Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ଆପଣଙ୍କୁ ଧନ୍ୟବାଦ। ଆପଣ ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ସହିତ ଏକ ବ୍ରାଉଜର ସଂସ୍କରଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି। ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ଆପଣଙ୍କୁ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଛୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ)। ଏହା ସହିତ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଷ୍ଟାଇଲ୍ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଦେଖାଉଛୁ।
ଏକାଥରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡର ଏକ କାରୋସେଲ ପ୍ରଦର୍ଶିତ କରେ। ଗୋଟିଏ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ପୂର୍ବ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବଟନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, କିମ୍ବା ଗୋଟିଏ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ଶେଷରେ ଥିବା ସ୍ଲାଇଡର ବଟନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ବାୟୋଥେରାପିଉଟିକ୍ ଏଜେଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀରେ ସେମାନଙ୍କର ଲକ୍ଷ୍ୟସ୍ଥଳରେ ପହଞ୍ଚିବାରୁ ବାଧା ଦିଏ, ଯାହା ଫଳରେ ସ୍ନାୟୁ ରୋଗର ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଚିକିତ୍ସା ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ। ଭିଭୋରେ ନୂତନ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନକାରୀମାନଙ୍କୁ ଆବିଷ୍କାର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ T7 ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ କ୍ରମିକ ଭାବରେ ସଂଗୃହିତ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) କୁ ମୂଷାମାନଙ୍କର ଏକ କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ ସଚେତନ ବଡ଼ ପୁଲ୍ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରଚଳିତ କରିଥିଲୁ। ଚାରି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ପରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ CSF ରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା। ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାର୍ଥୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ପରୀକ୍ଷା CSF ରେ 1000 ଗୁଣରୁ ଅଧିକ ସମୃଦ୍ଧି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ଚିହ୍ନିତ ନୂତନ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟର ବ୍ୟବହାର କରି ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ରେ ଆମିଲଏଡ୍-β ସ୍ତରକୁ 40% ହ୍ରାସ ଦ୍ୱାରା ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ବିତରଣର ଜୈବିକ ସକ୍ରିୟତା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ଚୟନ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ଗୁଡ଼ିକ ଚିକିତ୍ସା ପ୍ରଭାବ ସହିତ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ମ୍ୟାକ୍ରୋମଲିକ୍ୟୁଲ୍ସର ସିଷ୍ଟମିକ୍ ବିତରଣ ପାଇଁ ଉପଯୋଗୀ ଯାନ ହୋଇପାରେ।
କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀ (CNS) ଲକ୍ଷ୍ୟଭେଦୀ ଚିକିତ୍ସା ଗବେଷଣା ମୁଖ୍ୟତଃ CNS-ଲକ୍ଷ୍ୟକରଣ ଗୁଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବା ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ଡ ଔଷଧ ଏବଂ ଏଜେଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେଇଛି, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ସକ୍ରିୟ ଔଷଧ ବିତରଣ କରୁଥିବା ଯନ୍ତ୍ରପାତିଗୁଡ଼ିକୁ ଆବିଷ୍କାର କରିବାରେ କମ୍ ପ୍ରୟାସ ସହିତ। ଏହା ବର୍ତ୍ତମାନ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହେବା ଆରମ୍ଭ କରିଛି କାରଣ ଔଷଧ ବିତରଣ, ବିଶେଷକରି ବଡ଼ ଅଣୁ, ଆଧୁନିକ ନ୍ୟୁରୋସାଇନ୍ସ ଔଷଧ ବିକାଶର ଏକ ଅବିଚ୍ଛେଦ୍ୟ ଅଂଶ। କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀର ପରିବେଶ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ବାରିଅର୍ ସିଷ୍ଟମ୍ ଦ୍ୱାରା ଭଲ ଭାବରେ ସୁରକ୍ଷିତ, ଯେଉଁଥିରେ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାରିଅର୍ (BBB) ​​ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାରିଅର୍ (BCBB)1 ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଔଷଧ ବିତରଣ କରିବା ପାଇଁ ଏହାକୁ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜିଂ କରିଥାଏ1,2। ଏହା ଆକଳନ କରାଯାଇଛି ଯେ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ ବଡ଼ ଅଣୁ ଔଷଧ ଏବଂ 98% ରୁ ଅଧିକ ଛୋଟ ଅଣୁ ଔଷଧ ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ବାହାର କରିଦିଆଯାଏ3। ସେଥିପାଇଁ ନୂତନ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପ୍ରଣାଳୀଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ବହୁତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଯାହା CNS 4,5 କୁ ଚିକିତ୍ସା ଔଷଧର ଦକ୍ଷ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିତରଣ ପ୍ରଦାନ କରେ। ତଥାପି, BBB ଏବଂ BCSFB ମଧ୍ୟ ଔଷଧ ବିତରଣ ପାଇଁ ଏକ ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ସୁଯୋଗ ପ୍ରଦାନ କରନ୍ତି କାରଣ ସେମାନେ ଏହାର ବ୍ୟାପକ ଭାସ୍କୁଲେଚର ମାଧ୍ୟମରେ ମସ୍ତିଷ୍କର ସମସ୍ତ ଗଠନ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି ଏବଂ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି। ତେଣୁ, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଅଣ-ଆକ୍ରମଣାତ୍ମକ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିବାର ବର୍ତ୍ତମାନର ପ୍ରୟାସ ମୁଖ୍ୟତଃ ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ BBB6 ରିସେପ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ରିସେପ୍ଟର-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ପରିବହନ (PMT) ର ଯନ୍ତ୍ର ଉପରେ ଆଧାରିତ। ଟ୍ରାନ୍ସଫରିନ ରିସେପ୍ଟର ପାଥୱେ7,8 ବ୍ୟବହାର କରି ସାମ୍ପ୍ରତିକ ପ୍ରମୁଖ ଉନ୍ନତି ସତ୍ତ୍ୱେ, ଉନ୍ନତ ଗୁଣ ସହିତ ନୂତନ ବିତରଣ ପ୍ରଣାଳୀର ଆହୁରି ବିକାଶ ଆବଶ୍ୟକ। ଏଥିପାଇଁ, ଆମର ଲକ୍ଷ୍ୟ ଥିଲା CSF ପରିବହନର ମଧ୍ୟସ୍ଥତା କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା, କାରଣ ସେଗୁଡ଼ିକୁ ନୀତିଗତ ଭାବରେ CNS କୁ ମାକ୍ରୋମୋଲିକ୍ୟୁଲ୍ସ ପ୍ରଦାନ କରିବା କିମ୍ବା ନୂତନ ରିସେପ୍ଟର ପାଥୱେ ଖୋଲିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ। ବିଶେଷକରି, ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ସିଷ୍ଟମର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ରିସେପ୍ଟର ଏବଂ ପରିବହନକାରୀ (BBB ଏବଂ BSCFB) ବାୟୋଥେରାପିଟିକ୍ ଔଷଧର ସକ୍ରିୟ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିତରଣ ପାଇଁ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବେ। ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ହେଉଛି କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍ (CS) ର ଏକ ସ୍କ୍ରେଟୋରୀ ଉତ୍ପାଦ ଏବଂ ସବରାକ୍ନଏଡ୍ ସ୍ପେସ୍ ଏବଂ ଭେଣ୍ଟ୍ରିକୁଲାର୍ ସ୍ପେସ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ମସ୍ତିଷ୍କର ଇଣ୍ଟରଷ୍ଟିସିଆଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ସହିତ ସିଧାସଳଖ ସମ୍ପର୍କରେ ରହିଥାଏ। ସମ୍ପ୍ରତି ଏହା ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ସବରାକ୍ନଏଡ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ମସ୍ତିଷ୍କର ଇଣ୍ଟରଷ୍ଟିଟିୟମ୍ ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଭାବରେ ବିସ୍ତାରିତ ହୁଏ। ଆମେ ଏହି ସବରାକନଏଡ୍ ଇନଫ୍ଲୋ ଟ୍ରାକ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା ସିଧାସଳଖ BBB ମାଧ୍ୟମରେ ପାରେଙ୍କାଇମାଲ୍ ସ୍ପେସ୍ ପ୍ରବେଶ କରିବାକୁ ଆଶା କରୁଛୁ। ଏହାକୁ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ଦୃଢ଼ ଇନ୍ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ଚୟନ ରଣନୀତି କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କରିଛୁ ଯାହା ଆଦର୍ଶ ଭାବରେ ଏହି ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ପଥ ମଧ୍ୟରୁ ଯେକୌଣସି ଗୋଟିଏ ଦ୍ୱାରା ପରିବହନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରେ।
ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ ସର୍ବାଧିକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିବିଧତା ସହିତ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ନିରୀକ୍ଷଣ କରିବା ପାଇଁ CSF ସାମ୍ପଲିଂ ସହିତ ଉଚ୍ଚ ଥ୍ରୁପୁଟ୍ ସିକୋଏନ୍ସିଙ୍ଗ (HTS) ସହିତ ଏକ କ୍ରମିକ ଇନ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ଡିସପ୍ଲେ ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତି ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁଛୁ। ରକ୍ତ ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ ସ୍ଥାୟୀ ଭାବରେ ପ୍ରତିରୋପିତ ବଡ଼ ସିଷ୍ଟର୍ନା (CM) କାନୁଲା ସହିତ ସଚେତନ ମୂଷା ଉପରେ ସ୍କ୍ରିନିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ, ଏହି ପଦ୍ଧତି ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର୍ ବାଧା ଦେଇ ପରିବହନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ମସ୍ତିଷ୍କ-ଲକ୍ଷ୍ୟୀକରଣ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଉଭୟକୁ ଚୟନ କରେ। ଆମେ ସେମାନଙ୍କର ଛୋଟ ଆକାର (~60 nm)10 ଯୋଗୁଁ T7 ଫେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ ଏବଂ ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥିଲୁ ଯେ ସେମାନେ ଏଣ୍ଡୋଥେଲିଆଲ୍ ଏବଂ/କିମ୍ବା ଏପିଥେଲିୟଲ୍-ମେଡୁଲା ବାଧାକୁ ଟ୍ରାନ୍ସସେଲୁଲାର୍ କ୍ରସିଂକୁ ଅନୁମତି ଦେଉଥିବା ଭେସିକଲ୍ ପରିବହନ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ। ଚାରି ରାଉଣ୍ଡ ପ୍ୟାନିଂ ପରେ, ଫେଜ୍ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ଭିଭୋରେ ଦୃଢ଼ CSF ସମୃଦ୍ଧି ଏବଂ ସେରେବ୍ରାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋଭେସେଲ୍ ସମ୍ପର୍କ ଦେଖାଇ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ, ଆମେ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରି ଆମର ଫଳାଫଳକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିପାରିଲୁ ଯେ ପସନ୍ଦିତ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଭାବରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ ସର୍ବୋତ୍ତମ ପ୍ରାର୍ଥୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କାର୍ଗୋ ପରିବହନ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ। ପ୍ରଥମେ, BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡର ଏକ ଇନହିବିଟର ସହିତ ଏକ ଲିଡିଙ୍ଗ୍ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମିଶ୍ରଣ କରି CNS ର ଫାର୍ମାକୋଡାଇନାମିକ୍ ପ୍ରଭାବ ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ ହୋଇଥିଲା। ଭିଭୋ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ସ୍କ୍ରିନିଂ ରଣନୀତି ନୂତନ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌କୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ କାର୍ଗୋ ବାହକ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ବୋଲି ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବା ସହିତ, ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ ନୂତନ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନ ପଥ ଚିହ୍ନଟ କରିବାରେ ସମାନ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଚୟନ ପଦ୍ଧତି ମଧ୍ୟ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇଯିବ।
ପ୍ଲାକ୍-ଫର୍ମିଂ ୟୁନିଟ୍ (PFU) ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଫେଜ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପଦକ୍ଷେପ ପରେ, ପ୍ରାୟ 109 ବିବିଧତା ସହିତ ଅନିୟମିତ 12-mer ଲିନିଅର୍ T7 ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ ଏବଂ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା (ଉପକରଣ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି ଦେଖନ୍ତୁ)। ଏହା ମନେ ରଖିବା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଯେ ଆମେ ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ ପୂର୍ବରୁ ଏହି ଲାଇବ୍ରେରୀକୁ ସତର୍କତାର ସହିତ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରାଇମର ବ୍ୟବହାର କରି ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର PCR ପ୍ରଶସ୍ତିକରଣ ଆମ୍ପ୍ଲିକନ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲା ​​ଯାହା HTS ପାଇଁ ସିଧାସଳଖ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1a)। a) HTS11 ସିକୋଇନ୍ସିଂ ତ୍ରୁଟି, b) ପ୍ରାଇମରର ଗୁଣବତ୍ତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ (NNK)1-12, ଏବଂ c) ଷ୍ଟାଣ୍ଡବାଏ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ଫେଜ୍ (କଙ୍କାଳ ଇନସର୍ଟ) ର ଉପସ୍ଥିତି ଯୋଗୁଁ, କେବଳ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିବା କ୍ରମ ସୂଚନା ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଏକ କ୍ରମ ଫିଲ୍ଟରିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କରାଯାଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1b)। ଏହି ଫିଲ୍ଟର ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକ ସମସ୍ତ HTS ସିକୋଇନ୍ସିଂ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ। ମାନକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପାଇଁ, ମୋଟ 233,868 ପାଠ୍ୟ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ 39% ଫିଲ୍ଟର ମାନଦଣ୍ଡ ପାସ୍ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପାଇଁ ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଚୟନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1c–e)। ପାଠଗୁଡ଼ିକ ମୁଖ୍ୟତଃ 3ଟି ମୂଳ ଯୋଡ଼ା ଲମ୍ବରେ ଗୁଣିତ ଥିଲା ଯାହାର ଶୀର୍ଷ 36 ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1c) ଥିଲା, ଯାହା ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ (NNK) 1-12 କୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, ପ୍ରାୟ 11% ଲାଇବ୍ରେରୀ ସଦସ୍ୟଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଏକ 12-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ବ୍ୟାକବୋନ୍ PAGISRELVDKL ଇନସର୍ଟ ଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରାୟ ଅଧା କ୍ରମ (49%) ଇନସର୍ଟ କିମ୍ବା ବିଲୋପ ଥିଲା। ଲାଇବ୍ରେରୀ ଲାଇବ୍ରେରୀର HTS ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଉଚ୍ଚ ବିବିଧତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା: 81% ରୁ ଅଧିକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ କେବଳ ଥରେ ମିଳିଥିଲା ​​ଏବଂ କେବଳ 1.5% ≥4 କପିରେ ଘଟିଥିଲା ​​(ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2a)। କ୍ଷୟକାରୀ NKK ରେପ୍ଟୋର ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା କୋଡନ୍ ସଂଖ୍ୟା ପାଇଁ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ସମସ୍ତ 12 ସ୍ଥିତିରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ (aa) ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଭଲ ଭାବରେ ସହଭାଗୀ ଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2b)। ଏହି ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକ ଦ୍ୱାରା ଏନକୋଡ୍ କରାଯାଇଥିବା aa ଅବଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (r = 0.893) (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2c) ସହିତ ଭଲ ଭାବରେ ସହଭାଗୀ ଥିଲା। ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରସ୍ତୁତିରେ ଏଣ୍ଡୋଟକ୍ସିନ୍ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ଅପସାରଣର ପଦକ୍ଷେପ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଏହା ପୂର୍ବରୁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ବିବିଧତାକୁ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ଦେଖାଯାଇଛି12,13। ତେଣୁ, ଆମେ ଏକ ପ୍ଲେଟ୍-ଆମ୍ପ୍ଲିଫାଏଡ୍ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀକୁ କ୍ରମବଦ୍ଧ କରିଥିଲୁ ଯାହା ଏଣ୍ଡୋଟକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ AA ର ​​ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ ଏହାକୁ ମୂଳ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସହିତ ତୁଳନା କରିଥିଲୁ। ମୂଳ ପୁଲ୍ ଏବଂ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ ଏବଂ ପ୍ୟୁରିଫାଇଡ୍ ପୁଲ୍ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2d) ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଦୃଢ଼ ସମ୍ପର୍କ (r = 0.995) ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ T7 ଫେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ ପରିବର୍ଦ୍ଧିତ କ୍ଲୋନ୍ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତିଯୋଗିତା ପ୍ରମୁଖ ପକ୍ଷପାତ ସୃଷ୍ଟି କରିନଥିଲା। ଏହି ତୁଳନା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍‌ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଉପରେ ଆଧାରିତ, କାରଣ ଲାଇବ୍ରେରୀର ବିବିଧତା (~109) HTS ସହିତ ମଧ୍ୟ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ କଏଦ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥିତିରେ aa ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିବା ରେପର୍ଟୋୟାରର ଶେଷ ତିନୋଟି ସ୍ଥିତିରେ ଏକ ଛୋଟ ସ୍ଥିତି-ନିର୍ଭରଶୀଳ ପକ୍ଷପାତ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​(ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2e)। ଶେଷରେ, ଆମେ ଏହି ସିଦ୍ଧାନ୍ତରେ ପହଞ୍ଚିଲୁ ଯେ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଗୁଣବତ୍ତା ଏବଂ ବିବିଧତା ଗ୍ରହଣୀୟ ଥିଲା ଏବଂ ଚୟନର ଅନେକ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ମଧ୍ୟରେ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରବର୍ଦ୍ଧନ ଏବଂ ପ୍ରସ୍ତୁତି ଯୋଗୁଁ ବିବିଧତାରେ କେବଳ ସାମାନ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା।
BBB ଏବଂ/କିମ୍ବା BCSFB (ଚିତ୍ର 1a-b) ମାଧ୍ୟମରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା T7 ଫେଜ୍ (iv) ଚିହ୍ନଟକୁ ସହଜ କରିବା ପାଇଁ ସଚେତନ ମୂଷାର CM ରେ ଏକ କାନୁଲା ପ୍ରତିରୋପଣ କରି କ୍ରମିକ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇପାରିବ। ଆମେ ଇନ ଭିଭୋ ଚୟନର ପ୍ରଥମ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡରେ (ଚିତ୍ର 1c) ଦୁଇଟି ସ୍ୱାଧୀନ ଚୟନ ବାହୁ (ବାହୁ A ଏବଂ B) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ଚୟନର ପ୍ରଥମ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡରେ ପ୍ରଚଳିତ ଫେଜ୍ ର ମୋଟ ପରିମାଣକୁ ହ୍ରାସ କରି ଆମେ ଧୀରେ ଧୀରେ ଚୟନର କଠିନତା ବୃଦ୍ଧି କରିଥିଲୁ। ପ୍ୟାନିଂର ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡ ପାଇଁ, ଆମେ ଶାଖା A ଏବଂ B ରୁ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ମିଶ୍ରଣ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ତିନୋଟି ଅତିରିକ୍ତ ସ୍ୱାଧୀନ ଚୟନ କରିଥିଲୁ। ଏହି ମଡେଲରେ T7 ଫେଜ୍ କଣିକାଗୁଡ଼ିକର ଇନ ଭିଭୋ ଗୁଣଧର୍ମ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ, ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ ଫେଜ୍ (PAGISRELVDKL ମାଷ୍ଟର ଇନସର୍ଟ) କୁ ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମାଧ୍ୟମରେ ମୂଷାରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ଫେଜ୍ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ ଅପେକ୍ଷାକୃତ ଛୋଟ T7 ଆଇକୋସାହେଡ୍ରାଲ୍ ଫେଜ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ରକ୍ତ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରୁ ଏକ ଦ୍ରୁତ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 3)। ମୂଷାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦତ୍ତ ଟାଇଟର ଏବଂ ରକ୍ତ ପରିମାଣ ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଆମେ ଗଣନା କରିଥିଲୁ ଯେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନର 10 ମିନିଟ୍ ପରେ ରକ୍ତରେ ପ୍ରଦତ୍ତ ଡୋଜ୍ ରୁ ପ୍ରାୟ 1% wt. ଫେଜ୍ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା। ଏହି ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଦ୍ରୁତ ହ୍ରାସ ପରେ, 27.7 ମିନିଟ୍ ର ଅଧା-ଜୀବନ ସହିତ ଏକ ଧୀର ପ୍ରାଥମିକ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ, CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରୁ କେବଳ ବହୁତ କମ୍ ଫେଜ୍ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ପାଇଁ ଏକ ନିମ୍ନ ପୃଷ୍ଠଭୂମିକୁ ସୂଚିତ କରିଥାଏ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 3)। ହାରାହାରି, ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ନମୁନାକରଣ ଅବଧି (0-250 ମିନିଟ୍) ରେ ରକ୍ତରେ T7 ଫେଜ୍ ର ପ୍ରାୟ 1 x 10-3% ଟାଇଟର ଏବଂ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଭାବରେ ସଂଶୋଧିତ ଫେଜ୍ ର 4 x 10-8% ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ, ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ର ଅଧା-ଜୀବନ (25.7 ମିନିଟ୍) ରକ୍ତରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ସମାନ ଥିଲା। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ CM-କାନୁଲେଟେଡ୍ ମୂଷାଙ୍କଠାରେ ରକ୍ତରୁ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟକୁ ପୃଥକ କରୁଥିବା ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ରହିଛି, ଯାହା ରକ୍ତରୁ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟକୁ ସହଜରେ ପରିବହନ ହେଉଥିବା କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ଭିଭୋ ଚୟନକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ।
(କ) ଏକ ବଡ଼ ପୁଲରୁ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (CSF) ପୁନଃ-ନମୁନା ନେବା ପାଇଁ ଏକ ପଦ୍ଧତି ସ୍ଥାପନ କରିବା। (ଖ) କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ସ୍ନାୟୁ ପ୍ରଣାଳୀ (CNS) ବାଧା ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା (BBB) ​​ଏବଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ଅତିକ୍ରମ କରୁଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଚୟନ ରଣନୀତି ଦର୍ଶାଉଥିବା ଚିତ୍ର। (ଗ) ଇନ ଭିଭୋ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ସ୍କ୍ରିନିଂ ଫ୍ଲୋଚାର୍ଟ। ଚୟନର ପ୍ରତ୍ୟେକ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ଫେଜ୍ (ତୀର ଭିତରେ ପ୍ରାଣୀ ଚିହ୍ନଟକାରୀ) ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା। ଚୟନର ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଦୁଇଟି ସ୍ୱାଧୀନ ବିକଳ୍ପ ଶାଖା (A, B) ପୃଥକ ଭାବରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ 3 ଏବଂ 4 ପାଇଁ, CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ମାନୁଆଲୀ କ୍ରମବଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା। (ଘ) T7 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ (2 x 1012 ଫେଜ୍/ପଶୁ) ର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ ଦୁଇଟି କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ ମୂଷାରେ ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ରକ୍ତ (ଲାଲ ବୃତ୍ତ) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (ସବୁଜ ତ୍ରିଭୁଜ) ରୁ ପୃଥକ ଫେଜ୍ ର ଗତିବିଧି। ନୀଳ ବର୍ଗ ରକ୍ତରେ ଫେଜର ହାରାହାରି ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଘନତାକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଯାହା ମୋଟ ରକ୍ତ ପରିମାଣକୁ ହିସାବକୁ ନେଇ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଫେଜର ପରିମାଣରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥାଏ। କଳା ବର୍ଗ ରକ୍ତ ଫେଜର ସାନ୍ଦ୍ରତାରୁ ଏକ୍ସଟ୍ରାପୋଲେଟେଡ୍ y ରେଖାର ଛେଦନ ବିନ୍ଦୁକୁ ସୂଚାଇଥାଏ। (e,f) ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରେ ମିଳୁଥିବା ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଓଭରଲାପିଂ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ବଣ୍ଟନ ଉପସ୍ଥାପନ କରନ୍ତୁ। 1000 ରିଡିଂରେ ମିଳୁଥିବା ମୋଟିଫ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସଂଖ୍ୟା ଦର୍ଶାଯାଇଛି। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ (p < 0.001) ସମୃଦ୍ଧ ମୋଟିଫ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଲାଲ ବିନ୍ଦୁ ସହିତ ଚିହ୍ନିତ କରାଯାଇଛି। (e) ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କଠାରୁ ରକ୍ତ ପ୍ରାପ୍ତ ଫେଜ୍ #1.1 ଏବଂ #1.2 ସହିତ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଲାଇବ୍ରେରୀର ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍‌ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି ସହସଂଯୋଗ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍। (f) ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ପୃଥକ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାଣୀ ଫେଜର ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍‌ #1.1 ଏବଂ #1.2 ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି ସହସଂଯୋଗ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍। (g, h) ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଇନ ଭିଭୋ ଚୟନର ଏକ ରାଉଣ୍ଡ ପରେ ରକ୍ତରେ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ (g) ବନାମ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟେଟେଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ CSF (h) ବନାମ ରକ୍ତରେ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ (sequence ID) ର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ। ଏକ-ଅକ୍ଷର କୋଡର ଆକାର ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସେହି ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ସେହି ସ୍ଥାନରେ କେତେଥର ଘଟେ। ସବୁଜ = ଧ୍ରୁବୀୟ, ବାଇଗଣୀ = ନିରପେକ୍ଷ, ନୀଳ = ମୌଳିକ, ଲାଲ = ଏସିଡିକ୍ ଏବଂ କଳା = ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍। ଚିତ୍ର 1a, b ଏଡୁଆର୍ଡ ଉରିଚ୍ ଦ୍ୱାରା ଡିଜାଇନ୍ ଏବଂ ଉତ୍ପାଦନ କରାଯାଇଥିଲା।
ଆମେ ଦୁଇଟି CM ଉପକରଣ ମୂଷା (କ୍ଲେଡ୍ A ଏବଂ B) ରେ ଏକ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ଫେଜ୍ ପୃଥକ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1d)। ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଦ୍ରୁତ କ୍ଲିୟରାନ୍ସ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ତୁଳନାରେ କମ୍ ସ୍ପଷ୍ଟ ଥିଲା। ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ରକ୍ତରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଲାଇବ୍ରେରୀର ହାରାହାରି ଅଧା-ଜୀବନ ଥିଲା 24.8 ମିନିଟ୍, ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍ ପରି, ଏବଂ CSF ରେ 38.5 ମିନିଟ୍। ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଫେଜ୍ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ HTS ର ଶିକାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସମସ୍ତ ଚିହ୍ନଟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏକ ଛୋଟ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ର ଉପସ୍ଥିତି ପାଇଁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ବାଛିଥିଲେ କାରଣ ସେମାନେ ଗଠନ ଗଠନ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ପାଇଁ ଏକ ସର୍ବନିମ୍ନ ଆଧାର ପ୍ରଦାନ କରନ୍ତି14,15। ଆମେ ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ରକ୍ତରୁ ନିଷ୍କାସିତ ଫେଜ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ କ୍ଲୋନ୍ ମଧ୍ୟରେ ମୋଟିଫ୍ ବଣ୍ଟନରେ ଏକ ଭଲ ସମ୍ପର୍କ ପାଇଲୁ (ଚିତ୍ର 1e)। ତଥ୍ୟ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଗଠନ ରକ୍ତ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ କେବଳ ସାମାନ୍ୟ ଭାବରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଛି। Weblogo16 ସଫ୍ଟୱେର୍‌ର ଅନୁକୂଳନ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥାନରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ସହମତି କ୍ରମଗୁଡ଼ିକୁ ଆହୁରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟଜନକ ଭାବରେ, ଆମେ ରକ୍ତ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରେ ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ସମୃଦ୍ଧି ପାଇଲୁ (ଚିତ୍ର 1g)। ଯେତେବେଳେ CSF ରୁ ମନୋନୀତ କ୍ଲୋନ୍ ସହିତ ରକ୍ତକୁ ତୁଳନା କରାଯାଇଥିଲା, ସେତେବେଳେ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଚୟନ ଏବଂ ମୋଟିମ୍‌ଗୁଡ଼ିକର କିଛି ଅବିଚ୍ଛେଦ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1f), ଏବଂ 12-ସଦସ୍ୟ (ଚିତ୍ର 1h) ରେ ପୂର୍ବନିର୍ଦ୍ଧାରିତ ସ୍ଥିତିରେ କିଛି ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପସନ୍ଦନୀୟ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥିଲେ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନେ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ ଯଥେଷ୍ଟ ଭିନ୍ନ ଥିଲେ, ଯେତେବେଳେ ଉଭୟ ପ୍ରାଣୀଙ୍କଠାରେ ରକ୍ତ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସମୃଦ୍ଧି ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 4a-j)। ପ୍ରାଣୀ #1.1 ଏବଂ #1.2 ର ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥରେ କ୍ରମ ତଥ୍ୟର କଠୋର ଫିଲ୍ଟରିଂ ପରେ, ମୋଟ 964 ଏବଂ 420 ଅନନ୍ୟ 12-ମେର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1d-e)। ପୃଥକ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଭିଭୋ ଚୟନର ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀରେ HTS ର ଶିକାର ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ସମସ୍ତ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ (ଚିତ୍ର 2a, b, ef) ର ଘଟଣା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ମୋଟିଫ୍ ଚିହ୍ନଟକରଣ ପ୍ରୋଗ୍ରାମରେ ଇନପୁଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। CSF ରୁ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍ ର ପ୍ରଥମ ଚକ୍ର ତୁଳନାରେ, ଆମେ ଶାଖା A ଏବଂ B ରେ CSF ରେ ଅନେକ ମୋଟିଫ୍ ର ଆହୁରି ଚୟନ ଏବଂ ଅଚୟନ ଦେଖିଲୁ (ଚିତ୍ର 2)। ସେମାନେ ସ୍ଥିର କ୍ରମର ବିଭିନ୍ନ ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି କି ନାହିଁ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ନେଟୱାର୍କ ଚିହ୍ନଟକରଣ ଆଲଗୋରିଦମ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା। ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ A (ଚିତ୍ର 2c, d) ଏବଂ କ୍ଲେଡ୍ B (ଚିତ୍ର 2g, h) ରେ CSF ଦ୍ୱାରା ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିବା 12-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ କ୍ରମ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ସମାନତା ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଶାଖାରେ ପୁଲ୍ ହୋଇଥିବା ବିଶ୍ଳେଷଣ 12-ମେର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ ପାଇଁ ଭିନ୍ନ ଚୟନ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 5c, d) ଏବଂ ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ତୁଳନାରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ପରେ ପୁଲ୍ ହୋଇଥିବା କ୍ଲୋନ୍ ପାଇଁ ସମୟ ସହିତ CSF/ରକ୍ତ ଟାଇଟର ଅନୁପାତରେ ବୃଦ୍ଧି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​(ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 5e)।
ଇନ ଭିଭୋ ଫଙ୍କସନ୍ଲ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ଚୟନର ଦୁଇଟି କ୍ରମାଗତ ରାଉଣ୍ଡ ଦ୍ୱାରା ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍‌ରେ ମୋଟିଫ୍ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସମୃଦ୍ଧି।
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟରୁ ଉଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା ସମସ୍ତ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଫେଜ୍ (ପ୍ରାଣ୍ୟ #1.1 ଏବଂ #1.2) ପୁଲ୍, ପ୍ରଶସ୍ତ, HT-କ୍ରମିତ ଏବଂ ଏକାଠି ପୁନଃଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା (2 x 1010 ଫେଜ୍/ପ୍ରାଣ୍ୟ) 2 SM କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ ମୂଷା (#1.1 → #)। 2.1 ଏବଂ 2.2, 1.2 → 2.3 ଏବଂ 2.4)। (a,b,e,f) ପ୍ରଥମ ଏବଂ ଦ୍ୱିତୀୟ ଚୟନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ସମସ୍ତ CSF-ପ୍ରାପ୍ତ ଫେଜ୍‌ର ଟ୍ରାଇପେପ୍‌ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍‌ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରୁଥିବା ସହସଂଯୋଗ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍। ଉଭୟ ଦିଗନିର୍ଦ୍ଦେଶନରେ ପେପ୍‌ଟାଇଡ୍‌ରେ ମିଳୁଥିବା ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଓଭରଲାପ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍‌ଟାଇଡ୍‌କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରୁଥିବା ମୋଟିଫ୍‌ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ବଣ୍ଟନ। 1000 ପାଠ୍ୟକ୍ରମରେ ମିଳୁଥିବା ମୋଟିଫ୍‌ର ସଂଖ୍ୟା ଦର୍ଶାଯାଇଛି। ତୁଳନାତ୍ମକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ (p < 0.001) ଚୟନ କରାଯାଇଥିବା କିମ୍ବା ବାଦ ଦିଆଯାଇଥିବା ମୋଟିଫ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଲାଲ ବିନ୍ଦୁ ସହିତ ହାଇଲାଇଟ୍ କରାଯାଇଛି। (c, d, g, h) ଇନ ଭିଭୋ ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 2 ଏବଂ 1 ଉପରେ ଆଧାରିତ ସମସ୍ତ CSF-ସମୃଦ୍ଧ 12 ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଲମ୍ବା କ୍ରମର କ୍ରମ ଲୋଗୋ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ। ଗୋଟିଏ-ଅକ୍ଷର କୋଡର ଆକାର ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସେହି ସ୍ଥାନଟିରେ ସେହି ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କେତେଥର ଘଟେ। ଲୋଗୋକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରିବା ପାଇଁ, ଦୁଇଟି ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କଠାରୁ ନିଷ୍କାସିତ CSF କ୍ରମଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରାଯାଏ ଏବଂ ଦ୍ୱିତୀୟ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମୃଦ୍ଧ କ୍ରମଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଯାଏ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ଏବଂ (h) #1.2–#2.4। (c, d) ପ୍ରାଣୀ ନଂ. 2.1 ଏବଂ ନଂ. 2.2 କିମ୍ବା (g, h) ପ୍ରାଣୀ ନଂ. 2.3 ଏବଂ ନଂ. 2.4 ରେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସ୍ଥାନରେ ସର୍ବାଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ରଙ୍ଗରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି। ସବୁଜ = ଧ୍ରୁବୀୟ, ବାଇଗଣୀ = ନିରପେକ୍ଷ, ନୀଳ = ମୌଳିକ, ଲାଲ = ଏସିଡିକ୍ ଏବଂ କଳା = ଜଳଫୋବିକ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍।
ତୃତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ପରେ, ଆମେ ଦୁଇଟି ପ୍ରାଣୀରୁ ପୃଥକ ହୋଇଥିବା 332 CSF-ପୁନର୍ଗଠିତ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍‌ରୁ 124 ଟି ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (#3.1 ଏବଂ #3.2) ଚିହ୍ନଟ କଲୁ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 6a)। LGSVS (18.7%) କ୍ରମ ସର୍ବାଧିକ ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ ଥିଲା, ତା’ପରେ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଇନସର୍ଟ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ଏବଂ SARGSWREIVSLS (2.2%) ଥିଲା। ଶେଷ ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ଆମେ ତିନୋଟି ପୃଥକ ପ୍ରାଣୀ (ଚିତ୍ର 1c) ରୁ ଦୁଇଟି ସ୍ୱାଧୀନ ଭାବରେ ମନୋନୀତ ଶାଖା ସଂଗ୍ରହ କଲୁ। CSF ରୁ ଉଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା 925 ଟି କ୍ରମିକ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ମଧ୍ୟରୁ, ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଆମେ 64 ଟି ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 6b) ପାଇଲୁ, ଯାହା ମଧ୍ୟରେ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ଫେଜ୍‌ର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ 0.8% କୁ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା। ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ CSF କ୍ଲୋନ୍ ଥିଲା LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ଏବଂ RLSSVDSDLSGC (3, 2%)। %)। NNK ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ଡିଜେନେରେଟ୍ କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସମୟରେ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରାଇମରରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଇନସର୍ସନ୍/ଡିଲିସନ୍ କିମ୍ବା ପ୍ରିମାଚ୍ୟୁରି ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ଯୋଗୁଁ ଚୟନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଗୁଡିକ ଛୋଟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସୃଷ୍ଟି କରନ୍ତି ଏବଂ ଚୟନ କରାଯାଏ କାରଣ ଏଥିରେ ଅନୁକୂଳ aa ମୋଟିଫ୍ ଥାଏ। ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରାଇମରରେ ଇନସର୍ସନ୍/ଡିଲିସନ୍ ଯୋଗୁଁ ଲମ୍ବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହୋଇପାରେ। ଏହା ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଥିବା ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ କୁ ଫ୍ରେମ୍ ବାହାରେ ସ୍ଥାନିତ କରେ ଏବଂ ଏକ ନୂତନ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଦେଖାଯିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏହାକୁ ପଢ଼େ। ସାଧାରଣତଃ, ଆମେ ନମୁନା ଆଉଟପୁଟ୍ ଡାଟା ସହିତ ଇନପୁଟ୍ ଡାଟା ତୁଳନା କରି ସମସ୍ତ ଚାରୋଟି ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡ ପାଇଁ ସମୃଦ୍ଧି କାରକ ଗଣନା କରିଥିଲୁ। ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ସ୍କ୍ରିନିଂ ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ଅ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସନ୍ଦର୍ଭ ଭାବରେ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ ଫେଜ୍ ଟାଇଟର ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟଜନକ ଭାବରେ, ପ୍ରଥମ CSF ଚକ୍ରରେ ନକାରାତ୍ମକ ଫେଜ୍ ଚୟନ ବହୁତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଥିଲା, କିନ୍ତୁ ରକ୍ତରେ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3a), ଯାହା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଅଧିକାଂଶ ସଦସ୍ୟଙ୍କ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ନିଷ୍କ୍ରିୟ ପ୍ରସାରଣର କମ୍ ସମ୍ଭାବନା ହେତୁ ହୋଇପାରେ କିମ୍ବା ଆପେକ୍ଷିକ ଫେଜ୍ ଗୁଡ଼ିକ ଜୀବାଣୁଫେଜ୍ ଅପେକ୍ଷା ରକ୍ତପ୍ରବାହରୁ ଅଧିକ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ରଖା କିମ୍ବା ଅପସାରିତ ହୋଇଥାଏ। ତଥାପି, ପ୍ୟାନିଂର ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, CSF ରେ ଫେଜ୍ ଗୁଡ଼ିକର ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଚୟନ ଉଭୟ କ୍ଲେଡରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦେଉଛି ଯେ ପୂର୍ବ ପର୍ଯ୍ୟାୟ CSF ଗ୍ରହଣକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରୁଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବା ଫେଜ୍ ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 3a)। ପୁଣି, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ରକ୍ତ ସମୃଦ୍ଧି ବିନା। ତୃତୀୟ ଏବଂ ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମଧ୍ୟ, ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଗୁଡ଼ିକ CSF ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା। ଶେଷ ଦୁଇଟି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ତୁଳନା କରି, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ କ୍ରମଗୁଡ଼ିକ ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରେ ଆହୁରି ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 3b)। ଉଭୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଦିଗନିର୍ଦ୍ଦେଶ ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ 64ଟି ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମରୁ ମୋଟ 931ଟି ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମୋଟିଫ୍ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରେ ସବୁଠାରୁ ସମୃଦ୍ଧ ମୋଟିଫ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ ଲାଇବ୍ରେରୀ (କଟ-ଅଫ୍: 10% ସମୃଦ୍ଧି) ତୁଳନାରେ ସମସ୍ତ ରାଉଣ୍ଡରେ ସେମାନଙ୍କର ସମୃଦ୍ଧି ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ପାଇଁ ଅଧିକ ନିକଟରୁ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 6c)। ଚୟନର ସାଧାରଣ ପଦ୍ଧତି ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ ଅଧିକାଂଶ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ମୋଟିଫ୍ ଉଭୟ ଚୟନ ଶାଖାର ପୂର୍ବ ସମସ୍ତ ରାଉଣ୍ଡରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା। ତଥାପି, କିଛି ମୋଟିଫ୍ (ଯଥା SGL, VSG, LGS GSV) ମୁଖ୍ୟତଃ ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ A ରୁ ଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଅନ୍ୟଗୁଡ଼ିକ (ଯଥା FGW, RTN, WGF, NTR) ବିକଳ୍ପ କ୍ଲେଡ୍ B ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା।
ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ପେଲୋଡ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ CSF-ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍-ପ୍ରଦର୍ଶିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଲିଡର ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର CSF ପରିବହନର ବୈଧକରଣ।
