Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ଆପଣଙ୍କୁ ଧନ୍ୟବାଦ। ଆପଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ବ୍ରାଉଜର ସଂସ୍କରଣରେ ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ଅଛି। ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ଆପଣଙ୍କୁ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଛୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ)। ଏହି ସମୟ ମଧ୍ୟରେ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ସାଇଟ୍‌କୁ ଷ୍ଟାଇଲ୍ ଏବଂ JavaScript ବିନା ରେଣ୍ଡର କରିବୁ।
AFEX ସହିତ ପ୍ରାକ୍-ଟ୍ରିଟେଡ୍ ହୋଇଥିବା ମକା ଷ୍ଟୋଭରରେ ସ୍ଥାୟୀ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଜଟିଳ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ନୂତନ ଇମ୍ୟୁନୋଲୋଜିକାର୍ଡି ଏବଂ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରିକ୍ ପଦ୍ଧତି। ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ବାୟୋମାସ ହେଉଛି ଜୀବାଶ୍ମ ଇନ୍ଧନର ଏକ ସ୍ଥାୟୀ ବିକଳ୍ପ ଏବଂ ଖାଦ୍ୟ, ଖାଦ୍ୟ, ଇନ୍ଧନ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଦ୍ରବ୍ୟ ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ଜୈବ ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା ବିକାଶ ପାଇଁ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ଏହି ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟାର ମୁଖ୍ୟ ହେଉଛି ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥରେ ଉପସ୍ଥିତ ଜଟିଳ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍‌କୁ ସରଳ ଚିନି ଯେପରିକି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ଜାଇଲୋଜ୍ ଏବଂ ଆରାବିନୋଜ୍‌ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିବା ପାଇଁ ମୂଲ୍ୟ-ପ୍ରତିଦ୍ୱନ୍ଦ୍ୱିତାମୂଳକ ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକର ବିକାଶ। କାରଣ ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ବାୟୋମାସ ବହୁତ ଜିଦ୍ଖୋର, ଏହାକୁ ଇଚ୍ଛିତ ଉତ୍ପାଦ ପାଇବା ପାଇଁ ଥର୍ମୋକେମିକାଲ୍ ଚିକିତ୍ସା (ଯଥା, ଆମୋନିଆ ଫାଇବର ଏକ୍ସଫୋଲିଏସନ୍ (AFEX), ଡିଲୁଏଟ୍ ଏସିଡ୍ (DA), ଆୟନିକ୍ ତରଳ (IL)) ଏବଂ ଜୈବିକ ଚିକିତ୍ସା (ଯଥା, ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋବାୟଲ୍ କିଣ୍ବନ) ମିଶ୍ରଣ କରିବାକୁ ପଡିବ। ତଥାପି, ଯେତେବେଳେ ବାଣିଜ୍ୟିକ କବକ ଏନଜାଇମଗୁଡ଼ିକୁ ଜଳବିଜ୍ଞାନ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ, ସେତେବେଳେ ଗଠିତ ଦ୍ରବଣୀୟ ଶର୍କରାର କେବଳ 75-85% ମନୋସାକାରାଇଡ ହୋଇଥାଏ, ଏବଂ ବାକି 15-25% ଦ୍ରବଣୀୟ, ଅଶାନ୍ତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ ହୋଇଥାଏ, ଯାହା ସର୍ବଦା ସୂକ୍ଷ୍ମଜୀବମାନଙ୍କ ପାଇଁ ଉପଲବ୍ଧ ହୁଏ ନାହିଁ। ପୂର୍ବରୁ, ଆମେ କାର୍ବନ ଏବଂ ଡାଏଟୋମାସିୟସ୍ ପୃଥିବୀ ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ଆକାର ବର୍ଜନ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫିର ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଦ୍ରବଣୀୟ ଜିଦ୍ଖୋର ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ସଫଳତାର ସହିତ ପୃଥକ ଏବଂ ବିଶୋଧିତ କରିଛୁ, ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଏନଜାଇମ ନିରୋଧୀ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକର ତଦନ୍ତ ମଧ୍ୟ କରିଛୁ। ଆମେ ପାଇଛୁ ଯେ ଉଚ୍ଚ ଡିଗ୍ରୀ ପଲିମରାଇଜେସନ୍ (DP) ମିଥାଇଲେଟେଡ୍ ୟୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ କମ DP ଏବଂ ନିରପେକ୍ଷ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ ତୁଳନାରେ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ ମିଶ୍ରଣ ସହିତ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରିବା ଅଧିକ କଷ୍ଟକର। ଏଠାରେ ଆମେ ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସେଟ୍ସରେ ଗ୍ଲାଇକାନ ବଣ୍ଡକୁ ଚିହ୍ନିତ କରିବା ପାଇଁ ଉଦ୍ଭିଦ ବାୟୋମାସ୍ ଗ୍ଲାଇକାନ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (mAbs) ବ୍ୟବହାର କରି ଗ୍ଲାଇକାନ ପ୍ରୋଫାଇଲିଂ, ମାଟ୍ରିକ୍ସ-ସହାୟିତ ଲେଜର ଡିସୋର୍ପସନ୍ ଆୟନାଇଜେସନ୍, ଟାଇମ୍-ଅଫ୍-ଫ୍ଲାଇଟ୍ ମାସ୍-ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ସମେତ ଅନେକ ଅତିରିକ୍ତ ପଦ୍ଧତିର ବ୍ୟବହାର ରିପୋର୍ଟ କରୁଛୁ। MALDI-TOF-MS) ନକାରାତ୍ମକ ଆୟନ, ଗ୍ୟାସ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ଏବଂ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (GC-MS) ର ଦ୍ୱିତୀୟ କ୍ଷୟ ପରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋସ୍କୋପି ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ ଗଠନ-ସୂଚନାମୂଳକ ଡାଇଗ୍ନୋଷ୍ଟିକ୍ ଶିଖର ବ୍ୟବହାର କରେ ଯାହା ଡେରିଭେଟାଇଜେସନ୍ ସହିତ ଏବଂ ବିନା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବଣ୍ଡକୁ ଚିହ୍ନିତ କରିଥାଏ। ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ (DP 4-20) ର ଛୋଟ ଆକାର ଯୋଗୁଁ, ଏହି ଅଣୁଗୁଡ଼ିକ mAb ବନ୍ଧନ ଏବଂ ଚରିତ୍ରୀକରଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରିବା କଷ୍ଟକର। ଏହି ସମସ୍ୟାକୁ ଦୂର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ନୂତନ ବାୟୋଟିନ୍ କଞ୍ଜୁଗେସନ୍-ଆଧାରିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଇମୋବିଲାଇଜେସନ୍ ପଦ୍ଧତି ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ ଯାହା ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ ପୃଷ୍ଠରେ ଅଧିକାଂଶ କମ୍ DP ଦ୍ରବଣୀୟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ କୁ ସଫଳତାର ସହିତ ଲେବଲ୍ କରିଥିଲା, ଯାହା ପରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଲାଇଗେସନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ଉଚ୍ଚ ଥ୍ରୁପୁଟ୍ mAb ସିଷ୍ଟମରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା। ଏହି ନୂତନ ପଦ୍ଧତି ଭବିଷ୍ୟତରେ ଅଧିକ ଉନ୍ନତ ଉଚ୍ଚ ଥ୍ରୁପୁଟ୍ ଗ୍ଲାଇକୋମ୍ ପରୀକ୍ଷାର ବିକାଶକୁ ସହଜ କରିବ ଯାହା ରୋଗ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ ବାୟୋମାର୍କରରେ ଉପସ୍ଥିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ କୁ ପୃଥକ ଏବଂ ଚିହ୍ନିତ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ।
କୃଷି, ବନୀକରଣ, ଘାସ ଏବଂ କାଠ ସାମଗ୍ରୀରେ ଗଠିତ ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ବାୟୋମାସ ହେଉଛି ଉଚ୍ଚ ମୂଲ୍ୟର ଉତ୍ପାଦ ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ଖାଦ୍ୟ, ଖାଦ୍ୟ, ଇନ୍ଧନ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ ସମେତ ଜୈବ-ଆଧାରିତ ଉତ୍ପାଦ ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଫିଡଷ୍ଟକ୍। ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥରେ ଉପସ୍ଥିତ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ (ଯେପରିକି ସେଲୁଲୋଜ୍ ଏବଂ ହେମିସେଲୁଲୋଜ୍) ରାସାୟନିକ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଏବଂ ଜୈବ ପରିବର୍ତ୍ତନ (ଯେପରିକି ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋବାୟଲ୍ ଫାର୍ମେସନ୍) ଦ୍ୱାରା ମୋନୋସାକାରାଇଡ୍‌ରେ ଡିପଲିମରାଇଜ୍ କରାଯାଏ। ସାଧାରଣ ପ୍ରାକ୍-ଉପଚାରରେ ଆମୋନିଆ ଫାଇବର ବିସ୍ତାର (AFEX), ଡିଲୁଏଟ୍ ଏସିଡ୍ (DA), ଆୟନିକ୍ ତରଳ (IL), ଏବଂ ବାଷ୍ପ ବିସ୍ଫୋରଣ (SE) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯାହା ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥ ଖୋଲି ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋଜ୍ ଉତ୍ପାଦନ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ରାସାୟନିକ ଏବଂ ତାପ ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରେ 3,4। ପଦାର୍ଥର ଜିଦ୍, 5. ଜୈବ-ଆଧାରିତ ଇନ୍ଧନ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ବାଣିଜ୍ୟିକ ସକ୍ରିୟ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍-ଧାରଣ କରିଥିବା ଏନଜାଇମ (CAZymes) ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋବାୟଲ୍ ଫାର୍ମେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଉଚ୍ଚ କଠିନ ଲୋଡରେ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ କରାଯାଏ 6।
ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମରେ CAZymes ଏନଜାଇମର ଏକ ଜଟିଳ ମିଶ୍ରଣରେ ଗଠିତ ଯାହା ଜଟିଳ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍-ଚିନି ବନ୍ଧନକୁ ସହଭାଗୀ ଭାବରେ ଭାଙ୍ଗି ମୋନୋସାକାରାଇଡ୍ ଗଠନ କରେ 2,7। ଆମେ ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ କରିଥିଲୁ ଯେ, କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ସହିତ ଲିଗନିନର ସୁଗନ୍ଧିତ ପଲିମରର ଜଟିଳ ନେଟୱାର୍କ ସେମାନଙ୍କୁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଅକ୍ଲାନ୍ତ କରିଥାଏ, ଯାହା ଅପୂର୍ଣ୍ଣ ଚିନି ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ନେଇଥାଏ, ଯାହା 15-25% ସେକ୍ସ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଜମା କରିଥାଏ ଯାହା ପ୍ରିଟ୍ରିଟେଡ୍ ବାୟୋମାସର ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ସମୟରେ ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ ନାହିଁ। ଏହା ବିଭିନ୍ନ ବାୟୋମାସ ପ୍ରିଟ୍ରିଟେସନ୍ ପଦ୍ଧତି ସହିତ ଏକ ସାଧାରଣ ସମସ୍ୟା। ଏହି ବାଧା ପାଇଁ କିଛି କାରଣ ମଧ୍ୟରେ ଜଳବିହୀନତା ସମୟରେ ଏନଜାଇମ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ, କିମ୍ବା ଉଦ୍ଭିଦ ବାୟୋମାସରେ ଚିନି ବନ୍ଧନ ଭାଙ୍ଗିବା ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକୀୟ ଏନଜାଇମର ଅନୁପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ନିମ୍ନ ସ୍ତର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡରେ ଚିନି ବନ୍ଧନ ଭଳି ଚିନିର ଗଠନ ଏବଂ ଗଠନାତ୍ମକ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ବୁଝିବା ଆମକୁ ଜଳବିହୀନତା ସମୟରେ ଚିନି ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ଉନ୍ନତ କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିବ, ଜୈବପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ପେଟ୍ରୋଲିୟମ୍-ଉତ୍ପନ୍ନ ଉତ୍ପାଦ ସହିତ ଖର୍ଚ୍ଚ-ପ୍ରତିଯୋଗୀ କରିବ।
କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟର ଗଠନ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ଏକ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜିଂ ଏବଂ ଏଥିପାଇଁ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (LC)11,12, ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ମ୍ୟାଗ୍ନେଟିକ୍ ରେଜୋନସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋସ୍କୋପି (NMR)13, କେପିଲାରି ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ (CE)14,15,16 ଏବଂ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS)17 ଭଳି ପଦ୍ଧତିର ମିଶ୍ରଣ ଆବଶ୍ୟକ। ,ଅଠର। ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ (MALDI-TOF-MS) ବ୍ୟବହାର କରି ଲେଜର ଡିସର୍ପସନ୍ ଏବଂ ଆୟନାଇଜେସନ୍ ସହିତ ଟାଇମ୍-ଅଫ୍-ଫ୍ଲାଇଟ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ଭଳି MS ପଦ୍ଧତି କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ଗଠନ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ବହୁମୁଖୀ ପଦ୍ଧତି। ସମ୍ପ୍ରତି, ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସଂଲଗ୍ନ ସ୍ଥିତି, ଆନୋମେରିକ୍ ବିନ୍ୟାସ, କ୍ରମ ଏବଂ ଶାଖା ସ୍ଥିତି 20, 21 ସହିତ ଜଡିତ ଫିଙ୍ଗରପ୍ରିଣ୍ଟ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ସୋଡିୟମ୍ ଆୟନ୍ ଆଡକ୍ଟଗୁଡ଼ିକର ଟକ୍କର-ପ୍ରେରିତ ଡିସୋସିଏସନ୍ (CID) ଟେଣ୍ଡେମ୍ MS ସର୍ବାଧିକ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି।
ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ବନ୍ଧନର ଗଭୀର ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଏକ ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ଉପକରଣ 22। ଏହି ପଦ୍ଧତି ଜଟିଳ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ସଂଯୋଗକୁ ବୁଝିବା ପାଇଁ ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ କୁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (mAbs) ବ୍ୟବହାର କରେ। ବିଭିନ୍ନ ସାକାରାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ବିଭିନ୍ନ ରେଖୀୟ ଏବଂ ଶାଖାଯୁକ୍ତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଥିବା 250 ରୁ ଅଧିକ mAbs ବିଶ୍ୱବ୍ୟାପୀ ଉପଲବ୍ଧ। 24। ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥର ଗଠନ, ଗଠନ ଏବଂ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ଚିହ୍ନିତ କରିବା ପାଇଁ ଅନେକ mAbs ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଛି, କାରଣ ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ ପ୍ରକାର, ଅଙ୍ଗ, ବୟସ, ବିକାଶ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଏବଂ ବୃଦ୍ଧି ପରିବେଶ 25,26 ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ ରହିଛି। ସମ୍ପ୍ରତି, ଏହି ପଦ୍ଧତି ଉଦ୍ଭିଦ ଏବଂ ପ୍ରାଣୀ ପ୍ରଣାଳୀରେ ଭେସିକଲ୍ ଜନସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଉପକୋଷୀୟ ମାର୍କର, ବିକାଶ ପର୍ଯ୍ୟାୟ କିମ୍ବା ପରିବେଶଗତ ଉଦ୍ଦୀପନା ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣିତ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ପରିବହନରେ ସେମାନଙ୍କର ଭୂମିକା ବୁଝିବା ପାଇଁ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି। ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ଏବଂ ଜାଇଲାନ୍‌ର କିଛି ଭିନ୍ନ ଗଠନ ମଧ୍ୟରେ ପେକ୍ଟିନ (P), ଜାଇଲାନ୍ (X), ମାନ୍ନାନ (M), ଜାଇଲୋଗ୍ଲୁକାନ୍ (XylG), ମିଶ୍ରିତ ବନ୍ଧନ ଗ୍ଲୁକାନ୍ସ (MLG), ଆରାବିନୋକ୍ସିଲାନ୍ (ArbX), ଗାଲାକ୍ଟୋମାନ୍ନାନ (GalG), ଗ୍ଲୁକୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍-ଆରାବିନୋକ୍ସିଲାନ୍ (GArbX) ଏବଂ ଆରାବିନୋ-ଗାଲାକ୍ଟାନ୍ (ArbG)29 ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ।
ତଥାପି, ଏହି ସମସ୍ତ ଗବେଷଣା ପ୍ରୟାସ ସତ୍ତ୍ୱେ, କେବଳ କିଛି ଅଧ୍ୟୟନ ଉଚ୍ଚ କଠିନ ଲୋଡ୍ (HSL) ଜଳବିଜ୍ଞାନ ସମୟରେ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସଂଚୟର ପ୍ରକୃତି ଉପରେ ଧ୍ୟାନ କେନ୍ଦ୍ରିତ କରିଛି, ଯେଉଁଥିରେ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ମୁକ୍ତି, ଜଳବିଜ୍ଞାନ ସମୟରେ ଅଲିଗୋମେରିକ୍ ଶୃଙ୍ଖଳ ଲମ୍ବ ପରିବର୍ତ୍ତନ, ବିଭିନ୍ନ ନିମ୍ନ DP ପଲିମର ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ବକ୍ର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ବଣ୍ଟନ 30,31,32। ଏହି ସମୟରେ, ଯଦିଓ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ଗଠନର ଏକ ବ୍ୟାପକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ଉପଯୋଗୀ ଉପକରଣ ଭାବରେ ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି, ତଥାପି ଆଣ୍ଟିବଡି ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ଜଳ-ଦ୍ରବଣୀୟ ନିମ୍ନ DP ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା କଷ୍ଟକର। 5-10 kDa ରୁ କମ୍ ଆଣବିକ ଓଜନ ସହିତ ଛୋଟ DP ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ELISA ପ୍ଲେଟ୍ 33, 34 ସହିତ ବାନ୍ଧି ହୁଏ ନାହିଁ ଏବଂ ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡିବା ପୂର୍ବରୁ ଧୋଇଯାଏ।
ଏଠାରେ, ପ୍ରଥମ ଥର ପାଇଁ, ଆମେ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି ଆଭିଡିନ୍-ଆବୃତ ପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ ଏକ ELISA ପରୀକ୍ଷା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଛୁ, ଯାହା ଗ୍ଲାଇକୋମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ସହିତ ଦ୍ରବଣୀୟ ରିଫ୍ରାକ୍ଟାରି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପାଇଁ ଏକ-ପଦକ୍ଷେପ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ମିଶ୍ରଣ କରିଥାଏ। ଗ୍ଲାଇକୋମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ରତି ଆମର ଦୃଷ୍ଟିକୋଣକୁ MALDI-TOF-MS ଏବଂ GC-MS ଆଧାରିତ ପରିପୂରକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଲିଙ୍କେଜ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ୱାରା ବୈଧ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ଡ ଚିନି ରଚନାର ଟ୍ରାଇମେଥାଇଲସିଲିଲ୍ (TMS) ଡେରିଭେଟାଇଜେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ଅଭିନବ ପଦ୍ଧତିକୁ ଭବିଷ୍ୟତରେ ଏକ ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୁପୁଟ୍ ପଦ୍ଧତି ଭାବରେ ବିକଶିତ କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ ଜୈବ ଚିକିତ୍ସା ଗବେଷଣାରେ ବ୍ୟାପକ ପ୍ରୟୋଗ ପାଇପାରିବ।
ଗ୍ଲାଇକୋସିଲେସନ ଭଳି ଏନଜାଇମ ଏବଂ ଆଣ୍ଟିବଡିର ଅନୁବାଦ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପରିବର୍ତ୍ତନ, 36 ସେମାନଙ୍କର ଜୈବିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ସେରମ୍ ପ୍ରୋଟିନର ଗ୍ଲାଇକୋସିଲେସନରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପ୍ରଦାହଜନକ ଆର୍ଥ୍ରାଇଟିସ୍‌ରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରେ, ଏବଂ ଗ୍ଲାଇକୋସିଲେସନରେ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ନିଦାନ ମାର୍କର ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ 37। ସାହିତ୍ୟରେ ବିଭିନ୍ନ ଗ୍ଲାଇକାନଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ରୋଗରେ ସହଜରେ ଦେଖାଯିବାର ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି, ଯେଉଁଥିରେ ପାକସ୍ଥଳୀ ଏବଂ ଯକୃତର ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ପ୍ରଦାହଜନକ ରୋଗ, ଭାଇରାଲ୍ ସଂକ୍ରମଣ, ଡିମ୍ବାଶୟ, ସ୍ତନ ଏବଂ ପ୍ରୋଷ୍ଟେଟ୍ କର୍କଟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ 38,39,40। ଆଣ୍ଟିବଡି-ଆଧାରିତ ଗ୍ଲାଇକାନ ELISA ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ଗ୍ଲାଇକାନର ଗଠନକୁ ବୁଝିବା ଜଟିଳ MS ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର ନକରି ରୋଗ ନିର୍ଣ୍ଣୟରେ ଅତିରିକ୍ତ ବିଶ୍ୱାସ ପ୍ରଦାନ କରିବ।
