Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Ewolucja pasożytów mikrobiologicznych obejmuje przeciwdziałanie między selekcją naturalną, która powoduje poprawę pasożytów, a dryfem genetycznym, który powoduje, że pasożyty tracą geny i gromadzą szkodliwe mutacje. Tutaj, aby zrozumieć, jak to przeciwdziałanie zachodzi w skali pojedynczej makrocząsteczki, opisujemy strukturę kriomikroskopii elektronowej rybosomu Encephalitozoon cuniculi, organizmu eukariotycznego o jednym z najmniejszych genomów w naturze. Ekstremalna redukcja rRNA w rybosomach E. cuniculi wiąże się z bezprecedensowymi zmianami strukturalnymi, takimi jak ewolucja wcześniej nieznanych połączonych łączników rRNA i rRNA bez wybrzuszeń. Ponadto rybosom E. cuniculi przetrwał utratę fragmentów rRNA i białek, rozwijając zdolność do wykorzystywania małych cząsteczek jako strukturalnych naśladowców zdegradowanych fragmentów rRNA i białek. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że struktury molekularne, które od dawna uważano za zredukowane, zdegenerowane i podatne na wyniszczające mutacje, posiadają szereg mechanizmów kompensacyjnych, które utrzymują je aktywnymi pomimo ekstremalnych skurczów molekularnych.
Ponieważ większość grup pasożytów mikrobiologicznych ma unikalne narzędzia molekularne do wykorzystywania swoich gospodarzy, często musimy opracowywać różne terapie dla różnych grup pasożytów1,2. Jednak nowe dowody sugerują, że niektóre aspekty ewolucji pasożytów są zbieżne i w dużej mierze przewidywalne, co wskazuje na potencjalną podstawę dla szerokich interwencji terapeutycznych w pasożytach mikrobiologicznych3,4,5,6,7,8,9.
Poprzednie prace zidentyfikowały powszechny trend ewolucyjny u pasożytów mikrobiologicznych zwany redukcją genomu lub rozpadem genomu10,11,12,13. Obecne badania pokazują, że gdy mikroorganizmy rezygnują ze swojego wolnożyjącego trybu życia i stają się pasożytami wewnątrzkomórkowymi (lub endosymbiontami), ich genomy przechodzą powolne, ale niesamowite metamorfozy na przestrzeni milionów lat9,11. W procesie znanym jako rozpad genomu pasożyty mikrobiologiczne gromadzą szkodliwe mutacje, które zamieniają wiele wcześniej ważnych genów w pseudogeny, co prowadzi do stopniowej utraty genów i załamania mutacyjnego14,15. To załamanie może zniszczyć do 95% genów u najstarszych organizmów wewnątrzkomórkowych w porównaniu do blisko spokrewnionych gatunków wolno żyjących. Tak więc ewolucja pasożytów wewnątrzkomórkowych jest przeciąganiem liny między dwiema przeciwnymi siłami: darwinowską selekcją naturalną, prowadzącą do ulepszenia pasożytów, i załamaniem genomu, rzucającym pasożyty w zapomnienie. W jaki sposób pasożytowi udało się wyjść z tej rywalizacji i zachować aktywność swojej struktury molekularnej, pozostaje niejasne.
Chociaż mechanizm rozpadu genomu nie jest w pełni poznany, wydaje się, że występuje on głównie z powodu częstego dryfu genetycznego. Ponieważ pasożyty żyją w małych, bezpłciowych i genetycznie ograniczonych populacjach, nie mogą skutecznie eliminować szkodliwych mutacji, które czasami występują podczas replikacji DNA. Prowadzi to do nieodwracalnej akumulacji szkodliwych mutacji i redukcji genomu pasożyta. W rezultacie pasożyt nie tylko traci geny, które nie są już niezbędne do jego przetrwania w środowisku wewnątrzkomórkowym. To niezdolność populacji pasożytów do skutecznego eliminowania sporadycznych szkodliwych mutacji powoduje, że mutacje te kumulują się w całym genomie, w tym w ich najważniejszych genach.
Większość naszej obecnej wiedzy na temat redukcji genomu opiera się wyłącznie na porównaniach sekwencji genomu, przy czym mniejszą uwagę zwraca się na zmiany w rzeczywistych cząsteczkach, które pełnią funkcje porządkowe i służą jako potencjalne cele leków. Badania porównawcze wykazały, że obciążenie szkodliwymi wewnątrzkomórkowymi mutacjami mikrobiologicznymi wydaje się predysponować białka i kwasy nukleinowe do nieprawidłowego fałdowania i agregacji, czyniąc je bardziej zależnymi od chaperonów i nadwrażliwymi na ciepło19,20,21,22,23. Ponadto różne pasożyty — niezależne ewolucje czasami rozdzielone nawet o 2,5 miliarda lat — doświadczyły podobnej utraty centrów kontroli jakości w mechanizmach syntezy białek5,6 i naprawy DNA24. Jednak niewiele wiadomo o wpływie wewnątrzkomórkowego stylu życia na wszystkie inne właściwości makrocząsteczek komórkowych, w tym na adaptację molekularną do rosnącego obciążenia szkodliwymi mutacjami.
W tej pracy, aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych wewnątrzkomórkowych mikroorganizmów, określiliśmy strukturę rybosomów wewnątrzkomórkowego pasożyta Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi to grzybopodobny organizm należący do grupy pasożytniczych mikrosporydiów, które mają niezwykle małe genomy eukariotyczne i dlatego są wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania rozpadu genomu25,26,27,28,29,30. Niedawno określono strukturę rybosomu kriomikroskopii elektronowej dla umiarkowanie zredukowanych genomów Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genom ~3,2 Mb). Struktury te sugerują, że pewna utrata amplifikacji rRNA jest kompensowana przez rozwój nowych kontaktów między sąsiadującymi białkami rybosomalnymi lub nabycie nowych białek rybosomalnych msL131,32. Gatunek Encephalitozoon (genom ~2,5 miliona pb), wraz z ich najbliższym krewnym Ordospora, wykazują najwyższy stopień redukcji genomu u eukariotów – mają mniej niż 2000 genów kodujących białka i oczekuje się, że ich rybosomy nie tylko są pozbawione fragmentów ekspansji rRNA (fragmentów rRNA, które odróżniają rybosomy eukariotyczne od rybosomów bakteryjnych), ale także mają cztery białka rybosomalne ze względu na brak homologów w genomie E. cuniculi26,27,28. Dlatego też doszliśmy do wniosku, że rybosom E. cuniculi może ujawnić dotychczas nieznane strategie molekularnej adaptacji do rozpadu genomu.