(କ) ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ (ଇନପୁଟ = I) ଫେଜ୍ (PFU) ଟାଇଟର ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଧାରିତ CSF ଫେଜ୍ ଟାଇଟର (ଆଉଟପୁଟ୍ = O) ଉପରେ ଆଧାର କରି ସମସ୍ତ ଚାରୋଟି ରାଉଣ୍ଡ (R1-R4) ରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ସମୃଦ୍ଧି ଅନୁପାତ। ଶେଷ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡ (R2-R4) ପାଇଁ ସମୃଦ୍ଧି କାରକଗୁଡ଼ିକୁ ପୂର୍ବ ରାଉଣ୍ଡ ଏବଂ ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ (R1) ସହିତ ଓଜନ ତଥ୍ୟ ସହିତ ତୁଳନା କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ଖୋଲା ବାର୍ ହେଉଛି ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥ, ଛାୟାଯୁକ୍ତ ବାର୍ ହେଉଛି ପ୍ଲାଜ୍ମା। (***p<0.001, ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା ଉପରେ ଆଧାରିତ)। (ଖ) ସର୍ବାଧିକ ପ୍ରଚୁର ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ତାଲିକା, ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 4 ପରେ CSF ରେ ସଂଗୃହିତ ସମସ୍ତ ଫେଜ୍ ସହିତ ସେମାନଙ୍କର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତ ଅନୁସାରେ ସ୍ଥାନିତ। ଛଅଟି ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ରଙ୍ଗ, ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଚୟନର ରାଉଣ୍ଡ 3 ଏବଂ 4 (ଇନସେଟ୍) ମଧ୍ୟରେ ସେମାନଙ୍କର ସମୃଦ୍ଧି କାରକଗୁଡ଼ିକରେ ହାଇଲାଇଟ୍ କରାଯାଇଛି। (c,d) ଚତୁର୍ଥ ରାଉଣ୍ଡରୁ ଛଅଟି ସବୁଠାରୁ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍, ଖାଲି ଫେଜ୍ ଏବଂ ପ୍ୟାରେଣ୍ଟାଲ୍ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ CSF ନମୁନା ମଡେଲରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସୂଚିତ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। (c) ସମାନ ପରିମାଣର 6 ପ୍ରାର୍ଥୀ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ (2 x 1010 ଫେଜ୍/ପଶୁ), ଖାଲି ଫେଜ୍ (#1779) (2 x 1010 ଫେଜ୍/ପଶୁ) ଏବଂ ଷ୍ଟକ୍ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ (2 x 1012 ଫେଜ୍/ପଶୁ) ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମାଧ୍ୟମରେ କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ ପ୍ରାଣୀଙ୍କୁ ଅତି କମରେ 3 CM ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ କରାଯାଏ। ସମୟ ସହିତ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଏବଂ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର CSF ଫାର୍ମାକୋକାଇନେଟିକ୍ସ ଦର୍ଶାଯାଇଛି। (d) ନମୁନା ଗ୍ରହଣ ସମୟରେ ସମସ୍ତ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଫେଜ୍/mL ପାଇଁ ହାରାହାରି CSF/ରକ୍ତ ଅନୁପାତ ଦେଖାଏ। (e) ଚାରୋଟି ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ଲିଡର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ଗୋଟିଏ ସ୍କ୍ରାମ୍ବଲ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣକୁ ସେମାନଙ୍କର N-ଟର୍ମିନସ୍ (ଟେଟ୍ରାମର ପ୍ରଦର୍ଶନ) ମାଧ୍ୟମରେ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ସହିତ ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା'ପରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ (ଲାଞ୍ଜ ଶିରା iv, 10 mg ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍/kg) କରାଯାଇଥିଲା। ଅତି କମରେ ତିନୋଟି ଇନଟୁବେଟେଡ୍ ମୂଷା (N = 3)। ସୂଚିତ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ CSF ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ CSF ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ELISA (nd = ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନାହିଁ) ଦ୍ୱାରା ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ପରୀକ୍ଷା ଉପରେ ଆଧାରିତ)। (f) ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ଅନ୍ୟ ମନୋନୀତ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଭିଡ୍ କ୍ଲୋନ୍ ସହିତ ସର୍ବାଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଭିଡ୍ କ୍ଲୋନ୍ #2002 (ବାଇଗଣୀ) ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମର ତୁଳନା। ସମାନ ଏବଂ ସମାନ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ରଙ୍ଗ-କୋଡେଡ୍।
ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟ (ଚିତ୍ର 3b) ରେ ସମସ୍ତ ସମୃଦ୍ଧ ଫେଜ ମଧ୍ୟରୁ, CSF ନମୁନା ମଡେଲରେ ଅଧିକ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଛଅଟି ପ୍ରାର୍ଥୀ କ୍ଲୋନକୁ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା। ତିନୋଟି କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ CM ପ୍ରାଣୀରେ ସମାନ ପରିମାଣର ଛଅଟି ପ୍ରାର୍ଥୀ ଫେଜ, ଖାଲି ଫେଜ (ସନ୍ନିବେଶ ନାହିଁ) ଏବଂ ପ୍ରୋଫେଜ ପେପଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ CSF (ଚିତ୍ର 3c) ଏବଂ ରକ୍ତ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 7) ପରୀକ୍ଷାରେ ଫାର୍ମାକୋକାଇନେଟିକ୍ସ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ପରୀକ୍ଷିତ ସମସ୍ତ ଫେଜ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକ ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ (#1779) ଅପେକ୍ଷା 10-1000 ଗୁଣ ଅଧିକ ସ୍ତରରେ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଥିଲେ। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, କ୍ଲୋନ #2020 ଏବଂ #2077 ରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ ଅପେକ୍ଷା ପ୍ରାୟ 1000 ଗୁଣ ଅଧିକ CSF ଟାଇଟର ଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ମନୋନୀତ ପେପଟାଇଡର ଫାର୍ମାକୋକାଇନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଭିନ୍ନ, କିନ୍ତୁ ସମସ୍ତଙ୍କର CSF ହୋମିଂ କ୍ଷମତା ଅଧିକ। ଆମେ କ୍ଲୋନ୍ #1903 ଏବଂ #2011 ପାଇଁ ସମୟ ସହିତ ଏକ ନିରନ୍ତର ହ୍ରାସ ଦେଖିଲୁ, ଯେତେବେଳେ କ୍ଲୋନ୍ #2077, #2002 ଏବଂ #2009 ପାଇଁ ପ୍ରଥମ 10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ବୃଦ୍ଧି ସକ୍ରିୟ ପରିବହନକୁ ସୂଚାଇପାରେ କିନ୍ତୁ ଏହାକୁ ଯାଞ୍ଚ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ। କ୍ଲୋନ୍ #2020, #2002, ଏବଂ #2077 ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରରେ ସ୍ଥିର ହୋଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ କ୍ଲୋନ୍ #2009 ର CSF ସାନ୍ଦ୍ରତା ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ବୃଦ୍ଧି ପରେ ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସ ପାଇଲା। ଆମେ ତା’ପରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ CSF ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିକୁ ଏହାର ରକ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତା ସହିତ ତୁଳନା କଲୁ (ଚିତ୍ର 3d)। ସମସ୍ତ ନମୁନା ସମୟରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ CSF ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ରକ୍ତ ଟାଇଟର ସହିତ ଏହାର ମଧ୍ୟମା ଟାଇଟରର ସହସଂଯୋଗ ଦେଖାଇଲା ଯେ ଛଅ ଜଣ ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ ତିନି ଜଣ ରକ୍ତ CSFରେ ଯଥେଷ୍ଟ ପରିମାଣରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲେ। ଆକର୍ଷଣୀୟ ଭାବରେ, କ୍ଲୋନ୍ #2077 ଉଚ୍ଚ ରକ୍ତ ସ୍ଥିରତା ଦେଖାଇଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 7)। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନିଜେ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ଫେଜ୍ କଣିକା ବ୍ୟତୀତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାର୍ଗୋକୁ ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ପରିବହନ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ ବୋଲି ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ N-ଟର୍ମିନସରେ ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ବ୍ୟୁତ୍ପନ୍ନ ଚାରୋଟି ନେତା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସଂଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେଉଁଠାରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଫେଜ୍ କଣିକା ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ହୋଇଥାଏ। ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ (ସଂଖ୍ୟା 2002, 2009, 2020 ଏବଂ 2077) କୁ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ (SA) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଫେଜ୍ ଜ୍ୟାମିତିକୁ କିଛି ମାତ୍ରାରେ ଅନୁକରଣ କରୁଥିବା ମଲ୍ଟିମେରିକ୍ ଫର୍ମ ହାସଲ କରିଥିଲା। ଏହି ଫର୍ମାଟ୍ ଆମକୁ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍‌ରେ କାର୍ଗୋ-ପରିବହନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ ଭାବରେ SA ଏକ୍ସପୋଜର ମାପିବାକୁ ମଧ୍ୟ ଅନୁମତି ଦେଇଥିଲା। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, ଯେତେବେଳେ ଏହି SA-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଫର୍ମାଟ୍ (ଚିତ୍ର 3e) ରେ ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ ପ୍ରଶାସିତ କରାଯାଉଥିଲା ସେତେବେଳେ ଫେଜ୍ ଡାଟା ପ୍ରାୟତଃ ପୁନଃଉତ୍ପାଦିତ ହୋଇପାରିବ। ସ୍କ୍ରାମ୍ବଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡିକର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏକ୍ସପୋଜର କମ୍ ଥିଲା ଏବଂ 48 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ଅଚିହ୍ନିତ ସ୍ତର ସହିତ ଦ୍ରୁତ CSF କ୍ଲୋନ୍ ଥିଲା। CSF ସ୍ଥାନରେ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ବିତରଣ ପଥ ବିଷୟରେ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ପାଇବା ପାଇଁ, ଆମେ ଭିଭୋରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପରେ ସିଧାସଳଖ ଫେଜ୍ କଣିକାଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି (IHC) ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଫେଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହିଟ୍‌ର ସ୍ଥାନୀୟକରଣ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, କ୍ଲୋନ୍ #2002, #2077, ଏବଂ #2009 ମସ୍ତିଷ୍କ କୈଶିକାରେ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ସ୍ଟେନ୍ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିଲା, ଯେତେବେଳେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ୍ (#1779) ଏବଂ କ୍ଲୋନ୍ #2020 ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 8)। ଏହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଗୁଡିକ BBB ଅତିକ୍ରମ କରି ମସ୍ତିଷ୍କ ଉପରେ ପ୍ରଭାବରେ ଅବଦାନ ରଖନ୍ତି। ଏହି ପରିକଳ୍ପନାକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଆବଶ୍ୟକ, କାରଣ BSCFB ମାର୍ଗ ମଧ୍ୟ ଏଥିରେ ସାମିଲ ହୋଇପାରେ। ସବୁଠାରୁ ସମୃଦ୍ଧ କ୍ଲୋନ୍ (#2002) ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମକୁ ଅନ୍ୟ ମନୋନୀତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ତୁଳନା କରିବା ସମୟରେ, ଏହା ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଥିଲା ଯେ ସେମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ କିଛିର ସମାନ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିସ୍ତାର ଅଛି, ଯାହା ଏକ ସମାନ ପରିବହନ ଯନ୍ତ୍ରକୁ ସୂଚାଇପାରେ (ଚିତ୍ର 3f)।
ଏହାର ଅନନ୍ୟ ପ୍ଲାଜ୍ମା ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଏବଂ ସମୟ ସହିତ CSF ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ବୃଦ୍ଧି ହେତୁ, ଫେଜ୍ ଡିସପ୍ଲେ କ୍ଲୋନ୍ #2077 କୁ 48 ଘଣ୍ଟା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିରନ୍ତର SA ସ୍ତର ସହିତ ଜଡିତ CSF ରେ ଦ୍ରୁତ ବୃଦ୍ଧିକୁ ପୁନଃଉତ୍ପାଦନ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4a)। ଅନ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ବିଷୟରେ, #2077 ମସ୍ତିଷ୍କ କୈଶିକ ପାଇଁ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ରଙ୍ଗୀନ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନରେ ଦେଖାଗଲେ କୈଶିକ ମାର୍କର ଲେକ୍ଟିନ୍ ସହିତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସମସ୍ଥାନୀକରଣ ଦେଖାଇଥିଲା ଏବଂ ସମ୍ଭବତଃ ପ୍ୟାରେଙ୍କାଇମାଲ୍ ସ୍ପେସରେ କିଛି ରଙ୍ଗୀନ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4b)। CNS ରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ଔଷଧୀୟ ପ୍ରଭାବ ମିଳିପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେଉଁଥିରେ i) #2077 ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ii) BACE1 ଇନହିବିଟର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ସଂସ୍କରଣଗୁଡ଼ିକୁ SA ସହିତ ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଅନୁପାତରେ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୋଟିଏ ମିଶ୍ରଣ ପାଇଁ ଆମେ କେବଳ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟର ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ ଏବଂ ଅନ୍ୟଟି ପାଇଁ ଆମେ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟରର #2077 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ 1:3 ଅନୁପାତ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ଉଭୟ ନମୁନା ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରଶାସିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସମୟ ସହିତ ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ସ୍ତର ବିଟା-ଆମାଇଲଏଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 40 (Abeta40) ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। Abeta40 କୁ CSF ରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା କାରଣ ଏହା ମସ୍ତିଷ୍କ ପାରେଞ୍ଚାଇମାରେ BACE1 ପ୍ରତିରୋଧକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିଥାଏ। ଆଶା ଅନୁଯାୟୀ, ଉଭୟ ଜଟିଳ Abeta40 ର ରକ୍ତ ସ୍ତରକୁ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରିଥିଲା ​​(ଚିତ୍ର 4c, d)। ତଥାପି, କେବଳ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନଂ. 2077 ଏବଂ SA ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ଏକ ନିରୋଧକ ମିଶ୍ରଣ ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ରେ Abeta40 ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ହ୍ରାସ ଘଟାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4c)। ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନଂ. 2077 60 kDa SA ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁ CNS ରେ ପରିବହନ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ ଏବଂ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର SA-ସଂଯୁକ୍ତ ନିରୋଧକ ସହିତ ଔଷଧୀୟ ପ୍ରଭାବ ମଧ୍ୟ ପ୍ରେରଣା କରେ।