ଆମର ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ପ୍ରିଟ୍ରିମେଣ୍ଟ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ପରେ ଜିଦ୍ଖୋର ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅଣହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜିଡ୍ ରହିଗଲା (ଚିତ୍ର 1)। ଆମର ପୂର୍ବ ପ୍ରକାଶିତ କାର୍ଯ୍ୟରେ, ଆମେ AFEX-ପ୍ରିଟ୍ରିଟେଡ୍ କର୍ଣ୍ଣ ଷ୍ଟୋଭର ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ (ACSH)8 ରୁ ଜିଦ୍ଖୋରାଇଡ୍ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ସକ୍ରିୟ ଚାରିକୋଲ ସଲିଡ୍-ଫେଜ୍ ନିଷ୍କାସନ ପଦ୍ଧତି ବିକଶିତ କରିଥିଲୁ। ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ନିଷ୍କାସନ ଏବଂ ପୃଥକୀକରଣ ପରେ, ଜିଦ୍ଖୋରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଆକାର ବର୍ଜନ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (SEC) ଦ୍ୱାରା ଆହୁରି ଭାଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଆଣବିକ ଓଜନ କ୍ରମରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରିଟ୍ରିମେଣ୍ଟରୁ ମୁକ୍ତ ହୋଇଥିବା ଚିନି ମନୋମର୍ ଏବଂ ଅଲିଗୋମରଗୁଡ଼ିକୁ ଚିନି ରଚନା ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରିଟ୍ରିମେଣ୍ଟ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ ଚିନି ଅଲିଗୋମରଗୁଡ଼ିକର ବିଷୟବସ୍ତୁ ତୁଳନା କରିବା ସମୟରେ, ଜିଦ୍ଖୋର ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଉପସ୍ଥିତି ବାୟୋମାସକୁ ମୋନୋସାକାରାଇଡ୍‌ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିବାରେ ଏକ ସାଧାରଣ ସମସ୍ୟା ଏବଂ ଏହା ଅତି କମରେ 10-15% ଏବଂ ଏପରିକି 18% ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଚିନି ଉତ୍ପାଦନ ହ୍ରାସ କରିପାରେ। ଏହି ପଦ୍ଧତିଟି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶର ଆହୁରି ବଡ଼ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ ACH ଏବଂ ଏହାର ପରବର୍ତ୍ତୀ ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡ଼ିକୁ ବିଭିନ୍ନ ଆଣବିକ ଓଜନ ସହିତ ଏହି କାର୍ଯ୍ୟରେ ଜିଦ୍ଖୋରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ବର୍ଣ୍ଣନ ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ସାମଗ୍ରୀ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ପ୍ରିଟ୍ରିଟ୍ମେଣ୍ଟ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ପରେ, ସ୍ଥାୟୀ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅଣହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜିଡ୍ ରହିଲା। ଏଠାରେ (A) ଏକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପୃଥକୀକରଣ ପଦ୍ଧତି ଯେଉଁଥିରେ ସକ୍ରିୟ କାର୍ବନ ଏବଂ ଡାଏଟୋମାସିୟସ୍ ପୃଥିବୀର ଏକ ପ୍ୟାକ୍ ବେଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ଗୁଡ଼ିକୁ AFEX-ପ୍ରିଟ୍ରିଟେଡ୍ କର୍ଣ୍ଣ ସ୍ଟୋଭର ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ (ACSH) ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଏ; (B) ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପୃଥକୀକରଣ ପାଇଁ ପଦ୍ଧତି। ଆକାର ବର୍ଜନ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (SEC) ଦ୍ୱାରା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଆହୁରି ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା; (C) ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରିଟ୍ରିଟ୍ମେଣ୍ଟରୁ ମୁକ୍ତ ହୋଇଥିବା ସାକାରାଇଡ୍ ମୋନୋମର୍ ଏବଂ ଅଲିଗୋମର୍ (ଡିଲୁଟେଡ୍ ଏସିଡ୍: DA, ଆୟନିକ୍ ତରଳ: IL ଏବଂ AFEX)। ଏଞ୍ଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଅବସ୍ଥା: 25% (w/w) ର ଉଚ୍ଚ କଠିନ ଲୋଡିଂ (ପ୍ରାୟ 8% ଗ୍ଲୁକାନ୍ ଲୋଡିଂ), 96 ଘଣ୍ଟା ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍, 20 mg/g ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ୍ ଲୋଡିଂ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ଅନୁପାତ) ଏବଂ (D) AFEX ପ୍ରି-ଟ୍ରିଟେଡ୍ କର୍ଣ୍ଣ ସ୍ଟୋଭର (ACS) ରୁ ମୁକ୍ତ ହୋଇଥିବା ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ଜାଇଲୋଜ୍ ଏବଂ ଆରାବିନୋଜ୍ ର ଚିନି ମୋନୋମର୍ ଏବଂ ଅଲିଗୋମର୍।
କଠିନ ବାୟୋମାସ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରୁ ପୃଥକ ହୋଇଥିବା ନିଷ୍କାସନରେ ଗ୍ଲାଇକାନଗୁଡ଼ିକର ଏକ ବ୍ୟାପକ ଗଠନମୂଳକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଗ୍ଲାଇକାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏକ ଉପଯୋଗୀ ଉପକରଣ ଭାବରେ ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି। ତଥାପି, ଏହି ପାରମ୍ପରିକ ପଦ୍ଧତି 41 ବ୍ୟବହାର କରି ଜଳ-ଦ୍ରବଣୀୟ ସାକାରାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ଅଣଦେଖା କରାଯାଏ କାରଣ କମ୍ ଆଣବିକ ଓଜନ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ELISA ପ୍ଲେଟରେ ସ୍ଥିର କରିବା କଷ୍ଟକର ଏବଂ ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡିବା ପୂର୍ବରୁ ଧୋଇ ଦିଆଯାଏ। ତେଣୁ, ଆଣ୍ଟିବଡି ବାଇଣ୍ଡିଂ ଏବଂ ଚରିତ୍ରୀକରଣ ପାଇଁ, ଆଭିଡିନ-ଆବରଣିତ ELISA ପ୍ଲେଟଗୁଡ଼ିକରେ ଦ୍ରବଣୀୟ, ଅଣ-ଅନୁପାଳିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ଆବରଣ କରିବା ପାଇଁ ଏକ-ପଦକ୍ଷେପ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ପଦ୍ଧତିଟି ଆମର ପୂର୍ବରୁ ଉତ୍ପାଦିତ ACSH ଏବଂ ଏହାର ଆଣବିକ ଓଜନ (କିମ୍ବା ପଲିମରାଇଜେସନର ଡିଗ୍ରୀ, DP) ଉପରେ ଆଧାରିତ ଏକ ଭଗ୍ନାଂଶ ବ୍ୟବହାର କରି ପରୀକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା। କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟର ହ୍ରାସକାରୀ ଶେଷକୁ ବାୟୋଟିନ-LC-ହାଇଡ୍ରାଜାଇଡ ଯୋଡ଼ି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ ବାଇଣ୍ଡିଂ ଆଫିନେସି ବୃଦ୍ଧି କରିବା ପାଇଁ ଏକ-ପଦକ୍ଷେପ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2)। ଦ୍ରବଣରେ, ହ୍ରାସକାରୀ ଶେଷକୁ ହେମିଆସେଟାଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀ ହାଇଡ୍ରାଜାଇଡ ବାୟୋଟିନ-LC-ହାଇଡ୍ରାଜାଇଡ ଗୋଷ୍ଠୀ ସହିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରି ହାଇଡ୍ରାଜୋନ ବନ୍ଧନ ଗଠନ କରେ। ହ୍ରାସକାରୀ ଏଜେଣ୍ଟ NaCNBH3 ର ଉପସ୍ଥିତିରେ, ହାଇଡ୍ରାଜୋନ୍ ବନ୍ଧନକୁ ଏକ ସ୍ଥିର ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଶେଷ ଉତ୍ପାଦରେ ହ୍ରାସ କରାଯାଏ। ଚିନି ହ୍ରାସକାରୀ ଶେଷର ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ, ନିମ୍ନ DP ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ELISA ପ୍ଲେଟ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧିବା ସମ୍ଭବ ହୋଇଥିଲା, ଏବଂ ଆମର ଅଧ୍ୟୟନରେ ଏହା ଗ୍ଲାଇକାନ୍-ଲକ୍ଷ୍ୟଯୁକ୍ତ mAbs ବ୍ୟବହାର କରି ଆଭିଡିନ୍-ଆବରଣିତ ପ୍ଲେଟ୍‌ରେ କରାଯାଇଥିଲା।
ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପାଇଁ ELISA ଉପରେ ଆଧାରିତ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକର ସ୍କ୍ରିନିଂ। ଏଠାରେ (A) ନ୍ୟୁଟ୍ରାଭିଡିନ୍ ଆବୃତ ପ୍ଲେଟ୍‌ରେ ଗ୍ଲାଇକାନ୍-ଲକ୍ଷ୍ୟଯୁକ୍ତ mAbs ସହିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ର ମିଳିତ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ELISA ସ୍କ୍ରିନିଂ ଏବଂ (B) ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକର ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ପାଇଁ ଏକ-ପଦକ୍ଷେପ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଦେଖାଏ।
ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଆଭିଡିନ୍-ଆବୃତ ପ୍ଲେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡିରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ଆଲୋକ ଏବଂ ସମୟ-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ମାଧ୍ୟମରେ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଆଣ୍ଟିବଡି ବାଇଣ୍ଡିଂ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ହେବା ପରେ, ପ୍ଲେଟ୍ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରିବା ପାଇଁ TMB ସବ୍ଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ। ଶେଷରେ ସଲଫ୍ୟୁରିକ୍ ଏସିଡ୍ ସହିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବନ୍ଦ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଣ୍ଟିବଡି-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରସ୍-ଲିଙ୍କିଂ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆଣ୍ଟିବଡିର ବନ୍ଧନ ଶକ୍ତି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ELISA ରିଡର ବ୍ୟବହାର କରି ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ପ୍ଲେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପରୀକ୍ଷଣର ବିବରଣୀ ଏବଂ ପାରାମିଟର ପାଇଁ, "ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି" ସମ୍ବନ୍ଧିତ ବିଭାଗ ଦେଖନ୍ତୁ।
