Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczone wsparcie dla CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Morfogeneza ludzkiego jelita ustanawia cechy krypt-kosmków trójwymiarowej mikroarchitektury nabłonka i organizacji przestrzennej. Ta unikalna struktura jest wymagana do utrzymania homeostazy jelit poprzez ochronę niszy komórek macierzystych w krypcie podstawnej przed egzogennymi antygenami drobnoustrojów i ich metabolitami. Ponadto kosmki jelitowe i wydzielający śluz prezentują funkcjonalnie zróżnicowane komórki nabłonkowe z barierą ochronną na powierzchni błony śluzowej jelita. Dlatego odtworzenie trójwymiarowych struktur nabłonkowych ma kluczowe znaczenie dla budowy modeli jelitowych in vitro. Warto zauważyć, że organiczny mimetyczny układ jelitowy na chipie może indukować spontaniczną morfogenezę 3D nabłonka jelitowego z ulepszonymi funkcjami fizjologicznymi i biomechaniką. Tutaj zapewniamy powtarzalny protokół do silnego indukowania morfogenezy jelitowej w jelitach na chipie mikroprzepływowym, jak również w chipie hybrydowym osadzonym w Transwell. platforma płynowa, indukcja morfogenezy 3D i charakterystyka utworzonego nabłonka 3D przy użyciu wielu metod obrazowania. Protokół ten zapewnia regenerację funkcjonalnej mikroarchitektury jelit poprzez kontrolowanie przepływu płynu podstawno-bocznego przez 5 dni. Nasza metoda morfogenezy in vitro wykorzystuje fizjologicznie istotne naprężenia ścinające i ruch mechaniczny i nie wymaga złożonej inżynierii komórkowej ani manipulacji, które mogą przewyższać inne istniejące techniki. Przewidujemy, że nasz proponowany protokół może mieć szerokie implikacje dla społeczności badaczy biomedycznych, zapewniając metodę regeneracji Trójwymiarowe warstwy nabłonka jelitowego in vitro do zastosowań biomedycznych, klinicznych i farmaceutycznych.
Eksperymenty pokazują, że komórki nabłonka jelitowego Caco-2 hodowane w jelitach na chipie1,2,3,4,5 lub dwuwarstwowych urządzeniach mikroprzepływowych6,7 mogą ulegać spontanicznej morfogenezie 3D in vitro bez jasnego zrozumienia podstawowego mechanizmu. pochodne organoidów jelitowych.Zwalidowano komórki nabłonkowe. W tym badaniu skupiliśmy się w szczególności na produkcji komórek i dystrybucji stężenia silnego antagonisty Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), w jelitach na chipie i zmodyfikowanych urządzeniach mikroprzepływowych zawierających wkładki Transwell, określane jako „Hybrydowy chip”. ip gut hamuje morfogenezę lub zaburza wstępnie ustrukturyzowaną warstwę nabłonka 3D, co sugeruje, że stres antagonistyczny podczas hodowli jest odpowiedzialny za morfogenezę jelit in vitro. Dlatego praktycznym podejściem do osiągnięcia silnej morfogenezy na interfejsie nabłonka jest usunięcie lub minimalne utrzymanie poziomów antagonistów Wnt w przedziale podstawno-bocznym przez aktywne płukanie (np. z wkładek Transwell do dużych zbiorników podstawno-bocznych w studzienkach).
W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania mikrourządzeń typu „jet na chipie” i chipów hybrydowych wkładanych przez Transwell (kroki 1-5) do hodowli komórek nabłonka jelitowego na porowatych membranach na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS) (etapy 6A, 7A, 8, 9) lub membranach poliestrowych wkładek Transwell (kroki 6B, 7B, 8, 9) i indukowanej morfogenezy 3D in vitro (etap In vitro . Aby wywołać morfogenezę 3D z monowarstw nabłonka 2D, usunęliśmy antagonistów morfogenu w obu hodowanych formach, przepuszczając pożywkę do przedziału podstawno-bocznego hodowli. Na koniec przedstawiamy reprezentację użyteczności regenerowalnej warstwy nabłonka 3D, która może być wykorzystana do modelowania zależnego od morfogenu wzrostu nabłonka, podłużnych współhodowli gospodarz-mikrobiom, zakażenia patogenem, uszkodzenia zapalnego, dysfunkcji bariery nabłonkowej i probiotyku- terapie oparte na Przykładach wpływów.
Nasz protokół może być przydatny dla szerokiego grona naukowców w badaniach podstawowych (np. biologia błony śluzowej jelit, biologia komórek macierzystych i biologia rozwoju) i stosowanych (np. przedkliniczne testowanie leków, modelowanie chorób, inżynieria tkankowa i gastroenterologia). Ze względu na powtarzalność i solidność naszego protokołu do indukowania trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego in vitro, wyobrażamy sobie, że nasza strategia techniczna może zostać rozpowszechniona wśród odbiorców badających dynamikę sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju jelit, regeneracji lub homeostazy. Ponadto nasz protokół jest przydatny do badania infekcji różnymi czynnikami zakaźnymi, takimi jak norowirus 8, zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, koronawirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 lub Vibrio cholerae.Przydatni są również audytorzy patologii i patogenezy chorób. Zastosowanie systemu mikrofizjologii jelit na chipie może umożliwić współhodowlę podłużną 10 i późniejszą ocenę obrony gospodarza, odpowiedzi immunologicznych i naprawy uszkodzeń związanych z patogenami w przewodzie pokarmowym (GI) 11 . Inne zaburzenia żołądkowo-jelitowe związane z zespołem nieszczelnego jelita, celiakią, chorobą Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, zapaleniem jelita grubego lub zespołem jelita drażliwego można symulować, gdy trójwymiarowy obraz nabłonka jelitowego warstwy są przygotowywane przy użyciu trójwymiarowych warstw nabłonka jelitowego pacjenta. Choroby te obejmują zanik kosmków, skrócenie krypt, uszkodzenie błony śluzowej lub upośledzoną barierę nabłonkową. Biopsja lub organoidy jelitowe pochodzące z komórek macierzystych12,13. Aby lepiej modelować większą złożoność środowiska chorobowego, czytelnicy mogą rozważyć dodanie typów komórek związanych z chorobą, takich jak jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) pacjenta, do modeli zawierających trójwymiarową mikroarchitekturę kosmków jelitowych i krypt .tkankowo specyficzne komórki odpornościowe, 5.
Ponieważ mikrostrukturę nabłonka 3D można utrwalić i zwizualizować bez procesu cięcia, widzowie pracujący nad transkryptomiką przestrzenną i obrazowaniem w wysokiej lub super rozdzielczości mogą być zainteresowani naszym mapowaniem czasoprzestrzennej dynamiki genów i białek w niszach nabłonkowych.Interesuje się technologią. Reakcja na bodźce drobnoustrojowe lub immunologiczne. Co więcej, podłużne przesłuchy między gospodarzem a mikrobiomem 10, 14, które koordynują homeostazę jelit, można ustalić w trójwymiarowej warstwie błony śluzowej jelita poprzez wspólną hodowlę różnych gatunków drobnoustrojów, społeczności drobnoustrojów lub mikroflory kałowej, zwłaszcza w jelitach na chipie.na platformie. To podejście jest szczególnie atrakcyjne dla odbiorców zajmujących się immunologią błon śluzowych, gastroenterologią, mikrobiomem człowieka, kulturomiką i mikrobiologią kliniczną, którzy chcą hodować w laboratorium niehodowaną wcześniej mikroflorę jelitową. Jeśli nasz protokół morfogenezy in vitro można dostosować do skalowalnych formatów hodowli, takich jak wstawki wielodołkowe w płytkach 24, 96 lub 384 dołkowych, które stale uzupełniają kompartmenty podstawno-boczne, protokół można również rozpowszechniać wśród osób opracowujących farmaceutyczne, biologiczne medyczne lub wysokowydajne platformy do badań przesiewowych lub walidacji dla przemysłu spożywczego. Jako dowód na zasadę, niedawno wykazaliśmy wykonalność multipleksowego systemu morfogenezy o wysokiej przepustowości, skalowalnego do formatu 24-dołkowej płytki. Ponadto skomercjalizowano wiele produktów typu narząd na chipie16,17,18. Dlatego walidacja naszej metody morfogenezy in vitro może zostać przyspieszona i potencjalnie przyjęta przez wiele laboratoriów badawczych, przemysłu lub rządu i organów regulacyjnych agencji, aby zrozumieć przeprogramowanie komórkowe morfogenezy jelit in vitro na poziomie transkryptomicznym w celu testowania leków lub bioterapeutyków Wchłanianie i transport kandydatów na leki oceniano za pomocą surogatów jelit 3D lub przy użyciu niestandardowych lub komercyjnych modeli organ na chipie w celu oceny odtwarzalności procesu morfogenezy jelit.
Do badania morfogenezy nabłonka jelit wykorzystano ograniczoną liczbę modeli eksperymentalnych odpowiednich dla ludzi, głównie ze względu na brak możliwych do wdrożenia protokołów indukowania morfogenezy 3D in vitro. W rzeczywistości znaczna część obecnej wiedzy na temat morfogenezy jelit opiera się na badaniach na zwierzętach (np. danio pręgowany20, myszach21 lub kurach22). Są one jednak pracochłonne i kosztowne, mogą być wątpliwe pod względem etycznym, a co najważniejsze, nie określają dokładnie procesów rozwojowych człowieka. Modele te są również bardzo ograniczone pod względem możliwości testowania w sposób skalowalny na wiele sposobów. Dlatego nasz protokół regeneracji trójwymiarowych struktur tkankowych in vitro przewyższa modele zwierzęce in vivo, jak również inne tradycyjne statyczne modele hodowli komórkowych 2D. badać, w jaki sposób komórki drobnoustrojów współzawodniczą o tworzenie nisz przestrzennych i ewolucję ekologiczną w odpowiedzi na czynniki gospodarza (np. wewnętrzne i zewnętrzne warstwy śluzu, wydzielanie IgA i peptydów przeciwdrobnoustrojowych). Ponadto trójwymiarowa morfologia nabłonka pozwala nam zrozumieć, w jaki sposób mikroflora jelitowa buduje swoje społeczności i synergistycznie wytwarza metabolity drobnoustrojów (np. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe), które kształtują organizację komórkową i nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych. Cechy te można wykazać tylko wtedy, gdy trójwymiarowy nabłonek warstwy są ustalane in vitro.
Oprócz naszej metody tworzenia trójwymiarowych struktur nabłonka jelitowego istnieje kilka metod in vitro. Hodowla organoidów jelitowych jest najnowocześniejszą techniką inżynierii tkankowej opartą na hodowli jelitowych komórek macierzystych w określonych warunkach morfogenicznych23,24,25. Jednak wykorzystanie trójwymiarowych modeli organoidów do analizy transportu lub współhodowli gospodarza z mikrobiomem jest często trudne, ponieważ światło jelita jest zamknięte w organoidzie, a zatem wprowadzenie składników światła, takich jak komórki drobnoustrojów lub ex ilość antygenów genowych jest ograniczona.Dostęp do światła organoidów można poprawić za pomocą mikroiniektora,26,27 ale metoda ta jest inwazyjna i pracochłonna oraz wymaga specjalistycznej wiedzy do wykonania. Ponadto tradycyjne hodowle organoidów utrzymywane w rusztowaniach hydrożelowych w warunkach statycznych nie odzwierciedlają dokładnie aktywnej biomechaniki in vivo.
