Niektóre tematy dotyczące rozwiązywania problemów z układami LC nigdy się nie starzeją, ponieważ w praktyce LC wciąż pojawiają się problemy, nawet gdy technologia przyrządów z czasem się rozwija. Istnieje wiele sposobów, w jaki mogą pojawić się problemy w układzie LC i skutkować złym kształtem szczytów. Gdy pojawiają się problemy związane z kształtem szczytów, krótka lista możliwych przyczyn tych wyników pomaga uprościć proces rozwiązywania problemów.
Pisanie tej kolumny „Rozwiązywanie problemów z chromatografią cieczową” i comiesięczne rozmyślanie nad tematami było świetną zabawą, ponieważ niektóre tematy nigdy nie wychodzą z mody. Podczas gdy w dziedzinie badań nad chromatografią pewne tematy lub pomysły stają się przestarzałe, ponieważ są zastępowane nowszymi i lepszymi pomysłami, w dziedzinie rozwiązywania problemów, odkąd pierwszy artykuł o rozwiązywaniu problemów pojawił się w tym czasopiśmie (wówczas LC Journal), ponieważ niektóre tematy są nadal aktualne) w 1983 r. (1). Przez ostatnie kilka lat skupiłem kilka sekcji dotyczących rozwiązywania problemów z chromatografią cieczową na współczesnych trendach wpływających na chromatografię cieczową (LC) (na przykład względne porównanie naszego zrozumienia wpływu ciśnienia na retencję [2] Nowe osiągnięcia), nasza interpretacja wyników LC i sposób rozwiązywania problemów za pomocą nowoczesnych urządzeń LC. W tej części kontynuuję moją serię (3), którą rozpocząłem w grudniu 2021 r., która skupiała się na niektórych tematach „życia i śmierci” rozwiązywania problemów z chromatografią cieczową — elementy, które są świetne dla każdego specjalisty od rozwiązywania problemów, są niezbędne, niezależnie od wieku systemu, którego używamy używając.Główny temat tej serii jest bardzo istotny dla słynnej tabeli ściennej „LC Troubleshooting Guide” (4) LCGC wiszącej w wielu laboratoriach.W trzeciej części tej serii postanowiłem skupić się na problemach związanych z kształtem lub charakterystyką szczytu.Niesamowite, że tabela ścienna wymienia 44 różne potencjalne przyczyny złego kształtu szczytu!Nie możemy omówić wszystkich tych problemów szczegółowo w jednym artykule, więc w tej pierwszej części tego tematu skupię się na niektórych z tych, z którymi spotykam się najczęściej.Mam nadzieję, że młodzi i starsi użytkownicy LC znajdą kilka pomocnych wskazówek i przypomnień na ten ważny temat.
Coraz częściej odpowiadam na pytania dotyczące rozwiązywania problemów słowami „wszystko jest możliwe”. Ta odpowiedź może wydawać się łatwa, gdy rozważa się obserwacje, które są trudne do zinterpretowania, ale często uważam ją za właściwą. Biorąc pod uwagę wiele możliwych przyczyn złego kształtu szczytu, ważne jest, aby zachować otwarty umysł, rozważając, na czym może polegać problem, i móc ustalić priorytety potencjalnych przyczyn, aby rozpocząć rozwiązywanie problemów, koncentrując się na tych najczęstszych możliwościach, ten punkt jest bardzo ważny.możliwy.
Kluczowym krokiem w każdym ćwiczeniu rozwiązywania problemów — ale moim zdaniem niedocenianym — jest rozpoznanie, że istnieje problem, który należy rozwiązać. Rozpoznanie, że istnieje problem, często oznacza rozpoznanie, że to, co dzieje się z narzędziem, różni się od naszych oczekiwań, które są kształtowane przez teorię, wiedzę empiryczną i doświadczenie (5). „Kształt szczytu”, o którym mowa tutaj, odnosi się w rzeczywistości nie tylko do kształtu szczytu (symetryczny, asymetryczny, gładki, puszysty, krawędź natarcia, ogon itp.), ale także do szerokości. Nasze oczekiwania co do rzeczywistego kształtu szczytu są proste. Teoria (6) dobrze potwierdza podręcznikowe oczekiwanie, że w większości przypadków szczyty chromatograficzne powinny być symetryczne i zgodne z kształtem rozkładu Gaussa, jak pokazano na rysunku 1a. To, czego oczekujemy od szerokości szczytów, jest bardziej złożoną kwestią i omówimy ten temat w przyszłym artykule. Inne kształty szczytów na rysunku 1 pokazują niektóre z innych możliwości, które można zaobserwować — innymi słowy, niektóre sposoby, w jakie rzeczy mogą pójść nie tak. W pozostałej części tego W dalszej części artykułu poświęcimy czas na omówienie kilku konkretnych przykładów sytuacji, które mogą prowadzić do tego typu kształtów.
