Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla jednocześnie karuzelę trzech slajdów.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby przechodzić między trzema slajdami jednocześnie, lub użyj przycisków suwaków na końcu, aby przechodzić między trzema slajdami jednocześnie.
Bariera krew-mózg i bariera krew-mózg uniemożliwiają bioterapeutykom dotarcie do celu w ośrodkowym układzie nerwowym, utrudniając tym samym skuteczne leczenie chorób neurologicznych.Aby odkryć nowe transportery mózgowe in vivo, wprowadziliśmy bibliotekę peptydów faga T7 i seryjnie zebraliśmy krew i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) przy użyciu kaniulowanego świadomego modelu dużej puli szczurów.Specyficzne klony fagów były silnie wzbogacone w CSF po czterech rundach selekcji.Testowanie poszczególnych kandydujących peptydów ujawniło ponad 1000-krotne wzbogacenie płynu mózgowo-rdzeniowego.Bioaktywność dostarczania do mózgu za pośrednictwem peptydów została potwierdzona przez 40% redukcję poziomu amyloidu-β w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu inhibitora peptydu BACE1 połączonego ze zidentyfikowanym nowym peptydem tranzytowym.Wyniki te sugerują, że peptydy zidentyfikowane metodami selekcji fagów in vivo mogą być użytecznymi nośnikami do ogólnoustrojowego dostarczania makrocząsteczek do mózgu z efektem terapeutycznym.
Badania terapii ukierunkowanej na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) w dużej mierze koncentrowały się na identyfikacji zoptymalizowanych leków i środków, które wykazują właściwości ukierunkowane na OUN, przy mniejszym wysiłku odkrywania mechanizmów napędzających aktywne dostarczanie leków do mózgu.To zaczyna się teraz zmieniać, ponieważ dostarczanie leków, zwłaszcza dużych cząsteczek, jest integralną częścią opracowywania nowoczesnych leków neurobiologicznych.Środowisko ośrodkowego układu nerwowego jest dobrze chronione przez układ bariery naczyniowo-mózgowej, składający się z bariery krew-mózg (BBB) ​​i bariery krew-mózg (BCBB)1, co utrudnia dostarczanie leków do mózgu1,2.Szacuje się, że prawie wszystkie leki wielkocząsteczkowe i ponad 98% leków małocząsteczkowych jest usuwanych z mózgu3.Dlatego tak ważna jest identyfikacja nowych systemów transportu mózgowego, które zapewniają wydajne i specyficzne dostarczanie leków terapeutycznych do OUN 4,5.Jednak BBB i BCSFB stanowią również doskonałą okazję do dostarczania leków, ponieważ penetrują i wchodzą do wszystkich struktur mózgu poprzez jego rozległe unaczynienie.Tak więc obecne wysiłki zmierzające do zastosowania nieinwazyjnych metod dostarczania do mózgu opierają się w dużej mierze na mechanizmie transportu za pośrednictwem receptora (PMT) z wykorzystaniem endogennego receptora BBB6.Pomimo ostatnich kluczowych postępów w wykorzystaniu szlaku receptora transferyny7,8 wymagany jest dalszy rozwój nowych systemów dostarczania o ulepszonych właściwościach.W tym celu naszym celem było zidentyfikowanie peptydów zdolnych do pośredniczenia w transporcie płynu mózgowo-rdzeniowego, ponieważ zasadniczo można by je wykorzystać do dostarczania makrocząsteczek do OUN lub otwierania nowych szlaków receptorowych.W szczególności specyficzne receptory i transportery układu naczyniowo-mózgowego (BBB i BSCFB) mogą służyć jako potencjalne cele dla aktywnego i swoistego dostarczania leków bioterapeutycznych.Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) jest produktem wydzielniczym splotu naczyniówkowego (CS) i ma bezpośredni kontakt z płynem śródmiąższowym mózgu poprzez przestrzeń podpajęczynówkową i przestrzeń komorową4.Ostatnio wykazano, że płyn podpajęczynówkowy ulega nadmiernej dyfuzji do śródmiąższu mózgu9.Mamy nadzieję na dostęp do przestrzeni miąższowej tą drogą napływu podpajęczynówkowego lub bezpośrednio przez BBB.Aby to osiągnąć, wdrożyliśmy solidną strategię selekcji fagów in vivo, która idealnie identyfikuje peptydy transportowane przez jedną z tych dwóch odrębnych ścieżek.
Opisujemy teraz sekwencyjną metodę przesiewową prezentacji fagowej in vivo z pobieraniem próbek płynu mózgowo-rdzeniowego w połączeniu z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (HTS) w celu monitorowania początkowych rund selekcji z najwyższą różnorodnością bibliotek.Badania przesiewowe przeprowadzono na przytomnych szczurach z wszczepioną na stałe kaniulą dużego cisterna (CM), aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.Co ważne, podejście to wybiera zarówno celowanie w mózg, jak i peptydy o aktywności transportowej przez barierę naczyniowo-mózgową.Użyliśmy fagów T7 ze względu na ich mały rozmiar (~60 nm)10 i zasugerowaliśmy, że są one odpowiednie do transportu pęcherzyków, które umożliwiają transkomórkowe przekraczanie bariery śródbłonek i/lub nabłonek-rdzeń.Po czterech rundach panoramowania wyizolowano populacje fagów wykazujące silne wzbogacenie płynu mózgowo-rdzeniowego in vivo i asocjację mikronaczyń mózgowych.Co ważne, byliśmy w stanie potwierdzić nasze odkrycia, wykazując, że preferowane i chemicznie syntetyzowane najlepsze kandydujące peptydy są w stanie transportować ładunek białkowy do płynu mózgowo-rdzeniowego.Najpierw ustalono działanie farmakodynamiczne OUN przez połączenie wiodącego peptydu tranzytowego z inhibitorem peptydu BACE1.Oprócz wykazania, że ​​​​strategie funkcjonalnego przeszukiwania in vivo mogą identyfikować nowe peptydy transportujące mózg jako skuteczne nośniki ładunku białkowego, oczekujemy, że podobne podejścia do selekcji funkcjonalnej staną się również ważne w identyfikacji nowych szlaków transportu mózgowego.
W oparciu o jednostki tworzące łysinki (PFU), po etapie pakowania faga, zaprojektowano i utworzono bibliotekę losowych 12-merowych liniowych peptydów faga T7 o różnorodności około 109 (patrz Materiały i metody).Należy zauważyć, że dokładnie przeanalizowaliśmy tę bibliotekę przed panoramowaniem in vivo.Amplifikacja PCR próbek biblioteki fagowej przy użyciu zmodyfikowanych starterów wygenerowała amplikony, które można było bezpośrednio zastosować do HTS (Uzupełniająca Fig. 1a).Ze względu na a) błędy sekwencjonowania HTS11, b) wpływ na jakość starterów (NNK) 1-12 i c) obecność faga typu dzikiego (wt) (wstawki szkieletu) w bibliotece rezerwowej, wdrożono procedurę filtrowania sekwencji w celu wyodrębnienia tylko zweryfikowanych informacji o sekwencji (Uzupełniająca Ryc. 1b).Te etapy filtrowania mają zastosowanie do wszystkich bibliotek sekwencjonowania HTS.W przypadku biblioteki standardowej uzyskano łącznie 233 868 odczytów, z których 39% spełniło kryteria filtrowania i wykorzystano do analizy biblioteki i selekcji do kolejnych rund (rysunek uzupełniający 1c – e).Odczyty były przeważnie wielokrotnościami długości 3 par zasad z pikiem przy 36 nukleotydach (rysunek uzupełniający 1c), potwierdzając projekt biblioteki (NNK) 1-12.Warto zauważyć, że około 11% członków biblioteki zawierało 12-wymiarową wstawkę PAGISRELVDKL szkieletu typu dzikiego (wt), a prawie połowa sekwencji (49%) zawierała insercje lub delecje.HTS biblioteki biblioteki potwierdził dużą różnorodność peptydów w bibliotece: ponad 81% sekwencji peptydów znaleziono tylko raz, a tylko 1, 5% wystąpiło w ≥ 4 kopiach (Uzupełniająca Ryc. 2a).Częstotliwości aminokwasów (aa) na wszystkich 12 pozycjach w repertuarze dobrze korelowały z częstotliwościami oczekiwanymi dla liczby kodonów generowanych przez zdegenerowany repertuar NKK (Uzupełniająca Ryc. 2b).Obserwowana częstotliwość reszt aa kodowanych przez te wstawki dobrze korelowała z obliczoną częstotliwością ( r = 0, 893) (rysunek uzupełniający 2c).Przygotowanie bibliotek fagowych do wstrzyknięcia obejmuje etapy amplifikacji i usunięcia endotoksyny.Wykazano wcześniej, że potencjalnie zmniejsza to różnorodność bibliotek fagowych12,13.Dlatego zsekwencjonowaliśmy bibliotekę fagów amplifikowanych na płytkach, która została poddana usunięciu endotoksyn i porównaliśmy ją z oryginalną biblioteką, aby oszacować częstość AA.Zaobserwowano silną korelację ( r = 0, 995) między pierwotną pulą a amplifikowaną i oczyszczoną pulą (Uzupełniająca Fig. 2d), co wskazuje, że konkurencja między klonami amplifikowanymi na płytkach z użyciem faga T7 nie spowodowała większego błędu.To porównanie opiera się na częstotliwości motywów tripeptydowych w każdej bibliotece, ponieważ różnorodności bibliotek (~ 109) nie można w pełni uchwycić nawet za pomocą HTS.Analiza częstotliwości aa w każdej pozycji ujawniła niewielkie odchylenie zależne od pozycji w ostatnich trzech pozycjach wprowadzonego repertuaru (rysunek uzupełniający 2e).Podsumowując, doszliśmy do wniosku, że jakość i różnorodność biblioteki były akceptowalne i zaobserwowano jedynie niewielkie zmiany w różnorodności z powodu amplifikacji i przygotowania bibliotek fagowych między kilkoma rundami selekcji.
