Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਧੰਨਵਾਦ। ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਜਾ ਰਹੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਿੱਚ ਸੀਮਤ CSS ਸਹਾਇਤਾ ਹੈ। ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)। ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਹਾਇਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਰੈਂਡਰ ਕਰਾਂਗੇ।
AFEX ਨਾਲ ਪ੍ਰੀ-ਟਰੀਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮੱਕੀ ਦੇ ਸਟੋਵਰ ਵਿੱਚ ਸਥਾਈ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਨਵੇਂ ਇਮਯੂਨੋਲੋਜੀਕਲ ਅਤੇ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟ੍ਰਿਕ ਤਰੀਕੇ। ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਬਾਇਓਮਾਸ ਜੈਵਿਕ ਇੰਧਨ ਦਾ ਇੱਕ ਟਿਕਾਊ ਵਿਕਲਪ ਹੈ ਅਤੇ ਭੋਜਨ, ਫੀਡ, ਇੰਧਨ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਾਂ ਵਰਗੇ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀਆਂ ਨੂੰ ਵਿਕਸਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ ਦੀ ਕੁੰਜੀ ਪੌਦਿਆਂ ਦੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕੰਧਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਨੂੰ ਗਲੂਕੋਜ਼, ਜ਼ਾਈਲੋਜ਼ ਅਤੇ ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਵਰਗੀਆਂ ਸਧਾਰਨ ਸ਼ੱਕਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਲਈ ਲਾਗਤ-ਮੁਕਾਬਲੇ ਵਾਲੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਵਿਕਾਸ ਹੈ। ਕਿਉਂਕਿ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਬਾਇਓਮਾਸ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿੱਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇਸਨੂੰ ਲੋੜੀਂਦਾ ਉਤਪਾਦ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਥਰਮੋਕੈਮੀਕਲ ਇਲਾਜ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਮੋਨੀਆ ਫਾਈਬਰ ਐਕਸਫੋਲੀਏਸ਼ਨ (AFEX), ਪਤਲਾ ਐਸਿਡ (DA), ਆਇਓਨਿਕ ਤਰਲ (IL)) ਅਤੇ ਜੈਵਿਕ ਇਲਾਜ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਬਾਇਲ ਫਰਮੈਂਟੇਸ਼ਨ) ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੇ ਅਧੀਨ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ। . ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜਦੋਂ ਵਪਾਰਕ ਫੰਗਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਬਣੀਆਂ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਸ਼ੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਿਰਫ਼ 75-85% ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਬਾਕੀ 15-25% ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ, ਅਟੱਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਹਮੇਸ਼ਾ ਸੂਖਮ ਜੀਵਾਂ ਲਈ ਉਪਲਬਧ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ। ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਕਾਰਬਨ ਅਤੇ ਡਾਇਟੋਮੇਸੀਅਸ ਧਰਤੀ ਵਿਭਾਜਨ ਅਤੇ ਆਕਾਰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਜ਼ਿੱਦੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਅਲੱਗ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਰੋਕਣ ਵਾਲੇ ਗੁਣਾਂ ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਉੱਚ ਡਿਗਰੀ ਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (DP) ਮਿਥਾਈਲੇਟਿਡ ਯੂਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ ਬਦਲਾਂ ਵਾਲੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟ DP ਅਤੇ ਨਿਰਪੱਖ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕਰਨਾ ਵਧੇਰੇ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਕਈ ਵਾਧੂ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ ਸੈੱਲ ਦੀਆਂ ਕੰਧਾਂ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸੇਟਸ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਕਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ ਬਾਇਓਮਾਸ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (mAbs) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਗਲਾਈਕਨ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਿੰਗ, ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ-ਸਹਾਇਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਲੇਜ਼ਰ ਡੀਸੋਰਪਸ਼ਨ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ, ਟਾਈਮ-ਆਫ-ਫਲਾਈਟ ਮਾਸ-ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। MALDI-TOF-MS) ਨੈਗੇਟਿਵ ਆਇਨਾਂ, ਗੈਸ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਅਤੇ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (GC-MS) ਦੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਸੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਬਣਤਰ-ਜਾਣਕਾਰੀਪੂਰਨ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਸਿਖਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ ਅਤੇ ਬਿਨਾਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ। ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ (DP 4–20) ਦੇ ਛੋਟੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਇਹਨਾਂ ਅਣੂਆਂ ਨੂੰ mAb ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਵਰਤਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ। ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਬਾਇਓਟਿਨ ਸੰਜੋਗ-ਅਧਾਰਤ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਇਮੋਬਿਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਵਿਧੀ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਜਿਸਨੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਸਤਹ 'ਤੇ ਘੱਟ DP ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਬਹੁਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ, ਜਿਸਨੂੰ ਫਿਰ ਖਾਸ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਉੱਚ ਥਰੂਪੁੱਟ mAb ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ। ਇਹ ਨਵੀਂ ਵਿਧੀ ਭਵਿੱਖ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਉੱਨਤ ਉੱਚ ਥਰੂਪੁੱਟ ਗਲਾਈਕੋਮ ਅਸੈਸ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦੇਵੇਗੀ ਜਿਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਬਾਇਓਮਾਰਕਰਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੇਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਖੇਤੀਬਾੜੀ, ਜੰਗਲਾਤ, ਘਾਹ ਅਤੇ ਲੱਕੜੀ ਦੇ ਪਦਾਰਥਾਂ ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਬਾਇਓਮਾਸ, ਜੈਵਿਕ-ਅਧਾਰਤ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਫੀਡਸਟੌਕ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਭੋਜਨ, ਫੀਡ, ਬਾਲਣ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਪੂਰਵਗਾਮੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਜੋ ਉੱਚ ਮੁੱਲ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਪੌਦਿਆਂ ਦੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕੰਧਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਅਤੇ ਹੇਮੀਸੈਲੂਲੋਜ਼) ਰਸਾਇਣਕ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਅਤੇ ਬਾਇਓਟ੍ਰਾਂਸਫਾਰਮੇਸ਼ਨ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਬਾਇਲ ਫਰਮੈਂਟੇਸ਼ਨ) ਦੁਆਰਾ ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਡੀਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਆਮ ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅਮੋਨੀਆ ਫਾਈਬਰ ਐਕਸਪੈਂਸ਼ਨ (AFEX), ਪਤਲਾ ਐਸਿਡ (DA), ਆਇਓਨਿਕ ਤਰਲ (IL), ਅਤੇ ਭਾਫ਼ ਵਿਸਫੋਟ (SE) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜੋ ਪੌਦਿਆਂ ਦੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕੰਧਾਂ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹ ਕੇ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਉਤਪਾਦਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਰਸਾਇਣਾਂ ਅਤੇ ਗਰਮੀ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ3,4। ਪਦਾਰਥ ਦੀ ਜ਼ਿੱਦ, 5. ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਵਪਾਰਕ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ-ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (CAZymes) ਅਤੇ ਬਾਇਓ-ਅਧਾਰਤ ਬਾਲਣ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਾਂ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਟ੍ਰਾਂਸਜੇਨਿਕ ਖਮੀਰ ਜਾਂ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਬਾਇਲ ਫਰਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਉੱਚ ਠੋਸ ਭਾਰ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ 6।
ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਵਿੱਚ CAZymes ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਤੋਂ ਬਣੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ-ਸ਼ੂਗਰ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਸਹਿਯੋਗੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਤੋੜ ਕੇ ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡ 2,7 ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਸੀ, ਲਿਗਨਿਨ ਦੇ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੇ ਨਾਲ ਖੁਸ਼ਬੂਦਾਰ ਪੋਲੀਮਰਾਂ ਦਾ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਨੈਟਵਰਕ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਟੱਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਅਧੂਰੀ ਖੰਡ ਤਬਦੀਲੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, 15-25% ਸੈਕਸ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਇਕੱਠੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਬਾਇਓਮਾਸ ਦੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੌਰਾਨ ਪੈਦਾ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ। ਇਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਬਾਇਓਮਾਸ ਪ੍ਰੀਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨਾਲ ਇੱਕ ਆਮ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ। ਇਸ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਕੁਝ ਕਾਰਨਾਂ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੌਰਾਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਰੋਕ, ਜਾਂ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ ਬਾਇਓਮਾਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ੂਗਰ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਤੋੜਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਜ਼ਰੂਰੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਜਾਂ ਘੱਟ ਪੱਧਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਸ਼ੱਕਰ ਦੀ ਰਚਨਾ ਅਤੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ੂਗਰ ਬਾਂਡ, ਸਾਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੌਰਾਨ ਖੰਡ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰੇਗਾ, ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੌਜੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਪੈਟਰੋਲੀਅਮ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨਾਲ ਲਾਗਤ-ਮੁਕਾਬਲੇ ਵਾਲਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੀ ਬਣਤਰ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣਾ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (LC)11,12, ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਮੈਗਨੈਟਿਕ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (NMR)13, ਕੇਸ਼ੀਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ (CE)14,15,16 ਅਤੇ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS)17 ਵਰਗੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ,ਅਠਾਰਾਂ। ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ (MALDI-TOF-MS) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਲੇਜ਼ਰ ਡੀਸੋਰਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ ਟਾਈਮ-ਆਫ-ਫਲਾਈਟ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਵਰਗੇ MS ਤਰੀਕੇ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਬਣਤਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਬਹੁਪੱਖੀ ਢੰਗ ਹਨ। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਪੋਜੀਸ਼ਨਾਂ, ਐਨੋਮੇਰਿਕ ਕੌਂਫਿਗਰੇਸ਼ਨਾਂ, ਕ੍ਰਮਾਂ ਅਤੇ ਬ੍ਰਾਂਚਿੰਗ ਪੋਜੀਸ਼ਨਾਂ 20, 21 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਫਿੰਗਰਪ੍ਰਿੰਟਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਸੋਡੀਅਮ ਆਇਨ ਐਡਕਟਾਂ ਦੇ ਕੋਲੀਜ਼ਨ-ਇੰਡਿਊਸਡ ਡਿਸਸੋਸੀਏਸ਼ਨ (CID) ਟੈਂਡਮ MS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
ਗਲਾਈਕਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਬਾਂਡ 22 ਦੀ ਡੂੰਘਾਈ ਨਾਲ ਪਛਾਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਧੀਆ ਸਾਧਨ ਹੈ। ਇਹ ਵਿਧੀ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਲਿੰਕੇਜ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ ਪਲਾਂਟ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨ ਨੂੰ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (mAbs) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਦੁਨੀਆ ਭਰ ਵਿੱਚ 250 ਤੋਂ ਵੱਧ mAbs ਉਪਲਬਧ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਲੀਨੀਅਰ ਅਤੇ ਬ੍ਰਾਂਚਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਪੌਦੇ ਸੈੱਲ ਦੀਵਾਰ ਦੀ ਬਣਤਰ, ਰਚਨਾ ਅਤੇ ਸੋਧਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਕਈ mAbs ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਪੌਦੇ ਸੈੱਲ ਦੀ ਕਿਸਮ, ਅੰਗ, ਉਮਰ, ਵਿਕਾਸ ਪੜਾਅ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸ ਵਾਤਾਵਰਣ 25,26 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਹਨ। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੌਦਿਆਂ ਅਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੇਸਿਕਲ ਆਬਾਦੀ ਅਤੇ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਮਾਰਕਰਾਂ, ਵਿਕਾਸ ਦੇ ਪੜਾਵਾਂ, ਜਾਂ ਵਾਤਾਵਰਣਕ ਉਤੇਜਨਾ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਗਲਾਈਕਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਸੰਬੰਧਿਤ ਭੂਮਿਕਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਗਲਾਈਕੈਨ ਅਤੇ ਜ਼ਾਈਲਾਨ ਦੀਆਂ ਕੁਝ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਬਣਤਰਾਂ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਉਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਕਟਿਨ (P), ਜ਼ਾਈਲਾਨ (X), ਮੰਨਾਨ (M), ਜ਼ਾਈਲਗਲੂਕੈਨ (XylG), ਮਿਸ਼ਰਤ ਬਾਂਡ ਗਲੂਕਨ (MLG), ਅਰਬੀਨੋਕਸੀਲਨ (ArbX), ਗਲੈਕਟੋਮੈਨਨ (GalG), ਗਲੂਕੁਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ-ਅਰਬੀਨੋਕਸੀਲਨ (GArbX) ਅਤੇ ਅਰਬੀਨੋ-ਗਲੈਕਟਨ (ArbG)29 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।
ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹਨਾਂ ਸਾਰੇ ਖੋਜ ਯਤਨਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਸਿਰਫ ਕੁਝ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਉੱਚ ਠੋਸ ਭਾਰ (HSL) ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੌਰਾਨ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਰੀਲੀਜ਼, ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੌਰਾਨ ਓਲੀਗੋਮੇਰਿਕ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ ਬਦਲਾਅ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਘੱਟ DP ਪੋਲੀਮਰ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵਕਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਵੰਡ 30,31,32। ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਗਲਾਈਕਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਗਲਾਈਕਨ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਵਿਆਪਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਉਪਯੋਗੀ ਸਾਧਨ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਘੱਟ DP ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ। 5-10 kDa ਤੋਂ ਘੱਟ ਦੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲੇ ਛੋਟੇ DP ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ELISA ਪਲੇਟਾਂ 33, 34 ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਜੁੜਦੇ ਅਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਧੋਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਇੱਥੇ, ਪਹਿਲੀ ਵਾਰ, ਅਸੀਂ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਐਵੀਡਿਨ-ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ELISA ਪਰਖ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ ਕਿ ਗਲਾਈਕੋਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਨਾਲ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਲਈ ਇੱਕ-ਪੜਾਅ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ। ਗਲਾਈਕੋਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਸਾਡਾ ਪਹੁੰਚ MALDI-TOF-MS ਅਤੇ GC-MS ਅਧਾਰਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ਡ ਸ਼ੂਗਰ ਰਚਨਾਵਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਈਮੇਥਾਈਲਸਿਲਿਲ (TMS) ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪੂਰਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਲਿੰਕੇਜ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਨਵੀਨਤਾਕਾਰੀ ਪਹੁੰਚ ਨੂੰ ਭਵਿੱਖ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ ਵਿਧੀ ਵਜੋਂ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਇਓਮੈਡੀਕਲ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਉਪਯੋਗ ਲੱਭਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ35।
ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਅਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਅਨੁਵਾਦ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਸੋਧ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਗਲਾਈਕੋਸਾਈਲੇਸ਼ਨ, 36 ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਜੈਵਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਸੀਰਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਗਲਾਈਕੋਸਾਈਲੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਬਦਲਾਅ ਸੋਜਸ਼ ਗਠੀਏ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਗਲਾਈਕੋਸਾਈਲੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਬਦਲਾਅ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਮਾਰਕਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ37। ਸਾਹਿਤ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਨੂੰ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੀਆਂ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਣ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਗੈਸਟਰੋਇੰਟੇਸਟਾਈਨਲ ਟ੍ਰੈਕਟ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੀਆਂ ਪੁਰਾਣੀਆਂ ਸੋਜਸ਼ ਬਿਮਾਰੀਆਂ, ਵਾਇਰਲ ਇਨਫੈਕਸ਼ਨਾਂ, ਅੰਡਕੋਸ਼, ਛਾਤੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਸਟੇਟ ਕੈਂਸਰ 38,39,40 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਅਧਾਰਤ ਗਲਾਈਕਨ ELISA ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਦੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ ਗੁੰਝਲਦਾਰ MS ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਨਿਦਾਨ ਵਿੱਚ ਵਾਧੂ ਵਿਸ਼ਵਾਸ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰੇਗਾ।
ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪ੍ਰੀਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ (ਚਿੱਤਰ 1) ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਜ਼ਿੱਦੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅਣਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਰਹੇ। ਸਾਡੇ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕੰਮ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ AFEX-ਪ੍ਰੀਟ੍ਰੀਟੇਡ ਕੌਰਨ ਸਟੋਵਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ੇਟ (ACSH)8 ਤੋਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਚਾਰਕੋਲ ਠੋਸ-ਪੜਾਅ ਕੱਢਣ ਦਾ ਤਰੀਕਾ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ। ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕੱਢਣ ਅਤੇ ਵੱਖ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਆਕਾਰ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (SEC) ਦੁਆਰਾ ਹੋਰ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੀਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟਾਂ ਤੋਂ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸ਼ੂਗਰ ਮੋਨੋਮਰ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਮਰਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸ਼ੂਗਰ ਰਚਨਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੀਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸ਼ੂਗਰ ਓਲੀਗੋਮਰਾਂ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਜ਼ਿੱਦੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਬਾਇਓਮਾਸ ਨੂੰ ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਆਮ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਘੱਟੋ ਘੱਟ 10-15% ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ 18% ਤੱਕ ਖੰਡ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਲਿਆ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਯੂ.ਐਸ. ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅੰਸ਼ਾਂ ਦੇ ਹੋਰ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ACH ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਅੰਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅਣੂ ਭਾਰਾਂ ਨਾਲ ਇਸ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੱਗਰੀ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਥਾਈ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅਣਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਰਹੇ। ਇੱਥੇ (A) ਇੱਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦਾ ਤਰੀਕਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ AFEX-ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟੇਡ ਕੌਰਨ ਸਟੋਵਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸੇਟ (ACSH) ਤੋਂ ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਕਾਰਬਨ ਅਤੇ ਡਾਇਟੋਮੇਸੀਅਸ ਅਰਥ ਦੇ ਪੈਕਡ ਬੈੱਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ; (B) ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦਾ ਤਰੀਕਾ। ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਸਾਈਜ਼ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (SEC) ਦੁਆਰਾ ਹੋਰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; (C) ਸੈਕਰਾਈਡ ਮੋਨੋਮਰ ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟਾਂ (ਪਤਲਾ ਐਸਿਡ: DA, ਆਇਓਨਿਕ ਤਰਲ: IL ਅਤੇ AFEX) ਤੋਂ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਓਲੀਗੋਮਰ। ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਸਥਿਤੀਆਂ: 25% (w/w) ਦੀ ਉੱਚ ਠੋਸ ਲੋਡਿੰਗ (ਲਗਭਗ 8% ਗਲੂਕਨ ਲੋਡਿੰਗ), 96 ਘੰਟੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ, 20 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਜੀ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਲੋਡਿੰਗ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ਅਨੁਪਾਤ) ਅਤੇ (D) AFEX ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟੇਡ ਕੌਰਨ ਸਟੋਵਰ (ACS) ਤੋਂ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਗਲੂਕੋਜ਼, ਜ਼ਾਈਲੋਜ਼ ਅਤੇ ਅਰਾਬੀਨੋਜ਼ ਦੇ ਸ਼ੂਗਰ ਮੋਨੋਮਰ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਮਰ।
ਗਲਾਈਕਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਠੋਸ ਬਾਇਓਮਾਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਐਬਸਟਰੈਕਟਾਂ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਦੇ ਵਿਆਪਕ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਉਪਯੋਗੀ ਸਾਧਨ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ41 ਕਿਉਂਕਿ ਘੱਟ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ELISA ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਧੋਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ, ਐਵੀਡਿਨ-ਕੋਟੇਡ ELISA ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ, ਗੈਰ-ਅਨੁਕੂਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਕੋਟ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ-ਪੜਾਅ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਜਾਂਚ ਸਾਡੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ACSH ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਅਣੂ ਭਾਰ (ਜਾਂ ਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੀ ਡਿਗਰੀ, DP) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਇੱਕ ਅੰਸ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੇ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨ-LC-ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ਾਈਡ ਜੋੜ ਕੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਬਾਈਡਿੰਗ ਐਫੀਨਿਟੀ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ-ਪੜਾਅ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2)। ਘੋਲ ਵਿੱਚ, ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਹੇਮੀਆਸੀਟਲ ਸਮੂਹ ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ੋਨ ਬਾਂਡ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਬਾਇਓਟਿਨ-LC-ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ਾਈਡ ਦੇ ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ਾਈਡ ਸਮੂਹ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟ NaCNBH3 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ੋਨ ਬਾਂਡ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਅੰਤਮ ਉਤਪਾਦ ਵਿੱਚ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਖੰਡ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਿਰੇ ਦੇ ਸੋਧ ਦੇ ਨਾਲ, ਘੱਟ DP ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ELISA ਪਲੇਟਾਂ ਨਾਲ ਜੋੜਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਇਹ ਗਲਾਈਕਨ-ਟਾਰਗੇਟਡ mAbs ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਐਵੀਡਿਨ-ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਸ ਲਈ ELISA 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ। ਇੱਥੇ (A) ਨਿਊਟਰਐਵਿਡਿਨ ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਗਲਾਈਕਨ-ਟਾਰਗੇਟਡ mAbs ਨਾਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਸ ਦਾ ਸੰਯੁਕਤ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ELISA ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਅਤੇ (B) ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਸ਼ਨ ਲਈ ਇੱਕ-ਪੜਾਅ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