Czasami pików w ogóle nie widać na chromatogramie, gdzie powinny zostać wyeluowane. Powyższy wykres ścienny wskazuje, że brak piku (zakładając, że próbka faktycznie zawiera analit docelowy w stężeniu, które powinno sprawić, że odpowiedź detektora będzie wystarczająca, aby zobaczyć go ponad szumem) jest zwykle związany z jakimś problemem z urządzeniem lub nieprawidłowymi warunkami fazy ruchomej (jeśli w ogóle zostaną zaobserwowane). piki, zwykle zbyt „słabe”). Krótką listę potencjalnych problemów i rozwiązań w tej kategorii można znaleźć w Tabeli I.
Jak wspomniano powyżej, kwestia, jak duże poszerzenie piku należy tolerować, zanim zwróci się na nie uwagę i spróbuje je naprawić, jest złożonym tematem, który omówię w przyszłym artykule. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​znacznemu poszerzeniu piku często towarzyszy znacząca zmiana kształtu piku, a ogonowanie piku jest częstsze niż przedszczytowe lub rozdzielające się. Jednak nominalnie symetryczne piki również są poszerzane, co może być spowodowane kilkoma różnymi przyczynami:
Każdy z tych problemów został szczegółowo omówiony w poprzednich wydaniach Troubleshooting LC, a czytelnicy zainteresowani tymi tematami mogą zapoznać się z tymi poprzednimi artykułami, aby uzyskać informacje na temat przyczyn źródłowych i potencjalnych rozwiązań tych problemów. Więcej szczegółów.
Ogonowanie, czołowanie i rozszczepianie się pików mogą być spowodowane zjawiskami chemicznymi lub fizycznymi, a lista potencjalnych rozwiązań tych problemów jest bardzo zróżnicowana w zależności od tego, czy mamy do czynienia z problemem chemicznym czy fizycznym. Często porównując różne piki na chromatogramie, można znaleźć ważne wskazówki dotyczące tego, który jest winowajcą. Jeśli wszystkie piki na chromatogramie mają podobne kształty, przyczyna najprawdopodobniej nie jest fizyczna. Jeśli problem dotyczy tylko jednego lub kilku pików, a reszta wygląda dobrze, przyczyna najprawdopodobniej jest chemiczna.
Chemiczne przyczyny ogonowania pików są zbyt złożone, aby omówić je tutaj pokrótce. Zainteresowany czytelnik powinien zapoznać się z najnowszym wydaniem „LC Troubleshooting” w celu bardziej szczegółowej dyskusji (10). Jednak łatwą rzeczą do wypróbowania jest zmniejszenie masy wstrzykiwanego analitu i sprawdzenie, czy kształt piku się poprawi. Jeśli tak, to jest to dobra wskazówka, że ​​problemem jest „przeciążenie masą”. W takim przypadku metoda musi być ograniczona do wstrzykiwania małych mas analitu lub warunki chromatograficzne muszą zostać zmienione tak, aby można było uzyskać dobre kształty pików nawet przy wstrzykiwaniu większych mas.
Istnieje również wiele potencjalnych fizycznych przyczyn ogonowania szczytowego. Czytelnicy zainteresowani szczegółową dyskusją na temat tych możliwości powinni zapoznać się z innym niedawnym wydaniem „LC Troubleshooting” (11). Jedną z częstszych fizycznych przyczyn ogonowania szczytowego jest słabe połączenie w punkcie między wtryskiwaczem a detektorem (12). Skrajny przykład pokazano na rysunku 1d, uzyskanym w moim laboratorium kilka tygodni temu. W tym przypadku zbudowaliśmy system z nowym zaworem wtryskowym, którego wcześniej nie używaliśmy, i zainstalowaliśmy pętlę wtryskową o małej objętości z tuleją, która została uformowana na kapilarze ze stali nierdzewnej. Po kilku początkowych eksperymentach z rozwiązywaniem problemów zdaliśmy sobie sprawę, że głębokość portu w stojanie zaworu wtryskowego była znacznie większa, niż byliśmy przyzwyczajeni, co skutkowało dużą martwą objętością na dole portu. Ten problem można łatwo rozwiązać, zastępując pętlę wtryskową inną rurą, możemy wyregulować tuleję do właściwej pozycji, aby wyeliminować martwą objętość na dole portu.
