ntchito MEGAHIT kupanga ma contigs [27].Pakadali pano, kugawidwa kwa taxonomic kwa ma microbiome achilendo adawerengedwa pogwiritsa ntchito Kraken2 [28] ndikuyimiridwa mowonekera ndi tchati cha Krona pa Galaxy [29, 30].Ma kmers abwino adatsimikiza kukhala kmers-59 kuchokera pazoyeserera zathu zoyambira. Self contigs ndiye adadziwika ndi kulumikizana ndi BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology) kuti afotokoze zomaliza. Self contigs ndiye adadziwika ndi kulumikizana ndi BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology) kuti afotokoze zomaliza. BLASTN (kapena BLASTN) были идентифицированы путем сопоставления BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значени10 e) нчательной аннотации. Self-contigs adadziwika pofananiza ndi BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ndi 60% homology) pomaliza.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐來识别自身里行。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN imakupatsani mwayi woti mugwiritse ntchito BLASTN (ndizolemba za BLASTN) е e <1e-10 ndi гомология 60%). Self-contigs adadziwika kuti afotokoze zomaliza pofananiza ndi BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ndi 60% homology). Mofananirako, ma contigs amagulu omwe sali eni adadziwika ndi BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology). Mofananirako, ma contigs amagulu omwe sali eni adadziwika ndi BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology). BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ndi гомология 60%). Mofananamo, ma contigs amagulu akunja adafotokozedwa ndi BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, знагогние 0 <6e-0%). Mofananamo, ma contigs omwe sali odzikonda adatchulidwa ndi BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ndi 60% homology). BLATX idachitidwanso pa nonself contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 ndi 60% homology). BLATX idachitidwanso pa nonself contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 ndi 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr ndi RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ndi 6%). BLATX idachitidwanso paomwe omwe sanadzipangire okha pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq NCBI nkhokwe zama protein (e value <1e-10 ndi 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ndi 60%). BLATX idachitidwanso paomwe sanali odzipangira okha pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq NCBI nkhokwe zama protein (e value <1e-10 ndi 60% homology).Maiwe a BLASTN ndi BLASTX osadzipangira okha amayimira ma contigs omaliza (onani fayilo yowonjezera).
Zoyambira zomwe zimagwiritsidwa ntchito pa PCR zalembedwa mu Table S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) idagwiritsidwa ntchito kukulitsa chibadwa cha ccfDNA.Zotsatirazi zidagwiritsidwa ntchito: denaturation pa 95 ° C kwa mphindi 3, 95 ° C kwa mphindi imodzi, ikani kutentha kwa mphindi imodzi, elongation pa 72 ° C kwa mphindi imodzi, kuzungulira 35, ndipo pamapeto pake 72 ° C mkati mwa mphindi 10..Zogulitsa za PCR zidalekanitsidwa ndi electrophoresis mu ma gels agarose (1.5%) okhala ndi SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) pa 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) adazolowera madzi am'nyanja a 500 ml (32 PSU) kwa maola 24 pa 4 ° C.DNA ya Plasmid yomwe ili ndi choyikamo chotsatana ndi galectin-7 cDNA (NCBI nambala ya L07769) idawonjezedwa ku vial pamapeto omaliza a 190 μg/μl.Nsomba zolumikizidwa pansi pamikhalidwe yofanana popanda kuwonjezera DNA zinali zowongolera.Tanki yowongolera yachitatu inali ndi DNA yopanda nkhanu.Kuwunika mtundu wa DNA m'madzi a m'nyanja, zitsanzo za madzi a m'nyanja (20 μl; kubwereza katatu) zinatengedwa kuchokera ku thanki iliyonse pa nthawi yosonyezedwa.Kwa plasmid DNA traceability, LB mussels adakololedwa pa nthawi zosonyezedwa ndikuwunikidwa ndi qPCR ndi ddPCR.Chifukwa cha kuchuluka kwa mchere m'madzi a m'nyanja, ma aliquots adachepetsedwa m'madzi amtundu wa PCR (1:10) asanayambe kuyesa kwa PCR.
Digital droplet PCR (ddPCR) idachitidwa pogwiritsa ntchito protocol ya BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Gwiritsani ntchito mbiri ya kutentha kuti mudziwe kutentha koyenera (Table S1).Madontho adapangidwa pogwiritsa ntchito jenereta ya QX200 (BioRad).ddPCR inachitika motere: 95 ° C kwa 5 min, 50 kuzungulira 95 ° C kwa 30 s ndi kupatsidwa annealing kutentha kwa 1 min ndi 72 ° C kwa 30 s, 4 ° C kwa 5 min ndi 90 ° C mkati 5 mphindi.Chiwerengero cha madontho ndi machitidwe abwino (chiwerengero cha makope / µl) adayesedwa pogwiritsa ntchito chowerengera chotsitsa cha QX200 (BioRad).Zitsanzo zokhala ndi madontho ochepera 10,000 zidakanidwa.Kuwongolera mawonekedwe sikunachitike nthawi iliyonse ddPCR imayendetsedwa.
qPCR idachitidwa pogwiritsa ntchito Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) ndi zoyambira za LGALS7.Ma PCR onse ochulukira adachitidwa mu 20 µl pogwiritsa ntchito QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR inayambika ndi 15 min incubation pa 95 ° C yotsatiridwa ndi maulendo a 40 pa 95 ° C kwa masekondi 10 ndi 60 ° C kwa masekondi 60 ndi kusonkhanitsa deta imodzi.Mapiritsi osungunuka anapangidwa pogwiritsa ntchito miyeso yotsatizana pa 95 ° C kwa 5 s, 65 ° C kwa 60 s, ndi 97 ° C kumapeto kwa qPCR.qPCR iliyonse idachitidwa katatu, kupatula zitsanzo zowongolera.
