Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów na raz. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy na raz, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy na raz.
Bariera krew-mózg i bariera krew-mózg uniemożliwiają środkom bioterapeutycznym dotarcie do ich celów w ośrodkowym układzie nerwowym, utrudniając tym samym skuteczne leczenie chorób neurologicznych. Aby odkryć nowe transportery mózgowe in vivo, wprowadziliśmy bibliotekę peptydów fagowych T7 i seryjnie pobieraliśmy krew i płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) przy użyciu kaniulowanego modelu dużej puli świadomych szczurów. Specyficzne klony fagowe były wysoce wzbogacone w PMR po czterech rundach selekcji. Testowanie poszczególnych kandydackich peptydów wykazało ponad 1000-krotne wzbogacenie w PMR. Bioaktywność pośredniczonego peptydem dostarczania do mózgu została potwierdzona 40% redukcją poziomu amyloidu-β w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu inhibitora peptydu BACE1 połączonego ze zidentyfikowanym nowym peptydem tranzytowym. Wyniki te wskazują, że peptydy zidentyfikowane metodą selekcji fagowej in vivo mogą być użytecznymi nośnikami do systemowego dostarczania makrocząsteczek do mózgu, wykazując działanie terapeutyczne.
Badania nad ukierunkowaną terapią ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w dużej mierze skupiały się na identyfikacji zoptymalizowanych leków i środków, które wykazują właściwości ukierunkowane na OUN, przy mniejszym wysiłku na odkrywaniu mechanizmów, które napędzają aktywne dostarczanie leków do mózgu. Zaczyna się to teraz zmieniać, ponieważ dostarczanie leków, zwłaszcza dużych cząsteczek, jest integralną częścią nowoczesnego rozwoju leków neurologicznych. Środowisko ośrodkowego układu nerwowego jest dobrze chronione przez system barier naczyniowo-mózgowych, składający się z bariery krew-mózg (BBB) ​​i bariery krew-mózg (BCBB)1, co utrudnia dostarczanie leków do mózgu1,2. Szacuje się, że prawie wszystkie leki wielkocząsteczkowe i ponad 98% leków małocząsteczkowych jest eliminowanych z mózgu3. Dlatego bardzo ważne jest zidentyfikowanie nowych systemów transportu mózgowego, które zapewnią wydajne i specyficzne dostarczanie leków terapeutycznych do OUN4,5. Jednak BBB i BCSFB stanowią również doskonałą okazję do dostarczania leków, ponieważ przenikają i wchodzą do wszystkich struktur mózgu przez jego rozległe naczynia krwionośne. Tak więc obecne wysiłki mające na celu wykorzystanie nieinwazyjnych metod dostarczania do mózgu opierają się w dużej mierze na mechanizmie transportu za pośrednictwem receptora (PMT) z wykorzystaniem endogennego receptora BBB6. Pomimo ostatnich kluczowych postępów w wykorzystaniu szlaku receptora transferyny7,8, konieczny jest dalszy rozwój nowych systemów dostarczania o ulepszonych właściwościach. W tym celu naszym celem było zidentyfikowanie peptydów zdolnych do pośredniczenia w transporcie CSF, ponieważ mogłyby one w zasadzie być używane do dostarczania makrocząsteczek do OUN lub do otwierania nowych szlaków receptorowych. W szczególności specyficzne receptory i transportery układu naczyniowo-mózgowego (BBB i BSCFB) mogą służyć jako potencjalne cele dla aktywnego i specyficznego dostarczania leków bioterapeutycznych. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) jest produktem wydzielniczym splotu naczyniówkowego (CS) i ma bezpośredni kontakt z płynem śródmiąższowym mózgu poprzez przestrzeń podpajęczynówkową i przestrzeń komorową4. Ostatnio wykazano, że podpajęczynówkowy płyn mózgowo-rdzeniowy dyfunduje nadmiernie do śródmiąższu mózgu9. Mamy nadzieję uzyskać dostęp do przestrzeni miąższowej za pomocą tego podpajęczynówkowego szlaku napływu lub bezpośrednio przez BBB. Aby to osiągnąć, wdrożyliśmy solidną strategię selekcji fagów in vivo, która idealnie identyfikuje peptydy transportowane przez jedną z tych dwóch odrębnych ścieżek.
Opisujemy teraz sekwencyjną metodę przesiewową ekspozycji fagowej in vivo z pobieraniem próbek płynu mózgowo-rdzeniowego połączoną z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (HTS) w celu monitorowania początkowych rund selekcji o największej różnorodności biblioteki. Przesiew przeprowadzono na przytomnych szczurach z trwale wszczepioną dużą kaniulą cysterny (CM), aby uniknąć zanieczyszczenia krwi. Co ważne, podejście to wybiera zarówno ukierunkowane na mózg, jak i peptydy o aktywności transportowej przez barierę naczyniowo-mózgową. Użyliśmy fagów T7 ze względu na ich mały rozmiar (~60 nm)10 i zasugerowaliśmy, że nadają się one do transportu pęcherzyków, które umożliwiają transkomórkowe przekraczanie bariery śródbłonkowej i/lub nabłonkowo-rdzeniowej. Po czterech rundach przesiewania wyizolowano populacje fagów wykazujące silne wzbogacenie płynu mózgowo-rdzeniowego in vivo i powiązanie z mikronaczyniami mózgowymi. Co ważne, byliśmy w stanie potwierdzić nasze ustalenia, wykazując, że preferowane i chemicznie syntetyzowane najlepsze kandydackie peptydy są w stanie transportować ładunek białkowy do płynu mózgowo-rdzeniowego. Po pierwsze, farmakodynamiczne efekty OUN zostały ustalone poprzez połączenie wiodącego peptydu tranzytowego z inhibitorem peptydu BACE1. Oprócz wykazania, że ​​strategie przesiewu funkcjonalnego in vivo mogą identyfikować nowe peptydy transportowe mózgu jako skuteczne nośniki ładunku białkowego, spodziewamy się, że podobne podejścia do selekcji funkcjonalnej staną się również ważne w identyfikowaniu nowych szlaków transportu mózgowego.
Na podstawie jednostek tworzących płytki (PFU), po etapie pakowania fagów, zaprojektowano i stworzono bibliotekę losowych 12-merowych liniowych peptydów fagowych T7 o różnorodności około 109 (patrz Materiały i metody). Ważne jest, aby zauważyć, że dokładnie przeanalizowaliśmy tę bibliotekę przed przeszukiwaniem in vivo. Amplifikacja PCR próbek biblioteki fagowej przy użyciu zmodyfikowanych starterów wygenerowała amplikony, które były bezpośrednio stosowalne do HTS (Rys. uzupełniający 1a). Ze względu na a) błędy sekwencjonowania HTS11, b) wpływ na jakość starterów (NNK)1-12 i c) obecność faga dzikiego typu (wt) (wstawki szkieletowe) w bibliotece zapasowej, wdrożono procedurę filtrowania sekwencji w celu wyodrębnienia tylko zweryfikowanych informacji o sekwencji (Rys. uzupełniający 1b). Te kroki filtrowania mają zastosowanie do wszystkich bibliotek sekwencjonowania HTS. W przypadku biblioteki standardowej uzyskano łącznie 233 868 odczytów, z których 39% przeszło kryteria filtrowania i zostało wykorzystanych do analizy biblioteki i selekcji w kolejnych rundach (Rysunek uzupełniający 1c–e). Odczyty były przeważnie wielokrotnościami 3 par zasad długości ze szczytem przy 36 nukleotydach (Rysunek uzupełniający 1c), co potwierdza projekt biblioteki (NNK) 1-12. Co godne uwagi, około 11% członków biblioteki zawierało 12-wymiarowy szkielet typu dzikiego (wt) PAGISRELVDKL, a prawie połowa sekwencji (49%) zawierała insercje lub delecje. HTS biblioteki potwierdził dużą różnorodność peptydów w bibliotece: ponad 81% sekwencji peptydowych znaleziono tylko raz, a tylko 1,5% wystąpiło w ≥4 kopiach (Rysunek uzupełniający 2a). Częstotliwości aminokwasów (aa) na wszystkich 12 pozycjach w repertuarze dobrze korelowały z częstościami oczekiwanymi dla liczby kodonów generowanych przez zdegenerowany repertuar NKK (Rys. uzupełniający 2b). Obserwowana częstość reszt aminokwasowych kodowanych przez te wstawki dobrze korelowała z obliczoną częstością (r = 0,893) (Rys. uzupełniający 2c). Przygotowanie bibliotek fagowych do wstrzyknięcia obejmuje etapy amplifikacji i usuwania endotoksyny. Wykazano wcześniej, że potencjalnie zmniejsza to różnorodność bibliotek fagowych12,13. Dlatego też zsekwencjonowaliśmy bibliotekę fagową amplifikowaną na płytce, która przeszła usuwanie endotoksyny i porównaliśmy ją z oryginalną biblioteką, aby oszacować częstość AA. Zaobserwowano silną korelację (r = 0,995) między oryginalną pulą a amplifikowaną i oczyszczoną pulą (Rys. uzupełniający 2d), co wskazuje, że konkurencja między klonami amplifikowanymi na płytkach przy użyciu faga T7 nie powodowała dużego odchylenia. Porównanie to opiera się na częstości motywów tripeptydowych w każdej bibliotece, ponieważ różnorodności bibliotek (~109) nie można w pełni uchwycić nawet za pomocą HTS. Analiza częstości aa w każdej pozycji ujawniła niewielkie odchylenie zależne od pozycji w ostatnich trzech pozycjach wprowadzonego repertuaru (rys. uzupełniający 2e). Podsumowując, doszliśmy do wniosku, że jakość i różnorodność biblioteki były akceptowalne, a jedynie niewielkie zmiany w różnorodności zaobserwowano ze względu na amplifikację i przygotowanie bibliotek fagowych pomiędzy kilkoma rundami selekcji.