ଆମେ ACSH ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଦ୍ରବଣୀୟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଏବଂ ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସେଟ୍ସରୁ ପୃଥକ ଅଶୋଧିତ ଏବଂ ପୃଥକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୟୋଗ ପାଇଁ ଏହି ନୂତନ ବିକଶିତ ପଦ୍ଧତିର ଉପଯୋଗିତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁ। ଚିତ୍ର 3 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି, ବାୟୋଆସିଲେଟେଡ୍ ଗ୍ଲାଇକୋମ ପରୀକ୍ଷା ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ACSH ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ ଏପିଟୋପ୍-ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ ଜାଇଲାନ୍ ସାଧାରଣତଃ ୟୁରୋନିକ୍ (U) କିମ୍ବା ମିଥାଇଲୁରୋନିକ୍ (MeU) ଏବଂ ପେକ୍ଟିକ ଆରାବିନୋଗାଲାକ୍ଟାନଗୁଡ଼ିକ। ସେମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ ଅଧିକାଂଶ ଅଣ-ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ଡ କଠିନ (UHS)43 ର ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଉପରେ ଆମର ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନରେ ମଧ୍ୟ ମିଳିଥିଲା।
କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନକୁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ଏକ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି ରିକାଲସିଟ୍ରାଣ୍ଟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଏପିଟୋପ୍ସ ଚିହ୍ନଟ। "ନିରପେକ୍ଷ" ଭଗ୍ନାଂଶ ହେଉଛି ACN ଭଗ୍ନାଂଶ ଏବଂ "ଏସିଡିକ୍" ଭଗ୍ନାଂଶ ହେଉଛି FA ଭଗ୍ନାଂଶ। ହିଟ୍ ମ୍ୟାପ୍‌ରେ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ଲାଲ ରଙ୍ଗ ଅଧିକ ଏପିଟୋପ୍ କଣ୍ଟେଣ୍ଟକୁ ସୂଚିତ କରେ, ଏବଂ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ନୀଳ ରଙ୍ଗ ଏକ ଖାଲି ପୃଷ୍ଠଭୂମିକୁ ସୂଚିତ କରେ। ସ୍କେଲରେ ରଙ୍ଗ ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଫର୍ମୁଲେସନ୍ N=2 ପାଇଁ କଞ୍ଚା OD ମୂଲ୍ୟ ଉପରେ ଆଧାରିତ। ଆଣ୍ଟିବଡି ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ ମୁଖ୍ୟ ଏପିଟୋପ୍ ଡାହାଣ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଦେଖାଯାଇଛି।
ଏହି ଅଣ-ସେଲୁଲୋଜ୍ ଗଠନଗୁଡ଼ିକୁ ପରୀକ୍ଷିତ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ୍ ମିଶ୍ରଣରେ ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ ସେଲୁଲେଜ୍ ଏବଂ ହେମିସେଲୁଲେଜ୍ ଦ୍ୱାରା ବିଭାଜିତ କରାଯାଇପାରିଲା ନାହିଁ, ଯେଉଁଥିରେ ସର୍ବାଧିକ ବ୍ୟବହୃତ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ତେଣୁ, ସେମାନଙ୍କର ଜଳବିଜ୍ଞାନ ପାଇଁ ନୂତନ ସହାୟକ ଏନଜାଇମ୍ ଆବଶ୍ୟକ। ଆବଶ୍ୟକୀୟ ଅଣ-ସେଲୁଲୋଜ୍ ଆସେସୋରି ଏନଜାଇମ୍ ବିନା, ଏହି ଅଣ-ସେଲୁଲୋଜ୍ ବନ୍ଧଗୁଡ଼ିକ ମନୋସାକାରାଇଡ୍‌ରେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ରୋକିଥାଏ, ଯଦିଓ ସେମାନଙ୍କର ମୂଳ ଚିନି ପଲିମରଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ କ୍ଷୁଦ୍ର ଖଣ୍ଡରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ କରାଯାଏ ଏବଂ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ୍ ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଏ।
ସଙ୍କେତ ବଣ୍ଟନ ଏବଂ ଏହାର ବନ୍ଧନ ଶକ୍ତିର ଅଧିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ବାନ୍ଧନ ଏପିଟୋପ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଉଚ୍ଚ DP ଚିନି ଭଗ୍ନାଂଶ (A, B, C, DP 20+ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ) ରେ କମ୍ ଥିଲା ଯାହା ଡାଇମରରେ କମ୍ DP ଭଗ୍ନାଂଶ (D, E, F, DP) ତୁଳନାରେ କମ୍ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 1)। ଅଣ-ସେଲ୍ୟୁଲୋଜ୍ ଏପିଟୋପ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ ଏସିଡ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ନିରପେକ୍ଷ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ସାଧାରଣ। ଏହି ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକ ଆମର ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ପ୍ୟାଟର୍ନ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ, ଯେଉଁଠାରେ ଉଚ୍ଚ DP ଏବଂ ଏସିଡ୍ ଅଂଶ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲିସିସ୍ ପ୍ରତି ଅଧିକ ପ୍ରତିରୋଧୀ ଥିଲେ। ତେଣୁ, ଅଣ-ସେଲ୍ୟୁଲୋଜ୍ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ଏପିଟୋପ୍ସ ଏବଂ U ଏବଂ MeU ପ୍ରତିସ୍ଥାପନର ଉପସ୍ଥିତି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସ୍ଥିରତାରେ ବହୁତ ଯୋଗଦାନ ଦେଇପାରେ। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯିବା ଉଚିତ ଯେ ବନ୍ଧନ ଏବଂ ଚିହ୍ନଟ ଦକ୍ଷତା କମ୍ DP ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ସମସ୍ୟାପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇପାରେ, ବିଶେଷକରି ଯଦି ଏପିଟୋପ୍ ଏକ ଡାଇମେରିକ୍ କିମ୍ବା ଟ୍ରାଇମେରିକ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ହୋଇଥାଏ। ଏହାକୁ ବିଭିନ୍ନ ଲମ୍ବ ବିଶିଷ୍ଟ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ ବ୍ୟବହାର କରି ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇପାରିବ, ପ୍ରତ୍ୟେକଟିରେ କେବଳ ଗୋଟିଏ ଏପିଟୋପ୍ ଥାଏ ଯାହା ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ mAb ସହିତ ବନ୍ଧନ କରିଥାଏ।
ତେଣୁ, ଗଠନ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କିଛି ପ୍ରକାରର ଅସ୍ଥାୟୀ ବନ୍ଧନ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ବ୍ୟବହୃତ ଆଣ୍ଟିବଡିର ପ୍ରକାର, ଉପଯୁକ୍ତ ବନ୍ଧନ ଢାଞ୍ଚା ଏବଂ ଏହା ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ସଙ୍କେତର ଶକ୍ତି (ସର୍ବାଧିକ ଏବଂ ସର୍ବନିମ୍ନ ପ୍ରଚୁର) ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି, ନୂତନ ସଙ୍କେତଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ ଅଧିକ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଗ୍ଲାଇକୋକନଭର୍ସନ ପାଇଁ ସଙ୍କେତ ମିଶ୍ରଣରେ ଅର୍ଦ୍ଧ-ମାଣାାତ୍ମକ ଭାବରେ ଯୋଡାଯାଇପାରିବ। ACSH ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ସର ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ ନେଇ, ଆମେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ବାୟୋମାସ ସାମଗ୍ରୀ ପାଇଁ ଗ୍ଲାଇକାନ ବଣ୍ଡର ଏକ ଡାଟାବେସ୍ ତିଆରି କରିପାରିବା। ଏଠାରେ ଏହା ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯିବା ଉଚିତ ଯେ ଆଣ୍ଟିବଡିର ବିଭିନ୍ନ ଆପତ୍ତିକୁ ବିଚାରକୁ ନିଆଯିବା ଉଚିତ, ଏବଂ ଯଦି ସେମାନଙ୍କର ଆପତ୍ତି ଅଜଣା, ତେବେ ଏହା ବିଭିନ୍ନ ଆଣ୍ଟିବଡିର ସଙ୍କେତ ତୁଳନା କରିବା ସମୟରେ କିଛି ଅସୁବିଧା ସୃଷ୍ଟି କରିବ। ଏହା ସହିତ, ସମାନ ଆଣ୍ଟିବଡି ପାଇଁ ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲାଇକାନ ବଣ୍ଡର ତୁଳନା ସର୍ବୋତ୍ତମ ଭାବରେ କାମ କରିପାରେ। ଏହି ଜିଦ୍ଖୋର ବନ୍ଧନଗୁଡ଼ିକୁ ତା'ପରେ CAZyme ଡାଟାବେସ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ କରାଯାଇପାରିବ, ଯେଉଁଠାରୁ ଆମେ ସଙ୍କେତଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବା, ପ୍ରାର୍ଥୀ ସଙ୍କେତଗୁଡ଼ିକୁ ଚୟନ କରିପାରିବା ଏବଂ ସଙ୍କେତ ଭାଙ୍ଗିବା ସଙ୍କେତ ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷା କରିପାରିବା, କିମ୍ବା ଜୈବ ରିଫାଇନାରୀଗୁଡ଼ିକରେ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଏହି ସଙ୍କେତଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରକାଶ କରିବା ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋବାୟଲ୍ ସିଷ୍ଟମ ବିକାଶ କରିପାରିବୁ।
ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସେଟ୍ସରେ ଉପସ୍ଥିତ କମ୍ ଆଣବିକ ଓଜନ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ଇମ୍ୟୁନୋଲୋଜିକାଲ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ କିପରି ବିକଳ୍ପ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକର ପରିପୂରକ ତାହା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ସମାନ ପ୍ୟାନେଲ୍ (ଚିତ୍ର 5) ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅଂଶରେ GC-MS ଉପରେ ଆଧାରିତ TMS-ପ୍ରାପ୍ତ ସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର MALDI (ଚିତ୍ର 4, S1-S8) ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଗଣ ବଣ୍ଟନ ଉଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଗଠନ ସହିତ ମେଳ ଖାଉଛି କି ନାହିଁ ତୁଳନା କରିବା ପାଇଁ MALDI ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ଚିତ୍ର 4 ରେ ନିରପେକ୍ଷ ଉପାଦାନ ACN-A ଏବଂ ACN-B ର MC ଦେଖାଯାଇଛି। ACN-A ବିଶ୍ଳେଷଣ DP 4-8 (ଚିତ୍ର 4) ରୁ DP 22 (ଚିତ୍ର S1) ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପେଣ୍ଟୋଜ୍ ଶର୍କରାର ଏକ ପରିସରକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି, ଯାହାର ଓଜନ MeU-xylan oligosaccharides ସହିତ ସମାନ। ACN-B ବିଶ୍ଳେଷଣ DP 8-15 ସହିତ ପେଣ୍ଟୋଜ୍ ଏବଂ ଗ୍ଲୁକୋକ୍ସାଇଲାନ୍ ସିରିଜ୍ ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି। ଚିତ୍ର S3 ପରି ପରିପୂରକ ସାମଗ୍ରୀରେ, FA-C ଏସିଡିକ୍ ମୋଇଟି ମାସ୍ ବିତରଣ ମାନଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ 8-15 ର DP ସହିତ (Me)U ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ ପେଣ୍ଟୋଜ୍ ଶର୍କରାର ଏକ ପରିସର ଦର୍ଶାଉଛି ଯାହା ELISA-ଆଧାରିତ mAb ସ୍କ୍ରିନିଂରେ ମିଳୁଥିବା ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ ଜାଇଲାନ୍ସ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ। ଏପିଟୋପ୍ସ ସ୍ଥିର।