Popeza nkhonozi zimadziwika kuti zimasefera kwambiri, tidafufuza kaye ngati zingathe kusefa ndi kusunga zidutswa za DNA zomwe zimapezeka m'madzi a m'nyanja.Tinalinso ndi chidwi chofuna kudziwa ngati tizidutswa tating'onoting'ono tomwe timaunjikira mu semi-open lymphatic system.Tinathetsa nkhaniyi moyesera pofufuza za tsogolo la zidutswa za DNA zosungunuka zomwe zinawonjezeredwa ku akasinja a mussel.Kuti tithandizire kutsata zidutswa za DNA, tidagwiritsa ntchito DNA yakunja (osati yaumwini) ya plasmid yomwe ili ndi jini ya galectin-7.ddPCR imafufuza zidutswa za plasmid za DNA m'madzi a m'nyanja ndi mussels.Zotsatira zathu zimasonyeza kuti ngati kuchuluka kwa zidutswa za DNA m'madzi a m'nyanja kunakhalabe kosasinthasintha pakapita nthawi (mpaka masiku 7) pakalibe nkhono, ndiye pamaso pa nkhono izi mlingo pafupifupi unasowa mkati mwa maola 8 (mkuyu 1a, b).Zidutswa za exogenous DNA mosavuta wapezeka mkati 15 min mu intravalvular madzimadzi ndi hemolymph (mkuyu. 1c).Zidutswazi zitha kuzindikirikabe mpaka mawola 4 pambuyo powonekera.Ntchito yosefayi yokhudzana ndi zidutswa za DNA ikufanana ndi kusefa kwa mabakiteriya ndi algae [31].Zotsatirazi zikusonyeza kuti nkhono zimatha kusefa ndikuunjikira DNA yachilendo m'zigawo zawo zamadzimadzi.
Kuchuluka kwa plasmid DNA m'madzi a m'nyanja pamaso (A) kapena kusakhalapo (B) kwa mussels, kuyeza ndi ddPCR.Mu A, zotsatira zimawonetsedwa ngati maperesenti, ndi malire a mabokosi omwe akuyimira 75th ndi 25th percentiles.Mzere wopindika wa logarithmic umawonetsedwa mofiira, ndipo malo omwe ali ndi imvi amayimira 95% nthawi yodalirika.Mu B, mzere wofiira umayimira tanthawuzo ndipo mzere wa buluu umayimira 95% nthawi yodalirika ya ndende.C Kuchuluka kwa plasmid DNA mu hemolymph ndi valvular madzimadzi a mussels nthawi zosiyanasiyana pambuyo pa kuwonjezera plasmid DNA.Zotsatira zimaperekedwa ngati makope athunthu opezeka/mL (±SE).
Kenako, tidafufuza komwe ccfDNA imasonkhanitsidwa kuchokera ku nkhono za mussel ku Kerguelen Islands, gulu lakutali la zisumbu zomwe zili ndi mphamvu zochepa za anthropogenic.Pachifukwa ichi, cccDNA yochokera ku mussel hemolymphs inasiyanitsidwa ndikuyeretsedwa ndi njira zomwe zimagwiritsidwa ntchito poyeretsa cccDNA yaumunthu [32, 33].Tinapeza kuti kuchuluka kwa hemolymph ccfDNA mu mussels ndi ma micrograms otsika pa ml hemolymph range (onani Table S2, Zowonjezera Zowonjezera).Kuchuluka kumeneku kumakhala kwakukulu kwambiri kuposa anthu athanzi (otsika nanograms pa millilita), koma nthawi zina, odwala khansa, mlingo wa ccfDNA ukhoza kufika ma micrograms angapo pa millilita [34, 35].Kufufuza kwa kukula kwa hemolymph ccfDNA kunasonyeza kuti zidutswazi zimasiyana kwambiri kukula kwake, kuyambira 1000 bp mpaka 1000 bp.mpaka 5000 bp (mkuyu 2).Zotsatira zofananazo zinapezedwa pogwiritsa ntchito silica-based QIAamp Investigator Kit, njira yomwe imagwiritsidwa ntchito mu sayansi yazamalamulo kuti adzilekanitse ndi kuyeretsa DNA ya genomic kuchokera ku zitsanzo zochepa za DNA, kuphatikizapo ccfDNA [36].
Woimira ccfDNA electrophoregram ya mussel hemolymph.Yotengedwa ndi NucleoSnap Plasma Kit (pamwamba) ndi QIAamp DNA Investigator Kit.B Chiwembu cha violin chosonyeza kugawa kwa hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) mu mussels.Mizere yakuda ndi yofiira imayimira pakati ndi quartiles yoyamba ndi yachitatu, motero.
Pafupifupi 1% ya ccfDNA mwa anthu ndi anyani ali ndi gwero lachilendo [21, 37].Poganizira njira yozungulira yozungulira ya ma bivalves, madzi am'nyanja okhala ndi tizilombo tating'onoting'ono, komanso kukula kwa mussel ccfDNA, tidayerekeza kuti mussel hemolymph ccfDNA ikhoza kukhala ndi dziwe lolemera komanso losiyanasiyana la DNA ya tizilombo tating'onoting'ono.Kuti tiyese lingaliro ili, tidatsata hemolymph ccfDNA kuchokera ku zitsanzo za Aulacomya atra zomwe zinasonkhanitsidwa ku Kerguelen Islands, zomwe zidawerengedwa mopitilira 10 miliyoni, 97.6% yomwe idadutsa kuwongolera bwino.Zowerengerazo zidasankhidwa molingana ndi magwero aumwini komanso osakhala aumwini pogwiritsa ntchito BLASTN ndi NCBI bivalve databases (mkuyu S1, Zowonjezera Zowonjezera).