Pobieranie seryjnych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego można wykonać poprzez chirurgiczne wszczepienie kaniuli do CM przytomnych szczurów w celu ułatwienia identyfikacji faga T7 wstrzykniętego dożylnie (iv) przez BBB i/lub BCSFB (rys. 1a-b). W pierwszych trzech rundach selekcji in vivo użyliśmy dwóch niezależnych ramion selekcji (ramion A i B) (rys. 1c). Stopniowo zwiększaliśmy rygorystyczność selekcji poprzez zmniejszenie całkowitej ilości faga wprowadzonego w pierwszych trzech rundach selekcji. W czwartej rundzie płukania połączyliśmy próbki z gałęzi A i B i przeprowadziliśmy trzy dodatkowe niezależne selekcje. Aby zbadać właściwości in vivo cząstek faga T7 w tym modelu, fag dzikiego typu (wkładka główna PAGISRELVDKL) został wstrzyknięty szczurom przez żyłę ogonową. Odzyskiwanie fagów z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi w różnych punktach czasowych wykazało, że stosunkowo małe fagi ikozaedryczne T7 miały szybką początkową fazę klirensu z przedziału krwi (Rys. uzupełniający 3). Na podstawie podanych mian i objętości krwi szczurów obliczyliśmy, że tylko około 1% wag. faga z podanej dawki zostało wykryte we krwi 10 minut po wstrzyknięciu dożylnym. Po tym początkowym szybkim spadku zmierzono wolniejszy pierwotny klirens z okresem półtrwania wynoszącym 27,7 minuty. Co ważne, tylko bardzo niewiele fagów zostało odzyskanych z przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego, co wskazuje na niskie tło migracji fagów dzikiego typu do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego (Rys. uzupełniający 3). Średnio tylko około 1 x 10-3% miana faga T7 we krwi i 4 x 10-8% początkowo wstrzykniętych fagów zostało wykrytych w płynie mózgowo-rdzeniowym przez cały okres pobierania próbek (0-250 min). Co ciekawe, okres półtrwania (25,7 min) faga dzikiego typu w płynie mózgowo-rdzeniowym był podobny do tego obserwowanego we krwi. Dane te pokazują, że bariera oddzielająca przedział CSF od krwi jest nienaruszona u szczurów z kaniulą CM, co pozwala na selekcję bibliotek fagowych in vivo w celu identyfikacji klonów, które są łatwo transportowane z krwi do przedziału CSF.
(a) Ustawianie metody ponownego pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z dużej puli. (b) Schemat pokazujący lokalizację komórkową bariery ośrodkowego układu nerwowego (CNS) i strategię selekcji użytą do identyfikacji peptydów, które przekraczają barierę krew-mózg (BBB) ​​i barierę krew-mózg. (c) Schemat blokowy badania przesiewowego ekspozycji fagowej in vivo. W każdej rundzie selekcji fagi (identyfikatory zwierząt wewnątrz strzałek) wstrzykiwano dożylnie. Dwie niezależne alternatywne gałęzie (A, B) są przechowywane oddzielnie do 4. rundy selekcji. W rundach selekcji 3 i 4 każdy klon faga wyekstrahowany z CSF został ręcznie sekwencjonowany. (d) Kinetyka faga wyizolowanego z krwi (czerwone kółka) i płynu mózgowo-rdzeniowego (zielone trójkąty) podczas pierwszej rundy selekcji u dwóch szczurów z wkłuciem kaniuli po dożylnym wstrzyknięciu biblioteki peptydów T7 (2 x 1012 fagów/zwierzę). Niebieskie kwadraty oznaczają średnie początkowe stężenie faga we krwi, obliczone na podstawie ilości wstrzykniętego faga, biorąc pod uwagę całkowitą objętość krwi. Czarne kwadraty oznaczają punkt przecięcia linii y ekstrapolowanej ze stężeń faga we krwi. (e, f) Przedstaw względną częstość i rozkład wszystkich możliwych nakładających się motywów tripeptydowych znalezionych w peptydzie. Przedstawiono liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach. Istotnie (p < 0,001) wzbogacone motywy oznaczono czerwonymi kropkami. (e) Wykres korelacji porównujący względną częstość motywu tripeptydowego wstrzykniętej biblioteki z fagiem pochodzącym z krwi zwierząt nr 1.1 i nr 1.2. (f) Wykres korelacji porównujący względne częstości motywów tripeptydowych fagów zwierzęcych nr 1.1 i nr 1.2 wyizolowanych z krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego. (g, h) Reprezentacja identyfikatora sekwencji faga wzbogaconego we krwi (g) w porównaniu z wstrzykniętymi bibliotekami i fagiem wzbogaconym w płynie mózgowo-rdzeniowym (h) w porównaniu z krwią po rundzie selekcji in vivo u obu zwierząt. Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często aminokwas występuje w danej pozycji. Zielony = polarny, fioletowy = neutralny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwaśny i czarny = hydrofobowe aminokwasy. Rysunek 1a, b został zaprojektowany i wyprodukowany przez Eduarda Uricha.
