Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i cechy cyklu życiowego. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych na różnych etapach życia, owady mogą pozyskiwać te składniki odżywcze poprzez dokarmianie, na przykład żywiąc się wydzielinami kręgowców w procesie znanym jako kałuże. Komar Anopheles arabiani wydaje się być niedożywiony, a zatem potrzebuje składników odżywczych zarówno do metabolizmu, jak i rozmnażania. Celem tego badania była ocena, czy pobudzenie An. arabiensis moczem krowim w celu pozyskania składników odżywczych poprawia cechy cyklu życiowego.
Upewnij się, że jest bezpieczny. Arabiensis był przyciągany zapachem świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu krowiego, a samice szukające żywiciela i karmione krwią (48 godzin po posiłku z krwią) mierzono olfaktometrem z rurką w kształcie litery Y, a samice ciężarne oceniano pod kątem testu tarłowego. Następnie zastosowano połączoną analizę chemiczną i elektrofizjologiczną w celu zidentyfikowania związków bioaktywnych w moczu krów we wszystkich czterech klasach wiekowych. Syntetyczne mieszaniny związków bioaktywnych oceniano w próbach z rurką w kształcie litery Y i w badaniach terenowych. Aby zbadać mocz krowi i jego główny związek zawierający azot, mocznik, jako potencjalne uzupełniające diety dla wektorów malarii, mierzono parametry żywienia i cechy cyklu życiowego. Oceniono odsetek samic komarów oraz ilość wchłoniętego moczu krowiego i mocznika. Po karmieniu oceniano samice pod kątem przeżywalności, lotu na uwięzi i rozrodu.
Poszukują krwi i pożywienia żywiciela. W badaniach laboratoryjnych i terenowych Arabowie byli przyciągani naturalnym i syntetycznym zapachem świeżego i starego moczu krowiego. Samice w ciąży były obojętne na reakcje moczu krowiego w miejscach tarła. Samice poszukujące żywiciela i ssące krew aktywnie wchłaniają mocz krowi i mocznik, a następnie rozdzielają te zasoby zgodnie z kompromisami w historii życia jako funkcją stanu fizjologicznego w kontekście lotu, przetrwania lub rozrodu.
Anopheles arabinis pozyskuje i rozprowadza mocz krowi w celu poprawy charakterystyki cyklu życiowego. Uzupełniające karmienie moczem krowim wpływa bezpośrednio na zdolność przenoszenia wektorów poprzez zwiększenie dziennego przeżycia i zagęszczenia wektorów, a także pośrednio poprzez zmianę aktywności lotu, dlatego też powinno być uwzględnione w przyszłych modelach.
Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i cechy cyklu życia [1,2,3]. Owady są w stanie wybierać i zdobywać pożywienie oraz wykonywać kompensacyjne żerowanie w oparciu o dostępność pożywienia i wymagania dotyczące składników odżywczych [1, 3]. Dystrybucja składników odżywczych zależy od procesu cyklu życia i może prowadzić do różnych wymagań dotyczących jakości i ilości diety na różnych etapach życia owadów [1, 2]. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych, owady mogą uzyskać te składniki odżywcze poprzez uzupełniające karmienie, takie jak błoto, różne odchody i wydzieliny kręgowców oraz padlina, proces znany jako kałuże [2]. Chociaż opisano przede wszystkim wiele gatunków motyli i ćm, wodopoje występują również u innych rzędów owadów, a przyciąganie i żerowanie na tych rodzajach zasobów może mieć znaczący wpływ na zdrowie i inne cechy cyklu życia [2, 4, 5, 6], 7]. Komar wywołujący malarię Anopheles gambiae sensu lato (sl) wyłania się jako „niedożywiony” dorosły osobnik [8], więc podlewanie może odgrywać ważną rolę w cechach cyklu życiowego, ale zachowanie to było dotychczas zaniedbywane. Zastosowanie pobudzania jako sposobu na zwiększenie spożycia składników odżywczych w tym ważnym nośniku zasługuje na uwagę, ponieważ może mieć poważne konsekwencje epidemiologiczne.
Pobór azotu przez dorosłe samice komarów Anopheles jest ograniczony ze względu na niskie rezerwy kaloryczne przenoszone ze stadium larwalnego i nieefektywne wykorzystanie mączki kostnej [9]. Samice Ann.gambiae sl zazwyczaj rekompensują to poprzez uzupełnianie diety o dodatkowe posiłki kostne [10, 11], narażając w ten sposób więcej osób na ryzyko zarażenia się chorobą, a komary na większe ryzyko drapieżnictwa. Alternatywnie komary mogą wykorzystywać uzupełniające karmienie odchodami kręgowców w celu pozyskania związków azotowych, które zwiększają adaptację i zwrotność lotu, co wykazały inne owady [2]. W tym względzie interesujące jest silne i wyraźne przyciąganie jednego z gatunków pokrewnych w obrębie An.Gambijski kompleks gatunków sl, Anopheles arabinis, świeży i stary mocz krowi [12,13,14]. Anopheles arabinis jest oportunistyczny w preferencjach żywiciela i wiadomo, że łączy się z bydłem i żywi się nim. Mocz krowi jest źródłem bogatym w związki azotowe, a mocznik stanowi dla 50-95% całkowitego azotu w świeżym moczu [15, 16].W miarę starzenia się moczu krowiego mikroorganizmy wykorzystują te zasoby do redukcji złożoności związków azotowych w ciągu 24 godzin [15].Wraz z szybkim wzrostem amoniaku, związanym ze spadkiem azotu organicznego, rozwijają się mikroorganizmy alkalofilne (wiele z nich produkuje związki toksyczne dla komarów) [15], które mogą być samicami Ann.arabiensis, które są preferencyjnie przyciągane do moczu w wieku 24 godzin lub krótszego [13, 14].
W tym badaniu poszukiwano żywicieli i Ans karmionych krwią. Podczas pierwszego cyklu gonadotropinowego, arabiensis oceniano pod kątem pozyskiwania związków azotowych, w tym mocznika, poprzez mieszanie moczu. Następnie przeprowadzono serię eksperymentów, aby ocenić, w jaki sposób samice komarów przydzielają ten potencjalny zasób składników odżywczych w celu poprawy przeżycia, reprodukcji i dalszego żerowania. Na koniec oceniono zapach świeżego i starego moczu krowiego, aby ustalić, czy dostarcza on wiarygodnych wskazówek dla żywicieli i karmionych krwią An. W swoich poszukiwaniach tego potencjalnego zasobu odżywczego, arabiensis odkrył korelacje chemiczne stojące za obserwowaną różnicą atrakcyjności. Syntetyczne mieszanki zapachowe lotnych związków organicznych (LZO) zidentyfikowane w 24-godzinnym moczu poddano dalszej ocenie w warunkach terenowych, rozszerzając wyniki uzyskane w warunkach laboratoryjnych i wykazując wpływ zapachu moczu bydlęcego na różne stany fizjologiczne. Przyciąganie komarów. Uzyskane wyniki potwierdzają, że An. arabiensis nabywa i dystrybuuje związki azotowe znajdujące się w moczu kręgowców, wpływając na cechy cyklu życiowego. Wyniki te omówiono w kontekście potencjalnych konsekwencji epidemiologicznych oraz tego, w jaki sposób można je wykorzystać do nadzoru i kontroli wektorów.
