Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Ewolucja pasożytów mikrobiologicznych obejmuje przeciwdziałanie między selekcją naturalną, która powoduje poprawę pasożytów, a dryfem genetycznym, który powoduje, że pasożyty tracą geny i gromadzą szkodliwe mutacje.Tutaj, aby zrozumieć, jak to przeciwdziałanie zachodzi w skali pojedynczej makrocząsteczki, opisujemy strukturę krio-EM rybosomu Encephalitozoon cuniculi, organizmu eukariotycznego o jednym z najmniejszych genomów w przyrodzie.Ekstremalnej redukcji rRNA w rybosomach E. cuniculi towarzyszą bezprecedensowe zmiany strukturalne, takie jak ewolucja nieznanych wcześniej połączonych łączników rRNA i rRNA bez wybrzuszeń.Ponadto rybosom E. cuniculi przetrwał utratę fragmentów i białek rRNA, rozwijając zdolność wykorzystywania małych cząsteczek jako naśladowców strukturalnych zdegradowanych fragmentów i białek rRNA.Ogólnie rzecz biorąc, pokazujemy, że struktury molekularne, które od dawna uważano za zredukowane, zdegenerowane i podlegające wyniszczającym mutacjom, mają szereg mechanizmów kompensacyjnych, które utrzymują ich aktywność pomimo ekstremalnych skurczów molekularnych.
Ponieważ większość grup pasożytniczych drobnoustrojów ma unikalne narzędzia molekularne do wykorzystywania swoich żywicieli, często musimy opracowywać różne terapie dla różnych grup pasożytów1,2.Jednak nowe dowody sugerują, że niektóre aspekty ewolucji pasożytów są zbieżne iw dużej mierze przewidywalne, co wskazuje na potencjalną podstawę szeroko zakrojonych interwencji terapeutycznych w pasożyty drobnoustrojowe3,4,5,6,7,8,9.
Wcześniejsze prace zidentyfikowały powszechny trend ewolucyjny pasożytów drobnoustrojów, zwany redukcją genomu lub rozpadem genomu10,11,12,13.Obecne badania pokazują, że kiedy mikroorganizmy rezygnują ze swojego wolno żyjącego trybu życia i stają się pasożytami wewnątrzkomórkowymi (lub endosymbiontami), ich genomy przechodzą powolne, ale niesamowite metamorfozy na przestrzeni milionów lat9,11.W procesie znanym jako rozpad genomu, pasożyty drobnoustrojowe gromadzą szkodliwe mutacje, które zamieniają wiele wcześniej ważnych genów w pseudogeny, prowadząc do stopniowej utraty genów i upadku mutacji14,15.To załamanie może zniszczyć do 95% genów w najstarszych organizmach wewnątrzkomórkowych w porównaniu z blisko spokrewnionymi gatunkami wolno żyjącymi.Tak więc ewolucja pasożytów wewnątrzkomórkowych to przeciąganie liny między dwiema przeciwstawnymi siłami: darwinowską selekcją naturalną, prowadzącą do udoskonalenia pasożytów, oraz załamaniem się genomu, rzucającym pasożyty w zapomnienie.W jaki sposób pasożytowi udało się wydostać z tego przeciągania liny i zachować aktywność swojej struktury molekularnej, pozostaje niejasne.
Chociaż mechanizm rozpadu genomu nie jest w pełni poznany, wydaje się, że występuje on głównie z powodu częstego dryfu genetycznego.Ponieważ pasożyty żyją w małych, bezpłciowych i genetycznie ograniczonych populacjach, nie mogą skutecznie wyeliminować szkodliwych mutacji, które czasami występują podczas replikacji DNA.Prowadzi to do nieodwracalnej kumulacji szkodliwych mutacji i redukcji genomu pasożyta.W efekcie pasożyt nie tylko traci geny, które nie są mu już potrzebne do przeżycia w środowisku wewnątrzkomórkowym.To niezdolność populacji pasożytów do skutecznego wyeliminowania sporadycznych szkodliwych mutacji powoduje, że mutacje te gromadzą się w całym genomie, w tym w ich najważniejszych genach.
Wiele z naszego obecnego rozumienia redukcji genomu opiera się wyłącznie na porównaniach sekwencji genomu, z mniejszą uwagą na zmiany w rzeczywistych cząsteczkach, które pełnią funkcje porządkowe i służą jako potencjalne cele leków.Badania porównawcze wykazały, że ciężar szkodliwych wewnątrzkomórkowych mutacji mikrobiologicznych wydaje się predysponować białka i kwasy nukleinowe do nieprawidłowego fałdowania i agregacji, czyniąc je bardziej zależnymi od białek opiekuńczych i nadwrażliwymi na ciepło19,20,21,22,23.Ponadto różne pasożyty — niezależnie ewoluujące, czasami oddalone nawet o 2,5 miliarda lat — doświadczyły podobnej utraty centrów kontroli jakości w swoich mechanizmach syntezy białek5,6 i naprawy DNA24.Jednak niewiele wiadomo na temat wpływu wewnątrzkomórkowego stylu życia na wszystkie inne właściwości makrocząsteczek komórkowych, w tym adaptację molekularną do rosnącego obciążenia szkodliwymi mutacjami.
W niniejszej pracy, aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych, określiliśmy budowę rybosomów wewnątrzkomórkowego pasożyta Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi to grzybopodobny organizm należący do grupy pasożytniczych mikrosporydiów, które mają niezwykle małe genomy eukariotyczne i dlatego są wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania rozpadu genomu25,26,27,28,29,30.Ostatnio określono strukturę rybosomu krio-EM dla umiarkowanie zredukowanych genomów Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genom ~ 3,2 Mb).Struktury te sugerują, że pewna utrata amplifikacji rRNA jest kompensowana przez rozwój nowych kontaktów między sąsiednimi białkami rybosomalnymi lub nabywanie nowych rybosomalnych białek msL131,32.Gatunki Encephalitozoon (genom ~2,5 miliona pz), wraz z ich najbliższym krewnym Ordospora, wykazują najwyższy stopień redukcji genomu u eukariontów – mają mniej niż 2000 genów kodujących białka i oczekuje się, że ich rybosomy są nie tylko pozbawione fragmentów ekspansji rRNA (fragmenty rRNA, które odróżniają rybosomy eukariotyczne od rybosomów bakteryjnych), mają również cztery białka rybosomalne ze względu na brak homologów w E genom cuniculi26,27,28.Dlatego doszliśmy do wniosku, że rybosom E. cuniculi może ujawnić nieznane wcześniej strategie molekularnej adaptacji do rozpadu genomu.
