Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów na raz. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy na raz, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy na raz.
Samoorganizujące się organelle nerwowe stanowią obiecującą platformę in vitro do modelowania rozwoju i chorób człowieka. Jednak organoidy nie mają łączności, która istnieje in vivo, co ogranicza dojrzewanie i uniemożliwia integrację z innymi obwodami kontrolującymi zachowanie. Tutaj pokazujemy, że ludzkie organoidy korowe pochodzące z komórek macierzystych przeszczepione do kory somatosensorycznej noworodków szczurów nagich rozwijają dojrzałe typy komórek, które integrują się z obwodami sensorycznymi i motywacyjnymi. MRI ujawniło wzrost organoidów po przeszczepie w kilku liniach komórek macierzystych i u zwierząt, podczas gdy analiza pojedynczego rdzenia ujawniła postęp kortykogenezy i pojawienie się programu transkrypcji zależnego od aktywności. Rzeczywiście, przeszczepione neurony korowe wykazują bardziej złożone właściwości morfologiczne, synaptyczne i błony wewnętrznej niż ich odpowiedniki in vitro, co pozwala na wykrywanie defektów neuronalnych u pacjentów z zespołem Timothy'ego. Anatomiczne i funkcjonalne śledzenie wykazało, że przeszczepione organelle otrzymują bodźce wzgórzowo-korowe i korowo-korowe, a zapisy aktywności neuronowej in vivo sugerują, że bodźce te mogą generować reakcje sensoryczne w komórkach ludzkich. Wreszcie, organoidy korowe rozciągają aksony w całym mózgu szczura, a ich optogenetyczna aktywacja prowadzi do zachowań polegających na poszukiwaniu nagrody. W ten sposób przeszczepione neurony kory mózgowej człowieka dojrzewają i uczestniczą w obwodach gospodarza, które kontrolują zachowanie. Oczekujemy, że to podejście ułatwi wykrywanie fenotypów na poziomie pasma w komórkach pochodzących od pacjenta, których nie można wykryć innymi metodami.
Rozwijający się ludzki mózg to niezwykły proces samoorganizacji, w którym komórki proliferują, różnicują się, migrują i łączą się, tworząc funkcjonalne obwody neuronalne, które są dalej udoskonalane poprzez doświadczenie sensoryczne. Kluczowym problemem w zrozumieniu rozwoju ludzkiego mózgu, zwłaszcza w kontekście choroby, jest brak dostępu do tkanki mózgowej. Samoorganizujące się organelle, w tym ludzkie organoidy korowe (hCO; znane również jako sfera kory mózgowej), mogą generować 2, 3, 4, 5, 6. Jednak kilka ograniczeń ogranicza ich szersze zastosowanie do zrozumienia rozwoju i funkcjonowania obwodów neuronalnych. W szczególności nie jest jasne, czy dojrzewanie hCO jest ograniczone przez brak pewnych mikrośrodowiskowych i sensorycznych bodźców obecnych in vivo. Ponadto, ponieważ hCO nie są zintegrowane w obwody, które mogą generować wyniki behawioralne, ich użyteczność w modelowaniu genetycznie złożonych i behawioralnych zaburzeń neuropsychiatrycznych jest obecnie ograniczona.
Przeszczep hCO do nieuszkodzonego żywego mózgu może przezwyciężyć te ograniczenia. Poprzednie badania wykazały, że ludzkie neurony przeszczepione do kory mózgowej gryzoni są w stanie przetrwać, projektować i komunikować się z komórkami gryzoni7,8,9,10,11,12. Jednak te eksperymenty są zwykle przeprowadzane na dorosłych zwierzętach, co może ograniczać integrację synaptyczną i aksonalną. Tutaj opisujemy paradygmat transplantacji, w którym przeszczepiliśmy 3D hCO pochodzące z komórek hiPS do pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) szczurów z niedoborami odporności na wczesnym etapie rozwoju plastycznego. Przeszczepione neurony hCO (t-hCO) przechodzą znaczną dojrzałość, otrzymują bodźce wzgórzowo-korowe i korowo-korowe, które wywołują reakcje sensoryczne i rozszerzają projekcje aksonowe do mózgu szczura, aby napędzać zachowanie poszukiwania nagrody. Przedłużone dojrzewanie t-hCO ujawniło defekty neuronalne u pacjentów z zespołem Timothy'ego (TS), poważnym schorzeniem genetycznym spowodowanym mutacjami w kanale wapniowym typu L CaV1.2 wrażliwym na napięcie (kodowanym przez CACNA1C).
Aby zbadać ludzkie neurony korowe w obwodach in vivo, stereotaktycznie przeszczepiliśmy nienaruszone 3D hCO do S1 wczesnych postnatalnych szczurów atymicznych (dni 3-7 po urodzeniu) (Rys. 1a i rozszerzone dane z Rys. 1a-c). W tym momencie projekcje aksonów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych nie zakończyły jeszcze swojej inerwacji S1 (ref. 13). Zatem podejście to zostało zaprojektowane w celu maksymalizacji integracji t-hCO przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu na obwody endogenne. Aby zwizualizować lokalizację t-hCO u żywych zwierząt, przeprowadziliśmy rekonstrukcje mózgu szczurów metodą rezonansu magnetycznego ważonego T2 2-3 miesiące po przeszczepie (Rys. 1b i rozszerzone dane, Rys. 1d). t-hCO2 można było łatwo zaobserwować, a pomiary objętości t-hCO2 były podobne do tych obliczonych na podstawie stałych plastrów (rozszerzone dane, rys. 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 można było łatwo zaobserwować, a pomiary objętości t-hCO2 były podobne do tych obliczonych na podstawie stałych plastrów (rozszerzone dane, rys. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> (0,05). t-hCO2 można było łatwo zaobserwować, a pomiary objętościowe t-hCO2 były podobne do tych obliczonych dla przekrojów nieruchomych (rozszerzone dane, rys. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似(扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO było łatwe do zaobserwowania, a pomiary objętościowe t-hCO były podobne do tych obliczonych dla przekrojów stałych (rozszerzone dane, rys. 1d, e; P > 0,05).U 81% przeszczepionych zwierząt oznaczyliśmy t-hCO około 2 miesiące po przeszczepie (n = 72 zwierzęta; hCO z 10 linii komórkowych hiPS; linie komórkowe hiPS w Tabeli uzupełniającej 1). 87% z nich znajdowało się w korze mózgowej (Rys. 1c). Wykonując seryjne skany MRI w wielu punktach czasowych u tego samego przeszczepionego szczura, stwierdziliśmy dziewięciokrotny wzrost objętości t-hCO w ciągu 3 miesięcy (Rys. 1d i rozszerzone dane, Ryc. 1f). Przeszczepione zwierzęta miały wysoki wskaźnik przeżycia (74%) po 12 miesiącach od przeszczepu (rozszerzone dane, Ryc. 1g i Tabela uzupełniająca 2) i nie stwierdzono żadnych jawnych zaburzeń motorycznych lub pamięci, glejozy ani elektroencefalogramu (EEG). Dane Ryc. 1g i tabela uzupełniająca 2). 1h–m i 3e).
a, Schemat projektu eksperymentu. hCO pochodzące z komórek hiPS przeszczepiono do S1 nowonarodzonych szczurów nagich w 30-60 dniu różnicowania. b, T2-ważone koronalne i poziome obrazy MRI pokazujące t-hCO w S1 2 miesiące po przeszczepie. Skala, 2 mm. c, Kwantyfikacja wskaźników powodzenia przeszczepu przedstawiona dla każdej linii komórek hiPS (n = 108, liczby w paskach oznaczają ilość t-hCO na linię komórek hIPS) i lokalizacji korowej lub podkorowej (n = 88). d, Obraz MRI tętnicy wieńcowej (po lewej; skala, 3 mm) i odpowiadająca mu trójwymiarowa rekonstrukcja objętościowa (skala, 3 mm) pokazująca wzrost t-hCO w ciągu 3 miesięcy. e, Przegląd wzorców t-hCO w korze mózgowej szczura. Skala, 1 mm. f, Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne t-hCO pokazane od lewego górnego rogu do prawego (podczas różnicowania): PPP1R17 (4 miesiące), NeuN (8 miesięcy), SOX9 i GFAP (8 miesięcy), PDGFRα; (8 miesięcy), MAP2 (8 miesięcy) i IBA1 (8 miesięcy). Skala, 20 µm. Współekspresja HNA wskazuje na komórki pochodzenia ludzkiego. g, snRNA-seq: obrazowanie redukcji wymiarowości zunifikowanej rozmaitości i projekcji (UMAP) wszystkich wysokiej jakości jąder t-hCO po integracji Seurata (n=3 próbki t-hCO, n=2 linie komórkowe hiPS). Astrocyty, komórki linii astrocytów; cyc prog, krążące progenitory; GluN DL, głębokie neurony glutaminergiczne; GluN DL/SP, głębokie i podblaszkowe neurony glutaminergiczne; GluN UL, neurony glutaminergiczne warstwy górnej; oligodendrocyty, oligodendrocyty; OPC, komórki progenitorowe oligodendrocytów; RELN, neurony reeliny. h, analiza wzbogacenia terminów Gene Ontology (GO) genów znacząco nadregulowanych (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, wyrażone w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO. h, analiza wzbogacenia terminów Gene Ontology (GO) genów znacząco nadregulowanych (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, wyrażone w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, analiza wzbogacenia terminów Gene Ontology (GO) dla genów ze znaczną aktywacją (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, ekspresja w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu do neuronów glutaminergicznych hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调(调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) analyz термина обогащения. h, geny były znacząco nadregulowane (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, wyrażone w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO. Analiza ontologiczna (GO) terminu wzbogacenia.Linia przerywana wskazuje wartość aq równą 0,05. i, obrazowanie UMAP typów komórek GluN w t-hCO z wykorzystaniem transferu znaczników z referencyjnego zestawu danych snRNA-seq 22 dorosłych osobników kory ruchowej. CT — komórki korowo-wzgórzowe, ET — komórki zewnątrzmózgowe, IT — wewnętrzne komórki kresomózgowia, NP — projekcja bliska.
Następnie oceniliśmy cytoarchitekturę i ogólny skład komórkowy t-hCO. Barwienie przeciwciałami komórek śródbłonka szczura wykazało waskularyzację z t-hCO, podczas gdy barwienie IBA1 wykazało obecność mikrogleju szczura w całym przeszczepie (ryc. 1f i rozszerzone dane, ryc. 3c,d). Immunobarwienie wykazało komórki dodatnie pod względem ludzkiego antygenu jądrowego (HNA) współekspresujące PPP1R17 (progenitory korowe), NeuN (neurony), SOX9 i GFAP (komórki pochodzące z gleju) lub PDGFRα (progenitory oligodendrocytów) (ryc. 1f). Aby zbadać skład komórkowy t-hCO w rozdzielczości pojedynczej komórki, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie pojedynczego rdzenia RNA (snRNA-seq) po około 8 miesiącach różnicowania. Masowa filtracja i usuwanie jąder szczurzych dało 21 500 wysokiej jakości map mononuklearnych człowieka (ryc. 1g i rozszerzone dane, ryc. 4a,b). Wzory ekspresji typowych markerów typów komórek zidentyfikowały skupiska głównych klas komórek korowych, w tym głębokie i powierzchniowe neurony glutaminergiczne, krążące progenitory, oligodendrocyty i linię astrocytów (ryc. 1g, rozszerzone dane, ryc. 4c i tabela uzupełniająca 3). Immunobarwienie dla SATB2 i CTIP2 wykazało, że pomimo obecności podtypów korowych, t-hCO nie wykazywało wyraźnej anatomicznej stratyfikacji (rozszerzone dane, ryc. 3a). dopasowane etapowo snRNA-seq hCO wytworzyło zasadniczo podobne klasy komórek, z kilkoma wyjątkami, w tym brakiem oligodendrocytów i obecnością neuronów GABAergicznych, co może odzwierciedlać wcześniej zgłoszone korzystne warunki in vitro dla bocznych komórek progenitorowych15 (rozszerzone dane, ryc. 4f – i oraz tabela uzupełniająca 4). Analiza różnicowej ekspresji genów wykazała istotne różnice w neuronach glutaminergicznych między t-hCO i hCO (tabela uzupełniająca 5), ​​w tym aktywację zestawów genów związanych z dojrzewaniem neuronów, takich jak sygnalizacja synaptyczna, lokalizacja dendrytyczna i aktywność kanału bramkowanego napięciem (ryc. 1h i tabela uzupełniająca 5). tabela 6). Zgodnie z tym korowe neurony glutaminergiczne t-hCO wykazywały przyspieszone dojrzewanie transkrypcyjne.