Mwa anthu, DNA ya nyukiliya ndi mitochondrial imatha kutulutsidwa m'magazi [38].Komabe, mu kafukufuku wamakono, sikunali kotheka kufotokoza mwatsatanetsatane DNA ya nyukiliya ya mussels, chifukwa chakuti A. atra genome sinatsatidwe kapena kufotokozedwa.Komabe, tinatha kuzindikira zidutswa zingapo za ccfDNA zachiyambi chathu pogwiritsa ntchito laibulale ya bivalve (Fig. S2, Supplementary Information).Tinatsimikiziranso kukhalapo kwa zidutswa za DNA zachiyambi chathu mwa kuwongolera kwa PCR kukulitsa kwa majini a A. atra omwe adatsatiridwa (mkuyu 3).Mofananamo, popeza kuti mitochondrial genome ya A. atra ikupezeka m'madawunite a anthu, munthu angapeze umboni wa kukhalapo kwa zidutswa za mitochondrial ccfDNA mu hemolymph ya A. atra.Kukhalapo kwa zidutswa za DNA ya mitochondrial kunatsimikiziridwa ndi kukulitsa kwa PCR (mkuyu 3).
Mitundu yosiyanasiyana ya mitochondrial inalipo mu hemolymph ya A. atra (madontho ofiira - chiwerengero cha katundu: SRX5705969) ndi M. platensis (madontho a buluu - chiwerengero cha katundu: SRX5705968) chokwezedwa ndi PCR.Chithunzi chosinthidwa kuchokera ku Breton et al., 2011 B Kukweza kwa hemolymph supernatant kuchokera ku A. atra Kusungidwa pa pepala la FTA.Gwiritsani ntchito nkhonya ya 3 mm kuti muwonjezere mwachindunji ku chubu cha PCR chokhala ndi PCR mix.
Poganizira za kuchuluka kwa tizilombo tating'onoting'ono m'madzi a m'nyanja, poyambirira tidayang'ana kwambiri mawonekedwe a ma DNA a microbial mu hemolymph.Kuti tichite izi, timagwiritsa ntchito njira ziwiri zosiyana.Njira yoyamba idagwiritsa ntchito Kraken2, pulogalamu yotsatizana ndi ma algorithm yomwe imatha kuzindikira masanjidwe a tizilombo molondola ngati BLAST ndi zida zina [28].Kuwerenga kwa 6719 kunatsimikiziridwa kuti ndi chiyambi cha mabakiteriya, pamene 124 ndi 64 anali ochokera ku archaea ndi mavairasi, motero (mkuyu 4).Zidutswa za DNA za bakiteriya zambiri zinali Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ndi Bacteroidetes (17%) (mkuyu 4a).Kugawa uku kumagwirizana ndi maphunziro am'mbuyomu a marine blue mussel microbiome [39, 40].Gammaproteobacteria anali gulu lalikulu la Proteobacteria (44%), kuphatikizapo Vibrionales ambiri (mkuyu 4b).Njira ya ddPCR inatsimikizira kukhalapo kwa zidutswa za Vibrio DNA mu ccfDNA ya A. atra hemolymph (Mkuyu 4c) [41].Kuti mudziwe zambiri zokhudza chiyambi cha mabakiteriya a ccfDNA, njira yowonjezera inatengedwa (mkuyu S2, Zowonjezera Zowonjezera). Pachifukwa ichi, zowerengera zomwe zidadutsana zidasonkhanitsidwa ngati zowerengera-mapeto ndipo adaziyika ngati zaumwini (bivalves) kapena osadzipangira okha pogwiritsa ntchito BLASTN ndi mtengo wa 1e−3 ndi cutoff ndi > 90% homology. Pachifukwa ichi, zowerengera zomwe zidadutsana zidasonkhanitsidwa ngati zowerengera-mapeto ndipo adaziyika ngati zaumwini (bivalves) kapena osadzipangira okha pogwiritsa ntchito BLASTN ndi mtengo wa 1e−3 ndi cutoff ndi > 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ndi были классифицированы как были собраны как чтения с парными концами ndi были классифицированы как были собраны как чтения с парными концами ndi были классифицированы как собственные обственные происхождению с использованием BLASTN ndi значения e 1e-3 ndi отсечения с гомологией> 90%. Pachifukwa ichi, zowerengera zophatikizika zidasonkhanitsidwa ngati zowerengera zomaliza ndipo zidasankhidwa kukhala zachibadwidwe (bivalve) kapena zosakhala zoyambira kugwiritsa ntchito BLASTN ndi mtengo wa 1e-3 ndi cutoff ndi> 90% homology.在這种情况下，重叠的读数组装為配对末端話数，并使用BLASTN 和1e-3 ndi 90% 同源自性制成的戶恶类）或非自身來源.在 這种 情况 下 , 重叠 读数 组装 為配末端 读数 , 使用 使用 1e-3 的 發生和 > 90 （双 壳类） 非 自身。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ndi классифицированы как собственыные (двуствонский) происхождению с использованием значений e BLASTN ndi 1e-3 ndi zotsatira гомологии> 90%. Pachifukwa ichi, zowerengera zophatikizika zidasonkhanitsidwa ngati zowerengera zomalizidwa ndikuziika ngati zawo (bivalves) kapena osakhala apachiyambi pogwiritsa ntchito e BLASTN ndi 1e-3 mfundo ndi homology> 90%.Popeza A. atra genome sichinatsatidwebe, tinagwiritsa ntchito de novo assembly strategy ya MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Okwana 147,188 contigs adadziwika kuti amadalira (bivalves) kochokera.Ma contigs awa adaphulika ndi ma e-value a 1e-10 pogwiritsa ntchito BLASTN ndi BLASTX.Njirayi idatithandiza kuzindikira zidutswa za 482 zopanda bivalve zomwe zili mu A. atra ccfDNA.Oposa theka (57%) mwa zidutswa DNA analandira kuchokera mabakiteriya, makamaka symbionts gill, kuphatikizapo sulfotrophic symbionts, ndi gill symbionts Solemya velum (mkuyu. 5).