Anopheles arabicans (szczep Dongola) utrzymywano w temperaturze 25 ± 2 °C, wilgotności względnej 65 ± 5% i cyklu światło:ciemność 12:12 h. Larwy hodowano na plastikowych tackach (20 cm × 18 cm × 7 cm) wypełnionych wodą destylowaną i karmiono pokarmem dla ryb Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Poczwarki zbierano do kubków o pojemności 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE), a następnie przenoszono do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajwan), aby umożliwić wyłonienie się osobników dorosłych. Dorosłym osobnikom podawano 10% roztwór sacharozy ad libitum do 4 dni po wykluciu (dpe), po czym samicom poszukującym żywiciela oferowano dietę bezpośrednio przed eksperymentem lub głodzono przez noc, podając wodę destylowaną przed do eksperymentu, jak opisano poniżej. Samice użyte do eksperymentów w rurach przelotowych były głodzone przez zaledwie 4-6 godzin, mając dostęp do wody ad libitum. Aby przygotować krwiopijne komary do późniejszych biotestów, 4 samicom dpe podano defibrotyzującą krew owczą (Håtunalab, Bro, SE) za pomocą systemu karmienia membranowego (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Całkowicie zakneblowane samice przeniesiono następnie do indywidualnych klatek i podawano im bezpośrednio dietę, jak opisano poniżej, lub 10% sacharozę ad libitum przez 3 dni przed eksperymentami opisanymi poniżej. Te ostatnie samice wykorzystano do biotestów w rurach przelotowych i przeniesiono do laboratorium, a następnie podawano im wodę destylowaną ad libitum przez 4-6 godzin przed eksperymentem.
Do ilościowego określenia spożycia moczu i mocznika przez dorosłe samice An.Arab zastosowano testy żywieniowe. Samice poszukujące żywiciela i karmione krwią otrzymywały dietę zawierającą 1% rozcieńczonego świeżego i starego moczu krowiego, różne stężenia mocznika oraz dwie kontrole (10% sacharozy i wody) przez 48 godzin. Ponadto do diety dodano barwnik spożywczy (1 mg ml-1 cyjanku ksylenu FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Sztokholm, SE) i podawano w matrycy 4 × 4 w 250 µl probówkach mikrocentrifugowych (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Rysunek 1A). Wypełnij do krawędzi (~300 µl). Aby uniknąć konkurencji między komarami i potencjalnych efektów koloru barwnika, umieść 10 komarów w dużej szalce Petriego (12 cm średnicy i 6 cm wysokości; Semadeni, Ostermundigen, CH; Rysunek 1A) w całkowitej ciemności, w temperaturze 25 ± 2 cm °C i przy wilgotności względnej 65 ± 5%. Eksperymenty te powtórzono 5 do 10 razy. Po wystawieniu na działanie pokarmu komary umieszczono w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
Poszukaj moczu bydlęcego i mocznika wchłoniętych przez żywiciela i ssącą krew samicę Anopheles arabianus. W próbie karmienia (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, różnych stężeń mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). Samice poszukujące żywiciela (B) i karmione krwią (C) wchłonęły więcej sacharozy niż jakakolwiek inna testowana dieta. Należy zauważyć, że samice poszukujące żywiciela wchłonęły 72-godzinny mocz krowi mniej niż 168-godzinny mocz krowi (B). Średnia całkowita zawartość azotu (± odchylenie standardowe) w moczu jest przedstawiona we wstawce. Samice poszukujące żywiciela (D, F) i ssące krew (E, G) pobierają mocznik w sposób zależny od dawki. Średnie wdychane objętości (D, E) o różnych nazwach literowych istotnie różniły się od siebie (jednokierunkowa analiza wariancji przy użyciu analizy post hoc Tukeya; p < 0,05). Słupki błędów oznaczają standardowe błąd średniej (BE). Linia prosta przerywana przedstawia linię regresji logarytmiczno-liniowej (F, G)
Aby uwolnić wchłonięty pokarm, komary umieszczano pojedynczo w 1,5 ml probówkach mikrocentrifugi zawierających 230 µl wody destylowanej, a tkankę rozrywano za pomocą jednorazowego tłuczka i bezprzewodowego silnika (VWR International, Lund, SE), a następnie wirowano przy 10 krpm przez 10 min. Supernatant (200 µl) przenoszono do 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej (Sigma-Aldrich), a absorbancję (λ620) oznaczano za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych opartego na spektrofotometrze (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternatywnie komary mielono w 1 ml wody destylowanej, z której 900 µl przenoszono do kuwety w celu wykonania analizy spektrofotometrycznej (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Aby określić ilościowo spożycie pokarmu, przygotowano krzywą standardową. poprzez seryjne rozcieńczenia w celu uzyskania od 0,2 µl do 2,4 µl ksylenu w stężeniu 1 mg ml-1. Następnie gęstość optyczna znanych stężeń barwnika została wykorzystana do określenia ilości pokarmu spożytego przez każdego komara.
Dane dotyczące objętości analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie porównań parami post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, Karolina Północna, USA, 1989–2007). Analizy regresji liniowej opisały zależne od stężenia spożycie mocznika i porównały reakcje między komarami szukającymi żywiciela i komarami ssącymi krew (GraphPad Prism v8.0.0 dla komputerów Mac, GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).
Około 20 µl próbek moczu z każdej grupy wiekowej związano na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i umieszczono w kapsułkach cynowych (8 mm × 5 mm). Kapsułki umieszczono w komorze spalania analizatora CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) w celu określenia zawartości azotu w świeżym i starym moczu zgodnie z protokołem producenta. Całkowity azot (g N l-1) określono ilościowo na podstawie znanych stężeń mocznika stosowanych jako standard.