Aby wyjaśnić, czy te zmiany transkrypcyjne w t-hCO były związane z różnicami morfologicznymi między hCO in vitro i t-hCO in vivo, zrekonstruowaliśmy dopasowane pod względem etapu hCO i hCO wypełnione biocytyną w ostrych przekrojach po 7–8 miesiącach różnicowania. neurony hCO (ryc. 2a). neurony t-hCO były znacznie większe, miały 1,5 raza większą średnicę somatyczną, dwa razy więcej dendrytów i ogólnie sześciokrotny wzrost całkowitej długości dendrytycznej w porównaniu z hCO in vitro (ryc. 2b). Ponadto zaobserwowaliśmy znacznie większą gęstość kolców dendrytycznych w neuronach t-hCO niż w neuronach hCO (ryc. 2c). Sugeruje to, że neurony t-hCO przechodzą rozległe wydłużanie i rozgałęzianie dendrytyczne, co w połączeniu z ciągłą proliferacją komórek może przyczyniać się do intensywnego wzrostu t-hCO po przeszczepie (ryc. 1d i rozszerzone dane ryc. 1f). Skłoniło nas to do zbadania właściwości elektrofizjologicznych. Pojemność błony była osiem razy większa (rozszerzone dane, rys. 8d), potencjał błony w stanie spoczynku był bardziej hiperpolaryzowany (około 20 mV), a wstrzyknięcie prądu wywołało wyższą maksymalną szybkość wzbudzenia w neuronach t-hCO niż w neuronach hCO. in vitro (rys. 2d), e), co jest zgodne z większymi i bardziej złożonymi cechami morfologicznymi t-hCO. Ponadto częstość spontanicznych pobudzających zdarzeń prądowych postsynaptycznych (EPSC) była istotnie wyższa w neuronach t-hCO (rys. 2f), co sugeruje, że zwiększona gęstość kolców dendrytycznych obserwowana w neuronach t-hCO była związana z pobudliwością funkcjonalną. synapsa seksualna. Potwierdziliśmy niedojrzały charakter neuronów hCO in vitro poprzez rejestrowanie znakowanych neuronów glutaminergicznych (rozszerzone dane, rys. 6a-c).
a, trójwymiarowa rekonstrukcja neuronów hCO i t-hCO wypełnionych biocytyną po 8 miesiącach różnicowania. b, Kwantyfikacja cech morfologicznych (n = 8 neuronów hCO, n = 6 neuronów t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, Kwantyfikacja cech morfologicznych (n = 8 neuronów hCO, n = 6 neuronów t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, ilościowa ocena cech morfologicznych (n=8 neuronów hCO, n=6 neuronów t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, ilościowa ocena cech morfologicznych (n=8 neuronów hCO, n=6 neuronów t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001).c, rekonstrukcja 3D gałęzi dendrytycznych hCO i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania. Czerwone gwiazdki oznaczają domniemane kolce dendrytyczne. Kwantyfikacja gęstości kolców dendrytycznych (n = 8 neuronów hCO, n = 6 neuronów t-hCO; **P = 0,0092). d, Kwantyfikacja potencjału błonowego w stanie spoczynku (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). d, Kwantyfikacja potencjału błonowego w stanie spoczynku (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ilościowe określenie potencjału błonowego w stanie spoczynku (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ilościowe określenie potencjału błonowego w stanie spoczynku (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). e, Powtarzające się wyładowania potencjału czynnościowego w hCO i t-hCO wywołane wzrastającymi wstrzyknięciami prądu oraz ilościowe określenie maksymalnej częstotliwości wyładowań (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). e, Powtarzające się wyładowania potencjału czynnościowego w hCO i t-hCO wywołane wzrastającymi wstrzyknięciami prądu oraz ilościowe określenie maksymalnej częstotliwości wyładowań (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO i t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ponowne wyładowanie potencjału czynnościowego w hCO i t-hCO wywołane wzrostem natężenia prądu i ilościowe określenie maksymalnej częstotliwości wyładowań (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化(n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO i t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и kolistyka оценная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, powtarzające się wyładowania potencjałów czynnościowych hCO i t-hCO wywołane zwiększonym dostarczaniem prądu i ilościowe określenie maksymalnej częstotliwości wyładowań (n = 25 neuronów hCO, n = 16 neuronów t-hCO; *** P < 0,0001). f, Spontaniczne EPSC (sEPSC) w neuronach hCO i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania oraz ilościowe określenie częstości zdarzeń synaptycznych (n = 25 neuronów hCO, n = 17 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). f, Spontaniczne EPSC (sEPSC) w neuronach hCO i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania oraz ilościowe określenie częstości zdarzeń synaptycznych (n = 25 neuronów hCO, n = 17 neuronów t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) w нейронах hCO i t-hCO через 8 miesięcy дифференцировки i количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 nieйронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontaniczne EPSC (sEPSC) w neuronach hCO i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania i kwantyfikacji częstości zdarzeń synaptycznych (n = 25 neuronów hCO, n = 17 neuronów t-hCO; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元,n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼(n = 25 hCO 神率的量匼(n = 25hCO P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) w нейронах hCO i t-hCO через 8 miesięcy дифференцировки i количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 nieйронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontaniczne EPSC (sEPSC) w neuronach hCO i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania i kwantyfikacji częstości zdarzeń synaptycznych (n = 25 neuronów hCO, n = 17 neuronów t-hCO; *** P<0,0001).W przypadku bf, hCO i t-hCO w linii 1208-2 pobrano z tej samej partii różnicowej prowadzonej równolegle. g, Analiza wzbogacenia zestawu genów (jednostronny dokładny test Fishera) genów istotnie nadregulowanych (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, wyrażone w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO z zestawami genów zależnych od aktywności zarówno wczesnej odpowiedzi (ERG), jak i późnej odpowiedzi (LRG) zidentyfikowanymi w badaniu na myszach in vivo16 oraz specyficznymi dla człowieka LRG z neuronów in vitro17. g, Analiza wzbogacenia zestawu genów (jednostronny dokładny test Fishera) genów istotnie nadregulowanych (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, wyrażone w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO z zestawami genów zależnych od aktywności zarówno wczesnej odpowiedzi (ERG), jak i późnej odpowiedzi (LRG) zidentyfikowanymi w badaniu na myszach in vivo16 oraz specyficznymi dla człowieka LRG z neuronów in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной aktiвацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах w vivo16, i специфических для человека LRG i нейронов in vitro17. g, analiza wzbogacenia zestawu genów (jednostronny dokładny test Fishera) genów ze znaczną aktywacją (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, ekspresja w co najmniej 10% jąder) w neuronach glutaminergicznych t-hCO w porównaniu z zestawami neuronów glutaminergicznych hCO zarówno wczesnych (ERG), jak i późnych (LRG) genów zależnych od aktywności zidentyfikowanych u myszy in vivo16 oraz specyficznych dla człowieka LRG z neuronów in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调(调整后P<0,05),倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный test Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 i нейронах in in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, neurony glutaminergiczne t-hCO były znacząco nadregulowane w porównaniu z neuronami glutaminergicznymi hCO (skorygowane P < 0,05, zmiana krotności > 2, co najmniej 10% Analiza wzbogacenia genów wczesnej odpowiedzi (ERG) i późnej odpowiedzi (jednostronny dokładny test Fishera) geny zależne od aktywności odpowiedzi (LRG) zidentyfikowane w neuronach in vivo myszy16 i in vitro.17 LRG specyficzne dla człowieka.Linia przerywana wskazuje skorygowaną metodą Bonferroniego wartość P wynoszącą 0,05. h, ekspresja genu GluN (pseudo-pakiet i skalowanie każdego genu) była istotnie zwiększona w replikach snRNA-seq genów LRG w neuronach glutaminergicznych t-hCO. i, immunobarwienie pokazujące ekspresję SCG2 w neuronach t-hCO (góra) i hCO (dół). Białe strzałki wskazują na komórki SCG2+. Skala, 25 µm. Dane wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe.
Na podstawie zwiększonej aktywności t-hCO obserwowanej w plasterkach ex vivo, snRNA-seq ujawniło zależną od aktywności regulację w górę transkryptów genów w t-hCO w porównaniu z hCO in vitro. Glutaminergiczne neurony t-hCO wyrażały wyższe poziomy genów regulujących późną aktywność odpowiedzi (ryc. 2g,h), które stwierdzono w poprzednich badaniach na neuronach myszy i ludzi16,17. Na przykład BDNF18, SCG2 i OSTN, gen regulujący aktywność specyficzny dla naczelnych, wykazały zwiększoną ekspresję w neuronach t-hCO w porównaniu z neuronami hCO (ryc. 2g-i). Tak więc neurony t-hCO wykazywały zwiększone cechy dojrzewania w porównaniu z neuronami hCO w analizach transkrypcyjnych, morfologicznych i funkcjonalnych.