Czoła pików, takie jak pokazane na rysunku 1e, mogą być również spowodowane problemami fizycznymi lub chemicznymi. Częstą przyczyną fizyczną krawędzi natarcia jest to, że warstwa cząstek kolumny nie jest dobrze upakowana lub że cząstki z czasem uległy reorganizacji. Podobnie jak w przypadku ogonowania pików spowodowanego tym zjawiskiem fizycznym, najlepszym sposobem na naprawienie tego jest wymiana kolumny i kontynuowanie pracy. Zasadniczo kształty pików krawędzi natarcia o pochodzeniu chemicznym często wynikają z tego, co nazywamy „nieliniowymi” warunkami retencji. W idealnych (liniowych) warunkach ilość analitu zatrzymanego przez fazę stacjonarną (a zatem współczynnik retencji) jest liniowo związana ze stężeniem analitu w kolumnie. Chromatograficznie oznacza to, że wraz ze wzrostem masy analitu wstrzykiwanego do kolumny pik staje się wyższy, ale nie szerszy. Ta zależność zostaje zerwana, gdy zachowanie retencji jest nieliniowe, a piki nie tylko stają się wyższe, ale również szersze, gdy wstrzykiwana jest większa masa. Ponadto kształty nieliniowe określają kształt pików chromatograficznych, co powoduje wiodące lub krawędzie spływu. Podobnie jak w przypadku przeciążenia masą, które powoduje ogonowanie piku (10), wyprzedzanie piku spowodowane nieliniową retencją można również zdiagnozować poprzez zmniejszenie masy wstrzykiwanego analitu. Jeśli kształt piku ulegnie poprawie, należy zmodyfikować metodę, aby nie przekroczyć jakości wtrysku powodującej krawędź spływu, lub należy zmienić warunki chromatograficzne, aby zminimalizować to zachowanie.
Czasami obserwujemy coś, co wydaje się być „rozszczepionym” szczytem, ​​jak pokazano na rysunku 1f. Pierwszym krokiem w rozwiązaniu tego problemu jest ustalenie, czy kształt szczytu jest wynikiem częściowej współelucji (tj. obecności dwóch odrębnych, ale blisko eluujących związków). Jeśli w rzeczywistości dwa różne anality eluują blisko siebie, to chodzi o poprawę ich rozdzielczości (na przykład poprzez zwiększenie selektywności, retencji lub liczby płytek), a pozorne „rozszczepione” szczyty są związane z parametrami fizycznymi. Wydajność nie ma nic wspólnego z samą kolumną. Często najważniejszą wskazówką przy tej decyzji jest to, czy wszystkie szczyty na chromatogramie wykazują rozdzielone kształty, czy tylko jeden lub dwa. Jeśli jest tylko jeden lub dwa, to prawdopodobnie jest to problem współelucji; jeśli wszystkie szczyty są rozdzielone, to prawdopodobnie jest to problem fizyczny, najprawdopodobniej związany z samą kolumną.
Rozszczepione piki związane z właściwościami fizycznymi samej kolumny są zwykle spowodowane częściowo zablokowanymi frytami wlotowymi lub wylotowymi lub reorganizacją cząstek w kolumnie, co pozwala fazie ruchomej płynąć szybciej niż fazie ruchomej w niektórych obszarach formowania kanału kolumny, a w innych regionach (11). Częściowo zatkany fryt można czasami oczyścić, odwracając przepływ przez kolumnę; jednak według mojego doświadczenia jest to zwykle rozwiązanie krótkoterminowe, a nie długoterminowe. W przypadku nowoczesnych kolumn jest to często fatalne w skutkach, jeśli cząstki rekombinują w kolumnie. W tym momencie najlepiej wymienić kolumnę i kontynuować.