Nasza struktura krio-EM reprezentuje najmniejszy eukariotyczny rybosom cytoplazmatyczny do scharakteryzowania i zapewnia wgląd w to, w jaki sposób ostateczny stopień redukcji genomu wpływa na strukturę, montaż i ewolucję maszynerii molekularnej, która jest integralną częścią komórki.Odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi łamie wiele szeroko konserwowanych zasad fałdowania RNA i składania rybosomów, i odkryliśmy nowe, wcześniej nieznane białko rybosomalne.Całkiem nieoczekiwanie pokazujemy, że rybosomy mikrosporydiów wyewoluowały zdolność wiązania małych cząsteczek i stawiamy hipotezę, że skrócenia rRNA i białek wyzwalają ewolucyjne innowacje, które ostatecznie mogą nadać rybosomowi użyteczne właściwości.
Aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych w organizmach wewnątrzkomórkowych, postanowiliśmy wyizolować zarodniki E. cuniculi z hodowli zakażonych komórek ssaków w celu oczyszczenia ich rybosomów i określenia struktury tych rybosomów.Trudno jest uzyskać dużą liczbę pasożytniczych mikrosporydiów, ponieważ mikrosporydiów nie można hodować w pożywce.Zamiast tego rosną i rozmnażają się tylko wewnątrz komórki gospodarza.Dlatego, aby uzyskać biomasę E. cuniculi do oczyszczenia rybosomów, zainfekowaliśmy linię komórkową nerki ssaka RK13 zarodnikami E. cuniculi i hodowaliśmy te zainfekowane komórki przez kilka tygodni, aby umożliwić E. cuniculi wzrost i namnażanie.Używając zakażonej pojedynczej warstwy komórek o powierzchni około pół metra kwadratowego, byliśmy w stanie oczyścić około 300 mg zarodników Microsporidia i użyć ich do wyizolowania rybosomów.Następnie rozbiliśmy oczyszczone zarodniki szklanymi kulkami i wyizolowaliśmy surowe rybosomy, stosując stopniowe frakcjonowanie lizatów glikolem polietylenowym.To pozwoliło nam uzyskać około 300 µg surowych rybosomów E. cuniculi do analizy strukturalnej.
Następnie zebraliśmy obrazy krio-EM przy użyciu otrzymanych próbek rybosomów i przetworzyliśmy te obrazy za pomocą masek odpowiadających dużej podjednostce rybosomu, małej główce podjednostki i małej podjednostce.Podczas tego procesu zebraliśmy obrazy około 108 000 cząstek rybosomalnych i obliczyliśmy obrazy krio-EM z rozdzielczością 2, 7 Å (rysunki uzupełniające 1-3).Następnie wykorzystaliśmy obrazy krioEM do modelowania rRNA, białka rybosomalnego i czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomami E. cuniculi (ryc. 1a, b).
a Struktura rybosomu E. cuniculi w kompleksie z czynnikiem hibernacji Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomem E. cuniculi.c Mapa struktury drugorzędowej porównująca odzyskany rRNA w gatunkach Microsporidian ze znanymi strukturami rybosomalnymi.Panele pokazują lokalizację zamplifikowanych fragmentów rRNA (ES) i miejsc aktywnych rybosomów, w tym miejsca dekodowania (DC), pętli sarcynicyny (SRL) i centrum transferazy peptydylowej (PTC).d Gęstość elektronowa odpowiadająca centrum transferazy peptydylowej rybosomu E. cuniculi sugeruje, że to miejsce katalityczne ma taką samą strukturę u pasożyta E. cuniculi i jego żywicieli, w tym H. sapiens.e, f Odpowiednia gęstość elektronowa centrum dekodowania (e) i schematyczna struktura centrum dekodowania (f) wskazują, że E. cuniculi ma reszty U1491 zamiast A1491 (numeracja E. coli) u wielu innych eukariontów.Ta zmiana sugeruje, że E. cuniculi może być wrażliwa na antybiotyki ukierunkowane na to miejsce aktywne.
W przeciwieństwie do wcześniej ustalonych struktur rybosomów V. necatrix i P. locustae (obie struktury reprezentują tę samą rodzinę mikrosporydiów Nosematidae i są do siebie bardzo podobne), 31,32 rybosomów E. cuniculi podlega licznym procesom fragmentacji rRNA i białek.Dalsza denaturacja (rysunki uzupełniające 4-6).W rRNA najbardziej uderzające zmiany obejmowały całkowitą utratę zamplifikowanego fragmentu 25S rRNA ES12L i częściową degenerację helis h39, h41 i H18 (ryc. 1c, ryc. Uzupełniająca 4).Wśród białek rybosomalnych najbardziej uderzające zmiany obejmowały całkowitą utratę białka eS30 i skrócenie białek eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (rysunki uzupełniające 4, 5).
Tak więc ekstremalna redukcja genomów gatunków Encephalotozoon / Ordospora znajduje odzwierciedlenie w ich strukturze rybosomów: rybosomy E. cuniculi doświadczają najbardziej dramatycznej utraty zawartości białka w eukariotycznych rybosomach cytoplazmatycznych podlegających charakteryzacji strukturalnej i nie mają nawet tych fragmentów rRNA i białek, które są szeroko konserwowane nie tylko u eukariontów, ale także w trzech domenach życia.Struktura rybosomu E. cuniculi zapewnia pierwszy model molekularny tych zmian i ujawnia zdarzenia ewolucyjne, które zostały przeoczone zarówno przez genomikę porównawczą, jak i badania wewnątrzkomórkowej struktury biomolekularnej (Uzupełniająca Ryc. 7).Poniżej opisujemy każde z tych zdarzeń wraz z ich prawdopodobnym ewolucyjnym pochodzeniem i ich potencjalnym wpływem na funkcję rybosomu.