Aby dalej ocenić związek dojrzewania t-hCO z rozwojem mózgu człowieka, przeprowadziliśmy porównania transkryptomowe płodowych i dorosłych typów komórek korowych19,20 i dorosłych21,22, a także obszerne dane dotyczące ekspresji genów korowych23 w trakcie rozwoju (rozszerzone dane, ryc. 5). ). z poprzednimi pracami24, globalny status dojrzewania transkryptomu hCO i t-hCO w 7–8 miesiącu różnicowania jest w dużej mierze zgodny z czasem rozwoju in vivo i jest najbardziej równoważny późnemu życiu płodowemu (rozszerzone dane, ryc. 5a). Co godne uwagi, zaobserwowaliśmy zwiększoną dojrzałość transkryptomu w t-hCO w porównaniu z hCO w tym samym wieku, a także aktywację transkryptomu związaną z synaptogenezą, astrogenezą i mielinizacją (rozszerzone dane, ryc. 5b-d). Na poziomie komórkowym znaleźliśmy dowody na cieńszy podtyp kory w t-hCO, z klastrami neuronów glutaminergicznych nakładającymi się z dorosłymi podtypami neuronów L2/3, L5 i L6 (Rysunek 1i). Natomiast nakładanie się klastrów między neuronami glutaminergicznymi t-hCO i neuronami kory płodowej było bardziej ograniczone w połowie ciąży (rozszerzone dane, Rysunek 5e-j). Aby ustalić, czy neurony t-hCO są funkcjonalnie podobne do ludzkich neuronów neokorowych po urodzeniu, przeprowadziliśmy zapisy elektrofizjologiczne i rekonstrukcje anatomiczne ludzkich neuronów piramidowych L2/3 w ostrych przekrojach ludzkiej kory postnatalnej (rozszerzone dane, Rysunek 7a). Właściwości elektrofizjologiczne neuronów piramidowych L2/3 były podobne do właściwości neuronów piramidowych t-hCO (rozszerzone dane, Rysunek 7e). Morfologicznie neurony L2/3 z próbek ludzkich pobranych po urodzeniu były bardziej podobne do t-hCO niż do hCO, chociaż komórki L2/3 były dłuższe, zawierały łącznie więcej rozgałęzień i miały większą gęstość kolców (ryc. 3g i rozszerzone dane, ryc. 7b-). G).
a, transplantacja hCO wytworzonego przez linie komórkowe hiPS kontrolne i TS do noworodków szczurów. b, trójwymiarowa rekonstrukcja neuronów t-hCO wypełnionych biocytyną po 8 miesiącach różnicowania. c, ilościowe określenie średniej długości dendrytów (n = 19 neuronów kontrolnych, n = 21 neuronów TS; **P = 0,0041). d, trójwymiarowa rekonstrukcja gałęzi dendrytycznych z kontroli i TS t-hCO po 8 miesiącach różnicowania oraz ilościowe określenie gęstości kolców dendrytycznych (n = 16 neuronów kontrolnych, n = 21 neuronów TS, ***P < 0,0001). d, trójwymiarowa rekonstrukcja gałęzi dendrytycznych z kontroli i TS t-hCO po 8 miesiącach różnicowania oraz ilościowe określenie gęstości kolców dendrytycznych (n = 16 neuronów kontrolnych, n = 21 neuronów TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля i TS t-hCO через 8 miesięcy дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, trójwymiarowa rekonstrukcja gałęzi dendrytycznych z TS kontrolnego i t-hCO po 8 miesiącach różnicowania i ilościowego określenia gęstości kolców dendrytycznych (n = 16 neuronów kontrolnych, n = 21 neuronów TS, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля i TS t-hCO через 8 miesięcy dla диференцировки i количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, trójwymiarowa rekonstrukcja kontrolnych gałęzi dendrytycznych i TS t-hCO po 8 miesiącach różnicowania i ilościowego określenia gęstości kolców dendrytycznych (n=16 neuronów kontrolnych, n=21 neuronów TS, ***P<0,0001).Czerwone gwiazdki oznaczają domniemane kolce dendrytyczne. e, spontaniczne EPSC w neuronach kontrolnych i TS t-hCO po 8 miesiącach różnicowania. f, wykres skumulowanej częstotliwości i kwantyfikacja częstotliwości i amplitudy zdarzeń synaptycznych (n=32 neurony kontrolne, n=26 neuronów TS; **P=0,0076 i P=0,8102). g, analiza Scholl neuronów TS i kontrolnych w hCO i t-hCO. Linie przerywane pokazują ludzkie neurony piramidowe L2/3 po urodzeniu w celach porównawczych (n = 24 neurony kontrolne t-hCO, n = 21 neuronów TS t-hCO, n = 8 neuronów kontrolnych hCO i n = 7 neuronów TS hCO). Dane wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe
Zdolność t-hCO do replikacji cech morfologicznych i funkcjonalnych neuronów kory mózgowej człowieka na wysokim poziomie skłoniła nas do zbadania, czy t-hCO może być użyte do wykrywania fenotypów choroby. Skupiliśmy się na TS, poważnym zaburzeniu neurorozwojowym spowodowanym mutacjami typu gain-of-function w genie kodującym CaV1.2, który inicjuje zależną od aktywności transkrypcję genu w neuronach. Uzyskaliśmy hCO od trzech pacjentów z TS noszących najczęstszą substytucję (p.G406R) i trzech kontroli (ryc. 3a). Po przeszczepie odkryliśmy, że morfologia dendrytyczna została zmieniona w neuronach TS w porównaniu z kontrolami (ryc. 3b i rozszerzone dane, ryc. 8a,b), z dwukrotnym wzrostem liczby dendrytów pierwotnych i ogólnym wzrostem średniej i ogólnym spadkiem długości dendrytycznej (ryc. 3c i rozszerzone dane, ryc. 8c). Było to związane ze zwiększoną gęstością kolców i zwiększoną częstością spontanicznych EPSC w TS w porównaniu z neuronami kontrolnymi (ryc. 3d–f i rozszerzone dane, ryc. 8g). Dalsza analiza ujawniła wzorce nieprawidłowego rozgałęzienia dendrytycznego w t-hCO TS w porównaniu z kontrolami, ale nie w in vitro TS hCO na podobnym etapie różnicowania (ryc. 3g). Jest to zgodne z naszymi poprzednimi raportami dotyczącymi zależnego od aktywności kurczenia się dendrytycznego w TS i podkreśla zdolność tej platformy przeszczepu do wykrywania fenotypów choroby in vivo.
Następnie zapytaliśmy, w jakim stopniu komórki t-hCO są funkcjonalnie zintegrowane z S1 szczura. S1 u gryzoni otrzymuje silne sygnały synaptyczne z ipsilateralnych jąder podstawy brzusznej i jąder wzgórza tylnego, a także z ipsilateralnej kory ruchowej i wtórnej kory czuciowo-somatycznej oraz kontralateralnego S1 (ryc. 4a). Aby przywrócić wzór unerwienia, zainfekowaliśmy hCO wirusem wścieklizny-dG-GFP/AAV-G i przeszczepiliśmy hCO do szczura S1 3 dni później. Obserwowaliśmy gęstą ekspresję GFP w neuronach ipsilateralnego S1 i brzusznych zwojów podstawy 7–14 dni po przeszczepie (ryc. 4b, c). Ponadto barwienie przeciwciałami markera wzgórzowego netryny G1 wykazało obecność zakończeń wzgórzowych w t-hCO (ryc. 4d, e). Aby ocenić, czy te projekcje aferentne mogą wywołać reakcje synaptyczne w komórkach t-hCO, przeprowadziliśmy rejestracje całych komórek z komórek ludzkich w ostrych przekrojach warstwy wzgórzowo-korowej. Elektryczna stymulacja szczurzego S1, torebki wewnętrznej, istoty białej, włókien w pobliżu t-hCO lub optogenetyczna aktywacja zakończeń wzgórzowych ekspresujących opsynę w t-hCO indukowała EPSC o krótkim czasie latencji w neuronach t-hCO wystawionych na działanie antagonisty receptora AMPA NBQX. (Ryc. 4f, g i rozszerzone dane, Ryc. 9a–g). Dane te pokazują, że t-hCO jest anatomicznie zintegrowane z mózgiem szczura i może być aktywowane przez tkankę gospodarza szczura.
a, Schematyczny diagram eksperymentu śledzenia wścieklizny. b, Ekspresja GFP i swoistego dla człowieka STEM121 pomiędzy t-hCO i korą mózgową szczura (górny panel). Pokazano również ekspresję GFP w ipsilateralnym brzusznym jądrze podstawnym (VB) szczura (lewy dolny róg) i ipsilateralnym S1 (prawy dolny róg). Skala, 50 µm. Czerwone kwadraty oznaczają obszary mózgu, w których wykonano zdjęcia. c, kwantyfikacja komórek wyrażających GFP (n = 4 szczury). d, e — terminale wzgórzowe netryny G1+ w t-hCO. d przedstawia przekrój wieńcowy zawierający jądra t-hCO i VB. Skala, 2 mm. e przedstawia ekspresję netryny G1 i STEM121 w neuronach t-hCO (lewy) i VB (prawy). Skala, 50 µm. Pomarańczowa linia przerywana wskazuje granicę t-hCO. f, g, Aktualne ślady neuronów t-hCO po stymulacji elektrycznej u szczura S1 (f) lub wewnętrznej torebki (g), z (fioletowy) lub bez (czarny) NBQX (po lewej). Amplitudy EPSC z i bez NBQX (n = 6 neuronów S1, *P = 0,0119; i n = 6 neuronów wewnętrznej torebki, **P = 0,0022) (środek). Procent neuronów t-hCO wykazujących EPSC w odpowiedzi na stymulację elektryczną szczura S1 (f) lub wewnętrznej torebki (g) (po prawej). aCSF, sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy. h, schematyczny diagram eksperymentu obrazowania 2P (po lewej). Ekspresja GCaMP6s w t-hCO (środek). Skala, 100 µm. Upływ czasu fluorescencji GCaMP6s (po prawej). i, wynik Z spontanicznej fluorescencji aktywności. j, schematyczna ilustracja stymulacji wąsami. k, trajektorie fluorescencji 2P z punktacją z w jednym badaniu, wyrównane z odchyleniem wąsów w czasie zerowym (linia przerywana) w przykładowych komórkach. l, uśrednione dla populacji odpowiedzi z-score wszystkich komórek wyrównane z odchyleniem wąsów w czasie zerowym (linia przerywana) (czerwony) lub losowo wygenerowanymi znacznikami czasu (szary). m. Schematyczny diagram eksperymentu na znakowaniu optycznym. n, surowe krzywe napięcia z przykładowej komórki t-hCO podczas stymulacji niebieskim laserem lub odchylenia wąsów. Czerwone strzałki wskazują pierwsze piki spowodowane światłem (góra) lub spowodowane odchyleniem wąsów (dół). Szare cieniowanie wskazuje okresy odchylenia wąsów. o, szczytowe przebiegi światła i odpowiedzi odchylenia wąsów. p, piki pojedynczej próby, wyrównane z odchyleniem wąsów w komórkach przykładu. 0 wskazuje odchylenie wąsów (linia przerywana). q, uśredniona w populacji częstość wyzwalania wyniku z dla wszystkich komórek światłoczułych, wyrównana z odchyleniem wibrysów w czasie zerowym (linia przerywana) (czerwony) lub losowo generowanymi znacznikami czasu (szary). r, odsetek jednostek światłoczułych istotnie modulowanych przez odchylenie wibrysów (n = 3 szczury) (po lewej). Maksymalne opóźnienie wyniku z (n = 3 szczury; n = 5 (jasnozielony), n = 4 (ciemnozielony) i n = 4 (cyjan) jednostek modulacji odchylenia wibrysów na szczura) (po prawej). Dane wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe
Następnie zapytaliśmy, czy t-hCO może być aktywowane przez bodźce sensoryczne in vivo. Przeszczepiliśmy hCO wyrażające genetycznie kodowane wskaźniki wapnia GCaMP6 szczurom S1. Po 150 dniach wykonaliśmy fotometrię włókien lub dwufotonowe obrazowanie wapnia (ryc. 4h i rozszerzone dane, ryc. 10a). Odkryliśmy, że komórki t-hCO wykazywały zsynchronizowaną aktywność rytmiczną (ryc. 4i, rozszerzone dane, ryc. 10b i film uzupełniający 1). Aby scharakteryzować szczytową aktywność t-hCO, wykonaliśmy pozakomórkowe zapisy elektrofizjologiczne u znieczulonych szczurów po przeszczepie (rozszerzone dane, ryc. 10c-f). Wygenerowaliśmy współrzędne stereotaktyczne z obrazów MRI; zatem te zarejestrowane jednostki reprezentują domniemane neurony ludzkie, chociaż sama elektrofizjologia nie pozwala na określenie gatunku pochodzenia. Zaobserwowaliśmy zsynchronizowane serie aktywności (rozszerzone dane, ryc. 10d). Wybuchy trwały około 460 ms i były rozdzielone okresami ciszy trwającymi około 2 s (rozszerzone dane, rys. 10d, e). Poszczególne jednostki wystrzeliły średnio około trzech pocisków na wybuch, co stanowi około 73% zarejestrowanych jednostek na wybuch. Aktywności poszczególnych jednostek były silnie skorelowane, a korelacje te były wyższe niż w przypadku jednostek zidentyfikowanych u niezaszczepionych zwierząt zarejestrowanych w tych samych warunkach (rozszerzone dane, rys. 10f). Aby lepiej scharakteryzować odpowiedzi kolców zidentyfikowanych neuronów pochodzących od człowieka, przeprowadziliśmy eksperymenty znakowania światłem na znieczulonych szczurach, którym przeszczepiono hCO ekspresujące wrażliwy na światło kanał kationowy rodopsyny 2 (hChR2), przez który neurony t-hCO rozpoznają krótkie opóźnienie (mniej niż 10 ms) w odpowiedzi na niebieskie bodźce świetlne (rys. 4m–o). Neurony t-hCO wykazywały wybuchy spontanicznej aktywności o częstotliwościach podobnych do tych obserwowanych w obrazowaniu wapnia, jak również w zapisach elektrofizjologicznych wykonanych w t-hCO bez znakowania światłem (rozszerzone dane, rys. 10c-g). Nie zaobserwowano żadnej spontanicznej aktywności w odpowiadających im stadiach hCO rejestrowanych in vitro. Aby ocenić, czy t-hCO może zostać aktywowane przez bodźce sensoryczne, na krótko odchyliliśmy wibrysy szczura od t-hCO (rys. 4j,m i rozszerzone dane, rys. 10h,k). Zgodnie z poprzednimi badaniami8,10, podzbiór komórek t-hCO wykazywał zwiększoną aktywność w odpowiedzi na odchylenie wibrysów, czego nie zaobserwowano, gdy dane porównano z losowymi znacznikami czasu (rys. 4k–q i rozszerzone dane, rys. 10h–q). Rzeczywiście, około 54% pojedynczych jednostek znakowanych optoelektronicznie wykazywało znacząco zwiększoną częstość pobudzenia po stymulacji wibrysami, osiągając szczyt około 650 ms (rys. 4r). Łącznie dane te wskazują, że t-hCO otrzymuje odpowiednie bodźce funkcjonalne i może być aktywowany przez bodźce środowiskowe.