Wstrzyknęliśmy bibliotekę peptydów fagowych dwóm szczurom CM (klady A i B) i wyizolowaliśmy faga z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi (Rysunek 1d). Początkowe szybkie oczyszczanie biblioteki było mniej wyraźne w porównaniu z fagiem dzikiego typu. Średni okres półtrwania wstrzykniętej biblioteki u obu zwierząt wynosił 24,8 minuty we krwi, podobnie jak w przypadku faga dzikiego typu, i 38,5 minuty w płynie mózgowo-rdzeniowym. Próbki faga krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego od każdego zwierzęcia poddano HTS, a wszystkie zidentyfikowane peptydy przeanalizowano pod kątem obecności krótkiego motywu tripeptydowego. Motywy tripeptydowe wybrano, ponieważ zapewniają minimalną podstawę do tworzenia struktury i interakcji peptyd-białko14,15. Stwierdziliśmy dobrą korelację w rozkładzie motywów między wstrzykniętą biblioteką fagową a klonami wyekstrahowanymi z krwi obu zwierząt (Rysunek 1e). Dane wskazują, że skład biblioteki jest tylko nieznacznie wzbogacony w przedziale krwi. Częstotliwości aminokwasów i sekwencje konsensusowe analizowano dalej w każdej pozycji przy użyciu adaptacji oprogramowania Weblogo16. Co ciekawe, stwierdziliśmy silne wzbogacenie reszt glicyny we krwi (ryc. 1g). Gdy krew porównano z klonami wybranymi z płynu mózgowo-rdzeniowego, zaobserwowano silną selekcję i pewną deselekcję motywów (ryc. 1f), a niektóre aminokwasy były preferencyjnie obecne w ustalonych pozycjach w 12-członowym (ryc. 1h). Co ciekawe, poszczególne zwierzęta różniły się znacząco pod względem płynu mózgowo-rdzeniowego, podczas gdy wzbogacenie glicyny we krwi zaobserwowano u obu zwierząt (Ryc. uzupełniająca 4a–j). Po rygorystycznym filtrowaniu danych sekwencyjnych w płynie mózgowo-rdzeniowym zwierząt nr 1.1 i nr 1.2 uzyskano łącznie 964 i 420 unikalnych peptydów 12-merowych (Ryc. uzupełniająca 1d–e). Wyizolowane klony fagowe zostały wzmocnione i poddane drugiej rundzie selekcji in vivo. Fagi wyekstrahowane z drugiej rundy selekcji poddano HTS u każdego zwierzęcia, a wszystkie zidentyfikowane peptydy wykorzystano jako dane wejściowe do programu rozpoznawania motywów w celu analizy występowania motywów tripeptydowych (rys. 2a, b, ef). W porównaniu z pierwszym cyklem faga odzyskanego z płynu mózgowo-rdzeniowego, zaobserwowaliśmy dalszą selekcję i deselekcję wielu motywów w płynie mózgowo-rdzeniowym w gałęziach A i B (rys. 2). Zastosowano algorytm identyfikacji sieci, aby określić, czy reprezentują one różne wzorce spójnej sekwencji. Zaobserwowano wyraźne podobieństwo między 12-wymiarowymi sekwencjami odzyskanymi przez płyn mózgowo-rdzeniowy w alternatywnym kladzie A (rys. 2c, d) i kladzie B (rys. 2g, h). Połączona analiza w każdej gałęzi ujawniła różne profile selekcji dla peptydów 12-merowych (rys. uzupełniający 5c, d) i wzrost stosunku miana płynu mózgowo-rdzeniowego/krwi w czasie dla połączonych klonów po drugiej rundzie selekcji w porównaniu z pierwszą rundą selekcji (rys. uzupełniający 5e). ).
Wzbogacenie motywów i peptydów w płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez dwie kolejne rundy selekcji funkcjonalnej ekspozycji fagowej in vivo.
Wszystkie fagi płynu mózgowo-rdzeniowego odzyskane z pierwszej rundy każdego zwierzęcia (zwierzęta nr 1.1 i nr 1.2) zostały połączone, wzmocnione, poddane sekwencjonowaniu HT i ponownie wstrzyknięte razem (2 x 1010 fagów/zwierzę) 2 szczurom z kaniulą SM (#1.1 → #). 2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4). (a, b, e, f) Wykresy korelacji porównujące względną częstość motywów tripeptydowych wszystkich fagów pochodzących z płynu mózgowo-rdzeniowego w pierwszej i drugiej rundzie selekcji. Względna częstość i rozkład motywów reprezentujących wszystkie możliwe nakładające się tripeptydy znalezione w peptydach w obu orientacjach. Przedstawiono liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach. Motywy, które zostały istotnie (p < 0,001) wybrane lub wykluczone w jednej z porównywanych bibliotek, zaznaczono czerwonymi kropkami. (c, d, g, h) Reprezentacja logo sekwencji wszystkich bogatych w CSF 12 długich sekwencji aminokwasowych na podstawie rund 2 i 1 selekcji in vivo. Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często dany aminokwas występuje w danej pozycji. Aby przedstawić logo, porównywana jest częstotliwość sekwencji CSF wyodrębnionych od poszczególnych zwierząt między dwiema rundami selekcji, a wzbogacone sekwencje w drugiej rundzie są pokazane: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4. Najbardziej wzbogacone aminokwasy w danej pozycji u (c, d) zwierząt nr 2.1 i nr 2.2 lub (g, h) u zwierząt nr 2.3 i nr 2.4 są pokazane w kolorze. Zielony = polarny, fioletowy = neutralny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwaśny i czarny = hydrofobowe aminokwasy.
Po trzeciej rundzie selekcji zidentyfikowaliśmy 124 unikalne sekwencje peptydowe (#3.1 i #3.2) z 332 klonów fagowych zrekonstruowanych w płynie mózgowo-rdzeniowym, wyizolowanych od dwóch zwierząt (Rys. uzupełniający 6a). Sekwencja LGSVS (18,7%) miała najwyższy względny udział, a następnie wstawki typu dzikiego PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%). W ostatniej czwartej rundzie połączyliśmy dwie niezależnie wybrane gałęzie od trzech oddzielnych zwierząt (Rys. 1c). Spośród 925 zsekwencjonowanych klonów fagowych odzyskanych z płynu mózgowo-rdzeniowego, w czwartej rundzie znaleźliśmy 64 unikalne sekwencje peptydowe (Rys. uzupełniający 6b), wśród których względny udział fagów typu dzikiego spadł do 0,8%. Najczęstszymi klonami CSF w czwartej rundzie były LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Zakres długości wybranych peptydów wynika z insercji/delecji nukleotydów lub przedwczesnych kodonów stop w starterach biblioteki podczas używania zdegenerowanych kodonów do projektowania biblioteki NNK. Przedwczesne kodony stop generują krótsze peptydy i są wybierane, ponieważ zawierają korzystny motyw aa. Dłuższe peptydy mogą być wynikiem insercji/delecji w starterach bibliotek syntetycznych. Umieszcza to zaprojektowany kodon stop poza ramką i odczytuje go, aż do pojawienia się nowego kodonu stop w dół. Ogólnie rzecz biorąc, obliczyliśmy współczynniki wzbogacenia dla wszystkich czterech rund selekcji, porównując dane wejściowe z danymi wyjściowymi próbki. W pierwszej rundzie przesiewu użyliśmy miana fagów dzikiego typu jako niespecyficznego odniesienia tła. Co ciekawe, negatywna selekcja fagów była bardzo silna w pierwszym cyklu CSF, ale nie we krwi (ryc. 3a), co może wynikać z niskiego prawdopodobieństwa biernej dyfuzji większości członków biblioteki peptydów do przedziału CSF lub względne fagi mają tendencję do bardziej wydajnego zatrzymywania lub usuwania z krwiobiegu niż bakteriofagi. Jednak w drugiej rundzie przesiewania zaobserwowano silną selekcję fagów w CSF w obu kladach, co sugeruje, że poprzednia runda była wzbogacona w fagi prezentujące peptydy, które promują wychwyt CSF (ryc. 3a). Ponownie, bez znaczącego wzbogacenia krwi. Również w trzeciej i czwartej rundzie klony fagów były znacząco wzbogacone w CSF. Porównując względną częstość każdej unikalnej sekwencji peptydowej pomiędzy dwoma ostatnimi rundami selekcji, odkryliśmy, że sekwencje były jeszcze bardziej wzbogacone w czwartej rundzie selekcji (ryc. 3b). Łącznie 931 motywów tripeptydowych zostało wyekstrahowanych ze wszystkich 64 unikalnych sekwencji peptydowych przy użyciu obu orientacji peptydów. Najbardziej wzbogacone motywy w czwartej rundzie zostały dokładniej zbadane pod kątem ich profili wzbogacenia we wszystkich rundach w porównaniu z biblioteką wstrzykniętą (próg: 10% wzbogacenia) (rys. uzupełniający 6c). Ogólne wzorce selekcji wykazały, że większość badanych motywów była wzbogacona we wszystkich poprzednich rundach obu gałęzi selekcji. Jednak niektóre motywy (np. SGL, VSG, LGS GSV) pochodziły głównie z alternatywnego kladu A, podczas gdy inne (np. FGW, RTN, WGF, NTR) były wzbogacone w alternatywnym kladzie B.
Walidacja transportu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) wzbogaconych w płyn mózgowo-rdzeniowy peptydów prezentowanych na fagach oraz biotynylowanych peptydów liderowych sprzężonych z ładunkiem streptawidyny.