Następnie odkryliśmy, że oprócz dużych skróceń rRNA, rybosomy E. cuniculi mają odmiany rRNA w jednym ze swoich miejsc aktywnych.Chociaż centrum transferazy peptydylowej rybosomu E. cuniculi ma taką samą strukturę jak inne rybosomy eukariotyczne (ryc. 1d), centrum dekodowania różni się ze względu na zmienność sekwencji przy nukleotydzie 1491 (numeracja E. coli, ryc. 1e, f).Ta obserwacja jest ważna, ponieważ miejsce dekodowania rybosomów eukariotycznych zazwyczaj zawiera reszty G1408 i A1491 w porównaniu z resztami typu bakteryjnego A1408 i G1491.Ta zmienność leży u podstaw różnej wrażliwości rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych na rodzinę aminoglikozydów antybiotyków rybosomalnych i inne małe cząsteczki, które celują w miejsce dekodowania.W miejscu dekodowania rybosomu E. cuniculi reszta A1491 została zastąpiona U1491, potencjalnie tworząc unikalny interfejs wiązania dla małych cząsteczek ukierunkowanych na to miejsce aktywne.Ten sam wariant A14901 jest również obecny w innych mikrosporydiach, takich jak P. locustae i V. necatrix, co sugeruje, że jest szeroko rozpowszechniony wśród gatunków mikrosporydiów (ryc. 1f).
Ponieważ nasze próbki rybosomów E. cuniculi zostały wyizolowane z nieaktywnych metabolicznie zarodników, przetestowaliśmy mapę krio-EM E. cuniculi pod kątem wcześniej opisanego wiązania rybosomów w warunkach stresu lub głodu.Czynniki hibernacji 31,32,36,37, 38. Dopasowaliśmy wcześniej ustaloną strukturę hibernującego rybosomu do mapy krio-EM rybosomu E. cuniculi.Do dokowania zastosowano rybosomy S. cerevisiae w kompleksie z czynnikiem hibernacji Stm138, rybosomy szarańczy w kompleksie z czynnikiem Lso232 oraz rybosomy V. necatrix w kompleksie z czynnikami Mdf1 i Mdf231.W tym samym czasie znaleźliśmy gęstość krio-EM odpowiadającą współczynnikowi spoczynku Mdf1.Podobnie jak Mdf1 wiąże się z rybosomem V. necatrix, Mdf1 wiąże się również z rybosomem E. cuniculi, gdzie blokuje miejsce E rybosomu, prawdopodobnie pomagając udostępnić rybosomy, gdy zarodniki pasożyta stają się metabolicznie nieaktywne po inaktywacji organizmu (ryc. 2).).
Mdf1 blokuje miejsce E rybosomu, co wydaje się pomagać w dezaktywacji rybosomu, gdy zarodniki pasożyta stają się metabolicznie nieaktywne.W strukturze rybosomu E. cuniculi odkryliśmy, że Mdf1 tworzy nieznany wcześniej kontakt z trzonem rybosomu L1, częścią rybosomu, która ułatwia uwalnianie deacylowanego tRNA z rybosomu podczas syntezy białka.Te kontakty sugerują, że Mdf1 dysocjuje od rybosomu przy użyciu tego samego mechanizmu, co deacetylowany tRNA, dostarczając możliwego wyjaśnienia, w jaki sposób rybosom usuwa Mdf1 w celu reaktywacji syntezy białek.
Jednak nasza struktura ujawniła nieznany kontakt między Mdf1 a odnogą rybosomu L1 (część rybosomu, która pomaga uwalniać deacylowany tRNA z rybosomu podczas syntezy białek).W szczególności Mdf1 wykorzystuje te same kontakty, co segment łokcia deacylowanej cząsteczki tRNA (ryc. 2).To nieznane wcześniej modelowanie molekularne wykazało, że Mdf1 dysocjuje z rybosomu przy użyciu tego samego mechanizmu, co deacetylowany tRNA, co wyjaśnia, w jaki sposób rybosom usuwa ten czynnik hibernacji, aby reaktywować syntezę białek.
Podczas konstruowania modelu rRNA odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi ma nieprawidłowo sfałdowane fragmenty rRNA, które nazwaliśmy fuzyjnym rRNA (ryc. 3).W rybosomach, które obejmują trzy domeny życia, rRNA fałduje się w struktury, w których większość zasad rRNA albo tworzy pary zasad i fałduje się ze sobą, albo oddziałuje z białkami rybosomalnymi38,39,40.Jednak w rybosomach E. cuniculi rRNA wydają się naruszać tę zasadę fałdowania, przekształcając niektóre z ich helis w niesfałdowane regiony rRNA.
Struktura helisy rRNA H18 25S w S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi.Zazwyczaj w rybosomach obejmujących trzy domeny życia ten łącznik zwija się w helisę RNA zawierającą od 24 do 34 reszt.Natomiast w Microsporidia ten łącznik rRNA jest stopniowo redukowany do dwóch jednoniciowych łączników bogatych w urydynę, zawierających tylko 12 reszt.Większość z tych pozostałości jest narażona na działanie rozpuszczalników.Rysunek pokazuje, że pasożytnicze mikrosporydia wydają się naruszać ogólne zasady fałdowania rRNA, gdzie zasady rRNA są zwykle sprzężone z innymi zasadami lub zaangażowane w interakcje rRNA-białko.W mikrosporydiach niektóre fragmenty rRNA przyjmują niekorzystne fałdowanie, w którym dawna helisa rRNA staje się jednoniciowym fragmentem wydłużonym prawie w linii prostej.Obecność tych niezwykłych regionów umożliwia mikrosporydiom rRNA wiązanie odległych fragmentów rRNA przy użyciu minimalnej liczby zasad RNA.