Kuchuluka kwachibale pamtundu wamtundu.B Kusiyanasiyana kwa tizilombo ta phyla ziwiri zazikulu (Firmicutes ndi Proteobacteria).Kukulitsa koyimilira kwa ddPCR C Vibrio spp.A. Zidutswa za jini ya 16S rRNA (buluu) mu ma atra hemolymphs atatu.
Ma contigs osonkhanitsidwa 482 adawunikidwa.Mbiri yonse ya kugawa kwa taxonomic kwa metagenomic contig annotations (prokaryotes ndi eukaryotes).B Kugawa mwatsatanetsatane zidutswa za DNA za bakiteriya zodziwika ndi BLASTN ndi BLASTX.
Kusanthula kwa Kraken2 kunawonetsanso kuti mussel ccfDNA inali ndi zidutswa za DNA zakale, kuphatikizapo zidutswa za DNA za Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ndi Thaurmarcheota (11%) (mkuyu 6a).Kukhalapo kwa zidutswa za DNA zochokera ku Euryarchaeota ndi Crenarchaeota, zomwe zinapezeka kale m'magulu ang'onoang'ono a mussels aku California, siziyenera kudabwitsa [42].Ngakhale kuti Euryarchaeota nthawi zambiri imagwirizanitsidwa ndi mikhalidwe yoopsa, tsopano ikudziwika kuti Euryarchaeota ndi Crenarcheota ndi ena mwa ma prokaryotes omwe amapezeka kwambiri m'nyanja ya cryogenic [43, 44].Kukhalapo kwa tizilombo tating'onoting'ono ta methane mu mussel sizodabwitsa, chifukwa cha malipoti aposachedwa a kutuluka kwa methane kuchokera pansi pa Kerguelen Plateau [45] komanso kupanga ma methane ang'onoang'ono omwe amapezeka pamphepete mwa zilumba za Kerguelen [46].
Kenako chidwi chathu chinasintha ndikuwerenga ma virus a DNA.Monga momwe tikudziwira, aka ndi kafukufuku woyamba yemwe sanakwaniritse cholinga chake chokhudza kachilombo ka mussels.Monga kuyembekezera, tinapeza zidutswa za DNA za bacteriophages (Caudovirales) (Mkuyu 6b).Komabe, DNA yodziwika bwino kwambiri imachokera ku phylum of nucleocytoviruses, yomwe imadziwikanso kuti nuclear cytoplasmic big DNA virus (NCLDV), yomwe ili ndi genome yaikulu kwambiri ya kachilomboka kalikonse.Mkati mwa phylum iyi, ma DNA ambiri amatsatizana ndi mabanja a Mimimidoviridae (58%) ndi Poxviridae (21%), omwe zachilengedwe zake zimakhala ndi vertebrates ndi arthropods, pomwe gawo laling'ono la ma DNA awa ndi la algae odziwika bwino.Imawononga algae ya eukaryotic ya m'madzi.Zotsatirazi zidapezedwanso kuchokera ku kachilombo ka Pandora, kachilombo kakang'ono kamene kamakhala ndi kukula kwakukulu kwamtundu uliwonse wa ma virus omwe amadziwika.Chochititsa chidwi n'chakuti, mndandanda wa makamu omwe amadziwika kuti ali ndi kachilombo ka HIV, monga momwe amachitira hemolymph ccfDNA sequencing, anali aakulu (Chithunzi S3, Supplementary Information).Zimaphatikizapo mavairasi omwe amawononga tizilombo monga Baculoviridae ndi Iridoviridae, komanso mavairasi omwe amawononga amoeba, algae ndi vertebrates.Tidapezanso zotsatizana zofananira ndi Pithovirus sibericum genome.Ma pitoviruses (omwe amadziwikanso kuti "ma virus a zombie") adasiyanitsidwa koyamba ndi 30,000 wazaka zakutchire ku Siberia [47].Chifukwa chake, zotsatira zathu zimagwirizana ndi malipoti am'mbuyomu omwe akuwonetsa kuti si mitundu yonse yamakono ya ma virus awa yatha [48] ndikuti ma viruswa atha kukhalapo m'malo akutali amadzi am'madzi am'madzi.
Pomalizira pake, tinayesa kuti tione ngati tingapeze zidutswa za DNA kuchokera ku nyama zina zambirimbiri.Ma contigs akunja okwana 482 adadziwika ndi BLASTN ndi BLASTX okhala ndi malaibulale a nt, nr ndi RefSeq (genomic ndi protein).Zotsatira zathu zimasonyeza kuti pakati pa zidutswa zakunja za ccfDNA za nyama zambirimbiri DNA ya mafupa a mafupa amatsogolera (mkuyu 5).Panapezekanso zidutswa za DNA za tizilombo ndi zamoyo zina.Gawo lalikulu la zidutswa za DNA silinadziwike, mwina chifukwa cha kuchepa kwa mitundu yambiri ya zamoyo zam'madzi m'mabuku a genomic poyerekeza ndi zamoyo zapadziko lapansi [49].
