Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିଥିବାରୁ ଧନ୍ୟବାଦ |ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ସହିତ ଆପଣ ଏକ ବ୍ରାଉଜର୍ ସଂସ୍କରଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ ଆପଣ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ) |ଏହା ସହିତ, ଚାଲୁଥିବା ସମର୍ଥନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଶ yles ଳୀ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଦେଖାଇଥାଉ |
ଥରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ୍ ର ଏକ କାରୁସେଲ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ |ଏକ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ୍ ଦେଇ ଗତି କରିବା ପାଇଁ ପୂର୍ବ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, କିମ୍ବା ଏକ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ୍ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ଶେଷରେ ସ୍ଲାଇଡର୍ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ବାୟୋଥେରାପ୍ୟୁଟିକ୍ ଏଜେଣ୍ଟମାନଙ୍କୁ କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀରେ ସେମାନଙ୍କ ଲକ୍ଷ୍ୟରେ ପହଞ୍ଚିବାରେ ରୋକିଥାଏ, ଯାହାଦ୍ୱାରା ସ୍ନାୟୁଗତ ରୋଗର ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଚିକିତ୍ସାରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ |ଭିଭୋରେ ଉପନ୍ୟାସ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନକାରୀଙ୍କୁ ଆବିଷ୍କାର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ T7 ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କଲୁ ଏବଂ କ୍ରମାନ୍ୱୟରେ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ସଂଗ୍ରହ କରି ଚେତନାଗୁଡ଼ିକର ଏକ ବଡ଼ ବଡ଼ ପୁଲ୍ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି |ଚାରି ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ପରେ CSF ରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଅତ୍ୟଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା |ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାର୍ଥୀ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା CSF ରେ 1000 ଗୁଣରୁ ଅଧିକ ସମୃଦ୍ଧତା ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା |ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥି ବିତରଣର ବାୟୋଆକ୍ଟିଭିଟି ଚିହ୍ନିତ ଉପନ୍ୟାସ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନିବିବିଟର ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ରେ ଆମିଲଏଡ୍- level ସ୍ତରରେ 40% ହ୍ରାସ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ଚୟନ ପ୍ରଣାଳୀ ଦ୍ identified ାରା ଚିହ୍ନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏକ ଚିକିତ୍ସା ପ୍ରଭାବ ସହିତ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲ୍ ବ୍ୟବସ୍ଥିତ ବିତରଣ ପାଇଁ ଉପଯୋଗୀ ଯାନ ହୋଇପାରେ |
କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀ (ସିଏନ୍ଏସ୍) ଟାର୍ଗେଟେଡ୍ ଥେରାପି ଅନୁସନ୍ଧାନ ମୁଖ୍ୟତ optim ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ drugs ଷଧ ଏବଂ ଏଜେଣ୍ଟମାନଙ୍କୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେଇଛି ଯାହା CNS- ଟାର୍ଗେଟ୍ ଗୁଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ସକ୍ରିୟ drug ଷଧ ବିତରଣ କରୁଥିବା ଯନ୍ତ୍ରକ discover ଶଳ ଆବିଷ୍କାର କରିବାରେ କମ୍ ପ୍ରୟାସ ସହିତ |Drug ଷଧ ବିତରଣ, ବିଶେଷକରି ବଡ଼ ଅଣୁ, ଆଧୁନିକ ସ୍ନାୟୁ ବିଜ୍ଞାନ drug ଷଧ ବିକାଶର ଏକ ଅବିଚ୍ଛେଦ୍ୟ ଅଙ୍ଗ ହୋଇଥିବାରୁ ଏହା ବର୍ତ୍ତମାନ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହେବାକୁ ଲାଗୁଛି |କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀର ପରିବେଶ ମସ୍ତିଷ୍କ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ (ବିବିବି) ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ (ବିସିବିବି) 1 ​​କୁ ନେଇ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ବ୍ୟାରେଜ୍ ସିଷ୍ଟମ୍ ଦ୍ୱାରା ଭଲ ଭାବରେ ସୁରକ୍ଷିତ ଅଟେ, ଯାହା ମସ୍ତିଷ୍କକୁ drugs ଷଧ ବିତରଣ କରିବା ଏକ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜ ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ |ଏହା ଅନୁମାନ କରାଯାଏ ଯେ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ ବୃହତ ଅଣୁ drugs ଷଧ ଏବଂ 98% ରୁ ଅଧିକ ଛୋଟ ଅଣୁ drugs ଷଧ ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥାଏ |ସେଥିପାଇଁ ନୂତନ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପ୍ରଣାଳୀ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଜରୁରୀ ଅଟେ ଯାହାକି CNS 4,5 କୁ ଚିକିତ୍ସା drugs ଷଧର ଦକ୍ଷ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିତରଣ ପ୍ରଦାନ କରିଥାଏ |ଅବଶ୍ୟ, BBB ଏବଂ BCSFB ମଧ୍ୟ drug ଷଧ ବିତରଣ ପାଇଁ ଏକ ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ସୁଯୋଗ ଉପସ୍ଥାପନ କରେ ଯେହେତୁ ସେମାନେ ଏହାର ବ୍ୟାପକ ଭାସ୍କୁଲ୍ୟୁଚର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ମସ୍ତିଷ୍କର ସମସ୍ତ ସଂରଚନାରେ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି |ଏହିପରି, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ବିତରଣର ଅଣ-ଆକ୍ରମଣକାରୀ ପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସାମ୍ପ୍ରତିକ ପ୍ରୟାସଗୁଡ଼ିକ ମୁଖ୍ୟତ the ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ BBB6 ରିସେପ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ରିସେପ୍ଟର-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପରିବହନ (PMT) ର ଯନ୍ତ୍ରକ on ଶଳ ଉପରେ ଆଧାରିତ |ଟ୍ରାନ୍ସଫରନ୍ ରିସେପ୍ଟର ପାଥ୍ 7,8 ବ୍ୟବହାର କରି ସାମ୍ପ୍ରତିକ ପ୍ରମୁଖ ଅଗ୍ରଗତି ସତ୍ତ୍ improved େ ଉନ୍ନତ ଗୁଣ ସହିତ ନୂତନ ବିତରଣ ପ୍ରଣାଳୀର ଅଧିକ ବିକାଶ ଆବଶ୍ୟକ |ଏଥିପାଇଁ, ଆମର ଲକ୍ଷ୍ୟ ଥିଲା CSF ପରିବହନରେ ମଧ୍ୟସ୍ଥତା କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା, ଯେହେତୁ ସେଗୁଡିକ ସିଏନଏସରେ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲ୍ ବିତରଣ କରିବାକୁ କିମ୍ବା ନୂତନ ରିସେପ୍ଟର ପଥ ଖୋଲିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ସିଷ୍ଟମ୍ (BBB ଏବଂ BSCFB) ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ରିସେପ୍ଟର ଏବଂ ପରିବହନକାରୀମାନେ ବାୟୋଥେରାପ୍ୟୁଟିକ୍ drugs ଷଧର ସକ୍ରିୟ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିତରଣ ପାଇଁ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବେ |ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ହେଉଛି କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍ (CS) ର ଏକ ଗୁପ୍ତ ଉତ୍ପାଦ ଏବଂ ସବାରାକ୍ନଏଡ୍ ସ୍ପେସ୍ ଏବଂ ଭେଣ୍ଟ୍ରିକୁଲାର ସ୍ପେସ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ମସ୍ତିଷ୍କର ଇଣ୍ଟରସ୍ଟିସିଆଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ସହିତ ସିଧାସଳଖ ଯୋଗାଯୋଗରେ |ସମ୍ପ୍ରତି ଏହା ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ସାବାରାକ୍ନଏଡ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ମସ୍ତିଷ୍କର ଇଣ୍ଟରଷ୍ଟିଟିୟମ୍ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ବିସ୍ତାର ହୁଏ |ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଏହି ସବାରାକ୍ନଏଡ୍ ଇନଫ୍ଲୋ ଟ୍ରାକ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା ସିଧାସଳଖ ବିବିବି ମାଧ୍ୟମରେ ପେରେଞ୍ଚିମାଲ୍ ସ୍ପେସ୍ ପ୍ରବେଶ କରିବାକୁ |ଏହା ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ଚୟନ କ strategy ଶଳରେ ଏକ ଦୃ ust ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ ଯାହା ଆଦର୍ଶ ଭାବରେ ଏହି ଦୁଇଟି ପୃଥକ ପଥ ଦ୍ୱାରା ପରିବହନ ହୋଇଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରେ |
ସର୍ବୋଚ୍ଚ ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିବିଧତା ସହିତ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ଉପରେ ନଜର ରଖିବା ପାଇଁ ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତିରେ CSF ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ ସହିତ ଉଚ୍ଚ ଥ୍ରୋପୁଟ୍ ସିକ୍ୱେନ୍ସିଙ୍ଗ୍ (HTS) ସହିତ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁ |ରକ୍ତ ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ ସ୍ଥାୟୀ ଇମ୍ପ୍ଲାଣ୍ଟ ହୋଇଥିବା ବଡ଼ ସିଷ୍ଟର୍ନା (CM) କାନନୁଲା ସହିତ ସଚେତନ ମୂଷା ଉପରେ ସ୍କ୍ରିନିଂ କରାଯାଇଥିଲା |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଏହି ପଦ୍ଧତି ଉଭୟ ମସ୍ତିଷ୍କ-ଟାର୍ଗେଟ୍ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ମଧ୍ୟରେ ପରିବହନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚୟନ କରେ |ସେମାନଙ୍କର ଛୋଟ ଆକାର (~ 60 nm) 10 ହେତୁ ଆମେ T7 ପର୍ଯ୍ୟାୟ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ ଏବଂ ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥିଲୁ ଯେ ଭେସିକଲ୍ ପରିବହନ ପାଇଁ ଏହା ଉପଯୁକ୍ତ ଅଟେ ଯାହା ଏଣ୍ଡୋଥେଲିଆଲ୍ ଏବଂ / କିମ୍ବା ଏପିଥେଲିଆଲ୍-ମେଡୁଲା ବ୍ୟାରେଜ୍ ର ଟ୍ରାନ୍ସସେଲୁଲାର୍ କ୍ରସିଂକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥାଏ |ଚାରି ରାଉଣ୍ଡ ପ୍ୟାନିଂ ପରେ, ଫେଜ୍ ଜନସଂଖ୍ୟା ଭିଭୋ CSF ସମୃଦ୍ଧତା ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ ମାଇକ୍ରୋଭେଲ୍ ଆସୋସିଏସନ୍ରେ ଦୃ strong ପ୍ରଦର୍ଶନ କରି ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଆମେ ଆମର ଅନୁସନ୍ଧାନକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ ସମର୍ଥ ହୋଇଥିଲୁ ଯେ ପସନ୍ଦିତ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଭାବରେ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ସର୍ବୋତ୍ତମ ପ୍ରାର୍ଥୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମସ୍ତିଷ୍କ କାର୍ଗୋକୁ ମସ୍ତିଷ୍କ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ପରିବହନ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ଅଟେ |ପ୍ରଥମେ, CNS ର ଫାର୍ମାକୋଡାଇନାମିକ୍ ପ୍ରଭାବଗୁଡିକ ଏକ ଅଗ୍ରଣୀ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କୁ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ଏକ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରି ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ ହେଲା |ଭିଭୋ ଫଙ୍କସନାଲ ସ୍କ୍ରିନିଂ କ ies ଶଳରେ ଉପାଦେୟ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପେପ୍ଟାଇଡକୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ କାର୍ଗୋ ବାହକ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ବୋଲି ଦର୍ଶାଇବା ସହିତ, ଆମେ ଆଶା କରୁ ଯେ ଉପନ୍ୟାସ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପଥ ଚିହ୍ନଟ କରିବାରେ ମଧ୍ୟ ସମାନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଚୟନ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହେବ |
ପ୍ଲେକ୍ ଫର୍ମିଂ ୟୁନିଟ୍ (PFU) ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଫେଜ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ ଷ୍ଟେପ୍ ପରେ, ପ୍ରାୟ 109 ର ବିବିଧତା ସହିତ ରାଣ୍ଡମ୍ 12-ମେର ଲାଇନ୍ T7 ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ ଏବଂ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା (ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି ଦେଖନ୍ତୁ) |ଏହା ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଜରୁରୀ ଯେ ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂରେ ଆମେ ଏହି ଲାଇବ୍ରେରୀକୁ ଯତ୍ନର ସହ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ |ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ନମୁନାଗୁଡିକର PCR ବିସ୍ତାରଣ ଆମ୍ପଲିକନ୍ ସୃଷ୍ଟି କରେ ଯାହା ସିଧାସଳଖ HTS ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1a) |କ) HTS11 କ୍ରମିକ ତ୍ରୁଟି ହେତୁ, ଖ) ପ୍ରାଇମର୍ (NNK) 1-12 ର ଗୁଣ ଉପରେ ପ୍ରଭାବ, ଏବଂ ଗ) ଷ୍ଟାଣ୍ଡବାଇ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ଫେଜ୍ (କଙ୍କାଳ ସନ୍ନିବେଶ) ର ଉପସ୍ଥିତି, କେବଳ ଯାଞ୍ଚ ହୋଇଥିବା କ୍ରମ ସୂଚନା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1 ବି) ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଏକ କ୍ରମ ଫିଲ୍ଟରିଂ ପ୍ରଣାଳୀ କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଫିଲ୍ଟର ଷ୍ଟେପଗୁଡିକ ସମସ୍ତ HTS କ୍ରମିକ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ |ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପାଇଁ ସମୁଦାୟ 233,868 ପଠନ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା, ସେଥିମଧ୍ୟରୁ 39% ଫିଲ୍ଟର ମାନଦଣ୍ଡ ପାସ କରିଥିଲେ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ରାଉଣ୍ଡ ପାଇଁ ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଚୟନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1c - e) |ପଠନଗୁଡ଼ିକ ମୁଖ୍ୟତ 3 3 ବେସ୍ ଯୁଗଳର ଦ multip ର୍ଘ୍ୟର 36 ଗୁଣ ବିଶିଷ୍ଟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1c) ସହିତ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ (NNK) 1-12 କୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା ​​|ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ଲାଇବ୍ରେରୀ ସଦସ୍ୟମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ ପ୍ରାୟ 11% ଏକ 12-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ବ୍ୟାକବୋନ PAGISRELVDKL ସନ୍ନିବେଶ ଧାରଣ କରିଥିଲେ ଏବଂ ପ୍ରାୟ ଅଧା କ୍ରମରେ (49%) ସନ୍ନିବେଶ କିମ୍ବା ଡିଲିଟ୍ ରହିଥିଲା ​​|ଲାଇବ୍ରେରୀ ଲାଇବ୍ରେରୀର HTS ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଉଚ୍ଚ ବିବିଧତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କଲା: ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମର 81% ରୁ ଅଧିକ କେବଳ ଥରେ ମିଳିଲା ଏବଂ କେବଳ 1.5% ≥4 କପିରେ ଘଟିଥିଲା ​​(ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2a) |ରେପର୍ଟୋରିରେ ଥିବା ସମସ୍ତ 12 ଟି ସ୍ଥିତିରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ (ଆ) ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିଗୁଡିକ ଖରାପ NKK ରେପର୍ଟୋରି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2 ବି) ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପନ୍ନ କୋଡନ୍ ସଂଖ୍ୟା ପାଇଁ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ଭଲ ଭାବରେ ସମ୍ପର୍କିତ |ଏହି ସନ୍ନିବେଶ ଦ୍ enc ାରା ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଥିବା ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ପରିଲକ୍ଷିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଗଣିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (r = 0.893) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2c) ସହିତ ଭଲ ଭାବରେ ଜଡିତ |ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପାଇଁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରସ୍ତୁତିରେ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ଅପସାରଣର ପଦକ୍ଷେପ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |ଏହା ପୂର୍ବରୁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ବିବିଧତାକୁ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ଦର୍ଶାଯାଇଛି 12,13 |ତେଣୁ, ଆମେ ଏକ ପ୍ଲେଟ୍-ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେଡ୍ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀକୁ କ୍ରମାନୁସିତ କରିଥିଲୁ ଯାହା ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ AA ର ​​ଆବୃତ୍ତି ଆକଳନ କରିବାକୁ ଏହାକୁ ମୂଳ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସହିତ ତୁଳନା କରିଥିଲୁ |ମୂଳ ପୁଲ୍ ଏବଂ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧ ପୁଲ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 2d) ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଦୃ strong ସମ୍ପର୍କ (r = 0.995) ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ T7 ଫେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ଲେଟଗୁଡିକରେ ବ pl ଼ାଯାଇଥିବା କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତିଯୋଗିତା ପ୍ରମୁଖ ପକ୍ଷପାତିତା ସୃଷ୍ଟି କରେ ନାହିଁ |ଏହି ତୁଳନା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଆବୃତ୍ତି ଉପରେ ଆଧାରିତ, ଯେହେତୁ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ବିବିଧତା (~ 109) HTS ସହିତ ମଧ୍ୟ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ରୂପେ ଧରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥିତିରେ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ entered ାରା ପ୍ରବେଶ କରିଥିବା ରେପର୍ଟୋରିର ଶେଷ ତିନୋଟି ଅବସ୍ଥାରେ ଏକ ଛୋଟ ସ୍ଥିତି-ନିର୍ଭରଶୀଳ ପକ୍ଷପାତ ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2e) |ପରିଶେଷରେ, ଆମେ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେଇଛୁ ଯେ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଗୁଣବତ୍ତା ଏବଂ ବିବିଧତା ଗ୍ରହଣୀୟ ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ମଧ୍ୟରେ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ପ୍ରସ୍ତୁତି ହେତୁ କେବଳ ବିବିଧତାର ସାମାନ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା |
BBB ଏବଂ / କିମ୍ବା BCSFB (ଚିତ୍ର 1a-b) ମାଧ୍ୟମରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଉଥିବା T7 ଫେଜ୍ ଚିହ୍ନଟକୁ ସୁଗମ କରିବା ପାଇଁ ସିରିୟଲ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ନମୁନା ସର୍ଜିକାଲ୍ ଚେତନାରେ CM ରେ ଏକ କାନନୁଲା ଲଗାଇ କରାଯାଇପାରିବ |ଭିଭୋ ଚୟନରେ ପ୍ରଥମ ତିନି ରାଉଣ୍ଡରେ ଆମେ ଦୁଇଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ଚୟନ ବାହୁ (ବାହୁ A ଏବଂ B) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1c) |ଚୟନର ପ୍ରଥମ ତିନି ରାଉଣ୍ଡରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୋଇଥିବା ମୋଟ ଫେଜ୍ ହ୍ରାସ କରି ଆମେ ଧୀରେ ଧୀରେ ଚୟନର କଠିନତା ବୃଦ୍ଧି କଲୁ |ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡ ପ୍ୟାନିଂ ପାଇଁ, ଆମେ ଶାଖା A ଏବଂ B ରୁ ନମୁନାକୁ ଏକତ୍ର କରି ତିନୋଟି ଅତିରିକ୍ତ ସ୍ independent ାଧୀନ ଚୟନ କରିଥିଲୁ |ଏହି ମଡେଲରେ T7 ଫେଜ୍ କଣିକାର ଭିଭୋ ଗୁଣଗୁଡିକ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ, ବଣୁଆ ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ (PAGISRELVDKL ମାଷ୍ଟର ଇନ୍ସର୍ଟ) ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମାଧ୍ୟମରେ ମୂଷାମାନଙ୍କରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା |ବିଭିନ୍ନ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ଫେଜ୍ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅପେକ୍ଷାକୃତ ଛୋଟ T7 ଆଇକୋସେଡ୍ରାଲ୍ ଫେଜ୍ ଗୁଡିକ ରକ୍ତ ବିଭାଗରୁ ଦ୍ରୁତ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3) |ବ୍ୟବହୃତ ଟାଇଟର୍ ଏବଂ ମୂଷାଙ୍କ ରକ୍ତ ପରିମାଣ ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଆମେ ହିସାବ କଲୁ ଯେ ପ୍ରାୟ 1% wt |ବ୍ୟବହୃତ ଡୋଜରୁ ଫେଜ୍ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନର 10 ମିନିଟ୍ ପରେ ରକ୍ତରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଦ୍ରୁତ ଅବନତି ପରେ, ଏକ ମନ୍ଥର ପ୍ରାଥମିକ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ 27.7 ମିନିଟର ଅଧା ଜୀବନ ସହିତ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, CSF ବିଭାଗରୁ କେବଳ ଖୁବ୍ କମ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା CSF ବିଭାଗରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ପାଇଁ ଏକ ସ୍ୱଳ୍ପ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସୂଚାଇଥାଏ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3) |ହାରାହାରି, ରକ୍ତରେ T7 ଫେଜ୍ ର ପ୍ରାୟ 1 x 10-3% ଟାଇଟର୍ ଏବଂ 4 x 10-8% ପ୍ରାରମ୍ଭରେ ଇନଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଥିବା ଫେଜଗୁଡିକ ସମଗ୍ର ନମୁନା ଅବଧି (0-250 ମିନିଟ୍) ମଧ୍ୟରେ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାରର ଫେଜ୍ ର ଅଧା ଜୀବନ (25.7 ମିନିଟ୍) ରକ୍ତରେ ଦେଖାଯାଉଥିବା ସମାନ ଥିଲା |ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ସିଏସ୍ଏଫ୍ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟକୁ ରକ୍ତରୁ ପୃଥକ କରୁଥିବା ପ୍ରତିବନ୍ଧକ CM- କାନନ୍ୟୁଟେଡ୍ ଇଦୁରରେ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ଅଟେ, ଯାହା ରକ୍ତରୁ ସହଜରେ CSF ବିଭାଗରେ ପରିବହନ ହେଉଥିବା କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ଭିଭୋ ଚୟନରେ ଅନୁମତି ଦେଇଥାଏ |
(କ) ଏକ ବୃହତ ପୁଷ୍କରିଣୀରୁ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ପୁନ-ନମୁନା ପାଇଁ ଏକ ପଦ୍ଧତି ସ୍ଥାପନ କରିବା |(ଖ) କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀ (CNS) ପ୍ରତିବନ୍ଧକର ସେଲୁଲାର୍ ଅବସ୍ଥାନ ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ (BBB) ​​ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଅତିକ୍ରମ କରୁଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଚୟନ କ strategy ଶଳକୁ ଦର୍ଶାଉଥିବା ଚିତ୍ର |(ଗ) ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ସ୍କ୍ରିନିଂ ଫ୍ଲୋଚାର୍ଟରେ |ଚୟନର ପ୍ରତ୍ୟେକ ରାଉଣ୍ଡରେ, ଫେଜ୍ (ତୀର ଭିତରେ ପଶୁ ପରିଚାୟକ) ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଗଲା |ଦୁଇଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ବିକଳ୍ପ ଶାଖା (A, B) ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପୃଥକ ଭାବରେ ରଖାଯାଏ |ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ 3 ଏବଂ 4 ପାଇଁ, CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ମାନୁଆଲ କ୍ରମରେ |(ଘ) T7 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ (2 x 1012 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) ର ଇଣ୍ଟ୍ରାଭେନସ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ ଦୁଇଟି କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ ଇଦୁର ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ସମୟରେ ରକ୍ତ (ଲାଲ୍ ସର୍କଲ୍) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (ସବୁଜ ତ୍ରିରଙ୍ଗା) ରୁ ପୃଥକ ଫେଜ୍ ର କିନେଟିକ୍ସ |ବ୍ଲୁ ବର୍ଗଗୁଡିକ ରକ୍ତରେ ଫେଜ୍ ର ହାରାହାରି ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏକାଗ୍ରତାକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ପରିମାଣରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥାଏ, ମୋଟ ରକ୍ତ ପରିମାଣକୁ ଧ୍ୟାନରେ ରଖି |କଳା ବର୍ଗଗୁଡିକ ରକ୍ତ ଫେଜ୍ ଏକାଗ୍ରତାରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା y ଲାଇନର ଛକ ବିନ୍ଦୁକୁ ସୂଚିତ କରେ |(ଇ, ଚ) ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରେ ମିଳୁଥିବା ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଓଭରଲିପ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ବଣ୍ଟନ ଉପସ୍ଥାପନ କର |1000 ରିଡିଙ୍ଗରେ ମିଳୁଥିବା ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ (p <0.001) ସମୃଦ୍ଧ ମୋଟିଫ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ବିନ୍ଦୁ ସହିତ ଚିହ୍ନିତ |()) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ପଶୁମାନଙ୍କ ରକ୍ତରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ଫେଜ୍ ସହିତ ସମ୍ପର୍କ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍(ଚ) ରକ୍ତ ଫେଜ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି ସମ୍ପର୍କ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍ ରକ୍ତ ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ପୃଥକ # 1.1 ଏବଂ # 1.2 |gଗୋଟିଏ ଅକ୍ଷର ସଂକେତର ଆକାର ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସେହି ଅବସ୍ଥାରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କେତେଥର ଘଟେ |ସବୁଜ = ପୋଲାର, ବାଇଗଣୀ = ନିରପେକ୍ଷ, ନୀଳ = ମ basic ଳିକ, ନାଲି = ଅମ୍ଳୀୟ ଏବଂ କଳା = ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ |ଚିତ୍ର 1a, b ଏଡୁଆର୍ଡ ଉରିଚ୍ ଦ୍ୱାରା ଡିଜାଇନ୍ ଏବଂ ଉତ୍ପାଦିତ ହୋଇଥିଲା |
ଆମେ ଦୁଇଟି ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀକୁ ଦୁଇଟି ସିଏମ୍ ଇନଷ୍ଟ୍ରୁମେଣ୍ଟ୍ ରେଟ୍ (କ୍ଲେଡ୍ ଏ ଏବଂ ବି) ରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦେଲୁ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ପୃଥକ ଫେଜ୍ (ଚିତ୍ର 1d) |ୱାଇଲ୍ଡ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ତୁଳନାରେ ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଦ୍ରୁତ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ କମ୍ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଥିଲା |ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିବା ଲାଇବ୍ରେରୀର ଅଧା ଜୀବନ ରକ୍ତରେ 24.8 ମିନିଟ୍ ଥିଲା, ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ପରି ଏବଂ CSF ରେ 38.5 ମିନିଟ୍ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀରୁ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଫେଜ୍ ନମୁନାଗୁଡିକ HTS ଅଧୀନରେ ରହିଥିଲା ​​ଏବଂ ଏକ ସ୍ୱଳ୍ପ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ଉପସ୍ଥିତି ପାଇଁ ସମସ୍ତ ଚିହ୍ନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା କାରଣ ସେମାନେ ଗଠନ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟ ପାଇଁ ସର୍ବନିମ୍ନ ଆଧାର ପ୍ରଦାନ କରନ୍ତି 14,15 |ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ରକ୍ତରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା କ୍ଲୋନ୍ ମଧ୍ୟରେ ମୋଟିଫ୍ ବଣ୍ଟନରେ ଆମେ ଏକ ଭଲ ସମ୍ପର୍କ ପାଇଲୁ (ଚିତ୍ର 1e) |ତଥ୍ୟ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଲାଇବ୍ରେରୀ ରଚନା କେବଳ ରକ୍ତ ବିଭାଗରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଛି |ୱେବଲୋଗୋ 16 ସଫ୍ଟୱେୟାରର ଏକ ଆଡାପ୍ଟେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ସହମତି କ୍ରମଗୁଡିକ ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥିତିରେ ଅଧିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଆମେ ରକ୍ତ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରେ ଏକ ଦୃ strong ସମୃଦ୍ଧତା ପାଇଲୁ (ଚିତ୍ର 1g) |ଯେତେବେଳେ CSF ରୁ ମନୋନୀତ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ସହିତ ରକ୍ତ ତୁଳନା କରାଯାଉଥିଲା, ଦୃ strong ଼ ଚୟନ ଏବଂ ମୋଟିଫ୍ ର କିଛି ଅବକ୍ଷୟ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1 ଫ), ଏବଂ କେତେକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ 12-ସଦସ୍ୟ (ପୂର୍ବ ଚିତ୍ର 1h) ରେ ପୂର୍ବ ନିର୍ଦ୍ଧାରିତ ସ୍ଥାନରେ ବିଶେଷ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥିଲେ |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ମସ୍ତିଷ୍କର ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନେ ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ ହୋଇଥିଲେ, ଯେତେବେଳେ ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀରେ ରକ୍ତ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସମୃଦ୍ଧତା ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a - j) |ପଶୁମାନଙ୍କର ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ # 1.1 ଏବଂ # 1.2 ରେ କ୍ରମାନ୍ୱୟରେ ତଥ୍ୟର କଠୋର ଫିଲ୍ଟରିଂ ପରେ ସମୁଦାୟ 964 ଏବଂ 420 ଅନନ୍ୟ 12-ମେର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମିଳିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1d - e) |ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଭିଭୋ ଚୟନରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ରାଉଣ୍ଡ ଅଧୀନରେ ରହିଲା |ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀରେ HTS ଅଧୀନରେ ରହିଥିଲା ​​ଏବଂ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ (ଚିତ୍ର 2a, b, ef) ର ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ମୋଟିଫ୍ ସ୍ୱୀକୃତି ପ୍ରୋଗ୍ରାମରେ ଇନପୁଟ୍ ଭାବରେ ସମସ୍ତ ଚିହ୍ନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |CSF ରୁ ଉଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା ଫେଜ୍ ର ପ୍ରଥମ ଚକ୍ର ତୁଳନାରେ, ଆମେ A ଏବଂ B ଶାଖାଗୁଡ଼ିକରେ CSF ରେ ଅନେକ ମୋଟିଫ୍ ଚୟନ ଏବଂ ବିଲୋପକୁ ଦେଖିଲୁ (ଚିତ୍ର 2) |ସେମାନେ ଏକ କ୍ରମାଗତ କ୍ରମର ବିଭିନ୍ନ s ାଞ୍ଚାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି କି ନାହିଁ ତାହା ଜାଣିବା ପାଇଁ ଏକ ନେଟୱାର୍କ ପରିଚୟ ଆଲଗୋରିଦମ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ A (ଚିତ୍ର 2c, d) ଏବଂ କ୍ଲେଡ୍ ବି (ଚିତ୍ର 2g, h) ରେ CSF ଦ୍ୱାରା ପୁନରୁଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା 12-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ କ୍ରମ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ସମାନତା ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଶାଖାରେ ପୁଲ୍ ହୋଇଥିବା ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ 12 ାରା 12-ମେର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 5c, d) ପାଇଁ ବିଭିନ୍ନ ଚୟନ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଏବଂ ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5e) ତୁଳନାରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ପରେ ପୁଲଡ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ପାଇଁ ସମୟ ସହିତ CSF / ରକ୍ତ ଟାଇଟର୍ ଅନୁପାତ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା |)
ଭିଭୋ ଫଙ୍କସନାଲ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ଚୟନରେ କ୍ରମାଗତ ଦୁଇଟି ରାଉଣ୍ଡ ଦ୍ୱାରା ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡରେ ମୋଟିଫ୍ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସମୃଦ୍ଧ |
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀ (ପଶୁ # 1.1 ଏବଂ # 1.2) ରୁ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା ସମସ୍ତ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଫେଜ୍ ଗୁଡିକ ପୁଲ, ବର୍ଦ୍ଧିତ, HT- ସିକ୍ୱେନ୍ସ ଏବଂ ଏକତ୍ର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଗଲା (2 x 1010 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) 2 SM କାନନ୍ୟୁଟେଡ୍ ଇଦୁର (# 1.1 → #) |2.1 ଏବଂ 2.2, 1.2 → 2.3 ଏବଂ 2.4) |(a, b, e, f) ପ୍ରଥମ ଏବଂ ଦ୍ୱିତୀୟ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମସ୍ତ CSF- ଉତ୍ପାଦିତ ପର୍ଯ୍ୟାୟଗୁଡିକର ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି ସମ୍ପର୍କ ଛିନ୍ନଛତ୍ର |ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ଉଭୟ ଆଭିମୁଖ୍ୟରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସରେ ମିଳୁଥିବା ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଓଭରଲିପ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରୁଥିବା ମୋଟିଫ୍ ବଣ୍ଟନ |1000 ରିଡିଙ୍ଗରେ ମିଳୁଥିବା ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ମୋଟିଫ୍ ଯାହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ (p <0.001) ମନୋନୀତ କିମ୍ବା ତୁଳନାତ୍ମକ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏରେ ବାଦ ପଡିଥିଲା ​​ନାଲି ବିନ୍ଦୁ ସହିତ ହାଇଲାଇଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା |(c, d, g, h) ଭିଭୋ ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 2 ଏବଂ 1 ଉପରେ ଆଧାର କରି ସମସ୍ତ CSF ସମୃଦ୍ଧ 12 ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଲମ୍ବା କ୍ରମର କ୍ରମର ଲୋଗୋ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ |ଗୋଟିଏ ଅକ୍ଷର ସଂକେତର ଆକାର ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସେହି ଅବସ୍ଥାରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କେତେଥର ଘଟେ |ଲୋଗୋକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ To କରିବା ପାଇଁ, ଦୁଇଟି ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପଶୁମାନଙ୍କଠାରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା CSF କ୍ରମର ଆବୃତ୍ତି ତୁଳନା କରାଯାଏ ଏବଂ ଦ୍ୱିତୀୟ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମୃଦ୍ଧ କ୍ରମଗୁଡିକ ଦେଖାଯାଏ: (ଗ) # 1.1– # 2.1 (d) # 1.1– # 2.2 (g) # 1.2– # 2.3 ଏବଂ (h) # 1.2– # 2.4 |(C, d) ପ୍ରାଣୀ ନଂରେ ଦିଆଯାଇଥିବା ସ୍ଥିତିରେ ସର୍ବାଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ |2.1 ଏବଂ ନା।2.2 କିମ୍ବା (g, h) ପଶୁମାନଙ୍କ ନଂ।2.3 ଏବଂ ନା।2.4 ରଙ୍ଗରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ସବୁଜ = ପୋଲାର, ବାଇଗଣୀ = ନିରପେକ୍ଷ, ନୀଳ = ମ basic ଳିକ, ନାଲି = ଅମ୍ଳୀୟ ଏବଂ କଳା = ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ |
ତୃତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ପରେ, ଆମେ ଦୁଇଟି ପ୍ରାଣୀଠାରୁ ପୃଥକ 332 CSF- ପୁନ stit ନିର୍ମାଣ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନରୁ 124 ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (# 3.1 ଏବଂ # 3.2) ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6a) |କ୍ରମରେ LGSVS (18.7%) ସର୍ବାଧିକ ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ ଥିଲା, ତା’ପରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ସନ୍ନିବେଶ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ଏବଂ SARGSWREIVSLS (2.2%) |ଅନ୍ତିମ ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ, ଆମେ ତିନୋଟି ପୃଥକ ପ୍ରାଣୀ (ଚିତ୍ର 1c) ରୁ ଦୁଇଟି ସ୍ independ ାଧୀନ ଭାବରେ ମନୋନୀତ ଶାଖା ପୁଲ କରିଛୁ |CSF ରୁ ଉଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା 925 କ୍ରମିକ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ ମଧ୍ୟରୁ ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ଆମେ 64 ଟି ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6b) ପାଇଲୁ, ଯାହା ମଧ୍ୟରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ 0.8% କୁ ଖସିଗଲା |ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ CSF କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକ ହେଲା LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ଏବଂ RLS |%)) |ମନୋନୀତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ପରିସର NNK ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ଡିଜେରେଟ୍ କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସମୟରେ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରାଇମର୍ରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ସନ୍ନିବେଶ / ବିଲୋପନ କିମ୍ବା ଅକାଳ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ କାରଣରୁ ହୋଇଥାଏ |ଅପରିପକ୍ୱ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ଗୁଡ଼ିକ କ୍ଷୁଦ୍ର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସୃଷ୍ଟି କରେ ଏବଂ ମନୋନୀତ ହୁଏ କାରଣ ସେଗୁଡ଼ିକରେ ଅନୁକୂଳ ଆ ମୋଟିଫ୍ ଥାଏ |ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରାଥମିକରେ ସନ୍ନିବେଶ / ବିଲୋପନରୁ ଲମ୍ବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହୋଇପାରେ |ଏହା ଫ୍ରେମ୍ ବାହାରେ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ କୁ ସ୍ଥାନିତ କରେ ଏବଂ ଏକ ନୂତନ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ନହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏହାକୁ ପ read େ |ସାଧାରଣତ ,, ଆମେ ନମୁନା ଆଉଟପୁଟ୍ ତଥ୍ୟ ସହିତ ଇନପୁଟ୍ ତଥ୍ୟ ତୁଳନା କରି ସମସ୍ତ ଚାରୋଟି ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ପାଇଁ ସମୃଦ୍ଧ କାରକ ଗଣନା କଲୁ |ସ୍କ୍ରିନିଂର ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ରେଫରେନ୍ସ ଭାବରେ ୱାଇଲ୍ଡ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ଟାଇଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ପ୍ରଥମ CSF ଚକ୍ରରେ ନକାରାତ୍ମକ ଫେଜ୍ ଚୟନ ବହୁତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଥିଲା, କିନ୍ତୁ ରକ୍ତରେ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3a), ଯାହା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଅଧିକାଂଶ ସଦସ୍ୟଙ୍କ ସିଏସ୍ଏଫ୍ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ପାସ୍ ଡିଫ୍ୟୁଜନ୍ ହେବାର ସମ୍ଭାବନା ହେତୁ ହୋଇପାରେ କିମ୍ବା ଆପେକ୍ଷିକ ଫେଜ୍ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଫେଜ୍ ଅପେକ୍ଷା ରକ୍ତ ପ୍ରବାହରୁ ଅଧିକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ରଖାଯାଇଥାଏ କିମ୍ବା ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥାଏ |ଅବଶ୍ୟ, ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପ୍ୟାନିଂରେ, ଉଭୟ କ୍ଲେଡରେ CSF ରେ ଫେଜଗୁଡିକର ଦୃ strong ଚୟନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ ପୂର୍ବ ରାଉଣ୍ଡ ପେଜରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବା ପେଜରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଛି ଯାହା CSF ଅପଟେକକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିଥାଏ (ଚିତ୍ର 3a) |ପୁନଶ୍ଚ, ରକ୍ତ ସମୃଦ୍ଧ ବିନା |ତୃତୀୟ ଏବଂ ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ମଧ୍ୟ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ CSF ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା |ଶେଷ ଦୁଇ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନରେ କ୍ରମଗୁଡ଼ିକ ଆହୁରି ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଛି (ଚିତ୍ର 3 ବି) |ଉଭୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଆଭିଏଣ୍ଟେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ 64 ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମରୁ ମୋଟ 931 ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡର ସବୁଠାରୁ ସମୃଦ୍ଧ ମୋଟିଫ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ (କଟ୍ ଅଫ୍: 10% ସମୃଦ୍ଧ) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6c) ତୁଳନାରେ ସମସ୍ତ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ପାଇଁ ଅଧିକ ଘନିଷ୍ଠ ଭାବରେ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |ଚୟନର ସାଧାରଣ s ାଞ୍ଚାଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅଧିକାଂଶ ଅଧ୍ୟୟନର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ଉଭୟ ଚୟନ ଶାଖାର ପୂର୍ବ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା |ଅବଶ୍ୟ, କେତେକ ମୋଟିଫ୍ (ଯଥା SGL, VSG, LGS GSV) ମୁଖ୍ୟତ alternative ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ A ରୁ ଆସିଥିବାବେଳେ ଅନ୍ୟମାନେ (ଯେପରିକି FGW, RTN, WGF, NTR) ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ ବିରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲେ |
CSF- ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍-ପ୍ରଦର୍ଶିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ଲିଡର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର CSF ପରିବହନର ବ id ଧତା, ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ପେଲୋଡ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ |
(କ) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ (ଇନପୁଟ୍ = I) ଫେଜ୍ (PFU) ଟାଇଟର୍ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ CSF ଫେଜ୍ ଟାଇଟର୍ (ଆଉଟପୁଟ୍ = O) ଉପରେ ଆଧାର କରି ସମସ୍ତ ଚାରି ରାଉଣ୍ଡରେ (R1-R4) ଗଣାଯାଇଥିବା ସମୃଦ୍ଧ ଅନୁପାତ |ଗତ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡ (R2-R4) ପାଇଁ ସମୃଦ୍ଧ କାରକଗୁଡିକ ପୂର୍ବ ରାଉଣ୍ଡ ଏବଂ ଓଜନ ତଥ୍ୟ ସହିତ ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ (R1) ତୁଳନାରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଖୋଲା ବାରଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍, ଛାଇଯୁକ୍ତ ବାରଗୁଡିକ ପ୍ଲାଜମା |(*** p <0.001, ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ଉପରେ ଆଧାର କରି) |(ଖ) ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 4 ପରେ CSF ରେ ସଂଗୃହିତ ସମସ୍ତ ଫେଜ୍ ସହିତ ସେମାନଙ୍କର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ ଅନୁଯାୟୀ ସ୍ଥାନିତ ହୋଇଥିବା ବହୁ ପରିମାଣର ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ତାଲିକା |Six ଟି ସାଧାରଣ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ରଙ୍ଗ, ସଂଖ୍ୟାଯୁକ୍ତ ଏବଂ ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 3 ରୁ 4 ମଧ୍ୟରେ (ଇନସେଟ) ମଧ୍ୟରେ ଆଲୋକିତ ହୋଇଛି |(ଗ, ଘ) ରାଉଣ୍ଡ 4 ରୁ six ଟି ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍, ଖାଲି ଫେଜ୍ ଏବଂ ପ୍ୟାରେଣ୍ଟାଲ୍ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ CSF ନମୁନା ମଡେଲରେ ପୃଥକ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |(ଗ) ସମାନ ପରିମାଣର 6 ପ୍ରାର୍ଥୀ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ (2 x 1010 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ), ଖାଲି ଫେଜ୍ (# 1779) (2 x 1010 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) ଏବଂ ଷ୍ଟକ୍ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡିକ (2 x 1012 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ 3 CM କୁ ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମାଧ୍ୟମରେ ପୃଥକ ଭାବରେ କାନ୍ୟୁଲେଡ୍ ପ୍ରାଣୀକୁ ଦିଆଯାଏ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଏବଂ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର CSF ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ସ ଦେଖାଯାଏ |(ଘ) ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ ସମୟ ମଧ୍ୟରେ ସମସ୍ତ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଫେଜ୍ / ଏମଏଲ୍ ପାଇଁ ହାରାହାରି CSF / ରକ୍ତ ଅନୁପାତ ଦେଖାଏ |)ଅତିକମରେ ତିନୋଟି ଅନ୍ତ ub କରଣ ମୂଷା (N = 3) |)ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ CSF ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନର ଏକାଗ୍ରତା CSF ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ELISA ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା (nd = ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନାହିଁ) |(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, ANOVA ପରୀକ୍ଷା ଉପରେ ଆଧାର କରି) |(ଚ) ସର୍ବାଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ଲୋନ୍ # 2002 (ବାଇଗଣୀ) ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମର ଚୟନର ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରୁ ଅନ୍ୟ ମନୋନୀତ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ଲୋନ ସହିତ ତୁଳନା |ସମାନ ଏବଂ ସମାନ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ରଙ୍ଗ-କୋଡେଡ୍ |
ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ଥିବା ସମସ୍ତ ସମୃଦ୍ଧ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ମଧ୍ୟରୁ (ଚିତ୍ର 3 ବି), CSF ନମୁନା ମଡେଲରେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ six ଟି ପ୍ରାର୍ଥୀ କ୍ଲୋନ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ ପରିମାଣର six ଟି ପ୍ରାର୍ଥୀ ଫେଜ୍, ଖାଲି ଫେଜ୍ (କ insert ଣସି ସନ୍ନିବେଶ ନାହିଁ) ଏବଂ ପ୍ରୋଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡିକ ତିନୋଟି କାନୁନ୍ୟୁଟେଡ୍ CM ପ୍ରାଣୀରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ CSF (ଚିତ୍ର 3c) ଏବଂ ରକ୍ତ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7) ଅନୁସନ୍ଧାନରେ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପରୀକ୍ଷିତ ସମସ୍ତ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ୍ (# 1779) ଠାରୁ 10-1000 ଗୁଣ ଅଧିକ ସ୍ତରରେ CSF ବିଭାଗକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରିଥିଲା ​​|ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, କ୍ଲୋନଗୁଡିକ # 2020 ଏବଂ # 2077 ରେ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଫେଜ୍ ଅପେକ୍ଷା ପ୍ରାୟ 1000 ଗୁଣ ଅଧିକ CSF ଟାଇଟର୍ ଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ମନୋନୀତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ର ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଅଲଗା, କିନ୍ତୁ ସେଗୁଡ଼ିକର ଏକ ଉଚ୍ଚ CSF ହୋମିଂ କ୍ଷମତା ଅଛି |କ୍ଲୋନ # 1903 ଏବଂ # 2011 ପାଇଁ ସମୟ ସହିତ କ୍ରମାଗତ ହ୍ରାସକୁ ଆମେ ଦେଖିଲୁ, ଯେତେବେଳେ କି କ୍ଲୋନ # 2077, # 2002 ଏବଂ # 2009 ପାଇଁ ପ୍ରଥମ 10 ମିନିଟରେ ବୃଦ୍ଧି ସକ୍ରିୟ ପରିବହନକୁ ସୂଚାଇପାରେ କିନ୍ତୁ ଯାଞ୍ଚ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ |କ୍ଲୋନ୍ # 2020, # 2002, ଏବଂ # 2077 ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରରେ ସ୍ଥିର ହୋଇଥିବାବେଳେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ବୃଦ୍ଧି ପରେ କ୍ଲୋନ୍ # 2009 ର CSF ଏକାଗ୍ରତା ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସ ପାଇଲା |ତା’ପରେ ଆମେ ପ୍ରତ୍ୟେକ CSF ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିକୁ ଏହାର ରକ୍ତ ଏକାଗ୍ରତା (ଚିତ୍ର 3d) ସହିତ ତୁଳନା କଲୁ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ସମୟରେ ଏହାର ରକ୍ତ ଟାଇଟର୍ ସହିତ ପ୍ରତ୍ୟେକ ସିଏସ୍ଏଫ୍ ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ହାରାହାରି ଟାଇଟର୍ ର ସମ୍ପର୍କ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ candidates ଜଣ ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ ତିନିଜଣ ରକ୍ତ CSF ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲେ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, କ୍ଲୋନ୍ # 2077 ଉଚ୍ଚ ରକ୍ତ ସ୍ଥିରତା ଦେଖାଇଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7) |ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ନିଜେ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ଫେଜ୍ କଣିକା ବ୍ୟତୀତ ଅନ୍ୟ କାର୍ଗୋକୁ ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ପରିବହନ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ବୋଲି ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ N- ଟର୍ମିନାସରେ ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ଡେରିଭାଇଜଡ୍ ହୋଇଥିବା ଚାରୋଟି ଲିଡର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରିଛୁ ଯେଉଁଠାରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଫେଜ୍ କଣିକା ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ହୋଇଛି |ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ (ନଂ। 2002, 2009, 2020 ଏବଂ 2077) ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ (SA) ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇ ମଲ୍ଟିମେରିକ୍ ଫର୍ମଗୁଡିକ ଫେଜ୍ ଜ୍ୟାମିତିକୁ କିଛି ମାତ୍ରାରେ ଅନୁକରଣ କରିଥିଲେ |ଏହି ଫର୍ମାଟ୍ ଆମକୁ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡରେ SA ଏକ୍ସପୋଜର ମାଲ ପରିବହନ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଭାବରେ ମାପିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଲା |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଏହି SA- କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଫର୍ମାଟରେ ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲେ ଫେଜ୍ ତଥ୍ୟ ପ୍ରାୟତ repr ପୁନ oduc ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇପାରେ | (ଚିତ୍ର 3e) |ସ୍କ୍ରାମବ୍ଲେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସରେ 48 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ଅଜ୍ଞାତ ସ୍ତର ସହିତ କମ୍ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏକ୍ସପୋଜର୍ ଏବଂ ତୀବ୍ର CSF କ୍ଲିୟରାନ୍ସ ଥିଲା |CSF ସ୍ପେସରେ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକର ବିତରଣ ପଥ ବିଷୟରେ ଜ୍ଞାନ ହାସଲ କରିବାକୁ, ଆମେ ଭିଭୋରେ ଇଣ୍ଟ୍ରାଭେନସ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦେବାର 1 ଘଣ୍ଟା ପରେ ଇମ୍ୟୁନୋହୋଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି (IHC) ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହିଟ୍ ର ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ମସ୍ତିଷ୍କ କ୍ୟାପିଲାରୀରେ ଦୃ strong ଦାଗ ଦ୍ୱାରା କ୍ଲୋନ୍ # 2002, # 2077, ଏବଂ # 2009 ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରେ, ଯେତେବେଳେ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଫେଜ୍ (# 1779) ଏବଂ କ୍ଲୋନ୍ # 2020 ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8) |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ BBB ଅତିକ୍ରମ କରି ମସ୍ତିଷ୍କ ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ଏହି ଅନୁମାନ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଆବଶ୍ୟକ, କାରଣ BSCFB ମାର୍ଗ ମଧ୍ୟ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ |ଅତ୍ୟଧିକ ସମୃଦ୍ଧ କ୍ଲୋନ (# 2002) ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମକୁ ଅନ୍ୟ ମନୋନୀତ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ସହିତ ତୁଳନା କରିବାବେଳେ, ଏହା ଲକ୍ଷ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା ଯେ ସେମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ କେତେକଙ୍କର ସମାନ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିସ୍ତାର ଅଛି, ଯାହା ସମାନ ପରିବହନ ଯନ୍ତ୍ରକୁ ସୂଚାଇପାରେ (ଚିତ୍ର 3f) |
ଏହାର ଅନନ୍ୟ ପ୍ଲାଜ୍ମା ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଏବଂ ସମୟ ସହିତ CSF ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ବୃଦ୍ଧି ହେତୁ, ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କ୍ଲୋନ୍ # 2077 ଅଧିକ 48 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସ୍ଥାୟୀ SA ସ୍ତର ସହିତ ମିଳିତ ଭାବରେ CSF ର ଦ୍ରୁତ ବୃଦ୍ଧିକୁ ପୁନ oduc ପ୍ରକାଶ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4a) |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଚିହ୍ନିତ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ବିଷୟରେ, # 2077 ମସ୍ତିଷ୍କ କ୍ୟାପିଲାରୀ ପାଇଁ ଦୃ strongly ଭାବରେ ଦାଗିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ରେଜୋଲୁସନରେ ଦେଖାଯିବା ସମୟରେ ଏବଂ କ୍ୟାପିଲାରୀ ମାର୍କର ଲେକ୍ଟିନ୍ ସହିତ ମହତ୍ col ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 4b) |CNS ରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଫାର୍ମାକୋଲୋଜିକାଲ୍ ଇଫେକ୍ଟ ମିଳିପାରିବ କି ନାହିଁ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ, ଆମେ ଏକ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେଉଁଥିରେ ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ସଂସ୍କରଣ i) # 2077 ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ii) BACE1 ଇନହିବିଟର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ SA ସହିତ ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଅନୁପାତରେ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା |ଗୋଟିଏ ମିଶ୍ରଣ ପାଇଁ ଆମେ କେବଳ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟର ବ୍ୟବହାର କରୁ ଏବଂ ଅନ୍ୟଟି ପାଇଁ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟରର 1: 3 ଅନୁପାତକୁ # 2077 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |ଉଭୟ ନମୁନାକୁ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଦିଆଯାଉଥିଲା ଏବଂ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ସ୍ତର ବିଟା-ଆମିଲଏଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 40 (ଆବେଟା 40) ସମୟ ସହିତ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |CSF ରେ Abeta40 ମାପ କରାଯାଇଥିଲା କାରଣ ଏହା ମସ୍ତିଷ୍କ ପେରେଞ୍ଚାଇମାରେ BACE1 ପ୍ରତିବନ୍ଧକକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିଥାଏ |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ଉଭୟ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସରେ Abeta40 ର ରକ୍ତ ସ୍ତର ଯଥେଷ୍ଟ କମିଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4c, d) |ତଥାପି, କେବଳ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନଂ ର ମିଶ୍ରଣ ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନା |2077 ଏବଂ SA ରେ ସଂଯୁକ୍ତ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ଏକ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (ଚିତ୍ର 4c) ରେ Abeta40 ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ଘଟାଇଲା |ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନଂ।2077 60 kDa SA ପ୍ରୋଟିନକୁ CNS ରେ ପରିବହନ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ଏବଂ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ର SA- କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଇନହିବିଟର ସହିତ ଫାର୍ମାକୋଲୋଜିକାଲ୍ ପ୍ରଭାବ ମଧ୍ୟ ସୃଷ୍ଟି କରେ |