Najbardziej uderzający przykład tego przejścia ewolucyjnego można zaobserwować w helisie rRNA H18 25S (ryc. 3).U gatunków od E. coli do ludzi podstawy tej helisy rRNA zawierają 24-32 nukleotydów, tworząc lekko nieregularną helisę.We wcześniej zidentyfikowanych strukturach rybosomalnych z V. necatrix i P. locustae31,32 zasady helisy H18 są częściowo rozwinięte, ale parowanie zasad nukleotydów jest zachowane.Jednak u E. cuniculi ten fragment rRNA staje się najkrótszymi łącznikami 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUU307.W przeciwieństwie do typowych fragmentów rRNA, te bogate w urydynę łączniki nie zwijają się ani nie wchodzą w rozległy kontakt z białkami rybosomalnymi.Zamiast tego przyjmują otwarte na rozpuszczalniki i całkowicie rozwinięte struktury, w których nici rRNA są rozciągnięte prawie prosto.Ta rozciągnięta konformacja wyjaśnia, w jaki sposób E. cuniculi wykorzystuje tylko 12 zasad RNA do wypełnienia przerwy 33 Å między helisami rRNA H16 i H18, podczas gdy inne gatunki wymagają co najmniej dwa razy więcej zasad rRNA, aby wypełnić lukę.
W ten sposób możemy wykazać, że poprzez energetycznie niekorzystne fałdowanie, pasożytnicze mikrosporydia opracowały strategię kurczenia się nawet tych segmentów rRNA, które pozostają szeroko konserwowane u różnych gatunków w trzech domenach życia.Najwyraźniej, gromadząc mutacje, które przekształcają helisy rRNA w krótkie łączniki poli-U, E. cuniculi może tworzyć niezwykłe fragmenty rRNA zawierające jak najmniej nukleotydów do ligacji dystalnych fragmentów rRNA.Pomaga to wyjaśnić, w jaki sposób mikrosporydia osiągnęły radykalną redukcję ich podstawowej struktury molekularnej bez utraty strukturalnej i funkcjonalnej integralności.
Inną niezwykłą cechą rRNA E. cuniculi jest pojawienie się rRNA bez zgrubień (ryc. 4).Wybrzuszenia to nukleotydy bez par zasad, które wykręcają się z helisy RNA zamiast się w niej ukrywać.Większość wypukłości rRNA działa jak kleje molekularne, pomagając związać sąsiednie białka rybosomalne lub inne fragmenty rRNA.Niektóre z wybrzuszeń działają jak zawiasy, umożliwiając helisie rRNA wyginanie się i fałdowanie optymalnie dla produktywnej syntezy białek 41 .
a Występ rRNA (numeracja S. cerevisiae) jest nieobecny w strukturze rybosomu E. cuniculi, ale obecny w większości innych eukariotów b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi wewnętrzne rybosomy.pasożytom brakuje wielu starożytnych, wysoce konserwatywnych wybrzuszeń rRNA.Te zgrubienia stabilizują strukturę rybosomu;dlatego ich brak w mikrosporydiach wskazuje na zmniejszoną stabilność fałdowania rRNA w pasożytach mikrosporydiów.Porównanie z łodygami P (łodygi L7/L12 u bakterii) pokazuje, że utrata guzków rRNA czasami zbiega się z pojawieniem się nowych guzków obok utraconych guzków.Helisa H42 w rRNA 23S/28S ma starożytne wybrzuszenie (U1206 w Saccharomyces cerevisiae), którego wiek szacuje się na co najmniej 3,5 miliarda lat ze względu na ochronę w trzech domenach życia.W mikrosporydiach to wybrzuszenie jest wyeliminowane.Jednak obok utraconego wybrzuszenia pojawiło się nowe wybrzuszenie (A1306 u E. cuniculi).
Co uderzające, odkryliśmy, że rybosomy E. cuniculi nie mają większości wybrzuszeń rRNA występujących u innych gatunków, w tym ponad 30 wybrzuszeń zachowanych u innych eukariotów (ryc. 4a).Ta utrata eliminuje wiele kontaktów między podjednostkami rybosomu a sąsiednimi helisami rRNA, czasami tworząc duże puste przestrzenie w rybosomie, czyniąc rybosom E. cuniculi bardziej porowatym w porównaniu z bardziej tradycyjnymi rybosomami (ryc. 4b).W szczególności odkryliśmy, że większość tych wybrzuszeń została również utracona we wcześniej zidentyfikowanych strukturach rybosomów V. necatrix i P. locustae, które zostały przeoczone we wcześniejszych analizach strukturalnych31,32.
Czasami utracie zgrubień rRNA towarzyszy rozwój nowych zgrubień obok utraconego zgrubienia.Na przykład rybosomalny rdzeń P zawiera wybrzuszenie U1208 (w Saccharomyces cerevisiae), które przetrwało od E. coli do ludzi i dlatego szacuje się, że ma 3,5 miliarda lat.Podczas syntezy białek to wybrzuszenie pomaga łodydze P poruszać się między konformacją otwartą i zamkniętą, dzięki czemu rybosom może rekrutować czynniki translacyjne i dostarczać je do miejsca aktywnego.W rybosomach E. cuniculi to pogrubienie jest nieobecne;jednak nowe zgrubienie (G883) zlokalizowane tylko w trzech parach zasad może przyczynić się do przywrócenia optymalnej elastyczności łodygi P (ryc. 4c).
Nasze dane dotyczące rRNA bez wybrzuszeń sugerują, że minimalizacja rRNA nie ogranicza się do utraty elementów rRNA na powierzchni rybosomu, ale może również obejmować jądro rybosomu, tworząc specyficzny dla pasożyta defekt molekularny, który nie został opisany w wolno żyjących komórkach.obserwowane są żywe gatunki.