Mu pepala ili, timagwiritsa ntchito lingaliro la LB kwa ma mussels, kunena kuti hemolymph ccfDNA kuwombera motsatizana kungapereke chidziwitso cha kapangidwe ka zamoyo zam'mphepete mwa nyanja.Makamaka, tidapeza kuti 1) mussel hemolymph ili ndi kuchuluka kwakukulu (miyezo ya microgram) yayikulu (~ 1-5 kb) yozungulira zidutswa za DNA;2) zidutswa za DNA izi ndizodziyimira pawokha komanso sizidziyimira pawokha 3) Pakati pa magwero akunja a zidutswa za DNA izi, tidapeza mabakiteriya, mabakiteriya komanso ma virus a DNA, komanso DNA ya nyama zina zambiri;4) Kuwunjika kwa zidutswa za ccfDNA zakunja mu hemolymph kumachitika mwachangu ndipo kumathandizira kusefa kwamkati kwa mamazelo.Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB, lomwe lakhala likugwiritsidwa ntchito makamaka pazamankhwala a biomedicine, likuphatikiza chidziwitso chochuluka koma chosawerengeka chomwe chingagwiritsidwe ntchito kumvetsetsa bwino kugwirizana pakati pa mitundu ya sentinel ndi chilengedwe chawo.
Kuphatikiza pa anyani, kudzipatula kwa ccfDNA kwanenedwapo ndi nyama zoyamwitsa, kuphatikiza mbewa, agalu, amphaka, ndi akavalo [50, 51, 52].Komabe, malinga ndi chidziwitso chathu, kafukufuku wathu ndi woyamba kufotokoza za kupezeka ndi kusanja kwa ccfDNA mu zamoyo zam'madzi zomwe zili ndi njira yotseguka yozungulira.Maonekedwe amtundu uwu komanso luso losefa la mussels, mwina, mwina, limafotokoza za kukula kosiyanasiyana kwa tizidutswa ta DNA tozungulira poyerekeza ndi zamoyo zina.Mwa anthu, tiziduswa ta DNA tozungulira m’magazi ndi tizidutswa tating’ono toyambira pa 150 mpaka 200 bp.ndi nsonga yapamwamba ya 167 bp [34, 53].Gawo laling'ono koma lofunika kwambiri la zidutswa za DNA zili pakati pa 300 ndi 500 bp kukula kwake, ndipo pafupifupi 5% ndi yaitali kuposa 900 bp.[54].Chifukwa chogawa kukula uku ndikuti gwero lalikulu la ccfDNA mu plasma limachitika chifukwa cha kufa kwa maselo, mwina chifukwa cha kufa kwa maselo kapena chifukwa cha necrosis ya ma cell a hematopoietic mwa anthu athanzi kapena chifukwa cha apoptosis yama cell chotupa mwa odwala khansa (omwe amadziwika kuti DNA chotupa chozungulira)., ctDNA).Kukula kwa hemolymph ccfDNA komwe tidapeza mu mussels kuyambira 1000 mpaka 5000 bp, kutanthauza kuti mussel ccfDNA ili ndi chiyambi chosiyana.Awa ndi malingaliro omveka, popeza mussels amakhala ndi mitsempha yotseguka ndipo amakhala m'malo am'madzi am'madzi okhala ndi kuchuluka kwa ma DNA a tizilombo tating'onoting'ono.M'malo mwake, kuyesa kwathu kwa labotale pogwiritsa ntchito DNA yakunja kwawonetsa kuti mussels amaunjikira zidutswa za DNA m'madzi a m'nyanja, pakangotha ​​​​maola angapo amawonongeka pambuyo potengera ma cell ndi / kapena kumasulidwa ndi / kapena kusungidwa m'mabungwe osiyanasiyana.Poganizira kusoŵa kwa ma cell (onse a prokaryotic ndi eukaryotic), kugwiritsa ntchito zipinda za intravalvular kumachepetsa kuchuluka kwa ccfDNA kuchokera kuzinthu zomwe zikuchokera komanso kuchokera kumayiko ena.Poganizira kufunikira kwa chitetezo cham'mimba cha bivalve komanso kuchuluka kwa ma phagocyte ozungulira, timaganizanso kuti ngakhale ccfDNA yakunja imalemeretsedwa pozungulira ma phagocyte omwe amaunjikira DNA yakunja ikameza tizilombo toyambitsa matenda komanso/kapena zinyalala zama cell.Kuphatikizidwa pamodzi, zotsatira zathu zikuwonetsa kuti bivalve hemolymph ccfDNA ndi malo apadera a chidziwitso cha mamolekyu ndipo imalimbitsa udindo wawo ngati mtundu wa sentinel.
Zomwe timapeza zikuwonetsa kuti kutsata ndi kusanthula zidutswa za hemolymph ccfDNA zomwe zimachokera ku bakiteriya zimatha kupereka chidziwitso chofunikira chokhudza zomera za bakiteriya ndi mabakiteriya omwe amapezeka m'madera ozungulira nyanja.Njira zotsatirira kuwombera zawulula kutsatizana kwa mabakiteriya a commensal A. atra gill omwe akanaphonya ngati njira zodziwika bwino za 16S rRNA zikadagwiritsidwa ntchito, chifukwa mwa zina ndi kukondera kwa library.Ndipotu, kugwiritsa ntchito kwathu deta ya LB yosonkhanitsidwa kuchokera ku M. platensis mumsewu womwewo wa mussel ku Kerguelen unasonyeza kuti mapangidwe a mabakiteriya okhudzana ndi gill anali ofanana ndi mitundu yonse ya mussel (mkuyu S4, Zowonjezera Zowonjezera).Kufanana kumeneku kwa nkhono ziwiri zosiyana siyana kungasonyeze momwe mabakiteriya amapangidwira kumalo ozizira, sulfure, ndi mapiri a Kerguelen [55, 56, 57, 58].Tizilombo tambiri tochepetsa sulfure talongosoledwa bwino tikamakolola nkhanu kuchokera kumadera a m'mphepete mwa nyanja omwe ali ndi bioturbated [59], monga gombe la Port-au-France.Kuthekera kwina ndikuti zomera za mussel commensal zitha kukhudzidwa ndi kufalikira kopingasa [60, 61].Kafukufuku wowonjezereka akufunika kuti adziwe kugwirizana pakati pa malo a m'nyanja, pansi pa nyanja, ndi mapangidwe a mabakiteriya ogwirizana mu mussels.Maphunzirowa akupitilira pakali pano.