Następnie zbadaliśmy, czy t-hCO może aktywować obwody u szczurów w celu kontrolowania zachowania. Najpierw zbadaliśmy, czy aksony neuronów t-hCO rzutują do otaczających tkanek szczura. Zainfekowaliśmy hCO lentiwirusem kodującym hChR2 połączonym z EYFP (hChR2-EYFP). Po 110 dniach zaobserwowaliśmy ekspresję EYFP w ipsilateralnych obszarach korowych, w tym w korze słuchowej, ruchowej i somatosensorycznej, a także w obszarach podkorowych, w tym w prążkowiu, hipokampie i wzgórzu (ryc. 5a). Aby ocenić, czy te projekcje eferentne mogą wywołać reakcje synaptyczne w komórkach szczura, optycznie aktywowaliśmy komórki t-hCO ekspresujące hChR2-EYFP, rejestrując komórki kory mózgowej szczura w ostrych przekrojach mózgu. Aktywacja aksonów t-hCO niebieskim światłem indukowała krótko-latencyjne EPSC w neuronach kory piramidowej szczura, które zostały zablokowane przez NBQX (ryc. 5b–g). Ponadto, te odpowiedzi mogły zostać zablokowane przez tetrodotoksynę (TTX) i przywrócone przez 4-aminopirydynę (4-AP), co sugeruje, że były one spowodowane przez połączenia monosynaptyczne (ryc. 5e).
a, Schematyczny diagram śledzenia aksonu (po lewej). Ekspresja t-hCO EYFP (po prawej). Skala, 100 µm. A1, kora słuchowa, ACC, przednia kora zakrętu obręczy, d. prążkowie, prążkowie grzbietowe, HPC, hipokamp; przepona, przegroda boczna, mPFC, przyśrodkowa kora przedczołowa, kość piri, kora gruszkowata, v. prążkowie, prążkowie brzuszne, VPM, jądro brzuszno-pośrodkowo-wzgórzowe, VTA, brzuszna okolica nakrywki. Czerwone kwadraty oznaczają obszary mózgu, w których wykonano zdjęcia. b, Schematyczny diagram eksperymentu stymulacyjnego. c, d, Przykłady reakcji fotoprądu indukowanego niebieskim światłem (góra) i napięcia (dół) w komórkach t-hCO człowieka (c) EYFP+ lub szczura (d) EYFP-. e, f, Aktualne ślady neuronów szczura po stymulacji aksonów t-hCO niebieskim światłem za pomocą TTX i 4-AR (zielony), TTX (szary) lub aCSF (czarny) (e), z (fioletowy) lub bez (czarny) ) ) NBQX (e). np. opóźnienie reakcji wywołanych niebieskim światłem w komórkach szczura (n = 16 komórek); poziome paski wskazują średnie opóźnienie (7,13 ms) (po lewej). Amplituda EPSC wywołanych światłem zarejestrowanych z NBQX lub bez niego (n = 7 komórek; ***P < 0,0001) (środek). Amplituda EPSC wywołanych światłem zarejestrowanych z NBQX lub bez niego (n = 7 komórek; ***P < 0,0001) (środek). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplituda EPSC indukowanych światłem zarejestrowanych z NBQX lub bez niego (n = 7 komórek; ***P < 0,0001) (środek).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅(n = 7 个细胞；***P < 0,0001）(中)。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅(n = 7 个细胞；***P < 0,0001）(中)。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplituda EPSC indukowanych światłem zarejestrowanych z NBQX lub bez niego (n = 7 komórek; ***P < 0,0001) (środek).Procent komórek szczura wykazujących EPSC reagujące na niebieskie światło (po prawej). h, Schematyczny diagram zadania behawioralnego. d0, dzień 0. i. Wydajność przykładowych zwierząt w 1. (po lewej) lub 15. (po prawej) dniu szkolenia. Średnia liczba liźnięć wykonanych w dniu 1 (po lewej) lub dniu 15 (po prawej w środku) (n = 150 prób ze światłem niebieskim, n = 150 prób ze światłem czerwonym; ***P < 0,0001). Średnia liczba liźnięć wykonanych w dniu 1 (po lewej) lub dniu 15 (po prawej w środku) (n = 150 prób ze światłem niebieskim, n = 150 prób ze światłem czerwonym; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Średnia liczba lizaków wykonanych w dniu 1. (po lewej) lub dniu 15. (środek po prawej) (n = 150 prób ze światłem niebieskim, n = 150 prób ze światłem czerwonym; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验;***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Średnia liczba lizaków wykonanych w dniu 1. (po lewej) lub dniu 15. (środek po prawej) (n = 150 prób ze światłem niebieskim, n = 150 prób ze światłem czerwonym; ***P < 0,0001).Skumulowane lizania podczas prób ze światłem czerwonym i niebieskim w dniu 1. (środek z lewej) lub dniu 15. (po prawej). NS, nieistotne statystycznie. j, k, Charakterystyka behawioralna wszystkich zwierząt, którym przeszczepiono t-hCO ekspresujące hChR2-EYFP (j) lub kontrolny fluorofor (k) w dniu 1. lub 15. (hChR2-EYFP: n = 9 szczurów, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Ewolucja wyniku preferencji (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Ewolucja wyniku preferencji (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ewolucja wyniku preferencji (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ewolucja wyników preferencji (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, Ekspresja FOS w odpowiedzi na optogenetyczną aktywację t-hCO w S1. Pokazano obrazy ekspresji FOS (po lewej) i kwantyfikację (n = 3 na grupę; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (po prawej). Pokazano obrazy ekspresji FOS (po lewej) i kwantyfikację (n = 3 na grupę; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (po prawej). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Pokazano obrazy ekspresji FOS (po lewej) i kwantyfikację (n = 3 w każdej grupie; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (po prawej).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Pokazano obrazy ekspresji FOS (po lewej) i kwantyfikację (n = 3 w każdej grupie; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (po prawej).Skala, 100 µm. Dane wyrażono jako średnia ± błąd standardowy BLA, migdałka boczno-podstawnego, MDT, jądra wzgórza grzbietowo-przyśrodkowego, PAG, szarej okołowodociągowej.
Na koniec zapytaliśmy, czy t-hCO może modulować zachowanie szczura. Aby to sprawdzić, przeszczepiliśmy hCO wyrażające hChR2-EYFP do S1, a 90 dni później wszczepiliśmy włókna optyczne do t-hCO w celu dostarczania światła. Następnie wytrenowaliśmy szczury za pomocą zmodyfikowanego paradygmatu warunkowania instrumentalnego (rys. 5h). Umieściliśmy zwierzęta w komorze testowej behawioralnej i losowo zastosowaliśmy 5-sekundowe niebieskie (473 nm) i czerwone (635 nm) bodźce laserowe. Zwierzęta otrzymywały nagrodę w postaci wody, jeśli lizały podczas stymulacji światłem niebieskim, ale nie lizały podczas stymulacji światłem czerwonym. Pierwszego dnia treningu zwierzęta nie wykazywały różnicy w lizaniu po stymulacji światłem niebieskim lub czerwonym. Jednak 15. dnia zwierzęta przeszczepione hCO wyrażające hChR2-EYFP wykazywały bardziej aktywne lizanie po stymulacji światłem niebieskim w porównaniu ze stymulacją światłem czerwonym. Te zmiany w zachowaniu lizania nie były obserwowane u zwierząt kontrolnych, którym przeszczepiono hCO wyrażające kontrolny fluorofor (wskaźnik powodzenia uczenia się: hChR2 89%, EYFP 0%, Rycina 5i-1 i Film uzupełniający 2). Dane te sugerują, że komórki t-hCO mogą aktywować neurony szczura, aby stymulować zachowanie poszukiwania nagrody. Aby dowiedzieć się, które obwody neuronowe szczura t-hCO mogą być zaangażowane w te zmiany behawioralne, wykonaliśmy optogenetyczną aktywację t-hCO u wyszkolonych zwierząt i pobraliśmy tkanki 90 minut później. Immunohistochemia ujawniła ekspresję zależnego od aktywności białka FOS w kilku obszarach mózgu zaangażowanych w zachowanie motywowane, w tym w przyśrodkowej korze przedczołowej, przyśrodkowym wzgórzu i istocie szarej okołowodociągowej, która była wyrażana u niestymulowanych zwierząt kontrolnych lub u zwierząt. rice. 5m). Łącznie dane te sugerują, że t-hCO może modulować aktywność neuronów szczura, aby napędzać zachowanie.
Organoidy neuronowe stanowią obiecujący system do badania rozwoju człowieka i chorób in vitro, ale są ograniczone przez brak połączeń między obwodami, które istnieją in vivo. Opracowaliśmy nową platformę, w której przeszczepiliśmy hCO do S1 u szczurów z niedoborem odporności we wczesnym okresie poporodowym, aby zbadać rozwój i funkcję komórek ludzkich in vivo. Wykazaliśmy, że t-hCO rozwija dojrzałe typy komórek, których nie zaobserwowano in vitro28 i że t-hCO jest anatomicznie i funkcjonalnie zintegrowane z mózgiem gryzoni. Integracja t-hCO z obwodami neuronowymi gryzoni pozwoliła nam ustalić powiązanie między aktywnością komórkową człowieka a badanym zachowaniem zwierzęcia, pokazując, że neurony t-hCO mogą modulować aktywność neuronalną szczura, aby wywołać reakcje behawioralne.