ACS ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଦ୍ରବଣୀୟ ଅଣ-ଅନୁପାଳିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ସର MALDI-MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍। ଏଠାରେ, (A) ACN-A କମ୍ ଓଜନ ପରିସର ଭଗ୍ନାଂଶ ଯେଉଁଥିରେ ମିଥାଇଲେଟେଡ୍ ୟୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ (DP 4-8) ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ ଗ୍ଲୁକୁରୋକ୍ସିଲାନ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଏବଂ (B) ACN-B ଜାଇଲାନ୍ ଏବଂ ମିଥାଇଲେଟେଡ୍ ୟୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଗ୍ଲୁକୁରୋକ୍ସିଲାନ୍ (DP 8-15) ସହିତ ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ।
ରିଫ୍ରାକ୍ଟୋରୀ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ର ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ୍ୟର ଗଠନର ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଏଠାରେ (A) GC-MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ବିଭିନ୍ନ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶର TMS ସାକାରାଇଡ୍ ରଚନା। (B) ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ରେ ଉପସ୍ଥିତ ବିଭିନ୍ନ TMS-ପ୍ରାପ୍ତ ଚିନିର ଗଠନ। ACN - ନିରପେକ୍ଷ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଆସେଟୋନିଟ୍ରାଇଲ୍ ଭଗ୍ନାଂଶ ଏବଂ FA - ଏସିଡ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଫେରୁଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶ।
ଚିତ୍ର S9 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶର LC-MS ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଆଉ ଏକ ଆକର୍ଷଣୀୟ ନିଷ୍କର୍ଷ ବାହାରିଥିଲା ​​(ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନିକ୍ ପରିପୂରକ ସାମଗ୍ରୀରେ ଦେଖାଯାଇପାରିବ)। ACN-B ଭଗ୍ନାଂଶର ଲାଇଗେସନ୍ ସମୟରେ ହେକ୍ସୋଜ୍ ଏବଂ -OAc ଗୋଷ୍ଠୀର ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ବାରମ୍ବାର ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା। ଏହି ନିଷ୍କର୍ଷ କେବଳ ଗ୍ଲାଇକୋମ୍ ଏବଂ MALDI-TOF ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ଖଣ୍ଡନକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ ନାହିଁ, ବରଂ ପ୍ରିଟ୍ରିଟେଡ୍ ଲିଗ୍ନୋସେଲୁଲୋସିକ୍ ବାୟୋମାସରେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ଡେରିଭେଟିଭ୍ ବିଷୟରେ ନୂତନ ସୂଚନା ମଧ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରେ।
ଆମେ TMS ଚିନି ଡେରିଭେଟାଇଜେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶର ଚିନି ଗଠନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। GC-MS ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶରେ ନ୍ୟୁରାଲ୍ (ଅଣ-ଡେରିଭେଟିଭ୍) ଏବଂ ଏସିଡିକ୍ ଶର୍କରା (GluA ଏବଂ GalA) ର ଗଠନ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 5)। ଗ୍ଲୁକୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ ଏସିଡିକ୍ ଉପାଦାନ C ଏବଂ D ରେ ମିଳିଥାଏ, ଯେତେବେଳେ ଗାଲାକ୍ଟୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ ଏସିଡିକ୍ ଉପାଦାନ A ଏବଂ B ରେ ମିଳିଥାଏ, ଯାହା ଉଭୟ ଏସିଡିକ୍ ଶର୍କରାର ଉଚ୍ଚ DP ଉପାଦାନ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ କେବଳ ଆମର ELISA ଏବଂ MALDI ତଥ୍ୟକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ ନାହିଁ, ବରଂ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସଂଗ୍ରହର ଆମର ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନ ସହିତ ମଧ୍ୟ ସୁସଙ୍ଗତ। ତେଣୁ, ଆମେ ବିଶ୍ୱାସ କରୁ ଯେ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ର ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ELISA ସ୍କ୍ରିନିଂ ବ୍ୟବହାର କରି ଆଧୁନିକ ଇମ୍ୟୁନୋଲୋଜିକାଲ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ଜୈବିକ ନମୁନାରେ ଦ୍ରବଣୀୟ ରିକାଲ୍ସିଟ୍ରାଣ୍ଟ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ।
ELISA-ଆଧାରିତ mAb ସ୍କ୍ରିନିଂ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକୁ ଅନେକ ଭିନ୍ନ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ୱାରା ବୈଧ କରାଯାଇଥିବାରୁ, ଆମେ ଏହି ନୂତନ ପରିମାଣାତ୍ମକ ପଦ୍ଧତିର ସମ୍ଭାବନାକୁ ଆହୁରି ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ଚାହୁଁଥିଲୁ। ଦୁଇଟି ବାଣିଜ୍ୟିକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ଏବଂ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରି ଏକ ନୂତନ mAb ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି କିଣାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରୀକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା। ଚିତ୍ର 6 ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ବନ୍ଧନ ସଙ୍କେତ ଏବଂ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତାର ଲଗ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ମଧ୍ୟରେ ଏକ ରେଖୀୟ ସମ୍ପର୍କ ଦର୍ଶାଉଛି, ଯାହା ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲାଙ୍ଗମୁଇର ଶୋଷଣ ମଡେଲକୁ ସୂଚାଇଥାଏ। mAbs ମଧ୍ୟରେ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ଏବଂ CCRC-M151 XHE ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ, ଏବଂ CCRC-M108, CCRC-M109, ଏବଂ LM11 1 nm ରୁ 100 nano ପରିସର ମଧ୍ୟରେ A2XX ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ। ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ ଆଣ୍ଟିବଡିର ସୀମିତ ଉପଲବ୍ଧତା ଯୋଗୁଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ସହିତ ସୀମିତ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଏଠାରେ ଏହା ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯିବା ଉଚିତ ଯେ କିଛି ଆଣ୍ଟିବଡି ଏକ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ ସମାନ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପ୍ରତି ବହୁତ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରନ୍ତି, ସମ୍ଭବତଃ କାରଣ ସେମାନେ ସାମାନ୍ୟ ଭିନ୍ନ ଏପିଟୋପ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧି ହୋଇଥାନ୍ତି ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ବହୁତ ଭିନ୍ନ ବନ୍ଧନଶୀଳତା ଥାଇପାରେ। ଯେତେବେଳେ ନୂତନ mAb ପଦ୍ଧତି ପ୍ରକୃତ ନମୁନାରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଏ ସେତେବେଳେ ସଠିକ୍ ଏପିଟୋପ୍ ଚିହ୍ନଟର ଯନ୍ତ୍ରପାତି ଏବଂ ପ୍ରଭାବ ବହୁତ ଜଟିଳ ହେବ।
ବିଭିନ୍ନ ଗ୍ଲାଇକାନ୍-ଟାର୍ଗେଟିଂ mAbs ର ଚିହ୍ନଟ ପରିସର ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଦୁଇଟି ବାଣିଜ୍ୟିକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଏଠାରେ, ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତାର ଲଗ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ସହିତ ରେଖୀୟ ସମ୍ପର୍କ (A) mAb ସହିତ XHE ଏବଂ (B) mAb ସହିତ A2XX ପାଇଁ ଲାଙ୍ଗମୁଇର୍ ଶୋଷଣ ପଦ୍ଧତି ସୂଚିତ କରେ। ଅନୁରୂପ ଏପିଟୋପ୍ ପରୀକ୍ଷାରେ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ର ଗଠନକୁ ସୂଚିତ କରେ।