Seryjne pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego można przeprowadzić przez chirurgiczne wszczepienie kaniuli do CM przytomnych szczurów, aby ułatwić identyfikację faga T7 wstrzykniętego dożylnie (iv) przez BBB i / lub BCSFB (ryc. 1a-b).Użyliśmy dwóch niezależnych ramion selekcyjnych (ramion A i B) w pierwszych trzech rundach selekcji in vivo (ryc. 1c).Stopniowo zwiększaliśmy surowość selekcji, zmniejszając całkowitą ilość faga wprowadzonego w pierwszych trzech rundach selekcji.W czwartej rundzie panoramowania połączyliśmy próbki z gałęzi A i B i wykonaliśmy trzy dodatkowe niezależne selekcje.Aby zbadać właściwości in vivo cząstek faga T7 w tym modelu, fag typu dzikiego (wstawka główna PAGISRELVDKL) wstrzyknięto szczurom przez żyłę ogonową.Odzyskiwanie fagów z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi w różnych punktach czasowych wykazało, że stosunkowo małe dwudziestościenne fagi T7 miały szybką początkową fazę klirensu z przedziału krwi (Uzupełniająca Ryc. 3).Na podstawie podanych mian i objętości krwi szczurów obliczyliśmy, że tylko około 1% wag.faga z podanej dawki wykryto we krwi 10 minut po wstrzyknięciu dożylnym.Po tym początkowym szybkim spadku zmierzono wolniejszy klirens pierwotny z okresem półtrwania wynoszącym 27,7 minuty.Co ważne, tylko kilka fagów zostało odzyskanych z przedziału CSF, co wskazuje na niskie tło dla migracji fagów typu dzikiego do przedziału CSF (Uzupełniająca Ryc. 3).Średnio tylko około 1 x 10-3% mian faga T7 we krwi i 4 x 10-8% początkowo podanych fagów wykrywano w płynie mózgowo-rdzeniowym przez cały okres pobierania próbek (0-250 min).Warto zauważyć, że okres półtrwania (25,7 min) faga typu dzikiego w płynie mózgowo-rdzeniowym był podobny do obserwowanego we krwi.Dane te pokazują, że bariera oddzielająca przedział płynu mózgowo-rdzeniowego od krwi jest nienaruszona u szczurów z kaniulą CM, co umożliwia selekcję bibliotek fagowych in vivo w celu identyfikacji klonów, które są łatwo transportowane z krwi do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego.
(a) Opracowanie metody ponownego pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z dużej puli.(b) Diagram przedstawiający komórkowe położenie bariery ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i strategię selekcji stosowaną do identyfikacji peptydów, które przekraczają barierę krew-mózg (BBB) ​​i barierę krew-mózg.(c) Schemat blokowy badania przesiewowego na fagach in vivo.W każdej rundzie selekcji fagi (identyfikatory zwierząt wewnątrz strzałek) wstrzykiwano dożylnie.Dwie niezależne alternatywne gałęzie (A, B) są trzymane oddzielnie do 4. rundy selekcji.W rundach selekcji 3 i 4 każdy klon faga wyekstrahowany z płynu mózgowo-rdzeniowego sekwencjonowano ręcznie.(d) Kinetyka faga wyizolowanego z krwi (czerwone kółka) i płynu mózgowo-rdzeniowego (zielone trójkąty) podczas pierwszej rundy selekcji u dwóch szczurów z kaniulą po dożylnym wstrzyknięciu biblioteki peptydów T7 (2 x 1012 fagów/zwierzę).Niebieskie kwadraty wskazują średnie początkowe stężenie faga we krwi, obliczone na podstawie ilości wstrzykniętego faga, z uwzględnieniem całkowitej objętości krwi.Czarne kwadraty wskazują punkt przecięcia linii y ekstrapolowanej ze stężeń faga we krwi.( e, f ) Przedstaw względną częstość i rozkład wszystkich możliwych nakładających się motywów tripeptydowych znalezionych w peptydzie.Pokazano liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach.Istotnie (p < 0,001) wzbogacone motywy zaznaczono czerwonymi kropkami.( e ) Wykres rozrzutu korelacji porównujący względną częstość motywu tripeptydowego wstrzykniętej biblioteki z fagiem pochodzącym z krwi od zwierząt # 1.1 i # 1.2.( f ) Wykres rozrzutu korelacji porównujący względne częstotliwości motywów tripeptydowych faga zwierzęcego # 1.1 i # 1.2 wyizolowanych we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym.(g, h) Reprezentacja ID sekwencji faga wzbogaconego we krwi (g) w porównaniu z bibliotekami wstrzykniętymi i faga wzbogaconego w CSF (h) w porównaniu z krwią po rundzie selekcji in vivo u obu zwierząt.Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często ten aminokwas występuje w tej pozycji.Zielony = polarny, fioletowy = neutralny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwasowy i czarny = aminokwasy hydrofobowe.Rysunek 1a, b został zaprojektowany i wykonany przez Eduarda Uricha.
