Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ। ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਹਾਇਤਾ ਵਾਲਾ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ। ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤਾ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਵਰਤੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਹਾਇਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਦਾ ਕੈਰੋਜ਼ਲ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਲਈ ਪਿਛਲੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਬਾਇਓਥੈਰੇਪੂਟਿਕ ਏਜੰਟਾਂ ਨੂੰ ਕੇਂਦਰੀ ਦਿਮਾਗੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਟੀਚਿਆਂ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਰੋਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਤੰਤੂ ਵਿਗਿਆਨਕ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਇਲਾਜ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ ਆਉਂਦੀ ਹੈ। ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਨਵੇਂ ਦਿਮਾਗੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ T7 ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਈਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਇੱਕ ਕੈਨੂਲੇਟਿਡ ਚੇਤੰਨ ਵੱਡੇ ਪੂਲ ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਲੜੀਵਾਰ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ। ਚੋਣ ਦੇ ਚਾਰ ਦੌਰਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਖਾਸ ਫੇਜ ਕਲੋਨ CSF ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਭਰਪੂਰ ਸਨ। ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਉਮੀਦਵਾਰ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਨੇ CSF ਵਿੱਚ 1000 ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਪੇਪਟਾਈਡ-ਮੱਧਮ ਡਿਲੀਵਰੀ ਦੀ ਬਾਇਓਐਕਟੀਵਿਟੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਨਾਵਲ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਈਡ ਨਾਲ ਜੁੜੇ BACE1 ਪੇਪਟਾਈਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ-β ਦੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ 40% ਕਮੀ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੇਜ ਚੋਣ ਵਿਧੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਈਡ ਇੱਕ ਇਲਾਜ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਨਾਲ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਦੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀਗਤ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਉਪਯੋਗੀ ਵਾਹਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਕੇਂਦਰੀ ਨਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (CNS) ਟਾਰਗੇਟਡ ਥੈਰੇਪੀ ਖੋਜ ਨੇ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਦਵਾਈਆਂ ਅਤੇ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ CNS-ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਡਰੱਗ ਡਿਲੀਵਰੀ ਚਲਾਉਣ ਵਾਲੇ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ 'ਤੇ ਘੱਟ ਮਿਹਨਤ ਦੇ ਨਾਲ। ਇਹ ਹੁਣ ਬਦਲਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਰਿਹਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਡਰੱਗ ਡਿਲੀਵਰੀ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਵੱਡੇ ਅਣੂ, ਆਧੁਨਿਕ ਨਿਊਰੋਸਾਇੰਸ ਡਰੱਗ ਵਿਕਾਸ ਦਾ ਇੱਕ ਅਨਿੱਖੜਵਾਂ ਅੰਗ ਹੈ। ਕੇਂਦਰੀ ਨਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦਾ ਵਾਤਾਵਰਣ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਬੈਰੀਅਰ ਸਿਸਟਮ ਦੁਆਰਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ (BBB) ​​ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ (BCBB)1 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਦਵਾਈਆਂ ਪਹੁੰਚਾਉਣਾ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ1,2। ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਲਗਭਗ ਸਾਰੀਆਂ ਵੱਡੀਆਂ ਅਣੂ ਦਵਾਈਆਂ ਅਤੇ 98% ਤੋਂ ਵੱਧ ਛੋਟੀਆਂ ਅਣੂ ਦਵਾਈਆਂ ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਖਤਮ ਹੋ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ3। ਇਸ ਲਈ ਨਵੇਂ ਦਿਮਾਗੀ ਆਵਾਜਾਈ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨਾ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਜੋ CNS 4,5 ਨੂੰ ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲ ਅਤੇ ਖਾਸ ਡਿਲੀਵਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, BBB ਅਤੇ BCSFB ਡਰੱਗ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਇੱਕ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਮੌਕਾ ਵੀ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਇਸਦੇ ਵਿਆਪਕ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਸਾਰੇ ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਦਿਮਾਗ ਤੱਕ ਡਿਲੀਵਰੀ ਦੇ ਗੈਰ-ਹਮਲਾਵਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਯਤਨ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ BBB6 ਰੀਸੈਪਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਰੀਸੈਪਟਰ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ (PMT) ਦੇ ਵਿਧੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹਨ। ਟ੍ਰਾਂਸਫਰਿਨ ਰੀਸੈਪਟਰ ਮਾਰਗ7,8 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਤਰੱਕੀ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਸੁਧਾਰੇ ਗਏ ਗੁਣਾਂ ਵਾਲੇ ਨਵੇਂ ਡਿਲੀਵਰੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੇ ਹੋਰ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ। ਇਸ ਉਦੇਸ਼ ਲਈ, ਸਾਡਾ ਟੀਚਾ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨਾ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ CNS ਨੂੰ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲ ਪਹੁੰਚਾਉਣ ਜਾਂ ਨਵੇਂ ਰੀਸੈਪਟਰ ਮਾਰਗ ਖੋਲ੍ਹਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (BBB ਅਤੇ BSCFB) ਦੇ ਖਾਸ ਰੀਸੈਪਟਰ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਬਾਇਓਥੈਰੇਪੂਟਿਕ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਅਤੇ ਖਾਸ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਸੰਭਾਵੀ ਟੀਚਿਆਂ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਸੇਰੇਬਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਕੋਰੋਇਡ ਪਲੇਕਸਸ (CS) ਦਾ ਇੱਕ ਗੁਪਤ ਉਤਪਾਦ ਹੈ ਅਤੇ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਸਪੇਸ ਅਤੇ ਵੈਂਟ੍ਰਿਕੂਲਰ ਸਪੇਸ4 ਰਾਹੀਂ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਇੰਟਰਸਟੀਸ਼ੀਅਲ ਤਰਲ ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਹੈ। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਸੇਰੇਬਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਇੰਟਰਸਟੀਟੀਅਮ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਫੈਲਦਾ ਹੈ9। ਅਸੀਂ ਇਸ ਸਬਰਾਚਨੋਇਡ ਇਨਫਲੋ ਟ੍ਰੈਕਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜਾਂ ਸਿੱਧੇ BBB ਰਾਹੀਂ ਪੈਰੇਨਕਾਈਮਲ ਸਪੇਸ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਇਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੇਜ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਹੈ ਜੋ ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕਿਸੇ ਇੱਕ ਦੁਆਰਾ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਹੁਣ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਇਨ ਵੀਵੋ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਿਸ ਵਿੱਚ CSF ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਉੱਚ ਥਰੂਪੁੱਟ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ (HTS) ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਾਲੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੋਣ ਦੌਰਾਂ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਖੂਨ ਦੇ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਇੱਕ ਸਥਾਈ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਵੱਡੇ ਸਿਸਟਰਨਾ (CM) ਕੈਨੂਲਾ ਨਾਲ ਚੇਤੰਨ ਚੂਹਿਆਂ 'ਤੇ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਦਿਮਾਗ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ T7 ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਛੋਟੇ ਆਕਾਰ (~60 nm)10 ਦੇ ਕਾਰਨ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਉਹ ਵੇਸੀਕਲਾਂ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਹਨ ਜੋ ਐਂਡੋਥੈਲੀਅਲ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਐਪੀਥੈਲੀਅਲ-ਮੇਡੁੱਲਾ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਸੈਲੂਲਰ ਕਰਾਸਿੰਗ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੇ ਹਨ। ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਚਾਰ ਦੌਰਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਫੇਜ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​CSF ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੇਸਲ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਦਿਖਾ ਕੇ ਆਪਣੇ ਖੋਜਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ ਕਿ ਪਸੰਦੀਦਾ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਉਮੀਦਵਾਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਸੇਰੇਬਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹਨ। ਪਹਿਲਾਂ, CNS ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਮੋਹਰੀ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ ਇੱਕ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਿ ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਨਾਵਲ ਦਿਮਾਗੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਕੈਰੀਅਰ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਨਾਵਲ ਦਿਮਾਗੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਵੀ ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਚੋਣ ਪਹੁੰਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਣ ਜਾਣਗੇ।
ਪਲੇਕ-ਫਾਰਮਿੰਗ ਯੂਨਿਟਾਂ (PFU) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਫੇਜ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਸਟੈਪ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਲਗਭਗ 109 ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਾਲੇ ਬੇਤਰਤੀਬ 12-mer ਲੀਨੀਅਰ T7 ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਇੱਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਅਤੇ ਬਣਾਈ ਗਈ ਸੀ (ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ ਵੇਖੋ)। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿ ਅਸੀਂ ਇਨ ਵੀਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇਸ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਸੀ। ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ PCR ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੇ ਐਂਪਲਿਕਨ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜੋ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ HTS 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1a)। a) HTS11 ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਗਲਤੀਆਂ, b) ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ (NNK)1-12, ਅਤੇ c) ਸਟੈਂਡਬਾਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ (wt) ਫੇਜ (ਸਕਲੀਟਨ ਇਨਸਰਟਸ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਸਿਰਫ਼ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1b) ਕੱਢਣ ਲਈ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇਹ ਫਿਲਟਰ ਸਟੈਪ ਸਾਰੀਆਂ HTS ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਸਟੈਂਡਰਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਈ, ਕੁੱਲ 233,868 ਰੀਡ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ 39% ਨੇ ਫਿਲਟਰ ਮਾਪਦੰਡ ਪਾਸ ਕੀਤੇ ਸਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਦੌਰਾਂ ਲਈ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਚੋਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1c–e)। ਰੀਡ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ 3 ਬੇਸ ਜੋੜਿਆਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਗੁਣਜ ਸਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਸਿਖਰ 36 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1c) ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀ ਸੀ, ਜੋ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ (NNK) 1-12 ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਲਗਭਗ 11% ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ 12-ਅਯਾਮੀ ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ (wt) ਬੈਕਬੋਨ PAGISRELVDKL ਇਨਸਰਟ ਸੀ, ਅਤੇ ਲਗਭਗ ਅੱਧੇ ਕ੍ਰਮ (49%) ਵਿੱਚ ਇਨਸਰਟ ਜਾਂ ਡਿਲੀਟੇਸ਼ਨ ਸਨ। ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ HTS ਨੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ: 81% ਤੋਂ ਵੱਧ ਪੇਪਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਵਾਰ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਿਰਫ 1.5% ≥4 ਕਾਪੀਆਂ ਵਿੱਚ ਹੋਏ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a)। ਰਿਪੋਰਟੋਇਰ ਵਿੱਚ ਸਾਰੀਆਂ 12 ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ (aa) ਦੀ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਡੀਜਨਰੇਟ NKK ਰਿਪੋਰਟੋਇਰ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2b) ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੋਡੋਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਲਈ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸੀ। ਇਹਨਾਂ ਇਨਸਰਟਾਂ ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ aa ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਦੇਖੀ ਗਈ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ (r = 0.893) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2c) ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸੀ। ਟੀਕੇ ਲਈ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਵਿੱਚ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਹਟਾਉਣ ਦੇ ਕਦਮ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨੂੰ ਸੰਭਾਵੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ12,13। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪਲੇਟ-ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਹਟਾਉਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੋਈ ਸੀ ਅਤੇ AA ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਇਸਦੀ ਤੁਲਨਾ ਅਸਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਾਲ ਕੀਤੀ। ਮੂਲ ਪੂਲ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਪੂਲ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2d) ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਬੰਧ (r = 0.995) ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ T7 ਫੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮੁਕਾਬਲਾ ਵੱਡਾ ਪੱਖਪਾਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਸੀ। ਇਹ ਤੁਲਨਾ ਹਰੇਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ (~109) ਨੂੰ HTS ਨਾਲ ਵੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ aa ਦੇ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਾਖਲ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਦੇ ਆਖਰੀ ਤਿੰਨ ਸਥਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਸਥਿਤੀ-ਨਿਰਭਰ ਪੱਖਪਾਤ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2e)। ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਅਸੀਂ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਿਆ ਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਸਵੀਕਾਰਯੋਗ ਸੀ ਅਤੇ ਚੋਣ ਦੇ ਕਈ ਦੌਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਫੈਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੇ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਅਤੇ ਤਿਆਰੀ ਕਾਰਨ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਮਾਮੂਲੀ ਬਦਲਾਅ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ।
ਸੀਰੀਅਲ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਨਮੂਨਾ ਲੈਣ ਲਈ ਚੇਤੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ CM ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕੈਨੂਲਾ ਨੂੰ ਸਰਜੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਮਪਲਾਂਟ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ BBB ਅਤੇ/ਜਾਂ BCSFB (ਚਿੱਤਰ 1a-b) ਰਾਹੀਂ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕੇ ਲਗਾਏ ਗਏ T7 ਫੇਜ ਦੀ ਪਛਾਣ ਨੂੰ ਆਸਾਨ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ (iv)। ਅਸੀਂ ਇਨ ਵੀਵੋ ਚੋਣ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਚੋਣ ਹਥਿਆਰਾਂ (ਬਾਹਾਂ A ਅਤੇ B) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੀ ਕੁੱਲ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਚੋਣ ਦੀ ਸਖ਼ਤਤਾ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਵਧਾਇਆ। ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ A ਅਤੇ B ਤੋਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਵਾਧੂ ਸੁਤੰਤਰ ਚੋਣ ਕੀਤੇ। ਇਸ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ T7 ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਦੇ ਇਨ ਵੀਵੋ ਗੁਣਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ ਫੇਜ (PAGISRELVDKL ਮਾਸਟਰ ਇਨਸਰਟ) ਨੂੰ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਰਿਕਵਰੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟੇ T7 ਆਈਕੋਸੈਡਰਲ ਫੇਜਾਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ ਤੋਂ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਪੜਾਅ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3)। ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਟਾਈਟਰਾਂ ਅਤੇ ਖੂਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਕਿ ਨਾੜੀ ਟੀਕੇ ਤੋਂ 10 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਖੁਰਾਕ ਤੋਂ ਲਗਭਗ 1% wt. ਫੇਜ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਗਿਰਾਵਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 27.7 ਮਿੰਟ ਦੀ ਅੱਧੀ-ਜੀਵਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਹੌਲੀ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਮਾਪੀ ਗਈ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, CSF ਡੱਬੇ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਫੇਜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਕਿ CSF ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਮਾਈਗ੍ਰੇਸ਼ਨ ਲਈ ਇੱਕ ਘੱਟ ਪਿਛੋਕੜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3)। ਔਸਤਨ, ਪੂਰੇ ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਪੀਰੀਅਡ (0-250 ਮਿੰਟ) ਦੌਰਾਨ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਵਿੱਚ T7 ਫੇਜ ਦੇ ਲਗਭਗ 1 x 10-3% ਟਾਈਟਰਾਂ ਅਤੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਨਫਿਊਜ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੇ 4 x 10-8% ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਦਾ ਅੱਧਾ-ਜੀਵਨ (25.7 ਮਿੰਟ) ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਮਾਨ ਸੀ। ਇਹ ਅੰਕੜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਸੀਐਮ-ਕੈਨੂਲੇਟਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸੀਐਸਐਫ ਡੱਬੇ ਨੂੰ ਖੂਨ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਰੁਕਾਵਟ ਬਰਕਰਾਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਇਨ ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਨਾਲ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜੋ ਖੂਨ ਤੋਂ ਸੀਐਸਐਫ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਲਿਜਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
(a) ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੂਲ ਤੋਂ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਦੇ ਦੁਬਾਰਾ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨਾ। (b) ਕੇਂਦਰੀ ਨਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (CNS) ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਸੈਲੂਲਰ ਸਥਾਨ ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਰੁਕਾਵਟ (BBB) ​​ਅਤੇ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਰੁਕਾਵਟ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਚਿੱਤਰ। (c) ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਫਲੋਚਾਰਟ। ਚੋਣ ਦੇ ਹਰੇਕ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਫੇਜ (ਤੀਰਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਜਾਨਵਰ ਪਛਾਣਕਰਤਾ) ਨੂੰ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਤੱਕ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਵਿਕਲਪਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ (A, B) ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਚੋਣ ਦੌਰ 3 ਅਤੇ 4 ਲਈ, CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਹਰੇਕ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। (d) T7 ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ (2 x 1012 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਦੇ ਨਾੜੀ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੋ ਕੈਨੂਲੇਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਦੌਰਾਨ ਖੂਨ (ਲਾਲ ਚੱਕਰ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਹਰੇ ਤਿਕੋਣ) ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਫੇਜ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ। ਨੀਲੇ ਵਰਗ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਦੀ ਔਸਤ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਕੁੱਲ ਖੂਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਟੀਕੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਫੇਜ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਤੋਂ ਗਿਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਕਾਲੇ ਵਰਗ ਖੂਨ ਦੇ ਫੇਜ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੋਂ ਐਕਸਟਰਾਪੋਲੇਟ ਕੀਤੀ ਗਈ y ਲਾਈਨ ਦੇ ਇੰਟਰਸੈਕਸ਼ਨ ਬਿੰਦੂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। (e,f) ਪੇਪਟਾਇਡ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਵੰਡ ਪੇਸ਼ ਕਰੋ। 1000 ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ (p < 0.001) ਭਰਪੂਰ ਮੋਟਿਫਾਂ ਨੂੰ ਲਾਲ ਬਿੰਦੀਆਂ ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। (e) ਜਾਨਵਰਾਂ ਤੋਂ ਖੂਨ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਨਾਲ ਟੀਕੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ ਸਕੈਟਰਪਲੋਟ। (f) ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਫੇਜ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ ਸਕੈਟਰਪਲੋਟ। (g, h) ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇਨ ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਦੇ ਇੱਕ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ (g) ਬਨਾਮ ਟੀਕੇ ਵਾਲੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਅਤੇ CSF (h) ਬਨਾਮ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ ਦੀ ਕ੍ਰਮ ID ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ। ਇੱਕ-ਅੱਖਰ ਕੋਡ ਦਾ ਆਕਾਰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਹ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਉਸ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਹਰਾ = ਧਰੁਵੀ, ਜਾਮਨੀ = ਨਿਰਪੱਖ, ਨੀਲਾ = ਮੂਲ, ਲਾਲ = ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਅਤੇ ਕਾਲਾ = ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ। ਚਿੱਤਰ 1a, b ਐਡੁਆਰਡ ਯੂਰਿਚ ਦੁਆਰਾ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਅਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਸੀਂ ਦੋ CM ਯੰਤਰ ਚੂਹਿਆਂ (ਕਲੇਡ A ਅਤੇ B) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਈਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਫੇਜ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 1d)। ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੇਜ਼ ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਘੱਟ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੀ। ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਈ ਗਈ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਔਸਤ ਅੱਧਾ ਜੀਵਨ ਖੂਨ ਵਿੱਚ 24.8 ਮਿੰਟ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸੀ, ਅਤੇ CSF ਵਿੱਚ 38.5 ਮਿੰਟ ਸੀ। ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ ਤੋਂ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਫੇਜ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ HTS ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਬਣਤਰ ਦੇ ਗਠਨ ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਈਡ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ ਇੱਕ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਆਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ14,15। ਸਾਨੂੰ ਟੀਕਾ ਲਗਾਈ ਗਈ ਫੇਜ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਵੰਡ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਚੰਗਾ ਸਬੰਧ ਮਿਲਿਆ (ਚਿੱਤਰ 1e)। ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਰਚਨਾ ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਮਾਮੂਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਹੈ। Weblogo16 ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਅਤੇ ਸਹਿਮਤੀ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਹੋਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਸਾਨੂੰ ਖੂਨ ਦੇ ਗਲਾਈਸੀਨ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1g) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਮਿਲਿਆ। ਜਦੋਂ ਖੂਨ ਦੀ ਤੁਲਨਾ CSF ਤੋਂ ਚੁਣੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਤਾਂ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਚੋਣ ਅਤੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਕੁਝ ਚੋਣ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ (ਚਿੱਤਰ 1f), ਅਤੇ ਕੁਝ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ 12-ਮੈਂਬਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1h) ਵਿੱਚ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਮੌਜੂਦ ਸਨ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਭਿੰਨਤਾ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੋਵਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਗਲਾਈਸੀਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a-j)। ਜਾਨਵਰਾਂ #1.1 ਅਤੇ #1.2 ਦੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਡੇਟਾ ਦੀ ਸਖ਼ਤ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕੁੱਲ 964 ਅਤੇ 420 ਵਿਲੱਖਣ 12-mer ਪੇਪਟਾਇਡ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1d-e)। ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਨ ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਫੇਜ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ ਵਿੱਚ HTS ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫਾਂ (ਚਿੱਤਰ 2a, b, ef) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮੋਟਿਫ ਪਛਾਣ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ ਇਨਪੁਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। CSF ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਚੱਕਰ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਅਸੀਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ A ਅਤੇ B (ਚਿੱਤਰ 2) ਵਿੱਚ CSF ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਹੋਰ ਚੋਣ ਅਤੇ ਅਚੋਣ ਦੇਖੀ। ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਨੈੱਟਵਰਕ ਪਛਾਣ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ ਕੀ ਉਹ ਇਕਸਾਰ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ A (ਚਿੱਤਰ 2c, d) ਅਤੇ ਕਲੇਡ B (ਚਿੱਤਰ 2g, h) ਵਿੱਚ CSF ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ 12-ਅਯਾਮੀ ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇਖੀ ਗਈ। ਹਰੇਕ ਸ਼ਾਖਾ ਵਿੱਚ ਪੂਲਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ 12-mer ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5c, d) ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਚੋਣ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਅਤੇ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5e) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਚੋਣ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੂਲਡ ਕਲੋਨਾਂ ਲਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ CSF/ਬਲੱਡ ਟਾਈਟਰ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ।
ਇਨ ਵੀਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇ ਚੋਣ ਦੇ ਦੋ ਲਗਾਤਾਰ ਦੌਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫਸ ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਸੰਸ਼ੋਧਨ।
ਹਰੇਕ ਜਾਨਵਰ (ਜਾਨਵਰ #1.1 ਅਤੇ #1.2) ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਫੇਜਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ, HT-ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇਕੱਠੇ ਦੁਬਾਰਾ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) 2 SM ਕੈਨੂਲੇਟਡ ਚੂਹੇ (#1.1 → #)। 2.1 ਅਤੇ 2.2, 1.2 → 2.3 ਅਤੇ 2.4)। (a,b,e,f) ਪਹਿਲੇ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਚੋਣ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ CSF-ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਈਡ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸਹਿ-ਸਬੰਧ ਸਕੈਟਰਪਲੋਟਸ। ਦੋਵਾਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਸੰਭਾਵੀ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਵੰਡ। 1000 ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ। ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਜਾਂ ਬਾਹਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮੋਟਿਫਾਂ ਨੂੰ ਲਾਲ ਬਿੰਦੀਆਂ ਨਾਲ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (p < 0.001)। (c, d, g, h) ਇਨ ਵੀਵੋ ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰ 2 ਅਤੇ 1 ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਸਾਰੇ CSF-ਅਮੀਰ 12 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਲੰਬੇ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਲੋਗੋ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ। ਇੱਕ-ਅੱਖਰ ਕੋਡ ਦਾ ਆਕਾਰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਸ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਉਹ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਲੋਗੋ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ, ਦੋ ਚੋਣ ਦੌਰਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ CSF ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਕ੍ਰਮ ਦਿਖਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ਅਤੇ (h) #1.2–#2.4। (c, d) ਜਾਨਵਰ ਨੰਬਰ 2.1 ਅਤੇ ਨੰਬਰ 2.2 ਜਾਂ (g, h) ਜਾਨਵਰ ਨੰਬਰ 2.3 ਅਤੇ ਨੰਬਰ 2.4 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਦਿੱਤੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। ਹਰਾ = ਧਰੁਵੀ, ਜਾਮਨੀ = ਨਿਰਪੱਖ, ਨੀਲਾ = ਮੂਲ, ਲਾਲ = ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਅਤੇ ਕਾਲਾ = ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ।
ਚੋਣ ਦੇ ਤੀਜੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਦੋ ਜਾਨਵਰਾਂ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ 332 CSF-ਪੁਨਰਗਠਿਤ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਤੋਂ 124 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (#3.1 ਅਤੇ #3.2) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6a)। ਕ੍ਰਮ LGSVS (18.7%) ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਨੁਪਾਤ ਸੀ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੰਮਿਲਨ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ਅਤੇ SARGSWREIVSLS (2.2%) ਸਨ। ਆਖਰੀ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜਾਨਵਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਤੋਂ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ। CSF ਤੋਂ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ 925 ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਾਨੂੰ 64 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6b) ਮਿਲੇ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਦਾ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਨੁਪਾਤ 0.8% ਤੱਕ ਘੱਟ ਗਿਆ। ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ CSF ਕਲੋਨ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ਅਤੇ RLSSVDSDLSGC (3, 2%) ਸਨ। %)। ਚੁਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਰੇਂਜ NNK ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਲਈ ਡੀਜਨਰੇਟ ਕੋਡੋਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਸੰਮਿਲਨ/ਮਿਟਾਉਣ ਜਾਂ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸਟਾਪ ਕੋਡੋਨ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸਟਾਪ ਕੋਡੋਨ ਛੋਟੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਚੁਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲ aa ਮੋਟਿਫ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਲੰਬੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਮਿਲਨ/ਮਿਟਾਉਣ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤੇ ਸਟਾਪ ਕੋਡੋਨ ਨੂੰ ਫਰੇਮ ਦੇ ਬਾਹਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਪੜ੍ਹਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਟਾਪ ਕੋਡੋਨ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ। ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਨਮੂਨਾ ਆਉਟਪੁੱਟ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਇਨਪੁਟ ਡੇਟਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਕੇ ਸਾਰੇ ਚਾਰ ਚੋਣ ਦੌਰਾਂ ਲਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ। ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ ਟਾਈਟਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪਿਛੋਕੜ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਪਹਿਲੇ CSF ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਫੇਜ ਚੋਣ ਬਹੁਤ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸੀ, ਪਰ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ (ਚਿੱਤਰ 3a), ਜੋ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮੈਂਬਰਾਂ ਦੇ CSF ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਪੈਸਿਵ ਫੈਲਾਅ ਦੀ ਘੱਟ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਫੇਜ ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜਾਂ ਨਾਲੋਂ ਖੂਨ ਦੇ ਪ੍ਰਵਾਹ ਤੋਂ ਵਧੇਰੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਬਰਕਰਾਰ ਜਾਂ ਹਟਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਚੋਣ ਦੋਵਾਂ ਕਲੇਡਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੀ ਗਈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਪਿਛਲਾ ਦੌਰ CSF ਗ੍ਰਹਿਣ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਫੇਜਾਂ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3a)। ਦੁਬਾਰਾ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਖੂਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ। ਤੀਜੇ ਅਤੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਵੀ, ਫੇਜ ਕਲੋਨ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸਨ। ਚੋਣ ਦੇ ਆਖਰੀ ਦੋ ਦੌਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਹਰੇਕ ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ (ਚਿੱਤਰ 3b) ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਹੋਰ ਵੀ ਅਮੀਰ ਸਨ। ਦੋਵਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡ ਓਰੀਐਂਟੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਾਰੇ 64 ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਤੋਂ ਕੁੱਲ 931 ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਮੋਟਿਫ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਨ। ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਮੀਰ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤੀ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ (ਕਟ-ਆਫ: 10% ਅਮੀਰੀ) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6c) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਸਾਰੇ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਮੀਰੀ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਚੋਣ ਦੇ ਆਮ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮੋਟਿਫ ਦੋਵਾਂ ਚੋਣ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਦੇ ਪਿਛਲੇ ਸਾਰੇ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਅਮੀਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੁਝ ਮੋਟਿਫ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ SGL, VSG, LGS GSV) ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ A ਤੋਂ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਹੋਰ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ FGW, RTN, WGF, NTR) ਵਿਕਲਪਕ ਕਲੇਡ B ਵਿੱਚ ਅਮੀਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
CSF-ਅਮੀਰ ਫੇਜ-ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਪੇਲੋਡਸ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੇ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ।