Nasza struktura kriomikroskopii elektronowej przedstawia najmniejszy eukariotyczny rybosom cytoplazmatyczny, który ma zostać scharakteryzowany, i dostarcza wglądu w to, jak ostateczny stopień redukcji genomu wpływa na strukturę, montaż i ewolucję maszynerii molekularnej, która jest integralną częścią komórki. Odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi narusza wiele powszechnie konserwowanych zasad składania RNA i montażu rybosomu, i odkryliśmy nowe, wcześniej nieznane białko rybosomalne. Zupełnie niespodziewanie pokazujemy, że rybosomy mikrosporidii rozwinęły zdolność wiązania małych cząsteczek i stawiamy hipotezę, że skrócenia w rRNA i białkach wyzwalają innowacje ewolucyjne, które mogą ostatecznie nadać rybosomowi użyteczne właściwości.
Aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych w organizmach wewnątrzkomórkowych, postanowiliśmy wyizolować zarodniki E. cuniculi z kultur zakażonych komórek ssaków, aby oczyścić ich rybosomy i określić strukturę tych rybosomów. Trudno jest uzyskać dużą liczbę pasożytniczych mikrosporydiów, ponieważ mikrosporydia nie mogą być hodowane w pożywce. Zamiast tego rosną i rozmnażają się tylko wewnątrz komórki gospodarza. Dlatego, aby uzyskać biomasę E. cuniculi do oczyszczania rybosomów, zainfekowaliśmy linię komórek nerki ssaków RK13 zarodnikami E. cuniculi i hodowaliśmy te zakażone komórki przez kilka tygodni, aby umożliwić E. cuniculi wzrost i namnażanie się. Używając monowarstwy zakażonych komórek o powierzchni około pół metra kwadratowego, byliśmy w stanie oczyścić około 300 mg zarodników Microsporidia i użyć ich do wyizolowania rybosomów. Następnie rozbiliśmy oczyszczone zarodniki szklanymi kulkami i wyizolowaliśmy surowe rybosomy, stosując stopniową frakcjonację lizatów glikolem polietylenowym. Pozwoliło nam to uzyskać około 300 µg surowych rybosomów E. cuniculi do analizy strukturalnej.
Następnie zebraliśmy obrazy kriomikroskopii elektronowej przy użyciu uzyskanych próbek rybosomów i przetworzyliśmy te obrazy przy użyciu masek odpowiadających dużej podjednostce rybosomalnej, małej głowie podjednostki i małej podjednostce. Podczas tego procesu zebraliśmy obrazy około 108 000 cząsteczek rybosomalnych i obliczyliśmy obrazy kriomikroskopii elektronowej o rozdzielczości 2,7 Å (rysunki uzupełniające 1-3). Następnie wykorzystaliśmy obrazy kriomikroskopii elektronowej do modelowania rRNA, białka rybosomalnego i czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomami E. cuniculi (ryc. 1a, b).
a Struktura rybosomu E. cuniculi w kompleksie z czynnikiem hibernacji Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomem E. cuniculi. c Mapa struktury drugorzędowej porównująca odzyskany rRNA w gatunkach Microsporidia do znanych struktur rybosomalnych. Panele pokazują lokalizację wzmocnionych fragmentów rRNA (ES) i miejsc aktywnych rybosomu, w tym miejsca dekodowania (DC), pętli sarcyny (SRL) i centrum peptydylotransferazy (PTC). d Gęstość elektronów odpowiadająca centrum peptydylotransferazy rybosomu E. cuniculi sugeruje, że to miejsce katalityczne ma taką samą strukturę u pasożyta E. cuniculi i jego żywicieli, w tym H. sapiens. e, f Odpowiednia gęstość elektronowa centrum dekodującego (e) i schematyczna struktura centrum dekodującego (f) wskazują, że E. cuniculi ma reszty U1491 zamiast A1491 (numeracja E. coli) u wielu innych eukariotów. Ta zmiana sugeruje, że E. cuniculi może być wrażliwy na antybiotyki, które celują w to miejsce aktywne.
W przeciwieństwie do wcześniej ustalonych struktur rybosomów V. necatrix i P. locustae (obie struktury reprezentują tę samą rodzinę mikrosporydiów Nosematidae i są do siebie bardzo podobne), 31,32 rybosomy E. cuniculi przechodzą liczne procesy fragmentacji rRNA i białka. Dalszą denaturację (rysunki uzupełniające 4-6). W rRNA najbardziej uderzające zmiany obejmowały całkowitą utratę amplifikowanego fragmentu 25S rRNA ES12L i częściową degenerację helis h39, h41 i H18 (rys. 1c, rys. uzupełniający 4). Wśród białek rybosomalnych najbardziej rzucające się w oczy zmiany obejmowały całkowitą utratę białka eS30 i skrócenie białek eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (rysunki uzupełniające 4, 5).
Tak więc ekstremalna redukcja genomów gatunków Encephalotozoon/Ordospora znajduje odzwierciedlenie w ich strukturze rybosomów: rybosomy E. cuniculi doświadczają najbardziej dramatycznej utraty zawartości białka w eukariotycznych rybosomach cytoplazmatycznych podlegających charakterystyce strukturalnej, a nawet nie mają tych fragmentów rRNA i białka, które są szeroko konserwowane nie tylko u eukariotów, ale także w trzech domenach życia. Struktura rybosomu E. cuniculi dostarcza pierwszego modelu molekularnego tych zmian i ujawnia wydarzenia ewolucyjne, które zostały przeoczone zarówno przez porównawczą genomikę, jak i badania wewnątrzkomórkowej struktury biomolekularnej (Rys. uzupełniający 7). Poniżej opisujemy każde z tych wydarzeń wraz z ich prawdopodobnymi ewolucyjnymi początkami i ich potencjalnym wpływem na funkcję rybosomu.