Wstrzyknęliśmy bibliotekę peptydów fagowych dwóm szczurom z instrumentami CM (klady A i B) i wyizolowaliśmy faga z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi (ryc. 1d).Początkowy szybki klirens biblioteki był mniej wyraźny w porównaniu z fagiem typu dzikiego.Średni okres półtrwania wstrzykniętej biblioteki u obu zwierząt wynosił 24,8 minuty we krwi, podobnie jak w przypadku faga typu dzikiego, i 38,5 minuty w płynie mózgowo-rdzeniowym.Próbki faga krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego od każdego zwierzęcia poddano HTS i wszystkie zidentyfikowane peptydy analizowano na obecność krótkiego motywu tripeptydowego.Wybrano motywy tripeptydowe, ponieważ zapewniają minimalną podstawę do tworzenia struktury i interakcji peptyd-białko14,15.Znaleźliśmy dobrą korelację w rozkładzie motywów między wstrzykniętą biblioteką fagów a klonami wyekstrahowanymi z krwi obu zwierząt (ryc. 1e).Dane wskazują, że skład biblioteki jest tylko nieznacznie wzbogacony w przedziale krwi.Częstotliwości aminokwasów i sekwencje konsensusowe analizowano dalej w każdej pozycji przy użyciu adaptacji oprogramowania Weblogo16.Co ciekawe, stwierdziliśmy silne wzbogacenie reszt glicyny we krwi (ryc. 1g).Gdy porównano krew z klonami wybranymi z CSF, zaobserwowano silną selekcję i pewną selekcję motywów (ryc. 1f), a niektóre aminokwasy były preferencyjnie obecne w określonych pozycjach w 12 członach (ryc. 1h).Warto zauważyć, że poszczególne zwierzęta różniły się znacznie płynem mózgowo-rdzeniowym, podczas gdy u obu zwierząt obserwowano wzbogacenie krwi glicyną (Uzupełniająca Ryc. 4a – j).Po rygorystycznym filtrowaniu danych dotyczących sekwencji w płynie mózgowo-rdzeniowym zwierząt # 1.1 i # 1.2 uzyskano łącznie 964 i 420 unikalnych 12-merowych peptydów (Uzupełniająca Ryc. 1d – e).Wyizolowane klony fagów amplifikowano i poddano drugiej rundzie selekcji in vivo.Faga wyekstrahowanego z drugiej rundy selekcji poddano HTS u każdego zwierzęcia i wszystkie zidentyfikowane peptydy zastosowano jako dane wejściowe do programu rozpoznawania motywów w celu analizy występowania motywów tripeptydowych (ryc. 2a, b, ef).W porównaniu z pierwszym cyklem faga odzyskanego z płynu mózgowo-rdzeniowego zaobserwowaliśmy dalszą selekcję i odznaczenie wielu motywów w płynie mózgowo-rdzeniowym w gałęziach A i B (ryc. 2).Zastosowano algorytm identyfikacji sieci w celu określenia, czy reprezentują one różne wzorce spójnej sekwencji.Zaobserwowano wyraźne podobieństwo między 12-wymiarowymi sekwencjami odzyskanymi przez CSF w alternatywnym kladzie A (ryc. 2c, d) i kladzie B (ryc. 2g, h).Analiza zbiorcza w każdej gałęzi ujawniła różne profile selekcji dla 12-merowych peptydów (Uzupełniająca Ryc. 5c, d) i wzrost stosunku miana płynu mózgowo-rdzeniowego do krwi w czasie dla połączonych klonów po drugiej rundzie selekcji w porównaniu z pierwszą rundą selekcji (Uzupełniająca Ryc. 5e).).
Wzbogacanie motywów i peptydów w płynie mózgowo-rdzeniowym przez dwie kolejne rundy funkcjonalnej selekcji prezentacji fagowej in vivo.
Wszystkie fagi płynu mózgowo-rdzeniowego odzyskane z pierwszej rundy każdego zwierzęcia (zwierzęta nr 1.1 i nr 1.2) połączono, amplifikowano, sekwencjonowano HT i ponownie wstrzyknięto razem (2 x 1010 fagów/zwierzę) 2 szczurom z kaniulą SM (nr 1.1 → #).2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4).( a, b, e, f) Wykresy rozrzutu korelacji porównujące względną częstość motywów tripeptydowych wszystkich fagów pochodzących z CSF w pierwszej i drugiej rundzie selekcji.Względna częstość i rozkład motywów reprezentujących wszystkie możliwe nakładające się tripeptydy występujące w peptydach w obu orientacjach.Pokazano liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach.Motywy, które zostały istotnie (p <0,001) wybrane lub wykluczone w jednej z porównywanych bibliotek, zaznaczono czerwonymi kropkami.(c, d, g, h) Reprezentacja logo sekwencji wszystkich długich sekwencji 12-aminokwasowych bogatych w płyn mózgowo-rdzeniowy, oparta na rundach 2 i 1 selekcji in vivo.Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często ten aminokwas występuje w tej pozycji.Aby przedstawić logo, porównuje się częstość sekwencji płynu mózgowo-rdzeniowego wyekstrahowanych z poszczególnych zwierząt między dwiema rundami selekcji i pokazano wzbogacone sekwencje w drugiej rundzie: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4.Najbardziej wzbogacone aminokwasy w danej pozycji u zwierząt (c, d) nr.2.1 i nie.2.2 lub (g, h) u zwierząt nie.2.3 i nie.2.4 są pokazane w kolorze.Zielony = polarny, fioletowy = neutralny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwasowy i czarny = aminokwasy hydrofobowe.
Po trzeciej rundzie selekcji zidentyfikowaliśmy 124 unikalne sekwencje peptydowe (# 3.1 i # 3.2) z 332 klonów fagów odtworzonych w CSF wyizolowanych z dwóch zwierząt (Uzupełniająca Fig. 6a).Sekwencja LGSVS (18,7%) miała najwyższy względny odsetek, a następnie wstawki typu dzikiego PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%).W ostatniej czwartej rundzie połączyliśmy dwie niezależnie wybrane gałęzie od trzech oddzielnych zwierząt (ryc. 1c).Spośród 925 zsekwencjonowanych klonów fagów odzyskanych z CSF, w czwartej rundzie znaleźliśmy 64 unikalne sekwencje peptydowe (Uzupełniająca Fig. 6b), wśród których względny odsetek faga typu dzikiego spadł do 0, 8%.Najczęstszymi klonami CSF w czwartej rundzie były LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Zakres długości wybranych peptydów wynika z insercji/delecji nukleotydów lub przedwczesnych kodonów stop w starterach biblioteki, gdy stosuje się zdegenerowane kodony do projektowania biblioteki NNK.Przedwczesne kodony stop generują krótsze peptydy i są wybierane, ponieważ zawierają korzystny motyw aa.Dłuższe peptydy mogą wynikać z insercji/delecji w starterach bibliotek syntetycznych.To ustawia zaprojektowany kodon stop poza ramką i odczytuje go, dopóki nowy kodon stop nie pojawi się poniżej.Ogólnie rzecz biorąc, obliczyliśmy współczynniki wzbogacenia dla wszystkich czterech rund selekcji, porównując dane wejściowe z danymi wyjściowymi próbki.W pierwszej rundzie badań przesiewowych wykorzystaliśmy miana fagów typu dzikiego jako niespecyficzne odniesienie tła.Co ciekawe, negatywna selekcja fagów była bardzo silna w pierwszym cyklu płynu mózgowo-rdzeniowego, ale nie we krwi (ryc. 3a), co może wynikać z niskiego prawdopodobieństwa pasywnej dyfuzji większości członków biblioteki peptydów do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego lub względnych fagi są zwykle skuteczniej zatrzymywane lub usuwane z krwioobiegu niż bakteriofagi.Jednak w drugiej rundzie panoramowania zaobserwowano silną selekcję fagów w płynie mózgowo-rdzeniowym w obu kladach, co sugeruje, że poprzednia runda została wzbogacona w fagi prezentujące peptydy, które promują wychwyt płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 3a).Ponownie bez znacznego wzbogacenia krwi.Również w trzeciej i czwartej rundzie klony faga były znacząco wzbogacone w CSF.Porównując względną częstość każdej unikalnej sekwencji peptydowej między dwiema ostatnimi rundami selekcji, stwierdziliśmy, że sekwencje były jeszcze bardziej wzbogacone w czwartej rundzie selekcji (ryc. 3b).W sumie 931 motywów tripeptydowych wyekstrahowano ze wszystkich 64 unikalnych sekwencji peptydowych, stosując obie orientacje peptydów.Najbardziej wzbogacone motywy w czwartej rundzie zostały dokładniej zbadane pod kątem ich profili wzbogacenia we wszystkich rundach w porównaniu z wstrzykniętą biblioteką (odcięcie: 10% wzbogacenia) (rysunek uzupełniający 6c).Ogólne wzorce selekcji wykazały, że większość badanych motywów została wzbogacona we wszystkich poprzednich rundach obu gałęzi selekcji.Jednak niektóre motywy (np. SGL, VSG, LGS GSV) pochodziły głównie z alternatywnego kladu A, podczas gdy inne (np. FGW, RTN, WGF, NTR) zostały wzbogacone w alternatywny klad B.
Walidacja transportu CSF peptydów prezentowanych na fagach wzbogaconych w CSF i biotynylowanych peptydów liderowych sprzężonych z ładunkami streptawidyny.