Inne podejścia stosowane przez kilka grup badawczych wykorzystują wstępnie ustrukturyzowane trójwymiarowe rusztowania hydrożelowe do naśladowania struktury nabłonka jelita poprzez hodowanie izolowanych ludzkich komórek jelitowych na powierzchni żelu. Wytwarzanie rusztowań hydrożelowych przy użyciu drukowanych w 3D, mikrofrezowanych lub wytwarzanych litograficznie form. Ta metoda pokazuje samoorganizujące się rozmieszczenie izolowanych komórek nabłonka in vitro z fizjologicznie istotnymi gradientami morfogenu, ustanawiając strukturę nabłonka o wysokim współczynniku kształtu i zrębu nabłonka przesłuch poprzez włączenie komórek zrębu do rusztowania. Jednak natura wstępnie ustrukturyzowanych rusztowań może uniemożliwić wyświetlenie samego spontanicznego procesu morfogenetycznego. Modele te również nie zapewniają dynamicznego przepływu światła lub śródmiąższowego, pozbawionego naprężenia ścinającego płynu, którego komórki jelitowe potrzebują, aby przejść morfogenezę i uzyskać funkcję fizjologiczną. Model ten nie wykazuje spontanicznych procesów morfogenetycznych ani nie obejmuje ruchów mechanobiologicznych jelit. Techniki drukowania 3D z tej samej grupy były w stanie stworzyć miniaturowe rurki jelitowe ze spontanicznymi procesami morfogenetycznymi. proces biodrukowania jest zakończony, zakłócając warunki eksperymentalne lub interakcje między komórkami. Zamiast tego, nasz proponowany protokół zapewnia spontaniczną morfogenezę jelit, fizjologicznie istotne naprężenia ścinające, biomechanikę naśladującą ruchliwość jelit, dostępność niezależnych kompartmentów wierzchołkowych i podstawno-bocznych oraz odtworzenie złożonych mikrośrodowisk biologicznych o modułowości. Dlatego nasz protokół morfogenezy 3D in vitro może zapewnić uzupełniające podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z istniejącymi metodami.
Nasz protokół jest całkowicie skoncentrowany na morfogenezie nabłonka 3D, z hodowlą tylko komórek nabłonkowych i bez innych typów otaczających komórek, takich jak komórki mezenchymalne, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe. odtworzyć falistą trójwymiarową warstwę nabłonkową, dodatkowe biologiczne złożoności, takie jak interakcje nabłonkowo-mezenchymalne33,34, odkładanie się macierzy pozakomórkowej (ECM)35 oraz, w naszym modelu, cechy krypt-kosmków, które przenoszą nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych, pozostają do dalszego rozważenia. Komórki zrębu (np. fibroblasty) w mezenchymie odgrywają kluczową rolę w produkcji białek ECM i regulacji morfogenezy jelitowej in vivo35, 37,38. Dodanie komórek mezenchymalnych do naszego modelu poprawiło proces morfogenetyczny i skuteczność przylegania komórek. Warstwa śródbłonka (tj. naczynia włosowate lub naczynia limfatyczne) odgrywa ważną rolę w regulacji transportu molekularnego39 i rekrutacji komórek odpornościowych40 w mikrośrodowisku jelitowym. Ponadto elementy układu naczyniowego, które można połączyć między modelami tkankowymi, są warunkiem wstępnym, gdy modele tkankowe są projektowane w celu wykazania interakcji między wieloma narządami. Dlatego może być konieczne włączenie komórek śródbłonka do modelu dokładniejsze cechy fizjologiczne z rozdzielczością na poziomie narządów. Komórki odpornościowe pochodzące od pacjentów są również niezbędne do wyświetlania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, prezentacji antygenu, wrodzonego adaptacyjnego przesłuchu immunologicznego i odporności tkankowej w kontekście naśladowania choroby jelit.
Stosowanie chipów hybrydowych jest prostsze niż w przypadku metody „jet na chipie”, ponieważ konfiguracja urządzenia jest prostsza, a użycie wkładek Transwell pozwala na skalowalną hodowlę nabłonka jelitowego. Jednak dostępne w handlu wkładki Transwell z membranami poliestrowymi nie są elastyczne i nie mogą symulować ruchów przypominających ruchy perystaltyczne. Komora ical rzadko umożliwia długotrwałą współhodowlę bakterii w chipach hybrydowych. Podczas gdy możemy solidnie indukować morfogenezę 3D we wkładkach Transwell przy użyciu chipów hybrydowych, brak fizjologicznie istotnych biomechaniki i wierzchołkowego przepływu płynu może ograniczać wykonalność hybrydowych platform chipowych dla potencjalnych zastosowań.
Rekonstrukcje w pełnej skali ludzkiej osi krypta-kosmek w hodowlach jelitowych i hybrydowych na chipie nie zostały w pełni ustalone. Ponieważ morfogeneza zaczyna się od monowarstwy nabłonka, mikroarchitektury 3D niekoniecznie zapewniają morfologiczne podobieństwo do krypt in vivo. są wyraźnie odgraniczone. Chociaż wyższe górne kanały na chipie prowadzą do zwiększonej wysokości mikroinżynierii nabłonka, maksymalna wysokość jest nadal ograniczona do ~300-400 µm. Rzeczywista głębokość krypt jelitowych człowieka w jelicie cienkim i grubym wynosi odpowiednio ~135 µm i ~400 µm, a wysokość kosmków jelita cienkiego ~600 µm41.