Następnie odkryliśmy, że oprócz dużych skróceń rRNA, rybosomy E. cuniculi mają wariacje rRNA w jednym ze swoich aktywnych miejsc. Chociaż centrum peptydylotransferazy rybosomu E. cuniculi ma taką samą strukturę jak inne rybosomy eukariotyczne (ryc. 1d), centrum dekodujące różni się ze względu na wariację sekwencji przy nukleotydzie 1491 (numeracja E. coli, ryc. 1e, f). Ta obserwacja jest ważna, ponieważ miejsce dekodowania rybosomów eukariotycznych zazwyczaj zawiera reszty G1408 i A1491 w porównaniu z resztami typu bakteryjnego A1408 i G1491. Ta wariacja leży u podstaw różnej wrażliwości rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych na rodzinę aminoglikozydowych antybiotyków rybosomalnych i inne małe cząsteczki, które celują w miejsce dekodowania. W miejscu dekodowania rybosomu E. cuniculi reszta A1491 została zastąpiona przez U1491, co potencjalnie tworzy unikalny interfejs wiążący dla małych cząsteczek ukierunkowanych na to miejsce aktywne. Ta sama odmiana A14901 jest również obecna w innych mikrosporidiach, takich jak P. locustae i V. necatrix, co sugeruje, że jest szeroko rozpowszechniona wśród gatunków mikrosporidiów (ryc. 1f).
Ponieważ nasze próbki rybosomów E. cuniculi zostały wyizolowane z metabolicznie nieaktywnych zarodników, przetestowaliśmy mapę kriomikroskopii elektronowej E. cuniculi pod kątem wcześniej opisanego wiązania rybosomu w warunkach stresu lub głodu. Czynniki hibernacji 31,32,36,37, 38. Dopasowaliśmy wcześniej ustaloną strukturę hibernującego rybosomu do mapy kriomikroskopii elektronowej rybosomu E. cuniculi. Do dokowania użyto rybosomów S. cerevisiae w kompleksie z czynnikiem hibernacji Stm138, rybosomów szarańczy w kompleksie z czynnikiem Lso232 i rybosomów V. necatrix w kompleksie z czynnikami Mdf1 i Mdf231. Jednocześnie znaleźliśmy gęstość kriomikroskopii elektronowej odpowiadającą czynnikowi spoczynku Mdf1. Podobnie jak wiązanie Mdf1 do rybosomu V. necatrix, Mdf1 wiąże się również z rybosomem E. cuniculi, gdzie blokuje miejsce E rybosomu, co może pomagać w udostępnianiu rybosomów, gdy zarodniki pasożyta stają się metabolicznie nieaktywne po inaktywacji organizmu (ryc. 2). ).
Mdf1 blokuje miejsce E rybosomu, co wydaje się pomagać w inaktywacji rybosomu, gdy zarodniki pasożyta stają się metabolicznie nieaktywne. W strukturze rybosomu E. cuniculi odkryliśmy, że Mdf1 tworzy wcześniej nieznany kontakt z łodygą rybosomu L1, częścią rybosomu, która ułatwia uwalnianie deacylowanego tRNA z rybosomu podczas syntezy białka. Kontakty te sugerują, że Mdf1 dysocjuje od rybosomu, wykorzystując ten sam mechanizm, co deacetylowane tRNA, co może stanowić potencjalne wyjaśnienie, w jaki sposób rybosom usuwa Mdf1, aby ponownie aktywować syntezę białka.
Jednak nasza struktura ujawniła nieznany kontakt między Mdf1 a odnogą rybosomu L1 (część rybosomu, która pomaga uwolnić deacylowany tRNA z rybosomu podczas syntezy białka). W szczególności Mdf1 wykorzystuje te same kontakty, co segment łokciowy deacylowanej cząsteczki tRNA (rys. 2). To wcześniej nieznane modelowanie molekularne wykazało, że Mdf1 dysocjuje od rybosomu, wykorzystując ten sam mechanizm, co deacetylowany tRNA, co wyjaśnia, w jaki sposób rybosom usuwa ten czynnik hibernacji, aby ponownie aktywować syntezę białka.
Podczas konstruowania modelu rRNA odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi ma nieprawidłowo złożone fragmenty rRNA, które nazwaliśmy połączonym rRNA (ryc. 3). W rybosomach obejmujących trzy domeny życia rRNA składa się w struktury, w których większość zasad rRNA albo łączy się w pary i składa ze sobą, albo wchodzi w interakcje z białkami rybosomowymi38,39,40. Jednak w rybosomach E. cuniculi rRNA wydają się naruszać tę zasadę składania, przekształcając niektóre ze swoich helis w nieposkładane regiony rRNA.
Struktura helisy rRNA H18 25S w S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi. Zazwyczaj w rybosomach obejmujących trzy domeny życiowe ten łącznik zwija się w helisę RNA zawierającą od 24 do 34 reszt. Natomiast u Microsporidia ten łącznik rRNA jest stopniowo redukowany do dwóch jednoniciowych łączników bogatych w urydynę, zawierających tylko 12 reszt. Większość tych reszt jest wystawiona na działanie rozpuszczalników. Rysunek pokazuje, że pasożytnicze mikrosporidia wydają się naruszać ogólne zasady składania rRNA, gdzie zasady rRNA są zwykle sprzężone z innymi zasadami lub uczestniczą w interakcjach rRNA-białko. W mikrosporidiach niektóre fragmenty rRNA przyjmują niekorzystną strukturę, w której poprzednia helisa rRNA staje się jednoniciowym fragmentem wydłużonym niemal w linii prostej. Obecność tych niezwykłych regionów pozwala mikrosporydiom rRNA wiązać odległe fragmenty rRNA przy użyciu minimalnej liczby zasad RNA.