(a) ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤੇ (ਇਨਪੁਟ = I) ਫੇਜ (PFU) ਟਾਈਟਰਾਂ ਅਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ CSF ਫੇਜ ਟਾਈਟਰਾਂ (ਆਉਟਪੁੱਟ = O) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਸਾਰੇ ਚਾਰ ਦੌਰਾਂ (R1-R4) ਵਿੱਚ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਅਨੁਪਾਤ। ਪਿਛਲੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ (R2-R4) ਲਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਪਿਛਲੇ ਦੌਰ ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ (R1) ਦੇ ਭਾਰ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਖੁੱਲ੍ਹੀਆਂ ਬਾਰਾਂ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਹਨ, ਛਾਂਦਾਰ ਬਾਰ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਹਨ। (***p<0.001, ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ)। (b) ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰ 4 ਤੋਂ ਬਾਅਦ CSF ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜਾਂ ਦੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਦਰਜਾਬੰਦੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਸੂਚੀ। ਛੇ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰ 3 ਅਤੇ 4 (ਇਨਸੈੱਟ) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਰੰਗ, ਸੰਖਿਆ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਾਰਕਾਂ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। (c,d) ਦੌਰ 4 ਤੋਂ ਛੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਫੇਜ ਕਲੋਨ, ਖਾਲੀ ਫੇਜ ਅਤੇ ਪੇਰੈਂਟਲ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦਾ CSF ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਮੇਂ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। (c) 6 ਉਮੀਦਵਾਰ ਫੇਜ ਕਲੋਨ (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ), ਖਾਲੀ ਫੇਜ (#1779) (2 x 1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਅਤੇ ਸਟਾਕ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ (2 x 1012 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ) ਦੀ ਬਰਾਬਰ ਮਾਤਰਾ। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 3 CM ਟੀਕਾ ਲਗਾ ਕੇ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੈਨੂਲੇਟਡ ਜਾਨਵਰ ਨੂੰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹਰੇਕ ਟੀਕਾ ਲਗਾਏ ਗਏ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਅਤੇ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ CSF ਫਾਰਮਾਕੋਕਾਇਨੇਟਿਕਸ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। (d) ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਸਾਰੇ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤੇ ਫੇਜ/mL ਲਈ ਔਸਤ CSF/ਖੂਨ ਅਨੁਪਾਤ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (e) ਚਾਰ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਕ੍ਰੈਂਬਲਡ ਕੰਟਰੋਲ ਨੂੰ ਬਾਇਓਟਿਨ ਨਾਲ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਉਹਨਾਂ ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ (ਟੈਟਰਾਮਰ ਡਿਸਪਲੇਅ) ਰਾਹੀਂ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ iv, 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ)। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਇਨਟਿਊਬੇਟਿਡ ਚੂਹੇ (N = 3)। CSF ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ CSF ਐਂਟੀ-ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ELISA (nd = ਖੋਜਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ) ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ਟੈਸਟ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ)। (f) ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਚੁਣੇ ਗਏ ਹੋਰ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕਲੋਨਾਂ ਨਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕਲੋਨ #2002 (ਜਾਮਨੀ) ਦੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਤੁਲਨਾ। ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਅਤੇ ਸਮਾਨ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਰੰਗ-ਕੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਚੌਥੇ ਦੌਰ (ਚਿੱਤਰ 3b) ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਭਰਪੂਰ ਫੇਜਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, CSF ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰ ਕਲੋਨ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ। ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰ ਫੇਜ, ਖਾਲੀ ਫੇਜ (ਕੋਈ ਸੰਮਿਲਨ ਨਹੀਂ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੀ ਬਰਾਬਰ ਮਾਤਰਾ ਤਿੰਨ ਕੈਨੂਲੇਟਿਡ CM ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਈ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ CSF (ਚਿੱਤਰ 3c) ਅਤੇ ਖੂਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7) ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੇਟਿਕਸ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਨੇ ਖਾਲੀ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ (#1779) ਨਾਲੋਂ 10-1000 ਗੁਣਾ ਉੱਚ ਪੱਧਰ 'ਤੇ CSF ਡੱਬੇ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਇਆ। ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਕਲੋਨ #2020 ਅਤੇ #2077 ਵਿੱਚ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ ਨਾਲੋਂ ਲਗਭਗ 1000 ਗੁਣਾ ਉੱਚ CSF ਟਾਈਟਰਸ ਸਨ। ਹਰੇਕ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦਾ ਫਾਰਮਾਕੋਕਿਨੇਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਵੱਖਰਾ ਹੈ, ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਸਾਰਿਆਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ CSF ਹੋਮਿੰਗ ਸਮਰੱਥਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕਲੋਨ #1903 ਅਤੇ #2011 ਲਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਕਮੀ ਦੇਖੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕਲੋਨ #2077, #2002 ਅਤੇ #2009 ਲਈ ਪਹਿਲੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਦੌਰਾਨ ਵਾਧਾ ਸਰਗਰਮ ਆਵਾਜਾਈ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ ਪਰ ਇਸਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ। ਕਲੋਨ #2020, #2002, ਅਤੇ #2077 ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਹੋ ਗਏ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕਲੋਨ #2009 ਦੀ CSF ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਵਾਧੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੌਲੀ ਹੌਲੀ ਘੱਟ ਗਈ। ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਹਰੇਕ CSF ਉਮੀਦਵਾਰ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਇਸਦੇ ਖੂਨ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ਚਿੱਤਰ 3d) ਨਾਲ ਕੀਤੀ। ਸਾਰੇ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਦੇ ਸਮਿਆਂ 'ਤੇ ਹਰੇਕ CSF ਉਮੀਦਵਾਰ ਦੇ ਔਸਤ ਟਾਇਟਰ ਦੇ ਇਸਦੇ ਖੂਨ ਦੇ ਟਾਇਟਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਛੇ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਤਿੰਨ ਖੂਨ ਦੇ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸਨ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਕਲੋਨ #2077 ਨੇ ਉੱਚ ਖੂਨ ਸਥਿਰਤਾ ਦਿਖਾਈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7)। ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਖੁਦ CSF ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਹੋਰ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮੀ ਨਾਲ ਲਿਜਾਣ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਹਨ, ਅਸੀਂ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਚਾਰ ਲੀਡਰ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਿੱਥੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਫੇਜ ਕਣ ਨਾਲ ਜੁੜਦੇ ਹਨ। ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਨੰਬਰ 2002, 2009, 2020 ਅਤੇ 2077) ਨੂੰ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ (SA) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਫੇਜ ਜਿਓਮੈਟਰੀ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਮਲਟੀਮੇਰਿਕ ਰੂਪ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਣ। ਇਸ ਫਾਰਮੈਟ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਕਾਰਗੋ-ਟਰਾਂਸਪੋਰਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ SA ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਵੀ ਦਿੱਤੀ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਫੇਜ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਦੁਬਾਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਇਸ SA-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਫਾਰਮੈਟ (ਚਿੱਤਰ 3e) ਵਿੱਚ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਸੀ। ਸਕ੍ਰੈਂਬਲਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਅਤੇ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪੱਧਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਤੇਜ਼ CSF ਕਲੀਅਰੈਂਸ ਸੀ। CSF ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਦੇ ਡਿਲੀਵਰੀ ਮਾਰਗਾਂ ਬਾਰੇ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰਾਵੇਨਸ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 1 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ ਫੇਜ ਕਣਾਂ ਦਾ ਸਿੱਧਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ (IHC) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਫੇਜ ਪੇਪਟਾਇਡ ਹਿੱਟਾਂ ਦੇ ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਲੋਨ #2002, #2077, ਅਤੇ #2009 ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਦੀਆਂ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਧੱਬੇ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ (#1779) ਅਤੇ ਕਲੋਨ #2020 ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8)। ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪੇਪਟਾਇਡ BBB ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ BSCFB ਰੂਟ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਮੀਰ ਕਲੋਨ (#2002) ਦੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਹੋਰ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨਾਲ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ ਉਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਹਨ, ਜੋ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿਧੀ (ਚਿੱਤਰ 3f) ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਇਸਦੇ ਵਿਲੱਖਣ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ CSF ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧੇ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਕਲੋਨ #2077 ਨੂੰ 48-ਘੰਟਿਆਂ ਦੀ ਲੰਮੀ ਮਿਆਦ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਨਿਰੰਤਰ SA ਪੱਧਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4a) ਦੇ ਸਹਿਯੋਗ ਨਾਲ ਦੇਖੇ ਗਏ CSF ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ। ਹੋਰ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ, #2077 ਦਿਮਾਗ ਦੀਆਂ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਲਈ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਉੱਚ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 'ਤੇ ਦੇਖੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਮਾਰਕਰ ਲੈਕਟਿਨ ਨਾਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਮੂਹੀਕਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੈਰੇਨਕਾਈਮਲ ਸਪੇਸ (ਚਿੱਤਰ 4b) ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਧੱਬੇ ਹੋਏ। ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ CNS ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਈਡ-ਮੱਧਮ ਫਾਰਮਾਕੋਲੋਜੀਕਲ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ i) #2077 ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਈਡ ਅਤੇ ii) BACE1 ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਸੰਸਕਰਣਾਂ ਨੂੰ SA ਨਾਲ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅਨੁਪਾਤਾਂ 'ਤੇ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਸੁਮੇਲ ਲਈ ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ਼ BACE1 ਪੇਪਟਾਈਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਲਈ ਅਸੀਂ BACE1 ਪੇਪਟਾਈਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦਾ #2077 ਪੇਪਟਾਈਡ ਨਾਲ 1:3 ਅਨੁਪਾਤ ਵਰਤਿਆ। ਦੋਵੇਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਬੀਟਾ-ਐਮੀਲੋਇਡ ਪੇਪਟਾਇਡ 40 (Abeta40) ਦੇ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। Abeta40 ਨੂੰ CSF ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਪੈਰੇਨਕਾਈਮਾ ਵਿੱਚ BACE1 ਰੋਕ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਦੋਵਾਂ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਨੇ Abeta40 ਦੇ ਖੂਨ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ (ਚਿੱਤਰ 4c, d)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਿਰਫ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੰ. 2077 ਦੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਅਤੇ SA ਨਾਲ ਜੁੜੇ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ ਇੱਕ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਚਿੱਤਰ 4c) ਵਿੱਚ Abeta40 ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਾਇਆ। ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੰ. 2077 60 kDa SA ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ CNS ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ ਅਤੇ BACE1 ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੇ SA-ਸੰਯੁਕਤ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਨਾਲ ਫਾਰਮਾਕੋਲੋਜੀਕਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
