Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਇੱਕ ਵਾਰ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਕੈਰੋਸਲ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਪਿਛਲੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਬਾਇਓਥੈਰੇਪੂਟਿਕ ਏਜੰਟਾਂ ਨੂੰ ਕੇਂਦਰੀ ਨਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਟੀਚਿਆਂ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਰੋਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਤੰਤੂ ਰੋਗਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਇਲਾਜ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ ਆਉਂਦੀ ਹੈ।ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਨਵੇਂ ਟਰਾਂਸਪੋਰਟਰਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਟੀ 7 ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਇੱਕ ਕੈਨੁਲੇਟਿਡ ਚੇਤੰਨ ਵੱਡੇ ਪੂਲ ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਲੜੀਵਾਰ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ।ਚੋਣ ਦੇ ਚਾਰ ਗੇੜਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ CSF ਵਿੱਚ ਖਾਸ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਮੀਰ ਹੋਏ ਸਨ।ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਉਮੀਦਵਾਰ ਪੇਪਟਾਇਡਜ਼ ਦੀ ਜਾਂਚ ਨੇ CSF ਵਿੱਚ 1000 ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਪੇਪਟਾਇਡ-ਵਿਚੋਲੇ ਦੀ ਡਿਲੀਵਰੀ ਦੀ ਬਾਇਓਐਕਟੀਵਿਟੀ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਾਵਲ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਾਲ ਜੁੜੇ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ-β ਦੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ 40% ਕਮੀ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਵਿਵੋ ਫੇਜ਼ ਚੋਣ ਵਿਧੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਇੱਕ ਉਪਚਾਰਕ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਨਾਲ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਦੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀਗਤ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਉਪਯੋਗੀ ਵਾਹਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਸੈਂਟਰਲ ਨਰਵਸ ਸਿਸਟਮ (ਸੀਐਨਐਸ) ਟਾਰਗੇਟ ਥੈਰੇਪੀ ਖੋਜ ਨੇ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਓਪਟੀਮਾਈਜ਼ਡ ਦਵਾਈਆਂ ਅਤੇ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਸੀਐਨਐਸ-ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਡਰੱਗ ਡਿਲਿਵਰੀ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਤੰਤਰ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ 'ਤੇ ਘੱਟ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਦੇ ਨਾਲ।ਇਹ ਹੁਣ ਬਦਲਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਰਿਹਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਡਰੱਗ ਡਿਲਿਵਰੀ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਡੇ ਅਣੂ, ਆਧੁਨਿਕ ਨਿਊਰੋਸਾਇੰਸ ਡਰੱਗ ਵਿਕਾਸ ਦਾ ਇੱਕ ਅਨਿੱਖੜਵਾਂ ਅੰਗ ਹੈ।ਸੈਂਟਰਲ ਨਰਵਸ ਸਿਸਟਮ ਦਾ ਵਾਤਾਵਰਨ ਸੇਰਬ੍ਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਬੈਰੀਅਰ ਸਿਸਟਮ ਦੁਆਰਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਬਲੱਡ-ਬ੍ਰੇਨ ਬੈਰੀਅਰ (ਬੀਬੀਬੀ) ਅਤੇ ਬਲੱਡ-ਬ੍ਰੇਨ ਬੈਰੀਅਰ (ਬੀਸੀਬੀਬੀ) 1 ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਦਿਮਾਗ ਤੱਕ ਦਵਾਈਆਂ ਪਹੁੰਚਾਉਣਾ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਲਗਭਗ ਸਾਰੀਆਂ ਵੱਡੀਆਂ ਅਣੂ ਦਵਾਈਆਂ ਅਤੇ 98% ਤੋਂ ਵੱਧ ਛੋਟੀਆਂ ਅਣੂ ਵਾਲੀਆਂ ਦਵਾਈਆਂ ਦਿਮਾਗ 3 ਤੋਂ ਖਤਮ ਹੋ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਹੀ ਕਾਰਨ ਹੈ ਕਿ ਨਵੀਂ ਦਿਮਾਗੀ ਆਵਾਜਾਈ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨਾ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਜੋ CNS 4,5 ਨੂੰ ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲ ਅਤੇ ਖਾਸ ਡਿਲਿਵਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, BBB ਅਤੇ BCSFB ਨਸ਼ੀਲੇ ਪਦਾਰਥਾਂ ਦੀ ਸਪੁਰਦਗੀ ਲਈ ਇੱਕ ਵਧੀਆ ਮੌਕਾ ਵੀ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਸਾਰੇ ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਵਿਆਪਕ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਡਿਲੀਵਰੀ ਦੇ ਗੈਰ-ਹਮਲਾਵਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਯਤਨ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ BBB6 ਰੀਸੈਪਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਰੀਸੈਪਟਰ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ (PMT) ਦੀ ਵਿਧੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹਨ।ਟ੍ਰਾਂਸਫਰਿਨ ਰੀਸੈਪਟਰ ਪਾਥਵੇਅ 7,8 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹਾਲ ਹੀ ਦੀਆਂ ਮੁੱਖ ਤਰੱਕੀਆਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਸੁਧਰੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਨਵੇਂ ਡਿਲੀਵਰੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੇ ਹੋਰ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਇਸ ਅੰਤ ਲਈ, ਸਾਡਾ ਟੀਚਾ ਸੀਐਸਐਫ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨਾ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੀਐਨਐਸ ਨੂੰ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਜਾਂ ਨਵੇਂ ਰੀਸੈਪਟਰ ਮਾਰਗ ਖੋਲ੍ਹਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸੇਰੀਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (ਬੀਬੀਬੀ ਅਤੇ ਬੀਐਸਸੀਐਫਬੀ) ਦੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸੰਵੇਦਕ ਅਤੇ ਟਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਬਾਇਓਥੈਰੇਪੂਟਿਕ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਅਤੇ ਖਾਸ ਡਿਲਿਵਰੀ ਲਈ ਸੰਭਾਵੀ ਟੀਚਿਆਂ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਸੇਰੇਬਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਕੋਰੋਇਡ ਪਲੇਕਸਸ (CS) ਦਾ ਇੱਕ ਗੁਪਤ ਉਤਪਾਦ ਹੈ ਅਤੇ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਸਪੇਸ ਅਤੇ ਵੈਂਟ੍ਰਿਕੂਲਰ ਸਪੇਸ 4 ਦੁਆਰਾ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਇੰਟਰਸਟੀਸ਼ੀਅਲ ਤਰਲ ਨਾਲ ਸਿੱਧਾ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਹੈ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਇੰਟਰਸਟੀਟੀਅਮ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਫੈਲਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇਸ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਇਨਫਲੋ ਟ੍ਰੈਕਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜਾਂ ਸਿੱਧੇ BBB ਰਾਹੀਂ ਪੈਰੇਨਚਾਈਮਲ ਸਪੇਸ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਇਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਵੋ ਫੇਜ਼ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕਿਸੇ ਇੱਕ ਦੁਆਰਾ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਆਦਰਸ਼ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਹੁਣ ਉੱਚਤਮ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੋਣ ਦੌਰ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਨ ਲਈ ਉੱਚ ਥ੍ਰਰੂਪੁਟ ਸੀਕੁਏਂਸਿੰਗ (HTS) ਦੇ ਨਾਲ CSF ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਵੋ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਲੜੀਵਾਰ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਖੂਨ ਦੀ ਗੰਦਗੀ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਸਥਾਈ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਵੱਡੇ ਸਿਸਟਰਨਾ (CM) ਕੈਨੁਲਾ ਨਾਲ ਚੇਤੰਨ ਚੂਹਿਆਂ 'ਤੇ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਦਿਮਾਗੀ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨਾਲ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਛੋਟੇ ਆਕਾਰ (~ 60 nm) 10 ਦੇ ਕਾਰਨ T7 ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਉਹ ਵੇਸਿਕਲਾਂ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਹਨ ਜੋ ਐਂਡੋਥੈਲੀਅਲ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਐਪੀਥੈਲਿਅਲ-ਮੇਡੁੱਲਾ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਸੈਲੂਲਰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਚਾਰ ਗੇੜਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਵਿਵੋ ਸੀਐਸਐਫ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੈਸਲ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਦਿਖਾਉਂਦਿਆਂ ਫੇਜ਼ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਸਾਡੇ ਖੋਜਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ ਕਿ ਤਰਜੀਹੀ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਉਮੀਦਵਾਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਸੇਰਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਲਿਜਾਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹਨ।ਪਹਿਲਾਂ, ਸੀਐਨਐਸ ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬੀਏਸੀਈ 1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ ਇੱਕ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮੋਹਰੀ ਟ੍ਰਾਂਜਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਦੇ ਇਲਾਵਾ ਕਿ ਵਿਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਨਾਵਲ ਬ੍ਰੇਨ ਟਰਾਂਸਪੋਰਟ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਕੈਰੀਅਰਾਂ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਚੋਣ ਪਹੁੰਚ ਵੀ ਨਾਵਲ ਬ੍ਰੇਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਣ ਜਾਣਗੇ।
ਪਲੇਕ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੀਆਂ ਇਕਾਈਆਂ (PFU) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਫੇਜ਼ ਪੈਕਜਿੰਗ ਕਦਮ ਦੇ ਬਾਅਦ, ਲਗਭਗ 109 ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਬੇਤਰਤੀਬ 12-ਮੇਰ ਲੀਨੀਅਰ T7 ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਇੱਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਅਤੇ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਵੇਖੋ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗ)।ਇਹ ਨੋਟ ਕਰਨਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿ ਅਸੀਂ ਵੀਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇਸ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਜੋ ਕਿ ਸਿੱਧੇ HTS (ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਚਿੱਤਰ 1a) 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਐਂਪਲੀਕੋਨ ਤਿਆਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।a) HTS11 ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਤਰੁੱਟੀਆਂ, b) ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ (NNK)1-12, ਅਤੇ c) ਸਟੈਂਡਬਾਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ (ਡਬਲਯੂਟੀ) ਫੇਜ਼ (ਸਕਲੇਟਨ ਇਨਸਰਟਸ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਸਿਰਫ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕ੍ਰਮ-ਅਪ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਹ ਫਿਲਟਰ ਕਦਮ ਸਾਰੀਆਂ HTS ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸਟੈਂਡਰਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਈ, ਕੁੱਲ 233,868 ਰੀਡਜ਼ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ 39% ਨੇ ਫਿਲਟਰ ਮਾਪਦੰਡ ਪਾਸ ਕੀਤੇ ਸਨ ਅਤੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਦੌਰ ਲਈ ਚੋਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1c–e)।ਰੀਡਜ਼ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ 36 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1c) 'ਤੇ ਇੱਕ ਚੋਟੀ ਦੇ ਨਾਲ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ 3 ਬੇਸ ਜੋੜਿਆਂ ਦੇ ਗੁਣਜ ਸਨ, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ (NNK) 1-12 ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਲਗਭਗ 11% ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ 12-ਅਯਾਮੀ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ (wt) ਬੈਕਬੋਨ PAGISRELVDKL ਸੰਮਿਲਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਲਗਭਗ ਅੱਧੇ ਕ੍ਰਮ (49%) ਵਿੱਚ ਸੰਮਿਲਨ ਜਾਂ ਮਿਟਾਉਣਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਐਚਟੀਐਸ ਨੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ: 81% ਤੋਂ ਵੱਧ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਕੇਵਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਲੱਭੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਕੇਵਲ 1.5% ≥4 ਕਾਪੀਆਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a) ਵਿੱਚ ਆਏ ਸਨ।ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਜ਼ (ਏਏ) ਦੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ 12 ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀਜ਼ ਡੀਜਨਰੇਟ ਐਨਕੇਕੇ ਰੀਪਰਟੋਇਰ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2b) ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਕੋਡਨ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਲਈ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਬੰਧਿਤ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ AA ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਦੇਖੀ ਗਈ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ (r = 0.893) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2c) ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਬੰਧਿਤ ਹੈ।ਟੀਕੇ ਲਈ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਵਿੱਚ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਹਟਾਉਣ ਦੇ ਪੜਾਅ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ 12,13 ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨੂੰ ਸੰਭਾਵੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪਲੇਟ-ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਹਟਾਉਣ ਦਾ ਕੰਮ ਹੋਇਆ ਸੀ ਅਤੇ AA ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਇਸਦੀ ਅਸਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਅਸਲ ਪੂਲ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਪੂਲ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2d) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਸੰਬੰਧ (r = 0.995) ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ T7 ਫੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਵਧਾਏ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮੁਕਾਬਲਾ ਮੁੱਖ ਪੱਖਪਾਤ ਦਾ ਕਾਰਨ ਨਹੀਂ ਬਣਿਆ।ਇਹ ਤੁਲਨਾ ਹਰੇਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ (~ 109) ਨੂੰ HTS ਦੇ ਨਾਲ ਵੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ aa ਦੇ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਦੀਆਂ ਆਖਰੀ ਤਿੰਨ ਸਥਿਤੀਆਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2e) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਸਥਿਤੀ-ਨਿਰਭਰ ਪੱਖਪਾਤ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਸਿੱਟਾ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਿਆ ਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਸਵੀਕਾਰਯੋਗ ਸੀ ਅਤੇ ਚੋਣ ਦੇ ਕਈ ਦੌਰਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੇ ਕਾਰਨ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਮਾਮੂਲੀ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਵੇਖੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।