Najbardziej uderzający przykład tej ewolucyjnej transformacji można zaobserwować w helisie rRNA 25S H18 (ryc. 3). U gatunków od E. coli do ludzi zasady tej helisy rRNA zawierają 24-32 nukleotydów, tworząc lekko nieregularną helisę. W zidentyfikowanych wcześniej strukturach rybosomalnych z V. necatrix i P. locustae,31,32 zasady helisy H18 są częściowo rozwinięte, ale parowanie zasad nukleotydowych jest zachowane. Jednak w E. cuniculi ten fragment rRNA staje się najkrótszymi łącznikami 228UUUGU232 i 301UUUUUUUU307. W przeciwieństwie do typowych fragmentów rRNA, te bogate w urydynę łączniki nie zwijają się ani nie mają rozległego kontaktu z białkami rybosomalnymi. Zamiast tego przyjmują struktury rozpuszczalnikowo-otwarte i w pełni rozwinięte, w których nici rRNA są wydłużone prawie prosto. Rozciągnięta konformacja wyjaśnia, w jaki sposób E. cuniculi wykorzystuje zaledwie 12 zasad RNA do wypełnienia luki 33 Å między helisami rRNA H16 i H18, podczas gdy inne gatunki potrzebują co najmniej dwukrotnie więcej zasad rRNA, aby wypełnić lukę.
W ten sposób możemy wykazać, że poprzez energetycznie niekorzystne fałdowanie, pasożytnicze mikrosporydia rozwinęły strategię kurczenia nawet tych segmentów rRNA, które pozostają szeroko konserwowane przez gatunki w trzech domenach życia. Najwyraźniej, poprzez gromadzenie mutacji, które przekształcają helisy rRNA w krótkie łączniki poli-U, E. cuniculi może tworzyć niezwykłe fragmenty rRNA zawierające jak najmniej nukleotydów do ligacji dystalnych fragmentów rRNA. Pomaga to wyjaśnić, w jaki sposób mikrosporydia osiągnęły drastyczną redukcję swojej podstawowej struktury molekularnej bez utraty integralności strukturalnej i funkcjonalnej.
Inną niezwykłą cechą rRNA E. cuniculi jest pojawienie się rRNA bez zgrubień (ryc. 4). Wybrzuszenia to nukleotydy bez par zasad, które wykręcają się z helisy RNA zamiast się w niej chować. Większość wybrzuszeń rRNA działa jak kleje molekularne, pomagając wiązać sąsiadujące białka rybosomalne lub inne fragmenty rRNA. Niektóre z wybrzuszeń działają jak zawiasy, umożliwiając helisie rRNA optymalne zginanie i składanie się w celu produktywnej syntezy białek 41 .
a Wypustka rRNA (numeracja S. cerevisiae) nie występuje w strukturze rybosomu E. cuniculi, ale występuje u większości innych eukariotów b Wewnętrzne rybosomy E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi. pasożytom brakuje wielu starożytnych, wysoce konserwowanych wybrzuszeń rRNA. Te zgrubienia stabilizują strukturę rybosomu; dlatego ich brak w mikrosporidiach wskazuje na zmniejszoną stabilność fałdowania rRNA u pasożytów mikrosporidiów. Porównanie z łodygami P (łodygi L7/L12 u bakterii) pokazuje, że utrata guzków rRNA czasami pokrywa się z pojawieniem się nowych guzków obok utraconych guzków. Helisa H42 w 23S/28S rRNA ma starożytne wybrzuszenie (U1206 w Saccharomyces cerevisiae), którego wiek szacuje się na co najmniej 3,5 miliarda lat ze względu na ochronę w trzech domenach życia. W mikrosporidiach to wybrzuszenie jest wyeliminowane. Jednak obok utraconego wybrzuszenia pojawiło się nowe (A1306 w E. cuniculi).
Co uderzające, odkryliśmy, że rybosomy E. cuniculi nie mają większości wybrzuszeń rRNA występujących u innych gatunków, w tym ponad 30 wybrzuszeń zachowanych u innych eukariotów (ryc. 4a). Ta utrata eliminuje wiele kontaktów między podjednostkami rybosomów i sąsiadującymi helisami rRNA, czasami tworząc duże puste przestrzenie wewnątrz rybosomu, co sprawia, że ​​rybosom E. cuniculi jest bardziej porowaty w porównaniu do bardziej tradycyjnych rybosomów (ryc. 4b). Co godne uwagi, odkryliśmy, że większość tych wybrzuszeń została utracona również w wcześniej zidentyfikowanych strukturach rybosomów V. necatrix i P. locustae, które zostały przeoczone w poprzednich analizach strukturalnych31,32.
Czasami utracie wybrzuszeń rRNA towarzyszy rozwój nowych wybrzuszeń obok utraconego wybrzuszenia. Na przykład, rybosomalny trzon P zawiera wybrzuszenie U1208 (w Saccharomyces cerevisiae), które przetrwało od E. coli do ludzi i dlatego szacuje się, że ma 3,5 miliarda lat. Podczas syntezy białek wybrzuszenie to pomaga trzonowi P poruszać się między konformacjami otwartymi i zamkniętymi, tak aby rybosom mógł rekrutować czynniki translacyjne i dostarczać je do miejsca aktywnego. W rybosomach E. cuniculi to pogrubienie jest nieobecne; jednak nowe pogrubienie (G883) zlokalizowane tylko w trzech parach zasad może przyczynić się do przywrócenia optymalnej elastyczności trzonu P (ryc. 4c).
Nasze dane dotyczące rRNA bez wybrzuszeń sugerują, że minimalizacja rRNA nie ogranicza się do utraty elementów rRNA na powierzchni rybosomu, ale może obejmować również jądro rybosomu, powodując specyficzny dla pasożyta defekt molekularny, którego nie opisano w komórkach żyjących swobodnie. Nie obserwuje się żadnych żywych gatunków.