(କ) T7 ଫେଜ୍ ର କ୍ଲୋନାଲ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ (2 × 10 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) CSF ପେପ୍ଟାଇଡ୍ # 2077 (RLSSVDSDLSGC) ର ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଏବଂ ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ ତିନିଟି CM- ଇଣ୍ଟୁବେଟେଡ୍ ଇଦୁର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଫେଜ୍ (# 1779) ଦର୍ଶାଉଛି |)ଏହି ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ 3 ଟି ରାଗରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ସୁଗନ୍ଧ ପୂର୍ବରୁ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ବୁଲିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଆଯାଇଥିଲା |ମସ୍ତିଷ୍କଗୁଡିକ T7 ଫେଜ୍ କ୍ୟାପସିଡ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ FITC- ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ବିଭାଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଦାଗ କରାଯାଇଥିଲା |ସୁଗନ୍ଧ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଫିକ୍ସିସନର ଦଶ ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ, DyLight594- ଲେବଲ୍ ଲେକ୍ଟିନ୍ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |କ୍ୟାପିଲିରି ଏବଂ ପେରିଭାସ୍କୁଲାର୍ ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁରେ ମାଇକ୍ରୋଭେଲ୍ସେଲ୍ ଏବଂ ଫେଜ୍ (ସବୁଜ) ର ଲ୍ୟୁମିନାଲ୍ ପାର୍ଶ୍ lect ର ଲେକ୍ଟିନ୍ ଦାଗ (ଲାଲ) ଦେଖାଉଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଚିତ୍ର |ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ 10 µm ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ |(ଗ)Aβ40 ରେ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟର-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ହ୍ରାସ Aβ1-40 ELISA ଦ୍ୱାରା ରକ୍ତ (ଲାଲ) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (କମଳା) ରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |ଉତ୍ତମ ସ୍ୱଚ୍ଛତା ପାଇଁ, 100% ସ୍କେଲରେ ଗ୍ରାଫରେ ଏକ ବିନ୍ଦୁ ରେଖା ଅଙ୍କିତ |(ଗ) ରକ୍ତରେ ଲାଲ (ତ୍ରିରଙ୍ଗା) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (କମଳା ତ୍ରିରଙ୍ଗା) ରେ ଶତକଡ଼ା ହ୍ରାସ, ପେପ୍ଟାଇଡ୍ # 2077 ଏବଂ BACE1 ଇନହିବିଟୋରୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ଟ୍ରାନଜିଟ୍ ପାଇଁ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ସହିତ ଚିକିତ୍ସିତ ହୋଇଥିବା ମୂଷାମାନଙ୍କରେ |(ଘ) ରକ୍ତ Aβ40 (ଲାଲ୍ ସର୍କଲ୍) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (କମଳା ବୃତ୍ତ) ରେ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ସହିତ ଚିକିତ୍ସିତ ରାଗରେ ଶତକଡା ହ୍ରାସ କେବଳ BACE1 ନିରୋଧକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ଯୋଡି ହୋଇଛି |ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ Aβ ଏକାଗ୍ରତା ଥିଲା 420 pg / ml (ମାନକ ବିଘ୍ନ = 101 pg / ml) |
ଜ bi ବ ଚିକିତ୍ସା ଅନୁସନ୍ଧାନର ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ସଫଳତାର ସହିତ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଛି |ଏହି ପଦ୍ଧତି ଭିଭୋ ଭାସ୍କୁଲାର ବିବିଧତା ଅଧ୍ୟୟନ 18,19 ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ ପାତ୍ରକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରୁଥିବା ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି 20,21,22,23,24,25,26 |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ଏହି ଚୟନ ପଦ୍ଧତିର ପ୍ରୟୋଗକୁ କେବଳ ମସ୍ତିଷ୍କ ପାତ୍ରକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରୁଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ନୁହେଁ, ବରଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଅତିକ୍ରମ କରିବାକୁ ସକ୍ରିୟ ପରିବହନ ଗୁଣ ଥିବା ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ଆବିଷ୍କାରକୁ ମଧ୍ୟ ବ extended ାଇଛୁ |ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ CM intubated rat ରେ ଏକ ଭିଭୋ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ବିକାଶକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁ ଏବଂ CSF ହୋମିଙ୍ଗ୍ ଗୁଣ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ଏହାର ସାମର୍ଥ୍ୟ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁ |12-ମେର ରାଣ୍ଡମ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବା T7 ଫେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଦର୍ଶାଇବାକୁ ସମର୍ଥ ହେଲୁ ଯେ T7 ଫେଜ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ଛୋଟ (ପ୍ରାୟ 60 nm ବ୍ୟାସ) 10 ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସହିତ ଖାପ ଖାଇବ, ଯାହା ଦ୍ directly ାରା ସିଧାସଳଖ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ କିମ୍ବା କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍ ଅତିକ୍ରମ କରିବ |ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ କାନନ୍ୟୁଟେଡ୍ ସିଏମ୍ ରାଗରୁ CSF ଅମଳ ଭିଭୋ ଫଙ୍କସନାଲ ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତିରେ ଏକ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଥିଲା ଏବଂ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ କେବଳ ଭାସ୍କ୍ୟୁଲେଚର୍ ସହିତ ବନ୍ଧା ହୋଇନଥିଲା ବରଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ମଧ୍ୟରେ ପରିବହନକାରୀ ଭାବରେ ମଧ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟ କରିଥିଲା ​​|ଅଧିକନ୍ତୁ, ଏକକାଳୀନ ରକ୍ତ ସଂଗ୍ରହ କରି ଏବଂ HTS କୁ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ଉତ୍ପାଦିତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପ୍ରୟୋଗ କରି, ଆମେ ନିଶ୍ଚିତ କଲୁ ଯେ CSF ର ପସନ୍ଦ ରକ୍ତ ସମୃଦ୍ଧତା କିମ୍ବା ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ବିସ୍ତାର ପାଇଁ ଫିଟନେସ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା |ଅବଶ୍ୟ, ରକ୍ତ ବିଭାଗ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ଏକ ଅଂଶ, ଯେହେତୁ CSF ବିଭାଗରେ ପହଞ୍ଚିବାରେ ସକ୍ଷମ ପର୍ଯ୍ୟାୟଗୁଡିକ ବଞ୍ଚିବା ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ନିଜକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ରକ୍ତ ପ୍ରବାହରେ ଦୀର୍ଘ ସମୟ ବଞ୍ଚିବା ଆବଶ୍ୟକ |କଞ୍ଚା HTS ତଥ୍ୟରୁ ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ କ୍ରମ ସୂଚନା ବାହାର କରିବାକୁ, ଆମେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରବାହରେ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମାନ୍ୱୟରେ ତ୍ରୁଟି ସହିତ ଖାପ ଖୁଆଇଥିବା ଫିଲ୍ଟରଗୁଡିକୁ କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କରିଛୁ |ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତିରେ ଗତିଜ ପାରାମିଟରଗୁଡିକ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି, ଆମେ ରକ୍ତ 24, 27, 28 ରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର T7 ଫେଜ୍ (t½ ~ 28 ମିନିଟ୍) ର ଦ୍ରୁତ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ସକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ପ୍ରତି ମିନିଟରେ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (t½ ~ 26 ମିନିଟ୍) ରେ ସେମାନଙ୍କର ଅଧା ଜୀବନ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ |ରକ୍ତ ଏବଂ CSF ରେ ସମାନ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ସତ୍ତ୍, େ, ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ମଧ୍ୟରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାରର T7 ଫେଜ୍ ର ନିମ୍ନ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଗତିଶୀଳତାକୁ ସୂଚାଇ CSF ରେ କେବଳ 0.001% ଫେଜ୍ ରକ୍ତ ଏକାଗ୍ରତା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ |ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ କ ies ଶଳରେ ବ୍ୟବହାର କରିବାବେଳେ ଏହି କାର୍ଯ୍ୟଟି ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନର ଗୁରୁତ୍ୱକୁ ଆଲୋକିତ କରିଥାଏ, ବିଶେଷତ ph ଫେଜ୍ ସିଷ୍ଟମଗୁଡିକ ପାଇଁ ଯାହା ଶୀଘ୍ର ରକ୍ତ ସଞ୍ଚାଳନରୁ ସଫା ହୋଇଯାଏ, କାରଣ କିଛି କ୍ଲୋନ୍ CNS ବିଭାଗରେ ପହଞ୍ଚିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲେ |ଏହିପରି, ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡରେ, ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିବିଧତା ହ୍ରାସ ବହୁତ ବଡ ଥିଲା, କାରଣ ଏହି ସୀମିତ CSF ମଡେଲରେ କେବଳ ସୀମିତ ସଂଖ୍ୟକ କ୍ଲୋନ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ କ strategy ଶଳରେ ଏହା ଅନେକ ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରିଥିଲା ​​ଯେପରିକି CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ସକ୍ରିୟ ଜମା, ରକ୍ତ ବିଭାଗରେ କ୍ଲୋନ ବଞ୍ଚିବା ଏବଂ ପ୍ରଥମ 10 ମିନିଟ ମଧ୍ୟରେ ରକ୍ତରୁ T7 ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଶୀଘ୍ର ଅପସାରଣ (ଚିତ୍ର 1d ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4 ମି) |)ଏହିପରି, ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ ପରେ, CSF ରେ ବିଭିନ୍ନ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଯଦିଓ ସମାନ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପୁଲ୍ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସଦସ୍ୟ ଥିବା ଉତ୍ସ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ଏକାଧିକ କଠୋର ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକ ବିବିଧତାରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହ୍ରାସ ଘଟାଏ |ତେଣୁ, ଅନିୟମିତ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ଏକ ଅବିଚ୍ଛେଦ୍ୟ ଅଙ୍ଗ ହେବ, ଫଳାଫଳକୁ ବହୁତ ପ୍ରଭାବିତ କରିବ |ଏହା ସମ୍ଭବତ the ମୂଳ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଥିବା ଅନେକ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକର ସମାନ CSF ସମୃଦ୍ଧତା ଥିଲା |ତଥାପି, ସମାନ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅବସ୍ଥାରେ ମଧ୍ୟ, ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପୁଲରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ଲୋନର ଅଳ୍ପ ସଂଖ୍ୟକ କାରଣରୁ ଚୟନ ଫଳାଫଳ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |
CSF ରେ ସମୃଦ୍ଧ ମୋଟିଫ୍ ରକ୍ତରେ ଭିନ୍ନ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଆମେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କ ରକ୍ତରେ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଆଡକୁ ପ୍ରଥମ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଥିଲୁ |(ଚିତ୍ର 1g, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 4e, 4f) |ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଫେଜ୍ ଅଧିକ ସ୍ଥିର ହୋଇପାରେ ଏବଂ ରକ୍ତ ସଞ୍ଚାଳନରୁ ବାହାର ହେବାର ସମ୍ଭାବନା କମ୍ |ଅବଶ୍ୟ, ଏହି ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ନମୁନାରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା, ପରାମର୍ଶ ଦେଇଛି ଯେ କ୍ୟୁରେଟେଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପ ଦେଇ ଗତି କରିଛନ୍ତି: ଗୋଟିଏ ରକ୍ତରେ ଏବଂ ଅନ୍ୟଟି ମସ୍ତିଷ୍କ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ଜମା ହେବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଛି |ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନରୁ CSF ସମୃଦ୍ଧ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଛି |ଖାଲି କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଫେଜ୍ ତୁଳନାରେ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷିତ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ CSF ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହେବା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ଗୋଟିଏ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହିଟ୍ (# 2077) କୁ ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା |ଅନ୍ୟ ହିଟ୍ ତୁଳନାରେ ଏହା ଏକ ଲମ୍ବା ପ୍ଲାଜମା ଅଧା ଜୀବନ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 3d ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7), ଏବଂ କ interesting ତୁହଳର ବିଷୟ, ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡରେ ସି-ଟର୍ମିନାସରେ ଏକ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ରହିଥିଲା ​​|ନିକଟରେ ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ପେପ୍ଟାଇଡରେ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଯୋଗ ହେବା ଦ୍ୱାରା ଆଲବମାଇନ୍ 29 କୁ ବାନ୍ଧି ସେମାନଙ୍କ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ଗୁଣ ଉନ୍ନତ ହୋଇପାରିବ |ପେପ୍ଟାଇଡ୍ # 2077 ପାଇଁ ଏହା ବର୍ତ୍ତମାନ ଅଜ୍ଞାତ ଅଟେ ଏବଂ ଅଧିକ ଅଧ୍ୟୟନ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |କେତେକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ CSF ସମୃଦ୍ଧରେ ଏକ ଭାଲେନ୍ସ-ନିର୍ଭରଶୀଳତା ଦେଖାଇଲା (ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଯାଇ ନାହିଁ), ଯାହା T7 କ୍ୟାପସିଡର ପ୍ରଦର୍ଶିତ ଭୂପୃଷ୍ଠ ଜ୍ୟାମିତି ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ |ଆମେ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା T7 ସିଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପେଜ୍ କଣିକା ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର 5-15 କପି ଦେଖାଇଲା |ପ୍ରାର୍ଥୀ ଲିଡ୍ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଉପରେ IHC କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ମୂଷାଙ୍କ ମସ୍ତିଷ୍କ କର୍ଟେକ୍ସରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8) |ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅତି କମରେ ତିନୋଟି କ୍ଲୋନ (ନଂ 2002, ନମ୍ବର 2009 ଏବଂ ନମ୍ବର 2077) ବିବିବି ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରିଥିଲେ।ଏହି BBB ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା CSF ଜମା ହେବା କିମ୍ବା ଏହି କ୍ଲୋନଗୁଡିକର ସିଧାସଳଖ BCSFB କୁ ଗତି କରିବା ଫଳାଫଳ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଆମେ ଦେଖାଇଥାଉ ଯେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କାର୍ଗୋରେ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇ ବନ୍ଧା ହେଲେ ମନୋନୀତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସେମାନଙ୍କର CSF ପରିବହନ କ୍ଷମତା ବଜାୟ ରଖେ |N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ SA ରେ ବାନ୍ଧିବା ମୁଖ୍ୟତ blood ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (ଚିତ୍ର 3e) ରେ ନିଜ ନିଜ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ସହିତ ପ୍ରାପ୍ତ ଫଳାଫଳକୁ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରେ |ଶେଷରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ସୀସା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ # 2077 SA ରେ ସଂଯୁକ୍ତ BACE1 ର ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟରର ମସ୍ତିଷ୍କ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ, CSF ରେ Abeta40 ସ୍ତରକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କରି CNS ରେ ଫାର୍ମାକୋଡାଇନାମିକ୍ ପ୍ରଭାବ ସୃଷ୍ଟି କରେ (ଚିତ୍ର 4) |ସମସ୍ତ ହିଟ୍ ର ଏକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ ହୋମୋଲୋଜି ସନ୍ଧାନ କରି ଆମେ ଡାଟାବେସରେ କ hom ଣସି ହୋମୋଲୋଜି ଚିହ୍ନଟ କରିବାରେ ଅସମର୍ଥ |ଏହା ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଜରୁରୀ ଯେ T7 ଲାଇବ୍ରେରୀର ଆକାର ପ୍ରାୟ 109 ଥିବାବେଳେ 12 ମିଟର ପାଇଁ ତତ୍ତ୍ୱିକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଆକାର 4 x 1015 ଅଟେ।କଳ୍ପନା ଅନୁଯାୟୀ, ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର କ natural ଣସି ପ୍ରାକୃତିକ ହୋମୋଲୋଜ୍ ପାଇ ନ ଥିବାର ଗୋଟିଏ କାରଣ ହେଉଛି ମସ୍ତିଷ୍କରେ କିଛି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଅନିୟନ୍ତ୍ରିତ ପ୍ରବେଶକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ବିବର୍ତ୍ତନ ସମୟରେ ବିଲୋପ ହୋଇପାରେ |
ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଆମର ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଭିଭୋରେ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ବ୍ୟାରେଜ୍ ର ପରିବହନ ପ୍ରଣାଳୀକୁ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ଭବିଷ୍ୟତ କାର୍ଯ୍ୟ ପାଇଁ ଏକ ଆଧାର ପ୍ରଦାନ କରେ |ଏହି ପଦ୍ଧତିର ମ basic ଳିକ ସେଟଅପ୍ ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଚୟନ କ strategy ଶଳ ଉପରେ ଆଧାରିତ ଯାହା କେବଳ ମସ୍ତିଷ୍କ ଭାସ୍କୁଲାର ବାଇଣ୍ଡିଂ ଗୁଣ ସହିତ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରେ ନାହିଁ, ବରଂ ଏକ ଗୁରୁତ୍ step ପୂର୍ଣ୍ଣ ପଦକ୍ଷେପ ମଧ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ ଯେଉଁଥିରେ ସଫଳ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ CNS ବିଭାଗରେ ଭିଭୋରେ ଜ bi ବିକ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଅତିକ୍ରମ କରିବାକୁ ଅନ୍ତର୍ନିହିତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପାଇଥାଏ |ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡିକର ପରିବହନର ଯନ୍ତ୍ରକ and ଶଳ ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ ଅଞ୍ଚଳ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାଇକ୍ରୋଭାସ୍କ୍ୟୁଲେଚର୍ ସହିତ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ ସେମାନଙ୍କର ପସନ୍ଦକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା |ଏହା BBB ଏବଂ ରିସେପ୍ଟର ପରିବହନ ପାଇଁ ନୂତନ ପଥ ଆବିଷ୍କାର କରିପାରେ |ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ ଚିହ୍ନିତ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ସିଧାସଳଖ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର ରିସେପ୍ଟର କିମ୍ବା BBB କିମ୍ବା BCSFB ମାଧ୍ୟମରେ ପରିବହନ ହେଉଥିବା ଲିଗାଣ୍ଡକୁ ବାନ୍ଧିପାରେ |ଏହି କାର୍ଯ୍ୟରେ ଆବିଷ୍କୃତ CSF ପରିବହନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଭେକ୍ଟରଗୁଡିକ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯିବ |BBB ଏବଂ / କିମ୍ବା BCSFB ଅତିକ୍ରମ କରିବାର କ୍ଷମତା ପାଇଁ ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ମସ୍ତିଷ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରୁଛୁ |ଏହି ନୂତନ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡିକ ନୂତନ ରିସେପ୍ଟର କିମ୍ବା ପଥଗୁଡିକର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆବିଷ୍କାର ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ଜ olog ବ ବିଜ୍ଞାନ ପରି ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲ୍ ବିତରଣ ପାଇଁ ନୂତନ ଉଚ୍ଚ ଦକ୍ଷତା ସମ୍ପନ୍ନ ପ୍ଲାଟଫର୍ମର ବିକାଶ ପାଇଁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ମୂଲ୍ୟବାନ ଉପକରଣ ହେବ |
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପଦ୍ଧତିର ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ବଡ଼ ସିଷ୍ଟର୍ନା (CM) କୁ ବାତିଲ କରନ୍ତୁ |ଆନାସ୍ଥେଟାଇଜଡ୍ ୱିଷ୍ଟାର୍ ମୂଷା (200-350 ଗ୍ରାମ) ଏକ ଷ୍ଟେରେଓଟାକ୍ସିକ୍ ଯନ୍ତ୍ରରେ ଲଗାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲିବା ପାଇଁ ସେଭ୍ ହୋଇଥିବା ଏବଂ ଅଜ୍ଞାତ ଭାବରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ ତ୍ୱଚା ଉପରେ ଏକ ମଧ୍ୟମା ଛେଦନ କରାଯାଇଥିଲା |ଉପର ସ୍ୟାସ୍ ଅଞ୍ଚଳରେ ଦୁଇଟି ଛିଦ୍ର ଖୋଳ ଏବଂ ଗାତରେ ଫିକ୍ସିଂ ସ୍କ୍ରୁଗୁଡିକ ବାନ୍ଧ |CM ରେ ଏକ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ କାନନୁଲାର ଷ୍ଟେରେଓଟାକ୍ଟିକ୍ ମାର୍ଗଦର୍ଶନ ପାଇଁ ଲାଟେରାଲ୍ ଅସିପିଟାଲ୍ କ୍ରେଷ୍ଟରେ ଏକ ଅତିରିକ୍ତ ଛିଦ୍ର ଖୋଳାଯାଇଥିଲା |କାନନୁଲାର ଚାରିପାଖରେ ଦାନ୍ତ ସିମେଣ୍ଟ ଲଗାନ୍ତୁ ଏବଂ ସ୍କ୍ରୁ ସହିତ ସୁରକ୍ଷିତ କରନ୍ତୁ |ଫଟୋ-ଆରୋଗ୍ୟ ଏବଂ ସିମେଣ୍ଟ କଠିନ ହେବା ପରେ ଚର୍ମ କ୍ଷତକୁ 4/0 ସୁପ୍ରାମିଡ୍ ସଟୁର ସହିତ ବନ୍ଦ କରିଦିଆଗଲା |କ୍ୟାନୁଲାର ସଠିକ୍ ସ୍ଥାନ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ର ସ୍ୱତ aneous ପ୍ରବୃତ୍ତ ଲିକ୍ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ ହୁଏ |ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ୍ ଉପକରଣରୁ ମୂର୍ତ୍ତିକୁ କା ove ଼ିଦିଅ, ଉପଯୁକ୍ତ ଅପରେଟିଭ୍ ଯତ୍ନ ଏବଂ ଯନ୍ତ୍ରଣା ପରିଚାଳନା ଗ୍ରହଣ କର ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କର ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ରକ୍ତ ଚିହ୍ନ ନହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏହାକୁ ଅତି କମରେ ଏକ ସପ୍ତାହ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୁସ୍ଥ ହେବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଅ |ଚାର୍ଲ୍ସ ନଦୀ (ଫ୍ରାନ୍ସ) ରୁ ୱିଷ୍ଟାର୍ ମୂଷା (Crl: WI / Han) ମିଳିଲା |ସମସ୍ତ ମୂଷା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ରୋଗମୁକ୍ତ ଅବସ୍ଥାରେ ରଖାଯାଇଥିଲା |ସମସ୍ତ ପଶୁ ପରୀକ୍ଷଣ ସ୍ୱିଜରଲ୍ୟାଣ୍ଡର ବେସେଲ ସହରର ପ୍ରାଣୀ ଚିକିତ୍ସା କାର୍ଯ୍ୟାଳୟ ଦ୍ approved ାରା ଅନୁମୋଦିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ପଶୁ ଲାଇସେନ୍ସ ନମ୍ବର 2474 (ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଏବଂ ବ୍ରେନ୍ ଅଫ୍ ରେଟ୍ ରେ ଥେରାପିଟିଭ୍ ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ସ୍ତର ମାପ କରି ସକ୍ରିୟ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ) ଅନୁଯାୟୀ କରାଯାଇଥିଲା।
ହାତରେ ଥିବା CM କାନନୁଲା ସହିତ ଧୀରେ ଧୀରେ ଚେତନାକୁ ସଚେତନ ରଖନ୍ତୁ |କାନନୁଲାରୁ ଡାଟୁରା କା ove ଼ି 10 µl ସ୍ୱତ ane ପ୍ରବୃତ୍ତ ଭାବରେ ପ୍ରବାହିତ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ |ଯେହେତୁ କାନୁଲାର ପ୍ୟାଟେନ୍ସି ଶେଷରେ ଆପୋଷ ବୁ .ାମଣା ହୋଇଥିଲା, କେବଳ ରକ୍ତ ପ୍ରଦୂଷଣ କିମ୍ବା ରଙ୍ଗୀନ ହେବାର କ evidence ଣସି ପ୍ରମାଣ ନଥିବା କେବଳ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ନମୁନା ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ୍ତରାଳ ଭାବରେ, ଲାଞ୍ଜର ପ୍ରାନ୍ତରେ ଥିବା ଏକ ଛୋଟ ଛୋଟ ଅଂଶରୁ ହେପାରିନ୍ (ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ସହିତ ଟ୍ୟୁବରେ ପ୍ରାୟ 10–20 μl ରକ୍ତ ନିଆଯାଇଥିଲା |T7 ଫେଜ୍ ର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପରେ ବିଭିନ୍ନ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ CSF ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ ହେବା ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରାୟ 5-10 μl ତରଳ ପଦାର୍ଥକୁ ବର୍ଜନ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା କ୍ୟାଥେରର ମୃତ ପରିମାଣ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ |
T7Select 10-3b ଭେକ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ T7Select system manual (Novagen, Rosenberg et al।, InNovations 6, 1-6, 1996) ରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏକ ଅନିୟମିତ 12-mer DNA ସନ୍ନିବେଶ ନିମ୍ନ ଫର୍ମାଟରେ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହେଲା:
ସନ୍ନିବେଶରେ ଡବଲ୍ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ଏବଂ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ NNK କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |N ହେଉଛି ପ୍ରତ୍ୟେକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ର ମାନୁଆଲୀ ମିଶ୍ରିତ ସମୀକରଣ ଅନୁପାତ, ଏବଂ K ହେଉଛି ଆଡେନାଇନ୍ ଏବଂ ସାଇଟୋସିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ସର ମାନୁଆଲୀ ମିଶ୍ରିତ ସମାନ୍ତରାଳ ଅନୁପାତ |37 ° C ରେ 3 ​​ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ dNTP (ନୋଭାଗେନ୍) ଏବଂ କ୍ଲେନୋ ଏନଜାଇମ୍ (ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲାବସ୍) ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଦ୍ Sing ାରା ଏକକ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକ ଦୁଇଗୁଣ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ DNA ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, EtOH ବୃଷ୍ଟିପାତ ଦ୍ double ାରା ଦୁଇଗୁଣ DNA ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା |ଫଳସ୍ୱରୂପ DNA ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଏନଜାଇମ୍ EcoRI ଏବଂ HindIII (ଉଭୟ ରୋଚେରୁ) ହଜମ ହୋଇଥିଲା |ଖଣ୍ଡବିଖଣ୍ଡିତ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧ (QIAquick, Qiagen) ସନ୍ନିବେଶ (T4 ଲିଗେଜ୍, ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲାବସ୍) ତା’ପରେ 10B କ୍ୟାପସିଡ୍ ଜିନ୍ ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ 348 ପରେ ଏକ ପ୍ରି-କ୍ଲିଭ୍ T7 ଭେକ୍ଟରରେ ଇନ୍-ଫ୍ରେମ୍ରେ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପୂର୍ବରୁ 18 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 16 ° C ରେ ଲିଗେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଭିଟ୍ରୋରେ ଫେଜ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ T7Select 10-3b କ୍ଲୋନିଂ କିଟ୍ (ନୋଭାଗେନ୍) ସହିତ ଦିଆଯାଇଥିବା ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଇଚେରିଚିଆ କୋଲି (BLT5615, ନୋଭାଗେନ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇଜିଂରେ ପ୍ୟାକେଜିଂ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଥରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ଲାଇସେଟ୍ସ ଗ୍ଲାଇସେରୋଲର ଏକ ଷ୍ଟକ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଭାବରେ -80 ° C ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗଡ୍, ଟାଇଟ୍ରେଟ୍ ଏବଂ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା |
ମାଲିକାନା 454 / ରୋଚେ-ଆମ୍ପଲିକନ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ରଜ୍ କିମ୍ବା ପ୍ଲେଟରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଫେଜ୍ ଭେରିଏବଲ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକର ସିଧାସଳଖ PCR ବିସ୍ତାର |ଫରୱାର୍ଡ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଭେରିଏବଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ (NNK) 12 (ଟେମ୍ପଲେଟ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ), GS FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ଆଡାପ୍ଟର A ଏବଂ ଏକ ଚାରି-ଆଧାର ଲାଇବ୍ରେରୀ କି କ୍ରମ (TCAG) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1a) କୁ ଧାରଣ କରିଥାଏ |
ରିଭର୍ସ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ରେ ବିଡ୍ କ୍ୟାପଚର୍ ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ବାୟୋଟିନ୍ ଏବଂ ଏମ୍ସୁଲ୍ PCR ସମୟରେ କ୍ଲୋନାଲ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ GS FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ଆଡାପ୍ଟର ବି ମଧ୍ୟ ରହିଥାଏ:
454 GS-FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ଆମ୍ପଲିକନ୍ ଗୁଡିକ 454 / ରୋଚ୍ ପିରୋସେକେନ୍ସିଙ୍ଗ୍ ଅଧୀନରେ ରହିଲା |ମାନୁଆଲ୍ ସେଞ୍ଜର କ୍ରମ (ପ୍ରୟୋଗ ହୋଇଥିବା ବାୟୋ ସିଷ୍ଟମ୍ ହିଟାଚି 3730 xl DNA ଆନାଲିଜର୍) ପାଇଁ, T7 ଫେଜ୍ DNA PCR ଦ୍ am ାରା ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିମ୍ନଲିଖିତ ପ୍ରାଥମିକ ଯୁଗଳଗୁଡ଼ିକ ସହିତ କ୍ରମାନୁସାରେ:
ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଫଳକରୁ ଇନ୍ସର୍ଟଗୁଡିକ ରୋଚ୍ ଫାଷ୍ଟ ଷ୍ଟାର୍ଟ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ କିଟ୍ (ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ) ବ୍ୟବହାର କରି PCR ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଅଧୀନରେ ରହିଲା |ଏକ ଗରମ ଆରମ୍ଭ (95 ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍) ଏବଂ 35 ବୃଦ୍ଧି ଚକ୍ର (95 s ରେ 50 s, 50 ° C ରେ 1 ମିନିଟ୍, ଏବଂ 72 ° C ରେ 1 ମିନିଟ୍) କରନ୍ତୁ |
ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକରୁ ଫେଜ୍, ୱାଇଲ୍ଡ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍, CSF ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ଉଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା ଫେଜ୍, କିମ୍ବା ବ୍ୟକ୍ତିଗତ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଇଚେରିଚିଆ କୋଲି BL5615 ରେ ଟିବି ବ୍ରଥରେ (ସିଗମା ଆଲଡ୍ରିଚ୍) କିମ୍ବା 500 ସେମି 2 ଡିସ୍ (ଥର୍ମୋ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 ° C ରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ଲେଟଗୁଡିକରୁ ଟ୍ରାଇସ୍- EDTA ବଫର୍ (ଫ୍ଲୁକା ଆନାଲିଟିକାଲ୍) ସହିତ ଧୋଇବା କିମ୍ବା ଷ୍ଟେରାଇଲ୍ ପାଇପେଟ୍ ଟିପ୍ସ ସହିତ ପ୍ଲେକ୍ ସଂଗ୍ରହ କରି ଫେଜ୍ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଫେଜ୍ ସଂସ୍କୃତି ଅଲ ern କିକ ବା ନିଷ୍କାସନ ବଫର୍ ଠାରୁ ଏକ ରାଉଣ୍ଡ ପଲିଥିନ୍ ଗ୍ଲାଇକଲ୍ (PEG 8000) ବୃଷ୍ଟିପାତ (ପ୍ରୋମେଗା) ସହିତ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଟ୍ରାଇସ୍-ଇଡିଟା ବଫର୍ ରେ ପୁନ us ସ୍ଥାନିତ ହୋଇଥିଲା |
ବର୍ଦ୍ଧିତ ଫେଜ୍ ଇଣ୍ଟ୍ରାଭେନସ୍ (IV) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ (500 μl / ପଶୁ) ପୂର୍ବରୁ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ ବିଡ୍ (ମିଲଟେନି ବାୟୋଟେକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି 2-3 ରାଉଣ୍ଡ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣର ଶିକାର ହୋଇଥିଲେ |ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡରେ 2 × 1012 ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା;ଦ୍ୱିତୀୟରେ, 2 × 1010 ପର୍ଯ୍ୟାୟ;ତୃତୀୟ ଏବଂ ଚତୁର୍ଥ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡରେ, ପଶୁମାନଙ୍କ ପାଇଁ 2 × 109 ପର୍ଯ୍ୟାୟ |CSF ରେ ଫେଜ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟ ପଏଣ୍ଟରେ ସଂଗୃହିତ ରକ୍ତ ନମୁନାଗୁଡିକ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ (T7Select system manual) ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ଲେକ୍ ଗଣନା ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ଫେଜ୍ ଚୟନ ଲାଞ୍ଜ ଶିରାରେ ଶୁଦ୍ଧ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡିକର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ କିମ୍ବା ପୂର୍ବ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡରୁ CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ପୁନ - ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ଦ୍ୱାରା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅମଳ ଯଥାକ୍ରମେ 10 ମିନିଟ୍, 30 ମିନିଟ୍, 60 ମିନିଟ୍, 90 ମିନିଟ୍, 120 ମିନିଟ୍, 180 ମିନିଟ୍, ଏବଂ 240 ମିନିଟ୍ରେ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ନମୁନାରେ କରାଯାଇଥିଲା |ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂରେ ସମୁଦାୟ ଚାରି ରାଉଣ୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ଦୁଇଟି ମନୋନୀତ ଶାଖା ପୃଥକ ଭାବରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇ ପ୍ରଥମ ତିନି ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନ ସମୟରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରଥମ ଦୁଇ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନରୁ CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ସମସ୍ତ ଫେଜ୍ ଇନ୍ସର୍ଟଗୁଡିକ 454 / ରୋଚ୍ ପିରୋସେକେନ୍ସିଙ୍ଗ୍ ଅଧୀନରେ ଥିବାବେଳେ ଶେଷ ଦୁଇ ରାଉଣ୍ଡ ଚୟନରୁ CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ସମସ୍ତ କ୍ଲୋନ ମାନୁଆଲ କ୍ରମରେ ରହିଥିଲା ​​|ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ସମସ୍ତ ରକ୍ତ ଫେଜ୍ ମଧ୍ୟ 454 / ରୋଚ୍ ପିରୋସେକେନ୍ସିଙ୍ଗ୍ ଅଧୀନରେ ରହିଲା |ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡିକର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପାଇଁ, ଇ-କୋଲି (BL5615) ରେ 500 cm2 ପ୍ଲେଟରେ 37 ° C ରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ମନୋନୀତ ପର୍ଯ୍ୟାୟଗୁଡିକ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ମନୋନୀତ ଏବଂ ମାନୁଆଲୀ କ୍ରମାନ୍ୱୟରେ କ୍ଲୋନଗୁଡିକ ଯକ୍ଷ୍ମା ମାଧ୍ୟମରେ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇଥିଲା |ଫେଜ୍ ଉତ୍ତୋଳନ, ଶୁଦ୍ଧତା ଏବଂ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ ପରେ (ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି), 300 μl ରେ 2 × 1010 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ ଗୋଟିଏ ଲାଞ୍ଜ ଶିରାରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଗଲା |
କ୍ରମ ତଥ୍ୟର ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଏବଂ ଗୁଣାତ୍ମକ ଫିଲ୍ଟରିଂ |କଞ୍ଚା 454 / ରୋଚ୍ ତଥ୍ୟ ବାଇନାରୀ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ବାଇନାରୀ ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ମାନଚିତ୍ର ଫର୍ମାଟ୍ (sff) ରୁ ପିଆରସନ୍ ମାନବ ପଠନୀୟ ଫର୍ମାଟ୍ (ଫାସ୍ତା) ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ନିମ୍ନରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ପରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ମାଲିକାନା C ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ଏବଂ ସ୍କ୍ରିପ୍ଟ (ଅପ୍ରକାଶିତ ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରାଥମିକ ତଥ୍ୟର ବିଶ୍ଳେଷଣରେ କଠୋର ମଲ୍ଟି ଷ୍ଟେଜ ଫିଲ୍ଟରିଂ ପ୍ରଣାଳୀ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |ପ read ଼ିବା ଫିଲ୍ଟର କରିବା ପାଇଁ ଯେଉଁଥିରେ ଏକ ବ valid ଧ 12mer ସନ୍ନିବେଶ DNA କ୍ରମ ଧାରଣ କରିନଥିଲା, ଲେବଲ୍ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ଷ୍ଟପ୍ ଲେବଲ୍ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ଏବଂ ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ଇନ୍ସର୍ଟ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGACGCGGGGGGTCTCGACGGGTCGGGGGGATGଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରତି 2 ଟି ଅସଙ୍ଗତିକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥାଏ |ତେଣୁ, ବିନା ଆରମ୍ଭରେ ପ read ଼ନ୍ତୁ ଏବଂ ଟ୍ୟାଗ୍ ବନ୍ଦ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସନ୍ନିବେଶ ଧାରଣ କରିଥିବା ପ read ଼ା, ଅର୍ଥାତ୍ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟ ଯାହା ଅନୁମୋଦିତ ସଂଖ୍ୟାର ମେଳ ଖାଉ ନାହିଁ, ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଅବଶିଷ୍ଟ ପ read ଼ିବା ପାଇଁ, N-mer DNA କ୍ରମ ଆରମ୍ଭ ମାର୍କରୁ ବିସ୍ତାର ହୋଇ ଷ୍ଟପ୍ ମାର୍କ ମୂଳ ପଠନ କ୍ରମରୁ ଉତ୍ତେଜିତ ହୋଇ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ (ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ “ସନ୍ନିବେଶ” କୁହାଯାଏ) |ସନ୍ନିବେଶର ଅନୁବାଦ ପରେ, ପ୍ରାଇମରର 5 ′ ଶେଷରେ ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ପରେ ଅଂଶ ସନ୍ନିବେଶରୁ ଅପସାରିତ ହୁଏ |ଏଥିସହ, ପ୍ରାଥମିକର ′ ′ ଶେଷରେ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଡନ୍ ଆଡକୁ ଯାଉଥିବା ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ମଧ୍ୟ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା |କେବଳ ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ କ୍ରମ ଧାରଣ କରିଥିବା ସନ୍ନିବେଶକୁ ବାଦ ଦେବା ପାଇଁ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ୟାଟର୍ “PAG” ରୁ ଆରମ୍ଭ ହୋଇଥିବା ଅନୁବାଦିତ ଇନ୍ସର୍ଟଗୁଡିକ ମଧ୍ୟ ଅପସାରିତ ହେଲା |ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ 3 ରୁ କମ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ର ଅନୁବାଦ ପରେ ଲମ୍ବ ଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଶେଷରେ, ସନ୍ନିବେଶ ପୁଲରେ ଅନାବଶ୍ୟକତା ହଟାନ୍ତୁ ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅନନ୍ୟ ସନ୍ନିବେଶର ଆବୃତ୍ତି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରନ୍ତୁ |ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣର ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (ସନ୍ନିବେଶ) ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର (ପ read ଼ିବା) ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଫିଗର୍ସ 1c ଏବଂ 2) ର ଏକ ତାଲିକା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |
କ୍ରମ ସମାନତା ଦ୍ Group ାରା ଗ୍ରୁପ୍ N-mer DNA ସନ୍ନିବେଶ: 454 / ରୋଚ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସିକ୍ୱେନ୍ସିଙ୍ଗ୍ ତ୍ରୁଟିଗୁଡିକୁ ଦୂର କରିବା ପାଇଁ (ଯେପରିକି ହୋମୋପଲିମର ଏକ୍ସଟେନ୍ସନ୍ ସହିତ ସମସ୍ୟା) ଏବଂ କମ୍ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅନାବଶ୍ୟକତାକୁ ହଟାଇବା ପାଇଁ, ପୂର୍ବରୁ ଫିଲ୍ଟର୍ ହୋଇଥିବା N-mer DNA କ୍ରମ ସନ୍ନିବେଶ (ସନ୍ନିବେଶ) ସମାନତା ଦ୍ୱାରା ସଜାଯାଇଥାଏ |ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଥିବା ଏକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଆଲଗୋରିଦମ ବ୍ୟବହାର କରି ସନ୍ନିବେଶ (2 ଟି ମେଳ ଖାଉଥିବା ବେସ୍ ଅନୁମୋଦିତ): ସନ୍ନିବେଶଗୁଡିକ ପ୍ରଥମେ ସେମାନଙ୍କ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (ସର୍ବୋଚ୍ଚରୁ ସର୍ବନିମ୍ନ) ଦ୍ sort ାରା ସଜାଯାଇଥାଏ, ଏବଂ ଯଦି ସେଗୁଡ଼ିକ ସମାନ, ଦ୍ secondary ିତୀୟ କ୍ରମ ଦ୍ length ାରା ଦ length ର୍ଘ୍ୟ (ଲମ୍ବାରୁ କ୍ଷୁଦ୍ର)) |ଏହିପରି, ବାରମ୍ବାର ଏବଂ ଦୀର୍ଘତମ ସନ୍ନିବେଶ ପ୍ରଥମ “ଗୋଷ୍ଠୀ” କୁ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରେ |ଗ୍ରୁପ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି କି ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ସେଟ୍ ହୋଇଛି |ତାପରେ, ସଜାଯାଇଥିବା ତାଲିକାରେ ଅବଶିଷ୍ଟ ପ୍ରତ୍ୟେକ ସନ୍ନିବେଶକୁ ଯୁଗଳ ଭାବରେ ନିଡଲମ୍ୟାନ୍-ୱନ୍ସ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟ ଦ୍ୱାରା ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଯୋଡିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରାଯାଇଥିଲା |ଯଦି ଏକ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟରେ ଅସଙ୍ଗତି, ସନ୍ନିବେଶ, କିମ୍ବା ବିଲୋପ ସଂଖ୍ୟା 2 ର ସୀମା ଅତିକ୍ରମ କରେ ନାହିଁ, ତେବେ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଏକ ସନ୍ନିବେଶ ଯୋଡାଯାଏ, ଏବଂ ସାମଗ୍ରିକ ଗୋଷ୍ଠୀ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି କେତେଥର ସନ୍ନିବେଶ ଯୋଡାଯାଏ ତାହା ବୃଦ୍ଧି ହୁଏ |ଏକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ଇନ୍ସର୍ଟଗୁଡିକ ବ୍ୟବହୃତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନିତ ହୋଇଛି ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣରୁ ବାଦ ଦିଆଯାଇଛି |ଯଦି ପୂର୍ବରୁ ବିଦ୍ୟମାନ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, ତେବେ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ଉପଯୁକ୍ତ ସନ୍ନିବେଶ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ଏକ ନୂତନ ଗୋଷ୍ଠୀ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ ଏବଂ ବ୍ୟବହୃତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନିତ ହୁଏ |ପୁନରାବୃତ୍ତି ସମାପ୍ତ ହୁଏ ଯେତେବେଳେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ଏକ ନୂତନ ଗୋଷ୍ଠୀ ଗଠନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ କିମ୍ବା ପୂର୍ବରୁ ବିଦ୍ୟମାନ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରାଯାଇପାରେ |ସର୍ବଶେଷରେ, ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ ନେଇ ଗଠିତ ଇନ୍ସର୍ଟଗୁଡିକ ଶେଷରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମରେ (ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ) ଅନୁବାଦ କରାଯାଇଥାଏ |ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣର ଫଳାଫଳ ହେଉଛି ସନ୍ନିବେଶର ଏକ ସେଟ୍ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଅନୁରୂପ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯାହା କ୍ରମାଗତ ପଠନ ସଂଖ୍ୟା ଗଠନ କରେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2) |
ମୋଟିଫ୍ ଜେନେରେସନ୍: ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଏକ ତାଲିକା ଉପରେ ଆଧାର କରି, ନିମ୍ନରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ s ାଞ୍ଚା (ଆ) ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ତିଆରି କରାଯାଇଥିଲା |ଦ length ର୍ଘ୍ୟ 3 ର ପ୍ରତ୍ୟେକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ pattern ାଞ୍ଚା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏହାର ବିପରୀତ pattern ାଞ୍ଚା ସମସ୍ତ s ାଞ୍ଚା (ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍) ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ସାଧାରଣ ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସହିତ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା |ଅତ୍ୟଧିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ମୋଟିଫ୍ ର ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ କ୍ରମାନୁସାରେ ଏବଂ ଅନାବଶ୍ୟକତା ହଟାଗଲା |ତାପରେ, ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଥିବା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପାଇଁ, ଆମେ ଗଣନାକାରୀ ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଏହାର ଉପସ୍ଥିତି ଯାଞ୍ଚ କରିଥିଲୁ |ଏହି ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ, ମିଳିଥିବା ମୋଟିଫ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯୋଡି ହୋଇ ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ମୋଟିଫ୍କୁ ନ୍ୟସ୍ତ କରାଯାଇଥାଏ (“ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା”) |ମୋଟିଫ୍ ଜେନେରେସନ୍ ର ଫଳାଫଳ ହେଉଛି ଏକ ଦୁଇ-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ ଆରେ ଯାହା ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ (ମୋଟିଫ୍) ର ସମସ୍ତ ଘଟଣା ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ନିଜସ୍ୱ ମୂଲ୍ୟ ଧାରଣ କରିଥାଏ, ଯାହାକି କ୍ରମର ପ read ଼ା ସଂଖ୍ୟା ଅଟେ ଯାହା ପ read ଼ିବା ଫିଲ୍ଟର୍, ଗ୍ରୁପ୍ ଏବଂ ଅନୁବାଦ ହେବାବେଳେ ସଂପୃକ୍ତ ମୋଟିଫ୍ ସୃଷ୍ଟି କରେ |ଉପରେ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି ମେଟ୍ରିକ୍ସ |
ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଅନୁରୂପ ବିଛାଇବା ପ୍ଲଟଗୁଡିକର ସ୍ ization ାଭାବିକକରଣ: ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ବ୍ୟବହାର କରି ସ୍ୱାଭାବିକ ହୋଇଥିଲା |
ଯେଉଁଠାରେ ni ହେଉଛି ବିଷୟ ଧାରଣ କରିଥିବା ପଠନ ସଂଖ୍ୟା |ଏହିପରି, vi ନମୁନାରେ ମୋଟିଫ୍ i ଧାରଣ କରିଥିବା ପଠନ (କିମ୍ବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍) ର ଶତକଡ଼ା ଆବୃତ୍ତି ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |ଫିସରର ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଅଣ-ସ୍ ized ାଭାବିକ ସଂଖ୍ୟକ ମୋଟିଫ୍ ପାଇଁ P- ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ସଂଖ୍ୟାର କରେଲୋଗ୍ରାମ୍ ବିଷୟରେ, ସ୍ପାୟରମ୍ୟାନ୍ଙ୍କ ସମ୍ପର୍କଗୁଡିକ ଆର ସହିତ ସାଧାରଣ ସଂଖ୍ୟାକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |
ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅବସ୍ଥାରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ର ବିଷୟବସ୍ତୁକୁ ଭିଜୁଆଲ୍ କରିବାକୁ ୱେବ୍ ଲୋଗୋଗ୍ରାମ୍ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରଥମେ, 12-ମେର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅବସ୍ଥାରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ର ବିଷୟବସ୍ତୁ 20 × 12 ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସରେ ଗଚ୍ଛିତ |ତାପରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥିତିରେ ସମାନ ଆପେକ୍ଷିକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଧାରଣ କରିଥିବା 1000 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଏକ ସେଟ୍ ଫାସ୍ତା-କ୍ରମ ଫର୍ମାଟରେ ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ ଏବଂ ୱେବ୍ ଲୋଗୋ 3 କୁ ଇନପୁଟ୍ ଭାବରେ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥାଏ, ଯାହା ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥିତିରେ ଆପେକ୍ଷିକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁର ଏକ ଆଲେଖୀକ ଉପସ୍ଥାପନା ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ |ପ୍ରଦତ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପାଇଁ |ବହୁମୁଖୀ ଡାଟାସେଟକୁ ଭିଜୁଆଲାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ, R ରେ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବିକଶିତ ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ରଗୁଡିକ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା (biosHeatmap, ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପ୍ରକାଶିତ R ପ୍ୟାକେଜ୍) |ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ରରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୋଇଥିବା ଡେଣ୍ଡ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ଗୁଡିକ ୱାର୍ଡର ହାଇରାର୍କିକାଲ୍ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ପଦ୍ଧତିକୁ ଇଉକ୍ଲିଡିଆନ୍ ଦୂରତା ମେଟ୍ରିକ୍ ସହିତ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ମୋଟିଫ୍ ସ୍କୋରିଂ ତଥ୍ୟର ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଅସ୍ ormal ାଭାବିକ ସ୍କୋରିଂ ପାଇଁ P ମୂଲ୍ୟ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଅନ୍ୟ ଡାଟାସେଟଗୁଡିକ ପାଇଁ P- ମୂଲ୍ୟ R ରେ ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ କିମ୍ବା ANOVA ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |
ସିଲେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଏବଂ ଫେଜ୍ ଗୁଡିକ ଲାଞ୍ଜ ଶିରା (300 μl PBS ରେ 2 × 1010 ଫେଜ୍ / ପ୍ରାଣୀ) ମାଧ୍ୟମରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା |ସୁଗନ୍ଧ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଫିକ୍ସିଂର ଦଶ ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ, ସମାନ ପ୍ରାଣୀଗୁଡିକ 100 μl DyLight594- ଲେବଲ୍ ଲେକ୍ଟିନ୍ (ଭେକ୍ଟର ଲାବୋରେଟୋରୀ ଇନକ୍।, DL-1177) ସହିତ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା |ଫେଜ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନର 60 ମିନିଟ୍ ପରେ, ମୂଷାମାନେ ହୃଦୟ ମାଧ୍ୟମରେ 50 ମିଲି ପିବିଏସ୍ ସହିତ ସୁଗନ୍ଧିତ ହୋଇଥିଲେ ଏବଂ ତା’ପରେ 50 ମିଲି 4% PFA / PBS |ମସ୍ତିଷ୍କ ନମୁନାଗୁଡିକ ଅତିରିକ୍ତ ଭାବରେ 4% PFA / PBS ରେ ରାତାରାତି ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 30% ସୁକ୍ରୋଜରେ ରାତାରାତି 4 ° C ରେ ଭିଜାଯାଇଥିଲା |OCT ମିଶ୍ରଣରେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକ ଫ୍ଲାସ୍ ଫ୍ରିଜ୍ |ଫ୍ରିଜ୍ ନମୁନାଗୁଡିକର ଇମ୍ୟୁନୋହୋଷ୍ଟୋକେମିକାଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ 1% BSA ସହିତ ଅବରୋଧିତ 30 µm କ୍ରାଇସେକସନ୍ ଉପରେ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4 ° C ରେ T7 ଫେଜ୍ (ନୋଭସ୍ NB 600-376A) ବିରୁଦ୍ଧରେ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ FITC- ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ରାତାରାତି ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ |ଶେଷରେ, ବିଭାଗଗୁଡିକ PBS ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ଏକ କନଫୋକାଲ୍ ଲେଜର ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (Leica TCS SP5) ସହିତ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା |
ସର୍ବନିମ୍ନ ଶୁଦ୍ଧତା ସହିତ 98% ଥିବା ସମସ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଜେନସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ୟୁଏସ୍, ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ଏବଂ ଲାଇଫିଲାଇଜଡ୍ ଦ୍ୱାରା ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଥିଲା |ବାୟୋଟିନ୍ N- ଟର୍ମିନାସରେ ଅତିରିକ୍ତ ଟ୍ରିପଲ୍ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସ୍ପେସର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ବନ୍ଧା |ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ |
ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ (ସିଗମା S0677) ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍, ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ BACE1 ନିରୋଧକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କିମ୍ବା 5-10% DMSO / ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ମିଶ୍ରଣ (3: 1 ଅନୁପାତ) ସହିତ ମିଶ୍ରିତ |ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା |ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ଏକ ମସ୍ତିଷ୍କ ଗୁହାଳ ସହିତ ମୂଷାଙ୍କ ଲାଞ୍ଜ ଶିରାରେ 10 ମିଗ୍ରା / କେଜି ଡୋଜରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା |
ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ-ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ଏକାଗ୍ରତା ELISA ଦ୍ୱାରା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା |ନଙ୍କ ମ୍ୟାକ୍ସିସର୍ପ ମାଇକ୍ରୋଟାଇଟର ପ୍ଲେଟଗୁଡିକ (ସିଗମା) ରାତିସାରା 4 ° C ରେ 1.5 μg / ml ମାଉସ୍ ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଥର୍ମୋ, MA1-20011) ସହିତ ଆବୃତ କରାଯାଇଥିଲା |2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ (ବଫର୍ ବ୍ଲକିଂ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ଜେଲାଟିନ୍, 1% BSA) ଅବରୋଧ କରିବା ପରେ, ପ୍ଲେଟ୍କୁ 0.05% Tween-20 / PBS (ୱାଶ୍ ବଫର୍) ସହିତ 3 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ, ସିଏସ୍ଏଫ୍ ଏବଂ ପ୍ଲାଜମା ନମୁନାଗୁଡିକ ବଫର୍ ବ୍ଲକ୍ ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କୂଅରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା (ପ୍ଲାଜା 1: 10,000, CSF 1: 115) |ପରେ ପ୍ଲେଟଟି ଚିହ୍ନଟ ଆଣ୍ଟିବଡି (1 μg / ml, ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ- HRP, ନୋଭସ୍ NB120-7239) ସହିତ 4 ° C ରେ ରାତାରାତି ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ତିନୋଟି ଧୋଇବା ପରେ, ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ଟିଏମବି ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ (ରୋଚ୍) ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |1M H2SO4 ସହିତ ରଙ୍ଗ ବିକାଶ ବନ୍ଦ କରିବା ପରେ, 450 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପନ୍ତୁ |
ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ-ପେପ୍ଟାଇଡ୍- BACE1 ଇନହିବିଟର କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର କାର୍ଯ୍ୟକୁ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ (ୱାକୋ, 294-64701) ଅନୁଯାୟୀ Aβ (1-40) ELISA ଦ୍ୱାରା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, CSF ନମୁନାଗୁଡିକ ମାନକ diluent (1:23) ରେ ମିଶ୍ରିତ ହେଲା ଏବଂ BNT77 କ୍ୟାପଚର ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଆବୃତ 96-କୂଅ ପ୍ଲେଟରେ ରାତାରାତି 4 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ହେଲା |ପାଞ୍ଚଟି ଧୋଇବା ପଦାଙ୍କ ପରେ, HRP- କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ BA27 ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4 ° C ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରେ ପାଞ୍ଚଟି ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ |କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ TMB ସମାଧାନରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେସନ ଦ୍ୱାରା Aβ (1-40) ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |ଷ୍ଟପ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ ରଙ୍ଗ ବିକାଶ ବନ୍ଦ ହେବା ପରେ, ଶୋଷଣକୁ 450 nm ରେ ମାପନ୍ତୁ |ପ୍ଲାଜ୍ମା ନମୁନାଗୁଡିକ Aβ (1-40) ELISA ପୂର୍ବରୁ କଠିନ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ନିର୍ବାହର ଶିକାର ହୋଇଥିଲେ |96-କୂଅ ପ୍ଲେଟରେ ପ୍ଲାଜମା 0.2% DEA (ସିଗମା) ରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ SPE ପ୍ଲେଟଗୁଡିକ (ଓସିସ୍, 186000679) ପାଣି ଏବଂ 100% ମିଥାନୋଲ୍ ସହିତ ଧୋଇବା ପରେ, ପ୍ଲାଜ୍ମା ନମୁନାଗୁଡିକ SPE ପ୍ଲେଟରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସମସ୍ତ ତରଳ ପଦାର୍ଥ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ନମୁନାଗୁଡିକ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା (ପ୍ରଥମେ 5% ମିଥାନୋଲ୍ ସହିତ 30% ମିଥାନୋଲ୍ ସହିତ) ଏବଂ 2% NH4OH / 90% ମିଥାନୋଲ୍ ସହିତ ବ uted ଼ାଗଲା |କ୍ରମାଗତ N2 କରେଣ୍ଟରେ 99 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 55 ° C ରେ ଏଲୁଏଟ୍ ଶୁଖାଇବା ପରେ, ନମୁନାଗୁଡିକ ମାନକ diluents ରେ ହ୍ରାସ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପରୋକ୍ତ ବର୍ଣ୍ଣନା ଅନୁଯାୟୀ Aβ (1-40) ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |
ଏହି ଆର୍ଟିକିଲକୁ କିପରି ଉଲ୍ଲେଖ କରିବେ: ଉରିଚ୍, ଇ।ଭିଭୋରେ ଚିହ୍ନିତ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କକୁ କାର୍ଗୋ ବିତରଣ |ବିଜ୍ଞାନ5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015) |
ଲିଖୋଟା ଜେ।, ସ୍କଜୋରିଙ୍ଗ ଟି।, ଥୋମସେନ୍ ଏଲ.ବି ଏବଂ ମୋସ୍ ଟି।ଜର୍ନାଲ୍ ଅଫ୍ ନ୍ୟୁରୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି 113, 1–13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010) |
ବ୍ରାସ୍ନେଭିଭିକ୍, I.ପ୍ରୋଗ୍ ନ୍ୟୁରୋବିଓଲ୍ 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009) |
ପାର୍ଡ୍ରିଜ୍, ଡବ୍ଲୁଏମ୍ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ: ମସ୍ତିଷ୍କ drug ଷଧ ବିକାଶରେ ଏକ ବାଧା।NeuroRx 2, 3–14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005) |
ଜୋହାନ୍ସନ୍, କେ, ଡଙ୍କନ୍, ଜେଏ, ଷ୍ଟୋପା, ଇଜି, ଏବଂ ବାଇର୍ଡ, ଏ।ଫାର୍ମାସ୍ୟୁଟିକାଲ୍ ରିସର୍ଚ୍ଚ 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005) |
ପାର୍ଡ୍ରିଜ୍, ମସ୍ତିଷ୍କ ବିତରଣ ପାଇଁ ମଲିକୁଲାର ଟ୍ରୋଜାନ୍ ଘୋଡା ସହିତ ଜ oph ବ ଫାର୍ମାସ୍ୟୁଟିକାଲ୍ସର ଆଧୁନିକୀକରଣ |ବାୟୋକନଜୁଗ୍ କେମ 19, 1327–1338, 10.1021 / bc800148t (2008) |
ପାର୍ଡ୍ରିଜ୍, ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଦେଇ WM ରିସେପ୍ଟର-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପରିବହନ |ଏଣ୍ଡୋକ୍ର୍ ରିଭର୍ 7, 314-330 (1986) |
Niewoehner, J. et al।ମୋନୋଭାଲାଣ୍ଟ ମଲିକୁଲାର ସଟଲ ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କର ଅନୁପ୍ରବେଶ ଏବଂ ଥେରାପିଟିଭ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକର କାର୍ଯ୍ୟକାରିତା ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ |ନ୍ୟୁରନ୍ 81, 49–60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014) |
ବିଏନ୍-ଲି, ଏନ।ଟ୍ରାନ୍ସଫରରିନ୍ ରିସେପ୍ଟର (TfR) ପରିବହନ TfR ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକର ଆଫିନିଟି ଭେରିଏଣ୍ଟଗୁଡିକର ମସ୍ତିଷ୍କ ଅପ୍ଟେକ୍ଟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ |J Exp Med 211, 233–244, 10.1084 / jem.20131660 (2014) |