Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i cechy historii życia. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych na różnych etapach życia, owady mogą uzyskiwać te składniki odżywcze poprzez dodatkowe karmienie, na przykład żywiąc się wydzielinami kręgowców w procesie znanym jako kałuże. Komar Anopheles arabiani wydaje się być niedożywiony i dlatego potrzebuje składników odżywczych zarówno do metabolizmu, jak i reprodukcji. Celem tego badania była ocena, czy An.arabiensis pobudzenie moczem krowy w celu uzyskania składników odżywczych poprawia charakterystykę historii życia.
Upewnij się, że jest bezpieczny. Arabiensis był przyciągany zapachem świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu krowy, a samice poszukujące żywiciela i karmione krwią (48 godzin po posiłku z krwi) były mierzone w olfaktometrze z rurką Y, a ciężarne samice oceniano pod kątem testu tarła. Następnie zastosowano połączoną analizę chemiczną i elektrofizjologiczną do identyfikacji związków bioaktywnych w moczu krów we wszystkich czterech klasach wiekowych. Mieszanki syntetyczne bioaktywnych związków oceniano w próbach Y-tube i terenowych. Aby zbadać mocz krowy i jego główny związek zawierający azot, mocznik jako potencjalne uzupełnienie diety dla nosicieli malarii, zmierzono parametry karmienia i charakterystykę historii życia. Oceniono odsetek samic komarów oraz ilość wchłoniętego moczu krowiego i mocznika. Po karmieniu samice oceniono pod kątem przeżycia, lotu na uwięzi i reprodukcji.
Szukaj krwi i pożywienia żywiciela. W badaniach laboratoryjnych i terenowych Arabów przyciągał naturalny i syntetyczny zapach świeżego i dojrzałego moczu krowy. Ciężarne samice były obojętne na reakcje moczu krowy w miejscach tarła. Samice poszukujące żywiciela i ssące krew aktywnie wchłaniają krowi mocz i mocznik i przydzielają te zasoby zgodnie z kompromisami w historii życia jako funkcją stanu fizjologicznego dla lotu, przetrwania lub reprodukcji.
Pozyskiwanie i dystrybucja moczu krowiego przez Anopheles arabinis w celu poprawy charakterystyki historii życia. Dokarmianie moczem krowim wpływa bezpośrednio na zdolność przenoszenia wektorów poprzez zwiększenie dziennej przeżywalności i gęstości wektorów, a pośrednio poprzez zmianę aktywności lotu, dlatego należy je uwzględnić w przyszłych modelach.
Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i historię życia [1,2,3]. Owady są w stanie wybierać i zdobywać pożywienie oraz wykonywać żywienie kompensacyjne w oparciu o dostępność pokarmu i zapotrzebowanie na składniki pokarmowe [1, 3]. Dystrybucja składników odżywczych zależy od procesu życiowego i może prowadzić do różnych wymagań co do jakości i ilości diety na różnych etapach życia owadów [1, 2]. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych, owady mogą uzyskiwać te składniki odżywcze poprzez dodatkowe karmienie, takie jak błoto, różne odchody i sekrety jony kręgowców i padliny, proces znany jako kałuże [2]. Chociaż opisano przede wszystkim różne gatunki motyli i ćmy, wodopoje występują również u innych rzędów owadów, a przyciąganie i żerowanie na tego typu zasobach może mieć znaczący wpływ na zdrowie i inne cechy historii życia [2, 4, 5, 6],7). może odgrywać ważną rolę w charakterystyce jego historii życiowej, ale jak dotąd zaniedbywano to zachowanie. Wykorzystanie pobudzenia jako sposobu na zwiększenie spożycia składników odżywczych w tym ważnym nośniku zasługuje na uwagę, ponieważ może mieć poważne konsekwencje epidemiologiczne.
Spożycie azotu przez dorosłe samice komarów Anopheles jest ograniczone ze względu na niskie rezerwy kaloryczne przenoszone ze stadium larwalnego i nieefektywne wykorzystanie mączki z krwi [9]. Samica Ann.gambiae sl zazwyczaj rekompensuje to poprzez suplementację dodatkowymi mączkami z krwi [10, 11], tym samym narażając więcej ludzi na ryzyko zarażenia się chorobą i narażając komary na większe ryzyko drapieżnictwa. zwiększają adaptację i manewrowość lotu, jak wykazały inne owady [2]. Pod tym względem interesująca jest silna i wyraźna atrakcyjność jednego z gatunków rodzeństwa w obrębie An. Kompleks gatunków Gambii sl, Anopheles arabinis, świeży i dojrzały mocz krowy [12,13,14]. Anopheles arabinis jest oportunistą w preferencjach żywiciela i wiadomo, że obcuje z bydłem i żeruje na nim. Mocz krowy jest zasobem bogatym w związki azotu, z mocznikiem stanowiącym 50- 95% całkowitego azotu w świeżym moczu [15, 16]. Wraz ze starzeniem się moczu krowy mikroorganizmy wykorzystują te zasoby do zmniejszenia złożoności związków azotowych w ciągu 24 godzin [15]. Wraz z szybkim wzrostem amoniaku, związanym ze spadkiem azotu organicznego, rozwijają się mikroorganizmy alkofilne (z których wiele wytwarza związki toksyczne dla komarów) [15], którymi mogą być samice Ann. 14].
W tym badaniu poszukiwano Ans żywiciela i karmionych krwią. Podczas pierwszego cyklu gonadotropowego arabiensis oceniano pod kątem pozyskiwania związków azotu, w tym mocznika, poprzez mieszanie moczu. Następnie przeprowadzono serię eksperymentów, aby ocenić, w jaki sposób samice komarów przydzielają ten potencjalny zasób składników odżywczych w celu poprawy przeżycia, reprodukcji i dalszego żerowania. potencjalnego zasobu odżywczego, arabiensis odkrył korelacje chemiczne stojące za obserwowaną zróżnicowaną atrakcyjnością. Syntetyczne mieszaniny zapachowe lotnych związków organicznych (LZO) zidentyfikowane w 24-godzinnym starzonym moczu były dalej oceniane w warunkach terenowych, rozszerzając wyniki uzyskane w warunkach laboratoryjnych i wykazując wpływ zapachu bydlęcego moczu na różne stany fizjologiczne.Wabienie komarów. Uzyskane wyniki potwierdzają, że An.arabiensis nabywa i rozprowadza związki azotu znajdujące się w moczu kręgowców, aby wpływać na charakterystykę historii życia. Wyniki te są omawiane w kontekście potencjalnych konsekwencji epidemiologicznych oraz tego, jak można je wykorzystać do nadzoru i kontroli wektorów.