Po modelowaniu kanonicznych białek rybosomalnych i rRNA odkryliśmy, że konwencjonalne składniki rybosomalne nie mogą wyjaśnić trzech części obrazu kriomikroskopii elektronowej. Dwa z tych fragmentów to małe cząsteczki pod względem wielkości (ryc. 5, ryc. uzupełniająca 8). Pierwszy segment jest umieszczony pomiędzy białkami rybosomalnymi uL15 i eL18 w pozycji zwykle zajmowanej przez C-koniec eL18, który jest skrócony w E. cuniculi. Chociaż nie możemy ustalić tożsamości tej cząsteczki, rozmiar i kształt tej wyspy gęstości można dobrze wyjaśnić obecnością cząsteczek spermidyny. Jej wiązanie z rybosomem jest stabilizowane przez specyficzne dla mikrosporydiów mutacje w białkach uL15 (Asp51 i Arg56), które wydają się zwiększać powinowactwo rybosomu do tej małej cząsteczki, ponieważ pozwalają uL15 owinąć małą cząsteczkę w strukturę rybosomu. Ryc. uzupełniająca 2). 8, dane dodatkowe 1, 2).
Obrazowanie Cryo-EM pokazujące obecność nukleotydów poza rybozą związaną z rybosomem E. cuniculi. W rybosomie E. cuniculi nukleotyd ten zajmuje to samo miejsce, co nukleotyd 25S rRNA A3186 (numeracja Saccharomyces cerevisiae) w większości innych rybosomów eukariotycznych. b W strukturze rybosomalnej E. cuniculi nukleotyd ten znajduje się między białkami rybosomowymi uL9 i eL20, stabilizując w ten sposób kontakt między tymi dwoma białkami. cd Analiza zachowania sekwencji eL20 wśród gatunków mikrosporydiów. Drzewo filogenetyczne gatunków Microsporidia (c) i wielokrotne wyrównanie sekwencji białka eL20 (d) pokazują, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są konserwowane w większości typowych Microsporidia, z wyjątkiem S. lophii, z wyjątkiem wczesnych rozgałęzionych Microsporidia, które zachowały rozszerzenie rRNA ES39L. e Ta ilustracja pokazuje, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są obecne tylko w eL20 wysoce zredukowanego genomu Microsporidia, ale nie u innych eukariotów. Ogólnie rzecz biorąc, te dane sugerują, że rybosomy Microsporidia rozwinęły miejsce wiązania nukleotydów, które wydaje się wiązać cząsteczki AMP i wykorzystywać je do stabilizacji interakcji białko-białko w strukturze rybosomu. Wysoki stopień konserwacji tego miejsca wiązania w Microsporidia i jego brak u innych eukariotów sugeruje, że miejsce to może zapewniać selektywną przewagę w przetrwaniu dla Microsporidia. Zatem kieszeń wiążąca nukleotydy w rybosomie mikrosporidii nie wydaje się być zdegenerowaną cechą lub końcową formą degradacji rRNA, jak opisano wcześniej, ale raczej użyteczną innowacją ewolucyjną, która pozwala rybosomowi mikrosporidii bezpośrednio wiązać małe cząsteczki, wykorzystując je jako molekularne bloki konstrukcyjne. bloki konstrukcyjne rybosomów. To odkrycie sprawia, że ​​rybosom mikrosporidii jest jedynym znanym rybosomem, który wykorzystuje pojedynczy nukleotyd jako swój strukturalny blok konstrukcyjny. f Hipotetyczna ścieżka ewolucyjna pochodząca z wiązania nukleotydów.
Druga gęstość niskiej masy cząsteczkowej znajduje się na styku białek rybosomalnych uL9 i eL30 (rys. 5a). Ten styk został wcześniej opisany w strukturze rybosomu Saccharomyces cerevisiae jako miejsce wiązania nukleotydu 25S rRNA A3186 (część rozszerzenia rRNA ES39L)38. Wykazano, że w zdegenerowanych rybosomach ES39L P. locustae ten styk wiąże nieznany pojedynczy nukleotyd 31 i zakłada się, że ten nukleotyd jest zredukowaną końcową formą rRNA, w której długość rRNA wynosi ~130-230 zasad. ES39L jest zredukowany do pojedynczego nukleotydu 32,43. Nasze obrazy kriomikroskopii elektronowej potwierdzają ideę, że gęstość można wyjaśnić za pomocą nukleotydów. Jednak wyższa rozdzielczość naszej struktury pokazała, że ​​nukleotyd ten jest cząsteczką pozarybosomalną, prawdopodobnie AMP (ryc. 5a, b).
Następnie zapytaliśmy, czy miejsce wiązania nukleotydów pojawiło się w rybosomie E. cuniculi, czy też istniało wcześniej. Ponieważ wiązanie nukleotydów jest głównie pośredniczone przez reszty Phe170 i Lys172 w białku rybosomalnym eL30, oceniliśmy konserwację tych reszt u 4396 reprezentatywnych eukariotów. Podobnie jak w przypadku uL15 powyżej, odkryliśmy, że reszty Phe170 i Lys172 są wysoce konserwowane tylko w typowych Microsporidia, ale nieobecne u innych eukariotów, w tym atypowych Microsporidia Mitosporidium i Amphiamblys, w których fragment rRNA ES39L nie jest zredukowany 44, 45, 46 (Rys. 5c). -e).
Łącznie te dane wspierają ideę, że E. cuniculi i prawdopodobnie inne kanoniczne mikrosporydia rozwinęły zdolność do efektywnego wychwytywania dużej liczby małych metabolitów w strukturze rybosomu, aby zrekompensować spadek poziomów rRNA i białka. Dzięki temu rozwinęły unikalną zdolność wiązania nukleotydów poza rybosomem, pokazując, że pasożytnicze struktury molekularne kompensują to, wychwytując liczne małe metabolity i wykorzystując je jako strukturalne naśladownictwo zdegradowanych fragmentów RNA i białka. .