Z punktu widzenia obrazowania obrazowanie in situ mikroarchitektur 3D w super rozdzielczości może być ograniczone do jelita na chipie, ponieważ wymagana odległość robocza od soczewki obiektywu do warstwy nabłonka jest rzędu kilku milimetrów. Aby przezwyciężyć ten problem, może być wymagany odległy cel. każdej warstwy niezwykle trudno jest otworzyć lub usunąć górną warstwę w celu zbadania struktury powierzchni warstwy nabłonkowej. Na przykład za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
Hydrofobowość PDMS była czynnikiem ograniczającym w badaniach mikroprzepływowych nad małymi cząsteczkami hydrofobowymi, ponieważ PDMS może niespecyficznie adsorbować takie cząsteczki hydrofobowe. Alternatywy dla PDMS można rozważyć w przypadku innych materiałów polimerowych. Alternatywnie można rozważyć modyfikację powierzchni PDMS (np. powlekanie materiałami lipofilowymi 42 lub poli(glikolem etylenowym) 43) w celu zminimalizowania adsorpcji cząsteczek hydrofobowych.
Wreszcie, nasza metoda nie została dobrze scharakteryzowana pod względem zapewnienia wysokoprzepustowych badań przesiewowych lub przyjaznej dla użytkownika platformy eksperymentalnej „jeden rozmiar dla wszystkich”. Obecny protokół wymaga pompy strzykawkowej na mikrourządzenie, co zajmuje miejsce w inkubatorze CO2 i zapobiega eksperymentom na dużą skalę. Ograniczenie to można znacznie zmniejszyć dzięki skalowalności innowacyjnych formatów hodowli (np. media podstawno-boczne).
Aby wywołać trójwymiarową morfogenezę ludzkiego nabłonka jelitowego in vitro, użyliśmy mikroprzepływowego chipowego urządzenia jelitowego zawierającego dwa równoległe mikrokanały i elastyczną porowatą membranę pomiędzy nimi, aby stworzyć interfejs światło-włośniczek. Demonstrujemy również zastosowanie jednokanałowego urządzenia mikroprzepływowego (chip hybrydowy), który zapewnia ciągły przepływ podstawno-boczny pod spolaryzowanymi warstwami nabłonka hodowanymi na wkładkach Transwell. Na obu platformach morfogenezę różnych ludzkich komórek nabłonka jelit można wykazać, stosując manipulację kierunkową przepływu w celu usunięcia antagonistów morfogenu z przedziału podstawno-bocznego. Cała procedura eksperymentalna (ryc. 1) składa się z pięciu części: (i) mikrofabrykacja chipa jelitowego lub wkładanego chipa hybrydowego Transwell (kroki 1-5; ramka 1), (ii) przygotowanie komórek nabłonka jelitowego (komórek Caco-2) lub ludzkich organoidów jelitowych;ramki 2-5), (iii) hodowlę komórek nabłonka jelitowego na chipach jelitowych lub chipach hybrydowych (etapy 6-9), (iv) indukcję morfogenezy 3D in vitro (etap 10) i (v)) w celu scharakteryzowania mikrostruktury nabłonka 3D (etapy 11-24). Na koniec zaprojektowano odpowiednią grupę kontrolną (omówioną poniżej) w celu potwierdzenia skuteczności morfogenezy in vitro poprzez porównanie morfogenezy nabłonka z przestrzenną, kontrole czasowe, warunkowe lub proceduralne.
Użyliśmy dwóch różnych platform hodowlanych: gut-on-a-chip z kanałami prostymi lub nieliniowymi kanałami zawiłymi lub hybrydowymi chipami zawierającymi wkładki Transwell (TW) w urządzeniu mikroprzepływowym, wytworzonymi zgodnie z opisem w ramce 1, oraz krok 1-5. „Produkcja urządzenia” przedstawia główne etapy tworzenia pojedynczego chipa lub chipa hybrydowego. ten protokół „Morfogeneza in vitro” przedstawia ogólne etapy, w których komórki nabłonkowe pochodzące z Caco-2 lub organoidów są hodowane na chipie jelitowym lub na wkładkach Transwell chipa hybrydowego, po czym następuje indukcja morfogenezy 3D i tworzenie scharakteryzowanej struktury nabłonkowej. Numer kroku programu lub numer pola jest wyświetlany pod każdą strzałką. ekosystemów mikrobiomów i modelowanie chorób. Obrazy immunofluorescencyjne w „Różnicowaniu komórek” przedstawiające jądra, F-aktynę i MUC2 wyrażane w trójwymiarowej warstwie nabłonka Caco-2 generowanej na chipie jelitowym. Sygnalizacja MUC2 jest obecna w komórkach kubkowych i śluzie wydzielanym z powierzchni błony śluzowej. aglutynina kiełków pszenicy. Dwa nakładające się obrazy w „Host-Microbe Co-Cultures” przedstawiają reprezentatywne współhodowle gospodarza i mikrobiomu w jelicie na chipie. Lewy panel przedstawia wspólną hodowlę E. coli wyrażającą białko zielonej fluorescencji (GFP) z mikroinżynierii 3D komórek nabłonkowych Caco-2. Prawy panel pokazuje lokalizację GFP E. coli hodowanych wspólnie z komórkami nabłonkowymi 3D Caco-2, a następnie immunologicznie barwienie fluorescencyjne F-aktyną (czerwony) i jądrami (niebieski). Modelowanie choroby ilustruje zdrowe i nieszczelne jelito w chipach zapalnych jelit pod wpływem fizjologicznej prowokacji antygenami bakteryjnymi (np. lipopolisacharyd, LPS) i komórkami odpornościowymi (np. PBMC;zielony). Komórki Caco-2 hodowano w celu ustalenia warstwy nabłonka 3D. Pasek skali, 50 µm. Obrazy w dolnym rzędzie: „Różnicowanie komórek” zaadaptowano za zgodą źródła.2.Oxford University Press;Reprodukowano za zgodą Ref.5.NAS;„Wspólna kultura gospodarza i drobnoustrojów” zaadaptowana za zgodą ref.3.NAS;„Modelowanie chorób” zaadaptowano za zgodą źródła.5.NAS.