( a ) Współczynniki wzbogacenia obliczone we wszystkich czterech rundach (R1-R4) na podstawie wstrzykniętych (wejście = I) mian faga (PFU) i określonych mian faga CSF (wyjście = O).Współczynniki wzbogacenia dla ostatnich trzech rund (R2-R4) obliczono przez porównanie z poprzednią rundą i pierwszą rundą (R1) z danymi wagowymi.Puste słupki to płyn mózgowo-rdzeniowy, zacienione słupki to osocze.(***p<0,001, na podstawie testu t-Studenta).( b ) Lista najliczniejszych peptydów fagowych, uszeregowana według ich względnej proporcji do wszystkich fagów zebranych w płynie mózgowo-rdzeniowym po czwartej rundzie selekcji.Sześć najczęstszych klonów fagów jest zaznaczonych kolorem, ponumerowanych i ich współczynniki wzbogacenia między rundami 3 i 4 selekcji (wstawki).( c, d ) Sześć najbardziej wzbogaconych klonów fagów, pustych bibliotek fagów i rodzicielskich peptydów fagowych z rundy 4 analizowano indywidualnie w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego.Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych.(c) Równe ilości 6 kandydujących klonów fagów (2 x 1010 fagów/zwierząt), pustych fagów (#1779) (2 x 1010 fagów/zwierząt) i podstawowych bibliotek peptydów fagów (2 x 1012 fagów/zwierząt) Wstrzyknąć co najmniej 3 CM zwierzęciu z kaniulą oddzielnie przez żyłę ogonową.Przedstawiono farmakokinetykę płynu mózgowo-rdzeniowego każdego wstrzykniętego klonu faga i biblioteki peptydów fagowych w czasie.(d) pokazuje średni stosunek płynu mózgowo-rdzeniowego do krwi dla wszystkich odzyskanych fagów/ml w czasie pobierania próbek.( e ) Cztery syntetyczne peptydy liderowe i jedną wymieszaną kontrolę połączono z biotyną ze streptawidyną przez ich N-koniec (wyświetlanie tetrameru), a następnie wstrzyknięto (żyła ogonowa iv, 10 mg streptawidyny / kg).Co najmniej trzy zaintubowane szczury (N = 3).).Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego zebrano we wskazanych punktach czasowych i zmierzono stężenia streptawidyny za pomocą testu ELISA anty-streptawidyny w płynie mózgowo-rdzeniowym (nd = nie wykryto).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na podstawie testu ANOVA).(f) Porównanie sekwencji aminokwasowej najbardziej wzbogaconego klonu peptydu faga #2002 (fioletowy) z innymi wybranymi klonami peptydu faga z czwartej rundy selekcji.Identyczne i podobne fragmenty aminokwasów są kodowane kolorami.
Spośród wszystkich wzbogaconych fagów w czwartej rundzie (ryc. 3b) wybrano sześć kandydujących klonów do dalszej indywidualnej analizy w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego.Równe ilości sześciu kandydujących fagów, pustych fagów (bez wstawki) i profagowych bibliotek peptydowych wstrzyknięto trzem kaniulowanym zwierzętom CM, a farmakokinetykę określono w testach płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 3c) i krwi (dodatkowa ryc. 7).Wszystkie testowane klony fagów celowały w przedział CSF na poziomie 10-1000 razy wyższym niż poziom pustego faga kontrolnego (#1779).Na przykład klony #2020 i #2077 miały około 1000 razy wyższe miana CSF niż fag kontrolny.Profil farmakokinetyczny każdego wybranego peptydu jest inny, ale wszystkie mają wysoką zdolność zasiedlania płynu mózgowo-rdzeniowego.Zaobserwowaliśmy stały spadek w czasie dla klonów #1903 i #2011, podczas gdy dla klonów #2077, #2002 i #2009 wzrost w ciągu pierwszych 10 minut może wskazywać na aktywny transport, ale wymaga weryfikacji.Klony #2020, #2002 i #2077 ustabilizowały się na wysokich poziomach, podczas gdy stężenie CSF klonu #2009 powoli spadało po początkowym wzroście.Następnie porównaliśmy względną częstość każdego kandydata na CSF z jego stężeniem we krwi (ryc. 3d).Korelacja średniego miana każdego kandydata na CSF z jego mianem krwi we wszystkich czasach pobierania próbek wykazała, że ​​trzech z sześciu kandydatów było znacznie wzbogaconych w CSF krwi.Co ciekawe, klon nr 2077 wykazywał wyższą stabilność krwi (rysunek uzupełniający 7).Aby potwierdzić, że same peptydy są zdolne do aktywnego transportu ładunku innego niż cząstki faga do przedziału CSF, zsyntetyzowaliśmy cztery peptydy liderowe derywatyzowane biotyną na N-końcu, gdzie peptydy przyłączają się do cząstki faga.Biotynylowane peptydy (nr 2002, 2009, 2020 i 2077) skoniugowano ze streptawidyną (SA) w celu uzyskania form multimerycznych nieco naśladujących geometrię faga.Ten format pozwolił nam również zmierzyć ekspozycję SA we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym jako peptydy białkowe przenoszące ładunek.Co ważne, dane dotyczące fagów często można było odtworzyć, gdy syntetyczne peptydy były podawane w tym formacie skoniugowanym z SA (ryc. 3e).Wymieszane peptydy miały mniejszą początkową ekspozycję i szybszy klirens płynu mózgowo-rdzeniowego z niewykrywalnymi poziomami w ciągu 48 godzin.Aby uzyskać wgląd w ścieżki dostarczania tych klonów fagów peptydowych do przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego, przeanalizowaliśmy lokalizację trafień poszczególnych peptydów fagowych za pomocą immunohistochemii (IHC) w celu bezpośredniego wykrycia cząstek faga 1 godzinę po wstrzyknięciu dożylnym in vivo.Warto zauważyć, że klony # 2002, # 2077 i # 2009 można było wykryć przez silne barwienie w naczyniach włosowatych mózgu, podczas gdy fag kontrolny (nr 1779) i klon # 2020 nie zostały wykryte (rysunek uzupełniający 8).Sugeruje to, że te peptydy przyczyniają się do wpływu na mózg właśnie poprzez przekraczanie BBB.Aby przetestować tę hipotezę, wymagana jest dalsza szczegółowa analiza, ponieważ w grę może również wchodzić trasa BSCFB.Porównując sekwencję aminokwasową najbardziej wzbogaconego klonu (nr 2002) z innymi wybranymi peptydami, zauważono, że niektóre z nich mają podobne rozszerzenia aminokwasowe, co może wskazywać na podobny mechanizm transportu (ryc. 3f).
Ze względu na swój unikalny profil w osoczu i znaczny wzrost CSF w czasie, klon fagowy # 2077 był dalej badany przez dłuższy okres 48 godzin i był w stanie odtworzyć szybki wzrost CSF obserwowany w związku z utrzymującymi się poziomami SA (ryc. 4a).Jeśli chodzi o inne zidentyfikowane klony fagów, nr 2077 wybarwiał się silnie pod kątem naczyń włosowatych mózgu i wykazywał znaczną kolokalizację z lektyną markerową naczyń włosowatych, gdy oglądano go w wyższej rozdzielczości i prawdopodobnie pewne barwienie w przestrzeni miąższowej (ryc. 4b).Aby zbadać, czy w OUN można uzyskać efekty farmakologiczne za pośrednictwem peptydów, przeprowadziliśmy eksperyment, w którym biotynylowane wersje i) peptydu tranzytowego #2077 i ii) peptydu inhibitorowego BACE1 zmieszano z SA w dwóch różnych proporcjach.Dla jednej kombinacji użyliśmy tylko inhibitora peptydowego BACE1, a dla drugiej użyliśmy stosunku 1:3 inhibitora peptydowego BACE1 do peptydu #2077.Obie próbki podano dożylnie i zmierzono poziomy peptydu beta-amyloidu 40 (Abeta40) we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym.Abeta40 mierzono w płynie mózgowo-rdzeniowym, ponieważ odzwierciedla hamowanie BACE1 w miąższu mózgu.Zgodnie z oczekiwaniami oba kompleksy znacząco obniżyły poziomy Abeta40 we krwi (ryc. 4c, d).Jednak tylko próbki zawierające mieszaninę peptydów nr.2077 i inhibitor peptydu BACE1 skoniugowany z SA spowodował znaczny spadek Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4c).Dane pokazują, że peptyd nr.2077 jest w stanie transportować białko SA o masie 60 kDa do OUN, a także indukuje działanie farmakologiczne za pomocą skoniugowanych z SA inhibitorów peptydu BACE1.