(a) Współczynniki wzbogacenia obliczone we wszystkich czterech rundach (R1-R4) na podstawie wstrzykniętych (wkład = I) mian fagów (PFU) i określonych mian fagów w płynie mózgowo-rdzeniowym (wyjście = O). Współczynniki wzbogacenia dla ostatnich trzech rund (R2-R4) obliczono przez porównanie z poprzednią rundą i pierwszą rundą (R1) z danymi wagowymi. Otwarte słupki to płyn mózgowo-rdzeniowy, zacienione słupki to osocze. (***p<0,001, na podstawie testu t-Studenta). (b) Lista najliczniejszych peptydów fagowych, uszeregowanych według ich względnego stosunku do wszystkich fagów zebranych w płynie mózgowo-rdzeniowym po 4 rundzie selekcji. Sześć najczęściej występujących klonów fagowych wyróżniono kolorem, ponumerowano i podano ich współczynniki wzbogacenia pomiędzy rundami 3 i 4 selekcji (wstawki). (c,d) Sześć najbardziej wzbogaconych klonów fagowych, pustych fagów i bibliotek peptydów fagowych rodzicielskich z rundy 4 analizowano indywidualnie w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych. (c) Równe ilości 6 kaniulowanych klonów fagowych (2 x 1010 fagów/zwierzęta), pustych fagów (#1779) (2 x 1010 fagów/zwierzęta) i bibliotek peptydów fagowych (2 x 1012 fagów/zwierzęta) Wstrzyknąć co najmniej 3 CM zwierzęciu z kaniulą oddzielnie przez żyłę ogonową. Przedstawiono farmakokinetykę płynu mózgowo-rdzeniowego każdego wstrzykniętego klonu fagowego i biblioteki peptydów fagowych w czasie. (d) przedstawia średni stosunek płynu mózgowo-rdzeniowego do krwi dla wszystkich odzyskanych fagów/ml w czasie pobierania próbek. (e) Cztery syntetyczne peptydy liderowe i jedna pomieszana kontrola zostały połączone biotyną ze streptawidyną poprzez ich N-koniec (ekspozycja tetrameru), a następnie wstrzyknięte (dożylnie do żyły ogonowej, 10 mg streptawidyny/kg). Co najmniej trzy intubowane szczury (N = 3). ). Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pobrano we wskazanych punktach czasowych, a stężenia streptawidyny mierzono za pomocą testu ELISA przeciwko streptawidynie w płynie mózgowo-rdzeniowym (nd = nie wykryto). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na podstawie testu ANOVA). (f) Porównanie sekwencji aminokwasowej najbardziej wzbogaconego klonu peptydu fagowego #2002 (fioletowy) z innymi wybranymi klonami peptydu fagowego z 4. rundy selekcji. Identyczne i podobne fragmenty aminokwasowe oznaczono kolorami.
Ze wszystkich wzbogaconych fagów w czwartej rundzie (ryc. 3b) sześć kandydackich klonów wybrano do dalszej indywidualnej analizy w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Takie same ilości sześciu kaniulowanych bibliotek fagów, pustych fagów (bez insertu) i peptydów profagowych wstrzyknięto trzem kaniulowatym zwierzętom CM, a farmakokinetykę określono w testach płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 3c) i krwi (ryc. uzupełniająca 7). Wszystkie testowane klony fagowe celowały w przedział płynu mózgowo-rdzeniowego na poziomie 10-1000 razy wyższym niż pusty fag kontrolny (#1779). Na przykład klony #2020 i #2077 miały około 1000 razy wyższe miana płynu mózgowo-rdzeniowego niż fag kontrolny. Profil farmakokinetyczny każdego wybranego peptydu jest inny, ale wszystkie mają wysoką zdolność do homerowania w płynie mózgowo-rdzeniowym. Zaobserwowaliśmy stały spadek w czasie dla klonów #1903 i #2011, podczas gdy dla klonów #2077, #2002 i #2009 wzrost w ciągu pierwszych 10 minut może wskazywać na aktywny transport, ale wymaga weryfikacji. Klony #2020, #2002 i #2077 ustabilizowały się na wysokim poziomie, podczas gdy stężenie płynu mózgowo-rdzeniowego klonu #2009 powoli spadało po początkowym wzroście. Następnie porównaliśmy względną częstość występowania każdego kandydata w płynie mózgowo-rdzeniowym z jego stężeniem we krwi (rys. 3d). Korelacja średniego miana każdego kandydata w płynie mózgowo-rdzeniowym z jego miana we krwi we wszystkich momentach pobierania próbek wykazała, że ​​trzech z sześciu kandydatów było istotnie wzbogaconych w płynie mózgowo-rdzeniowym we krwi. Co ciekawe, klon #2077 wykazał wyższą stabilność we krwi (rysunek uzupełniający 7). Aby potwierdzić, że same peptydy są zdolne do aktywnego transportu ładunku innego niż cząstki faga do przedziału CSF, zsyntetyzowaliśmy cztery peptydy liderowe derywatyzowane biotyną na N-końcu, gdzie peptydy przyłączają się do cząstki faga. Biotynylowane peptydy (nr 2002, 2009, 2020 i 2077) zostały sprzężone ze streptawidyną (SA), aby uzyskać formy multimeryczne w pewnym stopniu naśladujące geometrię faga. Ten format pozwolił nam również zmierzyć ekspozycję SA we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym jako peptydy białkowe transportujące ładunek. Co ważne, dane dotyczące faga można było często odtworzyć, gdy syntetyczne peptydy podawano w tym sprzężonym z SA formacie (ryc. 3e). Pomieszane peptydy miały mniejszą początkową ekspozycję i szybsze oczyszczanie CSF z poziomami niewykrywalnymi w ciągu 48 godzin. Aby uzyskać wgląd w ścieżki dostarczania tych klonów fagów peptydowych do przestrzeni CSF, przeanalizowaliśmy lokalizację pojedynczych trafień peptydów fagowych za pomocą immunohistochemii (IHC), aby bezpośrednio wykryć cząsteczki faga 1 godzinę po dożylnym wstrzyknięciu in vivo. Co godne uwagi, klony #2002, #2077 i #2009 można było wykryć za pomocą silnego barwienia w naczyniach włosowatych mózgu, podczas gdy fag kontrolny (#1779) i klon #2020 nie zostały wykryte (Rysunek uzupełniający 8). Sugeruje to, że te peptydy przyczyniają się do wpływu na mózg właśnie poprzez przekroczenie BBB. Aby przetestować tę hipotezę, konieczna jest dalsza szczegółowa analiza, ponieważ szlak BSCFB może być również zaangażowany. Porównując sekwencję aminokwasów najbardziej wzbogaconego klonu (#2002) z innymi wybranymi peptydami, zauważono, że niektóre z nich mają podobne rozszerzenia aminokwasów, co może wskazywać na podobny mechanizm transportu (Rys. 3f).
Ze względu na unikalny profil osocza i znaczny wzrost CSF w czasie, klon ekspozycji fagowej #2077 był dalej badany przez dłuższy okres 48 godzin i był w stanie odtworzyć szybki wzrost CSF obserwowany w związku z utrzymującymi się poziomami SA (ryc. 4a). Jeśli chodzi o inne zidentyfikowane klony fagowe, #2077 silnie barwił się w przypadku naczyń włosowatych mózgu i wykazywał znaczną kolokalizację z markerem kapilarnym lektyny, gdy był oglądany w wyższej rozdzielczości i prawdopodobnie pewne barwienie w przestrzeni miąższowej (ryc. 4b). Aby zbadać, czy farmakologiczne efekty pośredniczone przez peptyd można uzyskać w OUN, przeprowadziliśmy eksperyment, w którym biotynylowane wersje i) peptydu tranzytowego #2077 i ii) peptydu inhibitora BACE1 zostały zmieszane z SA w dwóch różnych proporcjach. W jednej kombinacji użyliśmy tylko inhibitora peptydu BACE1, a w drugiej użyliśmy stosunku 1:3 inhibitora peptydu BACE1 do peptydu #2077. Obie próbki podano dożylnie, a poziomy peptydu beta-amyloidu 40 (Abeta40) we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym mierzono w czasie. Abeta40 mierzono w płynie mózgowo-rdzeniowym, ponieważ odzwierciedla hamowanie BACE1 w miąższu mózgu. Zgodnie z oczekiwaniami oba kompleksy znacząco zmniejszyły poziomy Abeta40 we krwi (ryc. 4c, d). Jednak tylko próbki zawierające mieszaninę peptydu nr 2077 i inhibitora peptydu BACE1 sprzężonego z SA spowodowały znaczący spadek Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4c). Dane pokazują, że peptyd nr 2077 jest w stanie transportować 60 kDa białko SA do OUN, a także wywołuje efekty farmakologiczne z inhibitorami peptydu BACE1 sprzężonymi z SA.