ਫਿਰ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਾਲੀਆਂ ਐਵੀਡਿਨ-ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਹਲਕੇ ਅਤੇ ਸਮੇਂ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਧੋਤਾ ਗਿਆ। ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪੂਰੀ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਨ ਲਈ TMB ਸਬਸਟ੍ਰੇਟ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਫਿਊਰਿਕ ਐਸਿਡ ਨਾਲ ਰੋਕ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਹਰੇਕ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਤਾਕਤ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ELISA ਰੀਡਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟਿਡ ਪਲੇਟਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਵੇਰਵਿਆਂ ਅਤੇ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਲਈ, ਸੰਬੰਧਿਤ ਭਾਗ "ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗ" ਵੇਖੋ।
ਅਸੀਂ ACSH ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸੇਟਸ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਕੱਚੇ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅੰਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਖਾਸ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਇਸ ਨਵੇਂ ਵਿਕਸਤ ਢੰਗ ਦੀ ਉਪਯੋਗਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 3 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਬਾਇਓਐਸੀਲੇਟਿਡ ਗਲਾਈਕੋਮ ਅਸੇਅ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ACSH ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਐਪੀਟੋਪ-ਬਦਲਵੇਂ ਜ਼ਾਈਲਾਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਯੂਰੋਨਿਕ (U) ਜਾਂ ਮਿਥਾਈਲੂਰੋਨਿਕ (MeU) ਅਤੇ ਪੈਕਟਿਕ ਅਰਬੀਨੋਗੈਲੈਕਟਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਉਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਗੈਰ-ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਠੋਸ ਪਦਾਰਥਾਂ (UHS)43 ਦੇ ਗਲਾਈਕੈਨ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ 'ਤੇ ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵੀ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ।
ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨ ਵੱਲ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਐਪੀਟੋਪਸ ਦੀ ਖੋਜ। "ਨਿਊਟ੍ਰਲ" ਫਰੈਕਸ਼ਨ ACN ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਹੈ ਅਤੇ "ਐਸਿਡਿਕ" ਫਰੈਕਸ਼ਨ FA ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਹੈ। ਹੀਟਮੈਪ 'ਤੇ ਚਮਕਦਾਰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਉੱਚ ਐਪੀਟੋਪ ਸਮੱਗਰੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਚਮਕਦਾਰ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਇੱਕ ਖਾਲੀ ਪਿਛੋਕੜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਪੈਮਾਨੇ 'ਤੇ ਰੰਗ ਮੁੱਲ ਫਾਰਮੂਲੇ N=2 ਲਈ ਕੱਚੇ OD ਮੁੱਲਾਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹਨ। ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮੁੱਖ ਐਪੀਟੋਪ ਸੱਜੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।
ਇਹਨਾਂ ਗੈਰ-ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਬਣਤਰਾਂ ਨੂੰ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਸੈਲੂਲੇਜ਼ ਅਤੇ ਹੇਮੀਸੈਲੂਲੇਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਨਹੀਂ ਤੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਇਸ ਲਈ, ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਲਈ ਨਵੇਂ ਸਹਾਇਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਜ਼ਰੂਰੀ ਗੈਰ-ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਸਹਾਇਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ, ਇਹ ਗੈਰ-ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਬਾਂਡ ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਤਬਦੀਲੀ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ, ਭਾਵੇਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਮੂਲ ਸ਼ੂਗਰ ਪੋਲੀਮਰ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਭੰਗ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਸਿਗਨਲ ਵੰਡ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਤਾਕਤ ਦੇ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਬਾਈਡਿੰਗ ਐਪੀਟੋਪ ਉੱਚ DP ਸ਼ੂਗਰ ਫਰੈਕਸ਼ਨਾਂ (A, B, C, DP 20+ ਤੱਕ) ਵਿੱਚ ਘੱਟ DP ਫਰੈਕਸ਼ਨਾਂ (D, E, F, DP) ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 1)। ਐਸਿਡ ਟੁਕੜੇ ਗੈਰ-ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਐਪੀਟੋਪਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਰਪੱਖ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਆਮ ਹਨ। ਇਹ ਵਰਤਾਰੇ ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਪੈਟਰਨ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹਨ, ਜਿੱਥੇ ਉੱਚ DP ਅਤੇ ਐਸਿਡ ਮੋਇਟੀਜ਼ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਸਿਸ ਪ੍ਰਤੀ ਵਧੇਰੇ ਰੋਧਕ ਸਨ। ਇਸ ਲਈ, ਗੈਰ-ਸੈਲੂਲੋਜ਼ ਗਲਾਈਕਨ ਐਪੀਟੋਪਾਂ ਅਤੇ U ਅਤੇ MeU ਬਦਲਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਘੱਟ DP ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਲਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਖੋਜ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਸਮੱਸਿਆ ਵਾਲੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਜੇਕਰ ਐਪੀਟੋਪ ਇੱਕ ਡਾਈਮੇਰਿਕ ਜਾਂ ਟ੍ਰਾਈਮੇਰਿਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਹੈ। ਇਸਦੀ ਜਾਂਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਲੰਬਾਈਆਂ ਦੇ ਵਪਾਰਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਹਰੇਕ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਐਪੀਟੋਪ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਖਾਸ mAb ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਬਣਤਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੇ ਕੁਝ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਬਾਂਡਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਵਰਤੇ ਗਏ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਕਿਸਮ, ਢੁਕਵੇਂ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਪੈਟਰਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਤਾਕਤ (ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਅਤੇ ਘੱਟ ਭਰਪੂਰ) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਨਵੇਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸੰਪੂਰਨ ਗਲਾਈਕੋਕਨਵਰਜ਼ਨ ਲਈ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ ਅਰਧ-ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ACSH ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ ਲੈਂਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਹਰੇਕ ਬਾਇਓਮਾਸ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ ਗਲਾਈਕਨ ਬਾਂਡਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਡੇਟਾਬੇਸ ਬਣਾ ਸਕਦੇ ਹਾਂ। ਇੱਥੇ ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਾਂਝ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸਾਂਝ ਅਣਜਾਣ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਕੁਝ ਮੁਸ਼ਕਲਾਂ ਪੈਦਾ ਕਰੇਗਾ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਗਲਾਈਕਨ ਬਾਂਡਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਇੱਕੋ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਲਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਜ਼ਿੱਦੀ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ CAZyme ਡੇਟਾਬੇਸ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਅਸੀਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਉਮੀਦਵਾਰ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ ਅਤੇ ਬਾਂਡ-ਤੋੜਨ ਵਾਲੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਜਾਂ ਬਾਇਓਰੀਫਾਈਨਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਇਹਨਾਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਈਕ੍ਰੋਬਾਇਲ ਸਿਸਟਮ ਵਿਕਸਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ44।
ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਇਮਯੂਨੋਲੋਜੀਕਲ ਢੰਗ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸੇਟਸ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਘੱਟ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਵਿਕਲਪਿਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੇ ਪੂਰਕ ਕਿਵੇਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਉਸੇ ਪੈਨਲ (ਚਿੱਤਰ 5) ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਹਿੱਸੇ 'ਤੇ GC-MS 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ TMS-ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦਾ MALDI (ਚਿੱਤਰ 4, S1-S8) ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। MALDI ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਹ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਪੁੰਜ ਵੰਡ ਇੱਛਤ ਬਣਤਰ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ 4 'ਤੇ ਨਿਰਪੱਖ ਭਾਗ ACN-A ਅਤੇ ACN-B ਦਾ MC ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ACN-A ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ DP 4-8 (ਚਿੱਤਰ 4) ਤੋਂ DP 22 (ਚਿੱਤਰ S1) ਤੱਕ ਪੈਂਟੋਜ਼ ਸ਼ੱਕਰ ਦੀ ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ, ਜਿਸਦਾ ਭਾਰ MeU-xylan ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ। ACN-B ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ DP 8-15 ਦੇ ਨਾਲ ਪੈਂਟੋਜ਼ ਅਤੇ ਗਲੂਕੋਜ਼ਾਈਲਨ ਲੜੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ। ਚਿੱਤਰ S3 ਵਰਗੀ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ, FA-C ਐਸਿਡਿਕ ਮੋਇਟੀ ਪੁੰਜ ਵੰਡ ਨਕਸ਼ੇ 8-15 ਦੇ DP ਦੇ ਨਾਲ (Me)U ਬਦਲਵੇਂ ਪੈਂਟੋਜ਼ ਸ਼ੱਕਰ ਦੀ ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ELISA-ਅਧਾਰਤ mAb ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਬਦਲਵੇਂ ਜ਼ਾਈਲਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹਨ। ਐਪੀਟੋਪ ਇਕਸਾਰ ਹਨ।
ACS ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਗੈਰ-ਅਨੁਕੂਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦਾ MALDI-MS ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ। ਇੱਥੇ, (A) ACN-A ਘੱਟ ਭਾਰ ਰੇਂਜ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮਿਥਾਈਲੇਟਿਡ ਯੂਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ (DP 4-8) ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਗਲੂਕੁਰੋਕਸੀਲਨ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅਤੇ (B) ACN-B ਜ਼ਾਈਲਾਨ ਅਤੇ ਮਿਥਾਈਲੇਟਿਡ ਯੂਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਗਲੂਕੁਰੋਕਸੀਲਨ (DP 8-15) ਨਾਲ ਬਦਲੇ ਗਏ ਹਨ।
ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਦੇ ਗਲਾਈਕਨ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਦੀ ਰਚਨਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਇੱਥੇ (A) GC-MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਅੰਸ਼ਾਂ ਦੀ TMS ਸੈਕਰਾਈਡ ਰਚਨਾ। (B) ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਵੱਖ-ਵੱਖ TMS-ਪ੍ਰਾਪਤ ਸ਼ੱਕਰਾਂ ਦੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ। ACN - ਨਿਰਪੱਖ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਵਾਲਾ ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ ਅੰਸ਼ ਅਤੇ FA - ਐਸਿਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਵਾਲਾ ਫੇਰੂਲਿਕ ਐਸਿਡ ਅੰਸ਼।
ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਦੇ LC-MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਇੱਕ ਹੋਰ ਦਿਲਚਸਪ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ S9 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (ਢੰਗ ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ)। ACN-B ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ ਹੈਕਸੋਜ਼ ਅਤੇ -OAc ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਦੇਖੇ ਗਏ। ਇਹ ਖੋਜ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਗਲਾਈਕੋਮ ਅਤੇ MALDI-TOF ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਖੰਡਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਪ੍ਰੀ-ਟਰੀਟ ਕੀਤੇ ਲਿਗਨੋਸੈਲੂਲੋਸਿਕ ਬਾਇਓਮਾਸ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵਜ਼ ਬਾਰੇ ਨਵੀਂ ਜਾਣਕਾਰੀ ਵੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਅਸੀਂ TMS ਸ਼ੂਗਰ ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਦੀ ਸ਼ੂਗਰ ਰਚਨਾ ਦਾ ਵੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। GC-MS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਫਰੈਕਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 5) ਵਿੱਚ ਨਿਊਰਲ (ਗੈਰ-ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ) ਅਤੇ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਸ਼ੱਕਰ (GluA ਅਤੇ GalA) ਦੀ ਰਚਨਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ। ਗਲੂਕੁਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਹਿੱਸਿਆਂ C ਅਤੇ D ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਗਲੈਕਟੂਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਹਿੱਸਿਆਂ A ਅਤੇ B ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਦੋਵੇਂ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਸ਼ੱਕਰ ਦੇ ਉੱਚ DP ਹਿੱਸੇ ਹਨ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਸਾਡੇ ELISA ਅਤੇ MALDI ਡੇਟਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਸਗੋਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣ ਦੇ ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨਾਲ ਵੀ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਲਈ, ਸਾਡਾ ਮੰਨਣਾ ਹੈ ਕਿ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ELISA ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਆਧੁਨਿਕ ਇਮਯੂਨੋਲੋਜੀਕਲ ਤਰੀਕੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜੈਵਿਕ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਹਨ।
ਕਿਉਂਕਿ ELISA-ਅਧਾਰਤ mAb ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਕਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਨਵੇਂ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਧੀ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਹੋਰ ਖੋਜਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਸੀ। ਦੋ ਵਪਾਰਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ, ਜ਼ਾਈਲੋਹੈਕਸਾਸੈਕਰਾਈਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ (XHE) ਅਤੇ 23-α-L-ਅਰਬੀਨੋਫੁਰਾਨੋਸਾਈਲ-ਜ਼ਾਈਲੋਟ੍ਰੀਓਜ਼ (A2XX), ਸੈੱਲ ਕੰਧ ਗਲਾਈਕਨ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਨਵੇਂ mAb ਪਹੁੰਚ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਖਰੀਦੇ ਗਏ ਅਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ। ਚਿੱਤਰ 6 ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਿਗਨਲ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਲੌਗ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਲੈਂਗਮੁਇਰ ਸੋਸ਼ਣ ਮਾਡਲ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। mAbs ਵਿੱਚੋਂ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ਅਤੇ CCRC-M151 XHE ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹਨ, ਅਤੇ CCRC-M108, CCRC-M109, ਅਤੇ LM11 1 nm ਤੋਂ 100 ਨੈਨੋ ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ A2XX ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹਨ। ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੌਰਾਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਸੀਮਤ ਉਪਲਬਧਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਹਰੇਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਾਲ ਸੀਮਤ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਇੱਥੇ ਇਹ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੁਝ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਇੱਕ ਸਬਸਟਰੇਟ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਪ੍ਰਤੀ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੇ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਸ਼ਾਇਦ ਇਸ ਲਈ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਥੋੜ੍ਹੇ ਵੱਖਰੇ ਐਪੀਟੋਪਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸੰਬੰਧ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਜਦੋਂ ਨਵਾਂ mAb ਪਹੁੰਚ ਅਸਲ ਨਮੂਨਿਆਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਸਹੀ ਐਪੀਟੋਪ ਪਛਾਣ ਦੇ ਵਿਧੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਹੋਣਗੇ।
ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਲਾਈਕਨ-ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ mAbs ਦੀ ਖੋਜ ਰੇਂਜ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਦੋ ਵਪਾਰਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇੱਥੇ, ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਲੌਗ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ (A) mAb ਨਾਲ XHE ਅਤੇ (B) mAb ਨਾਲ A2XX ਲਈ ਲੈਂਗਮੁਇਰ ਸੋਸ਼ਣ ਪੈਟਰਨ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਸੰਬੰਧਿਤ ਐਪੀਟੋਪ ਪਰਖ ਵਿੱਚ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਗਏ ਵਪਾਰਕ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