Platforma, którą opisujemy, ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi badaniami nad przeszczepianiem ludzkich komórek do mózgów gryzoni. Po pierwsze, przeszczepiliśmy hCO do rozwijającej się kory mózgowej wczesnych szczurów postnatalnych, co może ułatwić integrację anatomiczną i funkcjonalną. Po drugie, monitorowanie t-hCO MRI pozwoliło nam zbadać położenie przeszczepu i wzrost u żywych zwierząt, co pozwoliło nam przeprowadzić długoterminowe badania na wielu zwierzętach i ustalić niezawodność kilku linii komórkowych hiPS. Na koniec, przeszczepiliśmy nienaruszone organoidy, a nie izolowane zawiesiny pojedynczych komórek, które są mniej destrukcyjne dla komórek ludzkich i mogą promować integrację i generację neuronów kory mózgowej człowieka w mózgach szczurów.
Uznajemy, że pomimo postępów w tej platformie, ograniczenia czasowe, przestrzenne i międzygatunkowe uniemożliwiają tworzenie ludzkich obwodów neuronowych o wysokiej wierności, nawet po przeszczepie na wczesnym etapie rozwoju. Na przykład nie jest jasne, czy spontaniczna aktywność obserwowana w t-hCO reprezentuje fenotyp rozwojowy podobny do rytmicznej aktywności obserwowanej podczas rozwoju kory mózgowej, czy też jest spowodowana brakiem supresyjnych typów komórek obecnych w t-hCO. Podobnie nie jest jasne, w jakim stopniu brak laminacji w t-hCO wpływa na łączność łańcuchową30. Przyszłe prace będą koncentrować się na integracji innych typów komórek, takich jak ludzkie mikrogleje, ludzkie komórki śródbłonka i różne proporcje interneuronów GABAergicznych, jak pokazano przy użyciu assembly 6 in vitro, a także na zrozumieniu, w jaki sposób integracja neuronalna i przetwarzanie mogą zachodzić w zmienionych poziomach transkrypcyjnych, synaptycznych i behawioralnych t-hCO w komórkach uzyskanych od pacjentów.
Ogólnie rzecz biorąc, ta platforma in vivo stanowi potężne źródło, które może uzupełniać rozwój ludzkiego mózgu in vitro i badania nad chorobami. Przewidujemy, że ta platforma pozwoli nam odkryć nowe fenotypy na poziomie pasma w inaczej nieuchwytnych komórkach pochodzących od pacjentów i przetestować nowe strategie terapeutyczne.
Wygenerowaliśmy hCO2,5 z komórek HiPS, jak opisano wcześniej. Aby zainicjować produkcję hCO z komórek hiPS hodowanych na warstwach podtrzymujących, nienaruszone kolonie komórek hiPS usunięto z naczyń hodowlanych za pomocą dyspazy (0,35 mg/ml) i przeniesiono do hodowli plastikowych o bardzo niskim przyleganiu, zawierających naczynia z podłożem do hodowli komórek hiPS. (Corning) uzupełnionym o dwa inhibitory SMAD: dorsomorfinę (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) oraz inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Podczas pierwszych 5 dni podłoże komórek hiPS zmieniano codziennie i dodawano dorsomorfinę i SB-431542. Szóstego dnia w zawieszeniu, sferoidy neuronalne przeniesiono do medium neuronalnego zawierającego neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 bez witaminy A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicylinę i streptomycynę (1:100, Life Technologies) i uzupełniono o czynnik wzrostu naskórka (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do dnia 24. Od dnia 25 do dnia 42, medium uzupełniano o neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinę 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), zmieniając medium co drugi dzień. Szóstego dnia w zawieszeniu, sferoidy neuronalne przeniesiono do medium neuronalnego zawierającego neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 bez witaminy A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicylinę i streptomycynę (1:100, Life Technologies) i uzupełniono o czynnik wzrostu naskórka (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do dnia 24. Od dnia 25 do dnia 42, medium uzupełniano o neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinę 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), zmieniając medium co drugi dzień.Szóstego dnia w zawieszeniu sferoidy neuronalne przeniesiono do medium neuronalnego zawierającego Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 bez witaminy A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) i penicylinę.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/ml; R&D Systems) до 24-го дня. i streptomycynę (1:100, Life Technologies) oraz uzupełniano czynnikiem wzrostu naskórka (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do dnia 24.Od 25. do 42. dnia dodawano do podłoża czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofinę 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), zmieniając podłoże co drugi dzień.6 wyników, 将神经球体转移到含有neurobasal-A (10888, Life Technologies), 不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；Systemy badawczo-rozwojowe）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；Badania i rozwój Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 , Life Technologies） 不 含 维生素 a 的b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （(1: 100 ， Life Technologie） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1； badania i rozwój Systems）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Systemy badawczo-rozwojowe) i фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Szóstego dnia zawiesiny neurosfer zamieniono na suplement zawierający neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 bez witaminy A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycynę zobojętnianą penicyliną (1:100, Life Technologies) uzupełniony o czynnik wzrostu naskórka (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. R&D Systems) do dnia 24.Od 25 do 42 dnia dodawano do podłoża hodowlanego czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i czynnik neurotroficzny 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) co drugi dzień. Podłoże zmieniano raz.Począwszy od 43. dnia, hCO utrzymywano w nieuzupełnionym medium neurobasal-A (NM; 1088022, Thermo Fisher) ze zmianą medium co 4–6 dni. Aby uzyskać hCO z komórek hiPS hodowanych w warunkach bezpodstawnych, komórki hiPS inkubowano z Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) w temperaturze 37°C przez 7 minut, rozdzielono na pojedyncze komórki i umieszczono na płytkach AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) w gęstości 3 × 106 pojedynczych komórek na dołek w medium Essential 8 uzupełnionym inhibitorem ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Po 24 godzinach medium w studzienkach pipetowano w górę i w dół do medium zawierającego Essential 6 medium (A1516401, Life Technologies) uzupełnione dorsomorfiną (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Od 2 do 6 dnia medium Essential 6 wymieniano codziennie na dorsomorfinę i suplement SB-431542. Od szóstego dnia zawiesiny neurosfer przenoszono do medium neurobasal i utrzymywano w sposób opisany powyżej.
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Zakupiono (Charles River Laboratories) lub umieszczono w klatkach ciężarne eutymiczne szczury RNU (rnu/+). Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Szczenięta szczurów nagich (FOXN1–/–) w wieku od trzech do siedmiu dni zidentyfikowano na podstawie wzrostu niedojrzałych wąsów przed selekcją. Szczenięta (samce i samice) znieczulono 2–3% izofluranem i umieszczono na ramie stereotaktycznej. Wykonano trepanację czaszki o średnicy około 2–3 mm powyżej S1, zachowując integralność opony twardej. Następnie użyto igły 30 G (około 0,3 mm) tuż za kraniotomią, aby przebić oponę twardą. Następnie nałóż HCO na cienki parafilm o wymiarach 3×3 cm i usuń nadmiar medium. Używając strzykawki Hamilton przymocowanej do igły 23 G, 45°, delikatnie wciągnij hCO do najbardziej dystalnego końca igły. Następnie zainstaluj strzykawkę na pompie strzykawkowej podłączonej do urządzenia stereotaktycznego. Następnie umieść końcówkę igły nad wcześniej wykonanym otworem o szerokości 0,3 mm w oponie twardej (z = 0 mm) i zwęź strzykawkę o 1–2 mm (z = około –1,5 mm), aż igła znajdzie się między oponą twardą A. utworzy się gęste uszczelnienie. Następnie podnieś strzykawkę do środka powierzchni korowej przy z = -0,5 mm i wstrzyknij hCO z szybkością 1–2 µl na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia hCO igła jest wycofywana z szybkością 0,2–0,5 mm na minutę, skóra jest zszywana, a szczeniak jest natychmiast umieszczany na ciepłej podkładce grzewczej do czasu całkowitego wyzdrowienia. Niektóre zwierzęta zostały przeszczepione obustronnie.
Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Stanford APLAC. Szczury (ponad 60 dni po przeszczepie) znieczulono 5% izofluranem i znieczulono 1-3% izofluranem podczas obrazowania. Do wizualizacji użyto 7-teslowego aktywnie ekranowanego skanera poziomego otworu Bruker (Bruker Corp.) z napędem gradientowym International Electric Company (IECO), ekranowaną wkładką gradientową o średnicy wewnętrznej 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) z wykorzystaniem AVANCE. III, ośmiokanałowych możliwości RF i wielordzeniowych oraz towarzyszącej platformy Paravision 6.0.1. Rejestracja została przeprowadzona przy użyciu aktywnie odsprzęgniętej objętościowej cewki RF o średnicy wewnętrznej 86 mm i czterokanałowej kriogenicznie chłodzonej cewki RF wyłącznie do odbioru. Axial 2D Turbo-RARE (czas powtórzenia = 2500 ms, czas echa = 33 ms, 2 średnie) z 16 przechwytami warstw, grubość warstwy 0,6–0,8 mm, zawierającymi 256 × 256 próbek. Sygnały odbierano za pomocą kwadraturowej cewki objętościowej RF o średnicy wewnętrznej 2 cm (Rapid MR International, LLC). Na koniec wykorzystano wbudowane funkcje szacowania powierzchni Imaris (BitPlane) do renderowania 3D i analizy objętości. Udany przeszczep zdefiniowano jako taki, w którym obszary ciągłego sygnału MRI ważonego T2 utworzyły się w przeszczepionej półkuli. Odrzucenie przeszczepu zdefiniowano jako przeszczep, który nie wytworzył obszarów ciągłego sygnału MRI ważonego T2 w przeszczepionej półkuli. Podkorowe t-hCO wykluczono z późniejszej analizy.
Aby stabilnie wyrażać GCaMP6s w hCO do dwufotonowego obrazowania wapnia, komórki hiPS zakażono pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, a następnie wybrano antybiotyki. Krótko mówiąc, komórki rozdzielono za pomocą EDTA i zawieszono w 1 ml pożywki Essential 8 w gęstości około 300 000 komórek w obecności polibrenu (5 μg/ml) i 15 μl wirusa. Następnie komórki inkubowano w zawiesinie przez 60 minut i wysiewano w gęstości 50 000 komórek na dołek. Po zlaniu się komórek traktowano 5-10 μg ml-1 puromycyny przez 5-10 dni lub do momentu pojawienia się stabilnych kolonii. Ostre zakażenie hCO przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem5 z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, przenieś dzień 30-45 hCO do 1,5 ml probówek mikrocentrifugowych Eppendorf zawierających 100 µl medium nerwów. Następnie usuwa się około 90 µl medium, do probówki dodaje się 3-6 µl lentiwirusa o wysokim mianie (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109), a hCO przenosi się do inkubatora na 30 minut. Następnie dodaje się 90–100 µl medium do każdej probówki i umieszcza probówki z powrotem w inkubatorze na noc. Następnego dnia przenieś hCO do świeżego medium nerwów w płytkach o niskim przyleganiu. Po 7 dniach hCO przeniesiono do 24-dołkowych płytek ze szklanym dnem w celu wizualizacji i oceny jakości zakażenia. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE i pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE zostały wygenerowane przez VectorBuilder. Lentiwirus jest używany w większości eksperymentów, ponieważ jest zintegrowany z genomem gospodarza, umożliwiając ekspresję genu reporterowego w zakażonych liniach komórkowych. W celu kontynuacji badań wścieklizny, w 30–45 dniu hCO współinfekowano wścieklizną-ΔG-eGFP i AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid #67528, Addgene), dokładnie przemywano przez 3 dni, a następnie przeszczepiano szczurom w S1 i utrzymywano in vivo przez 7–14 dni.