Zarówno chipy typu „jelito na chipie”, jak i układy hybrydowe zostały wyprodukowane przy użyciu replik PDMS, które zostały wyjęte z form krzemowych za pomocą miękkiej litografii1,44 i wzorowane za pomocą SU-8. Projekt mikrokanalików w każdym chipie jest określany na podstawie hydrodynamiki, takiej jak naprężenie ścinające i ciśnienie hydrodynamiczne1,4,12. Oryginalny projekt typu „jelito na chipie” (dane rozszerzone, ryc. 1a), który składał się z dwóch ustawionych obok siebie, prostych mikrokanalików, przekształcił się w złożone jelito na chipie (dane rozszerzone ryc. 1b), które obejmuje parę zakrzywionych mikrokanałów w celu wywołania zwiększonego czasu przebywania płynu, nieliniowych wzorców przepływu i wieloosiowego odkształcenia hodowanych komórek (ryc. 2a – f) 12. Kiedy trzeba odtworzyć bardziej złożoną biomechanikę jelit, można wybrać złożone jelita na chipach. ramy czasowe z podobnym stopniem wzrostu nabłonka w porównaniu z oryginalnym Gut-Chip, niezależnie od typu hodowanych komórek. Dlatego, aby wywołać morfogenezę 3D, liniowe i złożone projekty jelit na chipie są wymienne. Repliki PDMS utwardzane na formach silikonowych z wzorami SU-8 zapewniały negatywne cechy po rozformowaniu (ryc.2a). Aby wytworzyć jelito na chipie, przygotowaną górną warstwę PDMS połączono sekwencyjnie z porowatą folią PDMS, a następnie wyrównano z dolną warstwą PDMS przez nieodwracalne wiązanie za pomocą urządzenia do obróbki koronowej (ryc. 2b – f). Aby wytworzyć chipy hybrydowe, utwardzone repliki PDMS połączono ze szkiełkami szklanymi, aby stworzyć jednokanałowe urządzenia mikroprzepływowe, które mogłyby pomieścić wkładki Transwell (ryc. 2h i rozszerzone dane ryc. 2). Wiązanie proces jest przeprowadzany przez obróbkę powierzchni repliki PDMS i szkła plazmą tlenową lub obróbką koronową. Po sterylizacji mikrofabrykowanego urządzenia przymocowanego do silikonowej rurki, konfiguracja urządzenia była gotowa do przeprowadzenia trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego (Rysunek 2g).
a, Schematyczna ilustracja przygotowania części PDMS z form silikonowych wzorowanych na SU-8. Nieutwardzony roztwór PDMS wylano na silikonową formę (po lewej), utwardzono w 60 ° C (w środku) i rozformowano (po prawej). Wyjęty PDMS został pocięty na kawałki i oczyszczony do dalszego użytku. b, Zdjęcie formy silikonowej użytej do przygotowania górnej warstwy PDMS.c, Zdjęcie formy silikonowej użytej do wytworzenia porowatej membrany PDMS. fotografie górnych i dolnych elementów PDMS oraz zmontowanego urządzenia jelitowego na chipie. e, Schemat wyrównania górnych, membranowych i dolnych elementów PDMS. Każda warstwa jest nieodwracalnie związana przez obróbkę plazmową lub koronową. został umieszczony na szkiełku nakrywkowym. Chip został umieszczony na pokrywie 150 mm szalki Petriego w celu przetworzenia. Spoiwo jest używane do zamknięcia silikonowej rurki.h, Migawki wizualne wytwarzania hybrydowego chipa i morfogenezy 3D przy użyciu chipów hybrydowych. Wkładki Transwell przygotowane niezależnie do hodowli Monowarstwy 2D komórek nabłonka jelitowego zostały wprowadzone do chipa hybrydowego w celu wywołania morfogenezy jelit 3D. bar, 1 cm.h Przedruk za zgodą źródła.4.Elsevier.
W tym protokole linię komórkową Caco-2 i organoidy jelitowe zastosowano jako źródła nabłonkowe (ryc. 3a). Oba typy komórek hodowano niezależnie (pudełko 2 i pudełko 5) i użyto do wysiania mikrokanalików pokrytych ECM jelita na chipie lub wstawek Transwell. ed w celu przygotowania zawiesin zdysocjowanych komórek za pomocą płynu trypsynizacyjnego (ramka 2). Organoidy ludzkiego jelita z biopsji jelit lub resekcji chirurgicznych hodowano w kopułach rusztowania Matrigel w 24-dołkowych płytkach w celu wsparcia mikrośrodowiska strukturalnego. W pełni wyrośnięte organoidy są zbierane i dysocjowane na pojedyncze komórki w celu wysiania na jelicie lub wstawkach Transwell na chipie (ramka 5). Jak już wcześniej informowaliśmy, można je różnicować w zależności od typu choroby12,13 (np. cum, okrężnicy lub odbytnicy). W ramce 5 zapewniamy zoptymalizowany protokół do hodowli organoidów okrężnicy (koloidów), które zazwyczaj wymagają wyższych stężeń morfogenów niż organoidy jelita cienkiego.