Anopheles arabicans (szczep Dongola) utrzymywano w temperaturze 25 ± 2 °C, wilgotności względnej 65 ± 5% i cyklu światło:ciemność 12:12 h. Larwy hodowano na plastikowych tackach (20 cm × 18 cm × 7 cm) wypełnionych wodą destylowaną i karmionych pokarmem dla ryb Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Poczwarki zebrano do kubków o pojemności 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE), a następnie przeniesiono do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajwan), aby umożliwić pojawienie się dorosłych. Dorosłym podawano 10% roztwór sacharozy ad libitum do 4 dni po wzejściu (dpe), w którym to momencie samicom poszukującym żywiciela zaproponowano dietę bezpośrednio przed eksperymentem lub głodzono przez noc wodą destylowaną przed eksperymentem, jak opisano poniżej. do eksperymentów z rurką lotniczą były głodzone tylko przez 4-6 godzin z wodą ad libitum. Aby przygotować krwiopijne komary do kolejnych testów biologicznych, 4 samicom dpe podano defibrotyczną krew owczą (Håtunalab, Bro, SE) przy użyciu systemu żywienia membranowego (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Wielka Brytania). przez 3 dni przed eksperymentami opisanymi poniżej. Te ostatnie samice wykorzystano do testów biologicznych w rurce przelotowej i przeniesiono do laboratorium, a następnie przez 4-6 godzin przed eksperymentem poddawano im wodę destylowaną ad libitum.
Testy żywieniowe wykorzystano do ilościowego określenia spożycia moczu i mocznika przez dorosłe samice An.Arab. Samice poszukujące żywiciela i karmione krwią otrzymywały dietę zawierającą 1% rozcieńczonego świeżego i dojrzałego moczu krowiego, różne stężenia mocznika i dwie kontrole (10% sacharozy i wody) przez 48 godzin. , SE) dodawano do diety i dostarczano w matrycy 4 × 4 w 250 µl probówkach do mikrowirówki (Axygen Scientific, Union City, CA, US; ryc. 1A) Wypełnij do krawędzi (~300 µl). w temperaturze 25 ± 2 cm °C i wilgotności względnej 65 ± 5%. Eksperymenty te powtórzono 5 do 10 razy. Po ekspozycji na dietę komary umieszczono w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
Szukaj moczu bydlęcego i mocznika wchłanianego przez żywiciela i ssące krew samice Anopheles arabianus. W próbie żywieniowej (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i dojrzałego moczu krowiego, różnych stężeń mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). Samice poszukujące żywiciela (B) i karmione krwią (C) wchłaniały więcej sacharozy niż jakakolwiek inna badana dieta. mniej niż 168-godzinny mocz krowy (B). Średnia całkowita zawartość azotu (± odchylenie standardowe) w moczu jest przedstawiona we wstawce. Samice poszukujące żywiciela (D, F) i wysysające krew (E, G) pobierają mocznik w sposób zależny od dawki. średnia (BE). Linia prosta przerywana reprezentuje linię logarytmiczno-liniową regresji (F, G)
W celu uwolnienia wchłoniętego pokarmu komary umieszczano pojedynczo w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierających 230 µl wody destylowanej, a tkankę rozbijano za pomocą jednorazowego tłuczka i silnika bezprzewodowego (VWR International, Lund, SE), a następnie wirowano przy 10 krpm przez 10 min. Supernatant (200 µl) przenoszono do 96-dołkowej mikropłytki (Sigma-Aldrich) i absorbancję (λ620 ) określono za pomocą czytnika mikropłytek opartego na spektrofotometrze (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Alternatywnie, komary rozdrabniano w 1 ml wody destylowanej, której 900 µl przenoszono do kuwety do analizy spektrofotometrycznej (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). 0,2 µl do 2,4 µl 1 mg ml-1 cyjanku ksylenu. Następnie wykorzystano gęstość optyczną znanych stężeń barwnika do określenia ilości pokarmu spożytego przez każdego komara.
Dane objętościowe przeanalizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie porównań parami post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, Karolina Północna, USA, 1989–2007). Analizy regresji liniowej opisały zależne od stężenia spożycie mocznika i porównały reakcje między komarami poszukującymi żywiciela i komarami wysysającymi krew (GraphPad Prism v8.0.0 dla komputerów Mac, GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).
Około 20 µl próbek moczu z każdej grupy wiekowej wiązano na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i zamykano w blaszanych kapsułkach (8 mm × 5 mm). Kapsułki umieszczono w komorze spalania analizatora CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) w celu oznaczenia zawartości azotu w świeżym i starzonym moczu zgodnie z protokołem producenta. Azot całkowity ( g N 1-1) określono ilościowo na podstawie znanych stężeń mocznika stosowanych jako wzorzec.
Aby ocenić wpływ diety na przeżycie samic poszukujących żywiciela i wysysających krew, komary umieszczano pojedynczo na dużych szalkach Petriego (12 cm średnicy i 6 cm wysokości; Semadeni) z otworem w pokrywie pokrytym siatką (3 cm średnicy) z Do wentylacji i dostarczania pożywienia. nałożony na tampon dentystyczny (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) włożony do 5 ml strzykawki (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), wyjęty tłok i umieszczony na szalce Petriego (ryc. 1). 1A). Zmieniaj dietę każdego dnia. Pracuj w laboratorium zgodnie z powyższym opisem. Komary, które przeżyły, były liczone dwa razy dziennie, a martwe komary odrzucano aż do śmierci ostatniego komara (n = 40 na zabieg). Przeżywalność komara żywionych różnymi dietami poddano analizie statystycznej przy użyciu krzywych przeżycia Kaplana-Meyera i testów log-rank w celu porównania rozkładu przeżycia między dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Niestandardowy młyn latający na komary oparty na Attisano i wsp. [17], wykonany z przezroczystych paneli akrylowych o grubości 5 mm (10 cm szerokości x 10 cm długości x 10 cm wysokości) bez przednich i tylnych paneli (ryc. 3: góra). Zespół obrotowy z pionową rurą wykonaną z kolumny do chromatografii gazowej (0,25 mm śr. 6,5 cm L) przeciął pionową rurkę na pół, tworząc uwiązane ramię i ramię, które zawierało mały kawałek folii aluminiowej jako sygnał przerywający światło.
