Niektóre tematy dotyczące rozwiązywania problemów z LC nigdy nie są nieaktualne, ponieważ w praktyce LC pojawiają się problemy, nawet gdy technologia przyrządów poprawia się z biegiem czasu. Istnieje wiele sposobów, w jakie mogą pojawić się problemy w systemie LC i zakończyć się złym kształtem pików. Kiedy pojawiają się problemy związane z kształtem pików, krótka lista możliwych przyczyn tych wyników pomaga uprościć nasze doświadczenie w rozwiązywaniu problemów.
Fajnie było pisać tę kolumnę „LC Troubleshooting” i zastanawiać się nad tematami każdego miesiąca, ponieważ niektóre tematy nigdy nie wychodzą z mody. W dziedzinie badań nad chromatografią niektóre tematy lub idee stają się przestarzałe, ponieważ są zastępowane nowszymi i lepszymi pomysłami w dziedzinie rozwiązywania problemów, odkąd pierwszy artykuł dotyczący rozwiązywania problemów pojawił się w tym czasopiśmie (wówczas LC Journal), ponieważ niektóre tematy są nadal aktualne) w 1983 r. (1). W ciągu ostatnich kilku lat skupiłem się na kilku LC Sekcje dotyczące rozwiązywania problemów dotyczące współczesnych trendów wpływających na chromatografię cieczową (LC) (na przykład względne porównanie naszego zrozumienia wpływu ciśnienia na retencję [2] New Advances) Nasza interpretacja wyników LC i sposoby rozwiązywania problemów za pomocą nowoczesnych przyrządów LC. W tym miesiącu kontynuuję moją serię (3), która rozpoczęła się w grudniu 2021 r., która skupiała się na niektórych tematach „życia i śmierci” rozwiązywania problemów LC — elementy, które są świetne dla każdego narzędzia do rozwiązywania problemów, są niezbędne, bez względu na wiek systemu, którego używamy Główny temat tej serii jest bardzo związany ze słynnym wykresem ściennym LCGC „LC Troubleshooting Guide” (4), który wisi w wielu laboratoriach. W trzeciej części tej serii zdecydowałem się skupić na kwestiach związanych z kształtem piku lub charakterystyką piku. Niewiarygodne, że na wykresie ściennym wymieniono 44 różne potencjalne przyczyny złego kształtu piku! Nie możemy szczegółowo omówić wszystkich tych problemów w jednym artykule, więc w pierwszej części tego tematu skupię się na tych, z którymi spotykam się najczęściej. a starzy użytkownicy LC znajdą przydatne wskazówki i przypomnienia dotyczące tego ważnego tematu.
Coraz częściej odpowiadam na pytania dotyczące rozwiązywania problemów, mówiąc „wszystko jest możliwe”. Ta odpowiedź może wydawać się łatwa, biorąc pod uwagę obserwacje, które są trudne do interpretacji, ale często uważam ją za odpowiednią. Biorąc pod uwagę wiele możliwych przyczyn złego kształtu piku, ważne jest, aby zachować otwarty umysł podczas rozważania, jaki może być problem, i móc ustalić priorytety potencjalnych przyczyn, aby rozpocząć nasze wysiłki w celu rozwiązania problemu, koncentrując się na tych najczęstszych możliwościach, ten punkt jest bardzo ważny. możliwe.
Kluczowym krokiem w każdym ćwiczeniu rozwiązywania problemów — ale moim zdaniem niedocenianym — jest rozpoznanie, że istnieje problem, który należy rozwiązać. Rozpoznanie problemu często oznacza uznanie, że to, co dzieje się z narzędziem, różni się od naszych oczekiwań, które są kształtowane przez teorię, wiedzę empiryczną i doświadczenie (5). „Kształt piku”, o którym tutaj mowa, w rzeczywistości odnosi się nie tylko do kształtu piku (symetryczny, asymetryczny, gładki, puszysty, krawędź natarcia, ogonowanie itp.), ale także do Nasze oczekiwania co do faktycznego kształtu piku są proste. Teoria (6) dobrze potwierdza podręcznikowe oczekiwanie, że w większości przypadków piki chromatograficzne powinny być symetryczne i odpowiadać kształtowi rozkładu Gaussa, jak pokazano na rycinie 1a. To, czego oczekujemy od szerokości pików, jest bardziej złożonym zagadnieniem i omówimy ten temat w przyszłym artykule. raty, poświęcimy czas na omówienie konkretnych przykładów sytuacji, które mogą prowadzić do tego typu kształtów.
Czasami pików nie obserwuje się wcale na chromatogramie, w którym oczekuje się ich elucji. Powyższy wykres ścienny wskazuje, że brak piku (zakładając, że próbka rzeczywiście zawiera docelowy analit w stężeniu, które powinno sprawić, że odpowiedź detektora będzie wystarczająca, aby zobaczyć go ponad szumem) jest zwykle związany z jakimś problemem z instrumentem lub nieprawidłowymi warunkami fazy ruchomej (jeśli w ogóle jest obserwowany).szczyty, zwykle zbyt „słabe”). Krótką listę potencjalnych problemów i rozwiązań z tej kategorii zawiera Tabela I.