Trzecia niesymulowana część naszej mapy kriomikroskopowej znajduje się w dużej podjednostce rybosomalnej. Stosunkowo wysoka rozdzielczość (2,6 Å) naszej mapy sugeruje, że gęstość ta należy do białek o unikalnych kombinacjach dużych reszt łańcucha bocznego, co pozwoliło nam zidentyfikować tę gęstość jako wcześniej nieznane białko rybosomalne, które zidentyfikowaliśmy jako Nazwano je msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metody, rycina 6). Nasze poszukiwania homologii wykazały, że msL2 jest konserwowane w kladzie Microsporidia z rodzaju Encephaliter i Orosporidium, ale nieobecne u innych gatunków, w tym innych Microsporidia. W strukturze rybosomu msL2 zajmuje lukę utworzoną przez utratę rozszerzonego rRNA ES31L. W tej luce msL2 pomaga stabilizować fałdowanie rRNA i może kompensować utratę ES31L (rycina 6).
a Gęstość elektronowa i model specyficznego dla Microsporidia białka rybosomalnego msL2 znalezionego w rybosomach E. cuniculi. b Większość eukariotycznych rybosomów, w tym rybosom 80S Saccharomyces cerevisiae, ma utraconą amplifikację rRNA ES19L u większości gatunków Microsporidia. Wcześniej ustalona struktura rybosomu Microsporidia V. necatrix sugeruje, że utrata ES19L u tych pasożytów jest kompensowana przez ewolucję nowego białka rybosomalnego msL1. W tym badaniu odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi rozwinął również dodatkowe białko imitujące rybosomalne RNA jako pozorną rekompensatę za utratę ES19L. Jednak msL2 (obecnie adnotowane jako hipotetyczne białko ECU06_1135) i msL1 mają różne pochodzenie strukturalne i ewolucyjne. c To odkrycie generacji ewolucyjnie niezwiązanych białek rybosomalnych msL1 i msL2 sugeruje, że jeśli rybosomy gromadzą szkodliwe mutacje w swoim rRNA, mogą osiągnąć bezprecedensowy poziom różnorodności składu nawet w małym podzbiorze blisko spokrewnionych gatunków. To odkrycie może pomóc wyjaśnić pochodzenie i ewolucję rybosomu mitochondrialnego, który jest znany ze swojego wysoce zredukowanego rRNA i nieprawidłowej zmienności składu białka między gatunkami.
Następnie porównaliśmy białko msL2 z wcześniej opisanym białkiem msL1, jedynym znanym białkiem rybosomalnym specyficznym dla mikrosporydiów, znalezionym w rybosomie V. necatrix. Chcieliśmy sprawdzić, czy msL1 i msL2 są ewolucyjnie spokrewnione. Nasza analiza wykazała, że ​​msL1 i msL2 zajmują tę samą jamę w strukturze rybosomu, ale mają różne struktury pierwotne i trzeciorzędowe, co wskazuje na ich niezależne pochodzenie ewolucyjne (ryc. 6). Tak więc nasze odkrycie msL2 dostarcza dowodów na to, że grupy zwartych gatunków eukariotycznych mogą niezależnie ewoluować strukturalnie odrębne białka rybosomalne, aby zrekompensować utratę fragmentów rRNA. Odkrycie to jest godne uwagi, ponieważ większość cytoplazmatycznych rybosomów eukariotycznych zawiera białko niezmienne, w tym tę samą rodzinę 81 białek rybosomalnych. Pojawienie się msL1 i msL2 w różnych kladach mikrosporydiów w odpowiedzi na utratę rozszerzonych segmentów rRNA sugeruje, że degradacja architektury molekularnej pasożyta powoduje, że pasożyty poszukują mutacji kompensacyjnych, co może ostatecznie doprowadzić do ich nabycia w innych populacjach pasożytów. struktury.
Na koniec, gdy nasz model został ukończony, porównaliśmy skład rybosomu E. cuniculi z tym przewidywanym na podstawie sekwencji genomu. Kilka białek rybosomalnych, w tym eL14, eL38, eL41 i eS30, było wcześniej uznawanych za brakujące w genomie E. cuniculi z powodu pozornego braku ich homologów w genomie E. cuniculi. Utrata wielu białek rybosomalnych jest również przewidywana w większości innych silnie zredukowanych pasożytów wewnątrzkomórkowych i endosymbiontów. Na przykład, chociaż większość wolno żyjących bakterii zawiera tę samą rodzinę 54 białek rybosomalnych, tylko 11 z tych rodzin białek ma wykrywalne homologi w każdym analizowanym genomie bakterii ograniczonych do gospodarza. Na poparcie tej koncepcji, utratę białek rybosomalnych zaobserwowano eksperymentalnie w mikrosporidiach V. necatrix i P. locustae, w których brakuje białek eL38 i eL4131,32.
Jednak nasze struktury pokazują, że tylko eL38, eL41 i eS30 są faktycznie tracone w rybosomie E. cuniculi. Białko eL14 zostało zachowane, a nasza struktura pokazała, dlaczego nie można było znaleźć tego białka w wyszukiwaniu homologii (rys. 7). W rybosomach E. cuniculi większość miejsca wiązania eL14 jest tracona z powodu degradacji ES39L wzmocnionego rRNA. W przypadku braku ES39L eL14 utraciło większość swojej struktury drugorzędowej, a tylko 18% sekwencji eL14 było identyczne w E. cuniculi i S. cerevisiae. Ta słaba konserwacja sekwencji jest niezwykła, ponieważ nawet Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens — organizmy, które ewoluowały w odstępie 1,5 miliarda lat — mają ponad 51% tych samych reszt w eL14. Ta nietypowa utrata konserwatywności wyjaśnia, dlaczego białko eL14 z E. cuniculi jest obecnie określane jako domniemane białko M970_061160, a nie jako białko rybosomalne eL1427.