Wygłodzone przez 24 godziny samice otrzymywały powyższą dietę przez 30 minut przed unieruchomieniem. W pełni nakarmione samice komarów były następnie indywidualnie znieczulane na lodzie przez 2-3 minuty i przyczepiane do szpilek owadów za pomocą wosku pszczelego (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), a następnie przywiązywane do ramion poziomych rur. Oprogramowanie PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Młyn lotny umieszczono w pomieszczeniu o regulowanym klimacie (12 godz.:12 godz., światło: ciemność, 25 ± 2°C, 65 ± 5% RH).
Aby zobrazować wzorzec aktywności lotniczej, obliczono całkowitą przebytą odległość (m) i całkowitą liczbę kolejnych czynności lotniczych na godzinę w okresie 24-godzinnym. Ponadto średnie odległości przebyte przez poszczególne kobiety porównano w różnych grupach terapeutycznych i przeanalizowano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA i analizy post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdzie średni dystans uznano za zmienną zależną, podczas gdy leczenie jest czynnikiem niezależnym. Dodatkowo, średnia liczba rund jest obliczana w 10-minutowe przyrosty.
Aby ocenić wpływ diety na wydajność rozrodczą An.arabiensis, sześć samic (4 dpe) przeniesiono bezpośrednio do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) po pobraniu krwi, a następnie podawano im dietę eksperymentalną przez 48 h, jak opisano powyżej. Diety następnie usunięto, a kubki do tarła (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej zapewniono trzeciego dnia na 48 godzin, zmieniając co 24 godziny. Powtórzyć każdy schemat żywieniowy 20-50 razy. Jaja policzono i zarejestrowano dla każdej klatki doświadczalnej. Podpróbki jaj zastosowano do oceny średniej wielkości i zmienności długości poszczególnych jaj (n ≥ 200 na dietę) przy użyciu mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) wyposażonego w kamerę Leica (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Pozostałe jaja przechowywano w pomieszczeniu kontrolowanym przez klimat w standardowych warunkach hodowli przez 24 godziny, a podpróbkę niedawno pojawił się larwy 1. instaru (n ≥ 200 na dietę), jak opisano powyżej. Powyżej. Liczba jaj i wielkość jaj i larw porównywano między zabiegami i jedną dzienną analizą ANOVA i TUKE Post HOC (JMP Pro, V14.0.0, V14. Institute Inc.).
Substancje lotne w fazie nadpowierzchniowej ze świeżego (1 h po pobraniu), 24 h, 72 h i 168 h moczu zebrano z próbek pobranych od bydła Zebu rasy Arsi. Dla wygody próbki moczu pobrano wcześnie rano, gdy krowy były jeszcze w oborze. Próbki moczu pobrano od 10 osobników i 100-200 ml każdej próbki przeniesiono do indywidualnych poliamidowych toreb do pieczenia (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukt e GmbH and Co., Minden, DE) w 3 l poliamidu z pokrywką W plastikowych beczkach z chlorku winylu. Substancje lotne z fazy nadpowierzchniowej z każdej próbki moczu bydlęcego zbierano bezpośrednio (świeżo) lub po dojrzewaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, 72 godziny i 168 godzin, tj. każda próbka moczu była reprezentatywna dla każdej grupy wiekowej.
Do zbierania substancji lotnych w fazie nadpowierzchniowej stosowano system zamkniętej pętli do cyrkulacji strumienia gazu przefiltrowanego węglem aktywnym (100 ml min-1) przez worek poliamidowy do kolumny adsorpcyjnej przez 2,5 h przy użyciu membranowej pompy próżniowej (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Kontrolę stanowiło zbieranie fazy nadpowierzchniowej z pustego worka poliamidowego. d) zawierające 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) pomiędzy korkami z waty szklanej. Przed użyciem kolumnę przepłukano 1 ml redestylowanego n-heksanu (Merck, Darmstadt, DE) i 1 ml pentanu (99,0% czysty rozpuszczalnik, klasa GC, Sigma Aldrich). Zaadsorbowane substancje lotne eluowano 400 μl pentanu. Głowa kolekcje przestrzenne połączono, a następnie przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia do dalszej analizy.