Kutalika ndi kuchuluka kwa hemolymph ccfDNA, kuphweka kwake kuyeretsedwa, komanso khalidwe lapamwamba lololeza kuthamangitsidwa kwa mfuti ndi zina mwa ubwino wambiri wogwiritsa ntchito mussel ccfDNA kuyesa zamoyo zosiyanasiyana m'mphepete mwa nyanja.Njirayi ndiyothandiza makamaka pakuzindikiritsa magulu a ma virus (ma virome) muzachilengedwe [62, 63].Mosiyana ndi mabakiteriya, archaea, ndi eukaryotes, majeremusi a tizilombo alibe majini otetezedwa ndi phylogenetically monga 16S sequences.Zotsatira zathu zikuwonetsa kuti ma biopsies amadzimadzi ochokera ku mitundu yowonetsera ngati mussels amatha kugwiritsidwa ntchito kuzindikira zidutswa zambiri za kachilombo ka ccfDNA zomwe zimadziwika kuti zimapatsira omwe amakhala m'mphepete mwa nyanja.Izi zikuphatikizapo mavairasi omwe amadziwika kuti amapatsira protozoa, arthropods, tizilombo, zomera, ndi tizilombo toyambitsa matenda (mwachitsanzo, bacteriophages).Kugawa kofananako kunapezedwa pamene tinayang'ana hemolymph ccfDNA virome ya blue mussels (M. platensis) yomwe inasonkhanitsidwa mumtambo womwewo wa mussel ku Kerguelen (Table S2, Supplementary Information).Kutsatana kwa mfuti za ccfDNA ndi njira yatsopano yomwe ikukulirakulira pakufufuza za virome ya anthu kapena zamoyo zina [21, 37, 64].Njirayi ndiyothandiza kwambiri powerenga ma virus a DNA amitundu iwiri, chifukwa palibe jini imodzi yomwe imasungidwa pakati pa ma virus onse a DNA amitundu iwiri, omwe akuyimira mitundu yosiyanasiyana komanso yotakata ya ma virus ku Baltimore [65].Ngakhale ambiri mwa mavairasiwa amakhalabe osadziwika ndipo angaphatikizepo mavairasi ochokera kumadera osadziwika bwino a dziko lapansi [66], tapeza kuti ma viromes ndi magulu amtundu wa mussels A. atra ndi M. platensis amagwera pakati pa mitundu iwiriyi.mofanana (onani chithunzi S3, zambiri zowonjezera).Kufanana kumeneku sizodabwitsa, chifukwa kungasonyeze kusowa kwa kusankhidwa kwa DNA komwe kulipo m'chilengedwe.Maphunziro amtsogolo pogwiritsa ntchito RNA yoyeretsedwa pakali pano akufunika kuti awonetsere RNA virome.
Pakufufuza kwathu, tidagwiritsa ntchito mapaipi okhwima kwambiri omwe adasinthidwa kuchokera ku ntchito ya Kowarski ndi anzawo [37], omwe adachotsa magawo awiri owerengera ndi ma contigs asanayambe komanso atatha kusonkhana kwa ccfDNA yachibadwidwe, zomwe zidapangitsa kuti anthu ambiri asawerenge.Choncho, sitinganene kuti ena mwa mawerengedwe osajambulidwawa angakhale akadali ndi chiyambi chawo, makamaka chifukwa chakuti tilibe chibadwa cha mtundu wa mussel.Tidagwiritsanso ntchito payipi iyi chifukwa timada nkhawa ndi ma chimera pakati pa owerenga okha komanso osadziwerengera okha komanso kutalika kowerengedwa kopangidwa ndi Illumina MiSeq PE75.Chifukwa china chowerengera mosadziwika bwino ndikuti ma virus ambiri am'madzi, makamaka kumadera akutali monga Kerguelen, sanafotokozedwe.Tidagwiritsa ntchito Illumina MiSeq PE75, poganiza kuti chidutswa cha ccfDNA chimakhala chofanana ndi ccfDNA yamunthu.Pazofukufuku zamtsogolo, potengera zotsatira zathu zosonyeza kuti hemolymph ccfDNA imawerenga nthawi yayitali kuposa anthu ndi/kapena zoyamwitsa, timalimbikitsa kugwiritsa ntchito nsanja yotsatizana yoyenera kwambiri pazidutswa za ccfDNA zazitali.Mchitidwewu udzapangitsa kuti zikhale zosavuta kuzindikira zizindikiro zambiri zowunikira mozama.Kupeza mndandanda wathunthu wa A. atra nuclear genome womwe ulipo pano ungathandizenso kwambiri tsankho la ccfDNA kuchokera kuzinthu zomwe siziri zokha.Popeza kuti kafukufuku wathu wakhala akuyang'ana pa kuthekera kogwiritsa ntchito lingaliro la madzi amadzimadzi ku mussels, tikuyembekeza kuti pamene lingaliroli lidzagwiritsidwa ntchito pa kafukufuku wamtsogolo, zida zatsopano ndi mapaipi adzapangidwa kuti awonjezere kuthekera kwa njirayi kuti aphunzire kusiyanasiyana kwa ma mussels.Marine ecosystem.