( a ) Wstrzyknięcie klonalne (2 x 100 fagów / zwierzę) faga T7 wykazujące długoterminowe profile farmakokinetyczne peptydu CSF nr 2077 (RLSSVDSDLSGC) i niewstrzykniętego faga kontrolnego (nr 1779) u co najmniej trzech szczurów intubowanych CM.(b) Obraz z mikroskopu konfokalnego reprezentatywnych mikronaczyń korowych u szczurów, którym wstrzyknięto faga (2 x 1010 fagów/zwierzę) pokazujący barwienie kontrastowe peptydu nr 2077 i naczyń (lektyny).Te klony fagów podano 3 szczurom i pozostawiono do krążenia przez 1 godzinę przed perfuzją.Mózgi podzielono na skrawki i wybarwiono przeciwciałami poliklonalnymi znakowanymi FITC przeciwko kapsydowi faga T7.Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem podawano dożylnie lektynę znakowaną DyLight594.Obrazy fluorescencyjne przedstawiające barwienie lektyną (czerwony) luminalnej strony mikronaczyń i fagów (zielony) w świetle naczyń włosowatych i okołonaczyniowej tkanki mózgowej.Pasek skali odpowiada 10 µm.(c, d) Biotynylowany peptyd hamujący BACE1 sam lub w połączeniu z biotynylowanym peptydem tranzytowym #2077 sprzęgano ze streptawidyną, a następnie wstrzykiwano dożylnie co najmniej trzem szczurom CM z kaniulą (10 mg streptawidyny/kg).Redukcję Aβ40, w której pośredniczy inhibitor peptydu BACE1, mierzono za pomocą testu Aβ1-40 ELISA we krwi (czerwony) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowy) we wskazanych punktach czasowych.Dla lepszej przejrzystości na wykresie rysowana jest linia przerywana w skali 100%.(c) Procentowe zmniejszenie Aβ40 we krwi (czerwone trójkąty) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowe trójkąty) u szczurów leczonych streptawidyną skoniugowaną z peptydem tranzytowym #2077 i peptydem hamującym BACE1 w stosunku 3:1.( d ) Procentowe zmniejszenie poziomu Aβ40 we krwi (czerwone kółka) i płynu mózgowo-rdzeniowego (pomarańczowe kółka) szczurów leczonych streptawidyną sprzężoną wyłącznie z peptydem hamującym BACE1.Stężenie Aβ w próbie kontrolnej wynosiło 420 pg/ml (odchylenie standardowe = 101 pg/ml).
Prezentacja na fagach została z powodzeniem zastosowana w kilku obszarach badań biomedycznych17.Metodę tę stosowano w badaniach różnorodności naczyniowej in vivo18,19, jak również w badaniach ukierunkowanych na naczynia mózgowe20,21,22,23,24,25,26.W tym badaniu rozszerzyliśmy zastosowanie tej metody selekcji nie tylko na bezpośrednią identyfikację peptydów ukierunkowanych na naczynia mózgowe, ale także na odkrycie kandydatów o właściwościach aktywnego transportu do przekroczenia bariery krew-mózg.Opisujemy teraz opracowanie procedury selekcji in vivo u szczurów intubowanych CM i wykazujemy jej potencjał do identyfikacji peptydów o właściwościach zasiedlania CSF.Korzystając z faga T7 prezentującego bibliotekę 12-merowych losowych peptydów, byliśmy w stanie wykazać, że fag T7 jest wystarczająco mały (średnica około 60 nm)10, aby można go było zaadaptować do bariery krew-mózg, a tym samym bezpośrednio przekroczyć barierę krew-mózg lub splot naczyniówkowy.Zaobserwowaliśmy, że pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego od kaniulowanych szczurów CM było dobrze kontrolowaną funkcjonalną metodą przesiewową in vivo i że wyekstrahowany fag nie tylko wiązał się z układem naczyniowym, ale także działał jako transporter przez barierę krew-mózg.Ponadto, jednocześnie pobierając krew i stosując HTS do płynu mózgowo-rdzeniowego i fagów pochodzących z krwi, potwierdziliśmy, że na nasz wybór płynu mózgowo-rdzeniowego nie miało wpływu wzbogacenie krwi ani zdolność do ekspansji między rundami selekcji.Kompartment krwi jest jednak częścią procedury selekcji, ponieważ fagi zdolne do dotarcia do kompartmentu płynu mózgowo-rdzeniowego muszą przetrwać i krążyć w krwioobiegu wystarczająco długo, aby wzbogacić się w mózgu.Aby wyodrębnić wiarygodne informacje o sekwencjach z surowych danych HTS, zaimplementowaliśmy filtry dostosowane do specyficznych dla platformy błędów sekwencjonowania w przepływie pracy analizy.Włączając parametry kinetyczne do metody przesiewowej, potwierdziliśmy szybką farmakokinetykę fagów T7 typu dzikiego (t½ ~ 28 min) we krwi24, 27, 28, a także określiliśmy ich okres półtrwania w płynie mózgowo-rdzeniowym (t½ ~ 26 min) na minutę).Pomimo podobnych profili farmakokinetycznych we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym, w płynie mózgowo-rdzeniowym można było wykryć tylko 0,001% stężenia faga we krwi, co wskazuje na niską mobilność tła faga T7 typu dzikiego przez barierę krew-mózg.Ta praca podkreśla znaczenie pierwszej rundy selekcji przy stosowaniu strategii panoramowania in vivo, zwłaszcza w przypadku systemów fagowych, które są szybko usuwane z krążenia, ponieważ niewiele klonów jest w stanie dotrzeć do przedziału OUN.Zatem w pierwszej rundzie zmniejszenie różnorodności bibliotek było bardzo duże, ponieważ ostatecznie zebrano tylko ograniczoną liczbę klonów w tym bardzo ścisłym modelu płynu mózgowo-rdzeniowego.Ta strategia panoramowania in vivo obejmowała kilka etapów selekcji, takich jak aktywna akumulacja w przedziale CSF, przeżycie klonów w przedziale krwi i szybkie usuwanie klonów fagów T7 z krwi w ciągu pierwszych 10 minut (ryc. 1d i ryc. Uzupełniająca 4M).).Tak więc, po pierwszej rundzie, w płynie mózgowo-rdzeniowym zidentyfikowano różne klony fagów, chociaż dla poszczególnych zwierząt zastosowano tę samą początkową pulę.Sugeruje to, że wiele etapów ścisłej selekcji dla bibliotek źródłowych z dużą liczbą członków biblioteki skutkuje znacznym zmniejszeniem różnorodności.Dlatego zdarzenia losowe staną się integralną częścią wstępnego procesu selekcji, znacząco wpływając na wynik.Jest prawdopodobne, że wiele klonów w oryginalnej bibliotece miało bardzo podobną skłonność do wzbogacania płynu mózgowo-rdzeniowego.Jednak nawet w tych samych warunkach eksperymentalnych wyniki selekcji mogą się różnić ze względu na niewielką liczbę poszczególnych klonów w początkowej puli.