ਸੀਰੀਅਲ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ BBB ਅਤੇ/ਜਾਂ BCSFB (Fig. 1a-b) ਰਾਹੀਂ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀ 7 ਫੇਜ਼ ਟੀਕੇ (iv) ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਲਈ ਚੇਤੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੀਐਮ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕੈਨੂਲਾ ਨੂੰ ਸਰਜਰੀ ਨਾਲ ਇਮਪਲਾਂਟ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਵੀਵੋ ਚੋਣ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਚੋਣ ਹਥਿਆਰਾਂ (ਹਥਿਆਰਾਂ A ਅਤੇ B) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਅਸੀਂ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਗੇੜਾਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੀ ਕੁੱਲ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਚੋਣ ਦੀ ਸਖਤੀ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਵਧਾਇਆ ਹੈ।ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ A ਅਤੇ B ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਵਾਧੂ ਸੁਤੰਤਰ ਚੋਣ ਕੀਤੇ।ਇਸ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ T7 ਫੇਜ਼ ਕਣਾਂ ਦੇ ਵਿਵੋ ਗੁਣਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ਼ (PAGISRELVDKL ਮਾਸਟਰ ਇਨਸਰਟ) ਨੂੰ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਰਿਕਵਰੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟੇ ਟੀ 7 ਆਈਕੋਸੈਡਰਲ ਫੇਜਾਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3) ਤੋਂ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਪੜਾਅ ਸੀ।ਸੰਚਾਲਿਤ ਟਾਇਟਰਾਂ ਅਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਖੂਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਅਸੀਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਕਿ ਸਿਰਫ ਲਗਭਗ 1% ਡਬਲਯੂ.ਟੀ.ਪ੍ਰਸ਼ਾਸਿਤ ਖੁਰਾਕ ਤੋਂ ਫੇਜ ਦਾ ਪਤਾ ਨਾੜੀ ਦੇ ਟੀਕੇ ਤੋਂ 10 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਗਿਰਾਵਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇੱਕ ਹੌਲੀ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕਲੀਅਰੈਂਸ 27.7 ਮਿੰਟ ਦੀ ਅੱਧੀ-ਜੀਵਨ ਨਾਲ ਮਾਪੀ ਗਈ ਸੀ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਤੋਂ ਸਿਰਫ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਫੇਜ਼ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਕਿ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3) ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਮਾਈਗਰੇਸ਼ਨ ਲਈ ਇੱਕ ਘੱਟ ਪਿਛੋਕੜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਔਸਤਨ, ਖੂਨ ਵਿੱਚ T7 ਫੇਜ਼ ਦੇ ਸਿਰਫ 1 x 10-3% ਟਾਇਟਰ ਅਤੇ 4 x 10-8% ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸੰਕਰਮਿਤ ਫੇਜ਼ਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਮਿਆਦ (0-250 ਮਿੰਟ) ਦੌਰਾਨ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ਼ ਦੀ ਅੱਧੀ-ਜੀਵਨ (25.7 ਮਿੰਟ) ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸਮਾਨ ਸੀ।ਇਹ ਅੰਕੜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਖੂਨ ਤੋਂ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਰੁਕਾਵਟ CM-ਕੈਨਿਊਲੇਟਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਬਰਕਰਾਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਵਿਵੋ ਚੋਣ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜੋ ਖੂਨ ਤੋਂ CSF ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਲਿਜਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
(a) ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੂਲ ਤੋਂ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਨਮੂਨਾ ਲੈਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨਾ।(b) ਕੇਂਦਰੀ ਨਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (CNS) ਰੁਕਾਵਟ ਦੀ ਸੈਲੂਲਰ ਸਥਿਤੀ ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਰੁਕਾਵਟ (BBB) ​​ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਣ ਵਾਲੀ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਚਿੱਤਰ।(c) ਵਿਵੋ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਫਲੋਚਾਰਟ ਵਿੱਚ।ਚੋਣ ਦੇ ਹਰੇਕ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਫੇਜ (ਤੀਰਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਵਾਲੇ) ਨੂੰ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਵਿਕਲਪਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ (ਏ, ਬੀ) ਨੂੰ ਚੋਣ ਦੇ 4ਵੇਂ ਦੌਰ ਤੱਕ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਚੋਣ ਦੌਰ 3 ਅਤੇ 4 ਲਈ, CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਹਰੇਕ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।(d) T7 ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ (2 x 1012 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਦੇ ਨਾੜੀ ਦੇ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੋ ਕੈਨੁਲੇਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਦੌਰਾਨ ਖੂਨ (ਲਾਲ ਚੱਕਰ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਹਰੇ ਤਿਕੋਣ) ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ਼ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ।ਨੀਲੇ ਵਰਗ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਦੀ ਔਸਤ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਟੀਕੇ ਵਾਲੇ ਫੇਜ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਤੋਂ ਗਿਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਕੁੱਲ ਖੂਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ।ਕਾਲੇ ਵਰਗ ਖੂਨ ਦੇ ਫੇਜ਼ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੋਂ ਐਕਸਟਰਾਪੋਲੇਟਡ y ਲਾਈਨ ਦੇ ਇੰਟਰਸੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਬਿੰਦੂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।(e,f) ਪੇਪਟਾਇਡ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਸੰਭਵ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਅਨੁਸਾਰੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਵੰਡ ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰੋ।1000 ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ (p <0.001) ਭਰਪੂਰ ਮੋਟਿਫ਼ਾਂ ਨੂੰ ਲਾਲ ਬਿੰਦੀਆਂ ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।(e) ਜਾਨਵਰਾਂ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਤੋਂ ਲਹੂ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜ਼ ਦੇ ਨਾਲ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਸਹਿਸੰਬੰਧ ਸਕੈਟਰਪਲਾਟ।(f) ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਫੇਜ਼ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਸ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਕੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਸਕੈਟਰਪਲਾਟ।(g, h) ਖੂਨ (g) ਬਨਾਮ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਅਤੇ CSF (h) ਬਨਾਮ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ਼ ਦੀ ਕ੍ਰਮ ID ਦੀ ਨੁਮਾਇੰਦਗੀ ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਵੋ ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ।ਇੱਕ-ਅੱਖਰ ਕੋਡ ਦਾ ਆਕਾਰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਸ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਉਹ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਹਰਾ = ਧਰੁਵੀ, ਜਾਮਨੀ = ਨਿਰਪੱਖ, ਨੀਲਾ = ਬੁਨਿਆਦੀ, ਲਾਲ = ਤੇਜ਼ਾਬ ਅਤੇ ਕਾਲਾ = ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ।ਚਿੱਤਰ 1a, b ਨੂੰ ਐਡਵਾਰਡ ਯੂਰਿਚ ਦੁਆਰਾ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਅਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਸੀਂ ਦੋ CM ਇੰਸਟਰੂਮੈਂਟ ਚੂਹਿਆਂ (ਕਲੇਡਜ਼ ਏ ਅਤੇ ਬੀ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਖੂਨ (ਚਿੱਤਰ 1d) ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਫੇਜ ਲਗਾਇਆ।ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੇਜ਼ ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਘੱਟ ਉਚਾਰੀ ਗਈ ਸੀ।ਦੋਨਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਔਸਤ ਅੱਧਾ ਜੀਵਨ ਖੂਨ ਵਿੱਚ 24.8 ਮਿੰਟ ਸੀ, ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ਼ ਦੇ ਸਮਾਨ, ਅਤੇ ਸੀਐਸਐਫ ਵਿੱਚ 38.5 ਮਿੰਟ।ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ ਦੇ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਫੇਜ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਐਚਟੀਐਸ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਨਮੂਨੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਨਿਰਮਾਣ ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ 14,15 ਲਈ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਆਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਾਨੂੰ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀ ਫੇਜ਼ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਦੋਨਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਕਲੋਨ (ਚਿੱਤਰ 1e) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਮੋਟਿਫਸ ਦੀ ਵੰਡ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਚੰਗਾ ਸਬੰਧ ਮਿਲਿਆ ਹੈ।ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਰਚਨਾ ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਮਾਮੂਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਹੈ।ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀਜ਼ ਅਤੇ ਸਹਿਮਤੀ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਅੱਗੇ Weblogo16 ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਸਾਨੂੰ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (ਚਿੱਤਰ 1 ਗ੍ਰਾਮ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਸੰਪੂਰਨਤਾ ਮਿਲੀ।ਜਦੋਂ ਖੂਨ ਦੀ ਤੁਲਨਾ CSF ਤੋਂ ਚੁਣੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਤਾਂ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਚੋਣ ਅਤੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਕੁਝ ਅਣ-ਚੋਣ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 1f), ਅਤੇ ਕੁਝ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ 12-ਮੈਂਬਰ (ਚਿੱਤਰ 1h) ਵਿੱਚ ਪੂਰਵ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੌਜੂਦ ਸਨ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੇਰਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਭਿੰਨਤਾ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸੀਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a–j)।ਜਾਨਵਰਾਂ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਦੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਡੇਟਾ ਦੀ ਸਖ਼ਤ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕੁੱਲ 964 ਅਤੇ 420 ਵਿਲੱਖਣ 12-ਮੇਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1d–e)।ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਵਿਵੋ ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਗੇੜ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਫੇਜ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ ਵਿੱਚ HTS ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫਸ (ਚਿੱਤਰ 2a, b, ef) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮੋਟਿਫ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ ਇਨਪੁਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।CSF ਤੋਂ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਚੱਕਰ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਬ੍ਰਾਂਚਾਂ A ਅਤੇ B (ਚਿੱਤਰ 2) ਵਿੱਚ CSF ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਹੋਰ ਚੋਣ ਅਤੇ ਚੋਣ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਹੈ।ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਨੈੱਟਵਰਕ ਪਛਾਣ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ ਕੀ ਉਹ ਇਕਸਾਰ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ A (Fig. 2c, d) ਅਤੇ ਕਲੇਡ B (Fig. 2g, h) ਵਿੱਚ CSF ਦੁਆਰਾ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਗਏ 12-ਅਯਾਮੀ ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਸ਼ਾਖਾ ਵਿੱਚ ਪੂਲਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ 12-ਮੇਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5c,d) ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਚੋਣ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5e) ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੂਲਡ ਕਲੋਨਾਂ ਲਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ CSF/ਬਲੱਡ ਟਾਈਟਰ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ।).
ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਚੋਣ ਦੇ ਦੋ ਲਗਾਤਾਰ ਦੌਰ ਦੁਆਰਾ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫਸ ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਸੰਸ਼ੋਧਨ।
ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ (ਜਾਨਵਰ #1.1 ਅਤੇ #1.2) ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ ਤੋਂ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਫੇਜਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ, HT-ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇਕੱਠੇ ਦੁਬਾਰਾ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) 2 SM ਕੈਨੁਲੇਟਿਡ ਚੂਹੇ (#1.1 → #)।2.1 ਅਤੇ 2.2, 1.2 → 2.3 ਅਤੇ 2.4)।(a,b,e,f) ਪਹਿਲੇ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਚੋਣ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ CSF-ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸਬੰਧ ਸਕੈਟਰਪਲਾਟ।ਦੋਵਾਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਵੰਡ।1000 ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ (p <0.001) ਚੁਣੇ ਗਏ ਜਾਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖੇ ਗਏ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਲਾਲ ਬਿੰਦੀਆਂ ਨਾਲ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।(c, d, g, h) ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਵਿੱਚ ਰਾਊਂਡ 2 ਅਤੇ 1 ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਸਾਰੇ CSF-ਅਮੀਰ 12 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਲੰਬੇ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਲੋਗੋ ਪੇਸ਼ਕਾਰੀ।ਇੱਕ-ਅੱਖਰ ਕੋਡ ਦਾ ਆਕਾਰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਸ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਉਹ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਲੋਗੋ ਦੀ ਨੁਮਾਇੰਦਗੀ ਕਰਨ ਲਈ, ਦੋ ਚੋਣ ਦੌਰਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ CSF ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸੰਪੂਰਨ ਕ੍ਰਮ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ਅਤੇ (h) #1.2–#2.(c, d) ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸਥਾਨ 'ਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਮੀਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ.2.1 ਅਤੇ ਨੰ.2.2 ਜਾਂ (ਜੀ, ਐਚ) ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਨੰ.2.3 ਅਤੇ ਨੰ.2.4 ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਹਰਾ = ਧਰੁਵੀ, ਜਾਮਨੀ = ਨਿਰਪੱਖ, ਨੀਲਾ = ਬੁਨਿਆਦੀ, ਲਾਲ = ਤੇਜ਼ਾਬ ਅਤੇ ਕਾਲਾ = ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ।
ਚੋਣ ਦੇ ਤੀਜੇ ਗੇੜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਦੋ ਜਾਨਵਰਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6a) ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ 332 CSF-ਪੁਨਰਗਠਿਤ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਤੋਂ 124 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (#3.1 ਅਤੇ #3.2) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।ਕ੍ਰਮ LGSVS (18.7%) ਦਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਨੁਸਾਰੀ ਅਨੁਪਾਤ ਸੀ, ਇਸਦੇ ਬਾਅਦ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੰਮਿਲਨ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ਅਤੇ SARGSWREIVSLS (2.2%) ਹਨ।ਅੰਤਿਮ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜਾਨਵਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਦੋ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪੂਲ ਕੀਤਾ।CSF ਤੋਂ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਗਏ 925 ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਾਨੂੰ 64 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6b) ਮਿਲੇ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ਼ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਘਟ ਕੇ 0.8% ਹੋ ਗਿਆ ਹੈ।ਚੌਥੇ ਗੇੜ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ CSF ਕਲੋਨ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), GRPQKINGARVC (3.6%), %SSDRL2%) ਅਤੇ ਸਨ।%))।NNK ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਲਈ ਡੀਜਨਰੇਟ ਕੋਡਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਚੁਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਸੀਮਾ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਸੰਮਿਲਨ/ਮਿਟਾਉਣ ਜਾਂ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ।ਅਚਨਚੇਤੀ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਛੋਟੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲ ਏਏ ਮੋਟਿਫ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਮਿਲਨ/ਮਿਟਾਉਣ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਲੰਬੇ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤੇ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਨੂੰ ਫਰੇਮ ਦੇ ਬਾਹਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਪੜ੍ਹਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਦਿਖਾਈ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦਾ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਸੈਂਪਲ ਆਉਟਪੁੱਟ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇਨਪੁਟ ਡੇਟਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਕੇ ਸਾਰੇ ਚਾਰ ਚੋਣ ਦੌਰਾਂ ਲਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ।ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪਿਛੋਕੜ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਟਾਇਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਪਹਿਲੇ CSF ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਫੇਜ਼ ਦੀ ਚੋਣ ਬਹੁਤ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਸੀ, ਪਰ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ (ਚਿੱਤਰ 3a), ਜੋ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮੈਂਬਰਾਂ ਦੇ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਪੈਸਿਵ ਫੈਲਾਅ ਦੀ ਘੱਟ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜਾਂ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਫੇਜ਼ਾਂ ਨੂੰ ਬੈਕਟੀਰੀਓ ਨਾਲੋਂ ਖੂਨ ਦੇ ਪ੍ਰਵਾਹ ਤੋਂ ਵਧੇਰੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਬਰਕਰਾਰ ਜਾਂ ਹਟਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਦੂਜੇ ਗੇੜ ਵਿੱਚ, CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੀ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਚੋਣ ਦੋਵਾਂ ਕਲੇਡਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਪਿਛਲਾ ਗੇੜ CSF ਦੇ ਅਪਟੇਕ (ਚਿੱਤਰ 3a) ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਫੇਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸੀ।ਦੁਬਾਰਾ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਖੂਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇ ਬਿਨਾਂ.ਤੀਜੇ ਅਤੇ ਚੌਥੇ ਗੇੜ ਵਿੱਚ ਵੀ, ਫੇਜ ਕਲੋਨ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਚੋਣ ਦੇ ਆਖਰੀ ਦੋ ਗੇੜਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹਰੇਕ ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ (ਚਿੱਤਰ 3b) ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਹੋਰ ਵੀ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਦੋਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦਿਸ਼ਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਾਰੇ 64 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਤੋਂ ਕੁੱਲ 931 ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਸ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਨ।ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਮੋਟਿਫਾਂ ਨੂੰ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ (ਕਟ-ਆਫ: 10% ਸੰਸ਼ੋਧਨ) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6c) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਸਾਰੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਜਾਂਚਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਚੋਣ ਦੇ ਆਮ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮਨੋਰਥ ਦੋਵੇਂ ਚੋਣ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਦੇ ਸਾਰੇ ਪਿਛਲੇ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੁਝ ਨਮੂਨੇ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ SGL, VSG, LGS GSV) ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ A ਤੋਂ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਹੋਰ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ FGW, RTN, WGF, NTR) ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ B ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।
ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਪੇਲੋਡਾਂ ਨਾਲ ਸੰਯੁਕਤ CSF-ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਫੇਜ-ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੇ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ।
(a) ਇਨਜੈਕਟਡ (ਇਨਪੁਟ = I) ਫੇਜ਼ (PFU) ਟਾਇਟਰਾਂ ਅਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ CSF ਫੇਜ਼ ਟਾਇਟਰਾਂ (ਆਉਟਪੁੱਟ = O) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਸਾਰੇ ਚਾਰ ਦੌਰ (R1-R4) ਵਿੱਚ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਐਨਰੀਚਮੈਂਟ ਅਨੁਪਾਤ।ਪਿਛਲੇ ਤਿੰਨ ਗੇੜਾਂ (R2-R4) ਲਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਪਿਛਲੇ ਦੌਰ ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ (R1) ਦੇ ਭਾਰ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਖੁੱਲ੍ਹੀਆਂ ਬਾਰਾਂ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਛਾਂ ਵਾਲੀਆਂ ਬਾਰਾਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।(***p <0.001, ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ)।(b) ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਸੂਚੀ, ਚੋਣ ਦੇ 4 ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ CSF ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਅਨੁਪਾਤ ਅਨੁਸਾਰ ਦਰਜਾਬੰਦੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਛੇ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨ ਚੋਣ (ਇਨਸੈੱਟ) ਦੇ ਰਾਊਂਡ 3 ਅਤੇ 4 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਰੰਗ, ਨੰਬਰ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।(c,d) ਰਾਉਂਡ 4 ਤੋਂ ਛੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ ਕਲੋਨ, ਖਾਲੀ ਫੇਜ਼ ਅਤੇ ਪੇਰੈਂਟਲ ਫੇਜ਼ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦਾ ਇੱਕ CSF ਨਮੂਨਾ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।(c) ਬਰਾਬਰ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ 6 ਉਮੀਦਵਾਰ ਫੇਜ ਕਲੋਨ (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ), ਖਾਲੀ ਫੇਜ਼ (#1779) (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਅਤੇ ਸਟਾਕ ਫੇਜ਼ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ (2 x 1012 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਟੀਕਾ ਲਗਾ ਕੇ ਜਾਨਵਰ ਦੀ ਪੂਛ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 3 ਸੀ.ਐਮ. ਦੁਆਰਾ ਵੱਖਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹਰੇਕ ਟੀਕੇ ਵਾਲੇ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਅਤੇ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ CSF ਫਾਰਮਾੈਕੋਕਿਨੇਟਿਕਸ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।(d) ਨਮੂਨਾ ਲੈਣ ਦੇ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਸਾਰੇ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਫੇਜ਼ਾਂ/mL ਲਈ ਔਸਤ CSF/ਖੂਨ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।(e) ਚਾਰ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਕ੍ਰੈਮਬਲਡ ਕੰਟਰੋਲ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ (ਟੈਟਰਾਮਰ ਡਿਸਪਲੇ) ਦੁਆਰਾ ਟੀਕੇ (ਟੇਲ ਵੇਨ iv, 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਦੁਆਰਾ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਬਾਇਓਟਿਨ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਇਨਟੂਬੇਟਿਡ ਚੂਹੇ (N = 3)।).CSF ਨਮੂਨੇ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਮੇਂ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ CSF ਐਂਟੀ-ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ELISA (nd = ਖੋਜਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ) ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ਟੈਸਟ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ)।