a, Przebieg pracy dla indukcji morfogenezy jelita w chipie jelitowym. W tym protokole stosuje się ludzki nabłonek jelitowy Caco-2 i organoidy jelitowe w celu zademonstrowania morfogenezy 3D. Wyizolowane komórki nabłonkowe wysiano w przygotowanym urządzeniu typu „jet na chipie” (przygotowanie chipa). 2 dni (przepływ, AP, D0-D2). Przepływ podstawno-boczny (BL) jest również inicjowany wraz z cyklicznymi ruchami rozciągającymi (rozciąganie, przepływ, AP i BL), gdy tworzy się kompletna monowarstwa 2D. Morfogeneza jelita 3D wystąpiła spontanicznie po 5 dniach hodowli mikroprzepływowej (morfogeneza, D5). Obrazy z kontrastem fazowym pokazują reprezentatywną morfologię komórek Caco-2 w każdym etapie eksperymentu lub punkcie czasowym (wykres słupkowy, 100 µm).F nasze schematyczne diagramy ilustrujące odpowiednie kaskady morfogenezy jelit (prawy górny róg). Strzałki przerywane na schemacie reprezentują kierunek przepływu płynu. laudin (ZO-1, czerwony) i ciągłe błony rąbka szczoteczkowego oznaczone F-aktyna (zielony) i jądra (niebieski) Immunofluorescencyjna konfokalna wizualizacja komórek nabłonka na chipach jelitowych. Strzałki wskazujące na środkowy schemat wskazują położenie płaszczyzny ogniskowej dla każdego widoku konfokalnego. Wstawka (u góry po prawej) pokazuje duże powiększenie dostarczonego obrazu.e, fotomikrografia DIC organoidalnego nabłonka 3D utworzonego w jelicie na skrawku pobranym w dniu 7.f, nałożone obrazy immunofluorescencyjne pokazujące markery dla komórek macierzystych (LGR5;magenta), komórki kubkowe (MUC2; zielony), F-aktyna (szary) i jądra (cyjan) hodowane na chipach jelitowych przez 3 dni, odpowiednio (po lewej) i 13-dniowe (środkowe) organoidy na warstwie nabłonka. Zobacz także dane rozszerzone Rysunek 3, który podkreśla sygnalizację LGR5 bez sygnalizacji MUC2. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające mikrostrukturę nabłonka (po prawej) trójwymiarowego nabłonka organoidalnego ustalonego w jelitach na czip przez barwienie błony plazmatycznej barwnikiem CellMask (po prawej) w 13 dniu hodowli. Pasek skali wynosi 50 μm, chyba że zaznaczono inaczej.b Przedruk za zgodą źródła.2.Oxford University Press;c Dostosowano za zgodą Reference.2.Oxford University Press;eif zaadaptowano za zgodą przez odniesienie.12 Na licencji Creative Commons CC BY 4.0.
W jelicie na chipie konieczna jest modyfikacja hydrofobowej powierzchni porowatej membrany PDMS w celu pomyślnego powlekania ECM. W tym protokole stosujemy dwie różne metody modyfikacji hydrofobowości membran PDMS. W przypadku hodowli komórek Caco-2 aktywacja powierzchni przez samą obróbkę UV / ozonem była wystarczająca do zmniejszenia hydrofobowości powierzchni PDMS, pokrycia ECM i przyczepienia komórek Caco-2 do membrany PDMS. Jednak hodowla mikroprzepływowa epitetu organoidalnego Lium wymaga chemicznej funkcjonalizacji powierzchni w celu uzyskania wydajnego osadzania białek ECM poprzez sekwencyjne nakładanie polietylenoiminy (PEI) i aldehydu glutarowego na mikrokanały PDMS. Po modyfikacji powierzchni białka ECM zostały osadzone w celu pokrycia sfunkcjonalizowanej powierzchni PDMS, a następnie wprowadzone do wyizolowanego nabłonka organoidalnego. kanał utrzymuje warunki statyczne. Ta zoptymalizowana metoda aktywacji powierzchni i powlekania ECM umożliwia przyczepianie nabłonka organoidalnego w celu wywołania morfogenezy 3D na powierzchni PDMS.
Hodowle Transwell również wymagają powlekania ECM przed wysianiem komórek;jednakże hodowle Transwell nie wymagają skomplikowanych etapów obróbki wstępnej w celu aktywacji powierzchni porowatych insertów. W przypadku hodowli komórek Caco-2 na insertach Transwell, powlekanie ECM na porowatych insertach przyspiesza przyleganie zdysocjowanych komórek Caco-2 (<1 godzina) i tworzenie bariery ścisłego połączenia (<1-2 dni). jednowarstwowa z integralnością bariery. Hodowle Transwell są przeprowadzane na 24-dołkowych płytkach bez użycia hybrydowych chipów.
Morfogenezę 3D in vitro można zainicjować, stosując przepływ płynu do podstawno-bocznego aspektu ustalonej warstwy nabłonka. W jelitach na chipie morfogeneza nabłonka rozpoczęła się, gdy pożywka została wprowadzona do górnych i dolnych mikrokanałów (ryc. 3a). Jak wcześniej opisano, krytyczne znaczenie ma wprowadzenie przepływu płynu w dolnym (podstawno-bocznym) przedziale w celu ciągłego usuwania kierunkowych wydzielanych inhibitorów morfogenu. Aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych i surowicy komórkom związanym na porowatych błonach i wygenerować ścinanie światła stresu, zwykle stosujemy podwójny przepływ w jelicie na chipie. W chipach hybrydowych, wkładki Transwell zawierające monowarstwy nabłonka zostały wstawione do chipów hybrydowych. Następnie pożywkę nałożono pod boczno-podstawną stronę porowatej wkładki Transwell przez mikrokanał. Morfogeneza jelita wystąpiła 3-5 dni po rozpoczęciu przepływu podstawno-bocznego na obu platformach hodowlanych.