Jak wspomniano powyżej, kwestia tego, jak bardzo poszerzenie pików powinno być tolerowane, zanim zwróci się na to uwagę i spróbuje to naprawić, jest złożonym tematem, który omówię w przyszłym artykule. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​znacznemu poszerzeniu pików często towarzyszy znaczna zmiana kształtu piku, a ogonowanie pików jest bardziej powszechne niż przed pikiem lub dzielenie. Jednak nominalnie symetryczne piki są również poszerzane, co może być spowodowane kilkoma różnymi przyczynami:
Każdy z tych problemów został szczegółowo omówiony w poprzednich wydaniach Troubleshooting LC, a czytelnicy zainteresowani tymi tematami mogą zapoznać się z tymi poprzednimi artykułami, aby uzyskać informacje na temat głównych przyczyn i potencjalnych rozwiązań tych problemów.Więcej szczegółów.
Ogonowanie pików, czoło pików i rozszczepianie mogą być spowodowane zjawiskami chemicznymi lub fizycznymi, a lista potencjalnych rozwiązań tych problemów jest bardzo różna, w zależności od tego, czy mamy do czynienia z problemem chemicznym, czy fizycznym. Często porównując różne piki na chromatogramie, można znaleźć ważne wskazówki dotyczące winowajcy. Jeśli wszystkie piki na chromatogramie mają podobne kształty, przyczyna najprawdopodobniej nie jest fizyczna. .
Chemiczne przyczyny ogonowania pików są zbyt złożone, aby je tutaj krótko omówić. Zainteresowanego czytelnika odsyłamy do niedawnego wydania „LC Troubleshooting” w celu dokładniejszego omówienia (10). Jednak łatwą rzeczą do wypróbowania jest zmniejszenie masy wstrzykniętego analitu i sprawdzenie, czy kształt piku się poprawia. Jeśli tak, to jest to dobra wskazówka, że ​​problemem jest „przeciążenie masą”. dobre kształty pików można uzyskać nawet przy wstrzykiwaniu większych mas.
Istnieje również wiele potencjalnych fizycznych przyczyn ogonowania pików. Czytelników zainteresowanych szczegółowym omówieniem możliwości odsyłam do innego niedawnego wydania „LC Troubleshooting” (11). Jedną z najczęstszych fizycznych przyczyn ogonowania pików jest słabe połączenie w punkcie między wtryskiwaczem a detektorem (12). Skrajny przykład pokazano na rysunku 1d, uzyskanym w moim laboratorium kilka tygodni temu. który został uformowany na kapilarze ze stali nierdzewnej. Po kilku wstępnych próbach rozwiązywania problemów zdaliśmy sobie sprawę, że głębokość portu w stojanie zaworu wtryskowego była znacznie głębsza niż byliśmy do tego przyzwyczajeni, co skutkowało dużą martwą objętością na dnie portu.
Czoło pików, takie jak te pokazane na rysunku 1e, może być również spowodowane problemami fizycznymi lub chemicznymi. Częstą przyczyną fizyczną krawędzi natarcia jest to, że złoże cząstek w kolumnie nie jest dobrze upakowane lub cząstki z czasem przeorganizowały się. zatrzymywane przez fazę stacjonarną (stąd współczynnik retencji) jest liniowo związany ze stężeniem analitu w kolumnie. Chromatograficznie oznacza to, że wraz ze wzrostem masy analitu wstrzykniętego do kolumny pik staje się wyższy, ale nie szerszy. Zależność ta jest przerywana, gdy zachowanie retencji jest nieliniowe, a piki nie tylko stają się wyższe, ale także szersze w miarę wstrzykiwania większej masy. Podobnie jak w przypadku przeciążenia masą, które powoduje ogonowanie piku (10), wyprzedzenie piku spowodowane nieliniową retencją można również zdiagnozować poprzez zmniejszenie masy wstrzykniętego analitu. Jeśli kształt piku ulegnie poprawie, należy zmodyfikować metodę, aby nie przekraczała jakości nastrzyku, która powoduje krawędź natarcia, lub warunki chromatografii muszą zostać zmienione, aby zminimalizować to zachowanie.
Czasami obserwujemy coś, co wydaje się być „rozszczepionym” pikiem, jak pokazano na rysunku 1f. Pierwszym krokiem w rozwiązaniu tego problemu jest ustalenie, czy kształt piku jest spowodowany częściową koelucją (tj. obecnością dwóch różnych, ale ściśle eluujących związków). Jeśli rzeczywiście dwa różne anality eluują blisko siebie, to jest to kwestia poprawy ich rozdzielczości (na przykład poprzez zwiększenie selektywności, retencji lub liczby płytek), a widoczne „podzielone” piki są związane z właściwościami fizycznymi. Często najważniejszą wskazówką do podjęcia tej decyzji jest to, czy wszystkie piki na chromatogramie wykazują rozszczepione kształty, czy tylko jeden lub dwa. Jeśli to tylko jeden lub dwa, prawdopodobnie jest to kwestia koelucji;jeśli wszystkie piki są podzielone, prawdopodobnie jest to problem fizyczny, najprawdopodobniej związany z samą kolumną.