Reakcje behawioralne poszukujących gospodarza i krwiożerczych ekstraktów lotnych An.Headspace zebranych ze świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu analizowano pod kątem lotnych ekstraktów z komarów Arabidopsis za pomocą olfaktometru z prostą szklaną rurką [18]. Eksperymenty przeprowadzono podczas ZT 13-15, szczytowego okresu aktywności An w poszukiwaniu domu. Arab [19]. 80 cm × 9,5 cm id) oświetlono czerwonym światłem o natężeniu 3 ± 1 lx z góry. Przefiltrowane węglem drzewnym i nawilżone powietrze (25 ± 2 °C, 65 ± 2% wilgotności względnej) przeszło test biologiczny przy 30 cm s-1. Powietrze przepuszcza się przez szereg ekranów z siatki ze stali nierdzewnej, tworząc przepływ laminarny i jednorodną strukturę pióropuszu. Dozownik tamponów dentystycznych (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Den tal AB), zawieszony na 5 cm cewce na nawietrznej stronie olfaktometru, ze zmianą stymulatora co 5 minut. Do analizy użyto 10 μl każdego ekstraktu z przestrzeni nad głową, rozcieńczonego 1:10, jako bodźca. Równą ilość pentanu zastosowano jako kontrolę. Poszczególne komary poszukujące żywiciela lub krwiopijne umieszczono w oddzielnych klatkach wypuszczanych 2-3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Klatka wypuszczana została umieszczona po stronie zawietrznej olfaktometru, a komary pozostawiono do aklimatyzacji przez 1 minutę, a następnie otworzono zawór motylkowy klatki w celu uwolnienia. Przyciąganie do leczenia lub kontroli analizowano jako odsetek komarów, które weszły w kontakt ze źródłem w ciągu 5 minut od uwolnienia. Każdy lotny ekstrakt z przestrzeni nad głową i kontrola były replikowane co najmniej 30 razy i aby uniknąć skutków jednego dnia, w każdym dniu eksperymentu testowano taką samą liczbę zabiegów i kontroli. Szukaj odpowiedzi od gospodarza i Ans karmionych krwią. Zestawy arabski w porównaniu z zestawami headspace analizowano przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównań parami dla nieparzystych stosunków (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Odpowiedź An na tarło. Ekstrakty z przestrzeni nad głową ze świeżego i dojrzałego moczu krowy analizowano w klatkach Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastikowe kubki (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej zapewniły podłoże do tarła i zostały umieszczone w przeciwległych rogach klatki, w odległości 24 cm od siebie. Rozcieńczenie 1:10. Równą ilość pentanu użyto do regulacji kubka kontrolnego. Kubki do traktowania i kontrolne wymieniano między każdym doświadczeniem, aby kontrolować wpływ pozycji. Dziesięć karmionych krwią samic wpuszczono do klatek doświadczalnych w ZT 9-11 i jaja w kubkach policzono 24 godziny później. Wzór na obliczenie wskaźnika tarła jest następujący: (liczba jaj złożonych w kubku do leczenia – liczba jaj złożonych w kubku kontrolnym)/(całkowita liczba złożonych jaj).E każde leczenie powtórzono 8 razy.
Analizę metodą chromatografii gazowej i wykrywania wzoru anteny elektronowej (GC-EAD) żeńskich An.arabiensis przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [20]. Pokrótce, świeże ekstrakty lotne z przestrzeni nad roztworem rozdzielono przy użyciu Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) wyposażonej w kolumnę HP-5 (30 m × 0,25 mm id, grubość warstwy 0,25 μm, Agilent Technologies).i starzejący się mocz. Wodór zastosowano jako fazę ruchomą ze średnią liniową szybkością przepływu 45 cm·s-1. Każdą próbkę (2 μl) wstrzykiwano przez 30 sekund w trybie bez podziału z temperaturą na wlocie 225°C. dodano azot i rozdzielono 1: 1 w krzyżaku Gerstel 3D/2 o niskiej martwej objętości (Gerstel, Mülheim, DE) między detektorem płomieniowo-jonizacyjnym a EAD. Kapilara odpływowa GC dla EAD została przepuszczona przez linię transferową Gerstel ODP-2, która śledzi temperaturę pieca GC plus 5 ° C, do szklanej rurki (10 cm × 8 mm), gdzie została zmieszana z filtrowanym węglem, nawilżonym powietrzem (1, 5 l min-1). Antenę umieszczono 0,5 cm od wylotu rurki. Każdy komar stanowił jedno powtórzenie, a dla komarów poszukujących żywiciela wykonano co najmniej trzy powtórzenia na próbkach moczu w każdym wieku.
Identyfikacja związków bioaktywnych w kolekcjach świeżego i dojrzałego moczu bydlęcego przy użyciu połączonego GC i spektrometru masowego (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) w celu wywołania odpowiedzi antenowych w analizie GC-EAD, działającej w trybie jonizacji uderzeniowej elektronów przy 70 eV. średnica, grubość błony 0,25 μm) przy użyciu helu jako fazy ruchomej ze średnią liniową szybkością przepływu 35 cm s-1. Próbkę 2 μl wstrzyknięto przy tych samych ustawieniach wtryskiwacza i temperaturze pieca, jak w przypadku analizy GC-EAD. Związki zidentyfikowano na podstawie ich czasu retencji (indeks Kováta) i widm masowych w porównaniu z biblioteką niestandardową i biblioteką NIST14 (Agilent). Zidentyfikowane związki potwierdzono przez wstrzyknięcie autentycznych standardów (dodatkowy plik 1: Tabela S2). W celu oznaczenia ilościowego wstrzyknięto octan heptylu (10 ng, 99,8% czystości chemicznej, Aldrich) jako wzorzec zewnętrzny.
Ocena skuteczności syntetycznej mieszaniny zapachowej składającej się ze związków bioaktywnych zidentyfikowanych w świeżym i dojrzałym moczu w celu wabienia poszukujących gospodarza i wysysających krew Ans.arabiensis, przy użyciu tego samego olfaktometru i protokołu jak powyżej. Mieszanki syntetyczne naśladowały skład i proporcje związków w mieszanych ekstraktach lotnych z przestrzeni nad głową świeżego, 24-godzinnego, 48-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego starzonego moczu (Ryc. 5D-G; Dodatkowy plik 1) : Tabela S2). Do analizy użyć 10 μl rozcieńczenia 1:100 w pełni syntetycznej mieszaniny, z całkowitą szybkością uwalniania w zakresie około 140-2400 ng h-1, w celu oceny atrakcyjności dla żywicieli i komarów krwiopijnych. Następnie przeprowadza się test na kompletnych mieszaninach, z których usuwa się subtraktywne mieszaniny pojedynczych związków z kompletnej mieszaniny. analizowano przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównań parami dla nieparzystych ilorazów (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby ocenić, czy krowi mocz może służyć jako wskazówka dla siedliska żywiciela dla komarów malarii, świeży i stary mocz krowy, zebrany jak opisano powyżej, oraz woda zostały umieszczone w 3-litrowych wiadrach z oczkami (100 ml) i umieszczone w pułapkach na przynętę żywiciela.(wersja BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dziesięć pułapek umieszczonych w odległości 50 m od siebie na pastwisku, 400 m od społeczności wiejskiej (Silay, Etiopia, 5°53'24''N, 37°29'24''E) bez bydła, na stałych lęgowiskach i wioskach. Pięć pułapek ogrzewano, aby zasymulować obecność żywiciela, podczas gdy pięć pułapek pozostawiono nieogrzewanych. łącznie pięć nocy. Porównano liczbę komarów złapanych w pułapki z przynętą w moczu w różnym wieku, stosując regresję logistyczną z rozkładem dwumianowym beta (JMP Pro, wersja 14.0.0, SAS Institute Inc.).