Do immunocytochemii zwierzęta znieczulano i przezsercowo perfundowano PBS, a następnie 4% paraformaldehydem (PFA w PBS; Electron Microscopy Sciences). Mózgi utrwalano w 4% PFA przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4°C, kriokonserwowano w 30% sacharozie w PBS przez 48–72 godziny i zatapiano w 1:1, 30% sacharozy: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), a przekroje koronalne wykonywano o grubości 30 µm przy użyciu kriostatu (Leica). Do immunohistochemii grubych przekrojów zwierzęta perfundowano PBS, a mózg rozcinano i cięto na przekroje koronalne o grubości 300–400 µm przy użyciu wibratomu (Leica), a przekroje utrwalano w 4% PFA przez 30 minut. Następnie krioskrawki lub grube skrawki przemywano PBS, blokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (10% normalnej surowicy osła (NDS) i 0,3% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS) i blokowano roztworem blokującym w temperaturze 4°C. – Inkubacja Krioskrawki inkubowano przez noc, a grube skrawki przez 5 dni. Pierwotne przeciwciała użyte to: anty-NeuN (mysz, 1:500; ab104224, abcam), anty-CTIP2 (szczur, 1:300; ab18465, abcam), anty-GFAP (królik, 1:1000; Z0334, Dako), anty-GFP (kurczak, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anty-HNA (mysz, 1:200; ab191181, abcam), anty-NeuN (królik, 1:500; ABN78, Millipore), anty-PDGFRA (królik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anty-PPP1R17 (królik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anty-RECA-1 (mysz, 1:50; ab9774, abcam), anty-SCG2 (królik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anty-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anty-STEM121 (mysz, 1:200; Y40410, Takara Bio), anty-SATB2 (mysz, 1:50; ab51502, abcam), anty-GAD65/67 (królik, 1:400; ABN904, Millipore) i anty-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Pierwotne przeciwciała użyte to: anty-NeuN (mysz, 1:500; ab104224, abcam), anty-CTIP2 (szczur, 1:300; ab18465, abcam), anty-GFAP (królik, 1:1000; Z0334, Dako), anty-GFP (kurczak, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anty-HNA (mysz, 1:200; ab191181, abcam), anty-NeuN (królik, 1:500; ABN78, Millipore), anty-PDGFRA (królik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anty-PPP1R17 (królik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anty-RECA-1 (mysz, 1:50; ab9774, abcam), anty-SCG2 (królik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anty-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anty-STEM121 (mysz, 1:200; Y40410, Takara Bio), anty-SATB2 (mysz, 1:50; ab51502, abcam), anty-GAD65/67 (królik, 1:400; ABN904, Millipore) i anty-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, kamera odb.), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) i анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Pierwotnymi użytymi przeciwciałami były: anty-NeuN (mysz, 1:500; ab104224, abcam), anty-CTIP2 (szczur, 1:300; ab18465, abcam), anty-GFAP (królik, 1:1000; Z0334, Dako), anty-GFP (kurczak, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anty-HNA (mysz, 1:200; ab191181, abcam), anty-NeuN (królik, 1:500; ABN78, Millipore), anty-PDGFRA (królik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anty-PPP1R17 (królik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anty-RECA-1 (mysz, 1:50; ab9774, abcam), anty-SCG2 (królik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anty-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netryna G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anty-STEM121 (mysz, 1:200; Y40410, Takara Bio), anty-SATB2 (mysz, 1:50; ab51502, abcam), anty-GAD65/67 (królik, 1:400; ABN904, Millipore) i anty-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Obsługiwane formaty: NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Systemy badawczo-rozwojowe），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;Kamera: NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），SCG2 100, 20357-1-AP, Proteintech, SOX9, 1:500, AF3075, systemy badawczo-rozwojowe, Netrin G1a, 1:100, AF1166, badania i rozwój Systemy）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anty-SATB2 (mysz, 1:50; ab51502, abcam), anty-GAD65/67 (królik, 1:400; ABN904, Millipore) i anty-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Głównymi użytymi przeciwciałami były: anty-NeuN (mysz, 1:500; ab104224, abcam), anty-CTIP2 (szczur, 1:300; ab18465, abcam), anty-GFAP (królik, 1:1000; Z0334, Dako). , anty-GFP (kurczak, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anty-HNA (mysz, 1:200; ab191181, abcam), anty-NeuN (królik, 1:500; ABN78, Millipore), anty-PDGFRA (królik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anty-PPP1R17 (królik, 1:200; HPA047819, przeciwciało Atlas), anty-RECA-1 (mysz, 1:50; ab9774, abcam), anty-SCG2 (królik), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) i анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anty-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anty-STEM121 (mysz, 1:200; Y40410, Takara Bio), anty-SATB2 (mysz, 1:50; ab51502, abcam), anty-GAD65/67 (królik, 1:400; ABN904, Millipore) i anty-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Następnie sekcje przemyto PBS i inkubowano z przeciwciałem wtórnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (skrawki zamrożone) lub przez noc w temperaturze 4°C (skrawki grube). Zastosowano przeciwciało wtórne Alexa Fluor (Life Technologies) rozcieńczone 1:1000 w roztworze blokującym. Po przemyciu PBS jądra uwidoczniono za pomocą Hoechst 33258 (Life Technologies). Na koniec szkiełka umieszczono pod mikroskopem z szkiełkami nakrywkowymi (Fisher Scientific) przy użyciu Aquamount (Polysciences) i analizowano na obrazie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Keyence (analizator BZ-X) lub mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 (Las-X). Obrazy przetworzono za pomocą programu ImageJ (Fiji). Aby określić ilość ludzkich neuronów w t-hCO i korze mózgowej szczura, wykonano prostokątne obrazy o szerokości 387,5 μm w centrum t-hCO, na lub w pobliżu krawędzi kory mózgowej szczura. Marginesy przeszczepu określono, oceniając zmiany w przezroczystości tkanki, jądrach HNA+ i/lub obecności autofluorescencji tkanki. Na każdym obrazie całkowitą liczbę komórek NeuN+ i HNA+ podzielono przez całkowitą liczbę komórek NeuN+ w tym samym obszarze. Aby mieć pewność, że liczone są tylko komórki z jądrami w płaszczyźnie obrazu, w obliczeniach uwzględniono tylko komórki, które są również Hoechst+. Dwa obrazy oddzielone co najmniej 1 mm uśredniono w celu zmniejszenia błędu statystycznego.
Tydzień przed pobraniem próbki umieść zwierzęta z przeszczepem hCO (około 8 miesięcy różnicowania) w ciemnym pomieszczeniu z przyciętymi wąsami, aby zminimalizować stymulację sensoryczną. Izolację jąder przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, t-hCO i hCO zniszczono za pomocą lizy komórek przy użyciu detergentu i mechanicznego młynka do tkanek o pojemności 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Surowe jądra odfiltrowano za pomocą filtra 40 µm i odwirowano przy 320 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przed wykonaniem gradientu gęstości sacharozy. Po etapie wirowania (320 g przez 20 min w temp. 4°C) próbki zawieszono ponownie w 0,04% BSA/PBS z dodatkiem 0,2 jednostki inhibitora µl-1 RNazy (40 u µl-1, AM2682, Ambion) i przepuszczono przez filtr przepływowy 40 µm. Rozdzielone jądra zawieszono następnie ponownie w PBS zawierającym 0,02% BSA i załadowano na chip Chromium Single Cell 3' (szacowany odzysk 8000 komórek na ścieżkę). Biblioteki snRNA-seq przygotowano przy użyciu zestawu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteki snRNA-seq przygotowano przy użyciu zestawu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq są dostępne w wersji Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteki snRNA-seq przygotowano przy użyciu zestawu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Biblioteka i zestaw kulek żelowych v3 (10x Genomics) Więcej informacji snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Biblioteka i zestaw kulek żelowych v3 (10x Genomics) Więcej informacji Библиотеку snRNA-seq готовили z использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotekę snRNA-seq przygotowano przy użyciu zestawu Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteki z różnych próbek zostały połączone i zsekwencjonowane przez firmę Admera Health na sprzęcie NovaSeq S4 (Illumina).
Poziomy ekspresji genu dla każdego domniemanego kodu kreskowego jądra zostały skwantyfikowane przy użyciu pakietu oprogramowania do analizy 10x Genomics CellRanger (wersja 6.1.2). Dokładniej rzecz biorąc, odczyty zostały dopasowane do kombinacji genomów referencyjnych człowieka (GRCh38, Ensemble, wersja 98) i szczura (Rnor_6.0, Ensemble, wersja 100) utworzonych za pomocą polecenia mkref i przy użyciu count z poleceniem –include-introns=TRUE w celu ilościowego uwzględnienia odczytów mapowanych na regiony intronów. W przypadku próbek t-hCO jądra ludzkie zostały zidentyfikowane na podstawie konserwatywnego wymogu, że co najmniej 95% wszystkich mapowanych odczytów pasuje do genomu ludzkiego. Wszystkie kolejne analizy zostały przeprowadzone na filtrowanej macierzy kodów kreskowych z CellRanger przy użyciu pakietu R (wersja 4.1.2) Seurat (wersja 4.1.1)32.
Aby zapewnić, że w późniejszej analizie zostaną uwzględnione tylko jądra wysokiej jakości, dla każdej próbki wdrożono iteracyjny proces filtrowania. Najpierw zidentyfikowano i usunięto jądra niskiej jakości, w których znaleziono mniej niż 1000 unikalnych genów i ponad 20% całkowitej liczby mitochondriów. Następnie macierz surowej liczby genów została znormalizowana przez zregularizowaną ujemną regresję dwumianową przy użyciu funkcji sctransform(vst.flavor=”v2″), która również zidentyfikowała 3000 najbardziej zmiennych genów przy użyciu domyślnych parametrów. Redukcję wymiarów przeprowadzono na górnych zmiennych genach przy użyciu analizy głównych składowych (PCA) z domyślnymi parametrami przy użyciu wymiaru zestawu danych 30 (dims = 30 wybrano na podstawie wizualnej inspekcji miejsc kolan i zastosowano do wszystkich próbek i analiz zespołowych). Następnie przeprowadziliśmy kilka rund iteracyjnego klasteryzacji (rozdzielczość = 1), aby sklasyfikować geny na podstawie nieprawidłowo niskiej liczby genów (mediana poniżej 10. percentyla), nieprawidłowo wysokiej liczby genów mitochondrialnych (mediana powyżej 95. percentyla), aby zidentyfikować i usunąć domniemane komórki niskiej jakości. klastry i/lub wysoki odsetek podejrzanych bliźniąt zidentyfikowanych przy użyciu pakietu DoubletFinder33 (średni wynik DoubletFinder powyżej 95. percentyla). próbki t-hCO Próbki (n=3) i hCO (n=3) zintegrowano oddzielnie przy użyciu funkcji IntegrateData z powyższymi parametrami. Następnie przeprowadzono kolejną rundę jakościowego filtrowania zintegrowanego zestawu danych, jak opisano powyżej.