ଉଦ୍ଭିଦ ବାୟୋମାସ ଗଠନ କରୁଥିବା ଅଧିକାଂଶ ପ୍ରମୁଖ କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନଗୁଡ଼ିକର ଗଭୀର ବର୍ଣ୍ଣନ ପାଇଁ ଗ୍ଲାଇକାନ-ଲକ୍ଷ୍ୟଯୁକ୍ତ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଗ୍ଲାଇକୋକୋମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କିମ୍ବା ELISA-ଆଧାରିତ mAb ସ୍କ୍ରିନିଂ)ର ବ୍ୟବହାର ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଉପକରଣ। ତଥାପି, ଶାସ୍ତ୍ରୀୟ ଗ୍ଲାଇକାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କେବଳ ବଡ଼ କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣନ କରେ, କାରଣ ଅଧିକାଂଶ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ELISA ପ୍ଲେଟରେ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ସ୍ଥିର ହୋଇନଥାଏ। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, AFEX-ପୂର୍ବ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା କର୍ଣ୍ଣ ଷ୍ଟୋଭରକୁ ଏକ ଉଚ୍ଚ କଠିନ ସାମଗ୍ରୀରେ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ଭାବରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟରେ ରିକାଲ୍ସିଟ୍ରାଣ୍ଟ କୋଷ କାନ୍ଥ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟର ଗଠନ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଚିନି ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ତଥାପି, ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟରେ ଛୋଟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ଗୁଡ଼ିକର mAb ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ କମ୍ ଆକଳନ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ELISA ପ୍ଲେଟରେ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ସ୍ଥିର କରିବା ପାଇଁ ଅତିରିକ୍ତ ଉପକରଣ ଆବଶ୍ୟକ।
ଆମେ ଏଠାରେ NeutrAvidin™ ଆବୃତ ପ୍ଲେଟଗୁଡ଼ିକରେ ELISA ସ୍କ୍ରିନିଂ ଦ୍ୱାରା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ମିଶ୍ରଣ କରି mAb ସ୍କ୍ରିନିଂ ପାଇଁ ଏକ ନୂତନ ଏବଂ ଦକ୍ଷ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅସ୍ଥାୟୀକରଣ ପଦ୍ଧତି ରିପୋର୍ଟ କରୁଛୁ। ଅସ୍ଥାୟୀ ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ପାଇଁ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ଆକର୍ଷକତା ଦେଖାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା ରିକାଲସିଟ୍ରାଣ୍ଟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଦ୍ରୁତ ଏବଂ ଦକ୍ଷ ଚିହ୍ନଟ ସମ୍ଭବ ହୋଇଥିଲା। ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ଉପରେ ଆଧାରିତ ଏହି ଜିଦ୍ଖୋର ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଗଠନର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଇମ୍ୟୁନୋସ୍କ୍ରିନିଂ ପାଇଁ ଏହି ନୂତନ ପଦ୍ଧତିର ଫଳାଫଳକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା। ତେଣୁ, ଏହି ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ଗ୍ଲାଇକାନ୍-ଲକ୍ଷ୍ୟଯୁକ୍ତ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ଏବଂ ELISA ସ୍କ୍ରିନିଂର ମିଶ୍ରଣ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ କ୍ରସଲିଙ୍କ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଗଠନକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରୁଥିବା ଅନ୍ୟ ଜୈବ ରାସାୟନିକ ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇପାରିବ।
ଏହି ବାୟୋଟିନ୍-ଆଧାରିତ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲିଂ ପଦ୍ଧତି ହେଉଛି ପ୍ରଥମ ରିପୋର୍ଟ ଯାହା ଉଦ୍ଭିଦ ବାୟୋମାସରେ ଦ୍ରବଣୀୟ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ର ଅସ୍ଥାୟୀ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ବନ୍ଧନର ତଦନ୍ତ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ। ଏହା ଜୈବ ଇନ୍ଧନ ଉତ୍ପାଦନ କ୍ଷେତ୍ରରେ ବାୟୋମାସର କିଛି ଅଂଶ କାହିଁକି ଏତେ ଜିଦ୍ଖୋର ତାହା ବୁଝିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ। ଏହି ପଦ୍ଧତି ଗ୍ଲାଇକୋମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପଦ୍ଧତିରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଶୂନ୍ୟସ୍ଥାନ ପୂରଣ କରେ ଏବଂ ଉଦ୍ଭିଦ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବାହାରେ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍‌ର ଏକ ବ୍ୟାପକ ପରିସରକୁ ଏହାର ପ୍ରୟୋଗକୁ ବିସ୍ତାର କରେ। ଭବିଷ୍ୟତରେ, ଆମେ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ପାଇଁ ରୋବୋଟିକ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରିପାରୁ ଏବଂ ELISA ବ୍ୟବହାର କରି ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୁପୁଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଆମେ ବିକଶିତ କରିଥିବା ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିପାରୁ।
ପାୟୋନିୟର 33A14 ହାଇବ୍ରିଡ୍ ବିହନରୁ ଚାଷ କରାଯାଇଥିବା ମକା ନଡ଼ା (CS) 2010 ମସିହାରେ କଲୋରାଡୋର ରେରେ ଥିବା କ୍ରାମର ଫାର୍ମରୁ ଅମଳ କରାଯାଇଥିଲା। ଜମି ମାଲିକଙ୍କ ଅନୁମତି ସହିତ, ଏହି ବାୟୋମାସକୁ ଗବେଷଣା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଜିପ୍-ଲକ୍ ବ୍ୟାଗରେ ଶୁଖିଲା 6% < ଆର୍ଦ୍ରତାରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଜିପ୍-ଲକ୍ ବ୍ୟାଗରେ ଶୁଖିଲା 6% < ଆର୍ଦ୍ରତାରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। Об чинцы хранились сухим при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной зине। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଜିପର୍ ବ୍ୟାଗରେ <6% ଆର୍ଦ୍ରତାରେ ଶୁଖିଲା ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।样品在室温下以干燥 <6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥 <6% | Об كانцы хранят в пакетх с застежкой-молнией при комнатной че с влажностью <6% | ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ଜିପର୍ ବ୍ୟାଗରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 6% ରୁ କମ୍ ଆର୍ଦ୍ରତା ସହିତ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଏ।ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ ସ୍ଥାନୀୟ ଏବଂ ଜାତୀୟ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ପାଳନ କରିଥିଲା। NREL ପ୍ରୋଟୋକଲ ବ୍ୟବହାର କରି ରଚନା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ରଚନାରେ 31.4% ଗ୍ଲୁକାନ, 18.7% ଜାଇଲାନ, 3.3% ଆରବିନାନ, 1.2% ଗାଲାକ୍ଟାନ, 2.2% ଏସିଟେଲ, 14.3% ଲିଗନିନ, 1.7% ପ୍ରୋଟିନ ଏବଂ 13.4% ପାଉଁଶ ଥିବା ଜଣାପଡିଥିଲା।
Cellic® CTec2 (138 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/ml, ଲଟ୍ VCNI 0001) ହେଉଛି Novozymes (Franklinton, NC, USA) ରୁ ସେଲୁଲେଜ୍, β-glucosidase ଏବଂ Cellic® HTec2 (157 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/ml, ଲଟ୍ VHN00001) ର ଏକ ଜଟିଳ ମିଶ୍ରଣ। Multifect Pectinase® (72 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/mL), ପେକ୍ଟିନ ଡିଗ୍ରେଡିଂ ଏନଜାଇମର ଏକ ଜଟିଳ ମିଶ୍ରଣ, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) ଦ୍ୱାରା ଦାନ କରାଯାଇଥିଲା। Kjeldahl ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ (AOAC ପଦ୍ଧତି 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ସାମଗ୍ରୀ ଆକଳନ (ଏବଂ ଅଣ-ପ୍ରୋଟିନ୍ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ର ଅବଦାନ ବିଯୋଗ କରି) ଏନଜାଇମ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। Diatomaceous Earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) ରୁ କିଣାଯାଇଥିଲା। ସକ୍ରିୟ କାର୍ବନ (DARCO, 100 ମେଶ୍ ଗ୍ରାନୁଲା), ଆଭିସେଲ୍ (PH-101), ବିଚ୍ ଜାଇଲାନ୍, ଏବଂ ଅନ୍ୟ ସମସ୍ତ ରାସାୟନିକ ପଦାର୍ଥ ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍ (ସେଣ୍ଟ ଲୁଇସ୍, MO) ରୁ କିଣାଯାଇଥିଲା।
AFEX ପ୍ରିଟ୍ରିମେଣ୍ଟ GLBRC (ବାୟୋମାସ କନଭର୍ସନ ରିସର୍ଚ୍ଚ ଲାବୋରେଟୋରୀ, MSU, ଲାନ୍ସିଂ, MI, USA) ରେ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରି-ଟ୍ରିମେଣ୍ଟ 140° ସେଲସିୟସ୍ ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କରାଯାଇଥିଲା। 46 ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ବେଞ୍ଚଟପ୍ ବ୍ୟାଚ୍ ରିଆକ୍ଟର (ପାର ଇନଷ୍ଟ୍ରୁମେଣ୍ଟସ୍ କମ୍ପାନୀ) ରେ 60% (w/w) ଲୋଡିଂରେ ନିର୍ଜଳ ଆମୋନିଆ ଏବଂ ବାୟୋମାସର 1:1 ଅନୁପାତରେ ବାସ ସମୟ। ଏଥିରେ 30 ମିନିଟ୍ ଲାଗିଥିଲା। ରିଆକ୍ଟରକୁ 140° ସେଲସିୟସ୍ କୁ ଅଣାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଆମୋନିଆ ଦ୍ରୁତ ଗତିରେ ମୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ବାୟୋମାସକୁ ଶୀଘ୍ର କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାକୁ ଫେରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥିଲା। AFEX ପ୍ରି-ଟ୍ରିଟେଡ୍ କର୍ଣ୍ଣ ଷ୍ଟୋଭର୍ (ACS) ର ଗଠନ ଅପରିଶୋଧିତ କର୍ଣ୍ଣ ଷ୍ଟୋଭର୍ (UT-CS) ସହିତ ସମାନ ଥିଲା।
ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡର ବଡ଼ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ସାମଗ୍ରୀ ଭାବରେ ଉଚ୍ଚ କଠିନ ACSH 25% (w/w) (ପ୍ରାୟ 8% ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍ ଲୋଡିଂ) ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। ACS ର ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲିସିସ୍ ଏକ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଏନଜାଇମ ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ Cellic® Ctec2 10 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/g ଗ୍ଲୁକାନ୍ (ପ୍ରିଟ୍ରିଟେଡ୍ ବାୟୋମାସରେ), Htec2 (ନୋଭୋଜାଇମ୍ସ, ଫ୍ରାଙ୍କଲିଣ୍ଟନ୍, NC), 5 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/g ଗ୍ଲୁକାନ୍, ଏବଂ ମଲ୍ଟିଫେକ୍ଟ ପେକ୍ଟିନେଜ୍ (ଜେନେନକର୍ ଇନକର୍ପୋରେଟେଡ୍, ୟୁଏସ୍ଏ) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ଥିଲା। ), 5 mg ପ୍ରୋଟିନ୍/g ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍। 3 ଲିଟର, pH 4.8, 50°C ଏବଂ 250 rpm କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ପରିମାଣ ସହିତ 5-ଲିଟର ବାୟୋରିଆକ୍ଟରରେ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲିସିସ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 96 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଜଳବିଜ୍ଞାନ ପରେ, ଅଣଜଳବିଜ୍ଞାନ କଠିନ ପଦାର୍ଥକୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ 6000 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏବଂ ତା'ପରେ 14000 rpm ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ ୦.୨୨ ମିମି ଫିଲ୍ଟର ବିକର ମାଧ୍ୟମରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍‌କୁ ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ ଫିଲ୍ଟରେଶନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଫିଲ୍ଟର ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍‌କୁ ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ ବୋତଲରେ ୪° ସେଲସିୟସ୍‌ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା'ପରେ କାର୍ବନରେ ଖଣ୍ଡିତ କରାଯାଇଥିଲା।
NREL ପରୀକ୍ଷାଗାର ବିଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅନୁଯାୟୀ ନିଷ୍କାସନ-ଆଧାରିତ ବାୟୋମାସ ନମୁନାର ଗଠନର ବିଶ୍ଳେଷଣ: ରଚନା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି (NREL/TP-510-42620) ଏବଂ ବାୟୋମାସରେ ସଂରଚନାତ୍ମକ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ଏବଂ ଲିଗ୍ନିନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ (NREL/TP-510 – 42618)47।
ଅଟୋକ୍ଲେଭ-ଆଧାରିତ ଏସିଡ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି 2 ମିଲି ସ୍କେଲରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ ଷ୍ଟ୍ରିମର ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଏକ 10 ମିଲି ସ୍କ୍ରୁ କ୍ୟାପ୍ କଲଚର୍ ଟ୍ୟୁବ୍‌ରେ 69.7 μl 72% ସଲଫ୍ୟୁରିକ୍ ଏସିଡ୍ ସହିତ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ ନମୁନାକୁ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 121 °C ତାପମାତ୍ରାରେ ଏକ ବେଞ୍ଚଟପ୍ ଉପରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, ବରଫ ଉପରେ ଥଣ୍ଡା କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଏକ ଉଚ୍ଚ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (HPLC) ଭାଏଲ୍ ରେ ଛାଣି ଦିଅନ୍ତୁ। ଏସିଡ୍-ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜିଡ୍ ନମୁନାରେ ମୋଟ ଚିନି ସାନ୍ଦ୍ରତାରୁ ଅଣ-ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜିଡ୍ ନମୁନାରେ ମୋନୋସାକାରାଇଡ୍ ର ସାନ୍ଦ୍ରତାକୁ ବିଯୋଗ କରି ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା।
ଏକ ବାୟୋ-ରାଡ୍ ଆମେନେକ୍ସ HPX-87H ସ୍ତମ୍ଭରେ ଏକ ଅଟୋସାମ୍ପଲର, ସ୍ତମ୍ଭ ହିଟର, ଆଇସୋକ୍ରାଟିକ୍ ପମ୍ପ ଏବଂ ପ୍ରତିସରଣ ସୂଚକାଙ୍କ ଡିଟେକ୍ଟର ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ଶିମାଡଜୁ HPLC ସିଷ୍ଟମ ବ୍ୟବହାର କରି ଏସିଡ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଡ୍ ବାୟୋମାସରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ଜାଇଲୋଜ୍ ଏବଂ ଆରାବିନୋଜ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ତମ୍ଭକୁ 50°C ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 0.6 ml/ମିନିଟ୍ 5 mM H2SO4 ଜଳ ପ୍ରବାହ ସହିତ ଏଲିଉଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜେଟ୍ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ମୋନୋମର ଏବଂ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ପରିମାଣ ପାଇଁ ତରଳାଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ପରେ ପ୍ରାପ୍ତ ମୋନୋମେରିକ୍ ଶର୍କରାକୁ ବାୟୋ-ରାଡ୍ (ହର୍କ୍ୟୁଲିସ୍, CA) ଆମେନେକ୍ସ HPX-87P ସ୍ତମ୍ଭ ଏବଂ ଏକ ଆଶ୍ ଗାର୍ଡ ସ୍ତମ୍ଭ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ HPLC ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ତମ୍ଭର ତାପମାତ୍ରା 80°C ରେ ରଖା ଯାଇଥିଲା, ପାଣିକୁ 0.6 ml/min ପ୍ରବାହ ହାର ସହିତ ମୋବାଇଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ରେଫରେନ୍ସ 41, 48, 49 ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପଦ୍ଧତି ଅନୁସାରେ 121°C ରେ ଡିଲୁଏଟ୍ ଏସିଡ୍ ରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପ୍ରକ୍ରିୟା 27, 43, 50, 51 ବ୍ୟବହାର କରି କଞ୍ଚା, AFEX ପୂର୍ବ-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ଏବଂ ସମସ୍ତ ଅଣ-ଜଳବିହୀନ ବାୟୋମାସ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ (କ୍ରମିକ କୋଷ କାନ୍ଥ ନିର୍ଗମ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର mAb ସ୍କ୍ରିନିଂ ଉତ୍ପାଦନ ସମେତ) ଉପରେ ସାକାରାଇଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଗ୍ଲାଇକୋମ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥ ସାମଗ୍ରୀର ଆଲକୋହଲ-ଅଦ୍ରବଣୀୟ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ବାୟୋମାସ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରୁ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଏ ଏବଂ ଆମୋନିୟମ୍ ଅକ୍ସାଲେଟ୍ (50 mM), ସୋଡିୟମ୍ କାର୍ବୋନେଟ୍ (50 mM ଏବଂ 0.5% w/v), CON. (1M ଏବଂ 4M, ଉଭୟ 1% w/v ସୋଡିୟମ୍ ବୋରୋହାଇଡ୍ରାଇଡ୍ ସହିତ) ଏବଂ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ 52,53 ପରି ଏସିଡ୍ କ୍ଲୋରାଇଟ୍ ପରି ବର୍ଦ୍ଧିତ ଆକ୍ରମଣାତ୍ମକ ପ୍ରତିକାରକ ସହିତ କ୍ରମିକ ନିଷ୍କାସନ କରାଯାଏ। ତା'ପରେ ନିର୍ଗମଗୁଡ଼ିକୁ କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନକୁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ mAb50s ର ଏକ ଜଟିଳ ପ୍ୟାନେଲ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ ELISA ର ଅଧୀନକୁ ନିଆଯାଏ, ଏବଂ mAb ବାଇଣ୍ଡିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ର ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ କରାଯାଏ। ଉଦ୍ଭିଦ କୋଷ କାନ୍ଥ ଗ୍ଲାଇକାନକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରୁଥିବା mAbs ପରୀକ୍ଷାଗାର ଷ୍ଟକ୍ (CCRC, JIM ଏବଂ MAC ସିରିଜ୍) ରୁ କିଣାଯାଇଥାଏ।
ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡର ଏକ-ପଦକ୍ଷେପ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ। ବାୟୋଟିନ-LC-ହାଇଡ୍ରାଜାଇଡ ସହିତ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟର ସଂଯୋଗ ନିମ୍ନଲିଖିତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା। ବାୟୋଟିନ-LC-ହାଇଡ୍ରାଜାଇଡ (4.6 mg/12 μmol) କୁ ଡାଇମିଥାଇଲ ସଲଫକ୍ସାଇଡ (DMSO, 70 μl) ରେ ଜୋରଦାର ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ଏବଂ 1 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65° C ରେ ଗରମ କରି ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। ଗ୍ଲେସିଆଲ୍ ଆସେଟିକ୍ ଏସିଡ୍ (30 μl) ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମିଶ୍ରଣକୁ ସୋଡିୟମ୍ ସାଇନୋବୋରୋହାଇଡ୍ରାଇଡ (6.4 mg/100 μmol) ଉପରେ ଢାଳି ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରାୟ 1 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65° C ରେ ଗରମ କରିବା ପରେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। ତାପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣର 5 ରୁ 8 μl ଶୁଖିଲା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ (1-100 nmol) ରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା ହ୍ରାସକାରୀ ଶେଷ ଉପରେ ଲେବଲର 10 ଗୁଣ କିମ୍ବା ଅଧିକ ମୋଲାର ଅଧିକ ପରିମାଣ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା 65° C ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ପରେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ତୁରନ୍ତ ବିଶୋଧିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଲେବଲିଂ ପରୀକ୍ଷଣରେ ହ୍ରାସ ବିନା କୌଣସି ସୋଡିୟମ୍ ସାଇନୋବୋରୋହାଇଡ୍ରାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇ ନଥିଲା, ଏବଂ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 2.5 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 65° ସେଲସିୟସ୍ ରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରାଯାଇଥିଲା।
ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍‌ର ନମୁନାର ELISA ଆବରଣ ଏବଂ ଧୋଇବା। ଆଭିଡିନ୍‌-ଆବରଣ ପ୍ଲେଟର ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂପରେ 25 μl ବାୟୋଟିନାଇଲେଟେଡ୍ ନମୁନା (ପ୍ରତ୍ୟେକ ଘନୀଭୂତ ନମୁନାର 100 μl 0.1 M Tris ବଫର ଦ୍ରବଣ (TBS) ର 5 ml ରେ ମିଳାଇ) ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କୂପଗୁଡ଼ିକୁ 0.1 M TBS ରେ 10 μg/ml ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ 50 μl ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ଆବରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଖାଲି ମାପ ପାଇଁ ଡିଓନାଇଜେଡ୍ ପାଣିକୁ ଏକ ଆବରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଟାବଲେଟ୍‌କୁ ଅନ୍ଧାରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଗ୍ରେନିଅର୍ ଫ୍ଲାଟ୍ 3A ପାଇଁ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ ନମ୍ବର 11 ବ୍ୟବହାର କରି 0.1 M TBS ରେ 0.1% ସ୍କିମ୍ଡ୍ କ୍ଷୀର ସହିତ ପ୍ଲେଟ୍‌କୁ 3 ଥର ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ।
ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡା ଏବଂ ଧୋଇବା। ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂଅରେ 40 μl ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡା। ଅନ୍ଧାରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟକୁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ତା'ପରେ ଗ୍ରେନିୟର ଫ୍ଲାଟ୍ 3A ପାଇଁ ୱାଶ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ #11 ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ଲେଟଗୁଡ଼ିକୁ 0.1M TBS ରେ 0.1% କ୍ଷୀର ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା।
ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ଧୋଇଦିଅନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂପରେ 50 μl ମୂଷା/ମୁଷା ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି (0.1 M TBS ରେ 0.1% କ୍ଷୀରରେ 1:5000 ମିଳାଇ) ଯୋଡନ୍ତୁ। ଅନ୍ଧାରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟକୁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ତା'ପରେ ଗ୍ରେନିୟର ଫ୍ଲାଟ୍ 5A ପ୍ଲେଟ୍ ୱାଶ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ #12 ବ୍ୟବହାର କରି ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟଗୁଡ଼ିକୁ 0.1 M TBS ରେ 0.1% କ୍ଷୀର ସହିତ 5 ଥର ଧୋଇଦିଆଗଲା।
ଏକ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଯୋଡ଼ନ୍ତୁ। ମୂଳ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ରେ 50 μl 3,3′,5,5′-ଟେଟ୍ରାମିଥାଇଲବେଞ୍ଜିଡିନ୍ (TMB) ଯୋଡ଼ନ୍ତୁ (15 ମିଲି ଡିଆୟୋନାଇଜଡ୍ ପାଣିରେ 2 ବୁନ୍ଦା ବଫର, 3 ବୁନ୍ଦା TMB, 2 ବୁନ୍ଦା ହାଇଡ୍ରୋଜେନ୍ ପେରଅକ୍ସାଇଡ୍ ମିଶାଇ)। TMB ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରନ୍ତୁ। ଏବଂ ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ ଭୋର୍ଟେକ୍ସ)। ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ କୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ଅନ୍ଧାରରେ।
ପଦକ୍ଷେପଟି ସମାପ୍ତ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଟାବଲେଟ୍ ପଢ଼ନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂପରେ 50 μl 1 N ସଲଫ୍ୟୁରିକ୍ ଏସିଡ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ଏକ ELISA ରିଡର ବ୍ୟବହାର କରି 450 ରୁ 655 nm ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅବଶୋଷଣ ରେକର୍ଡ କରନ୍ତୁ।
ଡିଆୟୋନାଇଜଡ୍ ପାଣିରେ ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣକାରୀଙ୍କ 1 mg/ml ଦ୍ରବଣ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରନ୍ତୁ: ଆରାବିନୋଜ୍, ରମନୋଜ୍, ଫ୍ୟୁକୋଜ୍, ଜାଇଲୋଜ୍, ଗାଲାକ୍ଟୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ (GalA), ଗ୍ଲୁକୁରୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ (GlcA), ମାନୋଜ୍, ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍, ଲାକ୍ଟୋଜ୍, N-ଆସେଟିଲମାନୋସାମାଇନ୍ (manNAc), N-ଆସେଟିଲଗ୍ଲୁକୋସାମାଇନ୍ . (glcNAc), N-ଆସେଟିଲଗାଲାକ୍ଟୋସାମାଇନ୍ (galNAc), ଇନୋସିଟଲ୍ (ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମାନକ)। ସାରଣୀ 1 ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଥିବା 1 mg/mL ଚିନି ଦ୍ରବଣକୁ ଯୋଡି ଦୁଇଟି ମାନକ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ଜଳ ଅପସାରିତ ହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ -80° C ରେ ଫ୍ରିଜ୍ ଏବଂ ଲାଇଓଫାଇଲାଇଜ୍ କରାଯାଏ (ସାଧାରଣତଃ ପ୍ରାୟ 12-18 ଘଣ୍ଟା)।
ଏକ ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ସନ୍ତୁଳନରେ ସ୍କ୍ରୁ କ୍ୟାପ୍ ଟ୍ୟୁବ୍‌ରେ 100-500 µg ନମୁନା ଯୋଡନ୍ତୁ। ଯୋଡା ହୋଇଥିବା ପରିମାଣ ରେକର୍ଡ କରନ୍ତୁ। ନମୁନାକୁ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଦ୍ରାବକ ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରି ଟ୍ୟୁବ୍‌ରେ ତରଳ ଆଲିକୋଟ୍ ଭାବରେ ଯୋଡନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ଟ୍ୟୁବ୍ ପାଇଁ 20 µl 1 mg/ml ଇନୋସିଟଲ୍ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମାନକ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ନମୁନାରେ ଯୋଡା ହୋଇଥିବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମାନକର ପରିମାଣ ମାନକ ଟ୍ୟୁବ୍‌ରେ ଯୋଡା ହୋଇଥିବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମାନକର ପରିମାଣ ସହିତ ସମାନ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ।
ଏକ ସ୍କ୍ରୁ କ୍ୟାପ୍ ଭାଏଲରେ 8 ମିଲି ନିର୍ଜଳ ମିଥାନଲ ମିଥାନଲ ମିଶାନ୍ତୁ। ତା'ପରେ 4 ମିଲି 3 N. ମିଥାନଲିକ HCl ଦ୍ରବଣ, ଆବରଣ ଏବଂ ହଲାନ୍ତୁ। ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ପାଣି ବ୍ୟବହାର ହୁଏ ନାହିଁ।
ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ନମୁନା ଏବଂ ମାନକ TMS ଟ୍ୟୁବରେ 500 μl 1 M HCl ମିଥାନଲ୍ ଦ୍ରବଣ ଯୋଡନ୍ତୁ। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଥର୍ମାଲ୍ ବ୍ଲକରେ 80° ସେଲ୍ସିୟସ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ରାତାରାତି (168 ଘଣ୍ଟା) ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଶୁଖାଇବା ମେନିଫୋଲ୍ଡ ବ୍ୟବହାର କରି ମିଥାନଲିସିସ୍ ଉତ୍ପାଦକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ। 200 μl MeOH ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ପୁଣି ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ। ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ଦୁଇଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି ହୁଏ। ନମୁନାରେ 200 μl ମିଥାନଲ୍, 100 μl ପାଇରିଡିନ୍ ଏବଂ 100 μl ଆସେଟିକ୍ ଆନାହାଇଡ୍ରାଇଡ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶାନ୍ତୁ। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଏବଂ ଶୁଖାଯାଇଥିଲା। 200 μl ମିଥାନଲ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ପୁଣି ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ।
୨୦୦ μl ଟ୍ରାଇ-ସିଲ୍ ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ ୨୦ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଆବଦ୍ଧ ଟ୍ୟୁବ୍ ଗରମ କରନ୍ତୁ। ୮୦°C, ତାପରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାକୁ ଥଣ୍ଡା କରନ୍ତୁ। ନମୁନାକୁ ପ୍ରାୟ ୫୦ μl ଆୟତନରେ ଆହୁରି ଶୁଖାଇବା ପାଇଁ ଏକ ଶୁଖାଇବା ମେନିଫୋଲ୍ଡ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଏହା ମନେ ରଖିବା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଯେ ଆମେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଶୁଖିବାକୁ ଦେଇନାହୁଁ।
2 ମିଲି ହେକ୍ସେନ ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ଦ୍ୱାରା ଭଲ ଭାବରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ। 5-3/4 ଇଞ୍ଚ ବ୍ୟାସର ଏକ ପିପେଟ୍ ଉପରେ କାଚ ପଶମ ଭର୍ତ୍ତି କରି ପାଷ୍ଟର ପିପେଟ୍ (5-8 ମିମି) ର ଅଗ୍ରଭାଗକୁ ଏକ କାଚ ପଶମ ଖଣ୍ଡ ସହିତ ପୂରଣ କରନ୍ତୁ। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 3000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଯେକୌଣସି ଅଦ୍ରବଣୀୟ ଅବଶେଷ ଅବଶେଷିତ ହୋଇଯାଏ। ନମୁନାକୁ 100-150 μl ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ। 80 °C ର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ 2.0 ମିନିଟ୍ ର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ସମୟରେ GC-MS ରେ ପ୍ରାୟ 1 μl ଆୟତନ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା (ସାରଣୀ 2)।