(f) ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਦੂਜੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਫੇਜ਼ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕਲੋਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ਼ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕਲੋਨ #2002 (ਜਾਮਨੀ) ਦੇ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਤੁਲਨਾ।ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਅਤੇ ਸਮਾਨ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਰੰਗ-ਕੋਡਿਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਚੌਥੇ ਗੇੜ (ਚਿੱਤਰ 3b) ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਅਮੀਰ ਫੇਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ CSF ਨਮੂਨਾ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰ ਫੇਜ, ਖਾਲੀ ਫੇਜ (ਕੋਈ ਸੰਮਿਲਿਤ ਨਹੀਂ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਬਰਾਬਰ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਕੈਨਿਊਲੇਟਡ CM ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੇਟਿਕਸ CSF (Fig. 3c) ਅਤੇ ਖੂਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7) ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਨੇ ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਫੇਜ਼ (#1779) ਨਾਲੋਂ 10-1000 ਗੁਣਾ ਉੱਚ ਪੱਧਰ 'ਤੇ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਇਆ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਕਲੋਨ #2020 ਅਤੇ #2077 ਵਿੱਚ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ ਨਾਲੋਂ ਲਗਭਗ 1000 ਗੁਣਾ ਵੱਧ CSF ਟਾਇਟਰ ਸਨ।ਹਰੇਕ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦਾ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਵੱਖਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਸਾਰਿਆਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਸੀਐਸਐਫ ਹੋਮਿੰਗ ਸਮਰੱਥਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਕਲੋਨ #1903 ਅਤੇ #2011 ਲਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਕਮੀ ਵੇਖੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕਲੋਨ #2077, #2002 ਅਤੇ #2009 ਲਈ ਪਹਿਲੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਸਰਗਰਮ ਆਵਾਜਾਈ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਪਰ ਇਸਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਕਲੋਨ #2020, #2002, ਅਤੇ #2077 ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਹੋਏ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਵਾਧੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕਲੋਨ #2009 ਦੀ CSF ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਘੱਟ ਗਈ।ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਹਰੇਕ CSF ਉਮੀਦਵਾਰ ਦੀ ਖੂਨ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ਚਿੱਤਰ 3d) ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ।ਹਰੇਕ CSF ਉਮੀਦਵਾਰ ਦੇ ਮਾਧਿਅਮ ਟਾਈਟਰ ਦੇ ਸਾਰੇ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਸਮੇਂ ਇਸਦੇ ਖੂਨ ਦੇ ਟਿਟਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਤਿੰਨ ਖੂਨ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਕਲੋਨ #2077 ਨੇ ਖੂਨ ਦੀ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਦਿਖਾਈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7)।ਇਸ ਗੱਲ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਖੁਦ ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਹੋਰ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮੀ ਨਾਲ ਲਿਜਾਣ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਟਿਨ ਨਾਲ ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜ਼ਡ ਚਾਰ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਿੱਥੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜਦੇ ਹਨ।ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਨੰਬਰ 2002, 2009, 2020 ਅਤੇ 2077) ਨੂੰ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ (SA) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਕੁਝ ਹੱਦ ਤੱਕ ਫੇਜ਼ ਜਿਓਮੈਟਰੀ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਮਲਟੀਮੇਰਿਕ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।ਇਸ ਫਾਰਮੈਟ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ SA ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਨੂੰ ਕਾਰਗੋ-ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਮਾਪਣ ਦੀ ਵੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਫੇਜ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਦੁਬਾਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਇਸ SA-ਸੰਯੁਕਤ ਫਾਰਮੈਟ (ਚਿੱਤਰ 3e) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਬੰਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਕ੍ਰੈਂਬਲਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਘੱਟ ਸੀ ਅਤੇ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਣਡਿੱਠੇ ਪੱਧਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਤੇਜ਼ CSF ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਸੀ।CSF ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਦੇ ਡਿਲੀਵਰੀ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 1 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਦਾ ਸਿੱਧਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ (IHC) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਫੇਜ਼ ਪੇਪਟਾਇਡ ਹਿੱਟ ਦੇ ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਲੋਨ #2002, #2077, ਅਤੇ #2009 ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਦੀਆਂ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਧੱਬਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ਼ (#1779) ਅਤੇ ਕਲੋਨ #2020 ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8)।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪੇਪਟਾਇਡਸ BBB ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਠੀਕ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਾਲ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਨੂੰ ਪਰਖਣ ਲਈ ਹੋਰ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ BSCFB ਰੂਟ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਹੋਰ ਚੁਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਕਲੋਨ (#2002) ਦੇ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਦੇ ਸਮਾਨ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਸਮਾਨ ਆਵਾਜਾਈ ਵਿਧੀ (ਚਿੱਤਰ 3f) ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਇਸਦੇ ਵਿਲੱਖਣ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧੇ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਕਲੋਨ #2077 ਦੀ 48-ਘੰਟਿਆਂ ਦੀ ਲੰਮੀ ਮਿਆਦ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਖੋਜ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਨਿਰੰਤਰ SA ਪੱਧਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4a) ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ CSF ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ।ਹੋਰ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ, #2077 ਨੇ ਦਿਮਾਗ ਦੀਆਂ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਲਈ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਧੱਬਾ ਪਾਇਆ ਅਤੇ ਉੱਚ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 'ਤੇ ਦੇਖੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਮਾਰਕਰ ਲੈਕਟਿਨ ਦੇ ਨਾਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਮੂਹੀਕਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਅਤੇ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੈਰੇਨਚਾਈਮਲ ਸਪੇਸ (ਚਿੱਤਰ 4b) ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਧੱਬੇ।ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਸੀਐਨਐਸ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੇ ਫਾਰਮਾਕੌਲੋਜੀਕਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ i) #2077 ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ ਅਤੇ ii) ਦੇ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਸੰਸਕਰਣਾਂ ਨੂੰ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅਨੁਪਾਤਾਂ 'ਤੇ SA ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ ਸੁਮੇਲ ਲਈ ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਲਈ ਅਸੀਂ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੇ #2077 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ 1:3 ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਦੋਵੇਂ ਨਮੂਨੇ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਬੀਟਾ-ਐਮੀਲੋਇਡ ਪੇਪਟਾਇਡ 40 (ਏਬੇਟਾ 40) ਦੇ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦੇ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।Abeta40 ਨੂੰ CSF ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਪੈਰੇਨਕਾਈਮਾ ਵਿੱਚ BACE1 ਰੋਕ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਦੋਵੇਂ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਨੇ Abeta40 (Fig. 4c, d) ਦੇ ਖੂਨ ਦੇ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘਟਾਇਆ.ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਿਰਫ ਪੈਪਟਾਇਡ ਦੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਨੰ.2077 ਅਤੇ SA ਨਾਲ ਸੰਯੁਕਤ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ ਇੱਕ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੇ ਸੇਰਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਚਿੱਤਰ 4c) ਵਿੱਚ Abeta40 ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਾਇਆ।ਅੰਕੜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੰ.2077 60 kDa SA ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ CNS ਵਿੱਚ ਲਿਜਾਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ ਅਤੇ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ SA-ਸੰਯੁਕਤ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰਾਂ ਨਾਲ ਫਾਰਮਾਕੋਲੋਜੀਕਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
(a) ਟੀ 7 ਫੇਜ਼ ਦਾ ਕਲੋਨਲ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ (2 × 10 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ CM-ਇਨਟੂਬੇਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ CSF ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ਅਤੇ ਅਣਇੰਜੈਕਟਡ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ਼ (#1779) ਦੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।(ਬੀ) ਫੇਜ਼-ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤੇ ਚੂਹਿਆਂ (2 × 10 10 ਫੇਜ਼/ਜਾਨਵਰ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਕਾਰਟਿਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੈਸਲਜ਼ ਦੀ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕਰੋਸਕੋਪਿਕ ਚਿੱਤਰ ਜੋ ਪੇਪਟਾਈਡ #2077 ਅਤੇ ਵੈਸਲਜ਼ (ਲੈਕਟਿਨ) ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨ 3 ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਘੁੰਮਣ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਦਿਮਾਗਾਂ ਨੂੰ ਟੀ 7 ਫੇਜ ਕੈਪਸਿਡ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ FITC-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਸੈਕਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਦਾਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਦਸ ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ, DyLight594-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਲੈਕਟਿਨ ਨੂੰ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਚਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਚਿੱਤਰ, ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੈਸਲਜ਼ ਦੇ ਲਿਊਮਿਨਲ ਸਾਈਡ ਦੇ ਲੈਕਟਿਨ ਸਟੈਨਿੰਗ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਕੇਸ਼ੀਲਾਂ ਅਤੇ ਪੈਰੀਵੈਸਕੁਲਰ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਦੇ ਲੂਮੇਨ ਵਿੱਚ ਫੇਜ (ਹਰੇ) ਨੂੰ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ।ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 10 µm ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ।(c, d) Biotinylated BACE1 ਨਿਰੋਧਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ ਇਕੱਲੇ ਜਾਂ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਕੈਨਿਊਲੇਟਡ CM ਚੂਹਿਆਂ (10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਦੇ ਨਾੜੀ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।Aβ40 ਵਿੱਚ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ-ਵਿਚੋਲਗੀ ਦੀ ਕਮੀ ਨੂੰ Aβ1-40 ELISA ਦੁਆਰਾ ਖੂਨ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ) ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਬਿਹਤਰ ਸਪੱਸ਼ਟਤਾ ਲਈ, 100% ਦੇ ਪੈਮਾਨੇ 'ਤੇ ਗ੍ਰਾਫ 'ਤੇ ਇੱਕ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਖਿੱਚੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।(c) 3:1 ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਅਤੇ BACE1 ਨਿਰੋਧਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਈ ਸਟਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ (ਲਾਲ ਤਿਕੋਣਾਂ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ ਤਿਕੋਣ) ਵਿੱਚ Aβ40 ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਦੀ ਕਮੀ।(d) ਸਿਰਫ਼ BACE1 ਨਿਰੋਧਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ ਨਾਲ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਖੂਨ Aβ40 (ਲਾਲ ਚੱਕਰ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ ਚੱਕਰ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਦੀ ਕਮੀ।ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ Aβ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 420 pg/ml (ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ = 101 pg/ml) ਸੀ।
