Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Płynna biopsja (LB) to koncepcja, która szybko zyskuje popularność w dziedzinie biomedycyny.Koncepcja opiera się głównie na wykrywaniu fragmentów krążącego zewnątrzkomórkowego DNA (ccfDNA), które są głównie uwalniane jako małe fragmenty po śmierci komórki w różnych tkankach.Niewielka część tych fragmentów pochodzi z obcych (obcych) tkanek lub organizmów.W obecnej pracy zastosowaliśmy tę koncepcję do małży, gatunku wartowniczego znanego z dużej zdolności filtrowania wody morskiej.Wykorzystujemy zdolność małży do działania jako naturalne filtry do wychwytywania środowiskowych fragmentów DNA z różnych źródeł, aby dostarczać informacji o różnorodności biologicznej morskich ekosystemów przybrzeżnych.Nasze wyniki pokazują, że hemolimfa omułka zawiera fragmenty DNA, które różnią się znacznie wielkością, od 1 do 5 kb.Sekwencjonowanie shotgun wykazało, że duża liczba fragmentów DNA pochodzi od obcych drobnoustrojów.Wśród nich znaleźliśmy fragmenty DNA bakterii, archeonów i wirusów, w tym wirusów, o których wiadomo, że infekują różnych żywicieli powszechnie występujących w przybrzeżnych ekosystemach morskich.Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcja LB zastosowana do małży stanowi bogate, ale jeszcze niezbadane źródło wiedzy na temat różnorodności drobnoustrojów w morskich ekosystemach przybrzeżnych.
Wpływ zmian klimatu (CC) na bioróżnorodność ekosystemów morskich jest szybko rozwijającym się obszarem badań.Globalne ocieplenie nie tylko powoduje istotne stresy fizjologiczne, ale także przesuwa ewolucyjne granice stabilności termicznej organizmów morskich, wpływając na siedliska wielu gatunków, skłaniając je do poszukiwania korzystniejszych warunków [1, 2].Oprócz wpływu na różnorodność biologiczną metazoanów, CC zakłóca delikatną równowagę interakcji między żywicielem a drobnoustrojami.Ta dysbakterioza drobnoustrojowa stanowi poważne zagrożenie dla ekosystemów morskich, ponieważ zwiększa podatność organizmów morskich na patogeny zakaźne [3, 4].Uważa się, że SS odgrywają ważną rolę w masowej śmierci, co stanowi poważny problem dla zarządzania światowymi ekosystemami morskimi [5, 6].Jest to ważna kwestia, biorąc pod uwagę ekonomiczny, ekologiczny i żywieniowy wpływ wielu gatunków morskich.Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku małży żyjących w regionach polarnych, gdzie skutki CK są bardziej natychmiastowe i dotkliwe [6, 7].W rzeczywistości małże, takie jak Mytilus spp.są szeroko stosowane do monitorowania wpływu CC na ekosystemy morskie.Nic dziwnego, że opracowano stosunkowo dużą liczbę biomarkerów do monitorowania ich zdrowia, często stosując podejście dwupoziomowe obejmujące funkcjonalne biomarkery oparte na aktywności enzymatycznej lub funkcjach komórkowych, takich jak żywotność komórek i aktywność fagocytarna [8].Metody te obejmują również pomiar stężenia określonych wskaźników ciśnienia, które gromadzą się w tkankach miękkich po wchłonięciu dużych ilości wody morskiej.Jednak wysoka zdolność filtracji i półotwarty układ krążenia małży dają możliwość opracowania nowych biomarkerów hemolimfy przy użyciu koncepcji płynnej biopsji (LB), prostej i minimalnie inwazyjnej metody postępowania z pacjentem.próbki krwi [9, 10].Chociaż w ludzkim LB można znaleźć kilka rodzajów krążących cząsteczek, koncepcja ta opiera się głównie na analizie sekwencjonowania DNA fragmentów krążącego zewnątrzkomórkowego DNA (ccfDNA) w osoczu.W rzeczywistości obecność krążącego DNA w ludzkim osoczu była znana od połowy XX wieku [11], ale dopiero w ostatnich latach pojawienie się wysokowydajnych metod sekwencjonowania doprowadziło do diagnozy klinicznej opartej na ccfDNA.Obecność tych krążących fragmentów DNA jest częściowo spowodowana biernym uwalnianiem genomowego DNA (jądrowego i mitochondrialnego) po śmierci komórki. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zwykle niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, co skutkuje uszkodzeniem tkanek. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zwykle niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, co skutkuje uszkodzeniem tkanek. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), но может повышаться в 5–10 раз у больн ых с различной патологией lub подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. U osób zdrowych stężenie cccDNA jest zwykle niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów z różnymi patologiami lub pod wpływem stresu prowadzącego do uszkodzenia tkanek.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациен тов с различными патологиями lub стрессом, что приводит к повреждению тканей. Stężenia ccfDNA są zwykle niskie (<10 ng/ml) u zdrowych osób, ale mogą być zwiększone 5-10-krotnie u pacjentów z różnymi patologiami lub stresem, co skutkuje uszkodzeniem tkanek.Wielkość fragmentów ccfDNA jest bardzo zróżnicowana, ale zwykle mieści się w zakresie od 150 do 200 pz.[12].Analiza samopochodzącego ccfDNA, tj. ccfDNA z normalnych lub transformowanych komórek gospodarza, może być wykorzystana do wykrywania zmian genetycznych i epigenetycznych obecnych w genomie jądrowym i/lub mitochondrialnym, pomagając w ten sposób klinicystom w wyborze specyficznych terapii ukierunkowanych molekularnie [13].Jednak ccfDNA można uzyskać z obcych źródeł, takich jak ccfDNA z komórek płodowych w czasie ciąży lub z przeszczepionych narządów [14,15,16,17].ccfDNA jest również ważnym źródłem informacji do wykrywania obecności kwasów nukleinowych czynnika zakaźnego (obcego), co pozwala na nieinwazyjne wykrywanie rozległych infekcji nie identyfikowanych przez posiewy krwi, unikając inwazyjnej biopsji zakażonej tkanki [18].Ostatnie badania rzeczywiście wykazały, że ludzka krew zawiera bogate źródło informacji, które można wykorzystać do identyfikacji patogenów wirusowych i bakteryjnych, a około 1% ccfDNA znalezionego w ludzkim osoczu jest pochodzenia obcego [19].Badania te pokazują, że bioróżnorodność krążącego mikrobiomu organizmu można ocenić za pomocą analizy ccfDNA.Jednak do niedawna koncepcja ta była stosowana wyłącznie u ludzi iw mniejszym stopniu u innych kręgowców [20, 21].
W niniejszym artykule wykorzystujemy potencjał LB do analizy ccfDNA Aulacomya atra, południowego gatunku powszechnie występującego na subantarktycznych Wyspach Kerguelena, grupie wysp na szczycie dużego płaskowyżu, który powstał 35 milionów lat temu.erupcja wulkanu.Za pomocą eksperymentalnego systemu in vitro odkryliśmy, że fragmenty DNA w wodzie morskiej są szybko wchłaniane przez małże i dostają się do przedziału hemolimfy.Sekwencjonowanie shotgun wykazało, że ccfDNA hemolimfy omułka zawiera fragmenty DNA własnego i obcego pochodzenia, w tym bakterie symbiotyczne i fragmenty DNA z biomów typowych dla zimnych wulkanicznych morskich ekosystemów przybrzeżnych.Hemolymph ccfDNA zawiera również sekwencje wirusowe pochodzące z wirusów o różnych zakresach gospodarzy.Znaleźliśmy również fragmenty DNA zwierząt wielokomórkowych, takich jak ryby kostnoszkieletowe, ukwiały, algi i owady.Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcję LB można z powodzeniem zastosować do bezkręgowców morskich w celu wygenerowania bogatego repertuaru genomowego w ekosystemach morskich.