ਗਲਾਈਕਨ-ਟਾਰਗੇਟਡ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (ਗਲਾਈਕੋਕੋਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਜਾਂ ELISA-ਅਧਾਰਤ mAb ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮੁੱਖ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਦੀ ਡੂੰਘਾਈ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਇੱਕ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਸਾਧਨ ਹੈ ਜੋ ਪੌਦੇ ਦੇ ਬਾਇਓਮਾਸ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕਲਾਸੀਕਲ ਗਲਾਈਕਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸਿਰਫ ਵੱਡੇ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ELISA ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਸਥਿਰ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, AFEX-ਪ੍ਰੀਟਰੇਟਡ ਮੱਕੀ ਦੇ ਸਟੋਵਰ ਨੂੰ ਉੱਚ ਠੋਸ ਸਮੱਗਰੀ 'ਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਵਿੱਚ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੀ ਰਚਨਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਖੰਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟਸ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ mAb ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਘੱਟ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ELISA ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸਥਿਰ ਕਰਨ ਲਈ ਵਾਧੂ ਸਾਧਨਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਇੱਥੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ mAb ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਇਮੋਬਿਲਾਈਜੇਸ਼ਨ ਵਿਧੀ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ NeutrAvidin™ ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ELISA ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸਥਿਰ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਟਿਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਸਾਂਝ ਦਿਖਾਈ ਤਾਂ ਜੋ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਤੇਜ਼ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲ ਖੋਜ ਨੂੰ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ। ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਇਹਨਾਂ ਜ਼ਿੱਦੀ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਰਚਨਾ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਇਮਯੂਨੋਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਲਈ ਇਸ ਨਵੇਂ ਪਹੁੰਚ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਗਲਾਈਕਨ-ਟਾਰਗੇਟਡ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਨਾਲ ELISA ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਕਰਾਸਲਿੰਕਸ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਹੋਰ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਇਹ ਬਾਇਓਟਿਨ-ਅਧਾਰਤ ਗਲਾਈਕਨ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਪਹਿਲੀ ਰਿਪੋਰਟ ਹੈ ਜੋ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ ਬਾਇਓਮਾਸ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਰੀਕੈਲਸੀਟ੍ਰੈਂਟ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਬਾਂਡਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਹੈ। ਇਹ ਸਮਝਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਬਾਇਓਫਿਊਲ ਉਤਪਾਦਨ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਮਾਸ ਦੇ ਕੁਝ ਹਿੱਸੇ ਇੰਨੇ ਜ਼ਿੱਦੀ ਕਿਉਂ ਹਨ। ਇਹ ਵਿਧੀ ਗਲਾਈਕੋਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿਧੀਆਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪਾੜੇ ਨੂੰ ਭਰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਤੋਂ ਪਰੇ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਤੱਕ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਭਵਿੱਖ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਲਈ ਰੋਬੋਟਿਕਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ ਅਤੇ ELISA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਸਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਢੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।
ਪਾਇਨੀਅਰ 33A14 ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਬੀਜਾਂ ਤੋਂ ਉਗਾਈ ਗਈ ਮੱਕੀ ਦੀ ਪਰਾਲੀ (CS) 2010 ਵਿੱਚ ਕੋਲੋਰਾਡੋ ਦੇ ਰੇਅ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰੈਮਰ ਫਾਰਮਜ਼ ਤੋਂ ਕਟਾਈ ਗਈ ਸੀ। ਜ਼ਮੀਨ ਦੇ ਮਾਲਕ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਨਾਲ, ਇਸ ਬਾਇਓਮਾਸ ਨੂੰ ਖੋਜ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਜ਼ਿਪ-ਲਾਕ ਬੈਗਾਂ ਵਿੱਚ 6% ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਮੀ ਦੇ ਸੁੱਕੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਜ਼ਿਪ-ਲਾਕ ਬੈਗਾਂ ਵਿੱਚ 6% ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਮੀ ਦੇ ਸੁੱਕੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਜ਼ਿੱਪਰ ਵਾਲੇ ਬੈਗਾਂ ਵਿੱਚ <6% ਨਮੀ 'ਤੇ ਸੁੱਕੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਜ਼ਿੱਪਰ ਬੈਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 6% ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਮੀ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਸਥਾਨਕ ਅਤੇ ਰਾਸ਼ਟਰੀ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦਾ ਸੀ। NREL ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰਚਨਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਰਚਨਾ ਵਿੱਚ 31.4% ਗਲੂਕਨ, 18.7% ਜ਼ਾਈਲਾਨ, 3.3% ਅਰਬੀਨਾਨ, 1.2% ਗਲੈਕਟਨ, 2.2% ਐਸੀਟਿਲ, 14.3% ਲਿਗਨਿਨ, 1.7% ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ 13.4% ਸੁਆਹ ਪਾਈ ਗਈ।
Celic® CTec2 (138 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/ml, ਲਾਟ VCNI 0001) ਨੋਵੋਜ਼ਾਈਮਜ਼ (ਫ੍ਰੈਂਕਲਿਨਟਨ, NC, USA) ਤੋਂ ਸੈਲੂਲੇਜ਼, β-ਗਲੂਕੋਸੀਡੇਜ਼ ਅਤੇ Celic® HTec2 (157 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/ml, ਲਾਟ VHN00001) ਦਾ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਹੈ। ਮਲਟੀਫੈਕਟ ਪੈਕਟਿਨੇਸ® (72 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/mL), ਪੈਕਟਿਨ ਡੀਗ੍ਰੇਡਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਮਿਸ਼ਰਣ, ਡੂਪੋਂਟ ਇੰਡਸਟਰੀਅਲ ਬਾਇਓਸਾਇੰਸਜ਼ (ਪਾਲੋ ਆਲਟੋ, CA, USA) ਦੁਆਰਾ ਦਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ Kjeldahl ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (AOAC ਵਿਧੀ 2001.11, ਡੇਅਰੀ ਵਨ ਕੋਆਪਰੇਟਿਵ ਇੰਕ., ਇਥਾਕਾ, NY, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੱਗਰੀ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾ ਕੇ (ਅਤੇ ਗੈਰ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਦੇ ਯੋਗਦਾਨ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ) ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਡਾਇਟੋਮੇਸੀਅਸ ਧਰਤੀ 545 ਨੂੰ EMD ਮਿਲੀਪੋਰ (ਬਿਲੇਰਿਕਾ, MA) ਤੋਂ ਖਰੀਦਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਕਾਰਬਨ (DARCO, 100 ਮੈਸ਼ ਗ੍ਰੈਨਿਊਲ), ਐਵੀਸੇਲ (PH-101), ਬੀਚ ਜ਼ਾਈਲਾਨ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਾਰੇ ਰਸਾਇਣ ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ (ਸੇਂਟ ਲੁਈਸ, MO) ਤੋਂ ਖਰੀਦੇ ਗਏ ਸਨ।
AFEX ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ GLBRC (ਬਾਇਓਮਾਸ ਕਨਵਰਜ਼ਨ ਰਿਸਰਚ ਲੈਬਾਰਟਰੀ, MSU, ਲੈਂਸਿੰਗ, MI, USA) ਵਿਖੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ 140° C. 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। 46 ਨਿਵਾਸ ਸਮਾਂ 1:1 ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਐਨਹਾਈਡ੍ਰਸ ਅਮੋਨੀਆ ਤੋਂ ਬਾਇਓਮਾਸ 60% (w/w) ਲੋਡਿੰਗ 'ਤੇ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਬੈਂਚਟੌਪ ਬੈਚ ਰਿਐਕਟਰ (ਪਾਰ ਇੰਸਟਰੂਮੈਂਟਸ ਕੰਪਨੀ) ਵਿੱਚ। ਇਸ ਵਿੱਚ 30 ਮਿੰਟ ਲੱਗੇ। ਰਿਐਕਟਰ ਨੂੰ 140° C 'ਤੇ ਲਿਆਂਦਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਅਮੋਨੀਆ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਛੱਡਿਆ ਗਿਆ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਬਾਇਓਮਾਸ ਜਲਦੀ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵਾਪਸ ਆ ਗਿਆ। AFEX ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟੇਡ ਕੌਰਨ ਸਟੋਵਰ (ACS) ਦੀ ਰਚਨਾ ਟ੍ਰੀਟੇਡ ਕੌਰਨ ਸਟੋਵਰ (UT-CS) ਦੇ ਸਮਾਨ ਸੀ।