W wiosce endemicznej malarii w pobliżu miasta Maki, region Oromia, Etiopia (8°11′08″N, 38°81′70″E; ryc. 6A). Do badań wybrano wioskę (ryc. 6A). Kryteriami zastosowanymi przy wyborze domów były: zakaz przebywania w domu zwierząt, zakaz gotowania w domu (czerpanie drewna opałowego lub węgla drzewnego) (przynajmniej w okresie próbnym) oraz domy z maksymalnie dwoma mieszkańcami, śpiącymi w środkach owadobójczych.pod traktowaną moskitierą. Zgoda etyczna została przyznana przez Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) Wydziału Nauk Przyrodniczych (CNS-IRB) Uniwersytetu w Addis Abebie, zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Deklarację Helsińską Światowego Stowarzyszenia Lekarzy. Uzyskano zgodę każdej głowy gospodarstwa domowego przy pomocy personelu medycznego. Cały proces jest zatwierdzany przez lokalną administrację na poziomie okręgu i okręgu („kebele”). stosowano wzór kwadratu łacińskiego 2 × 2, w którym syntetyczne mieszaniny i kontrole zostały przypisane do sparowanych domów pierwszej nocy i zamienione między domami następnej nocy eksperymentalnej. Proces ten powtórzono dziesięć razy. Dodatkowo, aby oszacować aktywność komarów w wybranych domach, pułapki CDC zostały ustawione na pięć kolejnych nocy na początku, w środku i na końcu próby terenowej o tej samej porze dnia.
Syntetyczną mieszaninę zawierającą sześć związków bioaktywnych rozpuszczono w heptanie (97,0% rozpuszczalnik GC, Sigma Aldrich) i uwolniono w ilości 140 ng h-1 za pomocą dozownika z knotem [20]. Dozownik z knotem umożliwiał uwalnianie wszystkich związków w stałych proporcjach przez cały 12-godzinny eksperyment. Heptan zastosowano jako kontrolę. Fiolkę zawieszono obok punktu wejścia pułapki świetlnej Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) (John W. Hock Company , Gainesville, Floryda, USA; Ryc. 6A). Pułapki zawieszono 0,8 – 1 m nad ziemią, w pobliżu stóp łóżka, a ochotnik spał pod nietraktowaną moskitierą i działał między 18:00 a 06:30. Komary schwytane według płci i stanu fizjologicznego (niekarmione, karmione, pół-ciężarne i ciężarne [21] zostały następnie przebadane przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu zidentyfikowania gatunku morfologicznie zidentyfikowanego jako A. gambiae sl Członkowie kompleksu [23] W badaniu terenowym pułapkowanie sparowanych domów zostało przeanalizowane przy użyciu nominalnego modelu dopasowania logistycznego, w którym atrakcyjność była zmienną zależną, a leczenie (mieszanka syntetyczna vs kontrola) było efektem stałym (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.).Tutaj podajemy wartości χ2 i p z testu ilorazu wiarygodności.
Oceń, czy jest to bezpieczne. Arabiensis był w stanie uzyskać mocz, jego główne źródło azotu, mocznik, poprzez bezpośrednie karmienie, w ciągu 48 godzin od podania przez 4 dni po (dpe) próbach karmienia samic poszukujących żywiciela i karmionych krwią (ryc. 1A). Zarówno samice poszukujące żywiciela, jak i samice wysysające krew wchłaniały znacznie więcej sacharozy niż jakakolwiek inna dieta lub woda (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F( 5 299) = 56,00, odpowiednio p < 0,0001; ryc. 1B, C). Ponadto samice poszukujące żywiciela jadły mniej moczu po 72 godzinach w porównaniu z moczem po 168 godzinach (ryc. 1B). Kiedy zaproponowano im dietę zawierającą mocznik, samice poszukujące żywiciela wchłonęły znacznie większą ilość mocznika w stężeniu 2,69 mM w porównaniu do wszystkich innych stężeń i wody, podczas gdy były nie do odróżnienia od 10 % sacharozy (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Ryc. 1D). Było to w przeciwieństwie do odpowiedzi samic karmionych krwią, które zazwyczaj wchłaniały znacznie więcej diety zawierającej mocznik niż wodę, chociaż znacznie mniej niż 10% sacharozy (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Ryc. 1).1E). porównując te dwa stany fizjologiczne, samice z flebotomią wchłaniały więcej mocznika niż samice poszukujące żywiciela przy najniższych stężeniach, a te samice wchłaniały podobne ilości mocznika przy wyższych stężeniach (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001;Ryc. 1F, G). Podczas gdy spożycie z diety zawierającej mocznik wydawało się mieć optymalne wartości (ryc. 1D, E), kobiety w obu stanach fizjologicznych były w stanie modulować ilość wchłanianego mocznika w całym zakresie stężeń mocznika w sposób log-liniowy (ryc. 1F, G).).Podobnie wydaje się, że komary kontrolują pobieranie azotu poprzez regulację ilości wchłanianego moczu, ponieważ ilość azotu w moczu odzwierciedla się w ilości wchłanianej (ryc. 1B, wstawki C i B).