Po modelowaniu kanonicznych białek rybosomalnych i rRNA odkryliśmy, że konwencjonalne składniki rybosomalne nie mogą wyjaśnić trzech części obrazu krio-EM.Dwa z tych fragmentów to małe cząsteczki (ryc. 5, ryc. Uzupełniająca 8).Pierwszy segment jest umieszczony pomiędzy białkami rybosomalnymi uL15 i eL18 w pozycji zwykle zajmowanej przez C-koniec eL18, który jest skrócony w E. cuniculi.Chociaż nie możemy określić tożsamości tej cząsteczki, rozmiar i kształt tej wyspy gęstości dobrze wyjaśnia obecność cząsteczek spermidyny.Jego wiązanie z rybosomem jest stabilizowane przez mutacje specyficzne dla mikrosporydiów w białkach uL15 (Asp51 i Arg56), które wydają się zwiększać powinowactwo rybosomu do tej małej cząsteczki, ponieważ pozwalają uL15 owinąć małą cząsteczkę w strukturę rybosomu.Rysunek uzupełniający 2).8, dane dodatkowe 1, 2).
Obrazowanie Cryo-EM pokazujące obecność nukleotydów poza rybozą związaną z rybosomem E. cuniculi.W rybosomie E. cuniculi nukleotyd ten zajmuje to samo miejsce, co nukleotyd 25S rRNA A3186 (numeracja Saccharomyces cerevisiae) w większości innych rybosomów eukariotycznych.b W strukturze rybosomalnej E. cuniculi nukleotyd ten znajduje się pomiędzy białkami rybosomalnymi uL9 i eL20, stabilizując w ten sposób kontakt między dwoma białkami.analiza zachowania sekwencji cd eL20 wśród gatunków mikrosporydiów.Drzewo filogenetyczne gatunków Microsporidia ( c ) i dopasowanie wielu sekwencji białka eL20 ( d ) pokazują, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są konserwowane w większości typowych Microsporidia, z wyjątkiem S. lophii, z wyjątkiem wczesnego rozgałęzienia Microsporidia, które zachowało rozszerzenie rRNA ES39L.e Ta figura pokazuje, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są obecne tylko w eL20 wysoce zredukowanego genomu mikrosporydiów, ale nie w innych eukariontach.Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że rybosomy Microsporydian wykształciły miejsce wiązania nukleotydów, które wydaje się wiązać cząsteczki AMP i wykorzystywać je do stabilizowania interakcji białko-białko w strukturze rybosomu.Wysoka konserwacja tego miejsca wiązania w Microsporidia i jego brak u innych eukariontów sugeruje, że to miejsce może zapewnić selektywną przewagę przeżycia dla Microsporidia.Zatem kieszeń wiążąca nukleotydy w rybosomie mikrosporydiów nie wydaje się być zdegenerowaną cechą lub końcową formą degradacji rRNA, jak opisano wcześniej, ale raczej użyteczną innowacją ewolucyjną, która pozwala rybosomowi mikrosporydiów bezpośrednio wiązać małe cząsteczki, wykorzystując je jako molekularne bloki budulcowe.budulec dla rybosomów.To odkrycie sprawia, że ​​rybosom mikrosporydiów jest jedynym rybosomem, o którym wiadomo, że wykorzystuje pojedynczy nukleotyd jako strukturalny element budulcowy.f Hipotetyczny szlak ewolucyjny wywodzący się z wiązania nukleotydów.
Druga gęstość o niskiej masie cząsteczkowej znajduje się na granicy między białkami rybosomalnymi uL9 i eL30 (ryc. 5a).Interfejs ten został wcześniej opisany w strukturze rybosomu Saccharomyces cerevisiae jako miejsce wiązania nukleotydu 25S rRNA A3186 (część przedłużenia rRNA ES39L)38.Wykazano, że w zdegenerowanych rybosomach P. locustae ES39L interfejs ten wiąże nieznany pojedynczy nukleotyd 31 i przyjmuje się, że nukleotyd ten jest zredukowaną końcową formą rRNA, w której długość rRNA wynosi ~130-230 zasad.ES39L jest zredukowany do pojedynczego nukleotydu 32.43.Nasze obrazy krio-EM potwierdzają ideę, że gęstość można wyjaśnić nukleotydami.Jednak wyższa rozdzielczość naszej struktury wykazała, że ​​​​ten nukleotyd jest cząsteczką pozarybosomalną, prawdopodobnie AMP (ryc. 5a, b).
Następnie zapytaliśmy, czy miejsce wiązania nukleotydu pojawiło się w rybosomie E. cuniculi, czy też istniało wcześniej.Ponieważ w wiązaniu nukleotydów pośredniczą głównie reszty Phe170 i Lys172 w białku rybosomalnym eL30, oceniliśmy zachowanie tych reszt w 4396 reprezentatywnych eukariontach.Podobnie jak w przypadku uL15 powyżej, stwierdziliśmy, że reszty Phe170 i Lys172 są wysoce konserwatywne tylko w typowych Microsporidia, ale nieobecne w innych eukariotach, w tym w nietypowych Microsporidia Mitosporidium i Amphiamblys, w których fragment rRNA ES39L nie jest zredukowany 44, 45, 46 (ryc. 5c).-mi).
Podsumowując, dane te potwierdzają pogląd, że E. cuniculi i prawdopodobnie inne kanoniczne mikrosporydia wyewoluowały zdolność do skutecznego wychwytywania dużej liczby małych metabolitów w strukturze rybosomu, aby zrekompensować spadek poziomu rRNA i białka.W ten sposób rozwinęli unikalną zdolność wiązania nukleotydów poza rybosomem, co pokazuje, że pasożytnicze struktury molekularne kompensują to poprzez wychwytywanie obfitych małych metabolitów i wykorzystywanie ich jako naśladowców strukturalnych zdegradowanych fragmentów RNA i białek..