i Rybosom Microsporidia utracił rozszerzenie rRNA ES39L, co częściowo wyeliminowało miejsce wiązania białka rybosomalnego eL14. W przypadku braku ES39L białko mikrospory eL14 ulega utracie struktury drugorzędowej, w której dawna α-helisa wiążąca rRNA degeneruje się do pętli o minimalnej długości. b Wielokrotne dopasowanie sekwencji pokazuje, że białko eL14 jest wysoce konserwowane w gatunkach eukariotycznych (57% identyczności sekwencji między homologami drożdży i człowieka), ale słabo konserwowane i rozbieżne w mikrosporidiach (w których nie więcej niż 24% reszt jest identycznych z homologiem eL14). z S. cerevisiae lub H. sapiens). Ta słaba konserwacja sekwencji i zmienność struktury drugorzędowej wyjaśnia, dlaczego homolog eL14 nigdy nie został znaleziony w E. cuniculi i dlaczego uważa się, że to białko zostało utracone w E. cuniculi. Natomiast E. cuniculi eL14 zostało wcześniej opisane jako domniemane białko M970_061160. Ta obserwacja sugeruje, że różnorodność genomu mikrosporydiów jest obecnie przeceniana: niektóre geny, o których obecnie uważa się, że zostały utracone w mikrosporydiach, są w rzeczywistości zachowane, choć w wysoce zróżnicowanych formach; zamiast tego uważa się, że niektóre kodują geny mikrosporydiów dla białek specyficznych dla robaków (np. hipotetyczne białko M970_061160) w rzeczywistości koduje bardzo zróżnicowane białka występujące u innych eukariotów.
Odkrycie to sugeruje, że denaturacja rRNA może prowadzić do drastycznej utraty konserwacji sekwencji w sąsiadujących białkach rybosomalnych, co sprawia, że ​​białka te są niewykrywalne w poszukiwaniach homologicznych. W związku z tym możemy przeceniać rzeczywisty stopień degradacji molekularnej w organizmach o małym genomie, ponieważ niektóre białka uważane za utracone w rzeczywistości pozostają, choć w wysoce zmienionych formach.
W jaki sposób pasożyty mogą zachować funkcję swoich maszyn molekularnych w warunkach ekstremalnej redukcji genomu? Nasze badanie odpowiada na to pytanie, opisując złożoną strukturę molekularną (rybosom) E. cuniculi, organizmu o jednym z najmniejszych genomów eukariotycznych.
Wiadomo od prawie dwóch dekad, że cząsteczki białka i RNA w pasożytniczych mikroorganizmach często różnią się od homologicznych cząsteczek w gatunkach wolno żyjących, ponieważ brakuje im centrów kontroli jakości, są zredukowane do 50% ich wielkości w wolno żyjących mikroorganizmach itd. wiele wyniszczających mutacji, które upośledzają fałdowanie i funkcję. Na przykład oczekuje się, że rybosomy organizmów o małym genomie, w tym wielu pasożytów wewnątrzkomórkowych i endosymbiontów, będą pozbawione kilku białek rybosomalnych i do jednej trzeciej nukleotydów rRNA w porównaniu do gatunków wolno żyjących 27, 29, 30, 49. Jednak sposób, w jaki te cząsteczki działają u pasożytów, pozostaje w dużej mierze tajemnicą, badaną głównie za pomocą genomiki porównawczej.
Nasze badanie pokazuje, że struktura makrocząsteczek może ujawnić wiele aspektów ewolucji, które są trudne do wydobycia z tradycyjnych porównawczych badań genomicznych pasożytów wewnątrzkomórkowych i innych organizmów ograniczonych do żywiciela (rys. uzupełniający 7). Na przykład przykład białka eL14 pokazuje, że możemy przecenić rzeczywisty stopień degradacji aparatu molekularnego u gatunków pasożytniczych. Uważa się obecnie, że pasożyty encefaliczne mają setki genów specyficznych dla mikrosporydiów. Jednak nasze wyniki pokazują, że niektóre z tych pozornie specyficznych genów są w rzeczywistości bardzo różnymi wariantami genów, które są powszechne u innych eukariotów. Ponadto przykład białka msL2 pokazuje, jak pomijamy nowe białka rybosomalne i niedoceniamy zawartości pasożytniczych maszyn molekularnych. Przykład małych cząsteczek pokazuje, jak możemy przeoczyć najbardziej pomysłowe innowacje w pasożytniczych strukturach molekularnych, które mogą nadać im nową aktywność biologiczną.
Łącznie te wyniki poprawiają nasze zrozumienie różnic między strukturami molekularnymi organizmów ograniczonych do gospodarza a ich odpowiednikami w organizmach żyjących na wolności. Pokazujemy, że maszyny molekularne, od dawna uważane za zredukowane, zdegenerowane i podlegające różnym wyniszczającym mutacjom, zamiast tego mają zestaw systematycznie pomijanych niezwykłych cech strukturalnych.
Z drugiej strony, nieobszerne fragmenty rRNA i fragmenty zespolone, które znaleźliśmy w rybosomach E. cuniculi, sugerują, że redukcja genomu może zmienić nawet te części podstawowego mechanizmu molekularnego, które są zachowane w trzech domenach życia – po prawie 3,5 miliarda lat niezależnej ewolucji gatunków.
Fragmenty rRNA bez wypukłości i połączone w rybosomach E. cuniculi są szczególnie interesujące w świetle wcześniejszych badań cząsteczek RNA w bakteriach endosymbiotycznych. Na przykład u endosymbionta mszycy Buchnera aphidicola wykazano, że cząsteczki rRNA i tRNA mają struktury wrażliwe na temperaturę ze względu na odchylenie składu A+T i wysoki odsetek niekanonicznych par zasad20,50. Uważa się obecnie, że te zmiany w RNA, a także zmiany w cząsteczkach białek, są odpowiedzialne za nadmierną zależność endosymbiontów od partnerów i niezdolność endosymbiontów do przenoszenia ciepła21, 23. Chociaż rRNA pasożytniczych mikrosporydiów ma strukturalnie odrębne zmiany, charakter tych zmian sugeruje, że zmniejszona stabilność termiczna i większa zależność od białek chaperonowych mogą być wspólnymi cechami cząsteczek RNA w organizmach o zredukowanych genomach.