Aby ocenić wpływ moczu i mocznika na przeżywalność komarów poszukujących żywiciela i wysysających krew, samicom karmiono moczem wszystkich czterech grup wiekowych (świeży, 24-godzinny, 72-godzinny i 168-godzinny po osadzeniu), a zakres stężeń mocznika, jak również woda destylowana i 10% sacharoza służyły jako kontrola (ryc. 2A). Ta analiza przeżycia wykazała, że ​​dieta miała znaczący wpływ na całkowite przeżycie samic poszukujących żywiciela (mocz: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; ryc. 2B, C) oraz samice karmione krwią (mocz: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; ryc. 2D, E). We wszystkich eksperymentach samice karmione dietą składającą się z moczu, mocznika i wody miały znacznie niższe wskaźniki przeżycia w porównaniu z samicami karmionymi dietą z sacharozą (ryc. 2B-E). Samice poszukujące żywiciela karmione świeżym i nieświeżym moczem wykazywały różne wskaźniki przeżywalności, przy czym te karmione 72-godzinnym nieświeżym moczem (p = 0, 016) miały najniższe prawdopodobieństwo przeżycia (ryc. 2B). 135 mM mocznik przeżywał dłużej niż kontrole wodne (p <0,04) (ryc.2C). W porównaniu z wodą kobiety karmione świeżym moczem i 24-godzinnym moczem przeżywały dłużej (odpowiednio p = 0,001 i p = 0,012; ryc. 2D), podczas gdy kobiety karmione 72-godzinnym moczem przeżywały dłużej niż kobiety karmione krótkim świeżym moczem i 24-godzinnym moczem starzonym (odpowiednio p < 0,0001 i p = 0,013; ryc. 2D). Po karmieniu 135 mM mocznika samice karmione krwią przetrwały dłużej niż wszystkie inne stężenia mocznika i wody (p < 0,013; ryc. 2E).
Przeżywalność żywiciela i krwiopijnej samicy Anopheles arabinis żywiącej się krowim moczem i mocznikiem. W teście biologicznym (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i starego krowiego moczu, różnych stężeń mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). i mocznik (C, E) oraz kontrole, sacharoza i woda, są martwe
Całkowity dystans i liczba rund określonych w teście młyna latającego w ciągu 24 godzin różniły się między komarami poszukującymi żywiciela i komarami wysysającymi krew, które wykazywały ogólnie mniejszą aktywność lotną (ryc. 3). Komary poszukujące żywiciela, które dostarczały świeży i stary mocz lub sacharozę i wodę, wykazywały różne wzorce lotu (ryc. 3), przy czym samice żywiące się świeżym moczem były bardziej aktywne o świcie, podczas gdy komary karmione 24- i 168-godzinnym wiekiem, które żywiły się moczem, wykazywały różne wzorce lotu i były głównie dzienne. Samice komarów, które dostarczały sacharozę lub 72-godzinny mocz, wykazywały aktywność przez cały okres 24-godzinny, podczas gdy samice, które dostarczały wodę, były bardziej aktywne w połowie okresu. Komary karmione sacharozą wykazywały najwyższy poziom aktywności późną nocą i wczesnym rankiem, podczas gdy te, które spożywały 72-godzinny mocz, doświadczały stałego spadku aktywności w ciągu 24 godzin (ryc. 3).
Wydajność lotu poszukujących myśliwych, krwiopijnych samic Anopheles arabinis, żywiących się krowim moczem i mocznikiem. W teście we młynie samice komarów karmione świeżym i starym moczem krowim, różnymi stężeniami mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O) były uwiązane do poziomych, swobodnie obracających się ramion (powyżej). rejestrowano w ciągu 24 godzin (ciemny: szary; jasny: biały). Średni dystans i średnia liczba ataków są pokazane po prawej stronie wykresu aktywności okołodobowej. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej. Analiza statystyczna patrz tekst
Ogólnie rzecz biorąc, ogólna aktywność lotna samic poszukujących żywiciela przebiegała według wzorca podobnego do odległości lotu w okresie 24 godzin. Na średni dystans lotu istotny wpływ miała spożyta dieta (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a samice poszukujące żywiciela, które spożyły mocz przez 72 godziny, pokonywały znacznie większe odległości w porównaniu do wszystkich innych diet (p <0,0001), a komary karmione sacharozą latały dłużej niż komary karmione świeżym (p = 0,022) i 24-godzinnym moczem (p = 0,022). W przeciwieństwie do wzorca aktywności lotu opisanego przez dietę moczową, karmione mocznikiem samice poszukujące żywiciela wykazywały ciągłą aktywność lotu w okresie 24 godzin, osiągając szczyt w drugiej połowie fazy ciemnej (ryc. 3). , 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice poszukujące żywiciela karmione dowolnym stężeniem mocznika latały dłużej niż samice karmione wodą lub sacharozą (p < 0,03).
Ogólna aktywność lotna komarów wysysających krew była stabilna i utrzymywała się przez 24 godziny we wszystkich dietach, ze zwiększoną aktywnością moczu w drugiej połowie ciemnego okresu u samic karmionych wodą, jak również u samic karmionych świeżą i 24-godzinną (ryc. = 1,36, p = 0,24) z innym moczem i dietą kontrolną (świeża, p = 0,0091; 72 godziny, p = 0,0022; 168 godzin, p = 0,001; sacharoza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Wpływ karmienia moczem i mocznikiem na parametry reprodukcyjne oceniano w testach biologicznych składania jaj (ryc. 4A) i badano je na podstawie liczby jaj złożonych przez każdą samicę, wielkości jaj i nowo wyklutych larw w pierwszym stadium rozwojowym. mocz i mączka z krwi składały znacznie więcej jaj niż samice karmione inną dietą moczową i były podobne do tych karmionych sacharozą (ryc. 4B). Podobnie wielkość jaj składanych przez samice karmione moczem różniła się w zależności od diety (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), przy czym samice karmione moczem przez 24 godziny i karmione sacharozą składały znacznie większe jaja niż samice karmione wodą, podczas gdy jaja samic karmionych 168 godz. moczu były znacznie mniejsze (ryc. 4C). Ponadto dieta z moczem znacząco wpłynęła na wielkość larw (F (5, 187) = 7, 86, p < 0, 0001), przy czym znacznie większe larwy wyłaniały się z jaj złożonych przez 24- i 72-godzinne samice karmione moczem niż z jaj złożonych z jaj larw. Samice karmione wodą i 168-godzinne karmione moczem (ryc. 4D).