ਬਾਇਓਮੈਡੀਕਲ ਖੋਜ17 ਦੇ ਕਈ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਵਿਵੋ ਨਾੜੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਧਿਐਨ 18,19 ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਦਿਮਾਗੀ ਨਾੜੀਆਂ 20,21,22,23,24,25,26 ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਚੋਣ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਦਿਮਾਗੀ ਨਾੜੀਆਂ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਸਿੱਧੀ ਪਛਾਣ ਲਈ, ਸਗੋਂ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਲਈ ਸਰਗਰਮ ਆਵਾਜਾਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਲਈ ਵੀ ਵਧਾਇਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਹੁਣ CM ਇਨਟੂਬੇਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਇਨ-ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਅਤੇ CSF ਹੋਮਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੀ ਇਸਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।12-ਮੇਰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਇੱਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ T7 ਫੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਦਿਖਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ ਕਿ T7 ਫੇਜ਼ ਕਾਫ਼ੀ ਛੋਟਾ ਹੈ (ਲਗਭਗ 60 nm ਵਿਆਸ ਵਿੱਚ) 10 ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੋਣ ਲਈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਜਾਂ ਚੋਰੋਇਡ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਕੈਨੁਲੇਟਿਡ CM ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ CSF ਦੀ ਕਟਾਈ ਵਿਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਫੇਜ਼ ਨਾ ਸਿਰਫ ਨਾੜੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਬਲਕਿ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਖੂਨ ਇਕੱਠਾ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਸੀਐਸਐਫ ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜ਼ਾਂ ਲਈ ਐਚਟੀਐਸ ਲਾਗੂ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ ਸੀਐਸਐਫ ਦੀ ਸਾਡੀ ਚੋਣ ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਸਤਾਰ ਲਈ ਖੂਨ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਜਾਂ ਤੰਦਰੁਸਤੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਸੀ.ਹਾਲਾਂਕਿ, ਖੂਨ ਦਾ ਡੱਬਾ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ CSF ਡੱਬੇ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਫੇਜ਼ਾਂ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਆਪ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਖੂਨ ਦੇ ਪ੍ਰਵਾਹ ਵਿੱਚ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਬਚਣਾ ਅਤੇ ਘੁੰਮਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਕੱਚੇ HTS ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਰਕਫਲੋ ਵਿੱਚ ਪਲੇਟਫਾਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤਰਤੀਬ ਦੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਫਿਲਟਰਾਂ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਖੂਨ 24, 27, 28 ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ T7 ਫੇਜ਼ (t½ ~ 28 ਮਿੰਟ) ਦੇ ਤੇਜ਼ ਫਾਰਮਾੈਕੋਕਿਨੇਟਿਕਸ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (t½ ~ 26 ਮਿੰਟ) ਪ੍ਰਤੀ ਮਿੰਟ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅੱਧੇ ਜੀਵਨ ਨੂੰ ਵੀ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ।ਖੂਨ ਅਤੇ CSF ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਦੀ ਖੂਨ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਸਿਰਫ 0.001% ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ T7 ਫੇਜ਼ ਦੀ ਘੱਟ ਪਿਛੋਕੜ ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਕੰਮ ਵਿਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫੇਜ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਲਈ ਜੋ ਸਰਕੂਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸਾਫ਼ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਕੁਝ ਕਲੋਨ CNS ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਬਹੁਤ ਵੱਡੀ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਬਹੁਤ ਸਖਤ CSF ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਸੀਮਤ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸ ਵਿੱਚ ਵਿਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ ਵਿੱਚ ਕਈ ਚੋਣ ਪੜਾਅ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਸੰਚਵ, ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਸਰਵਾਈਵਲ, ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1d ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4M) ਦੇ ਅੰਦਰ ਖੂਨ ਵਿੱਚੋਂ T7 ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਹਟਾਉਣਾ।).ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, CSF ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਲਈ ਇੱਕੋ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਾਲੀ ਸਰੋਤ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਲਈ ਕਈ ਸਖਤ ਚੋਣ ਕਦਮਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਘਟਨਾਵਾਂ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਇੱਕ ਅਨਿੱਖੜਵਾਂ ਅੰਗ ਬਣ ਜਾਣਗੀਆਂ, ਨਤੀਜੇ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਹ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸਮਾਨ CSF ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਸੀ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਉਸੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ, ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੂਲ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਖਾਸ ਕਲੋਨ ਦੀ ਛੋਟੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਕਾਰਨ ਚੋਣ ਨਤੀਜੇ ਵੱਖਰੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
CSF ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਨਮੂਨੇ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਨਮੂਨੇ ਨਾਲੋਂ ਵੱਖਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਅਸੀਂ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸੀਨ-ਅਮੀਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਵੱਲ ਪਹਿਲੀ ਤਬਦੀਲੀ ਨੋਟ ਕੀਤੀ।(ਚਿੱਤਰ 1 ਜੀ, ਪੂਰਕ ਅੰਜੀਰ 4e, 4f)।ਗਲਾਈਸੀਨ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਵਾਲੇ ਫੇਜ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਥਿਰ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸਰਕੂਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਘੱਟ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਹ ਗਲਾਈਸੀਨ-ਅਮੀਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਹੀਂ ਲੱਭੇ ਗਏ ਸਨ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਕਿਉਰੇਟਿਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਚੋਣ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘੀਆਂ: ਇੱਕ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਨੂੰ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਗਈ।ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਗੇੜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ CSF-ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਫੇਜ਼ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਲਗਭਗ ਸਾਰੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ CSF ਵਿੱਚ ਅਮੀਰ ਹੋਣ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇੱਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਹਿੱਟ (#2077) ਦੀ ਹੋਰ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ।ਇਸ ਨੇ ਹੋਰ ਹਿੱਟਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3d ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7) ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਲੰਬਾ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਅਰਧ-ਜੀਵਨ ਦਿਖਾਇਆ, ਅਤੇ ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਪੇਪਟਾਇਡ ਵਿੱਚ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿਸਟੀਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਸੀ।ਇਹ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡਜ਼ ਵਿੱਚ ਸਿਸਟੀਨ ਦਾ ਜੋੜ ਐਲਬਿਊਮਿਨ 29 ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਕੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਫਾਰਮਾੈਕੋਕਿਨੇਟਿਕ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਲਈ ਅਣਜਾਣ ਹੈ ਅਤੇ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਕੁਝ ਪੇਪਟਾਇਡਜ਼ ਨੇ CSF ਸੰਸ਼ੋਧਨ (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੈਲੈਂਸ-ਨਿਰਭਰਤਾ ਦਿਖਾਈ, ਜੋ ਕਿ T7 ਕੈਪਸਿਡ ਦੀ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਸਤਹ ਜਿਓਮੈਟਰੀ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਗਏ T7 ਸਿਸਟਮ ਨੇ ਹਰੇਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪ੍ਰਤੀ ਫੇਜ਼ ਕਣ ਦੀਆਂ 5-15 ਕਾਪੀਆਂ ਦਿਖਾਈਆਂ।IHC ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਕਾਰਟੈਕਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8) ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਉਮੀਦਵਾਰ ਲੀਡ ਫੇਜ ਕਲੋਨ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਕਲੋਨ (ਨੰਬਰ 2002, ਨੰਬਰ 2009 ਅਤੇ ਨੰਬਰ 2077) ਨੇ ਬੀਬੀਬੀ ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕੀਤੀ।ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਬਾਕੀ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਇਸ BBB ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ CSF ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਇਹਨਾਂ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਗਤੀ ਨੂੰ BCSFB ਵਿੱਚ ਸਿੱਧਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਆਪਣੀ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ SA ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਜ਼ਰੂਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਚਿੱਤਰ 3e) ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਲੀਡ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 SA ਵਿੱਚ ਸੰਯੁਕਤ BACE1 ਦੇ ਇੱਕ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੀ ਦਿਮਾਗੀ ਕਾਰਵਾਈ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ CSF (ਚਿੱਤਰ 4) ਵਿੱਚ Abeta40 ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘਟਾ ਕੇ CNS ਵਿੱਚ ਫਾਰਮਾਕੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਸਾਰੀਆਂ ਹਿੱਟਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਸਮਰੂਪ ਖੋਜ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਸੀ।ਇਹ ਨੋਟ ਕਰਨਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿ T7 ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਆਕਾਰ ਲਗਭਗ 109 ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ 12-mers ਲਈ ਸਿਧਾਂਤਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਆਕਾਰ 4 x 1015 ਹੈ। ਇਸਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ 12-mer ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਸਪੇਸ ਦੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਜਿਹੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਚੁਣਿਆ ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਵਧੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਸਪੇਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਕਲਪਨਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸਾਨੂੰ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੇ ਕੋਈ ਵੀ ਕੁਦਰਤੀ ਸਮਰੂਪ ਨਾ ਮਿਲਣ ਦੇ ਕਾਰਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਕਾਰਨ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੇ ਬੇਕਾਬੂ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਵਿਕਾਸਵਾਦ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਅਣਚੋਣ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਸੇਰਬ੍ਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਕੰਮ ਲਈ ਇੱਕ ਅਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਵਿਧੀ ਦਾ ਮੁਢਲਾ ਸੈਟਅਪ ਇੱਕ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ ਜੋ ਨਾ ਸਿਰਫ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਵੈਸਕੁਲਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਬਲਕਿ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਕਦਮ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਫਲ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸੀਐਨਐਸ ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਵੀਵੋ ਵਿੱਚ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਦੀ ਵਿਧੀ ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਖੇਤਰ ਲਈ ਖਾਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੈਸਕੁਲੇਚਰ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਤਰਜੀਹ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਇਸ ਨਾਲ ਬੀਬੀਬੀ ਅਤੇ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਲਈ ਨਵੇਂ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਸਿੱਧੇ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਨਾਲ ਜਾਂ BBB ਜਾਂ BCSFB ਦੁਆਰਾ ਟਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਲਿਗੈਂਡਸ ਨਾਲ ਜੋੜ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਗਏ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਵੈਕਟਰਾਂ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਵੇਗੀ।ਅਸੀਂ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ BBB ਅਤੇ/ਜਾਂ BCSFB ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਲਈ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਦਿਮਾਗੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰ ਰਹੇ ਹਾਂ।ਇਹ ਨਵੇਂ ਪੈਪਟਾਇਡਜ਼ ਨਵੇਂ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਜਾਂ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ ਖੋਜ ਲਈ ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਬਾਇਓਲੋਜੀਸ ਵਰਗੇ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਦੀ ਡਿਲਿਵਰੀ ਲਈ ਨਵੇਂ ਉੱਚ ਕੁਸ਼ਲ ਪਲੇਟਫਾਰਮਾਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਲਈ ਬਹੁਤ ਕੀਮਤੀ ਸਾਧਨ ਹੋਣਗੇ।
ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਿਤ ਵਿਧੀ ਦੀ ਸੋਧ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵੱਡੇ ਸਿਸਟਰਨਾ (CM) ਨੂੰ ਕੈਨੁਲੇਟ ਕਰੋ।ਬੇਹੋਸ਼ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਵਿਸਟਾਰ ਚੂਹਿਆਂ (200-350 ਗ੍ਰਾਮ) ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਯੰਤਰ ਉੱਤੇ ਮਾਊਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਬੇਨਕਾਬ ਕਰਨ ਲਈ ਸ਼ੇਵਡ ਅਤੇ ਅਸੈਪਟਲੀ ਨਾਲ ਤਿਆਰ ਖੋਪੜੀ ਉੱਤੇ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਚੀਰਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਉਪਰਲੇ ਸੈਸ਼ ਦੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਛੇਕ ਡ੍ਰਿਲ ਕਰੋ ਅਤੇ ਛੇਕਾਂ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸਿੰਗ ਪੇਚਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹੋ।CM ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਕੈਨੁਲਾ ਦੀ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਮਾਰਗਦਰਸ਼ਨ ਲਈ ਲੇਟਰਲ ਓਸੀਪੀਟਲ ਕਰੈਸਟ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਮੋਰੀ ਡ੍ਰਿਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਕੈਨੁਲਾ ਦੇ ਦੁਆਲੇ ਦੰਦਾਂ ਦਾ ਸੀਮਿੰਟ ਲਗਾਓ ਅਤੇ ਪੇਚਾਂ ਨਾਲ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕਰੋ।ਫੋਟੋ-ਕਿਊਰਿੰਗ ਅਤੇ ਸੀਮਿੰਟ ਦੇ ਸਖ਼ਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਚਮੜੀ ਦੇ ਜ਼ਖ਼ਮ ਨੂੰ 4/0 ਸੁਪਰਮਿਡ ਸਿਉਚਰ ਨਾਲ ਬੰਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ.ਕੈਨੁਲਾ ਦੀ ਸਹੀ ਪਲੇਸਮੈਂਟ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਦੇ ਆਪੋ-ਆਪਣੀ ਲੀਕ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਯੰਤਰ ਤੋਂ ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਹਟਾਓ, ਉਚਿਤ ਪੋਸਟੋਪਰੇਟਿਵ ਦੇਖਭਾਲ ਅਤੇ ਦਰਦ ਪ੍ਰਬੰਧਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤੇ ਤੱਕ ਠੀਕ ਹੋਣ ਦਿਓ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਸੰਕੇਤ ਨਹੀਂ ਵੇਖੇ ਜਾਂਦੇ।ਵਿਸਟਾਰ ਚੂਹੇ (Crl:WI/Han) ਚਾਰਲਸ ਰਿਵਰ (ਫਰਾਂਸ) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਾਰੇ ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰੋਗਾਣੂ-ਮੁਕਤ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਾਰੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਸਵਿਟਜ਼ਰਲੈਂਡ ਦੇ ਸ਼ਹਿਰ ਬਾਸੇਲ ਦੇ ਵੈਟਰਨਰੀ ਦਫਤਰ ਦੁਆਰਾ ਮਨਜ਼ੂਰੀ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਲਾਇਸੰਸ ਨੰਬਰ 2474 (ਚੂਹੇ ਦੇ ਸੇਰੇਬਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਉਪਚਾਰਕ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
CM ਕੈਨੁਲਾ ਨੂੰ ਹੱਥ ਵਿੱਚ ਲੈ ਕੇ ਹੌਲੀ ਹੌਲੀ ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਚੇਤੰਨ ਰੱਖੋ।ਕੈਨੁਲਾ ਤੋਂ ਡੈਟੂਰਾ ਨੂੰ ਹਟਾਓ ਅਤੇ 10 µl ਸਵੈ-ਪ੍ਰਤੀਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਹਿਣ ਵਾਲੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ।ਕਿਉਂਕਿ ਕੈਨੂਲਾ ਦੀ ਪੇਟੈਂਸੀ ਨਾਲ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਮਝੌਤਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੀ ਗੰਦਗੀ ਜਾਂ ਰੰਗੀਨ ਹੋਣ ਦੇ ਕੋਈ ਸਬੂਤ ਦੇ ਨਾਲ ਸਿਰਫ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਨਮੂਨੇ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਵਿੱਚ, ਲਗਭਗ 10-20 μl ਖੂਨ ਨੂੰ ਪੂਛ ਦੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਚੀਰੇ ਤੋਂ ਹੈਪਰੀਨ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਵਾਲੀਆਂ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਟੀ 7 ਫੇਜ ਦੇ ਨਾੜੀ ਦੇ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਸੀਐਸਐਫ ਅਤੇ ਖੂਨ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ CSF ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਲਗਭਗ 5-10 μl ਤਰਲ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਕੈਥੀਟਰ ਦੇ ਮਰੇ ਹੋਏ ਵਾਲੀਅਮ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ।
ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ T7Select 10-3b ਵੈਕਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ T7Select ਸਿਸਟਮ ਮੈਨੂਅਲ (ਨੋਵਾਗੇਨ, ਰੋਜ਼ੇਨਬਰਗ ਐਟ ਅਲ., ਇਨੋਵੇਸ਼ਨਜ਼ 6, 1-6, 1996) ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਬੇਤਰਤੀਬ 12-ਮੇਰ ਡੀਐਨਏ ਸੰਮਿਲਨ ਨੂੰ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਫਾਰਮੈਟ ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ:
NNK ਕੋਡੋਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੰਮਿਲਨ ਵਿੱਚ ਡਬਲ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਅਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।N ਹਰੇਕ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਦਾ ਹੱਥੀਂ ਮਿਸ਼ਰਤ ਸਮਾਨ ਅਨੁਪਾਤ ਹੈ, ਅਤੇ K ਐਡੀਨਾਈਨ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਸਾਈਨ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਾਂ ਦਾ ਹੱਥੀਂ ਮਿਸ਼ਰਤ ਸਮਾਨ ਅਨੁਪਾਤ ਹੈ।ਸਿੰਗਲ ਫਸੇ ਹੋਏ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕਲੇਨੋ ਬਫਰ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਜ਼) ਵਿੱਚ dNTP (ਨੋਵਾਗੇਨ) ਅਤੇ ਕਲੇਨੋ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਜ਼) ਨਾਲ ਹੋਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, EtOH ਵਰਖਾ ਦੁਆਰਾ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ.ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪਾਬੰਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ EcoRI ਅਤੇ HindIII (ਦੋਵੇਂ ਰੋਚੇ ਤੋਂ) ਨਾਲ ਹਜ਼ਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਲੀਵਡ ਅਤੇ ਪਿਊਰੀਫਾਈਡ (QIAquick, Qiagen) ਇਨਸਰਟ (T4 ligase, New England Biolabs) ਨੂੰ ਫਿਰ 10B ਕੈਪਸਿਡ ਜੀਨ ਦੇ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ 348 ਦੇ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰੀ-ਕਲੀਵਡ T7 ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਫਰੇਮ ਵਿੱਚ ਲੀਗੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਤੋਂ 18 ਘੰਟੇ ਪਹਿਲਾਂ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ 16 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਪੈਕੇਜਿੰਗ T7Select 10-3b ਕਲੋਨਿੰਗ ਕਿੱਟ (ਨੋਵਾਗੇਨ) ਦੇ ਨਾਲ ਸਪਲਾਈ ਕੀਤੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਘੋਲ ਨੂੰ ਏਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ (BLT5615, ਨੋਵਾਗੇਨ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਵਾਰ ਲਾਈਸਿਸ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਲਾਈਸੈਟਸ ਨੂੰ ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਦੇ ਸਟਾਕ ਘੋਲ ਵਜੋਂ -80° C. 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਟਾਇਟਰੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਪ੍ਰੋਪਰਾਈਟਰੀ 454/ਰੋਚੇ-ਐਂਪਲੀਕਨ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਰੋਥ ਜਾਂ ਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਫੇਜ਼ ਵੇਰੀਏਬਲ ਖੇਤਰਾਂ ਦਾ ਸਿੱਧਾ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ।ਫਾਰਵਰਡ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਵੇਰੀਏਬਲ ਖੇਤਰ (NNK) 12 (ਟੈਂਪਲੇਟ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼), GS FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਅਡਾਪਟਰ A, ਅਤੇ ਇੱਕ ਚਾਰ-ਬੇਸ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਕੁੰਜੀ ਕ੍ਰਮ (TCAG) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1a):
ਰਿਵਰਸ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਕੈਪਚਰ ਬੀਡਜ਼ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਬਾਇਓਟਿਨ ਅਤੇ ਐਮਲਸ਼ਨ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕਲੋਨਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ GS FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਅਡਾਪਟਰ ਬੀ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ:
ਫਿਰ ਐਂਪਲੀਕਨਾਂ ਨੂੰ 454 GS-FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ 454/Roche pyrosequencing ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮੈਨੁਅਲ ਸੈਂਗਰ ਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ ਹਿਟਾਚੀ 3730 xl ਡੀਐਨਏ ਐਨਾਲਾਈਜ਼ਰ), T7 ਫੇਜ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋੜਿਆਂ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ:
ਰੋਸ਼ ਫਾਸਟ ਸਟਾਰਟ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਕਿੱਟ (ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਅਨੁਸਾਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤਖ਼ਤੀਆਂ ਤੋਂ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ ਗਰਮ ਸ਼ੁਰੂਆਤ (95 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ) ਅਤੇ 35 ਬੂਸਟ ਚੱਕਰ (95 °C 'ਤੇ 50 s, 50 °C 'ਤੇ 1 ਮਿੰਟ, ਅਤੇ 72 °C 'ਤੇ 1 ਮਿੰਟ) ਕਰੋ।
ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਤੋਂ ਫੇਜ, ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ ਫੇਜ, CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਬਚਾਏ ਗਏ ਫੇਜ, ਜਾਂ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ Escherichia coli BL5615 ਵਿੱਚ TB ਬਰੋਥ (ਸਿਗਮਾ ਐਲਡਰਿਕ) ਵਿੱਚ ਜਾਂ 500 cm2 ਪਕਵਾਨਾਂ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਵਿੱਚ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟੇ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਿਸ-ਈਡੀਟੀਏ ਬਫਰ (ਫਲੂਕਾ ਐਨਾਲਿਟਿਕਲ) ਨਾਲ ਕੁਰਲੀ ਕਰਕੇ ਜਾਂ ਨਿਰਜੀਵ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪਸ ਨਾਲ ਪਲੇਕਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਕੇ ਪਲੇਟਾਂ ਤੋਂ ਫੇਜ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫੇਜ਼ ਨੂੰ ਕਲਚਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਜਾਂ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਬਫਰ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪੋਲੀਥੀਲੀਨ ਗਲਾਈਕੋਲ (ਪੀਈਜੀ 8000) ਵਰਖਾ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ) ਦੇ ਇੱਕ ਦੌਰ ਨਾਲ ਟ੍ਰਿਸ-ਈਡੀਟੀਏ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਮੁੜ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫੇਜ ਨੂੰ ਨਾੜੀ (IV) ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ (500 μl/ਜਾਨਵਰ) ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਰਿਮੂਵਲ ਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ ਬਾਇਓਟੈਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਹਟਾਉਣ ਦੇ 2-3 ਦੌਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, 2×1012 ਫੇਜ਼ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ;ਦੂਜੇ ਵਿੱਚ, 2×1010 ਫੇਜ਼;ਤੀਜੇ ਅਤੇ ਚੌਥੇ ਚੋਣ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਤੀ ਜਾਨਵਰ 2×109 ਪੜਾਅ।CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਅਤੇ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਖੂਨ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ (T7 ਸਿਲੈਕਟ ਸਿਸਟਮ ਮੈਨੂਅਲ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪਲੇਕ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।Phage selection was performed by intravenous injection of purified libraries into the tail vein or by re-injection of phage extracted from CSF from the previous selection round, and subsequent harvests were performed at 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, and 240 min respectively CSF and blood samples.ਇਨ ਵਿਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਕੁੱਲ ਚਾਰ ਗੇੜ ਕਰਵਾਏ ਗਏ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਗੇੜਾਂ ਦੌਰਾਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੋ ਗੇੜਾਂ ਤੋਂ CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜ਼ ਇਨਸਰਟਸ ਨੂੰ 454/Roche pyrosequencing ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਚੋਣ ਦੇ ਆਖਰੀ ਦੋ ਗੇੜਾਂ ਤੋਂ CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਕਲੋਨ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਗੇੜ ਦੇ ਸਾਰੇ ਖੂਨ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵੀ 454/ਰੋਚੇ ਪਾਈਰੋਸੇਕੈਂਸਿੰਗ ਦੇ ਅਧੀਨ ਸਨ।ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਦੇ ਟੀਕੇ ਲਈ, ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਫੇਜ਼ਾਂ ਨੂੰ E. ਕੋਲੀ (BL5615) ਵਿੱਚ 500 cm2 ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਅਤੇ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕਲੋਨ ਟੀਬੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਫੇਜ ਕੱਢਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਅਤੇ ਹਟਾਉਣ (ਜਿਵੇਂ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ), 300 μl ਵਿੱਚ 2×1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਕ੍ਰਮ ਡੇਟਾ ਦੀ ਪ੍ਰੀਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਅਤੇ ਗੁਣਾਤਮਕ ਫਿਲਟਰਿੰਗ।Raw 454/Roche ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਵਿਕਰੇਤਾ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਾਈਨਰੀ ਸਟੈਂਡਰਡ ਸਟ੍ਰੀਮ ਮੈਪ ਫਾਰਮੈਟ (sff) ਤੋਂ ਪੀਅਰਸਨ ਮਨੁੱਖੀ ਪੜ੍ਹਨਯੋਗ ਫਾਰਮੈਟ (ਫਾਸਟ) ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਮਲਕੀਅਤ ਸੀ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਾਂ ਅਤੇ ਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ (ਅਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਡੇਟਾ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਸਖਤ ਮਲਟੀ-ਸਟੇਜ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਗਲੋਬਲ ਸੂਈਰਮੈਨ-ਵਾਂਸ਼ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੜ੍ਹਨ ਲਈ ਪੁਨਰਗਠਨ (ਕਲਿਕ ਕਰੋ) ਅਤੇ ਪਿਛੋਕੜ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕਰੋ (XCctGGGGGGACGCCACTCGAATCGACGACGTCCTCATCATCGACGTCGTCGTCGTCGTCGTCGCTCGTCGTCGTCGCTCGTCGTCGCTCGTCGTCGTCGTCGCTCGTCGTCGCTCGTCGTCGTCGCTCCTCGTCGTCGTCGTCGCTCGTCGTCGCTCGTCGRCACGCTCGTCCTCACTCGTCGTCGTCGCTCGTCGTCGCTCGTCGTCGRCGCTCGTCGTCGTCGCTCGTCCGCTC) ਅਤੇ ਪਿਛੋਕੜ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕਰੋ.ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਪ੍ਰਤੀ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ 31 ਤੱਕ 2 ਅਸੰਗਤੀਆਂ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।ਇਸਲਈ, ਬਿਨਾਂ ਸਟਾਰਟ ਅਤੇ ਸਟਾਪ ਟੈਗਾਂ ਦੇ ਪੜ੍ਹੇ ਅਤੇ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਇਨਸਰਟਸ ਵਾਲੇ ਰੀਡਜ਼, ਭਾਵ, ਅਲਾਈਨਮੈਂਟਸ ਜੋ ਅਨੁਮਤੀ ਦੀ ਅਨੁਮਤੀ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹਨ, ਨੂੰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਬਾਕੀ ਰੀਡਜ਼ ਲਈ, N-mer DNA ਕ੍ਰਮ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚਿੰਨ੍ਹ ਤੋਂ ਵਧਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਟਾਪ ਮਾਰਕ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਖਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਸਲ ਰੀਡ ਕ੍ਰਮ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ "ਇਨਸਰਟ" ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ)।ਸੰਮਿਲਨ ਦੇ ਅਨੁਵਾਦ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪਹਿਲੇ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਸੰਮਿਲਨ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਅਧੂਰੇ ਕੋਡਨ ਵੱਲ ਅਗਵਾਈ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਨੂੰ ਵੀ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਿਰਫ਼ ਬੈਕਗ੍ਰਾਊਂਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਾਲੇ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਪੈਟਰਨ "PAG" ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਅਨੁਵਾਦਿਤ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।3 ਤੋਂ ਘੱਟ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਪੋਸਟ-ਅਨੁਵਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਸੰਮਿਲਿਤ ਪੂਲ ਵਿੱਚ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾਓ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਵਿਲੱਖਣ ਸੰਮਿਲਨ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ।ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ (ਇਨਸਰਟਸ) ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ (ਪੜ੍ਹਨ) ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ (ਪੂਰਕ ਅੰਕੜੇ 1c ਅਤੇ 2) ਦੀ ਇੱਕ ਸੂਚੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।
ਕ੍ਰਮ ਸਮਾਨਤਾ ਦੁਆਰਾ ਗਰੁੱਪ N-mer DNA ਸੰਮਿਲਨ: 454/Roche-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕ੍ਰਮ ਸੰਬੰਧੀ ਤਰੁਟੀਆਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ homopolymer ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ) ਅਤੇ ਘੱਟ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ, ਪਹਿਲਾਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ N-mer DNA ਕ੍ਰਮ ਸੰਮਿਲਨ (ਇਨਸਰਟਸ) ਸਮਾਨਤਾ ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।ਸੰਮਿਲਨ (2 ਗੈਰ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਬੇਸਾਂ ਤੱਕ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਹੈ) ਇੱਕ ਦੁਹਰਾਓ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ: ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ (ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ) ਦੁਆਰਾ ਛਾਂਟਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਉਹ ਸਮਾਨ ਹਨ, ਤਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੁਆਰਾ ਸੈਕੰਡਰੀ ਕ੍ਰਮਬੱਧ (ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬੇ ਤੋਂ ਛੋਟੇ) ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਕਸਰ ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬੇ ਸੰਮਿਲਨ ਪਹਿਲੇ "ਸਮੂਹ" ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਮੂਹ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਕੁੰਜੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਫਿਰ, ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਸੂਚੀ ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਬਚੇ ਹਰੇਕ ਸੰਮਿਲਨ ਨੂੰ ਜੋੜੇ ਅਨੁਸਾਰ ਨੀਡਲਮੈਨ-ਵੰਸ਼ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਦੁਆਰਾ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਜੇਕਰ ਇੱਕ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਬੇਮੇਲ, ਸੰਮਿਲਨ, ਜਾਂ ਮਿਟਾਉਣ ਦੀ ਸੰਖਿਆ 2 ਦੀ ਇੱਕ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਇੱਕ ਸੰਮਿਲਨ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਮੁੱਚੀ ਸਮੂਹ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਇਸ ਗੱਲ ਨਾਲ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੰਮਿਲਨ ਨੂੰ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਵਰਤੇ ਗਏ ਵਜੋਂ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕ੍ਰਮ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਮੌਜੂਦ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਢੁਕਵੀਂ ਸੰਮਿਲਿਤ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਾਲ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਮੂਹ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਵਜੋਂ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਦੁਹਰਾਓ ਉਦੋਂ ਖਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਹਰੇਕ ਸੰਮਿਲਨ ਕ੍ਰਮ ਜਾਂ ਤਾਂ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਮੂਹ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਮੌਜੂਦ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਖ਼ਰਕਾਰ, ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਵਾਲੇ ਸਮੂਹਿਕ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਅਨੁਵਾਦ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਅਨੁਸਾਰੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾਵਾਂ ਜੋ ਲਗਾਤਾਰ ਰੀਡਜ਼ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਬਣਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2)।
ਮੋਟਿਫ ਜਨਰੇਸ਼ਨ: ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਸੂਚੀ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਇੱਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਬਣਾਈ ਗਈ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਸੰਭਵ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਪੈਟਰਨ (ਏ.ਏ.) ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਲੰਬਾਈ 3 ਦੇ ਹਰੇਕ ਸੰਭਾਵੀ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਉਲਟ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਇੱਕ ਆਮ ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਪੈਟਰਨ (ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡਸ) ਸਨ।ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਰ, ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਇਡ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕੰਪਿਊਟੇਸ਼ਨਲ ਟੂਲਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਲੱਭੇ ਗਏ ਮੋਟਿਫ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡ ਵਾਲੇ ਪੈਪਟਾਇਡ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ("ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ") ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮੋਟਿਫ ਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਇੱਕ ਦੋ-ਅਯਾਮੀ ਐਰੇ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡਸ (ਮੋਟਿਫਸ) ਦੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਘਟਨਾਵਾਂ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮੁੱਲ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਰੀਡਸ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਹੈ ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਅਨੁਰੂਪ ਮੋਟਿਫ ਬਣਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਰੀਡਜ਼ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ, ਸਮੂਹ ਅਤੇ ਅਨੁਵਾਦ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਜਿਵੇਂ ਉੱਪਰ ਵੇਰਵੇ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਨਮੂਨੇ ਅਤੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸਕੈਟਰਪਲੋਟਸ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦਾ ਸਧਾਰਣਕਰਨ: ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ
ਜਿੱਥੇ ni ਵਿਸ਼ੇ i ਨੂੰ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਪੜ੍ਹਨ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, vi ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫ i ਵਾਲੇ ਰੀਡਜ਼ (ਜਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਸ) ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਟੀਕ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗੈਰ-ਸਧਾਰਨ ਸੰਖਿਆ ਲਈ ਪੀ-ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਮਨੋਰਥਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਕੋਰੀਲੋਗ੍ਰਾਮਾਂ ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਸਪੀਅਰਮੈਨ ਦੇ ਸਬੰਧਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਆਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇਰਾਦਿਆਂ ਦੀ ਸਧਾਰਨ ਸੰਖਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਵੈੱਬ ਲੋਗੋਗ੍ਰਾਮ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਪਹਿਲਾਂ, 12-ਮੇਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਨੂੰ 20×12 ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਫਿਰ, ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਸਮੱਗਰੀ ਵਾਲੇ 1000 ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਸੈੱਟ ਫਾਸਟ-ਸਿਕਵੇਂਸ ਫਾਰਮੈਟ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵੈੱਬ-ਲੋਗੋ 3 ਨੂੰ ਇਨਪੁਟ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਗ੍ਰਾਫਿਕਲ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਈ।ਬਹੁ-ਆਯਾਮੀ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, R (ਬਾਇਓਸਹੀਟਮੈਪ, ਅਜੇ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਆਰ ਪੈਕੇਜ) ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਕਸਤ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਰਮੀ ਦੇ ਨਕਸ਼ੇ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਗਰਮੀ ਦੇ ਨਕਸ਼ਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਡੇਂਡਰੋਗ੍ਰਾਮਾਂ ਨੂੰ ਯੂਕਲੀਡੀਅਨ ਦੂਰੀ ਮੈਟ੍ਰਿਕ ਦੇ ਨਾਲ ਵਾਰਡ ਦੀ ਲੜੀਵਾਰ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਮੋਟਿਫ ਸਕੋਰਿੰਗ ਡੇਟਾ ਦੇ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਹੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਅਸਧਾਰਨ ਸਕੋਰਿੰਗ ਲਈ P ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਜਾਂ ANOVA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹੋਰ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਲਈ P-ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ R ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਫੇਜ਼ ਕਲੋਨ ਅਤੇ ਬਿਨਾਂ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਦੇ ਫੇਜਾਂ ਨੂੰ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ (300 μl PBS ਵਿੱਚ 2×1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਰਾਹੀਂ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਦਸ ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ, ਉਹੀ ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ 100 μl DyLight594-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਲੈਕਟਿਨ (ਵੈਕਟਰ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼ ਇੰਕ., DL-1177) ਦੇ ਨਾਲ ਨਾੜੀ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫੇਜ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 60 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ, ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ 50 ਮਿ.ਲੀ. ਪੀ.ਬੀ.ਐਸ. ਅਤੇ 50 ਮਿ.ਲੀ. 4% ਪੀ.ਐਫ.ਏ./ਪੀ.ਬੀ.ਐਸ.ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਨਮੂਨੇ 4% PFA/PBS ਵਿੱਚ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਫਿਕਸ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ 30% ਸੁਕਰੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਰਾਤ ਨੂੰ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਵਿੱਚ ਭਿੱਜ ਗਏ ਸਨ।ਨਮੂਨੇ OCT ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ ਫਲੈਸ਼ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮੀਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 µm ਕ੍ਰਾਇਓਸੈਕਸ਼ਨਾਂ 'ਤੇ 1% BSA ਨਾਲ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 4 °C 'ਤੇ T7 ਫੇਜ਼ (ਨੋਵਸ NB 600-376A) ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ FITC-ਲੇਬਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਰਾਤ ਭਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ.ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਕਨਫੋਕਲ ਲੇਜ਼ਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਲੀਕਾ TCS SP5) ਨਾਲ ਜਾਂਚਿਆ ਗਿਆ।
98% ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਜੈਨਸਕ੍ਰਿਪਟ ਯੂਐਸਏ ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਅਤੇ ਲਾਇਓਫਿਲਾਈਜ਼ਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਬਾਇਓਟਿਨ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਟ੍ਰਿਪਲ ਗਲਾਈਸੀਨ ਸਪੇਸਰ ਦੁਆਰਾ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਾਰੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰੋ।
ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ (ਸਿਗਮਾ S0677) ਨੂੰ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡ, ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ BACE1 ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ 5-ਗੁਣਾ ਸਮਤੋਲ ਵਾਧੂ, ਜਾਂ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ BACE1 ਇਨਿਹਿਬੀਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ ਸੁਮੇਲ (3:1 ਅਨੁਪਾਤ) ਅਤੇ BACE1 ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ- SOBS1015% ਵਿੱਚ ਐਸਓਬੀਐਸਯੂਬੀਐਸਡੀਐਮ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟਾ.ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗੀ ਖੋਲ ਵਾਲੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੀ ਪੂਛ ਦੀਆਂ ਨਾੜੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਵਿੱਚ 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ ਦੀ ਖੁਰਾਕ ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਏਲੀਸਾ ਦੁਆਰਾ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਪੇਪਟਾਇਡ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।Nunc Maxisorp ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਾਈਟਰ ਪਲੇਟਾਂ (ਸਿਗਮਾ) ਨੂੰ 1.5 μg/ml ਮਾਊਸ ਐਂਟੀ-ਸਟਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਥਰਮੋ, MA1-20011) ਨਾਲ 4°C 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਕੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ਜੈਲੇਟਿਨ, 1% BSA) ਨੂੰ ਬਲਾਕ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਲੇਟ ਨੂੰ 0.05% Tween-20/PBS (ਧੋਣ ਬਫਰ) ਨਾਲ ਧੋਵੋ ਅਤੇ 3 ਦੇ ਨਾਲ ਬਲਾਕਿੰਗ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਨਾਲ ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਲਾਸਮਾ 1:10,000, CSF 1:115)।ਫਿਰ ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਖੋਜਣ ਵਾਲੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (1 μg/ml, ਐਂਟੀ-ਸਟਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-HRP, ਨੋਵਸ NB120-7239) ਦੇ ਨਾਲ 4°C 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਧੋਣ ਦੇ ਤਿੰਨ ਕਦਮਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨੂੰ ਟੀਐਮਬੀ ਸਬਸਟਰੇਟ ਘੋਲ (ਰੋਚੇ) ਵਿੱਚ 20 ਮਿੰਟ ਤੱਕ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।1M H2SO4 ਨਾਲ ਰੰਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 450 nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਨੂੰ ਮਾਪੋ।
ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ (ਵਾਕੋ, 294-64701) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ Aβ(1-40) ELISA ਦੁਆਰਾ streptavidin-peptide-BACE1 ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਕੰਮ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, CSF ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਮਿਆਰੀ ਪਤਲੇ (1:23) ਵਿੱਚ ਪੇਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ BNT77 ਕੈਪਚਰ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਲੇਪ ਵਾਲੀਆਂ 96-ਖੂਹ ਵਾਲੀਆਂ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ 4°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਧੋਣ ਦੇ ਪੰਜ ਕਦਮਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, HRP-ਸੰਯੁਕਤ BA27 ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੰਜ ਧੋਣ ਦੇ ਕਦਮ ਹਨ।Aβ(1–40) ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ TMB ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਟੌਪ ਘੋਲ ਨਾਲ ਰੰਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 450 nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਨੂੰ ਮਾਪੋ।Aβ(1–40) ELISA ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਠੋਸ ਪੜਾਅ ਕੱਢਣ ਦੇ ਅਧੀਨ ਸਨ।ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਨੂੰ 96-ਖੂਹ ਵਾਲੀਆਂ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ 0.2% ਡੀਈਏ (ਸਿਗਮਾ) ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।SPE ਪਲੇਟਾਂ (Oasis, 186000679) ਨੂੰ ਪਾਣੀ ਅਤੇ 100% ਮਿਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਦੇ ਨਮੂਨੇ SPE ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਤਰਲ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨੇ ਧੋਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਪਹਿਲਾਂ 5% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਫਿਰ 30% ਮੀਥੇਨੌਲ) ਅਤੇ 2% NH4OH/90% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਨਸ਼ਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਥਿਰ N2 ਕਰੰਟ 'ਤੇ 99 ਮਿੰਟ ਲਈ 55°C 'ਤੇ ਐਲੂਏਟ ਨੂੰ ਸੁਕਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਾਇਲੁਐਂਟਸ ਵਿੱਚ ਘਟਾਏ ਗਏ ਅਤੇ Aβ(1–40) ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ।
ਇਸ ਲੇਖ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਕਿਵੇਂ ਦੇਣਾ ਹੈ: Urich, E. et al.ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਕਾਰਗੋ ਡਿਲੀਵਰੀ।ਵਿਗਿਆਨ.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015)।
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ਅਤੇ Moos T. ਟਾਰਗੇਟਡ ਥੈਰੇਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਸਪੁਰਦਗੀ।ਜਰਨਲ ਆਫ਼ ਨਿਊਰੋਕੈਮਿਸਟਰੀ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ਅਤੇ Martinez-Martinez, P. ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਪੇਪਟਾਈਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਸਪੁਰਦਗੀ।Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂਐਮ ਬਲੱਡ-ਬ੍ਰੇਨ ਬੈਰੀਅਰ: ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਦਵਾਈ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ।NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)।
ਜੋਹਾਨਸਨ, ਕੇ.ਈ., ਡੰਕਨ, ਜੇ.ਏ., ਸਟੋਪਾ, ਈਜੀ, ਅਤੇ ਬਾਇਰਡ, ਏ. ਕੋਰੋਇਡ ਪਲੇਕਸਸ-ਸੀਐਸਐਫ ਪਾਥਵੇਅ ਰਾਹੀਂ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਅਤੇ ਡਰੱਗ ਡਿਲਿਵਰੀ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਲਈ ਸੰਭਾਵਨਾਵਾਂ।ਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਰਿਸਰਚ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂਐਮ ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਅਣੂ ਟਰੋਜਨ ਘੋੜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਬਾਇਓਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਦਾ ਆਧੁਨਿਕੀਕਰਨ।ਬਾਇਓਕੋਨਜਗ ਕੈਮ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂਐਮ ਰੀਸੈਪਟਰ-ਵਿਚੋਲੇ ਪੈਪਟਾਇਡ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਐਂਡੋਕਰ ਰਿਵ. 7, 314–330 (1986)।
ਨੀਵੋਹੇਨਰ, ਜੇ. ਐਟ ਅਲ.ਮੋਨੋਵੈਲੈਂਟ ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਸ਼ਟਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦਿਮਾਗੀ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਅਤੇ ਉਪਚਾਰਕ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਓ।ਨਿਊਰੋਨ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
ਬਿਏਨ-ਲੀ, ਐਨ. ਐਟ ਅਲ.ਟ੍ਰਾਂਸਫਰਿਨ ਰੀਸੈਪਟਰ (TfR) ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ TfR ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਐਫੀਨਿਟੀ ਵੇਰੀਐਂਟਸ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਗ੍ਰਹਿਣ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।