Z drugiej strony, nasze struktury pokazują, że pasożytnicze mikrosporydia wyewoluowały unikalną zdolność do opierania się szeroko konserwowanym fragmentom rRNA i białek, rozwijając zdolność do wykorzystywania obfitych i łatwo dostępnych małych metabolitów jako strukturalnych naśladowców zdegenerowanych fragmentów rRNA i białek. Degradacja struktury molekularnej. . Pogląd ten jest poparty faktem, że małe cząsteczki, które kompensują utratę fragmentów białek w rRNA i rybosomach E. cuniculi, wiążą się z resztami specyficznymi dla mikrosporydiów w białkach uL15 i eL30. Sugeruje to, że wiązanie małych cząsteczek z rybosomami może być produktem pozytywnej selekcji, w której mutacje specyficzne dla mikrosporydiów w białkach rybosomalnych zostały wybrane ze względu na ich zdolność do zwiększania powinowactwa rybosomów do małych cząsteczek, co może prowadzić do bardziej wydajnych organizmów rybosomalnych. Odkrycie ujawnia inteligentną innowację w strukturze molekularnej pasożytniczych mikrobów i pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób struktury molekularne pasożytów zachowują swoją funkcję pomimo reduktywnej ewolucji.
Obecnie identyfikacja tych małych cząsteczek pozostaje niejasna. Nie jest jasne, dlaczego wygląd tych małych cząsteczek w strukturze rybosomalnej różni się między gatunkami mikrosporidiów. W szczególności nie jest jasne, dlaczego wiązanie nukleotydów jest obserwowane w rybosomach E. cuniculi i P. locustae, a nie w rybosomach V. necatrix, pomimo obecności reszty F170 w białkach eL20 i K172 V. necatrix. Ta delecja może być spowodowana przez resztę 43 uL6 (znajdującą się obok kieszeni wiążącej nukleotydy), która jest tyrozyną w V. necatrix, a nie treoniną w E. cuniculi i P. locustae. Obszerny aromatyczny łańcuch boczny Tyr43 może zakłócać wiązanie nukleotydów z powodu nakładania się przestrzennego. Alternatywnie, pozorne usunięcie nukleotydów może być spowodowane niską rozdzielczością obrazowania kriomikroskopowego, co utrudnia modelowanie fragmentów rybosomalnych V. necatrix.
Z drugiej strony, nasza praca sugeruje, że proces rozpadu genomu może być siłą twórczą. W szczególności struktura rybosomu E. cuniculi sugeruje, że utrata rRNA i fragmentów białka w rybosomie mikrosporydiów tworzy presję ewolucyjną, która promuje zmiany w strukturze rybosomu. Te warianty występują daleko od aktywnego miejsca rybosomu i wydają się pomagać w utrzymaniu (lub przywróceniu) optymalnego montażu rybosomu, który w przeciwnym razie zostałby zakłócony przez zredukowany rRNA. Sugeruje to, że główna innowacja rybosomu mikrosporydiów wydaje się ewoluować w potrzebę buforowania dryfu genów.
Być może najlepiej ilustruje to wiązanie nukleotydów, którego dotychczas nie zaobserwowano u innych organizmów. Fakt, że reszty wiążące nukleotydy są obecne w typowych mikrosporidiach, ale nie u innych eukariotów, sugeruje, że miejsca wiązania nukleotydów nie są po prostu reliktami czekającymi na zniknięcie lub ostatecznym miejscem, w którym rRNA zostanie przywrócone do postaci pojedynczych nukleotydów. Zamiast tego miejsce to wydaje się użyteczną cechą, która mogła ewoluować w ciągu kilku rund pozytywnej selekcji. Miejsca wiązania nukleotydów mogą być produktem ubocznym selekcji naturalnej: gdy ES39L ulegnie degradacji, mikrosporydia są zmuszone do poszukiwania rekompensaty w celu przywrócenia optymalnej biogenezy rybosomu w przypadku braku ES39L. Ponieważ ten nukleotyd może naśladować kontakty molekularne nukleotydu A3186 w ES39L, cząsteczka nukleotydu staje się elementem budulcowym rybosomu, którego wiązanie jest dodatkowo ulepszone przez mutację sekwencji eL30.
Jeśli chodzi o ewolucję molekularną pasożytów wewnątrzkomórkowych, nasze badanie pokazuje, że siły darwinowskiej selekcji naturalnej i dryfu genetycznego rozpadu genomu nie działają równolegle, ale oscylują. Po pierwsze, dryf genetyczny eliminuje ważne cechy biocząsteczek, co sprawia, że ​​kompensacja jest bardzo potrzebna. Dopiero gdy pasożyty zaspokoją tę potrzebę poprzez darwinowską selekcję naturalną, ich makrocząsteczki będą miały szansę rozwinąć swoje najbardziej imponujące i innowacyjne cechy. Co ważne, ewolucja miejsc wiązania nukleotydów w rybosomie E. cuniculi sugeruje, że ten wzór ewolucji molekularnej typu strata-zysk nie tylko amortyzuje szkodliwe mutacje, ale czasami nadaje zupełnie nowe funkcje pasożytniczym makrocząsteczkom.
Ta idea jest zgodna z teorią równowagi ruchomej Sewella Wrighta, która głosi, że ścisły system doboru naturalnego ogranicza zdolność organizmów do innowacji51,52,53. Jednakże, jeśli dryf genetyczny zakłóca dobór naturalny, dryf ten może powodować zmiany, które same w sobie nie są adaptacyjne (ani nawet szkodliwe), ale prowadzą do dalszych zmian, które zapewniają wyższą sprawność lub nową aktywność biologiczną. Nasze ramy wspierają tę ideę, ilustrując, że ten sam typ mutacji, który zmniejsza fałd i funkcję biocząsteczki, wydaje się być głównym wyzwalaczem jej poprawy. Zgodnie z ewolucyjnym modelem win-win, nasze badanie pokazuje, że rozpad genomu, tradycyjnie postrzegany jako proces degeneracyjny, jest również głównym motorem innowacji, czasami, a może nawet często, pozwalając makrocząsteczkom na nabycie nowych pasożytniczych aktywności. mogą ich używać.