(କ) ଅତି କମରେ ତିନୋଟି CM-ଇଣ୍ଟ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ମୂଷାରେ CSF ପେପ୍ଟାଇଡ୍ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ଏବଂ ଅଣଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ୍ (#1779) ର ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ଫାର୍ମାକୋକାଇନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଦେଖାଉଥିବା T7 ଫେଜର କ୍ଲୋନାଲ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ (2 × 10 ଫେଜ୍/ପଶୁ)। (ଖ) ଫେଜ୍-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ମୂଷାରେ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱକାରୀ କର୍ଟିକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋଭେସେଲ୍ସର କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍ପେକ୍ଟିଭ୍ ପ୍ରତିଛବି ଯାହା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ #2077 ଏବଂ ନଳୀ (ଲେକ୍ଟିନ୍) ର ପ୍ରତିରୋଧକତା ଦେଖାଉଥିବା। ଏହି ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ 3 ଟି ମୂଷାକୁ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରଫ୍ୟୁଜନ୍ ପୂର୍ବରୁ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ସଞ୍ଚାଳନ କରିବାକୁ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ମସ୍ତିଷ୍କକୁ T7 ଫେଜ୍ କ୍ୟାପସିଡ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ FITC-ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ବିଭାଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରଙ୍ଗ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ପରଫ୍ୟୁଜନ୍ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସ୍ଥିରୀକରଣର ଦଶ ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ, DyLight594-ଲେବଲ୍ ଲେକ୍ଟିନ୍ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ପ୍ରଶାସିତ କରାଯାଇଥିଲା। କୈଶିକା ଏବଂ ପେରିଭାସ୍କୁଲାର ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁର ଲୁମେନରେ ମାଇକ୍ରୋଭେସେଲ୍ସ ଏବଂ ଫେଜ (ସବୁଜ) ର ଲ୍ୟୁମିନାଲ୍ ପାର୍ଶ୍ଵର ଲେକ୍ଟିନ୍ ସ୍ଟେନିଂ (ଲାଲ) ଦେଖାଉଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରତିଛବି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ 10 µm ସହିତ ସମାନ। (c, d) କେବଳ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ BACE1 ଇନହିବିଟୋରି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କିମ୍ବା ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ #2077 ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ସହିତ ଏବଂ ତା'ପରେ ଅତି କମରେ ତିନୋଟି କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ CM ମୂଷା (10 mg ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍/କିଗ୍ରା) ର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା। Aβ40 ରେ BACE1 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟୋର-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ହ୍ରାସକୁ Aβ1-40 ELISA ଦ୍ୱାରା ରକ୍ତ (ଲାଲ) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (କମଳା) ରେ ସୂଚିତ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ଉତ୍ତମ ସ୍ପଷ୍ଟତା ପାଇଁ, ଗ୍ରାଫରେ 100% ସ୍କେଲରେ ଏକ ବିନ୍ଦୁ ରେଖା ଅଙ୍କିତ ହୋଇଛି। (c) 3:1 ଅନୁପାତରେ ଟ୍ରାନ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ #2077 ଏବଂ BACE1 ନିରୋଧୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ମୂଷାଙ୍କ ରକ୍ତରେ Aβ40 (ଲାଲ ତ୍ରିଭୁଜ) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ (କମଳା ତ୍ରିଭୁଜ) ରେ ପ୍ରତିଶତ ହ୍ରାସ। (d) କେବଳ BACE1 ନିରୋଧୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ମୂଷାଙ୍କ ରକ୍ତରେ Aβ40 (ଲାଲ ବୃତ୍ତ) ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ (କମଳା ବୃତ୍ତ) ରେ ପ୍ରତିଶତ ହ୍ରାସ। ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ Aβ ସାନ୍ଦ୍ରତା 420 pg/ml (ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତି = 101 pg/ml) ଥିଲା।
ବାୟୋମେଡିକାଲ୍ ଗବେଷଣାର ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଫେଜ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ ସଫଳତାର ସହିତ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଛି17। ଏହି ପଦ୍ଧତିକୁ ଭିଭୋ ଭାସ୍କୁଲାର୍ ବିବିଧତା ଅଧ୍ୟୟନ18,19 ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ ନଳୀକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରି ଅଧ୍ୟୟନ20,21,22,23,24,25,26 ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଛି। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ଏହି ଚୟନ ପଦ୍ଧତିର ପ୍ରୟୋଗକୁ କେବଳ ମସ୍ତିଷ୍କ ନଳୀକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରି ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସିଧାସଳଖ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ନୁହେଁ, ବରଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ପାର କରିବା ପାଇଁ ସକ୍ରିୟ ପରିବହନ ଗୁଣ ଥିବା ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ଆବିଷ୍କାର ପାଇଁ ମଧ୍ୟ ବିସ୍ତାର କରିଛୁ। ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ CM ଇନ୍ଟ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ମୂଷାରେ ଏକ ଇନ ଭିଭୋ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ବିକାଶ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁଛୁ ଏବଂ CSF ହୋମିଂ ଗୁଣ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ଏହାର ସମ୍ଭାବନା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଛୁ। 12-ମେର୍ ରାଣ୍ଡମ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବା T7 ଫେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିପାରିଲୁ ଯେ T7 ଫେଜ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ଛୋଟ (ପ୍ରାୟ 60 nm ବ୍ୟାସ)10 ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ସହିତ ଅନୁକୂଳିତ ହେବା ପାଇଁ, ଏହା ଦ୍ୱାରା ସିଧାସଳଖ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା କିମ୍ବା କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍ ପାର କରି। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ କ୍ୟାନୁଲେଟେଡ୍ CM ମୂଷାରୁ CSF ଅମଳ ଏକ ସୁନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଭିଭୋ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତି ଥିଲା, ଏବଂ ନିଷ୍କାସିତ ଫେଜ୍ କେବଳ ଭାସ୍କୁଲେଚର ସହିତ ବନ୍ଧିତ ନୁହେଁ ବରଂ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ପାର କରି ଏକ ପରିବହନକାରୀ ଭାବରେ ମଧ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟ କରିଥିଲା। ଅଧିକନ୍ତୁ, ଏକକାଳୀନ ରକ୍ତ ସଂଗ୍ରହ କରି ଏବଂ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ-ପ୍ରାପ୍ତ ଫେଜ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ HTS ପ୍ରୟୋଗ କରି, ଆମେ ନିଶ୍ଚିତ କଲୁ ଯେ CSF ର ଆମର ପସନ୍ଦ ରକ୍ତ ସମୃଦ୍ଧି କିମ୍ବା ଚୟନ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରସାରଣ ପାଇଁ ଫିଟନେସ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନାହିଁ। ତଥାପି, ରକ୍ତ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ଏକ ଅଂଶ, କାରଣ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ପହଞ୍ଚିବାକୁ ସକ୍ଷମ ଫେଜ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ନିଜକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୟ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ରକ୍ତପ୍ରବାହରେ ବଞ୍ଚି ରହିବା ଏବଂ ସଞ୍ଚାଳନ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ। କଞ୍ଚା HTS ତଥ୍ୟରୁ ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ କ୍ରମ ସୂଚନା ବାହାର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରଣାଳୀରେ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମ ତ୍ରୁଟି ସହିତ ଅନୁକୂଳିତ ଫିଲ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କଲୁ। ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତିରେ ଗତିଜ ପାରାମିଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି, ଆମେ ରକ୍ତ24, 27, 28 ରେ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର T7 ଫେଜ୍ (t½ ~ 28 ମିନିଟ୍) ର ଦ୍ରୁତ ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ସ ନିଶ୍ଚିତ କଲୁ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ (t½ ~ 26 ମିନିଟ୍) ପ୍ରତି ମିନିଟ୍‌ରେ ସେମାନଙ୍କର ଅଧା-ଜୀବନ ମଧ୍ୟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କଲୁ। ରକ୍ତ ଏବଂ CSF ରେ ସମାନ ଫାର୍ମାକୋକାଇନେଟିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ସତ୍ତ୍ୱେ, CSF ରେ ଫେଜର ରକ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତାର କେବଳ 0.001% ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିଲା, ଯାହା ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ଦେଇ ଜଙ୍ଗଲୀ-ପ୍ରକାର T7 ଫେଜର କମ୍ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଗତିଶୀଳତା ସୂଚାଇଥାଏ। ଏହି କାର୍ଯ୍ୟ ଇନ ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ ରଣନୀତି ବ୍ୟବହାର କରିବା ସମୟରେ ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନର ଗୁରୁତ୍ୱକୁ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କରେ, ବିଶେଷକରି ଫେଜ ସିଷ୍ଟମ ପାଇଁ ଯାହା ଶୀଘ୍ର ସଞ୍ଚାଳନରୁ ସଫା କରାଯାଏ, କାରଣ କିଛି କ୍ଲୋନ CNS କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ପହଞ୍ଚିବାକୁ ସକ୍ଷମ ହୁଅନ୍ତି। ତେଣୁ, ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ଲାଇବ୍ରେରୀ ବିବିଧତାରେ ହ୍ରାସ ବହୁତ ବଡ଼ ଥିଲା, କାରଣ ଏହି ଅତ୍ୟନ୍ତ କଠୋର CSF ମଡେଲରେ ଶେଷରେ କେବଳ ସୀମିତ ସଂଖ୍ୟକ କ୍ଲୋନ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ଇନ ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ ରଣନୀତିରେ CSF କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ସକ୍ରିୟ ସଂଗ୍ରହ, ରକ୍ତ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ କ୍ଲୋନ ବଞ୍ଚିବା ଏବଂ ପ୍ରଥମ 10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ରକ୍ତରୁ T7 ଫେଜ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକର ଦ୍ରୁତ ଅପସାରଣ ଭଳି ଅନେକ ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 1d ଏବଂ ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 4M)। ତେଣୁ, ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପରେ, CSF ରେ ଭିନ୍ନ ଫେଜ କ୍ଲୋନ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଯଦିଓ ସମାନ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପୁଲ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା। ଏହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସଦସ୍ୟ ଥିବା ଉତ୍ସ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପାଇଁ ଏକାଧିକ କଠୋର ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପ ବିବିଧତାରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହ୍ରାସ ଆଣିଥାଏ। ତେଣୁ, ଅନିୟମିତ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଚୟନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ଏକ ଅବିଚ୍ଛେଦ୍ୟ ଅଂଶ ହୋଇଯିବ, ଫଳାଫଳକୁ ବହୁଳ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବିତ କରିବ। ସମ୍ଭବତଃ ମୂଳ ଲାଇବ୍ରେରୀର ଅନେକ କ୍ଲୋନର CSF ସମୃଦ୍ଧି ପ୍ରବୃତ୍ତି ସମାନ ଥିଲା। ତଥାପି, ସମାନ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପରିସ୍ଥିତିରେ ମଧ୍ୟ, ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପୁଲରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ଲୋନର କମ୍ ସଂଖ୍ୟା ଯୋଗୁଁ ଚୟନ ଫଳାଫଳ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ।
CSF ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିବା ମୋଟିଫ୍ ରକ୍ତରେ ଥିବା ମୋଟିଫ୍ ଠାରୁ ଭିନ୍ନ। ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟଜନକ ଭାବରେ, ଆମେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ରକ୍ତରେ ଗ୍ଲାଇସିନ୍-ସମୃଦ୍ଧ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଆଡକୁ ପ୍ରଥମ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଛୁ। (ଚିତ୍ର 1g, ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 4e, 4f)। ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଫେଜ୍ ଅଧିକ ସ୍ଥିର ହୋଇପାରେ ଏବଂ ସଞ୍ଚାଳନରୁ ବାହାର କରିବାର ସମ୍ଭାବନା କମ୍ ହୋଇପାରେ। ତଥାପି, ଏହି ଗ୍ଲାଇସିନ୍-ସମୃଦ୍ଧ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ନମୁନାରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ନଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ କ୍ୟୁରେଟେଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଚୟନ ପଦକ୍ଷେପ ଦେଇ ଯାଇଛି: ଗୋଟିଏ ରକ୍ତରେ ଏବଂ ଅନ୍ୟଟି ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳରେ ଜମା ହେବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଆଯାଇଛି। ଚତୁର୍ଥ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା CSF-ସମୃଦ୍ଧ କ୍ଲୋନ୍ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷିତ ହୋଇଛି। ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫେଜ୍ ତୁଳନାରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷିତ ହୋଇଥିବା କ୍ଲୋନ୍ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ CSF ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିବା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୋଟିଏ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ହିଟ୍ (#2077) କୁ ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। ଏହା ଅନ୍ୟ ହିଟ୍ ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ପ୍ଲାଜ୍ମା ଅର୍ଦ୍ଧ-ଜୀବନ ଦେଖାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 3d ଏବଂ ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 7), ଏବଂ ଆକର୍ଷଣୀୟ ଭାବରେ, ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରେ C-ଟର୍ମିନସରେ ଏକ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ୍ୟ ଥିଲା। ସମ୍ପ୍ରତି ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ପେପ୍ଟାଇଡରେ ସିଷ୍ଟାଇନ ଯୋଡିବା ଦ୍ୱାରା ଆଲବୁମିନ 29 ସହିତ ବନ୍ଧନ ହୋଇ ସେମାନଙ୍କର ଫାର୍ମାକୋକିନେଟିକ୍ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକୁ ଉନ୍ନତ କରାଯାଇପାରିବ। ଏହା ବର୍ତ୍ତମାନ ପେପ୍ଟାଇଡ #2077 ପାଇଁ ଅଜଣା ଏବଂ ଅଧିକ ଅଧ୍ୟୟନ ଆବଶ୍ୟକ। କିଛି ପେପ୍ଟାଇଡ CSF ସମୃଦ୍ଧିରେ ଏକ ଭାଲେନ୍ସ-ନିର୍ଭରଶୀଳତା ଦେଖାଇଥିଲେ (ଡାଟା ଦେଖାଯାଇ ନାହିଁ), ଯାହା T7 କ୍ୟାପସିଡର ପ୍ରଦର୍ଶିତ ପୃଷ୍ଠ ଜ୍ୟାମିତି ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ। ଆମେ ବ୍ୟବହାର କରିଥିବା T7 ସିଷ୍ଟମ ପ୍ରତି ଫେଜ୍ କଣିକାର ପ୍ରତ୍ୟେକ ପେପ୍ଟାଇଡର 5-15 କପି ଦେଖାଇଥିଲା। IHC କୁ ମୂଷାର ସେରେବ୍ରାଲ କର୍ଟେକ୍ସରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିବା ପ୍ରାର୍ଥୀ ଲିଡ୍ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକରେ କରାଯାଇଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 8)। ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ଅତି କମରେ ତିନୋଟି କ୍ଲୋନ (ନଂ. 2002, ନଂ. 2009 ଏବଂ ନଂ. 2077) BBB ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରିଥିଲେ। ଏହି BBB ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା CSF ସଂଗ୍ରହ କରେ କି ଏହି କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକର ସିଧାସଳଖ BCSFB କୁ ଗତି କରେ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ବାକି ଅଛି। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ କାର୍ଗୋ ସହିତ ବନ୍ଧନ ହେବା ସମୟରେ ଚୟନିତ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକ ସେମାନଙ୍କର CSF ପରିବହନ କ୍ଷମତା ବଜାୟ ରଖେ। SA ସହିତ N-ଟର୍ମିନାଲ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ ବାନ୍ଧିବା ଦ୍ୱାରା ରକ୍ତ ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ (ଚିତ୍ର 3e) ରେ ସେମାନଙ୍କ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ସହିତ ପ୍ରାପ୍ତ ଫଳାଫଳକୁ ମୂଳତଃ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଏ। ଶେଷରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ଲିଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ #2077 SA ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ BACE1 ର ଏକ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇନହିବିଟରର ମସ୍ତିଷ୍କ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ, CSF ରେ Abeta40 ସ୍ତରକୁ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରି CNS ରେ ସ୍ପଷ୍ଟ ଫାର୍ମାକୋଡାଇନାମିକ୍ ପ୍ରଭାବ ସୃଷ୍ଟି କରେ (ଚିତ୍ର 4)। ସମସ୍ତ ହିଟ୍‌ର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ ହୋମୋଲୋଜି ସନ୍ଧାନ କରି ଆମେ ଡାଟାବେସ୍‌ରେ କୌଣସି ହୋମୋଲୋଗ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିଲୁ ନାହିଁ। ଏହା ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଯେ T7 ଲାଇବ୍ରେରୀର ଆକାର ପ୍ରାୟ 109, ଯେତେବେଳେ 12-ମର୍ସ ପାଇଁ ତାତ୍ତ୍ୱିକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଆକାର 4 x 1015। ତେଣୁ, ଆମେ କେବଳ 12-ମର୍ସ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ବିବିଧତା ସ୍ଥାନର ଏକ ଛୋଟ ଅଂଶ ଚୟନ କରିଛୁ, ଯାହାର ଅର୍ଥ ହୋଇପାରେ ଯେ ଏହି ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ହିଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ନିକଟବର୍ତ୍ତୀ କ୍ରମ ସ୍ଥାନର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରି ଅଧିକ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ। କାଳ୍ପନିକ ଭାବରେ, ଆମେ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକର କୌଣସି ପ୍ରାକୃତିକ ସମସଙ୍ଗତତା ପାଇନାହୁଁ ତାହାର ଏକ କାରଣ ହେଉଛି ବିବର୍ତ୍ତନ ସମୟରେ ମସ୍ତିଷ୍କରେ କିଛି ପେପ୍ଟାଇଡ ମୋଟିଫ୍‌ର ଅନିୟନ୍ତ୍ରିତ ପ୍ରବେଶକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ଡିସିଲେକ୍ସନ।
ଏକତ୍ରିତ ଭାବରେ, ଆମର ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଭିଭୋରେ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର ବାଧା ପରିବହନ ପ୍ରଣାଳୀକୁ ଅଧିକ ବିସ୍ତାରିତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ଭବିଷ୍ୟତ କାର୍ଯ୍ୟ ପାଇଁ ଏକ ଆଧାର ପ୍ରଦାନ କରେ। ଏହି ପଦ୍ଧତିର ମୌଳିକ ସେଟଅପ୍ ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଚୟନ ରଣନୀତି ଉପରେ ଆଧାରିତ ଯାହା କେବଳ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର ବାନ୍ଧନ ଗୁଣ ସହିତ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରେ ନାହିଁ, ବରଂ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପଦକ୍ଷେପ ମଧ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ ଯେଉଁଥିରେ ସଫଳ କ୍ଲୋନଗୁଡ଼ିକର CNS କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟରେ ଭିଭୋରେ ଜୈବିକ ବାଧା ପାର କରିବା ପାଇଁ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଥାଏ। ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକର ପରିବହନର ପଦ୍ଧତି ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କ କ୍ଷେତ୍ର ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାଇକ୍ରୋଭାସ୍କୁଲେଚର ସହିତ ବାନ୍ଧନ ପାଇଁ ସେମାନଙ୍କର ପସନ୍ଦକୁ ସ୍ପଷ୍ଟ କରିବା। ଏହା BBB ଏବଂ ରିସେପ୍ଟରଗୁଡ଼ିକର ପରିବହନ ପାଇଁ ନୂତନ ପଥ ଆବିଷ୍କାର କରିପାରେ। ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକ ସିଧାସଳଖ ସେରେବ୍ରୋଭାସ୍କୁଲାର ରିସେପ୍ଟର କିମ୍ବା BBB କିମ୍ବା BCSFB ମାଧ୍ୟମରେ ପରିବହନ ହେଉଥିବା ପରିଚଳିତ ଲିଗାଣ୍ଡ ସହିତ ବାନ୍ଧ କରିପାରିବେ। ଏହି କାର୍ଯ୍ୟରେ ଆବିଷ୍କୃତ CSF ପରିବହନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ ଭେକ୍ଟରଗୁଡ଼ିକର ଅଧିକ ତଦନ୍ତ କରାଯିବ। ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ BBB ଏବଂ/କିମ୍ବା BCSFB ପାର କରିବାର କ୍ଷମତା ପାଇଁ ଏହି ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକର ମସ୍ତିଷ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ତଦନ୍ତ କରୁଛୁ। ଏହି ନୂତନ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ନୂତନ ରିସେପ୍ଟର କିମ୍ବା ପଥଗୁଡ଼ିକର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆବିଷ୍କାର ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ବାୟୋଲୋଜିକ୍ସ ଭଳି ମାକ୍ରୋମଲିକ୍ୟୁଲ୍ସ ବିତରଣ ପାଇଁ ନୂତନ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଦକ୍ଷ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବିକାଶ ପାଇଁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ମୂଲ୍ୟବାନ ଉପକରଣ ହେବ।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପଦ୍ଧତିର ପରିବର୍ତ୍ତନ ବ୍ୟବହାର କରି ବଡ଼ ସିଷ୍ଟର୍ନା (CM)କୁ କ୍ୟାନୁଲେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ନିଶ୍ଚେତକ ୱିଷ୍ଟାର ମୂଷା (200-350 ଗ୍ରାମ)କୁ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଉପକରଣରେ ଲଗାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲା କରିବା ପାଇଁ କଟା ଏବଂ ଆସେପ୍ଟିକାଲି ପ୍ରସ୍ତୁତ ମୁଣ୍ଡ ଉପରେ ଏକ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଛେଦନ କରାଯାଇଥିଲା। ଉପର ସାଶର କ୍ଷେତ୍ରରେ ଦୁଇଟି ଗାତ ଖୋଳନ୍ତୁ ଏବଂ ଗାତଗୁଡ଼ିକରେ ଫିକ୍ସିଂ ସ୍କ୍ରୁଗୁଡ଼ିକୁ ଲଗାନ୍ତୁ। CM ରେ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ କାନୁଲାର ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ଟିକ୍ ମାର୍ଗଦର୍ଶନ ପାଇଁ ପାର୍ଶ୍ଵସ୍ଥ ଓସିପିଟାଲ୍ କ୍ରେଷ୍ଟରେ ଏକ ଅତିରିକ୍ତ ଗାତ ଖୋଳନ୍ତୁ। କାନୁଲା ଚାରିପାଖରେ ଡେଣ୍ଟାଲ୍ ସିମେଣ୍ଟ ଲଗାନ୍ତୁ ଏବଂ ସ୍କ୍ରୁ ସହିତ ସୁରକ୍ଷିତ କରନ୍ତୁ। ଫଟୋ-କ୍ୟୁରିଂ ଏବଂ ସିମେଣ୍ଟ କଠିନ ହେବା ପରେ, ଚର୍ମ କ୍ଷତକୁ 4/0 ସୁପରାମିଡ୍ ସିଲେଇ ସହିତ ବନ୍ଦ କରାଯାଇଥିଲା। ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ (CSF) ର ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ ଲିକେଜ୍ ଦ୍ୱାରା କାନୁଲାର ସଠିକ୍ ସ୍ଥାନ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଏ। ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଉପକରଣରୁ ମୂଷାକୁ ବାହାର କରନ୍ତୁ, ଉପଯୁକ୍ତ ପୋଷ୍ଟଅପରେଟିଭ୍ ଯତ୍ନ ଏବଂ ଯନ୍ତ୍ରଣା ପରିଚାଳନା ପାଆନ୍ତୁ, ଏବଂ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳରେ ରକ୍ତର ଚିହ୍ନ ଦେଖାଯିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅତି କମରେ ଗୋଟିଏ ସପ୍ତାହ ପାଇଁ ଏହାକୁ ସୁସ୍ଥ ହେବାକୁ ଦିଅନ୍ତୁ। ୱିଷ୍ଟାର ମୂଷା (Crl:WI/Han) ଚାର୍ଲ୍ସ ନଦୀ (ଫ୍ରାନ୍ସ) ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ମୂଷାକୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ରୋଗଜୀବାଣୁ-ମୁକ୍ତ ଅବସ୍ଥାରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ପରୀକ୍ଷଣ ସ୍ୱିଜରଲ୍ୟାଣ୍ଡର ବାସେଲ ସହରର ପଶୁଚିକିତ୍ସା କାର୍ଯ୍ୟାଳୟ ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ପଶୁ ଲାଇସେନ୍ସ ନମ୍ବର 2474 (ମୂଷାର ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ଚିକିତ୍ସା ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ସ୍ତର ମାପି ସକ୍ରିୟ ମସ୍ତିଷ୍କ ପରିବହନର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ) ଅନୁଯାୟୀ କରାଯାଇଥିଲା।
CM କାନୁଲା ହାତରେ ରଖି ମୂଷାକୁ ଧୀରେ ଧୀରେ ଚେତନା ଦିଅନ୍ତୁ। କାନୁଲାରୁ ଡାତୁରା ବାହାର କରନ୍ତୁ ଏବଂ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ ପ୍ରବାହିତ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ତରଳ ପଦାର୍ଥ 10 μl ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ। ଯେହେତୁ କାନୁଲାର ପେଟେନ୍ସି ଶେଷରେ ବିପଦପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇଯାଇଥିଲା, ତେଣୁ ରକ୍ତ ପ୍ରଦୂଷଣ କିମ୍ବା ବିବର୍ଣ୍ଣକରଣର କୌଣସି ପ୍ରମାଣ ବିନା କେବଳ ସ୍ପଷ୍ଟ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ ତରଳ ପଦାର୍ଥ ନମୁନା ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ସମାନ୍ତରାଳ ଭାବରେ, ଲାଞ୍ଜର ଅଗ୍ରଭାଗରେ ଥିବା ଏକ ଛୋଟ ଛେଦନରୁ ହେପାରିନ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ସହିତ ଟ୍ୟୁବରେ ପ୍ରାୟ 10-20 μl ରକ୍ତ ନିଆଯାଇଥିଲା। T7 ଫେଜର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ CSF ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରିବା ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରାୟ 5-10 μl ତରଳ ପଦାର୍ଥ ତ୍ୟାଗ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା କ୍ୟାଥେଟରର ମୃତ ପରିମାଣ ସହିତ ସମାନ।
T7Select ସିଷ୍ଟମ ମାନୁଆଲ୍ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ T7Select 10-3b ଭେକ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏକ ଅନିୟମିତ 12-mer DNA ଇନସର୍ଟ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଫର୍ମାଟରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ କରାଯାଇଥିଲା:
ଇନସର୍ଟରେ ଡବଲ୍ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ଏବଂ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରକାଶନକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ NNK କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। N ହେଉଛି ପ୍ରତ୍ୟେକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡର ଏକ ମାନୁଆଲି ମିଶ୍ରିତ ସମତୁଲ୍ୟ ଅନୁପାତ, ଏବଂ K ହେଉଛି ଆଡେନାଇନ୍ ଏବଂ ସାଇଟୋସାଇନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡର ଏକ ମାନୁଆଲି ମିଶ୍ରିତ ସମତୁଲ୍ୟ ଅନୁପାତ। କ୍ଲେନୋ ବଫର (ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲାବ୍ସ) ରେ 3 ​​ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37°C ରେ dNTP (ନୋଭାଜେନ୍) ଏବଂ କ୍ଲେନୋ ଏନଜାଇମ୍ (ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲାବ୍ସ) ସହିତ ଅଧିକ ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଏକକ ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡ଼ିକୁ ଡବଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ DNAରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, EtOH ଅବପାତ ଦ୍ୱାରା ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ DNA ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା। ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ DNA ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଏନଜାଇମ୍ EcoRI ଏବଂ HindIII (ଉଭୟ ରୋଚେରୁ) ସହିତ ହଜମ କରାଯାଇଥିଲା। କ୍ଲିଭଡ୍ ଏବଂ ପ୍ୟୁରିଫାଇଡ୍ (QIAquick, Qiagen) ଇନସର୍ଟ (T4 ligase, New England Biolabs) 10B କ୍ୟାପସିଡ୍ ଜିନ୍ ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ 348 ପରେ ଫ୍ରେମରେ ଏକ ପ୍ରି-କ୍ଲିଭଡ୍ T7 ଭେକ୍ଟରରେ ଲିଗେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପୂର୍ବରୁ 18 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 16° ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ଲିଗେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। T7Select 10-3b କ୍ଲୋନିଂ କିଟ୍ (ନୋଭାଜେନ୍) ସହିତ ଯୋଗାଣ କରାଯାଇଥିବା ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ଇନ ଭିଟ୍ରୋରେ ଫେଜ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ୟାକେଜିଂ ଦ୍ରବଣକୁ ଥରେ Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇସିସ୍ ପାଇଁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। ଲାଇସେଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଗ୍ଲିସେରୋଲର ଷ୍ଟକ୍ ଦ୍ରବଣ ଭାବରେ -80° ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍, ଟାଇଟେଟେଡ୍ ଏବଂ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
ପ୍ରୋପ୍ରାଇଟେରୀ 454/ରୋଚେ-ଆମ୍ପ୍ଲିକନ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମର ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ରୋଥ୍ କିମ୍ବା ପ୍ଲେଟରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଫେଜ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକର ସିଧାସଳଖ PCR ପ୍ରଶସ୍ତୀକରଣ। ଫରୱାର୍ଡ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମରରେ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ କ୍ଷେତ୍ର (NNK) 12 (ଟେମ୍ପଲେଟ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ), GS FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ଆଡାପ୍ଟର A, ଏବଂ ଏକ ଚାରି-ଆଧାର ଲାଇବ୍ରେରୀ କୀ ଅନୁକ୍ରମ (TCAG) (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1a) ସହିତ କ୍ରମିତ କ୍ରମ ରହିଛି:
ରିଭର୍ସ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରାଇମରରେ କ୍ୟାପଚର ବିଡ୍ସ ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ବାୟୋଟିନ୍ ଏବଂ ଏମ୍ଲସନ୍ PCR ସମୟରେ କ୍ଲୋନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ GS FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ଆଡାପ୍ଟର B ମଧ୍ୟ ଥାଏ:
ତା'ପରେ 454 GS-FLX ଟାଇଟାନିୟମ୍ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ଆମ୍ପ୍ଲିକନ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ 454/ରୋଚେ ପାଇରୋସେକ୍ୱିନ୍ସିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ମାନୁଆଲ୍ ସାଙ୍ଗର୍ ସିକୋଇନ୍ସିଂ (ଆପ୍ଲାଏଡ୍ ବାୟୋସିଷ୍ଟମ୍ସ ହିଟାଚି 3730 xl DNA ଆନାଲାଇଜର) ପାଇଁ, T7 ଫେଜ୍ DNA କୁ PCR ଦ୍ୱାରା ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିମ୍ନଲିଖିତ ପ୍ରାଇମର ଯୋଡ଼ା ସହିତ ସିକୋଇନ୍ସ କରାଯାଇଥିଲା:
ପୃଥକ ପ୍ଲାକରୁ ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ରୋଚ୍ ଫାଷ୍ଟ ଷ୍ଟାର୍ଟ ଡିଏନଏ ପଲିମରେଜ୍ କିଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପିସିଆର ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା (ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ)। ଏକ ହଟ୍ ଷ୍ଟାର୍ଟ (୯୫ ଡିଗ୍ରୀ ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ୧୦ ମିନିଟ୍) ଏବଂ ୩୫ଟି ବୁଷ୍ଟ ଚକ୍ର (୯୫ ଡିଗ୍ରୀ ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ୫୦ ସେକେଣ୍ଡ, ୫୦ ଡିଗ୍ରୀ ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ୧ ମିନିଟ୍, ଏବଂ ୭୨ ଡିଗ୍ରୀ ସେଲ୍ସିୟସ୍ ରେ ୧ ମିନିଟ୍) କରନ୍ତୁ।
ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ ଫେଜ୍, ଜଙ୍ଗଲୀ ପ୍ରକାରର ଫେଜ୍, CSF ଏବଂ ରକ୍ତରୁ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିବା ଫେଜ୍, କିମ୍ବା ବ୍ୟକ୍ତିଗତ କ୍ଲୋନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ Escherichia coli BL5615 ରେ TB ବ୍ରୋଥ୍ (Sigma Aldrich) ରେ କିମ୍ବା 500 cm2 ପାତ୍ରରେ (Thermo Scientific) 37°C ତାପମାତ୍ରାରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। Tris-EDTA ବଫର (Fluka Analytical) ସହିତ ପ୍ଲେଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଧୋଇ କିମ୍ବା ଷ୍ଟେରାଇଲ୍ ପିପେଟ୍ ଟିପ୍ସ ସହିତ ପ୍ଲାକ୍ ସଂଗ୍ରହ କରି ପ୍ଲେଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକରୁ ଫେଜ୍ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଗୋଟିଏ ରାଉଣ୍ଡ ପଲିଥିନ୍ ଗ୍ଲାଇକଲ୍ (PEG 8000) ବର୍ଷା (Promega) ସହିତ କଲଚର୍ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ କିମ୍ବା ଏକ୍ସଟ୍ରାକ୍ସନ ବଫରରୁ ଫେଜ୍ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ Tris-EDTA ବଫରରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା।
ଆମ୍ପ୍ଲିଫାଏଡ୍ ଫେଜ୍‌କୁ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର (IV) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ (500 μl/ପଶୁ) ପୂର୍ବରୁ ଏଣ୍ଡୋଟକ୍ସିନ୍ ରିମୁଭାଲ୍ ବିଡ୍ସ (ମିଲ୍‌ଟେନି ବାୟୋଟେକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି 2-3 ରାଉଣ୍ଡ ଏଣ୍ଡୋଟକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡରେ, 2×1012 ଫେଜ୍ ପ୍ରଚଳନ କରାଯାଇଥିଲା; ଦ୍ୱିତୀୟରେ, 2×1010 ଫେଜ୍; ତୃତୀୟ ଏବଂ ଚତୁର୍ଥ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡରେ, ପ୍ରତି ପ୍ରାଣୀ ପାଇଁ 2×109 ଫେଜ୍। ସୂଚିତ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ ସଂଗୃହୀତ CSF ଏବଂ ରକ୍ତ ନମୁନାରେ ଫେଜ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ (T7Select ସିଷ୍ଟମ୍ ମାନୁଆଲ୍) ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ଲାକ୍ ଗଣନା ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ଫେଜ୍ ଚୟନ ଟେଲ୍ ଶିରାରେ ପ୍ୟୁରିଫାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକର ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା କିମ୍ବା ପୂର୍ବ ଚୟନ ରାଉଣ୍ଡରୁ CSFରୁ ନିଷ୍କାସିତ ଫେଜ୍ ପୁନଃ-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଫସଲ ଯଥାକ୍ରମେ 10 ମିନିଟ୍, 30 ମିନିଟ୍, 60 ମିନିଟ୍, 90 ମିନିଟ୍, 120 ମିନିଟ୍, 180 ମିନିଟ୍ ଏବଂ 240 ମିନିଟ୍‌ରେ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ ତିନୋଟି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନ ସମୟରେ ମୋଟ ଚାରୋଟି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଇନ ଭିଭୋ ପ୍ୟାନିଂ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ଦୁଇଟି ମନୋନୀତ ଶାଖାକୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ସଂରକ୍ଷଣ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ ଦୁଇଟି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ସମସ୍ତ ଫେଜ୍ ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ 454/ରୋଚେ ପାଇରୋସେକ୍ୱିନ୍ସିଂ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଶେଷ ଦୁଇଟି ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ CSF ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ସମସ୍ତ କ୍ଲୋନ୍ ମାନୁଆଲି କ୍ରମବଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚୟନରୁ ସମସ୍ତ ରକ୍ତ ଫେଜ୍ ମଧ୍ୟ 454/ରୋଚେ ପାଇରୋସେକ୍ୱିନ୍ସିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ, ଚୟନିତ ଫେଜ୍ଗୁଡ଼ିକୁ E. coli (BL5615) ରେ 500 cm2 ପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37°C ରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ଚୟନିତ ଏବଂ ମାନୁଆଲି କ୍ରମବଦ୍ଧ କ୍ଲୋନ୍ ଟିବି ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଫେଜ୍ ନିଷ୍କାସନ, ବିଶୋଧନ ଏବଂ ଏଣ୍ଡୋଟକ୍ସିନ୍ ଅପସାରଣ ପରେ (ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ) 300 μl ରେ 2×1010 ଫେଜ୍/ପଶୁକୁ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଗୋଟିଏ ଲାଞ୍ଜ ଶିରାରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା।
କ୍ରମ ତଥ୍ୟର ପୂର୍ବ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଏବଂ ଗୁଣାତ୍ମକ ଫିଲ୍ଟରିଂ। ବିକ୍ରେତା ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ର 454/ରୋଚେ ତଥ୍ୟକୁ ଏକ ବାଇନାରୀ ମାନକ ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ମ୍ୟାପ୍ ଫର୍ମାଟ୍ (sff) ରୁ ଏକ ପିଅର୍ସନ୍ ମାନବ ପଠନୀୟ ଫର୍ମାଟ୍ (fasta) ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ନିମ୍ନରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁଯାୟୀ ମାଲିକାନା C ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ଏବଂ ସ୍କ୍ରିପ୍ଟ (ଅପ୍ରକାଶିତ ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ଆହୁରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଥମିକ ତଥ୍ୟର ବିଶ୍ଳେଷଣରେ କଠୋର ବହୁ-ସ୍ତରୀୟ ଫିଲ୍ଟରିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ବୈଧ 12mer ଇନସର୍ଟ DNA କ୍ରମ ନଥିବା ପଠନଗୁଡ଼ିକୁ ଫିଲ୍ଟର କରିବା ପାଇଁ, ପଠନଗୁଡ଼ିକୁ କ୍ରମିକ ଭାବରେ ଆରମ୍ଭ ଲେବଲ୍ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ଷ୍ଟପ୍ ଲେବଲ୍ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ଏବଂ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଇନସର୍ଟ (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCGTCG) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଗ୍ଲୋବାଲ୍ ନିଡଲ୍ମ୍ୟାନ୍-ୱନ୍ସ୍ଚ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତି ସଂଯୁକ୍ତତା 31 ପାଇଁ 2ଟି ଅସଙ୍ଗତିକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ତେଣୁ, ଆରମ୍ଭ ଏବଂ ବନ୍ଦ ଟ୍ୟାଗ୍ ବିନା ପଠନ ଏବଂ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଇନସର୍ଟ ଧାରଣ କରୁଥିବା ପଠନ, ଅର୍ଥାତ୍, ଅନୁମୋଦିତ ସଂଖ୍ୟା ମେଳ ନ ଥିବା ସଂଖ୍ୟକ ସଂଖ୍ୟକକୁ ଅତିକ୍ରମ କରୁଥିବା ସଂଯୁକ୍ତତା, ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଅବଶିଷ୍ଟ ପାଠ୍ୟକ୍ରମ ପାଇଁ, ଆରମ୍ଭ ଚିହ୍ନରୁ ଏବଂ ଶେଷ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବିସ୍ତାରିତ N-mer DNA କ୍ରମ ମୂଳ ପାଠ୍ୟ କ୍ରମରୁ ଷ୍ଟପ୍ ଚିହ୍ନକୁ ଛିନ୍ନ କରି ଆହୁରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା (ଏଠାରେ "ସନ୍ନିବେଶ" ଭାବରେ ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଛି)। ଇନସର୍ଟର ଅନୁବାଦ ପରେ, ପ୍ରାଇମରର 5′ ଶେଷରେ ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟପ୍ କୋଡନ୍ ପରେ ଥିବା ଅଂଶ ଇନସର୍ଟରୁ ଅପସାରିତ ହୁଏ। ଏହା ସହିତ, ପ୍ରାଇମରର 3′ ଶେଷରେ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଡନ୍ ଆଡ଼କୁ ନେଇଯାଉଥିବା ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ମଧ୍ୟ ଅପସାରିତ ହୋଇଥିଲା। କେବଳ ପୃଷ୍ଠଭୂମି କ୍ରମ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ବାଦ ଦେବା ପାଇଁ, ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ୟାଟର୍ନ "PAG" ସହିତ ଆରମ୍ଭ ହେଉଥିବା ଅନୁବାଦିତ ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ମଧ୍ୟ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ 3 ରୁ କମ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅନୁବାଦ ଲମ୍ବ ସହିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଶେଷରେ, ଇନସର୍ଟ ପୁଲରେ ରିଡାଣ୍ଡାନ୍ସି ହଟାନ୍ତୁ ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅନନ୍ୟ ଇନସର୍ଟର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରନ୍ତୁ। ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣର ଫଳାଫଳରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (ସନ୍ନିବେଶ) ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର (ପଠିତ) ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିଗୁଡ଼ିକର ଏକ ତାଲିକା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ଥିଲା (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1c ଏବଂ 2)।
କ୍ରମ ସମାନତା ଅନୁସାରେ ଗୋଷ୍ଠୀ N-mer DNA ଇନସର୍ଟ: 454/Roche-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମ ତ୍ରୁଟି (ଯେପରିକି କ୍ରମ ହୋମୋପଲିମର ଏକ୍ସଟେନସନ ସହିତ ସମସ୍ୟା) ଦୂର କରିବା ଏବଂ କମ୍ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅନାବଶ୍ୟକତା ଦୂର କରିବା ପାଇଁ, ପୂର୍ବରୁ ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା N-mer DNA କ୍ରମ ଇନସର୍ଟ (ଇନ୍ସର୍ଟ) ସମାନତା ଅନୁସାରେ ସଜାଯାଇଥାଏ। ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଆଲଗୋରିଦମ ବ୍ୟବହାର କରି ଇନସର୍ଟ (2 ଅଣ-ମେଳ ଖାଉଥିବା ଆଧାର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅନୁମୋଦିତ): ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରଥମେ ସେମାନଙ୍କର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (ସର୍ବାଧିକରୁ ସର୍ବନିମ୍ନ) ଦ୍ୱାରା ସଜାଯାଇଥାଏ, ଏବଂ ଯଦି ସେଗୁଡ଼ିକ ସମାନ, ତେବେ ସେମାନଙ୍କର ଦ୍ୱିତୀୟ କ୍ରମ ଅନୁସାରେ ଲମ୍ବ (ସର୍ବାଧିକରୁ କ୍ଷୁଦ୍ରତମ) ଦ୍ୱାରା ସଜାଯାଇଥାଏ। ଏହିପରି, ସବୁଠାରୁ ବାରମ୍ବାର ଏବଂ ଦୀର୍ଘତମ ଇନସର୍ଟ ପ୍ରଥମ "ଗୋଷ୍ଠୀ"କୁ ପରିଭାଷିତ କରିଥାଏ। ଗୋଷ୍ଠୀ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିକୁ କୀ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଛି। ତାପରେ, ସଜାଯାଇଥିବା ତାଲିକାରେ ବାକି ଥିବା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଇନସର୍ଟକୁ ପେୟାରୱାଇଜ୍ ନିଡଲ୍ମ୍ୟାନ୍-ୱନ୍ସଚ୍ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟ ଦ୍ୱାରା ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଯୋଡାଯିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରାଯାଇଥିଲା। ଯଦି ଏକ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟରେ ମେଳ ନହେବା, ଇନସର୍ଟ କିମ୍ବା ବିଲୋପ ସଂଖ୍ୟା 2 ର ସୀମା ଅତିକ୍ରମ କରେ ନାହିଁ, ତେବେ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଏକ ଇନସର୍ଟ ଯୋଡାଯାଏ, ଏବଂ ସାମଗ୍ରିକ ଗୋଷ୍ଠୀ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି କେତେଥର ଇନସର୍ଟ ଯୋଡାଯାଇଥିଲା ତାହା ଦ୍ୱାରା ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଏ। ଏକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଯୋଡାଯାଇଥିବା ଇନସର୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ୟବହୃତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣରୁ ବାଦ ଦିଆଯାଏ। ଯଦି ପୂର୍ବରୁ ଥିବା ଗୋଷ୍ଠୀରେ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ଯୋଡାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, ତେବେ ଉପଯୁକ୍ତ ସନ୍ନିବେଶ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ଏକ ନୂତନ ଗୋଷ୍ଠୀ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ଏବଂ ବ୍ୟବହୃତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନିତ କରିବା ପାଇଁ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମକୁ ଏକ ନୂତନ ଗୋଷ୍ଠୀ ଗଠନ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିବାବେଳେ କିମ୍ବା ପୂର୍ବରୁ ଥିବା ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇପାରିଲେ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଶେଷ ହୁଏ। ସର୍ବପରି, ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ସ ଯୁକ୍ତ ଗୋଷ୍ଠୀଭୁକ୍ତ ସନ୍ନିବେଶଗୁଡ଼ିକୁ ଶେଷରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମ (ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ) ରେ ଅନୁବାଦ କରାଯାଏ। ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣର ଫଳାଫଳ ହେଉଛି ସନ୍ନିବେଶର ଏକ ସେଟ୍ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଅନୁରୂପ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯାହା କ୍ରମାଗତ ପଠନ ସଂଖ୍ୟା ତିଆରି କରେ (ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 2)।
ମୋଟିଫ୍ ଜେନେରେସନ୍: ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଏକ ତାଲିକା ଉପରେ ଆଧାର କରି, ନିମ୍ନରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି ସମସ୍ତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣ (aa) ଧାରଣ କରି ଏକ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ଲମ୍ବ 3 ର ପ୍ରତ୍ୟେକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏହାର ବିପରୀତ ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣ ସହିତ ସମସ୍ତ ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣ (ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍) ଧାରଣ କରି ଏକ ସାଧାରଣ ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ଅତ୍ୟଧିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ମୋଟିଫ୍ ଗୁଡ଼ିକର ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ କ୍ରମବଦ୍ଧ ଏବଂ ଅନାବଶ୍ୟକତା ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ତା’ପରେ, ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପାଇଁ, ଆମେ କମ୍ପ୍ୟୁଟେସନ୍ ଟୁଲ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ଏହାର ଉପସ୍ଥିତି ଯାଞ୍ଚ କରିଥିଲୁ। ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, ମିଳିଥିବା ମୋଟିଫ୍ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଧାରଣ କରୁଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯୋଡାଯାଇଥାଏ ଏବଂ ମୋଟିଫ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ମୋଟିଫ୍ ସହିତ ନିଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥାଏ ("ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା")। ମୋଟିଫ୍ ଜେନେରେସନ୍ର ଫଳାଫଳ ହେଉଛି ଏକ ଦ୍ୱି-ପରିମାଣୀୟ ଆରେ ଯେଉଁଥିରେ ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ (ମୋଟିଫ୍) ର ସମସ୍ତ ଘଟଣା ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ସମ୍ପୃକ୍ତ ମୂଲ୍ୟ ଥାଏ, ଯାହା କ୍ରମିକ ପଠନର ସଂଖ୍ୟା ଯାହା ପଠନଗୁଡ଼ିକୁ ଫିଲ୍ଟର, ଗୋଷ୍ଠୀଭୁକ୍ତ ଏବଂ ଅନୁବାଦିତ କରିବା ସମୟରେ ଅନୁରୂପ ମୋଟିଫ୍ ରେ ପରିଣାମ ଦିଏ। ଉପରେ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ମେଟ୍ରିକ୍ସ।