Dorosłe osobniki (o długości 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) zebrano z międzypływowych skalistych wybrzeży Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Wyspy Kerguelena w grudniu 2018 r. Inne dorosłe omułki błękitne (Mytilus spp.) uzyskano od dostawcy komercyjnego (PEI Mussel King Inc., Wyspa Księcia Edwarda, Kanada) i umieszczono w napowietrzanym zbiorniku o kontrolowanej temperaturze (4°C), zawierającym 10–20 l sztucznej solanki 32‰.(sztuczna sól morska Reef Crystal, Instant Ocean, Wirginia, USA).Dla każdego eksperymentu mierzono długość i wagę poszczególnych muszli.
Bezpłatny protokół otwartego dostępu dla tego programu jest dostępny online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).W skrócie, hemolimfę LB pobrano z mięśni odwodzicieli, jak opisano [22].Hemolimfę klarowano przez wirowanie przy 1200 x g przez 3 minuty, supernatant zamrażano (-20°C) do użycia.W celu izolacji i oczyszczenia cfDNA próbki (1,5-2,0 ml) rozmrożono i poddano obróbce przy użyciu zestawu NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) zgodnie z instrukcjami producenta.ccfDNA przechowywano w -80°C do dalszej analizy.W niektórych eksperymentach ccfDNA izolowano i oczyszczano przy użyciu zestawu QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Oczyszczone DNA oznaczano ilościowo przy użyciu standardowego testu PicoGreen.Rozkład fragmentów wyizolowanego ccfDNA analizowano metodą elektroforezy kapilarnej przy użyciu bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) przy użyciu zestawu High Sensitivity DNA Kit.Test przeprowadzono stosując 1 ul próbki ccfDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
Do sekwencjonowania fragmentów ccfDNA hemolimfy, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) przygotował biblioteki shotgun przy użyciu zestawu Illumina DNA Mix z zestawu Illumina MiSeq PE75.Zastosowano standardowy adapter (BioO).Surowe pliki danych są dostępne w archiwum odczytu sekwencji NCBI (SRR8924808 i SRR8924809).Podstawową jakość odczytu oceniono za pomocą FastQC [23].Trimmomatic [24] był używany do przycinania adapterów i słabej jakości odczytów.Odczyty strzelby ze sparowanymi końcami zostały połączone FLASH w dłuższe pojedyncze odczyty z minimalnym nakładaniem się 20 pz, aby uniknąć niedopasowań [25]. Połączone odczyty zostały opatrzone adnotacjami za pomocą BLASTN przy użyciu bazy danych taksonomii małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono za pomocą DUST [26]. Połączone odczyty zostały opatrzone adnotacjami za pomocą BLASTN przy użyciu bazy danych taksonomii małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono za pomocą DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуствор чатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было вып олнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty zostały opatrzone adnotacjami za pomocą BLASTN przy użyciu bazy danych taksonomii małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono za pomocą DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 pył [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных дв устворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty zostały opatrzone adnotacjami za pomocą BLASTN przy użyciu taksonomicznej bazy danych małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono za pomocą DUST [26].Odczyty podzielono na dwie grupy: związane z sekwencjami małży (tu zwane samoczytaniami) i niepowiązane (niesamoczytane).Dwie grupy zostały oddzielnie złożone przy użyciu MEGAHIT do wygenerowania kontigów [27].Tymczasem rozkład taksonomiczny obcych mikrobiomów został sklasyfikowany za pomocą Krakena2 [28] i przedstawiony graficznie na wykresie kołowym Krona na Galaktyce [29, 30].Na podstawie naszych wstępnych eksperymentów ustalono, że optymalny kmers to kmers-59. Następnie zidentyfikowano własne kontigi przez dopasowanie z BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii) w celu uzyskania ostatecznej adnotacji. Następnie zidentyfikowano własne kontigi przez dopasowanie z BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii) w celu uzyskania ostatecznej adnotacji. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллю сков NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%) для окончательной аннотации. Następnie zidentyfikowano samokontigi przez dopasowanie do BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii) w celu uzyskania ostatecznej adnotacji.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 i гомология 60%). Następnie zidentyfikowano samokontigi do ostatecznej adnotacji przez dopasowanie do BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup innych niż ja zostały opatrzone adnotacjami BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup innych niż ja zostały opatrzone adnotacjami BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e < 1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grup obcych zostały opisane za pomocą BLASTN (baza danych NT NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grupy innej niż ja zostały opatrzone adnotacją BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). BLASTX przeprowadzono również na kontigach innych niż własne przy użyciu baz danych NCBI białek nr i RefSeq (wartość e <1e-10 i 60% homologii). BLASTX przeprowadzono również na kontigach innych niż własne przy użyciu baz danych NCBI białek nr i RefSeq (wartość e <1e-10 i 60% homologii). BLASTX umożliwia dostęp do niezarejestrowanych kont i RefSeq NCBI (zapisy е e <1e-10 i гомология 60%). BLASTX przeprowadzono również na kontigach innych niż własne, stosując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e <1e-10 i 60% homologii).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (zapisywanie e < 1e-10 i гомология 60%). BLASTX przeprowadzono również na kontigach innych niż własne, stosując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e <1e-10 i 60% homologii).Pule BLASTN i BLASTX nie-samokontigów reprezentują końcowe kontigi (patrz plik uzupełniający).
Startery użyte do PCR wymieniono w tabeli S1.Polimerazę Taq DNA (Bio Basic Canada, Markham, ON) zastosowano do amplifikacji docelowych genów ccfDNA.Zastosowano następujące warunki reakcji: denaturacja w 95°C przez 3 minuty, 95°C przez 1 minutę, ustalona temperatura hybrydyzacji przez 1 minutę, wydłużanie w 72°C przez 1 minutę, 35 cykli i na koniec 72°C w ciągu 10 minut..Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę w żelach agarozowych (1,5%) zawierających SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) przy 95 V.
Małże (Mytilus spp.) aklimatyzowano w 500 ml natlenionej wody morskiej (32 PSU) przez 24 godziny w temperaturze 4°C.Do fiolki dodano plazmidowy DNA zawierający wstawkę kodującą sekwencję cDNA ludzkiej galektyny-7 (numer dostępu NCBI L07769) w końcowym stężeniu 190 μg/μl.Kontrolę stanowiły małże inkubowane w tych samych warunkach bez dodatku DNA.Trzeci zbiornik kontrolny zawierał DNA bez małży.Aby monitorować jakość DNA w wodzie morskiej, próbki wody morskiej (20 μl; trzy powtórzenia) pobrano z każdego zbiornika we wskazanym czasie.W celu śledzenia plazmidowego DNA, małże LB zbierano we wskazanych czasach i analizowano za pomocą qPCR i ddPCR.Ze względu na wysoką zawartość soli w wodzie morskiej porcje rozcieńczono w wodzie o jakości PCR (1:10) przed wszystkimi testami PCR.
Cyfrowy PCR na kroplach (ddPCR) przeprowadzono przy użyciu protokołu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Użyj profilu temperaturowego, aby określić optymalną temperaturę (tabela S1).Krople generowano przy użyciu generatora kropel QX200 (BioRad).ddPCR przeprowadzono w następujący sposób: 95°C przez 5 min, 50 cykli w 95°C przez 30 s i zadaną temperaturę hybrydyzacji przez 1 min i 72°C przez 30 s, 4°C przez 5 min i 90°C w ciągu 5 minut.Liczbę kropli i pozytywne reakcje (liczbę kopii/µl) mierzono za pomocą czytnika kropli QX200 (BioRad).Próbki zawierające mniej niż 10 000 kropelek zostały odrzucone.Kontrola wzoru nie była wykonywana za każdym razem, gdy uruchamiano ddPCR.