ਉੱਚ ਠੋਸ ਪਦਾਰਥ ACSH 25% (w/w) (ਲਗਭਗ 8% ਡੈਕਸਟ੍ਰੇਨ ਲੋਡਿੰਗ) ਨੂੰ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੱਗਰੀ ਵਜੋਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ACS ਦਾ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਇੱਕ ਵਪਾਰਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ Cellic® Ctec2 10 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/g ਗਲੂਕਨ (ਪ੍ਰੀ-ਟਰੀਟਡ ਬਾਇਓਮਾਸ ਵਿੱਚ), Htec2 (ਨੋਵੋਜ਼ਾਈਮਜ਼, ਫ੍ਰੈਂਕਲਿਨਟਨ, NC), 5 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/g ਗਲੂਕਨ, ਅਤੇ ਮਲਟੀਫੈਕਟ ਪੈਕਟਿਨੇਜ (ਜੇਨੇਨਕੋਰ ਇੰਕ, ਯੂਐਸਏ) ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ। ). ), 5 mg ਪ੍ਰੋਟੀਨ/g ਡੈਕਸਟ੍ਰੇਨ। ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ 5-ਲੀਟਰ ਬਾਇਓਰੀਐਕਟਰ ਵਿੱਚ 3 ਲੀਟਰ, pH 4.8, 50°C ਅਤੇ 250 rpm ਦੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਵਾਲੀਅਮ ਦੇ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 96 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ੇਟ ਨੂੰ 6000 rpm 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 14000 rpm 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਗੈਰ-ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਠੋਸ ਪਦਾਰਥਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ। ਫਿਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਨੂੰ 0.22 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਫਿਲਟਰ ਬੀਕਰ ਰਾਹੀਂ ਨਿਰਜੀਵ ਫਿਲਟਰੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਨੂੰ 4° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਨਿਰਜੀਵ ਬੋਤਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ ਕਾਰਬਨ 'ਤੇ ਫਰੈਕਸ਼ਨੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
NREL ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟ-ਅਧਾਰਤ ਬਾਇਓਮਾਸ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਰਚਨਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ: ਰਚਨਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (NREL/TP-510-42620) ਲਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਅਤੇ ਬਾਇਓਮਾਸ (NREL/TP-510 – 42618) ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਅਤੇ ਲਿਗਨਿਨ ਦਾ ਨਿਰਧਾਰਨ 47।
ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਸਟ੍ਰੀਮ ਦਾ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ 2 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੈਮਾਨੇ 'ਤੇ ਆਟੋਕਲੇਵ-ਅਧਾਰਤ ਐਸਿਡ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 10 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਸਕ੍ਰੂ ਕੈਪ ਕਲਚਰ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ 72% ਸਲਫਿਊਰਿਕ ਐਸਿਡ ਦੇ 69.7 µl ਨਾਲ ਮਿਲਾਓ ਅਤੇ 121 °C 'ਤੇ ਬੈਂਚਟੌਪ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ, ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਠੰਡਾ ਕਰੋ ਅਤੇ ਇੱਕ ਉੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (HPLC) ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਵਿੱਚ ਫਿਲਟਰ ਕਰੋ। ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਐਸਿਡ-ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਕੁੱਲ ਖੰਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੋਂ ਗੈਰ-ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਜ਼ਡ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੋਨੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਸਿਡ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ਡ ਬਾਇਓਮਾਸ ਵਿੱਚ ਗਲੂਕੋਜ਼, ਜ਼ਾਈਲੋਜ਼ ਅਤੇ ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ ਸ਼ਿਮਾਡਜ਼ੂ ਐਚਪੀਐਲਸੀ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਇੱਕ ਆਟੋਸੈਂਪਲਰ, ਕਾਲਮ ਹੀਟਰ, ਆਈਸੋਕ੍ਰੇਟਿਕ ਪੰਪ, ਅਤੇ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਿਵ ਇੰਡੈਕਸ ਡਿਟੈਕਟਰ ਨਾਲ ਲੈਸ ਸੀ ਜੋ ਇੱਕ ਬਾਇਓ-ਰੈੱਡ ਐਮੀਨੈਕਸ ਐਚਪੀਐਕਸ-87ਐਚ ਕਾਲਮ 'ਤੇ ਸੀ। ਕਾਲਮ ਨੂੰ 50°C 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 0.6 ਮਿਲੀਲੀਟਰ/ਮਿੰਟ 5 ਐਮਐਮ H2SO4 ਪਾਣੀ ਦੇ ਪ੍ਰਵਾਹ ਨਾਲ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ੇਟ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮੋਨੋਮਰ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਸ਼ੱਕਰ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ HPLC ਦੁਆਰਾ ਬਾਇਓ-ਰੈੱਡ (ਹਰਕੂਲਸ, CA) ਐਮੀਨੈਕਸ HPX-87P ਕਾਲਮ ਅਤੇ ਇੱਕ ਐਸ਼ ਗਾਰਡ ਕਾਲਮ ਨਾਲ ਲੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਾਲਮ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 80°C 'ਤੇ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਾਣੀ ਨੂੰ 0.6 ਮਿਲੀਲੀਟਰ/ਮਿੰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ ਨਾਲ ਮੋਬਾਈਲ ਪੜਾਅ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਰੈਫਰੀ 41, 48, 49 ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਤਰੀਕਿਆਂ ਅਨੁਸਾਰ 121°C 'ਤੇ ਪਤਲੇ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸੈਕਰਾਈਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੱਚੇ, AFEX ਪ੍ਰੀ-ਟ੍ਰੀਟ ਕੀਤੇ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਗੈਰ-ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ਡ ਬਾਇਓਮਾਸ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ (ਸੀਰੀਅਲ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ mAb ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਸਮੇਤ) 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ 27, 43, 50, 51 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗਲਾਈਕੋਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਪੌਦੇ ਦੇ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਸਮੱਗਰੀ ਦੇ ਅਲਕੋਹਲ-ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਬਾਇਓਮਾਸ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅਮੋਨੀਅਮ ਆਕਸਲੇਟ (50 mM), ਸੋਡੀਅਮ ਕਾਰਬੋਨੇਟ (50 mM ਅਤੇ 0.5% w/v), CON ਵਰਗੇ ਵਧਦੇ ਹਮਲਾਵਰ ਰੀਐਜੈਂਟਾਂ ਨਾਲ ਸੀਰੀਅਲ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (1M ਅਤੇ 4M, ਦੋਵੇਂ 1% w/v ਸੋਡੀਅਮ ਬੋਰੋਹਾਈਡਰਾਈਡ ਦੇ ਨਾਲ) ਅਤੇ ਐਸਿਡ ਕਲੋਰਾਈਟ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ52,53। ਫਿਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟਾਂ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨ ਵੱਲ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ mAb50s ਦੇ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਪੈਨਲ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ELISA ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ mAb ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਗਰਮੀ ਦੇ ਨਕਸ਼ੇ ਵਜੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੌਦੇ ਦੇ ਸੈੱਲ ਵਾਲ ਗਲਾਈਕਨ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ mAbs ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਸਟਾਕਾਂ (CCRC, JIM ਅਤੇ MAC ਲੜੀ) ਤੋਂ ਖਰੀਦੇ ਗਏ ਸਨ।
ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਦਾ ਇੱਕ-ਪੜਾਅ ਵਾਲਾ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ। ਬਾਇਓਟਿਨ-ਐਲਸੀ-ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ਾਈਡ ਨਾਲ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦਾ ਸੰਯੋਜਨ ਹੇਠ ਲਿਖੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਇਓਟਿਨ-ਐਲਸੀ-ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ਾਈਡ (4.6 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/12 μmol) ਨੂੰ ਡਾਈਮੇਥਾਈਲ ਸਲਫੌਕਸਾਈਡ (DMSO, 70 μl) ਵਿੱਚ 65° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 1 ਮਿੰਟ ਲਈ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਹਿਲਾਅ ਅਤੇ ਗਰਮ ਕਰਕੇ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਗਲੇਸ਼ੀਅਲ ਐਸੀਟਿਕ ਐਸਿਡ (30 μl) ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਸੋਡੀਅਮ ਸਾਇਨੋਬੋਰੋਹਾਈਡਰਾਈਡ (6.4 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/100 μmol) 'ਤੇ ਡੋਲ੍ਹਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਲਗਭਗ 1 ਮਿੰਟ ਲਈ 65° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਘੁਲ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੇ 5 ਤੋਂ 8 μl ਤੱਕ ਸੁੱਕੇ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ (1-100 nmol) ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਿਰੇ ਉੱਤੇ ਲੇਬਲ ਦਾ 10 ਗੁਣਾ ਜਾਂ ਵੱਧ ਮੋਲਰ ਵਾਧੂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 65° ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਤੁਰੰਤ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਲੇਬਲਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਕਟੌਤੀ ਦੇ ਸੋਡੀਅਮ ਸਾਇਨੋਬੋਰੋਹਾਈਡਰਾਈਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਅਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 2.5 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 65° C 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ।
ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਜ਼ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ELISA ਕੋਟਿੰਗ ਅਤੇ ਧੋਣਾ। ਐਵੀਡਿਨ-ਕੋਟੇਡ ਪਲੇਟ ਦੇ ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ 25 μl ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਨਮੂਨੇ (0.1 M ਟ੍ਰਿਸ ਬਫਰ ਘੋਲ (TBS) ਦੇ 5 ਮਿ.ਲੀ. ਵਿੱਚ ਪਤਲੇ ਕੀਤੇ ਹਰੇਕ ਗਾੜ੍ਹੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ 100 μl) ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਕੰਟਰੋਲ ਖੂਹਾਂ ਨੂੰ 0.1 M TBS ਵਿੱਚ 10 μg/ml ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ 50 μl ਬਾਇਓਟਿਨ ਨਾਲ ਲੇਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਖਾਲੀ ਮਾਪ ਲਈ ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਨੂੰ ਇੱਕ ਕੋਟਿੰਗ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਟੈਬਲੇਟ ਨੂੰ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗ੍ਰੇਨੀਅਰ ਫਲੈਟ 3A ਲਈ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਨੰਬਰ 11 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਲੇਟ ਨੂੰ 0.1 M TBS ਵਿੱਚ 0.1% ਸਕਿਮਡ ਦੁੱਧ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਵੋ।
ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਅਤੇ ਧੋਣਾ। ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ 40 μl ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਪਾਓ। ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬ ਕਰੋ। ਫਿਰ ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਗ੍ਰੇਨੀਅਰ ਫਲੈਟ 3A ਲਈ ਵਾਸ਼ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ #11 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 0.1M TBS ਵਿੱਚ 0.1% ਦੁੱਧ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।
ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਪਾਓ ਅਤੇ ਧੋਵੋ। ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ 50 μl ਚੂਹਾ/ਚੂਹਾ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (0.1 M TBS ਵਿੱਚ 0.1% ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ 1:5000 ਪਤਲਾ) ਪਾਓ। ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬ ਕਰੋ। ਫਿਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਗ੍ਰੇਨੀਅਰ ਫਲੈਟ 5A ਪਲੇਟ ਵਾਸ਼ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ #12 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 0.1% ਦੁੱਧ 0.1 M TBS ਵਿੱਚ 5 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।
ਇੱਕ ਸਬਸਟਰੇਟ ਜੋੜਨਾ। ਬੇਸ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿੱਚ 50 μl 3,3′,5,5′-ਟੈਟਰਾਮੇਥਾਈਲਬੈਂਜ਼ੀਡੀਨ (TMB) ਪਾਓ (15 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਬਫਰ ਦੀਆਂ 2 ਬੂੰਦਾਂ, TMB ਦੀਆਂ 3 ਬੂੰਦਾਂ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਪਰਆਕਸਾਈਡ ਦੀਆਂ 2 ਬੂੰਦਾਂ ਪਾ ਕੇ)। TMB ਸਬਸਟਰੇਟ ਤਿਆਰ ਕਰੋ। ਅਤੇ ਵਰਤੋਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਵੌਰਟੈਕਸ)। ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ।
ਕਦਮ ਪੂਰਾ ਕਰੋ ਅਤੇ ਟੈਬਲੇਟ ਪੜ੍ਹੋ। ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ 50 µl 1 N ਸਲਫਿਊਰਿਕ ਐਸਿਡ ਪਾਓ ਅਤੇ ELISA ਰੀਡਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 450 ਤੋਂ 655 nm ਤੱਕ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰੋ।
ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕਾਂ ਦੇ 1 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਮਿ.ਲੀ. ਘੋਲ ਤਿਆਰ ਕਰੋ: ਅਰਾਬਿਨੋਜ਼, ਰਮਨੋਸ, ਫਿਊਕੋਜ਼, ਜ਼ਾਈਲੋਜ਼, ਗਲੈਕਟੂਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ (GalA), ਗਲੂਕੋਰੋਨਿਕ ਐਸਿਡ (GlcA), ਮੈਨਨੋਜ਼, ਗਲੂਕੋਜ਼, ਗਲੈਕਟੋਜ਼, ਲੈਕਟੋਜ਼, N-ਐਸੀਟਿਲਮੈਨੋਸਾਮਾਈਨ (manNAc), N-ਐਸੀਟਿਲਗਲੂਕੋਸਾਮਾਈਨ। (glcNAc), N-ਐਸੀਟਿਲਗਲੂਕੋਸਾਮਾਈਨ (galNAc), ਇਨੋਸਿਟੋਲ (ਅੰਦਰੂਨੀ ਮਿਆਰ)। ਸਾਰਣੀ 1 ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ 1 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਮਿ.ਲੀ. ਖੰਡ ਘੋਲ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਦੋ ਮਿਆਰ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ -80° C 'ਤੇ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਲਾਇਓਫਿਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸਾਰਾ ਪਾਣੀ ਨਹੀਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ (ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਗਭਗ 12-18 ਘੰਟੇ)।
ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਸੰਤੁਲਨ 'ਤੇ ਸਕ੍ਰੂ ਕੈਪ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ 100-500 µg ਨਮੂਨਾ ਪਾਓ। ਜੋੜੀ ਗਈ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰੋ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਦੀ ਇੱਕ ਖਾਸ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਘੋਲਣਾ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਤਰਲ ਐਲੀਕੋਟ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਜੋੜਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨਾ ਟਿਊਬ ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ 1 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਇਨੋਸਿਟੋਲ ਦੇ 20 µl ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅੰਦਰੂਨੀ ਮਿਆਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਮਿਆਰੀ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅੰਦਰੂਨੀ ਮਿਆਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
ਇੱਕ ਪੇਚ ਕੈਪ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਵਿੱਚ 8 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਐਨਹਾਈਡ੍ਰਸ ਮੀਥੇਨੌਲ ਪਾਓ। ਫਿਰ 4 ਮਿਲੀਲੀਟਰ 3 N. ਮੀਥੇਨੌਲਿਕ HCl ਘੋਲ, ਢੱਕ ਕੇ ਅਤੇ ਹਿਲਾ ਕੇ ਪਾਓ। ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਪਾਣੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ।
ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਅਤੇ ਸਟੈਂਡਰਡ TMS ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ 500 µl 1 M HCl ਮੀਥੇਨੌਲ ਘੋਲ ਪਾਓ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ (168 ਘੰਟੇ) 80° C 'ਤੇ ਥਰਮਲ ਬਲਾਕ ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੁਕਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮੈਨੀਫੋਲਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮੀਥੇਨੋਲਿਸਿਸ ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਸੁਕਾਓ। 200 µl MeOH ਪਾਓ ਅਤੇ ਦੁਬਾਰਾ ਸੁਕਾਓ। ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ 200 µl ਮੀਥੇਨੌਲ, 100 µl ਪਾਈਰੀਡੀਨ ਅਤੇ 100 µl ਐਸੀਟਿਕ ਐਨਹਾਈਡ੍ਰਾਈਡ ਪਾਓ ਅਤੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਓ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਤੇ ਸੁੱਕਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। 200 µl ਮੀਥੇਨੌਲ ਪਾਓ ਅਤੇ ਦੁਬਾਰਾ ਸੁਕਾਓ।
200 µl ਟ੍ਰਾਈ-ਸਿਲ ਪਾਓ ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਕੈਪਡ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਗਰਮ ਕਰੋ। 80°C, ਫਿਰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਠੰਢਾ ਕਰੋ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 50 µl ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਤੱਕ ਸੁਕਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਸੁਕਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮੈਨੀਫੋਲਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿ ਅਸੀਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੁੱਕਣ ਨਹੀਂ ਦਿੱਤਾ।
2 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਹੈਕਸੇਨ ਪਾਓ ਅਤੇ ਵੌਰਟੈਕਸਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਓ। 5-3/4 ਇੰਚ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ ਪਾਈਪੇਟ ਦੇ ਉੱਪਰ ਕੱਚ ਦੀ ਉੱਨ ਪਾ ਕੇ ਪਾਸਚਰ ਪਾਈਪੇਟਸ (5-8 ਮਿਲੀਮੀਟਰ) ਦੇ ਸਿਰਿਆਂ ਨੂੰ ਕੱਚ ਦੀ ਉੱਨ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਨਾਲ ਭਰੋ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 2 ਮਿੰਟ ਲਈ 3000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੋਈ ਵੀ ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 100-150 µl ਤੱਕ ਸੁਕਾਓ। ਲਗਭਗ 1 μl ਦੀ ਮਾਤਰਾ GC-MS ਵਿੱਚ 80 °C ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ 2.0 ਮਿੰਟ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਸਾਰਣੀ 2)।