Trzecia niesymulowana część naszej mapy krio-EM, znaleziona w dużej podjednostce rybosomu.Stosunkowo wysoka rozdzielczość (2,6 Å) naszej mapy sugeruje, że gęstość ta należy do białek z unikalnymi kombinacjami dużych reszt łańcuchów bocznych, co pozwoliło nam zidentyfikować tę gęstość jako nieznane wcześniej białko rybosomalne, które zidentyfikowaliśmy jako nazwane msL2 (białko specyficzne dla mikrosporydów L2) (metody, ryc. 6).Nasze poszukiwanie homologii wykazało, że msL2 jest konserwowany w kladzie Microsporidia z rodzaju Encephaliter i Orosporidium, ale nieobecny w innych gatunkach, w tym innych Microsporidia.W strukturze rybosomu msL2 zajmuje lukę utworzoną przez utratę wydłużonego rRNA ES31L.W tej pustce msL2 pomaga stabilizować fałdowanie rRNA i może kompensować utratę ES31L (ryc. 6).
a Gęstość elektronów i model białka rybosomalnego specyficznego dla Microsporidia msL2 znalezionego w rybosomach E. cuniculi.b Większość rybosomów eukariotycznych, w tym rybosom 80S Saccharomyces cerevisiae, utraciła amplifikację rRNA ES19L u większości gatunków Microsporidian.Wcześniej ustalona struktura rybosomu V. necatrix microsporidia sugeruje, że utrata ES19L u tych pasożytów jest kompensowana przez ewolucję nowego rybosomalnego białka msL1.W tym badaniu odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi rozwinął również dodatkowe białko naśladujące rybosomalny RNA jako pozorną kompensację utraty ES19L.Jednak msL2 (obecnie opisywane jako hipotetyczne białko ECU06_1135) i msL1 mają różne pochodzenie strukturalne i ewolucyjne.c To odkrycie generacji niezwiązanych ewolucyjnie białek rybosomalnych msL1 i msL2 sugeruje, że jeśli rybosomy gromadzą szkodliwe mutacje w swoim rRNA, mogą osiągnąć bezprecedensowy poziom różnorodności składu nawet w niewielkim podzbiorze blisko spokrewnionych gatunków.To odkrycie może pomóc wyjaśnić pochodzenie i ewolucję rybosomu mitochondrialnego, który jest znany z wysoce zredukowanego rRNA i nieprawidłowej zmienności składu białek u różnych gatunków.
Następnie porównaliśmy białko msL2 z wcześniej opisanym białkiem msL1, jedynym znanym rybosomalnym białkiem specyficznym dla mikrosporydiów znalezionym w rybosomie V. necatrix.Chcieliśmy sprawdzić, czy msL1 i msL2 są ewolucyjnie powiązane.Nasza analiza wykazała, że ​​msL1 i msL2 zajmują tę samą jamę w strukturze rybosomu, ale mają różne struktury pierwszorzędowe i trzeciorzędowe, co wskazuje na ich niezależne pochodzenie ewolucyjne (ryc. 6).Zatem nasze odkrycie msL2 dostarcza dowodów na to, że grupy zwartych gatunków eukariotycznych mogą niezależnie ewoluować strukturalnie odrębne białka rybosomalne, aby zrekompensować utratę fragmentów rRNA.To odkrycie jest godne uwagi, ponieważ większość cytoplazmatycznych rybosomów eukariotycznych zawiera niezmienne białko, w tym tę samą rodzinę 81 białek rybosomalnych.Pojawienie się msL1 i msL2 w różnych kladach mikrosporydiów w odpowiedzi na utratę wydłużonych segmentów rRNA sugeruje, że degradacja architektury molekularnej pasożyta powoduje, że pasożyty poszukują mutacji kompensacyjnych, co może ostatecznie doprowadzić do ich nabycia w różnych populacjach pasożytów.Struktury.
Wreszcie, kiedy nasz model został ukończony, porównaliśmy skład rybosomu E. cuniculi z przewidywanym na podstawie sekwencji genomu.Wcześniej uważano, że w genomie E. cuniculi brakuje kilku białek rybosomalnych, w tym eL14, eL38, eL41 i eS30, z powodu widocznego braku ich homologów w genomie E. cuniculi.Utratę wielu białek rybosomalnych przewiduje się również w przypadku większości innych wysoce zredukowanych pasożytów wewnątrzkomórkowych i endosymbiontów.Na przykład, chociaż większość wolno żyjących bakterii zawiera tę samą rodzinę 54 białek rybosomalnych, tylko 11 z tych rodzin białek ma wykrywalne homologi w każdym analizowanym genomie bakterii ograniczonych do gospodarza.Na poparcie tego poglądu, doświadczalnie zaobserwowano utratę białek rybosomalnych w mikrosporidia V. necatrix i P. locustae, którym brakuje białek eL38 i eL4131,32.
Jednak nasze struktury pokazują, że tylko eL38, eL41 i eS30 są faktycznie tracone w rybosomie E. cuniculi.Białko eL14 było konserwowane, a nasza struktura pokazała, dlaczego tego białka nie można znaleźć w wyszukiwaniu homologii (ryc. 7).W rybosomach E. cuniculi większość miejsca wiązania eL14 jest tracona z powodu degradacji amplifikowanego przez rRNA ES39L.Pod nieobecność ES39L eL14 utracił większość swojej struktury drugorzędowej i tylko 18% sekwencji eL14 było identycznych w E. cuniculi i S. cerevisiae.To słabe zachowanie sekwencji jest niezwykłe, ponieważ nawet Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens – organizmy, które ewoluowały w odstępie 1,5 miliarda lat – mają ponad 51% tych samych reszt w eL14.Ta anomalna utrata ochrony wyjaśnia, dlaczego eL14 E. cuniculi jest obecnie opisywane jako domniemane białko M970_061160, a nie jako białko rybosomalne eL1427.