qPCR przeprowadzono przy użyciu starterów specyficznych dla Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) i LGALS7.Wszystkie ilościowe PCR przeprowadzono w 20 µl przy użyciu zestawu QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR rozpoczęto od 15-minutowej inkubacji w 95°C, po której następowało 40 cykli w 95°C przez 10 sekund iw 60°C przez 60 sekund z jednym zbiorem danych.Krzywe topnienia wygenerowano stosując kolejne pomiary w 95°C przez 5 s, 65°C przez 60 s i 97°C na końcu qPCR.Każdy qPCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach, z wyjątkiem próbek kontrolnych.
Ponieważ małże są znane z wysokiej szybkości filtracji, najpierw zbadaliśmy, czy mogą filtrować i zatrzymywać fragmenty DNA obecne w wodzie morskiej.Interesowało nas również, czy te fragmenty gromadzą się w ich półotwartym układzie limfatycznym.Rozwiązaliśmy ten problem eksperymentalnie, śledząc losy rozpuszczalnych fragmentów DNA dodanych do zbiorników z omułkami.Aby ułatwić śledzenie fragmentów DNA, użyliśmy obcego (nie własnego) plazmidowego DNA zawierającego ludzki gen galektyny-7.ddPCR śledzi fragmenty plazmidowego DNA w wodzie morskiej i małżach.Nasze wyniki pokazują, że jeśli ilość fragmentów DNA w wodzie morskiej pozostawała względnie stała w czasie (do 7 dni) pod nieobecność małży, to w obecności małży poziom ten prawie całkowicie zniknął w ciągu 8 godzin (ryc. 1a, b).Fragmenty egzogennego DNA można było łatwo wykryć w ciągu 15 minut w płynie międzyzastawkowym i hemolimfie (ryc. 1c).Fragmenty te można było wykryć do 4 godzin po ekspozycji.Ta aktywność filtracyjna w stosunku do fragmentów DNA jest porównywalna z aktywnością filtracyjną bakterii i alg [31].Wyniki te sugerują, że małże mogą filtrować i gromadzić obce DNA w swoich przedziałach płynowych.
Względne stężenia plazmidowego DNA w wodzie morskiej w obecności (A) lub nieobecności (B) małży, mierzone metodą ddPCR.W A wyniki wyrażono w procentach, przy czym krawędzie pól reprezentują 75. i 25. percentyl.Dopasowana krzywa logarytmiczna jest pokazana na czerwono, a obszar zacieniony na szaro reprezentuje 95% przedział ufności.W B czerwona linia reprezentuje średnią, a niebieska linia reprezentuje 95% przedział ufności dla stężenia.C Nagromadzenie plazmidowego DNA w hemolimfie i płynie zastawkowym małży w różnym czasie po dodaniu plazmidowego DNA.Wyniki przedstawiono jako bezwzględne wykryte kopie/ml (±SE).
Następnie zbadaliśmy pochodzenie ccfDNA w małżach zebranych z pokładów małży na Wyspach Kerguelena, odległej grupie wysp o ograniczonym wpływie antropogenicznym.W tym celu cccDNA z hemolimf małży zostało wyizolowane i oczyszczone metodami powszechnie stosowanymi do oczyszczania ludzkiego cccDNA [32, 33].Stwierdziliśmy, że średnie stężenia ccfDNA hemolimfy w małżach mieszczą się w niskich mikrogramach na ml zakresu hemolimfy (patrz Tabela S2, Informacje dodatkowe).Ten zakres stężeń jest znacznie większy niż u osób zdrowych (niskie nanogramy na mililitr), ale w rzadkich przypadkach, u chorych na raka, poziom ccfDNA może sięgać kilku mikrogramów na mililitr [34, 35].Analiza rozkładu wielkości ccfDNA hemolimfy wykazała, że ​​fragmenty te różnią się znacznie pod względem wielkości, w zakresie od 1000 pz do 1000 pz.do 5000 pz (ryc. 2).Podobne wyniki uzyskano przy użyciu opartego na krzemionce zestawu QIAamp Investigator Kit, metody powszechnie stosowanej w kryminalistyce do szybkiego izolowania i oczyszczania genomowego DNA z próbek DNA o niskim stężeniu, w tym ccfDNA [36].