Aby ocenić wpływ diety na przeżycie samic szukających żywiciela i ssących krew, komary umieszczano pojedynczo w dużych szalkach Petriego (o średnicy 12 cm i wysokości 6 cm; Semadeni) z otworem pokrytym siateczką w pokrywce (o średnicy 3 cm) w celu zapewnienia wentylacji i zaopatrzenia w pokarm. Diety podawano bezpośrednio po 4 dniach od zakażenia i zawierały 1% rozcieńczonego świeżego i starego moczu krowiego, cztery stężenia mocznika i dwie kontrole, 10% sacharozy i wodę. Każdą dietę nanoszono pipetą na tampon dentystyczny (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) włożony do 5 ml strzykawki (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), usuwano tłok i umieszczano na górze szalki Petriego (ryc. 1).1A). Zmieniaj dietę każdego dnia. Utrzymuj laboratorium w sposób opisany powyżej. Komary, które przeżyły, liczono dwa razy dziennie, natomiast martwe komary usuwano aż do śmierci ostatniego komara (n = 40 na zabieg). Przeżywalność komarów karmionych różnymi dietami poddano analizie statystycznej, wykorzystując krzywe przeżycia Kaplana-Meyera oraz testy log-rank w celu porównania rozkładu przeżywalności pomiędzy dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Niestandardowy latający młyn na komary, opracowany przez Attisano i in. [17], wykonany z przezroczystych paneli akrylowych o grubości 5 mm (szerokość 10 cm x długość 10 cm x wysokość 10 cm) bez przednich i tylnych paneli (rys. 3: góra). Zespół obrotowy z pionową rurą wykonaną z kolumny chromatografii gazowej (średnica wewnętrzna 0,25 mm; długość 7,5 cm) z końcami przyklejonymi do igły owada zawieszonej pomiędzy parą magnesów neodymowych oddalonych od siebie o 9 cm. Pozioma rura wykonana z tego samego materiału (długość 6,5 cm) przecinała pionową rurę, tworząc ramię przywiązane oraz ramię, które przenosiło mały kawałek folii aluminiowej jako sygnał przerywający światło.
Samice głodzone przez 24 godziny otrzymywały powyższą dietę przez 30 minut przed unieruchomieniem. W pełni nakarmione samice komarów znieczulano pojedynczo na lodzie przez 2-3 minuty i przymocowywano do szpilek owadobójczych za pomocą wosku pszczelego (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), a następnie przywiązywano do ramion poziomych rurek. Latający młyn. Obroty na lot rejestrowano za pomocą specjalnie zbudowanego rejestratora danych, a następnie przechowywano i wyświetlano za pomocą oprogramowania PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Młyn latający umieszczono w klimatyzowanym pomieszczeniu (12 godz.:12 godz., światło: ciemność, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Aby zwizualizować wzorzec aktywności lotniczej, obliczono całkowitą przebytą odległość (m) oraz całkowitą liczbę kolejnych aktywności lotniczych na godzinę w okresie 24 godzin. Ponadto porównano średnie odległości przebyte przez poszczególne samice w różnych grupach leczenia i przeanalizowano je przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji oraz analizy post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdzie średnią odległość uznano za zmienną zależną, a grupę leczenia za czynnik niezależny. Ponadto średnią liczbę rund obliczono w 10-minutowych przyrostach.
Aby ocenić wpływ diety na wydajność reprodukcyjną An.arabiensis, sześć samic (4 dni po zapłodnieniu) przeniesiono bezpośrednio do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) po pobraniu krwi, a następnie podawano im dietę eksperymentalną przez 48 godzin, jak opisano powyżej. Następnie diety usunięto i trzeciego dnia przez 48 godzin podawano im miseczki do tarła (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej, wymieniając je co 24 godziny. Każdy schemat diety powtarzano 20–50 razy. Liczono i rejestrowano jaja dla każdej klatki eksperymentalnej. Podpróbki jaj użyto do oceny średniej wielkości i zmienności długości poszczególnych jaj (n ≥ 200 na dietę) przy użyciu mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) wyposażonego w kamerę Leica (DFC) 320 R2; Pozostałe jaja przechowywano w klimatyzowanym pomieszczeniu w standardowych warunkach hodowlanych przez 24 godziny, a następnie zmierzono podpróbkę niedawno wyklutych larw pierwszej fazy (n ≥ 200 na dietę), jak opisano powyżej. Liczbę jaj oraz wielkość jaj i larw porównano pomiędzy grupami stosując jednokierunkową analizę wariancji i analizę post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Lotne substancje z przestrzeni nad cieczą ze świeżego (1 godz. po pobraniu próbki), moczu leżakującego po 24, 72 i 168 godzinach pobrano z próbek pobranych od bydła rasy Zebu, Arsi. Dla wygody próbki moczu pobierano wcześnie rano, gdy krowy były jeszcze w oborze. Próbki moczu pobrano od 10 osobników, a 100–200 ml każdej próbki przeniesiono do indywidualnych poliamidowych worków do pieczenia (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) umieszczonych w 3-litrowych poliamidowych beczkach z pokrywką w plastikowych beczkach z chlorku winylu. Lotne substancje z przestrzeni nad cieczą z każdej próbki moczu bydlęcego pobrano bezpośrednio (świeżo) lub po dojrzewaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godz., 72 godz. i 168 godz., tzn. każda próbka moczu była reprezentatywna dla każdej grupy wiekowej.
Do zbierania lotnych substancji z przestrzeni nad cieczą zastosowano układ zamknięty, w którym strumień gazu filtrowanego węglem aktywnym (100 ml min-1) przez worek poliamidowy do kolumny adsorpcyjnej cyrkulował przez 2,5 godziny, stosując pompę próżniową z membraną (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Jako kontrolę zbieranie substancji z przestrzeni nad cieczą przeprowadzono z pustego worka poliamidowego. Kolumnę adsorpcyjną wykonano z rurki teflonowej (5,5 cm x 3 mm średnicy wewnętrznej) zawierającej 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) pomiędzy korkami z wełny szklanej. Przed użyciem kolumnę przepłukano 1 ml redestylowanego n-heksanu (Merck, Darmstadt, DE) i 1 ml pentanu (99,0% rozpuszczalnika o czystości GC, Sigma Aldrich). Zaadsorbowane substancje lotne eluowano 400 μl pentanu. Zbiory fazy gazowej połączono i przechowywano w temperaturze -20°C do momentu wykorzystania w dalszych analizach.