Motywy wzbogacone w płynie mózgowo-rdzeniowym różnią się od tych we krwi.Co ciekawe, zauważyliśmy pierwsze przesunięcie w kierunku peptydów bogatych w glicynę we krwi poszczególnych zwierząt.(Ryc. 1g, ryc. dodatkowe 4e, 4f).Fagi zawierające peptydy glicyny mogą być bardziej stabilne i mniej prawdopodobne, że zostaną usunięte z obiegu.Jednak tych bogatych w glicynę peptydów nie wykryto w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że wyselekcjonowane biblioteki przeszły dwa różne etapy selekcji: jeden we krwi, a drugi pozostawiono do akumulacji w płynie mózgowo-rdzeniowym.Klony wzbogacone w CSF powstałe w wyniku czwartej rundy selekcji zostały dokładnie przetestowane.Potwierdzono, że prawie wszystkie indywidualnie testowane klony były wzbogacone w płyn mózgowo-rdzeniowy w porównaniu z pustym fagiem kontrolnym.Bardziej szczegółowo zbadano jeden trafiony peptyd (nr 2077).Wykazał dłuższy okres półtrwania w osoczu w porównaniu z innymi trafieniami (rysunek 3d i rysunek dodatkowy 7) i, co ciekawe, peptyd ten zawierał resztę cysteiny na C-końcu.Niedawno wykazano, że dodatek cysteiny do peptydów może poprawić ich właściwości farmakokinetyczne poprzez wiązanie z albuminą29.Jest to obecnie nieznane dla peptydu nr 2077 i wymaga dalszych badań.Niektóre peptydy wykazywały zależność od wartościowości we wzbogaceniu CSF (dane nie pokazane), co może być związane z wyświetlaną geometrią powierzchni kapsydu T7.Stosowany przez nas system T7 wykazywał 5-15 kopii każdego peptydu na cząsteczkę faga.IHC przeprowadzono na kandydujących klonach fagów wiodących, wstrzykniętych dożylnie do kory mózgowej szczurów (Uzupełniająca Ryc. 8).Dane pokazały, że co najmniej trzy klony (nr 2002, nr 2009 i nr 2077) wchodziły w interakcję z BBB.Pozostaje do ustalenia, czy ta interakcja BBB powoduje akumulację płynu mózgowo-rdzeniowego lub ruch tych klonów bezpośrednio do BCSFB.Co ważne, pokazujemy, że wybrane peptydy zachowują zdolność transportu płynu mózgowo-rdzeniowego po syntezie i związaniu z ładunkiem białkowym.Wiązanie N-końcowych biotynylowanych peptydów z SA zasadniczo powtarza wyniki uzyskane z ich odpowiednimi klonami fagów we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 3e).Na koniec pokazujemy, że wiodący peptyd #2077 jest zdolny do promowania działania na mózg biotynylowanego peptydowego inhibitora BACE1 skoniugowanego z SA, powodując wyraźne efekty farmakodynamiczne w OUN poprzez znaczne zmniejszenie poziomów Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4).Nie byliśmy w stanie zidentyfikować żadnych homologów w bazie danych, przeprowadzając wyszukiwanie homologii sekwencji peptydów we wszystkich trafieniach.Należy zauważyć, że rozmiar biblioteki T7 wynosi około 109, podczas gdy teoretyczny rozmiar biblioteki dla 12-merów wynosi 4 x 1015. Dlatego wybraliśmy tylko niewielki ułamek przestrzeni różnorodności 12-merowej biblioteki peptydów, co może oznaczać, że bardziej zoptymalizowane peptydy można zidentyfikować poprzez ocenę sąsiedniej przestrzeni sekwencji tych zidentyfikowanych trafień.Hipotetycznie jednym z powodów, dla których nie znaleźliśmy żadnych naturalnych homologów tych peptydów, może być odznaczenie podczas ewolucji, aby zapobiec niekontrolowanemu wejściu niektórych motywów peptydowych do mózgu.
Podsumowując, nasze wyniki stanowią podstawę do przyszłych prac nad bardziej szczegółową identyfikacją i charakterystyką systemów transportowych bariery naczyniowo-mózgowej in vivo.Podstawowa konfiguracja tej metody opiera się na strategii selekcji funkcjonalnej, która nie tylko identyfikuje klony z właściwościami wiązania naczyń mózgowych, ale także obejmuje krytyczny etap, w którym udane klony mają wewnętrzną aktywność do przekraczania barier biologicznych in vivo do przedziału OUN.jest wyjaśnienie mechanizmu transportu tych peptydów i ich preferencji wiązania się z układem mikrokrążenia specyficznym dla regionu mózgu.Może to doprowadzić do odkrycia nowych szlaków transportu BBB i receptorów.Oczekujemy, że zidentyfikowane peptydy mogą bezpośrednio wiązać się z receptorami naczyniowo-mózgowymi lub krążącymi ligandami transportowanymi przez BBB lub BCSFB.Odkryte w tej pracy wektory peptydowe o aktywności transportowej CSF będą dalej badane.Obecnie badamy specyficzność mózgową tych peptydów pod kątem ich zdolności do przekraczania BBB i/lub BCSFB.Te nowe peptydy będą niezwykle cennymi narzędziami do potencjalnego odkrycia nowych receptorów lub szlaków oraz do opracowania nowych, wysoce wydajnych platform dostarczania makrocząsteczek, takich jak leki biologiczne, do mózgu.
Kaniulować cisternę dużą (CM) stosując modyfikację wcześniej opisanej metody.Znieczulone szczury Wistar (200-350 g) umieszczono na aparacie stereotaktycznym i wykonano środkowe nacięcie na ogolonej i przygotowanej aseptycznie skórze głowy w celu odsłonięcia czaszki.Wywierć dwa otwory w obszarze górnego skrzydła i wkręć w nie wkręty mocujące.W bocznym grzbiecie potylicznym wywiercono dodatkowy otwór w celu stereotaktycznego wprowadzenia kaniuli ze stali nierdzewnej do CM.Nałóż cement dentystyczny wokół kaniuli i zabezpiecz śrubami.Po fotoutwardzeniu i utwardzeniu cementu ranę skórną zamknięto szwem supramidowym 4/0.Prawidłowe położenie kaniuli potwierdza samoistny wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR).Wyjąć szczura z aparatu stereotaktycznego, zapewnić mu odpowiednią opiekę pooperacyjną i leczenie bólu oraz pozwolić mu dojść do siebie przez co najmniej jeden tydzień, aż do zaobserwowania śladów krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym.Szczury Wistar (Crl:WI/Han) otrzymano z Charles River (Francja).Wszystkie szczury trzymano w określonych warunkach wolnych od patogenów.Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Urząd Weterynaryjny Miasta Bazylei w Szwajcarii i zostały przeprowadzone zgodnie z licencją na zwierzętach nr 2474 (Ocena aktywnego transportu mózgu poprzez pomiar poziomów kandydatów terapeutycznych w płynie mózgowo-rdzeniowym i mózgu szczura).
Delikatnie utrzymuj szczura przytomnego z kaniulą CM w dłoni.Wyjąć Bieluń z kaniuli i pobrać 10 µl samoistnie wypływającego płynu mózgowo-rdzeniowego.Ponieważ drożność kaniuli została ostatecznie naruszona, do tego badania włączono tylko czyste próbki płynu mózgowo-rdzeniowego bez dowodów zanieczyszczenia krwi lub przebarwień.Równolegle pobierano około 10–20 μl krwi z małego nacięcia na końcu ogona do probówek z heparyną (Sigma-Aldrich).CSF i krew zebrano w różnych punktach czasowych po dożylnym wstrzyknięciu faga T7.Przed pobraniem każdej próbki płynu mózgowo-rdzeniowego usunięto około 5–10 μl płynu, co odpowiada martwej objętości cewnika.
Biblioteki generowano przy użyciu wektora T7Select 10-3b, jak opisano w podręczniku systemu T7Select (Novagen, Rosenberg i in., InNovations 6, 1-6, 1996).W skrócie, zsyntetyzowano losową 12-merową wstawkę DNA w następującym formacie:
Kodon NNK zastosowano w celu uniknięcia podwójnych kodonów stop i nadekspresji aminokwasów we wstawce.N to ręcznie zmieszany równomolowy stosunek każdego nukleotydu, a K to ręcznie zmieszany równomolowy stosunek nukleotydów adeniny i cytozyny.Regiony jednoniciowe przekształcono w dwuniciowy DNA przez dalszą inkubację z dNTP (Novagen) i enzymem Klenowa (New England Biolabs) w buforze Klenowa (New England Biolabs) przez 3 godziny w 37°C.Po reakcji dwuniciowy DNA odzyskano przez wytrącanie EtOH.Otrzymany DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll (oba z firmy Roche).Rozszczepioną i oczyszczoną wstawkę (QIAquick, Qiagen) (ligaza T4, New England Biolabs) poddano następnie ligacji w ramce odczytu z wstępnie pociętym wektorem T7 po aminokwasie 348 genu kapsydu 10B.Reakcje ligacji inkubowano w temperaturze 16°C przez 18 godzin przed pakowaniem in vitro.Pakowanie fagów in vitro przeprowadzono zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem do klonowania T7Select 10-3b (Novagen) i roztwór do pakowania amplifikowano raz do lizy przy użyciu Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizaty odwirowano, miareczkowano i zamrożono w temperaturze -80°C jako roztwór podstawowy glicerolu.