(a) Wstrzyknięcie klonalne (2 × 10 fagów/zwierzę) faga T7 pokazujące długoterminowe profile farmakokinetyczne peptydu CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) i niewstrzykniętego kontrolnego faga (#1779) u co najmniej trzech szczurów z intubacją CM. (b) Obraz mikroskopowy konfokalny reprezentatywnych mikronaczyń korowych u szczurów z wstrzykniętym fagiem (2 × 10 10 fagów/zwierzę) pokazujący kontrastowe barwienie peptydu #2077 i naczyń (lektyny). Te klony fagowe podano 3 szczurom i pozwolono im krążyć przez 1 godzinę przed perfuzją. Mózgi pocięto na sekcje i zabarwiono poliklonalnymi przeciwciałami znakowanymi FITC przeciwko kapsydowi faga T7. Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem podano dożylnie lektynę znakowaną DyLight594. Obrazy fluorescencyjne pokazujące barwienie lektyną (czerwone) strony światła mikronaczyń i fagów (zielone) w świetle naczyń włosowatych i okołonaczyniowej tkanki mózgowej. Skala odpowiada 10 µm. (c, d) Biotynylowany inhibitor peptydu BACE1 samodzielnie lub w połączeniu z biotynylowanym peptydem tranzytowym nr 2077 został sprzężony ze streptawidyną, a następnie dożylnie wstrzyknięto co najmniej trzem szczurom CM z założonymi kaniulami (10 mg streptawidyny/kg). Redukcję Aβ40 za pośrednictwem inhibitora peptydu BACE1 mierzono za pomocą testu ELISA Aβ1-40 we krwi (czerwony) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowy) we wskazanych punktach czasowych. Dla lepszej przejrzystości na wykresie narysowano linię przerywaną w skali 100%. (c) Procentowa redukcja Aβ40 we krwi (czerwone trójkąty) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowe trójkąty) u szczurów leczonych streptawidyną sprzężoną z peptydem tranzytowym #2077 i peptydem hamującym BACE1 w stosunku 3:1. (d) Procentowa redukcja Aβ40 we krwi (czerwone kółka) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowe kółka) u szczurów leczonych streptawidyną sprzężoną wyłącznie z peptydem hamującym BACE1. Stężenie Aβ w grupie kontrolnej wynosiło 420 pg/ml (odchylenie standardowe = 101 pg/ml).
Ekspozycję fagową z powodzeniem zastosowano w kilku obszarach badań biomedycznych17. Tę metodę wykorzystano w badaniach różnorodności naczyń in vivo18,19, a także w badaniach ukierunkowanych na naczynia mózgowe20,21,22,23,24,25,26. W tym badaniu rozszerzyliśmy zastosowanie tej metody selekcji nie tylko na bezpośrednią identyfikację peptydów ukierunkowanych na naczynia mózgowe, ale także na odkrywanie kandydatów z właściwościami aktywnego transportu, aby przekroczyć barierę krew-mózg. Obecnie opisujemy rozwój procedury selekcji in vivo u szczurów CM intubowanych i wykazujemy jej potencjał do identyfikacji peptydów z właściwościami homingu CSF. Używając faga T7 wyświetlającego bibliotekę 12-merowych losowych peptydów, byliśmy w stanie wykazać, że fag T7 jest wystarczająco mały (około 60 nm średnicy)10, aby dostosować się do bariery krew-mózg, tym samym bezpośrednio przekraczając barierę krew-mózg lub splot naczyniówkowy. Zaobserwowaliśmy, że pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego od kaniulowanych szczurów CM było dobrze kontrolowaną metodą przesiewu funkcjonalnego in vivo, a wyekstrahowany fag nie tylko wiązał się z naczyniami krwionośnymi, ale także działał jako transporter przez barierę krew-mózg. Ponadto, poprzez jednoczesne pobieranie krwi i stosowanie HTS do płynu mózgowo-rdzeniowego i fagów pochodzących z krwi, potwierdziliśmy, że nasz wybór płynu mózgowo-rdzeniowego nie był uzależniony od wzbogacenia krwi ani zdolności do ekspansji pomiędzy rundami selekcji. Jednak przedział krwi jest częścią procedury selekcji, ponieważ fagi zdolne do dotarcia do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego muszą przetrwać i krążyć w krwiobiegu wystarczająco długo, aby wzbogacić się w mózgu. Aby wyodrębnić wiarygodne informacje o sekwencji z surowych danych HTS, wdrożyliśmy filtry dostosowane do błędów sekwencjonowania specyficznych dla platformy w przepływie pracy analizy. Dzięki włączeniu parametrów kinetycznych do metody przesiewowej potwierdziliśmy szybką farmakokinetykę fagów T7 dzikiego typu (t½ ~ 28 min) we krwi24, 27, 28, a także określiliśmy ich okres półtrwania w płynie mózgowo-rdzeniowym (t½ ~ 26 min) na minutę). Pomimo podobnych profili farmakokinetycznych we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym, w płynie mózgowo-rdzeniowym można było wykryć jedynie 0,001% stężenia faga we krwi, co wskazuje na niską ruchliwość tła faga T7 dzikiego typu przez barierę krew-mózg. Niniejsza praca podkreśla znaczenie pierwszej rundy selekcji przy stosowaniu strategii panningu in vivo, zwłaszcza w przypadku systemów fagowych, które są szybko usuwane z krążenia, ponieważ niewiele klonów jest w stanie dotrzeć do przedziału OUN. Tak więc w pierwszej rundzie redukcja różnorodności biblioteki była bardzo duża, ponieważ w tym bardzo rygorystycznym modelu płynu mózgowo-rdzeniowego ostatecznie zebrano tylko ograniczoną liczbę klonów. Ta strategia przesiewania in vivo obejmowała kilka etapów selekcji, takich jak aktywna akumulacja w przedziale CSF, przeżycie klonu w przedziale krwi i szybkie usuwanie klonów faga T7 z krwi w ciągu pierwszych 10 minut (Rys. 1d i Ryc. uzupełniający 4M). ). Tak więc po pierwszej rundzie zidentyfikowano różne klony faga w CSF, chociaż dla poszczególnych zwierząt użyto tej samej początkowej puli. Sugeruje to, że wiele ścisłych etapów selekcji dla bibliotek źródłowych z dużą liczbą członków biblioteki skutkuje znaczną redukcją różnorodności. Dlatego zdarzenia losowe staną się integralną częścią początkowego procesu selekcji, znacząco wpływając na wynik. Jest prawdopodobne, że wiele klonów w oryginalnej bibliotece miało bardzo podobną skłonność do wzbogacania CSF. Jednak nawet w tych samych warunkach eksperymentalnych wyniki selekcji mogą się różnić ze względu na małą liczbę każdego konkretnego klonu w początkowej puli.