Reakcje behawioralne poszukujących żywiciela i żywiących się krwią An.Ekstrakty lotne przestrzeni nad powierzchnią zebrane ze świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu analizowano pod kątem obecności ekstraktów lotnych z komarów Arabidopsis przy użyciu olfaktometru z prostą szklaną rurką [18]. Eksperymenty przeprowadzono w ZT 13-15, w szczytowym okresie aktywności poszukiwania domu przez An.Arab [19].Olfaktometr z szklaną rurką (80 cm × 9,5 cm średnicy wewnętrznej) oświetlono 3 ± 1 luksów czerwonego światła z góry.Przepływ powietrza przefiltrowanego węglem drzewnym i nawilżonego (25 ± 2 °C, 65 ± 2% wilgotności względnej) przeszedł przez biotest przy 30 cm s-1.Powietrze przepływa przez szereg sit ze stali nierdzewnej, tworząc laminarny przepływ i jednorodną strukturę pióropusza.Dozownik tamponów dentystycznych (4 cm × 1 cm; D:D; DAB Dental AB), zawieszony na 5 cm zwoju na nawietrznym końcu olfaktometru, ze zmianą stymulatora co 5 minut. Do analizy użyto 10 μl każdego ekstraktu z przestrzeni nad cieczą, rozcieńczonego w stosunku 1:10, jako bodźca. Jako kontrolę zastosowano taką samą ilość pentanu. Poszczególne komary poszukujące żywiciela lub ssące krew umieszczono w indywidualnych klatkach wypuszczających 2-3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Klatkę wypuszczającą umieszczono po stronie nawietrznej olfaktometru, a komary pozostawiono do aklimatyzacji przez 1 minutę, a następnie otworzono zawór motylkowy klatki, aby wypuścić. Przyciąganie do leczenia lub kontroli analizowano jako proporcję komarów, które miały kontakt ze źródłem w ciągu 5 minut od wypuszczenia. Każdy lotny ekstrakt z przestrzeni nad cieczą i kontrola zostały powtórzone co najmniej 30 razy, a aby uniknąć efektów jednego dnia, przetestowano taką samą liczbę zabiegów i kontroli na każdego dnia eksperymentu. Szukaj odpowiedzi od gospodarza i zwierząt karmionych krwią. Zestawy arabskie i headspace analizowano przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównano parami dla ilorazów szans (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Reakcja tarłowa An. Ekstrakty przestrzeni nad powierzchnią cieczy ze świeżego i starego moczu krowiego analizowano w klatkach Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Kubki plastikowe (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej stanowiły podłoże do tarła i zostały umieszczone w przeciwległych rogach klatki, w odległości 24 cm od siebie. Kubki do leczenia dostosowano za pomocą 10 μl każdego ekstraktu przestrzeni nad powierzchnią cieczy w rozcieńczeniu 1:10. Do dostosowania kubka kontrolnego użyto takiej samej ilości pentanu. Kubki do leczenia i kontrolne wymieniano między każdym eksperymentem w celu kontrolowania wpływu położenia. Dziesięć samic karmionych krwią wypuszczono do klatek eksperymentalnych w czasie ZT 9-11, a jaja w kubkach policzono 24 godziny później. Wzór na obliczenie wskaźnika tarła jest następujący: (liczba jaj złożonych w kubku do leczenia – liczba jaj złożonych w kubku kontrolnym)/(całkowita liczba Każdy zabieg powtarzano 8 razy.
Analizę chromatograficzną gazową i detekcję wzoru anteny elektronowej (GC-EAD) żeńskich An. arabiensis przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [20]. W skrócie, świeże lotne ekstrakty z przestrzeni nad cieczą rozdzielono przy użyciu chromatografu GC 6890 firmy Agilent Technologies (Santa Clara, Kalifornia, USA) wyposażonego w kolumnę HP-5 (średnica wewnętrzna 30 m × 0,25 mm, grubość filmu 0,25 μm, Agilent Technologies). i starzejącego się moczu. Wodór był używany jako faza ruchoma ze średnią liniową szybkością przepływu 45 cm s-1. Każda próbka (2 μl) była wstrzykiwana przez 30 sekund w trybie bez podziału przy temperaturze wlotowej 225 °C. Temperaturę pieca GC zaprogramowano od 35 °C (utrzymywanie 3 minuty) do 300 °C (utrzymywanie 10 minut) przy 10 °C min-1. W rozdzielaczu odpływu GC dodano 4 psi azotu i podzielono go 1:1 w krzyżu o niskiej objętości martwej Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) między detektorem z płomieniową jonizacją a EAD. Kapilara odpływu GC dla EAD została przepuszczona przez linię transferową Gerstel ODP-2, która śledzi temperaturę pieca GC plus 5 °C, do szklanej rurki (10 cm × 8 mm), gdzie została zmieszana z nawilżonym powietrzem filtrowanym węglem (1,5 l min−1). Antenę umieszczono w odległości 0,5 cm od wylotu rurki. Na każdego pojedynczego komara przypadało jedno powtórzenie, a w przypadku komarów poszukujących żywiciela wykonano co najmniej trzy powtórzenia na próbkach moczu w każdym wieku.
Identyfikacja związków bioaktywnych w zbiorach przestrzeni nad cieczą świeżego i starego moczu bydlęcego przy użyciu połączonego GC i spektrometru masowego (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) w celu wywołania odpowiedzi anten w analizie GC-EAD, działającego w trybie jonizacji elektronowej przy 70 eV. GC został wyposażony w kolumnę kapilarną z topionej krzemionki pokrytą powłoką UI HP-5MS (60 m × 0,25 mm średnicy wewnętrznej, 0,25 μm grubości filmu) wykorzystującą hel jako fazę ruchomą ze średnią liniową szybkością przepływu 35 cm s-1. Próbkę 2 μl wstrzyknięto przy użyciu tych samych ustawień wtryskiwacza i temperatury pieca, co w analizie GC-EAD. Związki zidentyfikowano na podstawie ich czasu retencji (wskaźnik Kováta) i widm masowych w porównaniu z biblioteką niestandardową i biblioteką NIST14 (Agilent). Zidentyfikowane związki potwierdzono przez wstrzyknięcie autentycznych standardy (Dodatkowy plik 1: Tabela S2). Do ilościowego oznaczenia wstrzyknięto octan heptylu (10 ng, 99,8% czystości chemicznej, Aldrich) jako zewnętrzny standard.