Po usunięciu jąder niskiej jakości zintegrowany zestaw danych został zgrupowany (rozdzielczość = 0,5) i osadzony w celach wizualizacji UMAP34. Geny markerowe dla każdego klastra zostały określone przy użyciu funkcji FindMarkers z domyślnymi parametrami obliczonymi na podstawie znormalizowanych danych ekspresji genów. Identyfikujemy i klasyfikujemy główne klasy komórek, łącząc zestawy danych referencyjnych kory mózgowej płodu i dorosłego z ekspresją genu markerowego 19,20,21,35 i adnotacją. W szczególności krążące prekursory zostały zidentyfikowane przez ekspresję MKI67 i TOP2A. Klastry progenitorowe zostały zdefiniowane przez brak transkryptów mitotycznych, duże nakładanie się z wielopotencjalnymi klastrami progenitorowymi glejowymi opisanymi w późnej metafazie płodowej kory mózgowej oraz ekspresję EGFR i OLIG1. Używamy terminu astrocyt, aby objąć kilka stanów różnicowania astrocytów, od późnego gleju radialnego do dojrzewania astrocytów. Klastry astrocytów wyrażają wysokie poziomy SLC1A3 i AQP4 i wykazano, że mapują się z podtypami płodowych glejów radialnych i/lub dorosłych astrocytów. OPC wyrażają PDGFRA i SOX10, podczas gdy oligodendrocyty wyrażają markery mielinizacji (MOG i MYRF). Neurony glutaminergiczne zidentyfikowano na podstawie obecności transkryptów neuronalnych (SYT1 i SNAP25), braku markerów GABAergicznych (GAD2) i ekspresji NEUROD6, SLC17A7, BCL11B lub SATB2. Neurony GluN podzielono dalej na podklasy górne (ekspresja SATB2 i utrata BCL11B) i głębokie (ekspresja BCL11B). Domniemane neurony podpłytkowe (SP) wyrażają znane markery SP18, takie jak ST18 i SORCS1, oprócz głębokich markerów GluN. Komórki splotu naczyniówkowego zidentyfikowano na podstawie ekspresji TTR, a komórki oponowe wyrażały geny związane z fibroblastami i mapowały komórki opony miękkiej/naczyniowej zestawu danych referencyjnych.
Analizę różnicową ekspresji genów między podklasami t-hCO i hCO przeprowadzono przy użyciu nowo opracowanej metody pseudo-batch odtworzonej w próbkach wdrożonych przy użyciu pakietu Libra R (wersja 1.0.0). Dokładniej rzecz biorąc, testy logarytmiczne wiarygodności edgeR (wersja 3.36.0, pakiet R) przeprowadzono dla grup, sumując liczbę genów w komórkach dla danej klasy komórek dla każdej replikacji próbki. W celu wizualizacji mapy cieplnej znormalizowane wartości na milion (CPM) obliczono przy użyciu funkcji edgeR (cpm()) i skalowano (aby uzyskać średnią = 0, odchylenie standardowe = 1). Przeprowadzono analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) istotnie upregulowanych genów GluN t-hCO (skorygowana wartość P Benjaminiego-Hochberga mniejsza niż 0,05 wyrażona w co najmniej 10% komórek GluN t-hCO i krotny wzrost zmiany co najmniej 2-krotnie). przeprowadzono przy użyciu pakietu ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Korzystamy z aplikacji ToppFun z domyślnymi parametrami i raportujemy wartości p skorygowane metodą Benjaminiego-Hochberga, obliczone na podstawie testów hipergeometrycznych z adnotacją GO.
Aby dopasować nasze klastry snRNA-seq do adnotowanych klastrów komórkowych z badań referencyjnych pierwotnego RNA-seq pojedynczej komórki lub dorosłego snRNA-seq19,20,21,22, zastosowaliśmy podejście integracji sparowanych zestawów danych. Użyliśmy przepływu pracy normalizacji SCTransform (v2) w Seurat, aby zintegrować i porównać nakładanie się klastrów między zestawami danych (używając tych samych parametrów, co powyżej). Poszczególne zestawy danych zostały losowo podzielone na podzbiory do 500 komórek lub rdzeni na oryginalny klaster w celu zwiększenia wydajności obliczeniowej. Używając podobnego podejścia, jak opisano wcześniej, nakładanie się klastrów zostało zdefiniowane jako proporcja komórek lub jąder w każdym połączonym klastrze, które nakładały się z etykietą klastra referencyjnego. Aby dalej klasyfikować GluN, użyliśmy przepływu pracy TransferData Seurat dla danych podzbioru GluN, aby przypisać etykiety zestawu danych referencyjnych do naszych komórek GluN.
Aby ocenić stan dojrzewania globalnego transkryptomu próbek t-hCO i hCO, porównaliśmy nasze próbki pseudo-bulk z BrainSpan/psychENCODE23, które składają się z dużej sekwencji RNA obejmującej rozwój ludzkiego mózgu. Wykonaliśmy PCA na połączonej macierzy ekspresji genów znormalizowanej pod względem wzorca z próbek korowych 10 tygodni po poczęciu i później, w 5567 genach (wraz z naszymi danymi), które wcześniej zidentyfikowano jako aktywne w próbkach korowych BrainSpan (zdefiniowanych jako większe niż 50% wariancji rozwojowej wyjaśnionej wiekiem przy użyciu modelu sześciennego)38. Ponadto, wyprowadziliśmy geny związane z głównymi sygnaturami transkryptomu rozwoju neurologicznego przy użyciu nieujemnej faktoryzacji macierzy, jak opisano wcześniej. Wagi próbek obliczone przy użyciu procedury nieujemnej faktoryzacji macierzy są przedstawione na rys. 5b z rozszerzonymi danymi dla każdego z pięciu sygnatur opisanych przez Zhu i in.38. Ponownie, markery transkrypcyjne zależne od aktywności wyprowadzono z wcześniej opublikowanych badań. W szczególności, ERG i LRG były znacząco podwyższone w neuronach glutaminergicznych zidentyfikowanych przez zbiór snRNA-seq kory wzrokowej myszy po stymulacji wzrokowej z Tabeli uzupełniającej 3 Hrvatin i in.16. Wzbogacone ludzkie LRG uzyskano z kultur ludzkiego mózgu płodowego aktywowanych KCl i zebrano 6 godzin po stymulacji, a przefiltrowane geny były znacząco podwyższone u ludzi, ale nie u gryzoni (Tabela uzupełniająca 4). Analizę wzbogacenia zestawu genów przy użyciu tych zestawów genów przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowego dokładnego testu Fishera.
Znieczulić szczury izofluranem, wyjąć mózgi i umieścić je w zimnym (około 4°C) natlenionym (95% O2 i 5% CO2) roztworze sacharozy w przypadku skrawków zawierających: 234 mM sacharozy, 11 mM glukozy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 i 0,5 mM CaCl2 (około 310 mOsm). Skrawki wieńcowe mózgu szczura (300–400 µm) zawierające t-hCO wykonano przy użyciu wibratomu Leica VT1200, jak opisano wcześniej39. Następnie sekcje przeniesiono do komory sekcyjnej z ciągłym natlenianiem w temperaturze pokojowej, zawierającej aCSF przygotowany z: 10 mM glukozy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 i 126 mM NaCl (298 mOsm). co najmniej 45 minut przed rejestrowaniem. Sekcje rejestrowano w zanurzonej komorze, gdzie były one stale perfundowane aCSF (fiolka 95% O2 i 5% CO2). Wszystkie dane rejestrowano w temperaturze pokojowej. Neurony t-hCO zakończono za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego wypełnionej roztworem zawierającym 127 mM glukonianu potasu, 8 mM NaCl, 4 mM ATP magnezu, 0,3 mM GTP sodu, 10 mM HEPES i 0,6 mM EGTA, pH 7,2, roztwór wewnętrzny dostosowany za pomocą KOH (290 mOsm). W celu odzyskania, do roztworu rejestrującego dodano biocytynę (0,2%).
Dane uzyskano przy użyciu wzmacniacza MultiClamp 700B (Molecular Devices) i digitizera Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrowano dolnoprzepustowo przy 2 kHz, digitalizowano przy 20 kHz i analizowano przy użyciu Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). i niestandardowych funkcji MATLAB (Mathworks). Potencjał złącza obliczono przy użyciu JPCalc, a wpisy dostosowano do obliczonej wartości -14 mV. Operacja IV składa się z serii kroków prądowych w krokach 10-25 pA, od -250 do 750 pA.
Wzgórze, istota biała i aferentne S1 były stymulowane elektrycznie w plasterkach wzgórzowo-korowych podczas rejestracji metodą patch-clamp neuronów hCO, jak opisano wcześniej. Krótko mówiąc, mózg umieszczono na stole do druku 3D pochylonym pod kątem 10°, a przód mózgu przecięto pod kątem 35°. Następnie mózg przyklejono do powierzchni cięcia i podzielono na sekcje, zachowując wystające aksony wzgórzowo-korowe. Dwubiegunowe elektrody wolframowe (0,5 MΩ) zamontowano na drugim mikromanipulatorze i strategicznie ustawiono, aby stymulować cztery obszary na komórkę (torebka wewnętrzna, istota biała, S1 i hCO). Rejestruj odpowiedzi synaptyczne po stymulacji fazowej 300 µA przy częstotliwości 0,03–0,1 Hz.
Neurony hCO wyrażające hChR2 zostały aktywowane przy 480 nm, a impulsy światła generowane przez diodę LED (Prizmatix) zostały zastosowane przez obiektyw ×40 (0,9 NA; Olympus), aby zarejestrować ekspresję hChR2 w pobliżu komórek. Średnica oświetlonego pola wynosi około 0,5 mm, a całkowita moc wynosi 10-20 mW. Szerokość impulsu ustawiono na 10 ms, co odpowiada impulsowi podawanemu podczas eksperymentu uczenia się behawioralnego. Zastosowano różne częstotliwości stymulacji, od 1 do 20 Hz, ale do kwantyfikacji użyto tylko pierwszego impulsu z serii. Odstępy między seriami są zwykle dłuższe niż 30 s, aby zminimalizować wpływ na hamujące lub ułatwiające synaptyczne ścieżki. Aby sprawdzić, czy odpowiedź hChR2 była monosynaptyczna, zastosowaliśmy TTX (1 μM) do kąpieli, aż reakcja EPSC zanikła, a następnie zastosowaliśmy 4-aminopirydynę (4-AP; 100 μM). Zazwyczaj odpowiedź pojawia się w ciągu kilku minut, przy czym opóźnienie między zapaleniem diody LED a wygenerowaniem EPSC jest nieco dłuższe. Do sprawdzenia, czy odpowiedź jest wywoływana przez receptory AMPA, użyto NBQX (10 μM).
Ostre sekcje hCO stworzono w sposób opisany wcześniej. W skrócie, sekcje hCO zatopiono w 4% agarozie i przeniesiono do komórek zawierających 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 10 mM d-(+) -glukozy do Sekcje pocięto na 200–300 µm w temperaturze pokojowej za pomocą wibratora Leica VT1200 i przechowywano w ASF w temperaturze pokojowej. Następnie wykonano rejestrację patch-camp całych komórek na sekcjach hCO pod bezpośrednim mikroskopem SliceScope (Scientifica). Sekcje perfundowano aCSF (95% O2 i 5% CO2), a sygnały komórkowe rejestrowano w temperaturze pokojowej. Neurony hCO aplikowano za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego wypełnionej roztworem zawierającym 127 mM glukonianu potasu, 8 mM NaCl, 4 mM ATP magnezu, 0,3 mM GTP sodu, 10 mM HEPES i 0,6 mM EGTA, wewnętrzne pH 7, 2, dostosowane za pomocą KOH (osmolarność 290). W celu odzysku należy dodać 0,2% Biocytin do wewnętrznego roztworu.