Motywy wzbogacone w CSF różnią się od tych we krwi. Co ciekawe, zauważyliśmy pierwsze przesunięcie w kierunku peptydów bogatych w glicynę we krwi poszczególnych zwierząt. (Rys. 1g, Rys. uzupełniające 4e, 4f). Fagi zawierające peptydy glicynowe mogą być bardziej stabilne i mniej prawdopodobne, że zostaną wycofane z obiegu. Jednak tych bogatych w glicynę peptydów nie wykryto w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że wyselekcjonowane biblioteki przeszły przez dwa różne etapy selekcji: jeden we krwi, a drugi, któremu pozwolono na gromadzenie się w płynie mózgowo-rdzeniowym. Klony wzbogacone w CSF powstałe w czwartej rundzie selekcji zostały dokładnie przetestowane. Potwierdzono, że prawie wszystkie indywidualnie testowane klony są wzbogacone w CSF w porównaniu z fagiem kontrolnym. Jeden trafiony peptyd (#2077) został zbadany bardziej szczegółowo. Wykazywał dłuższy okres półtrwania w osoczu w porównaniu do innych trafień (Rysunek 3d i Rysunek uzupełniający 7) i co ciekawe, ten peptyd zawierał resztę cysteiny na C-końcu. Niedawno wykazano, że dodanie cysteiny do peptydów może poprawić ich właściwości farmakokinetyczne poprzez wiązanie się z albuminą 29. Obecnie nie jest to znane w przypadku peptydu #2077 i wymaga dalszych badań. Niektóre peptydy wykazywały zależność walencyjną w wzbogaceniu CSF (dane nie pokazano), co może być związane z wyświetlaną geometrią powierzchni kapsydu T7. System T7, którego użyliśmy, wykazywał 5-15 kopii każdego peptydu na cząsteczkę faga. IHC wykonano na kandydackich klonach faga wiodącego wstrzykniętych dożylnie do kory mózgowej szczurów (Rysunek uzupełniający 8). Dane wykazały, że co najmniej trzy klony (nr 2002, nr 2009 i nr 2077) oddziaływały z BBB. Pozostaje do ustalenia, czy ta interakcja BBB skutkuje akumulacją płynu mózgowo-rdzeniowego, czy też przemieszczaniem się tych klonów bezpośrednio do BCSFB. Co ważne, pokazujemy, że wybrane peptydy zachowują swoją zdolność transportu płynu mózgowo-rdzeniowego po syntezie i związaniu z ładunkiem białka. Wiązanie N-końcowych biotynylowanych peptydów z SA zasadniczo powtarza wyniki uzyskane z ich odpowiednimi klonami fagowymi we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 3e). Na koniec pokazujemy, że peptyd wiodący nr 2077 jest w stanie promować działanie mózgu biotynylowanego inhibitora peptydowego BACE1 sprzężonego z SA, powodując wyraźne efekty farmakodynamiczne w OUN poprzez znaczące zmniejszenie poziomów Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4). Nie byliśmy w stanie zidentyfikować żadnych homologów w bazie danych, wykonując przeszukiwanie homologii sekwencji peptydów wszystkich trafień. Ważne jest, aby zauważyć, że rozmiar biblioteki T7 wynosi około 109, podczas gdy teoretyczny rozmiar biblioteki dla 12-merów wynosi 4 x 1015. Dlatego wybraliśmy tylko niewielką część przestrzeni różnorodności biblioteki peptydów 12-merowych, co może oznaczać, że można zidentyfikować bardziej zoptymalizowane peptydy, oceniając przestrzeń sąsiadujących sekwencji tych zidentyfikowanych trafień. Hipotetycznie, jednym z powodów, dla których nie znaleźliśmy żadnych naturalnych homologów tych peptydów, może być deselekcja podczas ewolucji, aby zapobiec niekontrolowanemu przedostawaniu się niektórych motywów peptydowych do mózgu.
Łącznie nasze wyniki stanowią podstawę do przyszłych prac nad identyfikacją i scharakteryzowaniem systemów transportu bariery naczyniowo-mózgowej in vivo w sposób bardziej szczegółowy. Podstawowa konfiguracja tej metody opiera się na strategii selekcji funkcjonalnej, która nie tylko identyfikuje klony o właściwościach wiązania naczyń mózgowych, ale także obejmuje krytyczny krok, w którym udane klony mają wewnętrzną aktywność przekraczania barier biologicznych in vivo do przedziału OUN. jest wyjaśnienie mechanizmu transportu tych peptydów i ich preferencji do wiązania się z mikronaczyniami specyficznymi dla regionu mózgu. Może to doprowadzić do odkrycia nowych ścieżek transportu BBB i receptorów. Oczekujemy, że zidentyfikowane peptydy mogą wiązać się bezpośrednio z receptorami naczyniowo-mózgowymi lub z krążącymi ligandami transportowanymi przez BBB lub BCSFB. Wektory peptydowe o aktywności transportu CSF odkryte w tej pracy będą dalej badane. Obecnie badamy specyficzność mózgu tych peptydów pod kątem ich zdolności do przekraczania BBB i/lub BCSFB. Te nowe peptydy będą niezwykle cennym narzędziem umożliwiającym potencjalne odkrywanie nowych receptorów lub ścieżek oraz opracowywanie nowych, wysoce wydajnych platform do dostarczania makrocząsteczek, np. leków biologicznych, do mózgu.
Kaniulowanie dużej cysterny (CM) przy użyciu modyfikacji wcześniej opisanej metody. Znieczulone szczury Wistar (200-350 g) umieszczono na aparacie stereotaktycznym, a na ogolonej i aseptycznie przygotowanej skórze głowy wykonano nacięcie środkowe, aby odsłonić czaszkę. Wywiercono dwa otwory w obszarze górnego pasa i przykręcono śruby mocujące w otworach. Dodatkowy otwór wywiercono w bocznym grzebieniu potylicznym w celu stereotaktycznego prowadzenia kaniuli ze stali nierdzewnej do CM. Nałóż cement stomatologiczny wokół kaniuli i zabezpiecz śrubami. Po utwardzeniu światłem i cementem ranę skóry zamknięto szwem supramidowym 4/0. Prawidłowe umieszczenie kaniuli potwierdza samoistny wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Wyjmij szczura z aparatu stereotaktycznego, otrzymaj odpowiednią opiekę pooperacyjną i leczenie bólu i pozwól mu na rekonwalescencję przez co najmniej tydzień, aż do zaobserwowania oznak krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym. Szczury Wistar (Crl:WI/Han) uzyskano z Charles River (Francja). Wszystkie szczury były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Urząd Weterynaryjny Miasta Bazylea, Szwajcaria, i zostały przeprowadzone zgodnie z licencją na zwierzęta nr 2474 (Ocena aktywnego transportu mózgowego poprzez pomiar poziomów kandydatów terapeutycznych w płynie mózgowo-rdzeniowym i mózgu szczura).
Delikatnie utrzymuj szczura przytomnego, trzymając w ręku kaniulę CM. Wyjmij Datura z kaniuli i pobierz 10 µl spontanicznie płynącego płynu mózgowo-rdzeniowego. Ponieważ drożność kaniuli została ostatecznie naruszona, w badaniu uwzględniono tylko czyste próbki płynu mózgowo-rdzeniowego bez śladów zanieczyszczenia krwią lub przebarwienia. Równocześnie pobrano około 10–20 µl krwi z małego nacięcia na końcu ogona do probówek z heparyną (Sigma-Aldrich). Płyn mózgowo-rdzeniowy i krew pobierano w różnych punktach czasowych po dożylnym wstrzyknięciu faga T7. Przed pobraniem każdej próbki płynu mózgowo-rdzeniowego odrzucono około 5–10 µl płynu, co odpowiada objętości martwej cewnika.
Biblioteki wygenerowano przy użyciu wektora T7Select 10-3b, jak opisano w podręczniku systemu T7Select (Novagen, Rosenberg i in., InNovations 6, 1-6, 1996). W skrócie, losowy 12-merowy insert DNA został zsyntetyzowany w następującym formacie:
Kodon NNK został użyty, aby uniknąć podwójnych kodonów stop i nadmiernej ekspresji aminokwasów we wstawce. N to ręcznie mieszany stosunek ekwimolarny każdego nukleotydu, a K to ręcznie mieszany stosunek ekwimolarny nukleotydów adeniny i cytozyny. Jednoniciowe regiony zostały przekształcone w dwuniciowe DNA poprzez dalszą inkubację z dNTP (Novagen) i enzymem Klenowa (New England Biolabs) w buforze Klenowa (New England Biolabs) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Po reakcji dwuniciowe DNA zostało odzyskane przez wytrącanie EtOH. Powstałe DNA zostało strawione enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII (oba z Roche). Rozszczepiony i oczyszczony (QIAquick, Qiagen) insert (ligaza T4, New England Biolabs) został następnie zligowany w ramce do wstępnie rozszczepionego wektora T7 po aminokwasie 348 genu kapsydu 10B. Reakcje ligacji inkubowano w temperaturze 16° C przez 18 godzin przed pakowaniem in vitro. Pakowanie fagów in vitro przeprowadzono zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem do klonowania T7Select 10-3b (Novagen), a roztwór pakujący amplifikowano raz do lizy przy użyciu Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizaty odwirowano, miareczkowano i zamrożono w temperaturze -80° C jako roztwór wyjściowy glicerolu.