Ocena skuteczności syntetycznej mieszanki zapachowej składającej się ze związków bioaktywnych zidentyfikowanych w świeżym i starym moczu w celu przyciągnięcia poszukujących żywiciela i wysysających krew komarów Ans.arabiensis, przy użyciu tego samego olfaktometru i protokołu, jak powyżej. Mieszaniny syntetyczne naśladowały skład i proporcje związków w mieszanych lotnych ekstraktach przestrzeni nad lustrem cieczy świeżego, 24-godzinnego, 48-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu (Rysunek 5D-G; Dodatkowy plik 1: Tabela S2). Do analizy należy użyć 10 μl rozcieńczenia 1:100 w pełni syntetycznej mieszanki, o ogólnej szybkości uwalniania wynoszącej około 140-2400 ng h-1, w celu oceny atrakcyjności dla komarów żywicielskich i wysysających krew. Następnie przeprowadza się test na kompletnych mieszankach, w których usuwa się subtraktywne mieszanki pojedynczych związków kompletnej mieszanki. Zbadaj reakcje żywiciela i komarów karmionych krwią Ans.Arab vs syntetyczny i Mieszaniny subtraktywne analizowano przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównano parami ilorazy szans (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby ocenić, czy mocz krowi mógłby służyć jako sygnał siedliskowy dla komarów przenoszących malarię, świeży i stary mocz krowi, zebrany w sposób opisany powyżej, oraz wodę umieszczono w wiadrach o pojemności 3 l (100 ml) i umieszczono w pułapkach-przynętach. (wersja BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dziesięć pułapek rozmieszczono w odstępach 50 m na pastwisku, 400 m od społeczności wiejskiej (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i bez bydła, na stałych terenach lęgowych i wiosek. Pięć pułapek podgrzano, aby symulować obecność żywiciela, podczas gdy pięć pułapek pozostawiono nieogrzewanych. Każde miejsce zabiegu było zmieniane każdej nocy przez łącznie pięć nocy. Liczbę komarów złapanych w pułapki z przynętą w postaci moczu w różnym wieku porównano za pomocą regresji logistycznej z rozkładem beta dwumianowym (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
W wiosce, w której występuje malaria, niedaleko miasta Maki, w regionie Oromia w Etiopii (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; ryc. 6A). Badanie przeprowadzono w okresie od połowy sierpnia do połowy września przed corocznym opryskiem resztkowym w pomieszczeniach, wraz z długą porą deszczową. Do badania wybrano pięć par domów (oddalonych od siebie o 20–50 m) położonych na obrzeżach wioski (ryc. 6A). Kryteria wyboru domów były następujące: w domu nie wolno trzymać zwierząt, nie wolno gotować w domu (nie wyciągać drewna na opał lub węgla drzewnego) (przynajmniej w okresie próbnym) oraz w domach, w których mieszkało maksymalnie dwóch mieszkańców, śpiących w środkach owadobójczych. pod moskitierą.Zgoda etyczna została przyznana przez Instytucjonalną Komisję ds. Etyki Badań Naukowych (IRB/022/2016) Wydziału Nauk Przyrodniczych (CNS-IRB) Uniwersytetu w Addis Abebie, zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Deklarację Helsińską Światowego Stowarzyszenia Medycznego.Zgodę każdej głowy rodziny uzyskano przy pomocy personelu służby zdrowia.Cały proces jest zatwierdzany przez lokalne administracje na poziomie okręgu i okręgu („kebele”).Projekt eksperymentalny opierał się na schemacie kwadratu łacińskiego 2 × 2, w którym mieszanki syntetyczne i kontrole były przydzielane do sparowanych domów pierwszej nocy i zamieniane między domami kolejnej nocy eksperymentalnej.Proces ten powtórzono dziesięć razy.Ponadto, aby oszacować aktywność komarów w wybranych domach, pułapki CDC ustawiono tak, aby działały przez pięć kolejnych nocy na początku, w środku i na końcu badania terenowego o tej samej porze dnia.
Syntetyczną mieszaninę zawierającą sześć związków bioaktywnych rozpuszczono w heptanie (97,0% rozpuszczalnika klasy GC, Sigma Aldrich) i uwolniono w ilości 140 ng h-1 za pomocą dozownika knota bawełnianego [20]. Dozownik knota pozwolił na uwolnienie wszystkich związków w stałych proporcjach przez cały 12-godzinny eksperyment. Heptan został użyty jako kontrola. Fiolkę zawieszono obok punktu wejścia do pułapki świetlnej Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Rysunek 6A). Pułapki zawieszono 0,8–1 m nad ziemią, w pobliżu stóp łóżka, a ochotnik spał pod nieobrobioną moskitierą i działał w godzinach 18:00–06:30. Komary złapane według płci i stanu fizjologicznego (niekarmione, karmione, półciężarne i ciężarne [21]) przebadano następnie za pomocą analizy łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w celu zidentyfikowania gatunków morfologicznie zidentyfikowanych jako A. gambiae sl. Członkowie kompleksu [23]. W badaniu terenowym, pułapkowanie w parach domów analizowano przy użyciu nominalnego modelu dopasowania logistycznego, gdzie przyciąganie było zmienną zależną, a leczenie (mieszanka syntetyczna vs kontrola) było efektem stałym (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Tutaj przedstawiamy wartości χ2 i p z testu ilorazu wiarygodności.
Oceń, czy jest to bezpieczne. Arabiensis był w stanie uzyskać mocz, swoje główne źródło azotu, mocznik, poprzez bezpośrednie karmienie, w ciągu 48 godzin od podania przez 4 dni po (dpe) próbach karmienia samic poszukujących żywiciela i karmionych krwią (Rys. 1A). Zarówno samice poszukujące żywiciela, jak i ssące krew wchłonęły znacznie więcej sacharozy niż jakakolwiek inna dieta lub woda (odpowiednio F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Rys. 1B,C). Ponadto samice poszukujące żywiciela zjadły mniej moczu po 72 godzinach w porównaniu z moczem po 168 godzinach (Rys. 1B). Po zaoferowaniu diety zawierającej mocznik, samice poszukujące żywiciela wchłonęły znacznie większą ilość mocznika przy stężeniu 2,69 mM w porównaniu ze wszystkimi innymi stężeniami i wodą, podczas gdy nie można było ich odróżnić od 10% sacharozy (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Rycina 1D). Stanowiło to kontrast z reakcją samic karmionych krwią, które zazwyczaj wchłaniały znacznie więcej mocznika z diety niż z wody, choć znacznie mniej niż 10% sacharozy (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Rycina 1).1E). Ponadto, porównując oba stany fizjologiczne, samice poddane flebotomii wchłaniały więcej mocznika niż samice poszukujące żywiciela przy najniższych stężeniach, a te samice wchłaniały podobne ilości mocznika przy wyższych stężeniach (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Rycina 1F, G). Podczas gdy spożycie z diety zawierającej mocznik wydawało się mieć optymalne wartości (Rycina 1D, E), samice w obu stanach fizjologicznych były w stanie aby regulować ilość wchłanianego mocznika w całym zakresie stężeń mocznika w sposób logarytmiczno-liniowy (rys. 1F, G). Podobnie komary wydają się kontrolować pobieranie azotu poprzez regulację ilości wchłanianego moczu, ponieważ ilość azotu w moczu znajduje odzwierciedlenie w ilości wchłanianego moczu (wkładki na rysunkach 1B, C i B).