Cechy morfologiczne warstw nabłonka 3D poddanych mikroinżynierii można analizować za pomocą różnych metod obrazowania, w tym mikroskopii z kontrastem fazowym, mikroskopii różnicowo-interferencyjnej (DIC), SEM lub immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej (ryc. zarówno platforma typu gut-on-a-chip, jak i hybrydowa platforma chipowa mogą zapewnić obrazowanie in situ w czasie rzeczywistym bez potrzeby dzielenia lub demontażu urządzenia. Podczas wykonywania obrazowania immunofluorescencyjnego (ryc. 1, 3c, f i 4b, c), komórki są zazwyczaj utrwalane 4% (wag./obj.) paraformaldehydem (PFA), a następnie Triton X-100 i 2% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA), w kolejności.D w zależności od typu komórki można zastosować różne utrwalacze, środki zwiększające przepuszczalność i czynniki blokujące. Pierwotne przeciwciała ukierunkowane na markery komórek lub regionów zależnych od linii są używane do podświetlenia komórek unieruchomionych in situ na chipie, a następnie przeciwciała drugorzędowe wraz z barwnikiem kontrastowym celującym w jądro (np. 4′,6-diamidyno-2-fenylen) indol, DAPI) lub F-aktynę (np. fluorescencyjnie znakowana falloidyna). Obrazowanie na żywo oparte na fluorescencji można również wykonać in situ w celu wykrycia produkcji śluzu (ryc.Jak pokazano na ryc. 2 morfologię nabłonka 3D, jak również mikrokosmki na wierzchołkowej granicy szczoteczki można zwizualizować za pomocą SEM (ryc. 3b). Ekspresję markerów różnicowania można ocenić, przeprowadzając ilościowe sekwencjonowanie PCR5 lub jednokomórkowe RNA. W tym przypadku warstwy 3D komórek nabłonka hodowanych w chipsach jelitowych lub chipach hybrydowych są zbierane przez trypsynizację, a następnie wykorzystywane do analizy molekularnej lub genetycznej.
a, Przebieg pracy dla indukcji morfogenezy jelitowej w chipie hybrydowym. Caco-2 i organoidy jelitowe są używane w tym protokole do zademonstrowania morfogenezy 3D w hybrydowej platformie chipowej. Zdysocjowane komórki nabłonkowe wysiano w przygotowanych wkładkach Transwell (przygotowanie TW; patrz rysunek poniżej). wstawka zawierająca monowarstwę 2D komórek nabłonka została zintegrowana z chipem hybrydowym w celu wprowadzenia przepływu podstawno-bocznego (Flow, BL), co ostatecznie doprowadziło do wytworzenia warstwy nabłonka 3D (morfogeneza). Mikrografie z kontrastem fazowym przedstawiające cechy morfologiczne komórek nabłonka narządów ludzkich pochodzących od normalnego dawcy (linia C103) okrężnicy wstępującej w każdym etapie eksperymentu lub punkcie czasowym. Schematy w górnych warstwach ilustrują konfigurację eksperymentalną dla każdego etapu. prowadzić do morfogenezy 3D organoidalnych komórek nabłonkowych z widokami mikroskopii konfokalnej z góry na dół wykonanymi w różnych pozycjach Z (górna, środkowa i dolna;patrz prawy schemat i odpowiadające mu linie przerywane).wykazał oczywiste cechy morfologiczne. F-aktyna (cyjan), jądro (szary). Funkcje D i 3D. Pasek skali, 100 µm.c Przedruk za zgodą źródła.4.Elsevier.
Kontrole można przygotować hodując te same komórki (Caco-2 lub organoidalne komórki nabłonka jelitowego) w dwuwymiarowe monowarstwy w konwencjonalnych warunkach hodowli statycznej. Warto zauważyć, że wyczerpanie składników odżywczych może wynikać z ograniczonej pojemności objętościowej mikrokanałów (tj. ~4 µl w górnym kanale w oryginalnym projekcie jelita-chipu). W związku z tym można również porównać morfologię nabłonka przed i po zastosowaniu przepływu podstawno-bocznego.
Proces miękkiej litografii powinien być wykonywany w czystym pomieszczeniu. Dla każdej warstwy na chipie (górna i dolna warstwa oraz membrany) oraz chipów hybrydowych zastosowano różne fotomaski i wykonano je na oddzielnych płytkach krzemowych, ponieważ wysokości mikrokanalików były różne. Docelowe wysokości górnego i dolnego mikrokanalika jelita na chipie wynoszą odpowiednio 500 µm i 200 µm. Docelowa wysokość kanału chipa hybrydowego wynosi 200 µm.
Umieść 3-calową płytkę silikonową w naczyniu z acetonem. Delikatnie obracaj płytkę przez 30 sekund, a następnie wysusz płytkę powietrzem. Przenieś płytkę na płytkę z alkoholem izopropylowym, a następnie obracaj płytkę przez 30 sekund, aby ją wyczyścić.
Opcjonalnie można zastosować roztwór piranii (mieszanina nadtlenku wodoru i stężonego kwasu siarkowego, 1:3 (obj./obj.)), aby zmaksymalizować usuwanie pozostałości organicznych z powierzchni płytki krzemowej.