Bezpośrednia amplifikacja PCR zmiennych regionów faga amplifikowanych w bulionie lub na płytce przy użyciu zastrzeżonych primerów fuzyjnych 454/Roche-amplicon. Primer fuzyjny forward zawiera sekwencje flankujące region zmienny (NNK) 12 (specyficzny dla matrycy), adapter tytanowy GS FLX A i kluczową sekwencję biblioteki czterech zasad (TCAG) (Rysunek uzupełniający 1a):
Starter do odwrotnej fuzji zawiera również biotynę przyłączoną do kulek wychwytujących oraz adapter tytanowy GS FLX B wymagany do amplifikacji klonalnej podczas emulsyjnej reakcji PCR:
Następnie amplikony poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche zgodnie z protokołem 454 GS-FLX Titanium. W przypadku ręcznego sekwencjonowania Sangera (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) DNA faga T7 zostało wzmocnione metodą PCR i zsekwencjonowane przy użyciu następujących par primerów:
Wkładki z pojedynczych płytek poddano amplifikacji PCR przy użyciu zestawu Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (zgodnie z instrukcją producenta). Wykonaj gorący start (10 min w 95 °C) i 35 cykli boost (50 s w 95 °C, 1 min w 50 °C i 1 min w 72 °C).
Fagi z bibliotek, fagi dzikiego typu, fagi uratowane z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi lub pojedyncze klony amplifikowano w Escherichia coli BL5615 w bulionie TB (Sigma Aldrich) lub w naczyniach 500 cm2 (Thermo Scientific) przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Fagi ekstrahowano z płytek przez płukanie płytek buforem Tris-EDTA (Fluka Analytical) lub przez zbieranie płytek sterylnymi końcówkami pipet. Fagi izolowano z supernatantu hodowli lub buforu ekstrakcyjnego za pomocą jednej rundy precypitacji glikolem polietylenowym (PEG 8000) (Promega) i zawieszano ponownie w buforze Tris-EDTA.
Wzmocniony fag został poddany 2-3 rundom usuwania endotoksyn przy użyciu kulek do usuwania endotoksyn (Miltenyi Biotec) przed dożylnym (IV) wstrzyknięciem (500 μl/zwierzę). W pierwszej rundzie wprowadzono 2×1012 fagów; w drugiej 2×1010 fagów; w trzeciej i czwartej rundzie selekcji 2×109 fagów na zwierzę. Zawartość fagów w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi pobranych w określonych punktach czasowych określono przez liczenie płytek zgodnie z instrukcją producenta (instrukcja systemu T7Select). Selekcję fagów przeprowadzono poprzez dożylne wstrzyknięcie oczyszczonych bibliotek do żyły ogonowej lub poprzez ponowne wstrzyknięcie faga wyekstrahowanego z płynu mózgowo-rdzeniowego z poprzedniej rundy selekcji, a kolejne zbiory przeprowadzono odpowiednio po 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min i 240 min próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi. Przeprowadzono łącznie cztery rundy płukania in vivo, w których dwie wybrane gałęzie były oddzielnie przechowywane i analizowane podczas pierwszych trzech rund selekcji. Wszystkie wstawki fagów wyekstrahowane z płynu mózgowo-rdzeniowego z pierwszych dwóch rund selekcji poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche, podczas gdy wszystkie klony wyekstrahowane z płynu mózgowo-rdzeniowego z ostatnich dwóch rund selekcji poddano sekwencjonowaniu ręcznemu. Wszystkie fagi krwi z pierwszej rundy selekcji poddano również pirosekwencjonowaniu 454/Roche. W celu wstrzyknięcia klonów fagowych wybrane fagi amplifikowano w E. coli (BL5615) na płytkach 500 cm2 w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Indywidualnie wybrane i ręcznie sekwencjonowane klony rozmnażano w podłożu TB. Po ekstrakcji fagów, oczyszczeniu i usunięciu endotoksyny (jak opisano powyżej), 2×1010 fagów/zwierzę w 300 μl wstrzyknięto dożylnie do jednej żyły ogonowej.
Wstępne przetwarzanie i jakościowe filtrowanie danych sekwencji. Surowe dane 454/Roche zostały przekonwertowane z binarnego standardowego formatu mapy strumieniowej (sff) na czytelny dla człowieka format Pearson (fasta) przy użyciu oprogramowania dostawcy. Dalsze przetwarzanie sekwencji nukleotydowej przeprowadzono przy użyciu zastrzeżonych programów i skryptów C (niewydany pakiet oprogramowania), jak opisano poniżej. Analiza danych pierwotnych obejmuje ścisłe procedury filtrowania wieloetapowego. Aby odfiltrować odczyty, które nie zawierały prawidłowej sekwencji DNA insertu 12-merowego, odczyty zostały sekwencyjnie wyrównane do znacznika startowego (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), znacznika stopu (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i insertu tła (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) przy użyciu globalnego testu Needlemana-Wunscha. wyrównanie umożliwiające do 2 niespójności na wyrównanie31. Dlatego odczyty bez znaczników start i stop oraz odczyty zawierające wstawki tła, tj. dopasowania przekraczające dozwoloną liczbę niezgodności, zostały usunięte z biblioteki. Jeśli chodzi o pozostałe odczyty, sekwencja DNA N-mer rozciągająca się od znacznika start i kończąca się przed znacznikiem stop została wycięta z oryginalnej sekwencji odczytu i dalej przetworzona (zwana dalej „wstawką”). Po translacji wstawki część po pierwszym kodonie stop na końcu 5' primera została usunięta z wstawki. Ponadto usunięto również nukleotydy prowadzące do niekompletnych kodonów na końcu 3' primera. Aby wykluczyć wstawki zawierające tylko sekwencje tła, usunięto również przetłumaczone wstawki zaczynające się od wzoru aminokwasowego „PAG”. Peptydy o długości potranslacyjnej mniejszej niż 3 aminokwasy zostały usunięte z biblioteki. Na koniec usuń nadmiarowość w puli wstawek i określ częstotliwość każdego unikalnego wstawki. Wyniki tej analizy obejmowały listę sekwencji nukleotydowych (insert) i ich częstości (odczyt) (rysunki uzupełniające 1c i 2).
Grupuj wstawki DNA N-mer według podobieństwa sekwencji: Aby wyeliminować specyficzne dla 454/Roche błędy sekwencjonowania (takie jak problemy z sekwencjonowaniem rozszerzeń homopolimerowych) i usunąć mniej ważne redundancje, wcześniej odfiltrowane wstawki sekwencji DNA N-mer (wstawki) są sortowane według podobieństwa. wstawki (dopuszcza się do 2 niepasujących zasad) przy użyciu iteracyjnego algorytmu zdefiniowanego w następujący sposób: wstawki są sortowane najpierw według ich częstości (od najwyższej do najniższej), a jeśli są takie same, według ich drugorzędnego sortowania według długości (od najdłuższej do najkrótszej). W ten sposób najczęstsze i najdłuższe wstawki definiują pierwszą „grupę”. Częstotliwość grupy jest ustawiana na częstotliwość kluczową. Następnie każdą wstawkę pozostałą na posortowanej liście próbowano dodać do grupy przez parowe dopasowanie Needlemana-Wunscha. Jeśli liczba niezgodności, insercji lub delecji w dopasowaniu nie przekracza progu 2, insercja jest dodawana do grupy, a ogólna częstość grupy jest zwiększana o częstotliwość dodawania insercji. Insercje dodane do grupy są oznaczane jako użyte i wykluczane z dalszego przetwarzania. Jeśli sekwencji insercji nie można dodać do już istniejącej grupy, sekwencja insercji jest używana do utworzenia nowej grupy z odpowiednią częstością insercji i oznaczana jako użyta. Iteracja kończy się, gdy każda sekwencja insercji zostanie użyta do utworzenia nowej grupy lub może zostać uwzględniona w już istniejącej grupie. W końcu zgrupowane insercje składające się z nukleotydów są ostatecznie tłumaczone na sekwencje peptydowe (biblioteki peptydów). Wynikiem tej analizy jest zestaw insercji i odpowiadających im częstości, które składają się na liczbę kolejnych odczytów (rys. uzupełniający 2).