Aby ocenić wpływ moczu i mocznika na przeżywalność komarów szukających żywiciela i ssących krew, samicom podawano mocz w każdym z czterech grup wiekowych (świeży, 24 h, 72 h i 168 h po depozycji), a jako kontrolę stosowano różne stężenia mocznika, a także wodę destylowaną i 10% sacharozę (ryc. 2A). Ta analiza przeżywalności wykazała, że ​​dieta miała istotny wpływ na ogólne przeżycie samic szukających żywiciela (mocz: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; ryc. 2B, C) i samic karmionych krwią (mocz: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Rysunek 2D,E).We wszystkich eksperymentach samice karmione dietą składającą się z moczu, mocznika i wody miały znacząco niższe wskaźniki przeżywalności w porównaniu do samic karmionych dietą sacharozową (Rysunek 2B-E).Samice poszukujące żywiciela karmione świeżym i stęchłym moczem wykazywały różne wskaźniki przeżywalności, przy czym te karmione 72-godzinnym stęchłym moczem (p = 0,016) miały najniższe prawdopodobieństwo przeżycia (Rys. 2B).Co więcej, samice poszukujące żywiciela karmione 135 mM mocznika przeżyły dłużej niż kontrole otrzymujące wodę (p < 0,04) (Rys. 2C).W porównaniu z wodą, kobiety karmione świeżym moczem i moczem z 24-godzinnego moczem przeżyły dłużej (odpowiednio p = 0,001 i p = 0,012; Rysunek 2D), podczas gdy kobiety karmione moczem z 72-godzinnego moczem przeżyły dłużej niż te karmione Skróconym świeżym moczem i 24-godzinnym moczem (p < 0,0001 i p = 0,013, odpowiednio; Rysunek 2D). Samice karmione krwią, którym podawano 135 mM mocznika, przeżyły dłużej niż samice karmione innymi stężeniami mocznika i wody (p < 0,013; Rysunek 2E).
Przeżywalność żywicieli i ssących krew samic Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. W biopróbie (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, mocznika w różnych stężeniach, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). Przeżywalność komarów poszukujących żywiciela (B, C) i ssących krew (D, E) rejestrowano co 12 godzin, aż wszystkie samice żywione moczem (B, D) i mocznikiem (C, E) oraz osobniki kontrolne, czyli sacharozą i wodą, padły.
Całkowity dystans i liczba rund określone w teście młyna lotnego w okresie 24 godzin różniły się między komarami szukającymi żywiciela i ssącymi krew, które ogólnie wykazywały mniejszą aktywność lotną (rys. 3). Komary szukające żywiciela, które dostarczały świeży i stary mocz lub sacharozę i wodę, wykazywały odrębne wzorce lotu (rys. 3), przy czym samice żywiące się świeżym moczem były bardziej aktywne o świcie, podczas gdy te karmione moczem w wieku 24 i 168 godzin, które żywiły się moczem, wykazywały różne wzorce lotu i były głównie dzienne. Komary płci żeńskiej, które dostarczały sacharozę lub mocz w wieku 72 godzin, wykazywały aktywność przez cały okres 24 godzin, podczas gdy samice, które dostarczały wodę, były bardziej aktywne w środku okresu. Komary żywione sacharozą wykazywały najwyższy poziom aktywności późną nocą i wczesnym rankiem, podczas gdy u tych, które spożywały mocz w wieku 72 godzin, zaobserwowano stały spadek aktywności w ciągu 24 godzin (rys. 3).
Wydajność lotu polujących na żywiciela, krwiopijnych samic Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. W teście w młynie przelotowym samice komarów żywiące się świeżym i starym moczem krowim, różnymi stężeniami mocznika, sacharozą (10%) i wodą destylowaną (H2O) były przywiązane do poziomych, swobodnie obracających się ramion (powyżej). W przypadku samic poszukujących żywiciela (po lewej) i żywiących się krwią (po prawej) rejestrowano całkowity dystans i liczbę lotów na godzinę dla każdej diety w okresie 24 godzin (ciemny: szary; jasny: biały). Średni dystans i średnia liczba lotów są pokazane po prawej stronie wykresu aktywności dobowej. Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej. Analiza statystyczna — zobacz tekst
Ogólnie rzecz biorąc, ogólna aktywność lotu samic poszukujących żywiciela podążała za wzorcem podobnym do odległości lotu w okresie 24 godzin. Średnia odległość lotu była istotnie zależna od przyjmowanej diety (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a samice poszukujące żywiciela, które spożyły mocz z 72 godzin, przelatywały istotnie dłuższe odległości w porównaniu do wszystkich innych diet (p < 0,0001), a komary karmione sacharozą latały dłużej niż komary karmione świeżym (p = 0,022) i 24-godzinnym moczem (p = 0,022). W przeciwieństwie do wzorca aktywności lotu opisanego przez dietę moczową, samice poszukujące żywiciela karmione mocznikiem wykazywały stałą aktywność lotu w okresie 24 godzin, osiągając szczyt w drugiej połowie fazy ciemności (ryc. 3). Chociaż wzorce aktywności były podobne, samice poszukujące żywiciela karmione mocznikiem istotnie zwiększały średnią odległość lotu w zależności od wchłoniętego stężenia (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice poszukujące żywiciela, karmione dowolnym stężeniem mocznika, latały dłużej niż samice karmione wodą lub sacharozą (p < 0,03).
Całkowita aktywność lotu krwiopijnych komarów była stabilna i utrzymywała się przez 24 godziny przy wszystkich dietach, ze zwiększoną aktywnością moczu w drugiej połowie okresu ciemności u samic karmionych wodą, jak również u samic karmionych świeżą wodą i w wieku 24 godzin (rysunek 3). Podczas gdy dieta oparta na moczu istotnie wpływała na średni dystans lotu u samic karmionych krwią (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), dieta mocznikowa nie miała takiego wpływu (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) w przypadku innego moczu i diety kontrolnej (świeżej, p = 0,0091; 72 godziny, p = 0,0022; 168 godzin, p = 0,001; sacharozy, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Wpływ karmienia moczem i mocznikiem na parametry rozrodcze oceniano w biotestach składania jaj (rysunek 4A) i badano w oparciu o liczbę jaj złożonych przez każdą samicę, wielkość jaj i nowo wyklute larwy pierwszego stadium.Liczba złożonych jaj.Samice arabskie karmione moczem różniły się dietą (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; rys. 4B).Samice karmione 24-godzinnym moczem i krwią składały znacznie więcej jaj niż samice karmione innymi dietami moczowymi i były podobne do tych karmionych sacharozą (rys. 4B).Podobnie wielkość jaj składanych przez samice karmione moczem różniła się w zależności od diety (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), przy czym samice karmione 24-godzinnym moczem i sacharozą składały znacznie większe jaja niż samice karmione wodą, podczas gdy jaja samic karmionych 168 h moczu były istotnie mniejsze (ryc. 4C). Ponadto dieta moczowa istotnie wpłynęła na wielkość larw (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), przy czym z jaj składanych przez samice karmione moczem w wieku 24 i 72 godzin wylęgały się istotnie większe larwy niż z jaj składanych przez larwy karmione wodą i moczem w wieku 168 godzin (ryc. 4D).