Bezpośrednia amplifikacja PCR regionów zmiennych faga zamplifikowanych w bulionie lub płytce przy użyciu prawnie zastrzeżonych starterów fuzyjnych 454/Roche-amplikon.Starter fuzyjny do przodu zawiera sekwencje flankujące region zmienny (NNK) 12 (specyficzny dla szablonu), GS FLX Titanium Adapter A i czterozasadową sekwencję klucza biblioteki (TCAG) (rysunek uzupełniający 1a):
Starter do odwrotnej fuzji zawiera również biotynę przyczepioną do kulek wychwytujących oraz adapter B GS FLX Titanium Adapter wymagany do amplifikacji klonów podczas emulsyjnej PCR:
Amplikony następnie poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche zgodnie z protokołem 454 GS-FLX Titanium.Do ręcznego sekwencjonowania Sangera (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA faga T7 amplifikowano metodą PCR i sekwencjonowano z następującymi parami starterów:
Wstawki z poszczególnych łysinek poddano amplifikacji PCR przy użyciu zestawu Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (zgodnie z zaleceniami producenta).Wykonaj gorący start (10 min w 95 °C) i 35 cykli doładowania (50 s w 95 °C, 1 min w 50 °C i 1 min w 72 °C).
Fagi z bibliotek, fagi typu dzikiego, fagi uratowane z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi lub pojedyncze klony amplifikowano w Escherichia coli BL5615 w bulionie TB (Sigma Aldrich) lub w szalkach 500 cm2 (Thermo Scientific) przez 4 godziny w 37°C.Fagi ekstrahowano z płytek przez płukanie płytek buforem Tris-EDTA (Fluka Analytical) lub przez zbieranie łysinek sterylnymi końcówkami pipet.Fagi wyizolowano z supernatantu hodowli lub buforu ekstrakcyjnego z jedną rundą wytrącania glikolem polietylenowym (PEG 8000) (Promega) i ponownie zawieszono w buforze Tris-EDTA.
Zamplifikowany fag poddano 2-3 rundom usuwania endotoksyn przy użyciu kulek do usuwania endotoksyn (Miltenyi Biotec) przed wstrzyknięciem dożylnym (IV) (500 μl/zwierzę).W pierwszej rundzie wprowadzono 2 x 1012 fagów;w drugim 2 x 1010 fagów;w trzeciej i czwartej rundzie selekcji, 2 x 109 fagów na zwierzę.Zawartość faga w CSF i próbkach krwi pobranych we wskazanych punktach czasowych określono przez zliczanie łysinek zgodnie z instrukcjami producenta (instrukcja obsługi systemu T7Select).Selekcję faga przeprowadzono przez dożylne wstrzyknięcie oczyszczonych bibliotek do żyły ogonowej lub przez ponowne wstrzyknięcie faga wyekstrahowanego z płynu mózgowo-rdzeniowego z poprzedniej rundy selekcji, a kolejne zbiory przeprowadzono odpowiednio po 10 minutach, 30 minutach, 60 minutach, 90 minutach, 120 minutach, 180 minutach i 240 minutach próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi.Przeprowadzono w sumie cztery rundy panoramowania in vivo, w których dwie wybrane gałęzie były oddzielnie przechowywane i analizowane podczas pierwszych trzech rund selekcji.Wszystkie wstawki faga wyekstrahowane z CSF z pierwszych dwóch rund selekcji poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche, podczas gdy wszystkie klony wyekstrahowane z CSF z ostatnich dwóch rund selekcji sekwencjonowano ręcznie.Wszystkie fagi krwi z pierwszej rundy selekcji również poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche.W celu wstrzyknięcia klonów fagów, wybrane fagi amplifikowano w E. coli (BL5615) na płytkach 500 cm2 w temperaturze 37°C przez 4 godziny.Indywidualnie wybrane i ręcznie zsekwencjonowane klony namnażano w pożywce TB.Po ekstrakcji fagów, oczyszczeniu i usunięciu endotoksyny (jak opisano powyżej), 2 x 1010 fagów/zwierzę w 300 μl wstrzyknięto dożylnie do jednej żyły ogonowej.
Wstępne przetwarzanie i jakościowe filtrowanie danych sekwencyjnych.Surowe dane 454/Roche zostały przekonwertowane z binarnego standardowego formatu mapy strumienia (sff) do formatu Pearson czytelnego dla człowieka (fasta) przy użyciu oprogramowania dostawcy.Dalsze przetwarzanie sekwencji nukleotydów przeprowadzono przy użyciu zastrzeżonych programów i skryptów C (niewydany pakiet oprogramowania), jak opisano poniżej.Analiza danych pierwotnych obejmuje ścisłe, wieloetapowe procedury filtrowania.Aby odfiltrować odczyty, które nie zawierały prawidłowej 12-merowej sekwencji DNA wstawki, odczyty kolejno dopasowano do etykiety początkowej (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etykiety stop (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i wstawki tła (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) przy użyciu globalnego testu Needlemana-Wunscha.wyrównanie, dopuszczając do 2 niespójności na wyrównanie31.W związku z tym z biblioteki usunięto odczyty bez znaczników początkowych i końcowych oraz odczyty zawierające wstawki w tle, tj. wyrównania, które przekraczają dozwoloną liczbę niedopasowań.Jeśli chodzi o pozostałe odczyty, N-merowa sekwencja DNA rozciągająca się od znacznika początkowego i kończąca się przed znacznikiem końcowym została wycięta z oryginalnej odczytanej sekwencji i poddana dalszej obróbce (zwanej dalej „wstawką”).Po translacji wstawki, część po pierwszym kodonie stop na końcu 5' startera jest usuwana z wstawki.Ponadto usunięto również nukleotydy prowadzące do niekompletnych kodonów na końcu 3' startera.Aby wykluczyć wstawki zawierające tylko sekwencje tła, usunięto również przetłumaczone wstawki zaczynające się od wzoru aminokwasowego „PAG”.Z biblioteki usunięto peptydy o długości potranslacyjnej mniejszej niż 3 aminokwasy.Na koniec usuń nadmiarowość w puli wkładek i określ częstotliwość każdego unikalnego wkładu.Wyniki tej analizy obejmowały listę sekwencji nukleotydowych (wstawek) i ich (odczytanych) częstotliwości (rysunki uzupełniające 1c i 2).
Grupowanie wstawek N-merowego DNA według podobieństwa sekwencji: Aby wyeliminować błędy sekwencjonowania specyficzne dla 454/Roche (takie jak problemy z sekwencjonowaniem wydłużonych homopolimerów) i usunąć mniej istotne nadmiarowości, wcześniej przefiltrowane wstawki (inserty) sekwencji N-merowego DNA są sortowane według podobieństwa.wstawienia (dozwolone maksymalnie 2 niepasujące zasady) przy użyciu algorytmu iteracyjnego zdefiniowanego w następujący sposób: wstawienia są najpierw sortowane według ich częstotliwości (od najwyższej do najniższej), a jeśli są takie same, według ich drugorzędnego sortowania według długości (od najdłuższej do najkrótszej) ).Tak więc najczęstsze i najdłuższe wstawki definiują pierwszą „grupę”.Częstotliwość grupy jest ustawiona na częstotliwość klucza.Następnie każdą insercję pozostałą na posortowanej liście próbowano dodać do grupy przez wyrównanie parami Needlemana-Wunscha.Jeśli liczba niezgodności, wstawień lub usunięć w dopasowaniu nie przekracza progu 2, do grupy dodawana jest insercja, a ogólna częstotliwość grupowania jest zwiększana o to, jak często dodawana była insercja.Wstawki dodane do grupy są oznaczane jako używane i wykluczane z dalszej obróbki.Jeśli sekwencji wstawiania nie można dodać do już istniejącej grupy, sekwencja wstawiania jest używana do tworzenia nowej grupy z odpowiednią częstotliwością wstawiania i oznaczona jako używana.Iteracja kończy się, gdy każda sekwencja wstawiania została użyta do utworzenia nowej grupy lub może zostać włączona do już istniejącej grupy.W końcu zgrupowane wstawki składające się z nukleotydów są ostatecznie tłumaczone na sekwencje peptydowe (biblioteki peptydowe).Wynikiem tej analizy jest zestaw wstawek i odpowiadających im częstotliwości, które składają się na liczbę kolejnych odczytów (rysunek uzupełniający 2).