(a) ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ CM-ਇੰਟਿਊਬੇਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ CSF ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ਅਤੇ ਅਣ-ਇੰਜੈਕਟਿਡ ਕੰਟਰੋਲ ਫੇਜ (#1779) ਦੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਕਾਇਨੇਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ T7 ਫੇਜ ਦਾ ਕਲੋਨਲ ਟੀਕਾ (2 × 10 ਫੇਜ਼/ਜਾਨਵਰ)। (b) ਫੇਜ਼-ਇੰਜੈਕਟਿਡ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਕੋਰਟੀਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੇਸਲਾਂ ਦੀ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪਿਕ ਤਸਵੀਰ (2 × 10 10 ਫੇਜ਼/ਜਾਨਵਰ) ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਅਤੇ ਨਾੜੀਆਂ (ਲੈਕਟਿਨ) ਦੇ ਕਾਊਂਟਰਸਟੇਨਿੰਗ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ 3 ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਘੁੰਮਣ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦਿਮਾਗਾਂ ਨੂੰ T7 ਫੇਜ ਕੈਪਸਿਡ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ FITC-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਸੈਕਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰੰਗ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਦਸ ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ, DyLight594-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ ਲੈਕਟਿਨ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਤਸਵੀਰਾਂ ਜੋ ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਅਤੇ ਪੈਰੀਵੈਸਕੁਲਰ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਦੇ ਲੂਮੇਨ ਵਿੱਚ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੇਸਲਾਂ ਅਤੇ ਫੇਜਾਂ (ਹਰੇ) ਦੇ ਲੂਮੀਨਲ ਪਾਸੇ ਦੇ ਲੈਕਟਿਨ ਸਟੇਨਿੰਗ (ਲਾਲ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ 10 µm ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ। (c, d) ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ ਨੂੰ ਇਕੱਲੇ ਜਾਂ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਈਡ #2077 ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਕੈਨੂਲੇਟਿਡ CM ਚੂਹਿਆਂ (10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਦਾ ਨਾੜੀ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। Aβ40 ਵਿੱਚ BACE1 ਪੇਪਟਾਈਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ-ਮਾਧਿਅਮ ਕਮੀ ਨੂੰ Aβ1-40 ELISA ਦੁਆਰਾ ਖੂਨ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ) ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਮੇਂ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਿਹਤਰ ਸਪੱਸ਼ਟਤਾ ਲਈ, ਗ੍ਰਾਫ 'ਤੇ 100% ਦੇ ਪੈਮਾਨੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਖਿੱਚੀ ਗਈ ਹੈ। (c) 3:1 ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਅਤੇ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ (ਲਾਲ ਤਿਕੋਣ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ ਤਿਕੋਣ) ਵਿੱਚ Aβ40 ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਕਮੀ। (d) ਸਿਰਫ਼ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਖੂਨ Aβ40 (ਲਾਲ ਚੱਕਰ) ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਸੰਤਰੀ ਚੱਕਰ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਕਮੀ। ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ Aβ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 420 pg/ml (ਮਿਆਰੀ ਭਟਕਣਾ = 101 pg/ml) ਸੀ।
ਫੇਜ ਡਿਸਪਲੇਅ ਨੂੰ ਬਾਇਓਮੈਡੀਕਲ ਖੋਜ ਦੇ ਕਈ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ17। ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਇਨ ਵਿਵੋ ਵੈਸਕੁਲਰ ਡਾਇਵਰਸਿਟੀ ਸਟੱਡੀਜ਼18,19 ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਵੈਸਕੁਲਰ ਡਾਇਵਰਸਿਟੀ ਸਟੱਡੀਜ਼20,21,22,23,24,25,26 ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਚੋਣ ਵਿਧੀ ਦੇ ਉਪਯੋਗ ਨੂੰ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਵੈਸਕੁਲਰ ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਕੈਨੂਲੇਟਿਡ CM ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ CSF ਕਟਾਈ ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਇਨ ਵਿਵੋ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਫੇਜ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਨਾੜੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਸਗੋਂ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਸੀ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਖੂਨ ਇਕੱਠਾ ਕਰਕੇ ਅਤੇ CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਫੇਜਾਂ 'ਤੇ HTS ਲਾਗੂ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ CSF ਦੀ ਸਾਡੀ ਚੋਣ ਖੂਨ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਜਾਂ ਚੋਣ ਦੇ ਦੌਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਸਥਾਰ ਲਈ ਤੰਦਰੁਸਤੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਖੂਨ ਦਾ ਡੱਬਾ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ CSF ਡੱਬੇ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਫੇਜਾਂ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਆਪ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਖੂਨ ਦੇ ਪ੍ਰਵਾਹ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਦੇਰ ਤੱਕ ਜਿਉਂਦੇ ਰਹਿਣਾ ਅਤੇ ਸੰਚਾਰਿਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ। ਕੱਚੇ HTS ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਕੱਢਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਰਕਫਲੋ ਵਿੱਚ ਪਲੇਟਫਾਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕ੍ਰਮ ਗਲਤੀਆਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਫਿਲਟਰ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ। ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ T7 ਫੇਜਾਂ (t½ ~ 28 ਮਿੰਟ) ਦੇ ਤੇਜ਼ ਫਾਰਮਾਕੋਕਾਇਨੇਟਿਕਸ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ24, 27, 28 ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (t½ ~ 26 ਮਿੰਟ) ਪ੍ਰਤੀ ਮਿੰਟ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਅੱਧੀ-ਜੀਵਨ ਵੀ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ। ਖੂਨ ਅਤੇ CSF ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਫਾਰਮਾਕੋਕਾਇਨੇਟਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਦੇ ਖੂਨ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਸਿਰਫ 0.001% ਹੀ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਿਆ, ਜੋ ਕਿ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ T7 ਫੇਜ ਦੀ ਘੱਟ ਪਿਛੋਕੜ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਕੰਮ ਇਨ ਵੀਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਫੇਜ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਲਈ ਜੋ ਸਰਕੂਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸਾਫ਼ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਕੁਝ ਕਲੋਨ CNS ਡੱਬੇ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਬਹੁਤ ਵੱਡੀ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਬਹੁਤ ਸਖ਼ਤ CSF ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਸੀਮਤ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਇਸ ਇਨ ਵੀਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ ਵਿੱਚ ਕਈ ਚੋਣ ਕਦਮ ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ CSF ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣਾ, ਖੂਨ ਦੇ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਬਚਾਅ, ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਖੂਨ ਵਿੱਚੋਂ T7 ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਹਟਾਉਣਾ (ਚਿੱਤਰ 1d ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4M)। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, CSF ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਲਈ ਉਹੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੂਲ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਾਲੀਆਂ ਸਰੋਤ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਲਈ ਕਈ ਸਖ਼ਤ ਚੋਣ ਕਦਮਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਘਟਨਾਵਾਂ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਇੱਕ ਅਨਿੱਖੜਵਾਂ ਅੰਗ ਬਣ ਜਾਣਗੀਆਂ, ਨਤੀਜੇ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨਗੀਆਂ। ਇਹ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਕਿ ਮੂਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਮਾਨ CSF ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਹਾਲਤਾਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਵੀ, ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੂਲ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਖਾਸ ਕਲੋਨ ਦੀ ਛੋਟੀ ਗਿਣਤੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਚੋਣ ਨਤੀਜੇ ਵੱਖਰੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
CSF ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਨਮੂਨੇ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਨਮੂਨੇ ਨਾਲੋਂ ਵੱਖਰੇ ਹਨ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਅਸੀਂ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸੀਨ-ਅਮੀਰ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵੱਲ ਪਹਿਲੀ ਤਬਦੀਲੀ ਨੂੰ ਨੋਟ ਕੀਤਾ। (ਚਿੱਤਰ 1g, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4e, 4f)। ਗਲਾਈਸੀਨ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵਾਲੇ ਫੇਜ ਵਧੇਰੇ ਸਥਿਰ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸਰਕੂਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਘੱਟ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਗਲਾਈਸੀਨ-ਅਮੀਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਲੱਭੇ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਕਿਉਰੇਟਿਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਚੋਣ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘੀਆਂ: ਇੱਕ ਖੂਨ ਵਿੱਚ ਅਤੇ ਦੂਜਾ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਚੋਣ ਦੇ ਚੌਥੇ ਦੌਰ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ CSF-ਅਮੀਰ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਲਗਭਗ ਸਾਰੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਫੇਜ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ CSF ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਹੋਣ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇੱਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਹਿੱਟ (#2077) ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇਸਨੇ ਹੋਰ ਹਿੱਟਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3d ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਇੱਕ ਲੰਮਾ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਅੱਧਾ-ਜੀਵਨ ਦਿਖਾਇਆ, ਅਤੇ ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਪੇਪਟਾਇਡ ਵਿੱਚ C-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਇੱਕ ਸਿਸਟੀਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸੀ। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਵਿੱਚ ਸਿਸਟੀਨ ਦਾ ਜੋੜ ਐਲਬਿਊਮਿਨ 29 ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਕੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਕਾਇਨੇਟਿਕ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 ਲਈ ਅਣਜਾਣ ਹੈ ਅਤੇ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ। ਕੁਝ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੇ CSF ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੈਲੈਂਸ-ਨਿਰਭਰਤਾ ਦਿਖਾਈ (ਡੇਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ), ਜੋ ਕਿ T7 ਕੈਪਸਿਡ ਦੀ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਸਤਹ ਜਿਓਮੈਟਰੀ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਗਏ T7 ਸਿਸਟਮ ਨੇ ਹਰੇਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪ੍ਰਤੀ ਫੇਜ ਕਣ ਦੀਆਂ 5-15 ਕਾਪੀਆਂ ਦਿਖਾਈਆਂ। IHC ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕੇ ਲਗਾਏ ਗਏ ਉਮੀਦਵਾਰ ਲੀਡ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8)। ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਕਲੋਨ (ਨੰਬਰ 2002, ਨੰ. 2009 ਅਤੇ ਨੰ. 2077) ਨੇ BBB ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕੀਤਾ। ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਬਾਕੀ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਇਹ BBB ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ CSF ਦੇ ਇਕੱਠੇ ਹੋਣ ਜਾਂ ਇਹਨਾਂ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਸਿੱਧੇ BCSFB ਵਿੱਚ ਗਤੀ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਆਪਣੀ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। N-ਟਰਮੀਨਲ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ SA ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੂਨ ਅਤੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ਚਿੱਤਰ 3e) ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਫੇਜ ਕਲੋਨਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਲੀਡ ਪੇਪਟਾਇਡ #2077 SA ਨਾਲ ਜੁੜੇ BACE1 ਦੇ ਇੱਕ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੀ ਦਿਮਾਗੀ ਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ CSF ਵਿੱਚ Abeta40 ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾ ਕੇ CNS ਵਿੱਚ ਸਪੱਸ਼ਟ ਫਾਰਮਾਕੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 4)। ਅਸੀਂ ਸਾਰੇ ਹਿੱਟਾਂ ਦੀ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਸਮਰੂਪਤਾ ਖੋਜ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਸੀ। ਇਹ ਨੋਟ ਕਰਨਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿ T7 ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਆਕਾਰ ਲਗਭਗ 109 ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ 12-ਮਰ ਲਈ ਸਿਧਾਂਤਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਆਕਾਰ 4 x 1015 ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ 12-ਮਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਸਪੇਸ ਦਾ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਜਿਹਾ ਹਿੱਸਾ ਚੁਣਿਆ ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਅਰਥ ਇਹ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਹਿੱਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਕ੍ਰਮ ਸਪੇਸ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਕੇ ਵਧੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਕਾਲਪਨਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸਾਨੂੰ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੇ ਕੋਈ ਕੁਦਰਤੀ ਸਮਰੂਪ ਨਾ ਮਿਲਣ ਦਾ ਇੱਕ ਕਾਰਨ ਵਿਕਾਸ ਦੌਰਾਨ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਪੇਪਟਾਇਡ ਰੂਪਾਂ ਦੇ ਬੇਕਾਬੂ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਚੋਣ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰਨਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਇਕੱਠੇ ਮਿਲ ਕੇ, ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਕੰਮ ਲਈ ਇੱਕ ਆਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਬੈਰੀਅਰ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣਿਆ ਜਾ ਸਕੇ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਦਾ ਮੂਲ ਸੈੱਟਅੱਪ ਇੱਕ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਚੋਣ ਰਣਨੀਤੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ ਜੋ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਦਮ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਫਲ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸੀਐਨਐਸ ਡੱਬੇ ਵਿੱਚ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਜੈਵਿਕ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਦੀ ਵਿਧੀ ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਖੇਤਰ ਲਈ ਖਾਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੈਸਕੁਲੇਚਰ ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਤਰਜੀਹ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨਾ ਹੈ। ਇਸ ਨਾਲ BBB ਅਤੇ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਲਈ ਨਵੇਂ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਸਿੱਧੇ ਸੇਰੇਬਰੋਵੈਸਕੁਲਰ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਜਾਂ BBB ਜਾਂ BCSFB ਦੁਆਰਾ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਘੁੰਮਦੇ ਲਿਗੈਂਡਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਗਏ CSF ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਵੈਕਟਰਾਂ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਵੇਗੀ। ਅਸੀਂ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ BBB ਅਤੇ/ਜਾਂ BCSFB ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਲਈ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਦਿਮਾਗੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰ ਰਹੇ ਹਾਂ। ਇਹ ਨਵੇਂ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਵੇਂ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਜਾਂ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ ਖੋਜ ਲਈ ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਤੱਕ ਬਾਇਓਲੋਜਿਕਸ ਵਰਗੇ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਦੀ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਨਵੇਂ ਬਹੁਤ ਕੁਸ਼ਲ ਪਲੇਟਫਾਰਮਾਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਲਈ ਬਹੁਤ ਕੀਮਤੀ ਔਜ਼ਾਰ ਹੋਣਗੇ।
ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਢੰਗ ਦੀ ਸੋਧ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵੱਡੇ ਸਿਸਟਰਨਾ (CM) ਨੂੰ ਕੈਨੂਲੇਟ ਕਰੋ। ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤੇ ਵਿਸਟਾਰ ਚੂਹਿਆਂ (200-350 ਗ੍ਰਾਮ) ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਉਪਕਰਣ 'ਤੇ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਬੇਨਕਾਬ ਕਰਨ ਲਈ ਸ਼ੇਵ ਕੀਤੇ ਅਤੇ ਐਸੇਪਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਖੋਪੜੀ ਦੇ ਉੱਪਰ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਚੀਰਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਉੱਪਰਲੇ ਸੈਸ਼ ਦੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਛੇਕ ਕਰੋ ਅਤੇ ਛੇਕਾਂ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸਿੰਗ ਪੇਚਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹੋ। CM ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਕੈਨੂਲਾ ਦੇ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਮਾਰਗਦਰਸ਼ਨ ਲਈ ਲੇਟਰਲ ਓਸੀਪੀਟਲ ਕਰੈਸਟ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਛੇਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੈਨੂਲਾ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੰਦਾਂ ਦਾ ਸੀਮੈਂਟ ਲਗਾਓ ਅਤੇ ਪੇਚਾਂ ਨਾਲ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕਰੋ। ਫੋਟੋ-ਕਿਊਰਿੰਗ ਅਤੇ ਸੀਮਿੰਟ ਦੇ ਸਖ਼ਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਚਮੜੀ ਦੇ ਜ਼ਖ਼ਮ ਨੂੰ 4/0 ਸੁਪਰਾਮਿਡ ਸਿਉਚਰ ਨਾਲ ਬੰਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (CSF) ਦੇ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਲੀਕ ਦੁਆਰਾ ਕੈਨੂਲਾ ਦੀ ਸਹੀ ਪਲੇਸਮੈਂਟ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਉਪਕਰਣ ਤੋਂ ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਹਟਾਓ, ਢੁਕਵੀਂ ਪੋਸਟਓਪਰੇਟਿਵ ਦੇਖਭਾਲ ਅਤੇ ਦਰਦ ਪ੍ਰਬੰਧਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤੇ ਲਈ ਠੀਕ ਹੋਣ ਦਿਓ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਸੰਕੇਤ ਨਹੀਂ ਦੇਖੇ ਜਾਂਦੇ। ਵਿਸਟਾਰ ਚੂਹੇ (Crl:WI/Han) ਚਾਰਲਸ ਰਿਵਰ (ਫਰਾਂਸ) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਸਾਰੇ ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਖਾਸ ਰੋਗਾਣੂ-ਮੁਕਤ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਰੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸਵਿਟਜ਼ਰਲੈਂਡ ਦੇ ਬਾਸੇਲ ਸ਼ਹਿਰ ਦੇ ਵੈਟਰਨਰੀ ਦਫ਼ਤਰ ਦੁਆਰਾ ਮਨਜ਼ੂਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਜਾਨਵਰ ਲਾਇਸੈਂਸ ਨੰਬਰ 2474 (ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਅਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਮਾਪ ਕੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਦਿਮਾਗੀ ਆਵਾਜਾਈ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਸੀਐਮ ਕੈਨੂਲਾ ਹੱਥ ਵਿੱਚ ਲੈ ਕੇ ਸੁਚੇਤ ਰੱਖੋ। ਕੈਨੂਲਾ ਵਿੱਚੋਂ ਡੈਟੂਰਾ ਨੂੰ ਕੱਢੋ ਅਤੇ 10 μl ਸਵੈਚਲਿਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਹਿ ਰਹੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ। ਕਿਉਂਕਿ ਕੈਨੂਲਾ ਦੀ ਪੇਟੈਂਸੀ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੋ ਗਈ ਸੀ, ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਸਾਫ਼ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਖੂਨ ਦੇ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੋਣ ਜਾਂ ਰੰਗ ਬਦਲਣ ਦਾ ਕੋਈ ਸਬੂਤ ਨਹੀਂ ਸੀ। ਸਮਾਨਾਂਤਰ, ਪੂਛ ਦੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਜਿਹੇ ਚੀਰੇ ਤੋਂ ਲਗਭਗ 10-20 μl ਖੂਨ ਹੈਪਰੀਨ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨਾਲ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। T7 ਫੇਜ਼ ਦੇ ਨਾੜੀ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ 'ਤੇ CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ CSF ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਲਗਭਗ 5-10 μl ਤਰਲ ਪਦਾਰਥ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਕੈਥੀਟਰ ਦੇ ਡੈੱਡ ਵਾਲੀਅਮ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ।
T7Select ਸਿਸਟਮ ਮੈਨੂਅਲ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ T7Select 10-3b ਵੈਕਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਬੇਤਰਤੀਬ 12-mer DNA ਇਨਸਰਟ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਫਾਰਮੈਟ ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ:
NNK ਕੋਡਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਡਬਲ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਅਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। N ਹਰੇਕ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਦਾ ਇੱਕ ਹੱਥੀਂ ਮਿਸ਼ਰਤ ਸਮਰੂਪ ਅਨੁਪਾਤ ਹੈ, ਅਤੇ K ਐਡੀਨਾਈਨ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਸਾਈਨ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦਾ ਇੱਕ ਹੱਥੀਂ ਮਿਸ਼ਰਤ ਸਮਰੂਪ ਅਨੁਪਾਤ ਹੈ। ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕਲੇਨੋ ਬਫਰ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਸ) ਵਿੱਚ dNTP (ਨੋਵਾਜੇਨ) ਅਤੇ ਕਲੇਨੋ ਐਂਜ਼ਾਈਮ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਸ) ਨਾਲ ਹੋਰ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ EtOH ਵਰਖਾ ਦੁਆਰਾ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪਾਬੰਦੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮ EcoRI ਅਤੇ HindIII (ਦੋਵੇਂ ਰੋਸ਼ੇ ਤੋਂ) ਨਾਲ ਹਜ਼ਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਲੀਵਡ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ (QIAquick, Qiagen) ਇਨਸਰਟ (T4 ligase, New England Biolabs) ਨੂੰ ਫਿਰ 10B ਕੈਪਸਿਡ ਜੀਨ ਦੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ 348 ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਪ੍ਰੀ-ਕਲੀਵਡ T7 ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਫਰੇਮ ਵਿੱਚ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 18 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ 16° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫੇਜ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਇਨ ਵਿਟਰੋ T7Select 10-3b ਕਲੋਨਿੰਗ ਕਿੱਟ (ਨੋਵਾਜੇਨ) ਨਾਲ ਦਿੱਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਘੋਲ ਨੂੰ ਇੱਕ ਵਾਰ ਐਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ (BLT5615, ਨੋਵਾਜੇਨ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਈਸਿਸ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਲਾਈਸੇਟਸ ਨੂੰ ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਦੇ ਸਟਾਕ ਘੋਲ ਵਜੋਂ -80° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ, ਟਾਈਟਰੇਟ ਅਤੇ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਮਲਕੀਅਤ 454/ਰੋਚੇ-ਐਂਪਲਿਕਨ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਰੋਥ ਜਾਂ ਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਫੈਲਾਏ ਗਏ ਫੇਜ ਵੇਰੀਏਬਲ ਖੇਤਰਾਂ ਦਾ ਸਿੱਧਾ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ। ਫਾਰਵਰਡ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਵੇਰੀਏਬਲ ਖੇਤਰ (NNK) 12 (ਟੈਂਪਲੇਟ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼), GS FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਅਡਾਪਟਰ A, ਅਤੇ ਇੱਕ ਚਾਰ-ਅਧਾਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਕੁੰਜੀ ਕ੍ਰਮ (TCAG) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1a) ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਕ੍ਰਮ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ:
ਰਿਵਰਸ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਕੈਪਚਰ ਬੀਡਸ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਬਾਇਓਟਿਨ ਅਤੇ ਇਮਲਸ਼ਨ ਪੀਸੀਆਰ ਦੌਰਾਨ ਕਲੋਨਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ GS FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਅਡਾਪਟਰ B ਵੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ:
ਫਿਰ ਐਂਪਲਿਕਨਾਂ ਨੂੰ 454 GS-FLX ਟਾਈਟੇਨੀਅਮ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ 454/Roche pyrosequencing ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਮੈਨੂਅਲ ਸੈਂਗਰ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ ਹਿਟਾਚੀ 3730 xl DNA ਐਨਾਲਾਈਜ਼ਰ) ਲਈ, T7 ਫੇਜ਼ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ PCR ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋੜਿਆਂ ਨਾਲ ਸੀਕੁਐਂਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ:
ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤਖ਼ਤੀਆਂ ਤੋਂ ਇਨਸਰਟਾਂ ਨੂੰ ਰੋਸ਼ ਫਾਸਟ ਸਟਾਰਟ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਕਿੱਟ (ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਗਰਮ ਸ਼ੁਰੂਆਤ (95 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ) ਅਤੇ 35 ਬੂਸਟ ਚੱਕਰ (95 °C 'ਤੇ 50 ਸਕਿੰਟ, 50 °C 'ਤੇ 1 ਮਿੰਟ, ਅਤੇ 72 °C 'ਤੇ 1 ਮਿੰਟ) ਕਰੋ।
ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਤੋਂ ਫੇਜ, ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਫੇਜ, CSF ਅਤੇ ਖੂਨ ਤੋਂ ਬਚਾਇਆ ਗਿਆ ਫੇਜ, ਜਾਂ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ Escherichia coli BL5615 ਵਿੱਚ TB ਬਰੋਥ (ਸਿਗਮਾ ਐਲਡਰਿਕ) ਵਿੱਚ ਜਾਂ 500 cm2 ਡਿਸ਼ਾਂ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਵਿੱਚ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਿਸ-ਈਡੀਟੀਏ ਬਫਰ (ਫਲੂਕਾ ਐਨਾਲਿਟੀਕਲ) ਨਾਲ ਕੁਰਲੀ ਕਰਕੇ ਜਾਂ ਸਟੀਰਾਈਲ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪਸ ਨਾਲ ਪਲੇਕਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਕੇ ਪਲੇਟਾਂ ਤੋਂ ਫੇਜ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫੇਜ ਨੂੰ ਪੋਲੀਥੀਲੀਨ ਗਲਾਈਕੋਲ (PEG 8000) ਪ੍ਰਸਤੁਤੀ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ) ਦੇ ਇੱਕ ਦੌਰ ਨਾਲ ਕਲਚਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਜਾਂ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਬਫਰ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਟ੍ਰਿਸ-ਈਡੀਟੀਏ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫੇਜ ਨੂੰ ਇੰਟਰਾਵੇਨਸ (IV) ਟੀਕਾ (500 μl/ਜਾਨਵਰ) ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਰਿਮੂਵਲ ਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ ਬਾਇਓਟੈਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਹਟਾਉਣ ਦੇ 2-3 ਦੌਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, 2×1012 ਫੇਜ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ; ਦੂਜੇ ਵਿੱਚ, 2×1010 ਫੇਜ; ਤੀਜੇ ਅਤੇ ਚੌਥੇ ਚੋਣ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਤੀ ਜਾਨਵਰ 2×109 ਫੇਜ। CSF ਵਿੱਚ ਫੇਜ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਦੱਸੇ ਗਏ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਖੂਨ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ (T7Select ਸਿਸਟਮ ਮੈਨੂਅਲ) ਅਨੁਸਾਰ ਪਲੇਕ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫੇਜ ਦੀ ਚੋਣ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁੱਧ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਦੇ ਨਾੜੀ ਟੀਕੇ ਦੁਆਰਾ ਜਾਂ ਪਿਛਲੇ ਚੋਣ ਦੌਰ ਤੋਂ CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਫੇਜ ਦੇ ਦੁਬਾਰਾ ਟੀਕੇ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੀਆਂ ਫਸਲਾਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 10 ਮਿੰਟ, 30 ਮਿੰਟ, 60 ਮਿੰਟ, 90 ਮਿੰਟ, 120 ਮਿੰਟ, 180 ਮਿੰਟ, ਅਤੇ 240 ਮਿੰਟ 'ਤੇ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਇਨ ਵੀਵੋ ਪੈਨਿੰਗ ਦੇ ਕੁੱਲ ਚਾਰ ਦੌਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਨੂੰ ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ ਦੌਰਾਨ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੋ ਦੌਰਾਂ ਤੋਂ CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਫੇਜ ਇਨਸਰਟਸ ਨੂੰ 454/ਰੋਚੇ ਪਾਈਰੋਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਚੋਣ ਦੇ ਆਖਰੀ ਦੋ ਦੌਰਾਂ ਤੋਂ CSF ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਕਲੋਨ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਚੋਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਸਾਰੇ ਬਲੱਡ ਫੇਜ ਵੀ 454/ਰੋਚੇ ਪਾਈਰੋਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਦੇ ਟੀਕੇ ਲਈ, ਚੁਣੇ ਗਏ ਫੇਜ ਨੂੰ E. coli (BL5615) ਵਿੱਚ 500 cm2 ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਅਤੇ ਹੱਥੀਂ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕਲੋਨ ਟੀਬੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਫੇਜ ਕੱਢਣ, ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਅਤੇ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ), 300 μl ਵਿੱਚ 2×1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪੂਛ ਨਾੜੀ ਵਿੱਚ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸੀਕੁਐਂਸ ਡੇਟਾ ਦੀ ਪ੍ਰੀਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਅਤੇ ਗੁਣਾਤਮਕ ਫਿਲਟਰਿੰਗ। ਰਾਅ 454/ਰੋਸ਼ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਵਿਕਰੇਤਾ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਬਾਈਨਰੀ ਸਟੈਂਡਰਡ ਸਟ੍ਰੀਮ ਮੈਪ ਫਾਰਮੈਟ (sff) ਤੋਂ ਪੀਅਰਸਨ ਹਿਊਮਨ ਰੀਡੇਬਲ ਫਾਰਮੈਟ (fasta) ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਹੋਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਮਲਕੀਅਤ C ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਾਂ ਅਤੇ ਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ (ਅਣ-ਰਿਲੀਜ਼ ਕੀਤੇ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਡੇਟਾ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਸਖਤ ਮਲਟੀ-ਸਟੇਜ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਰੀਡਾਂ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ ਕਰਨ ਲਈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੈਧ 12mer ਇਨਸਰਟ ਡੀਐਨਏ ਸੀਕੁਐਂਸ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਰੀਡਾਂ ਨੂੰ ਗਲੋਬਲ ਨੀਡਲਮੈਨ-ਵੰਸ਼ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਟਾਰਟ ਲੇਬਲ (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT), ਸਟਾਪ ਲੇਬਲ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ਅਤੇ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਇਨਸਰਟ (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCG) ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਇਕਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਪ੍ਰਤੀ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ 31 ਤੱਕ 2 ਅਸੰਗਤੀਆਂ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਬਿਨਾਂ ਸਟਾਰਟ ਅਤੇ ਸਟਾਪ ਟੈਗਾਂ ਦੇ ਪੜ੍ਹਨ ਅਤੇ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਇਨਸਰਟਸ ਵਾਲੇ ਪੜ੍ਹਨ, ਭਾਵ, ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਜੋ ਮੇਲ ਨਾ ਖਾਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਗਿਣਤੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹਨ, ਨੂੰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਕੀ ਰੀਡਾਂ ਲਈ, ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਨਿਸ਼ਾਨ ਤੋਂ ਲੈ ਕੇ ਸਟਾਪ ਮਾਰਕ ਤੱਕ ਫੈਲਿਆ ਹੋਇਆ N-mer DNA ਕ੍ਰਮ, ਜੋ ਕਿ ਸਟਾਪ ਮਾਰਕ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਖਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ ਮੂਲ ਰੀਡ ਕ੍ਰਮ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ (ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ "ਇਨਸਰਟ" ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ)। ਇਨਸਰਟ ਦੇ ਅਨੁਵਾਦ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪਹਿਲੇ ਸਟਾਪ ਕੋਡਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਇਨਸਰਟ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਅਧੂਰੇ ਕੋਡਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਿਰਫ਼ ਬੈਕਗ੍ਰਾਊਂਡ ਕ੍ਰਮ ਵਾਲੇ ਇਨਸਰਟਾਂ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਲਈ, ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਪੈਟਰਨ "PAG" ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਅਨੁਵਾਦਿਤ ਇਨਸਰਟਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ 3 ਤੋਂ ਘੱਟ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਪੋਸਟ-ਅਨੁਵਾਦ ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਈਡ ਹਟਾ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਇਨਸਰਟ ਪੂਲ ਵਿੱਚ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾਓ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਵਿਲੱਖਣ ਇਨਸਰਟ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ। ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ (ਇਨਸਰਟ) ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ (ਪੜ੍ਹੀਆਂ) ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀਜ਼ ਦੀ ਇੱਕ ਸੂਚੀ ਸ਼ਾਮਲ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਅੰਕੜੇ 1c ਅਤੇ 2)।
ਸਮੂਹ N-mer DNA ਸੰਮਿਲਨ ਕ੍ਰਮ ਸਮਾਨਤਾ ਦੁਆਰਾ: 454/Roche-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕ੍ਰਮ ਗਲਤੀਆਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਕ੍ਰਮ ਹੋਮੋਪੋਲੀਮਰ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨਾਂ ਨਾਲ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ) ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਅਤੇ ਘੱਟ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ, ਪਹਿਲਾਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ N-mer DNA ਕ੍ਰਮ ਸੰਮਿਲਨ (ਸੰਮਿਲਨ) ਸਮਾਨਤਾ ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਸੰਮਿਲਨ (2 ਗੈਰ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਅਧਾਰਾਂ ਤੱਕ ਦੀ ਆਗਿਆ ਹੈ) ਇੱਕ ਦੁਹਰਾਓ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੋ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ: ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ (ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ) ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਉਹ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਕ੍ਰਮ ਅਨੁਸਾਰ ਲੰਬਾਈ (ਸਭ ਤੋਂ ਛੋਟੀ ਤੋਂ ਛੋਟੀ) ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਾਰ ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬੇ ਸੰਮਿਲਨ ਪਹਿਲੇ "ਸਮੂਹ" ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਸਮੂਹ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਕੁੰਜੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਫਿਰ, ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਸੂਚੀ ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਹਰੇਕ ਸੰਮਿਲਨ ਨੂੰ ਜੋੜਾ ਅਨੁਸਾਰ Needleman-Wunsch ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਦੁਆਰਾ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਜੋੜਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਜੇਕਰ ਇੱਕ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਬੇਮੇਲ, ਸੰਮਿਲਨ, ਜਾਂ ਮਿਟਾਉਣ ਦੀ ਗਿਣਤੀ 2 ਦੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੰਮਿਲਨ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਮੁੱਚੀ ਸਮੂਹ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਇਸ ਗੱਲ ਨਾਲ ਵਧਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਸੰਮਿਲਨ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਵਰਤੇ ਵਜੋਂ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਜੇਕਰ ਸੰਮਿਲਨ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਮੌਜੂਦ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸੰਮਿਲਨ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਢੁਕਵੀਂ ਸੰਮਿਲਨ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਮੂਹ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਵਰਤੀ ਗਈ ਵਜੋਂ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਦੁਹਰਾਓ ਉਦੋਂ ਖਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਹਰੇਕ ਸੰਮਿਲਨ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਜਾਂ ਤਾਂ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਮੂਹ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਮੌਜੂਦ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਆਖ਼ਰਕਾਰ, ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਾਂ ਵਾਲੇ ਸਮੂਹਬੱਧ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਨੂੰ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ (ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਅਨੁਵਾਦ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਸੰਬੰਧਿਤ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀਜ਼ ਦਾ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਹੈ ਜੋ ਲਗਾਤਾਰ ਪੜ੍ਹਨ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2)।
ਮੋਟਿਫ ਜਨਰੇਸ਼ਨ: ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਸੂਚੀ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਇੱਕ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਬਣਾਈ ਗਈ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਸੰਭਵ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਪੈਟਰਨ (aa) ਸਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਲੰਬਾਈ 3 ਦੇ ਹਰੇਕ ਸੰਭਾਵੀ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਉਲਟ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਇੱਕ ਆਮ ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਪੈਟਰਨ (ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡਸ) ਸਨ। ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ, ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕੰਪਿਊਟੇਸ਼ਨਲ ਟੂਲਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਪਾਏ ਗਏ ਮੋਟਿਫ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮੋਟਿਫ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ("ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ")। ਮੋਟਿਫ ਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਇੱਕ ਦੋ-ਅਯਾਮੀ ਐਰੇ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਈਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਮੋਟਿਫ) ਦੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਘਟਨਾਵਾਂ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮੁੱਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਰੀਡਸ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਹੈ ਜੋ ਰੀਡਸ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ, ਸਮੂਹਬੱਧ ਅਤੇ ਅਨੁਵਾਦ ਕੀਤੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮੋਟਿਫ ਵਿੱਚ ਨਤੀਜਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਉੱਪਰ ਵੇਰਵੇ ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ।