Wydajność reprodukcyjna samic Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. Samice komarów karmione krwią karmiono dietą składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, różnych stężeń mocznika, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O) przez 48 godzin przed umieszczeniem w biotestach i uzyskaniem substratów do składania jaj przez 48 godzin (A). Liczba jaj (B, E), wielkość jaj (C, F) i wielkość larw (D, G) były istotnie zależne od podawanej diety (mocz krowi: BD; mocznik: EG). Średnie dla każdego parametru mierzonego przy użyciu różnych nazw literowych istotnie różniły się od siebie (jednokierunkowa ANOVA z wykorzystaniem analizy post hoc Tukeya; p < 0,05). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej
Jako główny składnik azotowy moczu, mocznik, podawany w diecie samic karmionych krwią, znacząco wpływał na parametry reprodukcyjne we wszystkich badaniach. Liczba jaj złożonych przez samice karmione mocznikiem, po posiłku krwią, w zależności od stężenia mocznika (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice karmione mocznikiem w stężeniu od 134 µM do 1,34 mM składały więcej jaj (Rysunek 4E). Samice karmione mocznikiem w stężeniu 134 µM lub wyższym składały większe jaja niż samice karmione wodą (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Rysunek 4F), a także wielkość larw, chociaż zależna od podobnych stężeń mocznika u matek (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) była bardziej zmienna (Rys. (4G).
Ogólna atrakcyjność dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nad powierzchnią moczu bydlęcego poszukujących żywiciela. Arabiensis oceniany w szklanym olfaktometrze rurkowym (rys. 5A) był istotnie zależny od wieku moczu (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; rys. 5B). Analiza post hoc wykazała, że ​​stęchły zapach moczu po 24 godzinach powodował istotnie wyższy poziom atrakcyjności w porównaniu ze wszystkimi innymi metodami leczenia (72 godziny: p = 0,0060, 168 godzin: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), z wyjątkiem zapachu świeżego moczu (p = 0,13; rys. 5B). Chociaż ogólna atrakcyjność komarów ssących krew zapachem moczu nie była istotnie różna (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; rys. 5C), stwierdzono, że te samice były istotnie bardziej atrakcyjne dla przestrzeni nad powierzchnią moczu. ekstrakty lotne w porównaniu z moczem pobranym w ciągu 72 godzin i grupą kontrolną (p = 0,0066; rycina 5C).
Reakcje behawioralne na naturalne i syntetyczne zapachy moczu krowiego w poszukiwaniu żywiciela i krwiopijnego Anopheles arabianus. Schemat szklanego olfaktometru (A). Przyciąganie lotnych ekstraktów z przestrzeni nad cieczą ze świeżego i starego moczu krowiego do komarów żywiciela (B) i krwiopijnych (C). Znajdź reakcję macek Lorda An. Przedstawiono ekstrakty z przestrzeni nad cieczą wyizolowane ze świeżego (D), 24-godzinnego (E), 72-godzinnego (F) i 168-godzinnego (G) moczu krowiego. Ślady wykrywania anteny elektronowej (EAD) pokazują zmiany napięcia w odpowiedzi na związki bioaktywne w przestrzeni nad cieczą wymyte z chromatografu gazowego i wykryte przez detektor z płomieniową jonizacją (FID). Pasek skali przedstawia amplitudę odpowiedzi (mV) w stosunku do czasu retencji (s). Przedstawiono właściwości i szybkości uwalniania (µg h-1) biologicznie aktywnych związków. Pojedyncza gwiazdka (*) oznacza spójną odpowiedź o niskiej amplitudzie. Podwójne gwiazdki (**) oznaczają niepowtarzalne reakcje.Znajdź żywiciela (H) i krwiopijcę (I) An.arabiensis różnie reaguje na syntetyczne mieszanki zapachów świeżego i starego moczu krowiego.Średnie proporcje komarów przyciąganych przez różne nazwy liter istotnie się od siebie różniły (jednokierunkowa analiza wariancji z wykorzystaniem analizy post hoc Tukeya; p < 0,05).Słupki błędów oznaczają błąd standardowy skali
U samic Ann.arabiensis, 72 i 120 godzin po pobraniu krwi w trakcie tarła, nie wykazano preferencji dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nad cieczą ze świeżego i starego moczu krów w porównaniu z kontrolami pentanowymi (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatkowy plik 1: Ryc. S1).
W przypadku żeńskiego Ann.arabiensis analizy GC-EAD i GC-MS pozwoliły zidentyfikować odpowiednio osiem, sześć, trzy i trzy związki bioaktywne (ryc. 5D-G). Mimo że zaobserwowano różnice w liczbie związków wywołujących reakcje elektrofizjologiczne, większość z tych związków była obecna w każdym wyciągu lotnym z przestrzeni nad cieczą pobranym ze świeżego i starego moczu. Dlatego w przypadku każdego wyciągu w dalszych analizach uwzględniono tylko te związki, które wywołały reakcję fizjologiczną czułek żeńskich powyżej progu.
Całkowita szybkość uwalniania lotnych związków bioaktywnych w zbiorze przestrzeni nad cieczą wzrosła z 29 µg h-1 w świeżym moczu do 242 µg h-1 w moczu leżakowanym po 168 godzinach, głównie z powodu p-krezolu i m-formaldehydu, a także wzrostu stężenia fenolu. Natomiast szybkości uwalniania innych związków, takich jak 2-cykloheksen-1-on i dekanal, zmniejszały się wraz ze wzrostem wieku moczu, co korelowało z obserwowanym spadkiem intensywności sygnału (obfitości) na chromatogramie (rys. 5D-G lewy panel) i reakcjami fizjologicznymi na te związki (rys. 5D-G prawy panel).
Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczna mieszanka miała podobny naturalny stosunek związków bioaktywnych zidentyfikowanych w lotnych ekstraktach świeżego i leżakowanego moczu (ryc. 5D–G) i nie wydawała się wzbudzać znaczącego zainteresowania w poszukiwaniu żywiciela (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; ryc. 5H) lub komarów ssących krew (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; ryc. 5I). Jednakże porównania parami post hoc między metodami leczenia wykazały, że komary poszukujące żywiciela były znacząco atrakcyjne dla syntetycznej mieszanki 24-godzinnego leżakowanego moczu w porównaniu z kontrolami z pentanem (p = 0,0086; ryc. 5H).