Generowanie motywu: Na podstawie listy unikalnych peptydów utworzono bibliotekę zawierającą wszystkie możliwe wzory aminokwasów (aa), jak pokazano poniżej.Z peptydu ekstrahowano każdy możliwy wzór o długości 3 i dodawano jego odwrotny wzór wraz ze wspólną biblioteką motywów zawierającą wszystkie wzory (tripeptydy).Zsekwencjonowano biblioteki wysoce powtarzalnych motywów i usunięto nadmiarowość.Następnie dla każdego tripeptydu w bibliotece motywów sprawdziliśmy jego obecność w bibliotece za pomocą narzędzi obliczeniowych.W tym przypadku częstotliwość peptydu zawierającego znaleziony tripeptyd motywu jest dodawana i przypisywana do motywu w bibliotece motywów („liczba motywów”).Wynikiem generowania motywów jest dwuwymiarowa tablica zawierająca wszystkie wystąpienia tripeptydów (motywów) i ich odpowiednie wartości, które są liczbą odczytów sekwencjonowania, które dają odpowiedni motyw, gdy odczyty są filtrowane, grupowane i tłumaczone.Metryki opisane szczegółowo powyżej.
Normalizacja liczby motywów i odpowiadających im wykresów rozrzutu: Liczbę motywów dla każdej próbki znormalizowano za pomocą
gdzie ni to liczba odczytów zawierających temat i.Zatem vi reprezentuje procentową częstotliwość odczytów (lub peptydów) zawierających motyw i w próbce.Wartości P dla nieznormalizowanej liczby motywów obliczono za pomocą dokładnego testu Fishera.Jeśli chodzi o korelogramy liczby motywów, korelacje Spearmana zostały obliczone przy użyciu znormalizowanej liczby motywów z R.
Aby zwizualizować zawartość aminokwasów w każdej pozycji w bibliotece peptydów, utworzono logogramy internetowe 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Najpierw zawartość aminokwasów w każdej pozycji 12-merowego peptydu jest przechowywana w matrycy 20x12.Następnie zestaw 1000 peptydów zawierających taką samą względną zawartość aminokwasów w każdej pozycji jest generowany w formacie fasta-sequence i dostarczany jako dane wejściowe do web-logo 3, które generuje graficzną reprezentację względnej zawartości aminokwasów w każdej pozycji.dla danej biblioteki peptydów.Aby zwizualizować wielowymiarowe zestawy danych, utworzono mapy cieplne za pomocą opracowanego wewnętrznie narzędzia w R (biosHeatmap, jeszcze nie wydany pakiet R).Przedstawione na mapach cieplnych dendrogramy obliczono metodą hierarchicznego grupowania Warda z euklidesową metryką odległości.Do analizy statystycznej danych punktacji motywu, obliczono wartości P dla punktacji nieznormalizowanej przy użyciu dokładnego testu Fishera.Wartości P dla innych zestawów danych obliczono w R przy użyciu testu t-Studenta lub ANOVA.
Wybrane klony fagów i fagi bez wstawek wstrzykiwano dożylnie przez żyłę ogonową (2 x 1010 fagów/zwierzę w 300 μl PBS).Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem tym samym zwierzętom wstrzyknięto dożylnie 100 μl lektyny znakowanej DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minut po wstrzyknięciu faga szczurom poddano perfuzji serca 50 ml PBS, a następnie 50 ml 4% PFA/PBS.Próbki mózgu dodatkowo utrwalano przez noc w 4% PFA/PBS i moczono w 30% sacharozie przez noc w temperaturze 4°C.Próbki szybko zamraża się w mieszaninie OCT.Analizę immunohistochemiczną zamrożonych próbek przeprowadzono w temperaturze pokojowej na krioskrawkach 30 µm zablokowanych 1% BSA i inkubowanych z przeciwciałami poliklonalnymi znakowanymi FITC przeciwko fagowi T7 (Novus NB 600-376A) w temperaturze 4°C.Inkubować przez noc.Na koniec skrawki przemyto 3 razy PBS i zbadano za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego (Leica TCS SP5).
Wszystkie peptydy o minimalnej czystości 98% zsyntetyzowano za pomocą GenScript USA, biotynylowano i liofilizowano.Biotyna jest związana przez dodatkową potrójną przekładkę glicynową na N-końcu.Sprawdź wszystkie peptydy za pomocą spektrometrii mas.
Streptawidynę (Sigma S0677) zmieszano z 5-krotnym równomolowym nadmiarem biotynylowanego peptydu, biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 lub kombinacji (stosunek 3: 1) biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 i peptydu hamującego BACE1 w 5–10% DMSO / inkubowano w PBS.1 godzinę w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem.Sprzężone ze streptawidyną peptydy wstrzykiwano dożylnie w dawce 10 mg/kg do jednej z żył ogonowych szczurów z jamą mózgową.
Stężenie kompleksów streptawidyna-peptyd oceniano metodą ELISA.Płytki do mikromiareczkowania Nunc Maxisorp (Sigma) opłaszczano przez noc w 4°C 1,5 μg/ml mysiego przeciwciała przeciw streptawidynie (Thermo, MA1-20011).Po zablokowaniu (bufor blokujący: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% żelatyna, 1% BSA) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, przemyć płytkę 0,05% Tween-20/PBS (bufor do przemywania) przez 3 sekundy, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza dodano do dołków rozcieńczonych buforem blokującym (osocze 1:10 000, CSF 1: 115).Płytkę następnie inkubowano przez noc w 4°C z przeciwciałem wykrywającym (1 μg/ml, anty-streptawidyna-HRP, Novus NB120-7239).Po trzech etapach przemywania streptawidynę wykrywano przez inkubację w roztworze substratu TMB (Roche) przez maksymalnie 20 minut.Po zatrzymaniu rozwoju barwy za pomocą 1M H2SO4 zmierzyć absorbancję przy 450 nm.
Funkcję kompleksu streptawidyna-peptyd-inhibitor BACE1 oceniono metodą Aβ(1-40) ELISA zgodnie z protokołem producenta (Wako, 294-64701).Pokrótce, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczono w standardowym rozcieńczalniku (1:23) i inkubowano przez noc w 4°C w 96-studzienkowych płytkach opłaszczonych przeciwciałem wychwytującym BNT77.Po pięciu etapach przemywania dodano skoniugowane z HRP przeciwciało BA27 i inkubowano przez 2 godziny w 4°C, po czym przeprowadzono pięć etapów przemywania.Aβ(1–40) wykrywano przez inkubację w roztworze TMB przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po zatrzymaniu rozwoju barwy roztworem zatrzymującym, zmierzyć absorbancję przy 450 nm.Próbki osocza poddano ekstrakcji do fazy stałej przed testem Aβ(1–40) ELISA.Osocze dodano do 0,2% DEA (Sigma) w 96-studzienkowych płytkach i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po kolejnym przemyciu płytek SPE (Oasis, 186000679) wodą i 100% metanolem, do płytek SPE dodano próbki osocza i usunięto cały płyn.Próbki przemyto (najpierw 5% metanolem, a następnie 30% metanolem) i eluowano 2% NH4OH/90% metanolu.Po wysuszeniu eluatu w temperaturze 55°C przez 99 minut przy stałym natężeniu prądu N2 próbki redukowano w standardowych rozcieńczalnikach i mierzono Aβ(1–40) w sposób opisany powyżej.
Jak cytować ten artykuł: Urich, E. et al.Dostarczanie ładunku do mózgu przy użyciu peptydów tranzytowych zidentyfikowanych in vivo.nauka.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Dostarczanie leków wielkocząsteczkowych do mózgu za pomocą terapii celowanej.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Dostarczanie leków peptydowych i białkowych przez barierę krew-mózg.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Bariera krew-mózg: wąskie gardło w opracowywaniu leków mózgowych.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Perspektywy lepszego dostarczania leków i kierowania ich do mózgu poprzez szlak splotu naczyniówkowego-CSF.Badania farmaceutyczne 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacja biofarmaceutyków za pomocą molekularnych koni trojańskich do dostarczania mózgu.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transport peptydów za pośrednictwem receptora WM przez barierę krew-mózg.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. i in.Zwiększ penetrację mózgu i skuteczność przeciwciał terapeutycznych za pomocą monowalentnych wahadłowców molekularnych.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i in.Transport receptora transferyny (TfR) determinuje wychwyt przez mózg wariantów powinowactwa przeciwciał TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).