Dane zostały zebrane przez Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) przy użyciu wzmacniacza MultiClamp 700B (Molecular Devices) i digitizera Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrowane dolnoprzepustowo przy 2 kHz, digitalizowane przy 20 kHz i analizowane przy użyciu Clampfit (wersja 10.6) do analizy, molecular devices) i niestandardowych funkcji MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Potencjał złącza został obliczony przy użyciu JPCalc, a wpisy zostały dostosowane do obliczonego potencjału złącza -14 mV. Operacja IV składa się z serii kroków prądowych w krokach 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Do rekonstrukcji morfologicznej zaciśniętych neuronów do wewnętrznego roztworu dodano 0,2% biocytyny (Sigma-Aldrich). Komórki są przygotowywane przez co najmniej 15 minut po zhakowaniu. Następnie pipeta jest powoli wciągana przez 1–2 minuty, aż zarejestrowana membrana zostanie całkowicie uszczelniona. Po procedurze fizjologii sekcji, sekcje utrwalano przez noc w temperaturze 4° C. w 4% PFA, przemywano PBS X3 i rozcieńczano 1:1000 sprzężonym ze streptawidyną DyLight 549 lub DyLight 405 (Vector Labs). Komórki wypełnione biocytyną (2%; Sigma-Aldrich) znakowano podczas rejestracji patch clamp w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Sekcje umieszczono następnie na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu Aquamount (Thermo Scientific) i następnego dnia zwizualizowano na mikroskopie konfokalnym Leica TCS SP8 przy użyciu obiektywu immersyjnego z aperturą numeryczną ×40 1,3, powiększeniem ×0,9–1,0, xy. Częstotliwość próbkowania wynosi około 7 pikseli na mikron. Stosy Z w odstępach 1 µm uzyskano seryjnie, a mozaiki stosów Z i automatyczne zszywanie oparte na Leica przeprowadzono w celu pokrycia całego drzewa dendrytycznego każdego neuronu. Następnie neurony śledzono półautomatycznie przy użyciu interfejsu neuTube 40 i wygenerowano pliki SWC. Następnie pliki przesłano do wtyczki SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, wersja 2.1.0; NIH).
Ludzką tkankę korową uzyskano za świadomą zgodą zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board of Stanford University. Dwie próbki ludzkiej tkanki poporodowej (w wieku 3 i 18 lat) uzyskano poprzez resekcję kory czołowej (środkowego zakrętu czołowego) jako część operacji opornej na leczenie padaczki. Po resekcji zbierz tkankę w lodowatym NMDG-aCSF zawierającym: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukozy, 2 mM tiomocznika, 5 mM askorbinianu sodu, 3 mM pirogronianu sodu, 0,5 mM CaCl2 4H2O i 10 mM MgSO4 7H2O. Miareczkuj do pH 7,3-7,4 stężonym kwasem solnym. Tkanki dostarczono do laboratorium w ciągu 30 minut, a przekroje koronowe pobrano zgodnie z procedurą opisaną powyżej.
Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Stanford APLAC. Szczury (ponad 140 dni po przeszczepie) znieczulono 5% izofluranem i śródoperacyjnie 1-3% izofluranem. Zwierzęta umieszczono w ramie stereotaktycznej (Kopf) i wstrzyknięto podskórnie buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (SR). Czaszka została odsłonięta, oczyszczona i wprowadzono 3-5 śrub kostnych. Aby ukierunkować t-hCO, wygenerowaliśmy współrzędne stereotaktyczne z obrazów MRI. W miejscu zainteresowania wywiercono otwór, a włókna (średnica 400 µm, NA 0,48, Doric) obniżono o 100 µm poniżej powierzchni hCO i przymocowano do czaszki utwardzalnym promieniami UV cementem stomatologicznym (Relyx).
Rejestracje fotometryczne włókien przeprowadzono w sposób opisany wcześniej42. Aby zarejestrować spontaniczną aktywność, szczury umieszczono w czystej klatce, a do wszczepionego włókna podłączono światłowodowy kabel krosowy o średnicy 400 µm (Doric) podłączony do światłowodowego systemu akwizycji danych fotometrycznych. Podczas 10-minutowego rejestrowania aktywności ruchowej zwierzęta mogły swobodnie eksplorować klatkę. Aby zarejestrować wywołaną aktywność, szczury (ponad 140 dni po przeszczepie) znieczulono 5% izofluranem w celu indukcji i 1-3% izofluranem w celu podtrzymania. Umieszczono zwierzę w ramie stereotaktycznej (Kopf), a wąsy po przeciwnej stronie t-hCO przycięto do około 2 cm i przepuszczono przez siatkę podłączoną do siłownika piezoelektrycznego (PI). Do wszczepionego włókna podłączono światłowodowy kabel krosowy o średnicy 400 µm (Doric) i podłączono do systemu akwizycji danych. Wąsy po przeciwnej stronie t-hCO były następnie odchylane 50 razy (2 mm przy 20 Hz, 2 s na prezentację) w losowych momentach przez napęd piezoelektryczny w ciągu 20-minutowego okresu nagrywania. Użyj pakietu Arduino MATLAB Support Package, aby kontrolować czas odchylenia za pomocą niestandardowego kodu MATLAB. Zdarzenia są synchronizowane z oprogramowaniem do akwizycji danych za pomocą impulsów logiki tranzystor-tranzystor (TTL).
Szczury (ponad 140 dni po przeszczepie) znieczulono 5% izofluranem i śródoperacyjnie 1-3% izofluranem. Zwierzęta umieszczono w ramie stereotaktycznej (Kopf), a buprenorfinę SR i deksametazon wstrzyknięto podskórnie. Czaszka została odsłonięta, oczyszczona i wprowadzono 3-5 śrub kostnych. Aby ukierunkować t-hCO, wygenerowano współrzędne stereotaktyczne z obrazów MRI. Wykonano kraniotomię okrężną (o średnicy około 1 cm) wiertarką szybkoobrotową bezpośrednio nad przeszczepionym hCO. Gdy kość stała się tak najcieńsza, jak to możliwe, ale przed przewierceniem całej kości, użyj kleszczy, aby usunąć pozostały nienaruszony dysk miednicy, aby odsłonić leżący pod spodem t-hCO. Kraniotomię wypełniono jałowym roztworem soli fizjologicznej, a szkiełko nakrywkowe i specjalny kołek główkowy przymocowano do czaszki za pomocą utwardzanego promieniami UV cementu stomatologicznego (Relyx).
Obrazowanie dwufotonowe wykonano przy użyciu wielofotonowego mikroskopu Bruker z obiektywem Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Obrazowanie GCaMP6 wykonano przy 920 nm z 1,4-krotnym powiększeniem pojedynczej płaszczyzny z i średnią 8-krotną 7,5 fps. Szczury indukowano znieczuleniem 5% izofluranem i utrzymywano je znieczuleniem 1-3% izofluranem. Szczury umieszczono w specjalnie wykonanym uchwycie głowy i ustawiono pod soczewką. Uzyskano 3-minutowe nagranie tła aktywności ruchowej. W ciągu 20 minut nagrywania 50 zaciągnięć (każda prezentacja o długości 100 ms) zostało losowo dostarczonych do poduszki wąsowej naprzeciwko t-hCO przy użyciu picospricera. Użyj pakietu Arduino MATLAB Support Package, aby kontrolować czas serii za pomocą niestandardowego kodu MATLAB. Synchronizuj zdarzenia z oprogramowaniem do akwizycji danych (PrairieView 5.5) przy użyciu impulsów TTL. Do analizy obrazy zostały skorygowane pod kątem ruchu xy za pomocą korekty afinicznej w programie MoCo uruchomionym na Fidżi. Ekstrakcja śladów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek za pomocą CNMF-E43. Fluorescencja została wyekstrahowana dla każdego regionu zainteresowania, przekształcona na krzywe dF/F, a następnie przekształcona na wyniki z.
Szczury (ponad 140 dni po przeszczepie) znieczulono 5% izofluranem i śródoperacyjnie 1-3% izofluranem. Zwierzęta umieszczono w ramie stereotaktycznej (Kopf), a buprenorfinę SR i deksametazon wstrzyknięto podskórnie. Wąsy po przeciwnej stronie t-hCO przycięto do około 2 cm i przewleczono przez siatkę podłączoną do siłownika piezoelektrycznego. Czaszka została odsłonięta i oczyszczona. Do czaszki przymocowano śrubę uziemiającą ze stali nierdzewnej. Aby ukierunkować t-hCO, wygenerowaliśmy współrzędne stereotaktyczne z obrazów MRI. Wykonaj kraniotomię okrężną (o średnicy około 1 cm) wiertarką szybkoobrotową tuż nad t-hCO. Gdy kość będzie tak najcieńsza, jak to możliwe, ale przed przewierceniem całej kości, użyj kleszczy, aby usunąć pozostały nienaruszony dysk miednicy, aby odsłonić leżący pod spodem t-hCO. Poszczególne komórki rejestrowano przy użyciu 32-kanałowych lub 64-kanałowych sond krzemowych o wysokiej gęstości (Cambridge Neurotech) uziemionych do śrub uziemiających i wstępnie wzmacnianych za pomocą wzmacniaczy RHD (Intan). Za pomocą manipulatora opuść elektrody do miejsca docelowego przez kraniotomię, która jest wypełniona jałowym roztworem soli fizjologicznej. Zbieranie danych przeprowadzono przy częstotliwości 30 kHz przy użyciu systemu akwizycji danych Open Ephys. Rejestracja była kontynuowana tylko wtedy, gdy wykryliśmy wysoce skorelowaną rytmiczną aktywność spontaniczną w ponad 10 kanałach, co sugeruje, że elektrody znajdowały się w przeszczepie (na podstawie danych z obrazowania wapnia dwufotonowego). Uzyskano 10-minutowe tło rejestracji aktywności ruchowej. Wąsy po przeciwnej stronie t-hCO były następnie odchylane 50 razy (2 mm przy 20 Hz, 2 s na prezentację) w losowych momentach przez napęd piezoelektryczny w ciągu 20-minutowego okresu rejestracji. Używając pakietu MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b), kontroluj czas odchylenia za pomocą niestandardowego kodu MATLAB. Użyj impulsów TTL, aby zsynchronizować zdarzenia z oprogramowaniem do akwizycji danych.
Do eksperymentów z optycznym znakowaniem, optyczny kabel krosowy 200 µm (Doric) podłączony do lasera 473 nm (Omicron) został podłączony do światłowodu 200 µm umieszczonego nad kraniotomią. Bezpośrednio przed tym ustaw moc zworki na 20 mW. Użyj manipulatora, aby obniżyć elektrody do miejsca docelowego przez kraniotomię, która jest wypełniona jałowym roztworem soli fizjologicznej. Na początku rejestracji wyemitowano dziesięć impulsów światła 473 nm (częstotliwość 2 Hz, czas trwania impulsu 10 ms). Komórki światłoczułe zdefiniowano jako komórki, które wykazywały odpowiedź pikową w ciągu 10 ms światła w 70% lub więcej prób.