Monga biomarker yachipatala yosasokoneza, ma plasma okwera a ccfDNA amagwirizanitsidwa ndi matenda osiyanasiyana, kuwonongeka kwa minofu, ndi kupsinjika maganizo [67,68,69].Kuwonjezeka kumeneku kumagwirizana ndi kutulutsidwa kwa zidutswa za DNA zomwe zimayambira pambuyo pa kuwonongeka kwa minofu.Tinathana ndi vutoli pogwiritsa ntchito kutentha kwambiri, komwe nyama zam'madzi zidawonekera pang'ono kutentha kwa 30 ° C.Tidasanthula izi pamitundu itatu yosiyanasiyana ya mussels muzoyeserera zitatu zodziyimira pawokha.Komabe, sitinapeze kusintha kulikonse kwa ccfDNA pambuyo pa kupsinjika kwa kutentha kwakukulu (onani Chithunzi S5, zambiri zowonjezera).Kupeza kumeneku kutha kufotokozera, mwina, kuti mussels ali ndi njira yozungulira yotseguka ndipo amaunjikira ma DNA ambiri akunja chifukwa cha kusefa kwawo kwakukulu.Kumbali ina, nkhanu, monga zamoyo zambiri zopanda msana, zimatha kugonjetsedwa ndi kuwonongeka kwa minofu chifukwa cha kupsinjika maganizo, motero kumachepetsa kutulutsidwa kwa ccfDNA mu hemolymph yawo [70, 71].
Mpaka pano, kusanthula kwa DNA kwa zamoyo zosiyanasiyana m'zamoyo zam'madzi kwayang'ana kwambiri pazachilengedwe za DNA (eDNA) metabarcoding.Komabe, njira imeneyi nthawi zambiri imakhala yochepa pofufuza zamoyo zosiyanasiyana pamene zoyambira zimagwiritsidwa ntchito.Kugwiritsa ntchito kutsata kwa mfuti kumalepheretsa malire a PCR komanso kusankha kokondera kwa seti zoyambira.Chifukwa chake, mwanjira ina, njira yathu ili pafupi ndi njira yotsatizana ya eDNA Shotgun yaposachedwa kwambiri, yomwe imatha kutsata mwachindunji DNA yogawika ndikusanthula pafupifupi zamoyo zonse [72, 73].Komabe, pali zinthu zingapo zofunika zomwe zimasiyanitsa LB ndi njira zodziwika bwino za eDNA.Zoonadi, kusiyana kwakukulu pakati pa eDNA ndi LB ndiko kugwiritsa ntchito makamu osungira zachilengedwe.Kugwiritsa ntchito zamoyo zam'madzi monga masiponji ndi ma bivalves (Dresseina spp.) monga fyuluta yachilengedwe yophunzirira eDNA yanenedwa [74, 75].Komabe, kafukufuku wa Dreissena anagwiritsa ntchito ma biopsies a minofu omwe DNA inatulutsidwa.Kuwunika kwa ccfDNA yochokera ku LB sikufuna kuwunika kwa minofu, zida zapadera komanso nthawi zina zodula komanso zolumikizidwa ndi eDNA kapena biopsy ya minofu.Ndipotu, posachedwapa tinanena kuti ccfDNA yochokera ku LB ikhoza kusungidwa ndi kufufuzidwa ndi chithandizo cha FTA popanda kusunga unyolo wozizira, womwe ndi vuto lalikulu la kafukufuku kumadera akutali [76].Kuchotsa kwa ccfDNA kuchokera ku biopsies yamadzimadzi ndikosavuta ndipo kumapereka DNA yapamwamba kwambiri yotsatirira mfuti ndi kusanthula kwa PCR.Uwu ndi mwayi waukulu kupatsidwa zina mwazolephera zaukadaulo zomwe zimagwirizanitsidwa ndi kusanthula kwa eDNA [77].Kuphweka ndi kutsika mtengo kwa njira yopangira zitsanzo ndizoyeneranso makamaka pamapulogalamu a nthawi yayitali.Kuphatikiza pa luso lawo losefera, chinthu china chodziwika bwino cha bivalves ndi mankhwala a mucopolysaccharide a ntchofu zawo, zomwe zimathandizira kuyamwa kwa ma virus [78, 79].Izi zimapangitsa kuti ma bivalves akhale fyuluta yabwino yachilengedwe yozindikiritsa zamoyo zosiyanasiyana komanso momwe kusintha kwanyengo kumachitikira m'chilengedwe chamadzi.Ngakhale kukhalapo kwa zidutswa za DNA zomwe zimachokera ku khamu kungathe kuwonedwa ngati kuchepetsa njira poyerekeza ndi eDNA, mtengo wokhudzana ndi kukhala ndi ccfDNA yamtundu wotereyi poyerekeza ndi eDNA imamveka panthawi imodzimodziyo chifukwa cha kuchuluka kwa chidziwitso chopezeka pa maphunziro a zaumoyo.offset host.Izi zikuphatikizapo kukhalapo kwa ma virus omwe amatsatiridwa mu genome ya mwiniwakeyo.Izi ndizofunikira makamaka kwa nkhanu, chifukwa cha kupezeka kwa ma leukemic retroviruses opatsirana mozungulira mu bivalves [80, 81].Ubwino wina wa LB pa eDNA ndikuti umagwiritsa ntchito ntchito ya phagocytic yozungulira ma cell amagazi mu hemolymph, yomwe imayambitsa tizilombo tating'onoting'ono (ndi ma genome awo).Phagocytosis ndiye ntchito yayikulu yama cell amagazi mu bivalves [82].Potsirizira pake, njirayi imagwiritsa ntchito mphamvu zowonongeka kwambiri za mussels (pafupifupi 1.5 l / h ya madzi a m'nyanja) ndi kufalikira kwa masiku awiri, zomwe zimawonjezera kusakanikirana kwa zigawo zosiyanasiyana za madzi a m'nyanja, zomwe zimalola kugwidwa kwa heterologous eDNA.