oraz Rybosom Microsporidia utracił rozszerzenie rRNA ES39L, co częściowo wyeliminowało miejsce wiązania białka rybosomalnego eL14.Pod nieobecność ES39L białko mikrospory eL14 ulega utracie struktury drugorzędowej, w której dawna α-helisa wiążąca rRNA ulega degeneracji do pętli o minimalnej długości.b Dopasowanie wielu sekwencji pokazuje, że białko eL14 jest wysoce konserwatywne w gatunkach eukariotycznych (57% identyczności sekwencji między homologami drożdży i ludzkimi), ale słabo konserwowane i rozbieżne w mikrosporydiach (w których nie więcej niż 24% reszt jest identycznych z homologiem eL14).z S. cerevisiae lub H. sapiens).Ta słaba konserwacja sekwencji i zmienność struktury drugorzędowej wyjaśnia, dlaczego homolog eL14 nigdy nie został znaleziony w E. cuniculi i dlaczego uważa się, że to białko zostało utracone w E. cuniculi.W przeciwieństwie do tego, E. cuniculi eL14 był wcześniej oznaczony jako domniemane białko M970_061160.Ta obserwacja sugeruje, że różnorodność genomu mikrosporydiów jest obecnie przeceniana: niektóre geny, które obecnie uważa się za utracone w mikrosporydiach, są w rzeczywistości zachowane, chociaż w wysoce zróżnicowanych formach;zamiast tego uważa się, że niektóre kodują geny mikrosporydiów dla białek specyficznych dla robaków (np. hipotetyczne białko M970_061160) w rzeczywistości kodują bardzo zróżnicowane białka występujące u innych eukariontów.
To odkrycie sugeruje, że denaturacja rRNA może prowadzić do dramatycznej utraty zachowania sekwencji w sąsiednich białkach rybosomalnych, czyniąc te białka niewykrywalnymi do wyszukiwania homologii.W związku z tym możemy przeceniać rzeczywisty stopień degradacji molekularnej w organizmach o małym genomie, ponieważ niektóre białka uważane za utracone faktycznie utrzymują się, chociaż w wysoce zmienionych formach.
W jaki sposób pasożyty mogą zachować funkcję swoich maszyn molekularnych w warunkach ekstremalnej redukcji genomu?Nasze badanie odpowiada na to pytanie, opisując złożoną strukturę molekularną (rybosom) E. cuniculi, organizmu o jednym z najmniejszych genomów eukariotycznych.
Od prawie dwudziestu lat wiadomo, że cząsteczki białka i RNA u pasożytniczych drobnoustrojów często różnią się od ich cząsteczek homologicznych u wolno żyjących gatunków, ponieważ brakuje im centrów kontroli jakości, są one zredukowane do 50% ich wielkości u wolno żyjących drobnoustrojów itp.wiele wyniszczających mutacji, które upośledzają fałdowanie i funkcjonowanie.Na przykład oczekuje się, że rybosomy małych organizmów genomowych, w tym wielu wewnątrzkomórkowych pasożytów i endosymbiontów, będą pozbawione kilku białek rybosomalnych i do jednej trzeciej nukleotydów rRNA w porównaniu z wolno żyjącymi gatunkami 27, 29, 30, 49. Jednak sposób, w jaki te cząsteczki funkcjonują u pasożyta, pozostaje w dużej mierze tajemnicą, badaną głównie za pomocą genomiki porównawczej.
Nasze badanie pokazuje, że struktura makrocząsteczek może ujawnić wiele aspektów ewolucji, które są trudne do wydobycia z tradycyjnych porównawczych badań genomicznych pasożytów wewnątrzkomórkowych i innych organizmów ograniczonych do żywiciela (Uzupełniająca Ryc. 7).Przykładowo przykład białka eL14 pokazuje, że można przecenić rzeczywisty stopień degradacji aparatu molekularnego u gatunków pasożytniczych.Obecnie uważa się, że pasożyty wywołujące zapalenie mózgu mają setki genów specyficznych dla mikrosporydiów.Jednak nasze wyniki pokazują, że niektóre z tych pozornie specyficznych genów są w rzeczywistości po prostu bardzo różnymi wariantami genów, które są powszechne u innych eukariontów.Co więcej, przykład białka msL2 pokazuje, jak przeoczamy nowe białka rybosomalne i nie doceniamy zawartości pasożytniczych maszyn molekularnych.Przykład małych cząsteczek pokazuje, jak możemy przeoczyć najbardziej pomysłowe innowacje w pasożytniczych strukturach molekularnych, które mogą nadać im nową aktywność biologiczną.
Podsumowując, wyniki te poprawiają nasze zrozumienie różnic między strukturami molekularnymi organizmów o ograniczonym gospodarzu i ich odpowiednikami w organizmach wolno żyjących.Pokazujemy, że maszyny molekularne, od dawna uważane za zredukowane, zdegenerowane i podlegające różnym wyniszczającym mutacjom, zamiast tego mają zestaw systematycznie pomijanych niezwykłych cech strukturalnych.
Z drugiej strony nieobjętościowe fragmenty rRNA i fragmenty fuzyjne, które znaleźliśmy w rybosomach E. cuniculi sugerują, że redukcja genomu może zmienić nawet te części podstawowej maszynerii molekularnej, które są zachowane w trzech domenach życia – po prawie 3,5 miliarda lat.niezależna ewolucja gatunków.
Wolne od wybrzuszeń i połączone fragmenty rRNA w rybosomach E. cuniculi są szczególnie interesujące w świetle wcześniejszych badań cząsteczek RNA w bakteriach endosymbiotycznych.Na przykład wykazano, że w endosymbioncie mszyc Buchnera aphidicola cząsteczki rRNA i tRNA mają struktury wrażliwe na temperaturę z powodu odchylenia składu A + T i wysokiego udziału niekanonicznych par zasad20,50.Obecnie uważa się, że te zmiany w RNA, jak również zmiany w cząsteczkach białek, są odpowiedzialne za nadmierną zależność endosymbiontów od partnerów i niezdolność endosymbiontów do przenoszenia ciepła 21, 23 .Chociaż rRNA pasożytniczych mikrosporydiów ma strukturalnie różne zmiany, charakter tych zmian sugeruje, że zmniejszona stabilność termiczna i większa zależność od białek opiekuńczych mogą być wspólnymi cechami cząsteczek RNA w organizmach o zredukowanych genomach.