Wydajność reprodukcyjna samic Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. Karmione krwią samice komarów karmiono dietą składającą się ze świeżego i dojrzałego moczu krowiego, różnych stężeń mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O) przez 48 godzin przed umieszczeniem w testach biologicznych i uzyskaniem substratów do składania jaj przez 48 godzin (A). Liczba jaj (B, E), wielkość jaj (C, F) i wielkość larw (D, G) istotnie wpłynęła na to podawana dieta (mocz krowy: BD; mocznik: EG). Średnie dla każdego parametru mierzone przy użyciu różnych nazw liter znacznie różniły się od siebie (jednokierunkowa ANOVA z wykorzystaniem analizy post hoc Tukeya; p < 0,05). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej
Jako główny azotowy składnik moczu, mocznik, dostarczany w diecie samic karmionych krwią, znacząco wpływał na parametry reprodukcyjne we wszystkich badaniach. Liczba jaj składanych przez samice karmione mocznikiem, po posiłku z krwi, w zależności od stężenia mocznika (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice karmione mocznikiem o stężeniu między 134 µM a 1,34 mM składały więcej jaj (ryc. 4E).F samce karmione mocznikiem o stężeniu 134 µM lub wyższym składają jaja większe niż samice karmione wodą (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; ryc. 4F), a wielkość larw, chociaż podobne stężenia mocznika u matek miały na nie wpływ (F (10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), była bardziej zmienna (ryc. 4G).
Ogólna atrakcyjność dla poszukujących gospodarza ekstraktów lotnych z moczu bydlęcego. Na arabiensis oceniany w olfaktometrze w szklanej rurce (ryc. 5A) istotnie wpływał wiek moczu (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; ryc. 5B). Analiza post hoc wykazała, że ​​nieświeży zapach moczu po 24 godzinach powodował znacznie wyższy poziom atrakcyjności w porównaniu do wszystkich innych zabiegów (72 godziny: p = 0,0060) , 168 godzin: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), z wyjątkiem zapachu świeżego moczu (p = 0,13; ryc. 5B). Chociaż ogólna atrakcyjność zapachu moczu komarów wysysających krew nie była znacząco różna (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; ryc. 5C), stwierdzono, że samice te są znacznie bardziej atrakcyjne dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nad głową w porównaniu z moczem starzonym po 72 godzinach w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,0066; Ryc. 5C).
Reakcje behawioralne na naturalny i syntetyczny zapach moczu krowy w poszukiwaniu żywiciela i karmionych krwią Anopheles arabianus. Schemat olfaktometru ze szklanej rurki (A). Przyciąganie lotnych ekstraktów z przestrzeni nad głową ze świeżego i dojrzałego moczu krowiego do żywiciela (B) i krwiopijnych (C) komarów. Znajdź reakcję macek Pana An. Pokazano mocz krowy w wieku 168 godzin (G). Ślady detekcji anteny elektronowej (EAD) pokazują zmiany napięcia w odpowiedzi na związki bioaktywne w przestrzeni nad roztworem eluowane z chromatografu gazowego i wykrywane przez detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Pasek skali przedstawia amplitudę odpowiedzi (mV) w funkcji czasu retencji (s). Pokazane są właściwości i szybkości uwalniania (µg h-1) związków biologicznie czynnych. Pojedyncza gwiazdka (*) oznacza spójną odpowiedź przy niskiej amplitudzie. Podwójne gwiazdki (**) wskazują na nieodtwarzalne odpowiedzi. Znajdź żywiciela (H) i krwiopijnego (I) An.arabiensis różnie odwołuje się do syntetycznych mieszanek świeżego i starego zapachu moczu krowiego. Średnie proporcje komarów przyciąganych przez różne nazwy liter znacznie się od siebie różniły (jednokierunkowa ANOVA z wykorzystaniem analizy post hoc Tukeya;p < 0,05). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy skali
Samice Ann.arabiensis, 72 godziny i 120 godzin po posiłku z krwi, podczas tarła, nie wykazały preferencji dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nadpowierzchniowej ze świeżego i dojrzałego moczu krowiego w porównaniu z kontrolami z pentanem (χ2 = 3, 07, p > 0, 05; plik dodatkowy 1: ryc. S1).
W przypadku samic Ann.arabiensis, analizy GC-EAD i GC-MS zidentyfikowały osiem, sześć, trzy i trzy związki bioaktywne (ryc. 5D-G). Chociaż zaobserwowano różnice w liczbie związków, które wywoływały odpowiedzi elektrofizjologiczne, większość z tych związków była obecna w każdym ekstrakcie lotnym z przestrzeni nad roztworem pobranym ze świeżego i dojrzałego moczu. Dlatego też dla każdego ekstraktu w dalszych analizach uwzględniono tylko związki, które wywołały odpowiedź fizjologiczną czułków samic powyżej progu.
Całkowita szybkość uwalniania związków bioaktywnych w fazie nadpowierzchniowej wzrosła z 29 µg h-1 w świeżym moczu do 242 µg h-1 w 168-godzinnym moczu starzonym, głównie za sprawą wzrostu p-krezolu i m-formaldehydu Fenolu oraz fenolu. ance) na chromatogramie (ryc. 5D)-G lewy panel) i reakcje fizjologiczne na te związki (ryc. 5D-G prawy panel).
Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczna mieszanina miała podobny naturalny stosunek związków bioaktywnych zidentyfikowanych w lotnych ekstraktach świeżych i starych przestrzeni moczowych (ryc. 5D – G) i nie wydawała się wywoływać znaczącego odwołania w poszukiwaniu żywiciela (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; ryc. 5H) lub komarów wysysających krew (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; ryc. 5 I). Jednak porównania parami post hoc między zabiegami wykazały, że komary poszukujące żywiciela były znacząco atrakcyjne dla syntetycznej mieszanki 24-godzinnego dojrzewania moczu w porównaniu z kontrolami z pentanem (p = 0, 0086; Ryc. 5H).