Szczyt na Rysunku 1g, również z niedawnego przypadku w moim laboratorium, zwykle wskazuje, że sygnał jest tak wysoki, że osiągnął górny koniec zakresu odpowiedzi. W przypadku detektorów absorbancji optycznej (w tym przypadku UV-vis), gdy stężenie analitu jest bardzo wysokie, analit pochłania większość światła przechodzącego przez komorę przepływową detektora, pozostawiając bardzo mało światła do wykrycia. W tych warunkach sygnał elektryczny z fotodetektora jest silnie zależny od różnych źródeł szumu, takich jak światło rozproszone i „ciemny prąd”, co sprawia, że ​​sygnał ma bardzo „rozmyty” wygląd i jest niezależny od stężenia analitu. Kiedy tak się dzieje, problem można często łatwo rozwiązać, zmniejszając objętość wtrysku analitu — zmniejszając objętość wtrysku, rozcieńczając próbkę lub robiąc jedno i drugie.
W szkole chromatografii używamy sygnału detektora (tj. osi y na chromatogramie) jako wskaźnika stężenia analitu w próbce. Dlatego dziwne jest widzieć chromatogram z sygnałem poniżej zera, ponieważ prosta interpretacja jest taka, że ​​wskazuje to na ujemne stężenie analitu – co oczywiście nie jest fizycznie możliwe. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​ujemne piki najczęściej obserwuje się przy użyciu detektorów absorbancji optycznej (np. UV-vis).
W tym przypadku ujemny pik oznacza po prostu, że cząsteczki eluowane z kolumny absorbują mniej światła niż sama faza ruchoma bezpośrednio przed i po piku. Może się to zdarzyć na przykład przy użyciu stosunkowo niskich długości fal detekcji (<230 nm) i dodatków do fazy ruchomej, które absorbują większość światła przy tych długościach fal. Takimi dodatkami mogą być składniki rozpuszczalnika fazy ruchomej, takie jak metanol lub składniki buforu, takie jak octan lub mrówczan. Można faktycznie użyć ujemnych pików do przygotowania krzywej kalibracji i uzyskania dokładnych informacji ilościowych, więc nie ma zasadniczego powodu, aby ich unikać per se (ta metoda jest czasami określana jako „pośrednie wykrywanie UV”) (13). Jednak jeśli naprawdę chcemy całkowicie uniknąć ujemnych pików, w przypadku wykrywania absorbancji najlepszym rozwiązaniem jest użycie innej długości fali detekcji, tak aby analit absorbował więcej niż faza ruchoma, lub zmiana składu fazy ruchomej, tak aby absorbowała ona mniej światła niż anality.
Ujemne piki mogą się również pojawiać podczas stosowania detekcji współczynnika refrakcji (RI), gdy współczynnik refrakcji składników innych niż analit w próbce, takich jak matryca rozpuszczalnika, jest inny niż współczynnik refrakcji fazy ruchomej. Dzieje się tak również w przypadku detekcji UV-vis, ale efekt ten jest zwykle osłabiony w porównaniu z detekcją RI. W obu przypadkach ujemne piki można zminimalizować poprzez dokładniejsze dopasowanie składu matrycy próbki do składu fazy ruchomej.
W części trzeciej, dotyczącej podstawowego tematu rozwiązywania problemów LC, omówiłem sytuacje, w których obserwowany kształt szczytu różni się od oczekiwanego lub normalnego kształtu szczytu. Skuteczne rozwiązywanie takich problemów zaczyna się od znajomości oczekiwanych kształtów szczytów (opartej na teorii lub wcześniejszym doświadczeniu z istniejącymi metodami), więc odchylenia od tych oczekiwań są oczywiste. Problemy z kształtem szczytu mają wiele różnych potencjalnych przyczyn (zbyt szeroki, ogonowy, krawędź natarcia itp.). W tej części szczegółowo omawiam niektóre z najczęściej występujących przyczyn. Znajomość tych szczegółów zapewnia dobry punkt wyjścia do rozpoczęcia rozwiązywania problemów, ale nie obejmuje wszystkich możliwości. Czytelnicy zainteresowani bardziej szczegółową listą przyczyn i rozwiązań mogą zapoznać się ze schematem ściennym LCGC „LC Troubleshooting Guide”.
(4) LCGC „Przewodnik rozwiązywania problemów z LC” – wykres ścienny. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza danych i przetwarzanie sygnałów w chromatografii (Elsevier, Nowy Jork, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.