Z drugiej strony nasze struktury pokazują, że mikrosporydia pasożytów wyewoluowały wyjątkową zdolność do opierania się szeroko konserwatywnym rRNA i fragmentom białek, rozwijając zdolność do wykorzystywania obfitych i łatwo dostępnych małych metabolitów jako strukturalnych naśladowców zdegenerowanych fragmentów rRNA i białek.Degradacja struktury molekularnej..Opinię tę potwierdza fakt, że małe cząsteczki, które kompensują utratę fragmentów białek w rRNA i rybosomach E. cuniculi wiążą się z resztami specyficznymi dla mikrosporydiów w białkach uL15 i eL30.Sugeruje to, że wiązanie małych cząsteczek z rybosomami może być produktem selekcji pozytywnej, w której wyselekcjonowano specyficzne dla Microsporidia mutacje w białkach rybosomalnych ze względu na ich zdolność do zwiększania powinowactwa rybosomów do małych cząsteczek, co może prowadzić do bardziej wydajnych organizmów rybosomalnych.Odkrycie ujawnia inteligentną innowację w strukturze molekularnej pasożytów drobnoustrojów i pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób struktury molekularne pasożytów zachowują swoją funkcję pomimo ewolucji redukcyjnej.
Obecnie identyfikacja tych małych cząsteczek pozostaje niejasna.Nie jest jasne, dlaczego wygląd tych małych cząsteczek w strukturze rybosomu różni się między gatunkami mikrosporydiów.W szczególności nie jest jasne, dlaczego wiązanie nukleotydów obserwuje się w rybosomach E. cuniculi i P. locustae, a nie w rybosomach V. necatrix, pomimo obecności reszty F170 w białkach eL20 i K172 V. necatrix.Ta delecja może być spowodowana przez resztę 43 uL6 (znajdującą się w sąsiedztwie kieszeni wiążącej nukleotyd), którą jest tyrozyna w V. necatrix, a nie treonina w E. cuniculi i P. locustae.Masywny aromatyczny łańcuch boczny Tyr43 może zakłócać wiązanie nukleotydów z powodu nakładania się sterycznego.Alternatywnie, pozorna delecja nukleotydów może wynikać z niskiej rozdzielczości obrazowania krio-EM, co utrudnia modelowanie fragmentów rybosomów V. necatrix.
Z drugiej strony nasza praca sugeruje, że proces rozpadu genomu może być siłą wynalazczą.W szczególności struktura rybosomu E. cuniculi sugeruje, że utrata rRNA i fragmentów białka w rybosomie mikrosporydiów tworzy presję ewolucyjną, która sprzyja zmianom w strukturze rybosomu.Warianty te występują daleko od miejsca aktywnego rybosomu i wydają się pomagać w utrzymaniu (lub przywracaniu) optymalnego zestawu rybosomów, który w przeciwnym razie zostałby zakłócony przez zredukowany rRNA.Sugeruje to, że wydaje się, że główna innowacja rybosomu mikrosporydiów przekształciła się w potrzebę buforowania dryfu genów.
Być może najlepiej ilustruje to wiązanie nukleotydów, czego jak dotąd nie zaobserwowano u innych organizmów.Fakt, że reszty wiążące nukleotydy są obecne w typowych mikrosporydiach, ale nie w innych eukariotach, sugeruje, że miejsca wiążące nukleotydy nie są tylko reliktami czekającymi na zniknięcie lub ostatecznym miejscem przywrócenia rRNA do postaci pojedynczych nukleotydów.Zamiast tego ta strona wydaje się użyteczną funkcją, która mogła ewoluować w ciągu kilku rund pozytywnej selekcji.Miejsca wiązania nukleotydów mogą być produktem ubocznym doboru naturalnego: po degradacji ES39L mikrosporydia są zmuszone do poszukiwania kompensacji w celu przywrócenia optymalnej biogenezy rybosomów pod nieobecność ES39L.Ponieważ ten nukleotyd może naśladować kontakty molekularne nukleotydu A3186 w ES39L, cząsteczka nukleotydu staje się budulcem rybosomu, którego wiązanie jest dodatkowo ulepszane przez mutację sekwencji eL30.
Jeśli chodzi o molekularną ewolucję pasożytów wewnątrzkomórkowych, nasze badanie pokazuje, że siły darwinowskiej selekcji naturalnej i dryfu genetycznego rozpadu genomu nie działają równolegle, ale oscylują.Po pierwsze, dryf genetyczny eliminuje ważne cechy biomolekuł, przez co pilnie potrzebna jest kompensacja.Tylko wtedy, gdy pasożyty zaspokoją tę potrzebę poprzez darwinowską selekcję naturalną, ich makrocząsteczki będą miały szansę rozwinąć swoje najbardziej imponujące i innowacyjne cechy.Co ważne, ewolucja miejsc wiązania nukleotydów w rybosomie E. cuniculi sugeruje, że ten schemat ewolucji molekularnej oparty na zasadzie strata-zysk nie tylko amortyzuje szkodliwe mutacje, ale czasami nadaje zupełnie nowe funkcje pasożytniczym makromolekułom.
Pomysł ten jest zgodny z teorią ruchomej równowagi Sewella Wrighta, która głosi, że ścisły system doboru naturalnego ogranicza zdolność organizmów do innowacji51,52,53.Jeśli jednak dryf genetyczny zakłóci dobór naturalny, dryf ten może spowodować zmiany, które same w sobie nie są adaptacyjne (ani nawet szkodliwe), ale prowadzą do dalszych zmian, które zapewniają wyższą sprawność lub nową aktywność biologiczną.Nasze ramy wspierają tę ideę, ilustrując, że ten sam typ mutacji, który zmniejsza fałdowanie i funkcję biomolekuły, wydaje się być głównym czynnikiem wyzwalającym jej poprawę.Zgodnie z modelem ewolucyjnym, w którym wszyscy wygrywają, nasze badanie pokazuje, że rozpad genomu, tradycyjnie postrzegany jako proces degeneracyjny, jest również głównym motorem innowacji, czasami, a może nawet często, umożliwiając makrocząsteczkom nabywanie nowych aktywności pasożytniczych.może z nich korzystać.