ମୋଟିଫ୍ ଏବଂ ଅନୁରୂପ ସ୍କାଟର୍ପ୍ଲଟ୍ ସଂଖ୍ୟାର ସାଧାରଣୀକରଣ: ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ବ୍ୟବହାର କରି ସାଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା
ଯେଉଁଠାରେ ni ହେଉଛି ବିଷୟ i ଧାରଣ କରିଥିବା ପଠନର ସଂଖ୍ୟା। ତେଣୁ, vi ନମୁନାରେ ମୋଟିଫ୍ i ଧାରଣ କରିଥିବା ପଠନର ପ୍ରତିଶତ ଆବୃତ୍ତି (କିମ୍ବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍) ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ଫିଶରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ଅଣ-ସାଧାରଣକୃତ ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ପାଇଁ P-ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ମୋଟିଭ୍ ସଂଖ୍ୟାର ସହସଂଯୋଗ ସମ୍ପର୍କରେ, ସ୍ପିୟରମ୍ୟାନଙ୍କ ସହସଂଯୋଗ R ସହିତ ସାଧାରଣକୃତ ମୋଟିଫ୍ ସଂଖ୍ୟା ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା।
ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀର ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥାନରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍‌ର ବିଷୟବସ୍ତୁକୁ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରିବା ପାଇଁ, ୱେବ୍ ଲୋଗୋଗ୍ରାମ୍ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମେ, 12-ମେର୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ର ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥାନରେ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍‌ର ବିଷୟବସ୍ତୁକୁ 20×12 ମାଟ୍ରିକ୍ସରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଏ। ତା'ପରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥାନରେ ସମାନ ଆପେକ୍ଷିକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଥିବା 1000 ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ର ଏକ ସେଟ୍ ଫାଷ୍ଟା-ସିକୋଏନ୍ସ୍ ଫର୍ମାଟରେ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଏ ଏବଂ ୱେବ୍-ଲୋଗୋ 3 ପାଇଁ ଇନପୁଟ୍ ଭାବରେ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଏ, ଯାହା ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଥାନରେ ଆପେକ୍ଷିକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁର ଏକ ଗ୍ରାଫିକାଲ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ ସୃଷ୍ଟି କରେ। ଏକ ଦିଆଯାଇଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପାଇଁ। ବହୁ-ପରିମାଣୀୟ ଡାଟାସେଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରିବା ପାଇଁ, R ରେ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଭାବରେ ବିକଶିତ ଉପକରଣ (biosHeatmap, ଏକ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପ୍ରକାଶିତ ହେବାକୁ ଥିବା R ପ୍ୟାକେଜ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ର ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ୟୁକ୍ଲିଡିଆନ୍ ଦୂରତା ମେଟ୍ରିକ୍ ସହିତ ୱାର୍ଡର ହାରିକାଲ୍ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ରରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ଡେଣ୍ଡ୍ରୋଗ୍ରାମଗୁଡ଼ିକୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ମୋଟିଫ୍ ସ୍କୋରିଂ ତଥ୍ୟର ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଫିଶର୍‌ଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ଅସ୍ୱାଭାବିକ ସ୍କୋରିଂ ପାଇଁ P ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା କିମ୍ବା ANOVA ବ୍ୟବହାର କରି ଅନ୍ୟ ଡାଟାସେଟ୍ ପାଇଁ P-ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ R ରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା।
ଚୟନିତ ଫେଜ୍ କ୍ଲୋନ୍ ଏବଂ ଇନସର୍ଟ ବିନା ଫେଜ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମାଧ୍ୟମରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା (2×1010 ଫେଜ୍/ପ୍ରାଣୀ 300 μl PBS ରେ)। ପରଫ୍ୟୁଜନ୍ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସ୍ଥିରୀକରଣର ଦଶ ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ, ସମାନ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ 100 μl DyLight594-ଲେବଲ୍ ଲେକ୍ଟିନ୍ (ଭେକ୍ଟର ଲାବୋରେଟୋରିଜ୍ ଇନକର୍ପୋରେଟେଡ୍, DL-1177) ସହିତ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା। ଫେଜ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦେବାର 60 ମିନିଟ୍ ପରେ, ମୂଷାମାନଙ୍କୁ 50 ମିଲି PBS ସହିତ ହୃଦୟ ମାଧ୍ୟମରେ ପର୍ଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା'ପରେ 50 ମିଲି 4% PFA/PBS ଦିଆଯାଇଥିଲା। ମସ୍ତିଷ୍କ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 4% PFA/PBS ରେ ରାତିସାରା ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4°C ରେ ରାତିସାରା 30% ସୁକ୍ରୋଜ୍ ରେ ବୁଡ଼ାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ OCT ମିଶ୍ରଣରେ ଫ୍ଲାସ୍ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଫ୍ରୋଜିନ୍ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିକାଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1% BSA ସହିତ ଅବରୋଧିତ 30 µm କ୍ରାଇଓସେକ୍ସନ୍ ଉପରେ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4 °C ତାପମାତ୍ରାରେ T7 ଫେଜ୍ (Novus NB 600-376A) ବିରୁଦ୍ଧରେ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ FITC-ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ରାତାରାତି ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଉଥିଲା। ଶେଷରେ, ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ PBS ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇ ଏକ କନଫୋକାଲ୍ ଲେଜର ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (Leica TCS SP5) ସହିତ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା।
ସର୍ବନିମ୍ନ 98% ଶୁଦ୍ଧତା ସହିତ ସମସ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ GenScript USA ଦ୍ୱାରା ସଂଶ୍ଳେଷିତ କରାଯାଇଥିଲା, ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଏବଂ ଲାଇଓଫାଇଲାଇଜେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। N-ଟର୍ମିନସରେ ଏକ ଅତିରିକ୍ତ ଟ୍ରିପଲ୍ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ସ୍ପେସର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ବାୟୋଟିନ୍ ବନ୍ଧା ହୋଇଥିଲା। ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ।
ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ (ସିଗ୍ମା S0677) କୁ 5-ଗୁଣ ସମକକ୍ଷ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍, ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ BACE1 ଇନହିବିଟୋରି ପେପ୍ଟାଇଡ୍, କିମ୍ବା 5-10% DMSO/PBS ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ BACE1 ଇନହିବିଟୋରି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ BACE1 ଇନହିବିଟୋରି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ମିଶ୍ରଣ (3:1 ଅନୁପାତ) ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପୂର୍ବରୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା। ମସ୍ତିଷ୍କ ଗହ୍ବର ଥିବା ମୂଷାର ଲାଞ୍ଜ ଶିରା ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏରେ 10 mg/kg ଡୋଜରେ ଶିରାଭ୍ୟନ୍ତର ଭାବରେ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍-ସଂଯୁକ୍ତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା।
ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍-ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର ସାନ୍ଦ୍ରତା ELISA ଦ୍ୱାରା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। Nunc Maxisorp ମାଇକ୍ରୋଟାଇଟର୍ ପ୍ଲେଟ୍ (ସିଗ୍ମା) କୁ 4°C ରେ 1.5 μg/ml ମାଉସ୍ ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଥର୍ମୋ, MA1-20011) ସହିତ ରାତାରାତି ଆବରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଅବରୋଧ କରିବା ପରେ (ବ୍ଲକିଂ ବଫର: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ଜେଲେଟିନ୍, 1% BSA) କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପ୍ଲେଟ୍‌କୁ 0.05% Tween-20/PBS (ୱାସ୍ ବଫର) ସହିତ 3 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ, CSF ଏବଂ ପ୍ଲାଜ୍ମା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ଲକିଂ ବଫର ସହିତ ମିଶା କୂଅରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା (ପ୍ଲାଜ୍ମା 1:10,000, CSF 1:115)। ତା'ପରେ ପ୍ଲେଟ୍‌କୁ ଡିଟେକ୍ସନ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (1 μg/ml, ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍-HRP, Novus NB120-7239) ସହିତ ରାତାରାତି 4°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ତିନୋଟି ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ ପରେ, TMB ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଦ୍ରବଣ (ରୋଚେ) ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। 1M H2SO4 ସହିତ ରଙ୍ଗ ବିକାଶ ବନ୍ଦ କରିବା ପରେ, 450 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପନ୍ତୁ।
ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍-ପେପ୍ଟାଇଡ୍-BACE1 ଇନହିବିଟର କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର କାର୍ଯ୍ୟ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ (ୱାକୋ, 294-64701) ଅନୁଯାୟୀ Aβ(1-40) ELISA ଦ୍ୱାରା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, CSF ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ମାନକ ଡାଇଲୁଏଣ୍ଟ (1:23) ରେ ପତଳା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ BNT77 କ୍ୟାପଚର ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଆବୃତ 96-କୂପ ପ୍ଲେଟରେ 4°C ରେ ରାତାରାତି ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପାଞ୍ଚଟି ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ ପରେ, HRP-ସଂଯୁକ୍ତ BA27 ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4°C ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ତା'ପରେ ପାଞ୍ଚଟି ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ ପରେ। TMB ଦ୍ରବଣରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ ଦ୍ୱାରା Aβ(1–40) ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। ଷ୍ଟପ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ ରଙ୍ଗ ବିକାଶ ବନ୍ଦ ହେବା ପରେ, 450 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପ। Aβ(1–40) ELISA ପୂର୍ବରୁ ପ୍ଲାଜ୍ମା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ କଠିନ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ନିଷ୍କାସନ କରାଯାଇଥିଲା। 96-କୂପ ପ୍ଲେଟରେ ପ୍ଲାଜ୍ମାକୁ 0.2% DEA (ସିଗ୍ମା) ରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା ଏବଂ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। SPE ପ୍ଲେଟଗୁଡ଼ିକୁ (Oasis, 186000679) ପାଣି ଏବଂ 100% ମିଥାନଲ୍ ସହିତ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ଧୋଇବା ପରେ, SPE ପ୍ଲେଟରେ ପ୍ଲାଜ୍ମା ନମୁନା ଯୋଡାଗଲା ଏବଂ ସମସ୍ତ ତରଳ ପଦାର୍ଥ ବାହାର କରାଗଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା (ପ୍ରଥମେ 5% ମିଥାନଲ୍ ସହିତ ତା'ପରେ 30% ମିଥାନଲ୍ ସହିତ) ଏବଂ 2% NH4OH/90% ମିଥାନଲ୍ ସହିତ ଏଲୁଏଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ଥିର N2 କରେଣ୍ଟରେ 99 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 55°C ରେ ଏଲୁଏଟ୍ ଶୁଖାଇବା ପରେ, ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ମାନକ ଡାଇଲୁଏଣ୍ଟ୍‌ରେ ହ୍ରାସ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ Aβ(1–40) ମାପ କରାଯାଇଥିଲା।
ଏହି ଲେଖାଟି କିପରି ଉଲ୍ଲେଖ କରିବେ: ୟୁରିଚ୍, ଇ. ଏଟ୍ ଅଲ୍। ଭିଭୋରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଟ୍ରାଞ୍ଜିଟ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କକୁ କାର୍ଗୋ ବିତରଣ। ବିଜ୍ଞାନ। 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)।
ଲିଖୋଟା ଜେ., ସ୍କଜୋରିଞ୍ଜ ଟି., ଥମସେନ୍ ଏଲବି ଏବଂ ମୁସ୍ ଟି. ଟାର୍ଗେଟେଡ୍ ଥେରାପି ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ମାକ୍ରୋମଲିକୁଲାର ଔଷଧର ବିତରଣ। ଜର୍ଣ୍ଣାଲ୍ ଅଫ୍ ନ୍ୟୁରୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
ବ୍ରାସନ୍ଜେଭିକ୍, ଆଇ., ଷ୍ଟେନବୁସ୍ଚ, ଏଚ୍.ଡବ୍ଲୁ., ସ୍ମିଟ୍ଜ, ସି., ଏବଂ ମାର୍ଟିନେଜ୍-ମାର୍ଟିନେଜ୍, ପି. ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ଦେଇ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଔଷଧର ବିତରଣ। ପ୍ରୋଗ୍ ନ୍ୟୁରୋବିଓଲ୍ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
ପାରଡ୍ରିଜ୍, WM ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା: ମସ୍ତିଷ୍କ ଔଷଧ ବିକାଶରେ ଏକ ବାଧା। NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)।
ଜୋହାନସନ, କେଇ, ଡଙ୍କନ, ଜେଏ, ଷ୍ଟୋପା, ଇଜି, ଏବଂ ବାର୍ଡ, ଏ. କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍-ସିଏସଏଫ ପାଥୱେ ମାଧ୍ୟମରେ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଉନ୍ନତ ଔଷଧ ବିତରଣ ଏବଂ ଲକ୍ଷ୍ୟକରଣ ପାଇଁ ସମ୍ଭାବନା। ଔଷଧ ଗବେଷଣା 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
ପାରଡ୍ରିଜ୍, WM ମସ୍ତିଷ୍କ ବିତରଣ ପାଇଁ ଆଣବିକ ଟ୍ରୋଜନ ହର୍ସ ସହିତ ଜୈବ ଔଷଧର ଆଧୁନିକୀକରଣ। ବାୟୋକଞ୍ଜଗ୍ କେମ୍ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
ପାରଡ୍ରିଜ୍, WM ରିସେପ୍ଟର-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପରିବହନ ରକ୍ତ-ମସ୍ତିଷ୍କ ବାଧା ଦେଇ। ଏଣ୍ଡୋକର୍ ରେଭ. 7, 314–330 (1986)।
ନିଓହ୍ନର, ଜେ. ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ। ମୋନୋଭାଲେଣ୍ଟ ମଲିକୁଲାର ସଟଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ମସ୍ତିଷ୍କ ପ୍ରବେଶ ଏବଂ ଚିକିତ୍ସାଗତ ଆଣ୍ଟିବଡିର ପ୍ରଭାବ ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ। ନ୍ୟୁରନ୍ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
ବିଏନ୍-ଲି, ଏନ. ଏଟ୍ ଅନ୍ୟମାନେ। ଟ୍ରାନ୍ସଫରିନ୍ ରିସେପ୍ଟର (TfR) ପରିବହନ TfR ଆଣ୍ଟିବଡିର ଆଫିନିଟି ଭାରିଆଣ୍ଟର ମସ୍ତିଷ୍କ ଗ୍ରହଣକୁ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ। J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।