Rozszczepione piki związane z właściwościami fizycznymi samej kolumny są zwykle spowodowane częściowo zablokowanymi frytami wlotowymi lub wylotowymi lub reorganizacją cząstek w kolumnie, co umożliwia szybszy przepływ fazy ruchomej niż faza ruchoma w niektórych obszarach tworzenia kanału kolumny.jednak z mojego doświadczenia wynika, że ​​jest to zazwyczaj rozwiązanie krótkoterminowe, a nie długoterminowe. W przypadku nowoczesnych kolumn jest to często śmiertelne, jeśli cząsteczki rekombinują w kolumnie. W tym momencie najlepiej wymienić kolumnę i kontynuować.
Pik na rysunku 1g, również z niedawnego przypadku w moim własnym laboratorium, zwykle wskazuje, że sygnał jest tak wysoki, że osiągnął górną granicę zakresu odpowiedzi. W przypadku optycznych detektorów absorbancji (w tym przypadku UV-vis), gdy stężenie analitu jest bardzo wysokie, analit pochłania większość światła przechodzącego przez komorę przepływową detektora, pozostawiając bardzo mało światła do wykrycia. W tych warunkach na sygnał elektryczny z fotodetektora duży wpływ mają różne źródła szumu, takie jak światło rozproszone i „ciemny prąd”. sprawiając, że sygnał jest bardzo „rozmyty” i niezależny od stężenia analitu.Kiedy tak się dzieje, problem często można łatwo rozwiązać, zmniejszając objętość wtrysku analitu — zmniejszając objętość wtrysku, rozcieńczając próbkę lub jedno i drugie.
W szkole chromatografii używamy sygnału detektora (tj. osi y na chromatogramie) jako wskaźnika stężenia analitu w próbce. Dziwne wydaje się więc oglądanie chromatogramu z sygnałem poniżej zera, ponieważ prosta interpretacja jest taka, że ​​wskazuje to na ujemne stężenie analitu – co oczywiście nie jest fizycznie możliwe. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​ujemne piki obserwuje się najczęściej przy użyciu optycznych detektorów absorbancji (np. UV-vis).
W tym przypadku ujemny pik oznacza po prostu, że cząsteczki eluujące z kolumny absorbują mniej światła niż sama faza ruchoma bezpośrednio przed i po piku. Może to mieć miejsce na przykład przy użyciu stosunkowo niskich długości fal detekcji (<230 nm) i dodatków do fazy ruchomej, które pochłaniają większość światła przy tych długościach fal. Takimi dodatkami mogą być składniki rozpuszczalnika fazy ruchomej, takie jak metanol lub składniki buforowe, takie jak octan lub mrówczan. je per se (metoda ta jest czasami określana jako „pośrednia detekcja UV”) (13). Jeśli jednak naprawdę chcemy całkowicie uniknąć pików ujemnych, w przypadku detekcji absorbancji najlepszym rozwiązaniem jest zastosowanie innej długości fali detekcji, tak aby analit absorbował więcej niż faza ruchoma, lub zmiana składu fazy ruchomej tak, aby pochłaniały one mniej światła niż anality.
Ujemne piki mogą również pojawić się przy użyciu detekcji współczynnika załamania światła (RI), gdy współczynnik załamania światła składników innych niż analit w próbce, takich jak matryca rozpuszczalnika, różni się od współczynnika załamania światła fazy ruchomej. Dzieje się tak również w przypadku detekcji UV-vis, ale efekt ten jest zwykle osłabiany w stosunku do detekcji RI. W obu przypadkach ujemne piki można zminimalizować, ściślej dopasowując skład matrycy próbki do składu fazy ruchomej.
W części trzeciej, poświęconej podstawowemu tematowi rozwiązywania problemów LC, omówiłem sytuacje, w których obserwowany kształt piku różni się od oczekiwanego lub normalnego kształtu piku. Skuteczne rozwiązywanie takich problemów zaczyna się od znajomości oczekiwanych kształtów pików (na podstawie teorii lub wcześniejszego doświadczenia z istniejącymi metodami), więc odchylenia od tych oczekiwań są oczywiste. Problemy z kształtem piku mają wiele różnych potencjalnych przyczyn (zbyt szeroki, ogon, krawędź natarcia itp.). fotografowania, ale nie obejmuje wszystkich możliwości. Czytelnicy zainteresowani bardziej szczegółową listą przyczyn i rozwiązań mogą zapoznać się z tabelą ścienną LCGC „LC Troubleshooting Guide”.
(4) Schemat ścienny LCGC „LC Troubleshooting Guide”.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.