Aby ocenić rolę poszczególnych składników w syntetycznych mieszaninach moczu starzonego przez 24 godziny, sześć mieszanin subtraktywnych oceniono w porównaniu z kompletnymi mieszaninami w teście Y-tube, w którym usunięto poszczególne związki. W przypadku komarów poszukujących żywiciela odjęcie poszczególnych związków od kompletnej mieszaniny miało znaczący wpływ na reakcje behawioralne (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; plik dodatkowy 1: rysunek S2A), wszystkie mieszaniny subtraktywne były bardziej atrakcyjne W przeciwieństwie do tego, usunięcie poszczególnych związków z w pełni syntetycznej mieszanki nie wpłynęło na reakcje behawioralne komarów wysysających krew (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), z wyjątkiem dekanalu, który skutkował niższymi poziomami w porównaniu z pełną mieszanką Przyciąganie (p = 0,022; plik dodatkowy 1: ryc. S2B).
W wiosce endemicznej malarii w Etiopii skuteczność syntetycznej mieszanki 24-godzinnego moczu krowiego w przyciąganiu komarów w warunkach terenowych oceniano przez dziesięć nocy (ryc. 6A). W sumie schwytano i zidentyfikowano 4861 komarów, z czego 45,7% to Anthropus.gambiae sl, 18,9% to Anopheles pharoensis, a 35,4% to Culex spp. (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Anopheles arabinis jest jedynym przedstawicielem kompleksu gatunków An.Gambian zidentyfikowanym za pomocą analizy PCR. Średnio 320 komarów łapano w ciągu nocy, w tym czasie pułapki z syntetyczną mieszanką przynęt łapały więcej komarów niż sparowane pułapki bez mieszanki (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pułapki bez przynęty zakładano każdej z pięciu nocy kontrolnych na początku, w środku , i koniec badania. Podobną liczbę komarów schwytano w każdej parze pułapek, co wskazuje na brak odchylenia między budynkami (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i brak spadku populacji w okresie badania. W porównaniu z pułapkami kontrolnymi, liczba komarów złapanych w pułapki zawierające mieszankę syntetyczną znacznie wzrosła: poszukiwanie żywiciela (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), niedawne karmienie (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i ciąża (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Znajduje to również odzwierciedlenie w całkowitej liczbie schwytanych komarów: poszukujących żywiciela > wysysających krew > ciężarnych > półciężarnych > samców.
Ocena w terenie skuteczności 24-godzinnej mieszanki zapachowej syntetycznego moczu krowiego. Próby terenowe przeprowadzono w południowo-środkowej Etiopii (mapa), w pobliżu miasta Maki (wstaw), przy użyciu pułapki świetlnej Centrum Kontroli Chorób (CDC) (po prawej) w sparowanych domach, o układzie kwadratu łacińskiego (zdjęcie lotnicze) (A). es (C), w inny sposób, efekt zależny od stanu fizjologicznego. Ponadto pułapki te wychwytywały znacznie zwiększoną liczbę komarów Culex żywiciela. (D) W porównaniu z kontrolą. Słupki po lewej stronie przedstawiają średni wskaźnik selekcji komarów złapanych w pary pułapek zapachowych (zielona) i kontrolnych (otwartych) (N = 10), podczas gdy słupki po prawej stronie reprezentują średni wskaźnik selekcji w parach pułapek kontrolnych (otwartych; N = 5)..Gwiazdki oznaczają poziomy istotności statystycznej (*p = 0,01 i ***p < 0,0001)
Poszukując żywiciela (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), żywiącego się krwią (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i ciąży (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) pułapki uwalniające mieszankę syntetyczną (ryc. 6B), podczas gdy ilość An nie różniła się. Znaleziono Pharoensis w różnych stanach fizjologicznych (ryc. 6C). W przypadku Culex stwierdzono jedynie znaczny wzrost liczby komarów poszukujących żywicieli w pułapkach z przynętą z mieszanką syntetyczną (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; ryc. 6D) w porównaniu z pułapkami kontrolnymi.
Pułapki na przynęty dla żywicieli znajdujące się poza potencjalnymi żywicielami między miejscami rozrodu a społecznościami wiejskimi w Etiopii zostały użyte do oceny, czy komary malarii wykorzystują zapach moczu krowy jako wskazówkę dla siedliska żywiciela. W przypadku braku wskazówek żywiciela, ciepła i z obecnością zapachu moczu krowy lub bez niej nie złapano żadnych komarów (Dodatkowy plik 1: Ryc. (5, 25) = 2,29, p = 0,13;Dodatkowy plik 1: ryc. S3). W przeciwieństwie do kontroli wodnych nie uchwycono komarów malarii w wysokich temperaturach (dodatkowy plik 1: ryc. S3).
Komary malarii nabywają i rozprowadzają związki zawierające azot poprzez kompensacyjne odżywianie się moczem krowy (tj. kałuże) w celu wzmocnienia cech historii życia, podobnie jak inne owady [2, 4, 24, 25, 26]. Mocz krowy jest łatwo dostępnym odnawialnym zasobem ściśle związanym z miejscami odpoczynku wektorów malarii, takimi jak obory i wysoka roślinność w pobliżu domów wiejskich i miejsc tarła. Samice komarów lokalizują ten zasób za pomocą zapachu i są w stanie regulować pobieranie związków azotu w moczu, w tym mocznik, główny składnik azotowy w moczu [15, 16]. W zależności od stanu fizjologicznego samicy komara, składniki odżywcze w moczu są przydzielane w celu zwiększenia aktywności lotu i przeżywalności samic komarów poszukujących żywiciela, a także przeżywalności i cech reprodukcyjnych osobników karmionych krwią podczas pierwszego cyklu gonadotropowego. Dlatego mieszanie moczu odgrywa ważną rolę odżywczą dla wektorów malarii, które są zamknięte jak niedożywione dorosłe osobniki [8], ponieważ zapewnia samicom komarów zdolność do nabywania ważnych związków azotu poprzez angażowanie się w żywienie niskiego ryzyka. Odkrycie to ma znaczące konsekwencje epidemiologiczne, ponieważ samice wydłużają swoją oczekiwaną długość życia, aktywność i wydajność reprodukcyjną, z których wszystkie wpływają na zdolność przenoszenia wektorów. Co więcej, takie zachowanie może być celem przyszłych programów zarządzania wektorami.