Aby ocenić rolę poszczególnych składników w syntetycznych mieszankach 24-godzinnego moczu, sześć mieszanek subtraktywnych oceniono w porównaniu z kompletnymi mieszankami w teście z rurką w kształcie litery Y, w którym usunięto pojedyncze związki. W przypadku komarów poszukujących żywiciela odejmowanie pojedynczych związków od kompletnej mieszanki miało istotny wpływ na reakcje behawioralne (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Dodatkowy plik 1: Rysunek S2A), wszystkie mieszanki subtraktywne były bardziej atrakcyjne niż mniejsze niż w pełni wymieszane. Natomiast usunięcie pojedynczych związków z całkowicie syntetycznej mieszanki nie miało wpływu na reakcje behawioralne komarów ssących krew (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), z wyjątkiem dekanalu, którego stężenie było niższe w porównaniu z przyciąganiem kompletnej mieszanki (p = 0,022; Dodatkowy plik 1: Rysunek S2B).
W wiosce w Etiopii, w której występuje endemiczna malaria, skuteczność syntetycznej mieszanki 24-godzinnego moczu krowiego w przyciąganiu komarów w warunkach terenowych oceniano przez dziesięć nocy (ryc. 6A). Łącznie złapano i zidentyfikowano 4861 komarów, z czego 45,7% stanowiły Anthropus gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis, a 35,4% Culex spp. (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Anopheles arabinis jest jedynym członkiem kompleksu gatunków An.Gambian zidentyfikowanym za pomocą analizy PCR. Średnio łapano 320 komarów na noc, w tym czasie pułapki z przynętami z syntetycznej mieszanki złapały więcej komarów niż pułapki parzyste bez mieszanki (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pułapki bez przynęty rozstawiano każdej z pięciu nocy kontrolnych na początku, środek i koniec badania.Podobną liczbę komarów złapano w każdej parze pułapek, co wskazuje na brak odchyleń między domkami (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i brak spadku populacji w okresie badania.W porównaniu z pułapkami kontrolnymi liczba komarów złapanych w pułapki zawierające syntetyczną mieszankę była istotnie zwiększona: poszukujące żywiciela (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), niedawne pobieranie krwi (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i ciąża (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Dodatkowy plik 1: Tabela S1).Odzwierciedla to również całkowita liczba złapanych komarów: poszukujące żywiciela > krwiopijne > ciężarne > półciężarne > samce.
Ocena terenowa skuteczności 24-godzinnej mieszanki syntetycznego zapachu moczu krowiego. Badania terenowe przeprowadzono w południowo-środkowej Etiopii (mapa), w pobliżu miasta Maki (wkładka), używając pułapki świetlnej Centrum Kontroli Chorób (CDC) (po prawej) w parach domków o wzorze kwadratu łacińskiego (obraz lotniczy) (A). Fotopułapki CDC wabiące syntetycznym zapachem przyciągają i łapią samice komarów Anopheles arabesques (B), ale nie komarów Anopheles farroes (C), w inny sposób, efekt zależny od stanu fizjologicznego. Ponadto pułapki te wyłapały znacznie większą liczbę komarów żywicielskich Culex. (D) W porównaniu z grupą kontrolną. Słupki po lewej stronie przedstawiają średni wskaźnik selekcji komarów złapanych w parach pułapek z przynętą zapachową (zielona) i kontrolnych (otwartych) (N = 10), podczas gdy słupki po prawej stronie przedstawiają średni wskaźnik selekcji w parach pułapek kontrolnych (otwartych; N = 5). ). Gwiazdki oznaczają poziomy istotności statystycznej (*p = 0,01 i ***p < 0,0001)
Wszystkie trzy gatunki odławiano w różny sposób w pułapkach zawierających mieszanki syntetyczne. Poszukując żywiciela (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), żywienia się krwią (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i ciąży (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), .arabiensis został złapany w pułapkę uwalniając mieszankę syntetyczną (rys. 6B), podczas gdy ilość An nie różniła się. Stwierdzono, że Pharoensis są w różnych stanach fizjologicznych (rys. 6C). W przypadku Culex, w pułapkach z przynętą zmieszaną z mieszanką syntetyczną (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; rys. 6D), stwierdzono jedynie istotny wzrost liczby komarów poszukujących żywicieli w porównaniu z pułapkami kontrolnymi.
Pułapki-przynęty umieszczone poza potencjalnymi żywicielami, między miejscami rozrodu a społecznościami wiejskimi w Etiopii, zostały wykorzystane do oceny, czy komary przenoszące malarię wykorzystują zapach moczu krowiego jako sygnał siedliska żywiciela. W przypadku braku sygnałów żywicielskich, ciepła oraz obecności lub braku zapachu moczu krowiego, nie złapano żadnych komarów (plik dodatkowy 1: Rysunek S3). Jednak w obecności wysokiej temperatury i zapachu moczu krowiego samice komarów przenoszących malarię były wabione i łapane, choć w niewielkich liczbach, niezależnie od wieku moczu (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; plik dodatkowy 1: Rysunek S3). Natomiast kontrole wodne nie łapią komarów przenoszących malarię w wysokich temperaturach (plik dodatkowy 1: Rysunek S3).
Komary przenoszące malarię pozyskują i rozprowadzają związki zawierające azot poprzez kompensacyjne żerowanie na moczu krów (np. kałużach), aby wzmocnić cechy cyklu życiowego, podobnie jak inne owady [2, 4, 24, 25, 26]. Mocz krów jest łatwo dostępnym odnawialnym zasobem ściśle związanym z miejscami odpoczynku nosicieli malarii, takimi jak obory i wysoka roślinność w pobliżu domów wiejskich i miejsc tarła. Samice komarów lokalizują ten zasób za pomocą zapachu i są w stanie regulować pobieranie związków azotowych z moczu, w tym mocznika, głównego składnika azotowego moczu [15, 16]. W zależności od stanu fizjologicznego samicy komara składniki odżywcze w moczu są przydzielane w celu zwiększenia aktywności lotu i przeżycia samic komarów poszukujących żywiciela, a także przeżycia i cech reprodukcyjnych osobników karmionych krwią w pierwszym cyklu gonadotropowym. Dlatego mieszanie moczu odgrywa ważną rolę odżywczą dla nosicieli malarii, którzy są zamknięci jak niedożywieni dorośli [8], ponieważ zapewnia samicom komarów zdolność do pozyskiwania ważnych związków azotowych poprzez stosowanie diety o niskim ryzyku. Odkrycie to ma istotne konsekwencje epidemiologiczne, ponieważ samice zwiększają swoją oczekiwaną długość życia, aktywność i wydajność reprodukcyjną, co ma wpływ na zdolność przenoszenia wektorów. Ponadto zachowanie to może być celem przyszłych programów zarządzania wektorami.