Roztwór Piranha jest wyjątkowo żrący i wytwarza ciepło.Konieczne są dodatkowe środki ostrożności.W celu usunięcia odpadów należy pozwolić, aby roztwór ostygł i przenieść go do czystego, suchego pojemnika na odpady.Użyj pojemników drugorzędnych i odpowiednio oznakuj pojemniki na odpady.W celu uzyskania bardziej szczegółowych procedur należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa obowiązującymi w placówce.
Odwodnić wafle, umieszczając je na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C na 10 min. Po odwodnieniu wafelek wytrząsano pięć razy na powietrzu w celu ostygnięcia.
Wlej ~10 g fotorezystu SU-8 2100 na środek wyczyszczonej płytki silikonowej. Za pomocą pęsety równomiernie rozprowadź fotorezyst na płytce. Od czasu do czasu umieść płytkę na gorącej płycie o temperaturze 65°C, aby fotorezyst był mniej lepki i łatwiejszy do rozprowadzenia. Nie umieszczaj płytki bezpośrednio na płycie grzewczej.
SU-8 został równomiernie rozprowadzony na płytce poprzez uruchomienie powlekania wirowego. Zaprogramuj nadchodzący obrót SU-8 na 5–10 s, aby rozchodził się z prędkością 500 obr./min przy przyspieszeniu 100 obr./s. Ustaw wirowanie główne na grubość 200 µm przy 1500 obr./min lub uzyskaj grubość 250 µm (uzyskując wysokość 500 µm dla górnej warstwy jelita na chipie; patrz „Krytyczne kroki ” poniżej) ustawiony na przyspieszenie 300 obr/min/s 30 sekund przy 1200 obr/min.
Prędkość głównego wirowania można dostosować do docelowej grubości wzoru SU-8 na płytce silikonowej.
Aby wytworzyć wzory SU-8 o wysokości 500 µm dla górnej warstwy jelita na chipie, etapy powlekania obrotowego i miękkiego pieczenia tego pudełka (kroki 7 i 8) zostały sekwencyjnie powtórzone (patrz krok 9) w celu wytworzenia dwóch warstw o ​​grubości 250 µm.
Upiecz na miękko wafle pokryte SU-8, ostrożnie umieszczając wafle na płycie grzejnej w temperaturze 65°C na 5 min, następnie przełącz ustawienie na 95°C i inkubuj przez dodatkowe 40 min.
Aby uzyskać wysokość 500 μm wzoru SU-8 w górnym mikrokanale, powtórz kroki 7 i 8, aby wygenerować dwie warstwy SU-8 o grubości 250 μm.
Za pomocą urządzenia UV Mask Aligner wykonaj test lampy zgodnie z instrukcjami producenta, aby obliczyć czas ekspozycji płytki. (czas ekspozycji, ms) = (dawka ekspozycji, mJ/cm2)/(moc lampy, mW/cm2).
Po ustaleniu czasu naświetlania umieść fotomaskę na uchwycie maski nakładki UV mask aligner i umieść fotomaskę na płytce powlekanej SU-8.
Umieść zadrukowaną powierzchnię fotomaski bezpośrednio na powleczonej SU-8 stronie płytki silikonowej, aby zminimalizować dyspersję UV.
Naświetl płytkę pokrytą SU-8 i fotomaskę pionowo na działanie światła UV o natężeniu 260 mJ/cm2 przez określony czas ekspozycji (patrz krok 10 w tej ramce).
Po ekspozycji na promieniowanie UV płytki krzemowe pokryte powłoką SU-8 pieczono w temperaturze 65°C przez 5 min i 95°C przez 15 min na każdej płycie grzejnej, aby uzyskać wzory o wysokości 200 μm. Aby uzyskać wzory o wysokości 500 μm, należy wydłużyć czas pieczenia w 95°C do 30 min.
Wywoływacz wlewa się do szklanego naczynia, po czym umieszcza się w nim upieczony wafel. Objętość wywoływacza SU-8 może się różnić w zależności od wielkości szklanej płytki. Należy użyć wystarczającej ilości wywoływacza SU-8, aby całkowicie usunąć nienaświetlony SU-8. Na przykład, używając szklanego naczynia o średnicy 150 mm i pojemności 1 l, należy użyć ~300 ml wywoływacza SU-8. Wywoływać formę przez 25 minut, od czasu do czasu delikatnie obracając.
Przepłucz rozwiniętą pleśń ~10 ml świeżego wywoływacza, a następnie IPA, rozpylając roztwór za pomocą pipety.
Umieść płytkę w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i wystaw na działanie plazmy tlenowej (gaz atmosferyczny, ciśnienie docelowe 1 × 10-5 Torr, moc 125 W) przez 1,5 min.
Umieść płytkę w eksykatorze próżniowym ze szklanym szkiełkiem w środku. Płytki i szkiełka można umieścić obok siebie. Jeśli eksykator próżniowy jest podzielony płytką na kilka warstw, umieść szkiełka w dolnej komorze, a płytki w górnej komorze. Upuść 100 μl roztworu trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanu na szklane szkiełko i zastosuj próżnię w celu silanizacji.
Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi komórkami Caco-2 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, następnie przenieść rozmrożone komórki do kolby T75 zawierającej 15 ml wstępnie ogrzanej do 37°C pożywki Caco-2.
Aby przekazać komórki Caco-2 przy ~90% konfluencji, najpierw ogrzej pożywkę Caco-2, PBS i 0,25% trypsyny/1 mM EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Zaaspiruj pożywkę przez aspirację próżniową. Przemyj komórki dwukrotnie 5 ml ciepłego PBS, powtarzając aspirację próżniową i dodając świeży PBS.