ਮੋਟਿਫਾਂ ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸਕੈਟਰਪਲਾਟਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਾ ਸਧਾਰਣਕਰਨ: ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ
ਜਿੱਥੇ ni ਵਿਸ਼ਾ i ਵਾਲੇ ਰੀਡਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਹੈ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, vi ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫ i ਵਾਲੇ ਰੀਡਾਂ (ਜਾਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ) ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਗੈਰ-ਸਧਾਰਨ ਸੰਖਿਆ ਲਈ P-ਮੁੱਲ ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਹੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਿਣੇ ਗਏ ਸਨ। ਮੋਟਿਫਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਸਪੀਅਰਮੈਨ ਦੇ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ R ਨਾਲ ਮਨੋਰਥਾਂ ਦੀ ਆਮ ਸੰਖਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਵੈੱਬ ਲੋਗੋਗ੍ਰਾਮ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਪਹਿਲਾਂ, 12-mer ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਨੂੰ 20×12 ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ, ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਸਮੱਗਰੀ ਵਾਲੇ 1000 ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਸੈੱਟ ਫਾਸਟਾ-ਸੀਕੁਐਂਸ ਫਾਰਮੈਟ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵੈੱਬ-ਲੋਗੋ 3 ਵਿੱਚ ਇਨਪੁਟ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਗ੍ਰਾਫਿਕਲ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਲਈ। ਬਹੁ-ਆਯਾਮੀ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, R (ਬਾਇਓਸਹੀਟਮੈਪ, ਇੱਕ ਅਜੇ ਜਾਰੀ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ R ਪੈਕੇਜ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਅੰਦਰੂਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਕਸਤ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹੀਟ ਮੈਪ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਹੀਟ ਮੈਪਾਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਡੈਂਡਰੋਗ੍ਰਾਮਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਯੂਕਲੀਡੀਅਨ ਦੂਰੀ ਮੈਟ੍ਰਿਕ ਨਾਲ ਵਾਰਡ ਦੇ ਲੜੀਵਾਰ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਮੋਟਿਫ ਸਕੋਰਿੰਗ ਡੇਟਾ ਦੇ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਹੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਅਸਧਾਰਨ ਸਕੋਰਿੰਗ ਲਈ P ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਦੂਜੇ ਡੇਟਾਸੈੱਟਾਂ ਲਈ P-ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਜਾਂ ANOVA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ R ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਫੇਜ ਕਲੋਨ ਅਤੇ ਇਨਸਰਟਸ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਫੇਜ ਨੂੰ ਪੂਛ ਦੀ ਨਾੜੀ (2×1010 ਫੇਜ/ਜਾਨਵਰ 300 μl PBS ਵਿੱਚ) ਰਾਹੀਂ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਦਸ ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ, ਉਹੀ ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ DyLight594-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਲੈਕਟਿਨ (ਵੈਕਟਰ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼ ਇੰਕ., DL-1177) ਦੇ 100 μl ਨਾਲ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫੇਜ ਟੀਕੇ ਤੋਂ 60 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ, ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ 50 ਮਿਲੀਲੀਟਰ PBS ਨਾਲ ਦਿਲ ਰਾਹੀਂ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 50 ਮਿਲੀਲੀਟਰ 4% PFA/PBS ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਰਾਤੋ ਰਾਤ 4% PFA/PBS ਵਿੱਚ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ 30% ਸੁਕਰੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਭਿੱਜਿਆ ਗਿਆ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ OCT ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ ਫਲੈਸ਼ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਜੰਮੇ ਹੋਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮੀਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1% BSA ਨਾਲ ਬਲੌਕ ਕੀਤੇ 30 µm ਕ੍ਰਾਇਓਸੈਕਸ਼ਨਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 4 °C 'ਤੇ T7 ਫੇਜ਼ (ਨੋਵਸ NB 600-376A) ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ FITC-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰਾਤ ਭਰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਕਨਫੋਕਲ ਲੇਜ਼ਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (Leica TCS SP5) ਨਾਲ ਜਾਂਚਿਆ ਗਿਆ।
98% ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ GenScript USA ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਡ ਅਤੇ ਲਾਇਓਫਿਲਾਈਜ਼ਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਇਓਟਿਨ N-ਟਰਮੀਨਸ 'ਤੇ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਟ੍ਰਿਪਲ ਗਲਾਈਸੀਨ ਸਪੇਸਰ ਦੁਆਰਾ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਾਰੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰੋ।
ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ (ਸਿਗਮਾ S0677) ਨੂੰ 5-ਗੁਣਾ ਸਮਤੋਲ ਵਾਧੂ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੇਪਟਾਈਡ, ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ, ਜਾਂ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ ਅਤੇ BACE1 ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ ਸੁਮੇਲ (3:1 ਅਨੁਪਾਤ) ਦੇ ਨਾਲ 5-10% DMSO/PBS ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟੀਕੇ ਤੋਂ 1 ਘੰਟਾ ਪਹਿਲਾਂ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ। ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਸੰਯੁਕਤ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗੀ ਗੁਫਾ ਵਾਲੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੀ ਪੂਛ ਦੀਆਂ ਨਾੜੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਵਿੱਚ 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ ਦੀ ਖੁਰਾਕ 'ਤੇ ਨਾੜੀ ਰਾਹੀਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਪੇਪਟਾਇਡ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ELISA ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਨਕ ਮੈਕਸੀਸੋਰਪ ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਾਈਟਰ ਪਲੇਟਾਂ (ਸਿਗਮਾ) ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ 1.5 μg/ml ਮਾਊਸ ਐਂਟੀ-ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਥਰਮੋ, MA1-20011) ਨਾਲ ਕੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਬਲਾਕਿੰਗ (ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ਜੈਲੇਟਿਨ, 1% BSA) ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਲੇਟ ਨੂੰ 0.05% ਟਵੀਨ-20/PBS (ਵਾਸ਼ ਬਫਰ) ਨਾਲ 3 ਸਕਿੰਟ ਲਈ ਧੋਵੋ, CSF ਅਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ (ਪਲਾਜ਼ਮਾ 1:10,000, CSF 1:115) ਨਾਲ ਪਤਲੇ ਹੋਏ ਖੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਫਿਰ ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਡਿਟੈਕਸ਼ਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (1 μg/ml, ਐਂਟੀ-ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-HRP, ਨੋਵਸ NB120-7239) ਨਾਲ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਤਿੰਨ ਧੋਣ ਦੇ ਪੜਾਵਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਨੂੰ TMB ਸਬਸਟਰੇਟ ਘੋਲ (ਰੋਚੇ) ਵਿੱਚ 20 ਮਿੰਟ ਤੱਕ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ। 1M H2SO4 ਨਾਲ ਰੰਗ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 450 nm 'ਤੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪੋ।
ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਪੇਪਟਾਇਡ-BACE1 ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਕਾਰਜ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ Aβ(1-40) ELISA ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ (ਵਾਕੋ, 294-64701) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, CSF ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਾਇਲੂਐਂਟ (1:23) ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ BNT77 ਕੈਪਚਰ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਲੇਪੀਆਂ 96-ਵੈੱਲ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ 4°C 'ਤੇ ਰਾਤ ਭਰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੰਜ ਧੋਣ ਦੇ ਕਦਮਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, HRP-ਸੰਯੁਕਤ BA27 ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੰਜ ਧੋਣ ਦੇ ਕਦਮ ਸਨ। Aβ(1–40) ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ TMB ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਕੇ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਟਾਪ ਘੋਲ ਨਾਲ ਰੰਗ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 450 nm 'ਤੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪੋ। Aβ(1–40) ELISA ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਠੋਸ ਪੜਾਅ ਕੱਢਣ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਨੂੰ 96-ਵੈੱਲ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ 0.2% DEA (ਸਿਗਮਾ) ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। SPE ਪਲੇਟਾਂ (Oasis, 186000679) ਨੂੰ ਪਾਣੀ ਅਤੇ 100% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਲਗਾਤਾਰ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਦੇ ਨਮੂਨੇ SPE ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਸਾਰਾ ਤਰਲ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ (ਪਹਿਲਾਂ 5% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਫਿਰ 30% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ) ਅਤੇ 2% NH4OH/90% ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਐਲੂਏਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਥਿਰ N2 ਕਰੰਟ 'ਤੇ 99 ਮਿੰਟ ਲਈ 55°C 'ਤੇ ਐਲੂਏਟ ਨੂੰ ਸੁਕਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਾਇਲੂਐਂਟਸ ਵਿੱਚ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ Aβ(1–40) ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ।
ਇਸ ਲੇਖ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਕਿਵੇਂ ਦੇਣਾ ਹੈ: ਯੂਰਿਚ, ਈ. ਐਟ ਅਲ. ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਟ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ ਤੱਕ ਕਾਰਗੋ ਡਿਲੀਵਰੀ। ਵਿਗਿਆਨ। 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)।
ਲਿਖੋਟਾ ਜੇ., ਸਕਜੋਰਿੰਗ ਟੀ., ਥੌਮਸਨ ਐਲਬੀ ਅਤੇ ਮੂਸ ਟੀ. ਟਾਰਗੇਟਡ ਥੈਰੇਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ ਤੱਕ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਡਿਲਿਵਰੀ। ਜਰਨਲ ਆਫ਼ ਨਿਊਰੋਕੈਮਿਸਟਰੀ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
ਬ੍ਰਾਸਨਜੇਵਿਕ, ਆਈ., ਸਟਾਈਨਬੁਸ਼, ਐਚ.ਡਬਲਯੂ., ਸਮਿਟਜ਼, ਸੀ., ਅਤੇ ਮਾਰਟੀਨੇਜ਼-ਮਾਰਟੀਨੇਜ਼, ਪੀ. ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਵਾਈਆਂ ਦੀ ਡਿਲਿਵਰੀ। ਪ੍ਰੋਗ ਨਿਊਰੋਬਾਇਓਲ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂ.ਐਮ. ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ: ਦਿਮਾਗੀ ਦਵਾਈ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਰੁਕਾਵਟ। ਨਿਊਰੋਆਰਐਕਸ 2, 3–14, 10.1602/ਨਿਊਰੋਰੈਕਸ.2.1.3 (2005)।
ਜੋਹਾਨਸਨ, ਕੇ.ਈ., ਡੰਕਨ, ਜੇ.ਏ., ਸਟੋਪਾ, ਈ.ਜੀ., ਅਤੇ ਬਾਇਰਡ, ਏ. ਕੋਰੋਇਡ ਪਲੇਕਸਸ-ਸੀ.ਐਸ.ਐਫ. ਮਾਰਗ ਰਾਹੀਂ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਦਵਾਈ ਡਿਲੀਵਰੀ ਅਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਦੀਆਂ ਸੰਭਾਵਨਾਵਾਂ। ਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਰਿਸਰਚ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂਐਮ ਦਿਮਾਗ ਦੀ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਅਣੂ ਟਰੋਜਨ ਘੋੜਿਆਂ ਨਾਲ ਬਾਇਓਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਦਾ ਆਧੁਨਿਕੀਕਰਨ। ਬਾਇਓਕੋਨਜਗ ਕੈਮ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
ਪਾਰਡਰਿਜ, ਡਬਲਯੂਐਮ ਰੀਸੈਪਟਰ-ਮਾਧਿਅਮ ਪੇਪਟਾਇਡ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਖੂਨ-ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਪਾਰ। ਐਂਡੋਕਰ ਰੇਵ. 7, 314–330 (1986)।
ਨੀਵੋਹਨਰ, ਜੇ. ਐਟ ਅਲ। ਮੋਨੋਵੈਲੈਂਟ ਅਣੂ ਸ਼ਟਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਵਧਾਓ। ਨਿਊਰੋਨ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
ਬਿਏਨ-ਲੀ, ਐਨ. ਐਟ ਅਲ. ਟ੍ਰਾਂਸਫਰਿਨ ਰੀਸੈਪਟਰ (ਟੀਐਫਆਰ) ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਟੀਐਫਆਰ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਐਫੀਨਿਟੀ ਵੇਰੀਐਂਟਸ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਗ੍ਰਹਿਣ ਕਰਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਜੇ ਐਕਸਪ ਮੈਡ 211, 233–244, 10.1084/ਜੇਮ.20131660 (2014)।