[83, 84].Chifukwa chake, kusanthula kwa mussel ccfDNA ndi njira yosangalatsa chifukwa cha thanzi, chuma, komanso chilengedwe cha mussel.Mofanana ndi kusanthula kwa LB komwe kunasonkhanitsidwa kuchokera kwa anthu, njirayi imatsegulanso mwayi woyezera kusintha kwa majini ndi epigenetic mu DNA yolandira alendo poyankha zinthu zakunja.Mwachitsanzo, matekinoloje otsatizana a m'badwo wachitatu atha kuganiziridwa kuti apange kusanthula kwa genome-wide methylation mu ccfDNA yakubadwa pogwiritsa ntchito nanopore sequencing.Njirayi iyenera kuthandizidwa ndi mfundo yakuti kutalika kwa zidutswa za mussel ccfDNA zimagwirizana bwino ndi mapulaneti owerengera nthawi yaitali omwe amalola kusanthula kwa DNA methylation ya genome kuchokera kumayendedwe amodzi popanda kufunikira kwa kusintha kwa mankhwala.Chifukwa chake, imatha kupereka chidziwitso chofunikira pamakina omwe amayang'anira kuyankha pambuyo pakusintha kwanyengo kapena zowononga [87].Komabe, kugwiritsa ntchito LB sikuli kopanda malire.Mosafunikira kunena, izi zimafuna kukhalapo kwa mitundu yowonetsera mu chilengedwe.Monga tafotokozera pamwambapa, kugwiritsa ntchito LB kuyesa mitundu yosiyanasiyana ya zachilengedwe kumafunanso payipi yolimba ya bioinformatics yomwe imaganizira za kupezeka kwa zidutswa za DNA kuchokera kugwero.Vuto lina lalikulu ndi kupezeka kwa ma genome ofotokozera zamoyo zam'madzi.Tikukhulupirira kuti zoyeserera monga Marine Mammal Genomes Project komanso pulojekiti yomwe yangokhazikitsidwa kumene ya Fish10k [88] ithandizira kusanthula kotereku mtsogolomu.Kugwiritsiridwa ntchito kwa lingaliro la LB ku zamoyo zodyetsera zosefera zam'madzi kumagwirizananso ndi kupita patsogolo kwaposachedwa pakutsatizana kwaukadaulo, ndikupangitsa kuti ikhale yoyenera pakupanga ma multi-ohm biomarkers kuti apereke chidziwitso chofunikira chokhudza thanzi la malo okhala m'madzi poyankha kupsinjika kwa chilengedwe.
Deta yotsatizana ya genome yayikidwa mu NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pansi pa Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Zokhudza kusintha kwa nyengo pa zamoyo zam'madzi ndi zachilengedwe.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Ganizirani zovuta zomwe zimachitika chifukwa cha kusintha kwa nyengo ndi zovuta zina zapanyanja pazachilengedwe.chilengedwe sayansi.2021; 755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Sayansi yoyamba ya Marichi.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kuchepetsa kulekerera kutentha pansi pazikhalidwe za kutentha kwapang'onopang'ono kumalongosola za imfa ya chilimwe cha buluu.Lipoti la sayansi 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Kusintha kwaposachedwa kwafupipafupi, zomwe zimayambitsa komanso kukula kwa kufa kwa nyama.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Tizilombo toyambitsa matenda tambiri tokhala ndi mitundu ingapo titha kuyambitsa kufa kwa anthu ambiri a Pinna nobilis.Moyo.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Zomwe zingakhudze kusintha kwa nyengo pa matenda a Arctic zoonotic.Int J Circumpolar Health.2005;64:468-77 .
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Nsomba za buluu (Mytilus edulis spp.) monga zamoyo zowonetsera zowonongeka m'mphepete mwa nyanja: kubwereza.Mar Environ Res 2017;130:338-65 .
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration of liquid biopsy mu chithandizo cha khansa.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48 .
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Kukula kwamadzimadzi a biopsy: Kumalola chotupa cha DNA kufalikira.Nat Rev Cancer.2017; 17:223-38.
Mandel P., Metais P. Nucleic acids mu plasma yaumunthu.Mphindi zamisonkhano zamabungwe a Soc Biol.1948;142:241-3 .
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ntchito yatsopano ya DNA yopanda ma cell ngati chizindikiro cha maselo a khansa.Kuchuluka kwa kusanthula kwa biomolar.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy amalowa m'chipatala - nkhani zokhazikitsa ndi zovuta zamtsogolo.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312 .
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ndi ena.DNA ya fetal imapezeka mu plasma ya amayi ndi seramu.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Kafukufuku wa nthawi ya mimba ndi zovuta zake pogwiritsa ntchito RNA yozungulira m'magazi a amayi pa nthawi ya mimba.Dopediatrics.2020; 8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Liquid biopsy: DNA yopanda cell yopanda maselo imagwiritsidwa ntchito kuti izindikire zotupa za allogeneic mu impso.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603 .
Juan FC, Lo YM Innovations pakuzindikira kwa ana asanabadwe: kutsatizana kwa ma genome a amayi a plasma.Anna MD.2016; 67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Kuzindikira msanga tizilombo toyambitsa matenda ndi kutsatizana kwa m'badwo wotsatira wamadzi am'thupi omwe ali ndi kachilombo.Nat Medicine.2021; 27:115-24.