Generowanie motywów: Na podstawie listy unikalnych peptydów utworzono bibliotekę zawierającą wszystkie możliwe wzorce aminokwasów (aa), jak pokazano poniżej. Każdy możliwy wzór o długości 3 został wyodrębniony z peptydu, a jego odwrotny wzór został dodany wraz ze wspólną biblioteką motywów zawierającą wszystkie wzorce (tripeptydy). Biblioteki bardzo powtarzalnych motywów zostały zsekwencjonowane i usunięto nadmiarowość. Następnie dla każdego tripeptydu w bibliotece motywów sprawdziliśmy jego obecność w bibliotece za pomocą narzędzi obliczeniowych. W tym przypadku częstotliwość peptydu zawierającego znaleziony tripeptyd motywu jest dodawana i przypisywana do motywu w bibliotece motywów („liczba motywów”). Wynikiem generowania motywu jest dwuwymiarowa tablica zawierająca wszystkie wystąpienia tripeptydów (motywów) i ich odpowiednie wartości, które są liczbą odczytów sekwencjonowania, które skutkują odpowiadającym motywem, gdy odczyty są filtrowane, grupowane i tłumaczone. Metryki opisane szczegółowo powyżej.
Normalizacja liczby motywów i odpowiadających im wykresów punktowych: Liczbę motywów dla każdej próbki znormalizowano przy użyciu
gdzie ni jest liczbą odczytów zawierających temat i. Zatem vi reprezentuje procentową częstość odczytów (lub peptydów) zawierających motyw i w próbce. Wartości p dla nienormalizowanej liczby motywów obliczono przy użyciu dokładnego testu Fishera. Jeśli chodzi o korelogramy liczby motywów, korelacje Spearmana obliczono przy użyciu znormalizowanej liczby motywów z R.
Aby zwizualizować zawartość aminokwasów w każdej pozycji biblioteki peptydów, utworzono logogramy internetowe 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Najpierw zawartość aminokwasów w każdej pozycji peptydu 12-merowego jest przechowywana w macierzy 20×12. Następnie zestaw 1000 peptydów zawierających tę samą względną zawartość aminokwasów w każdej pozycji jest generowany w formacie fasta-sequence i dostarczany jako dane wejściowe do logo internetowego 3, które generuje graficzną reprezentację względnej zawartości aminokwasów w każdej pozycji dla danej biblioteki peptydów. Aby zwizualizować wielowymiarowe zestawy danych, utworzono mapy cieplne przy użyciu wewnętrznie opracowanego narzędzia w R (biosHeatmap, jeszcze nieopublikowany pakiet R). Dendrogramy przedstawione na mapach cieplnych obliczono przy użyciu hierarchicznej metody klastrowania Warda z metryką odległości euklidesowej. Do analizy statystycznej danych punktacji motywów, wartości p dla punktacji nienormalizowanej obliczono przy użyciu dokładnego testu Fishera. Wartości p dla innych zestawów danych obliczono w R przy użyciu testu t-Studenta lub ANOVA.
Wybrane klony fagowe i fagi bez insertów wstrzykiwano dożylnie przez żyłę ogonową (2×1010 fagów/zwierzę w 300 μl PBS). Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem tym samym zwierzętom wstrzykiwano dożylnie 100 μl lektyny znakowanej DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minut po wstrzyknięciu faga szczury perfundowano przez serce 50 ml PBS, a następnie 50 ml 4% PFA/PBS. Próbki mózgu dodatkowo utrwalano przez noc w 4% PFA/PBS i moczono w 30% sacharozie przez noc w temperaturze 4°C. Próbki zamrażano błyskawicznie w mieszaninie OCT. Analizę immunohistochemiczną zamrożonych próbek przeprowadzono w temperaturze pokojowej na 30 µm krioskrawkach zablokowanych 1% BSA i inkubowano z poliklonalnymi przeciwciałami znakowanymi FITC przeciwko fagowi T7 (Novus NB 600-376A) w temperaturze 4 °C. Inkubowano przez noc. Na koniec skrawki przemyto 3 razy PBS i zbadano za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego (Leica TCS SP5).
Wszystkie peptydy o minimalnej czystości 98% zostały zsyntetyzowane przez GenScript USA, biotynylowane i liofilizowane. Biotyna jest wiązana poprzez dodatkowy potrójny odstępnik glicyny na N-końcu. Sprawdź wszystkie peptydy za pomocą spektrometrii masowej.
Streptawidynę (Sigma S0677) zmieszano z 5-krotnym nadmiarem ekwimolarnym biotynylowanego peptydu, biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 lub kombinacji (stosunek 3:1) biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 i peptydu hamującego BACE1 w 5–10% DMSO/inkubowano w PBS. 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Peptydy sprzężone ze streptawidyną wstrzykiwano dożylnie w dawce 10 mg/kg do jednej z żył ogonowych szczurów z jamą mózgową.
Stężenie kompleksów streptawidyna-peptyd oceniano metodą ELISA. Płytki mikrotitracyjne Nunc Maxisorp (Sigma) pokrywano przez noc w temperaturze 4°C 1,5 μg/ml przeciwciała myszy przeciwko streptawidynie (Thermo, MA1-20011). Po zablokowaniu (bufor blokujący: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% żelatyny, 1% BSA) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, przemywano płytkę 0,05% Tween-20/PBS (bufor do przemywania) przez 3 sekundy, do studzienek rozcieńczonych buforem blokującym (osocze 1:10 000, CSF 1:115) dodawano próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza. Następnie płytkę inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałem detekcyjnym (1 μg/ml, anty-streptawidyna-HRP, Novus NB120-7239). Po trzech etapach płukania streptawidyna została wykryta przez inkubację w roztworze substratu TMB (Roche) przez okres do 20 min. Po zatrzymaniu rozwoju koloru za pomocą 1M H2SO4, zmierz absorbancję przy 450 nm.
Funkcjonowanie kompleksu streptawidyna-peptyd-inhibitor BACE1 oceniano za pomocą testu ELISA Aβ(1-40) zgodnie z protokołem producenta (Wako, 294-64701). W skrócie, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczano w standardowym rozcieńczalniku (1:23) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C w 96-dołkowych płytkach pokrytych przeciwciałem wychwytującym BNT77. Po pięciu etapach płukania dodano przeciwciało BA27 sprzężone z HRP i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C, a następnie wykonano pięć etapów płukania. Aβ(1–40) wykrywano przez inkubację w roztworze TMB przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zatrzymaniu rozwoju koloru roztworem zatrzymującym zmierz absorbancję przy 450 nm. Próbki osocza poddano ekstrakcji w fazie stałej przed testem ELISA Aβ(1–40). Do 96-dołkowych płytek dodano osocze do 0,2% DEA (Sigma) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po kolejnym umyciu płytek SPE (Oasis, 186000679) wodą i 100% metanolem, próbki osocza dodano do płytek SPE i usunięto cały płyn. Próbki umyto (najpierw 5% metanolem, a następnie 30% metanolem) i eluowano 2% NH4OH/90% metanolem. Po wysuszeniu eluatu w temperaturze 55°C przez 99 minut przy stałym natężeniu N2, próbki zredukowano w standardowych rozcieńczalnikach, a Aβ(1–40) zmierzono w sposób opisany powyżej.
Jak cytować ten artykuł: Urich, E. i in. Dostarczanie ładunku do mózgu przy użyciu peptydów transportowych zidentyfikowanych in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Dostarczanie leków makromolekularnych do mózgu przy użyciu terapii celowanej. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Dostarczanie leków peptydowych i białkowych przez barierę krew-mózg. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Bariera krew-mózg: wąskie gardło w rozwoju leków na mózg. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Perspektywy ulepszonego dostarczania leków i kierowania ich do mózgu poprzez szlak splotu naczyniówkowego i płynu mózgowo-rdzeniowego. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacja biofarmaceutyków za pomocą molekularnych koni trojańskich do dostarczania do mózgu. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide transport across the blood-brain barrier. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. i in. Zwiększenie penetracji mózgu i skuteczności przeciwciał terapeutycznych przy użyciu jednowartościowych wahadłowców molekularnych. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i in. Transport receptora transferyny (TfR) determinuje wychwyt wariantów powinowactwa przeciwciał TfR przez mózg. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).