Reprezentatywny elektroforegram ccfDNA hemolimfy małży.Ekstrakcja za pomocą zestawu NucleoSnap Plasma Kit (u góry) i zestawu QIAamp DNA Investigator.B Wykres skrzypcowy przedstawiający rozkład stężeń ccfDNA hemolimfy (± SE) w małżach.Czarne i czerwone linie reprezentują odpowiednio medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl.
Około 1% ccfDNA u ludzi i naczelnych ma obce źródło [21, 37].Biorąc pod uwagę półotwarty układ krążenia małży, bogatą w mikroorganizmy wodę morską i rozkład wielkości ccfDNA małży, postawiliśmy hipotezę, że ccfDNA hemolimfy małży może zawierać bogatą i zróżnicowaną pulę DNA drobnoustrojów.Aby przetestować tę hipotezę, zsekwencjonowaliśmy ccfDNA hemolimfy z próbek Aulacomya atra pobranych z Wysp Kerguelena, uzyskując ponad 10 milionów odczytów, z których 97,6% przeszło kontrolę jakości.Odczyty zostały następnie sklasyfikowane według własnych i obcych źródeł przy użyciu baz danych małży BLASTN i NCBI (ryc. S1, informacje uzupełniające).
U ludzi zarówno jądrowe, jak i mitochondrialne DNA mogą być uwalniane do krwioobiegu [38].Jednak w niniejszym badaniu nie było możliwe szczegółowe opisanie jądrowego genomowego DNA małży, biorąc pod uwagę, że genom A. atra nie został zsekwencjonowany ani opisany.Byliśmy jednak w stanie zidentyfikować szereg fragmentów ccfDNA naszego własnego pochodzenia, korzystając z biblioteki małży (ryc. S2, informacje uzupełniające).Potwierdziliśmy również obecność fragmentów DNA naszego własnego pochodzenia przez ukierunkowaną amplifikację PCR tych genów A. atra, które zostały zsekwencjonowane (ryc. 3).Podobnie, biorąc pod uwagę, że genom mitochondrialny A. atra jest dostępny w publicznych bazach danych, można znaleźć dowody na obecność mitochondrialnych fragmentów ccfDNA w hemolimfie A. atra.Obecność fragmentów mitochondrialnego DNA potwierdzono przez amplifikację PCR (ryc. 3).
Różne geny mitochondrialne były obecne w hemolimfie A. atra (czerwone kropki – numer katalogowy: SRX5705969) i M. platensis (niebieskie kropki – numer katalogowy: SRX5705968) zamplifikowane metodą PCR.Rysunek na podstawie Breton et al., 2011 B. Amplifikacja supernatantu hemolimfy z A. atra Przechowywane na papierze FTA.Użyj dziurkacza 3 mm, aby dodać bezpośrednio do probówki PCR zawierającej mieszaninę PCR.
Biorąc pod uwagę obfitą zawartość drobnoustrojów w wodzie morskiej, początkowo skupiliśmy się na charakterystyce sekwencji DNA drobnoustrojów w hemolimfie.W tym celu stosujemy dwie różne strategie.Pierwsza strategia wykorzystywała Kraken2, oparty na algorytmie program do klasyfikacji sekwencji, który może identyfikować sekwencje drobnoustrojów z dokładnością porównywalną z BLAST i innymi narzędziami [28].Ustalono, że ponad 6719 odczytów ma pochodzenie bakteryjne, podczas gdy 124 i 64 pochodziły odpowiednio z archeonów i wirusów (ryc. 4).Najobficiej występującymi bakteryjnymi fragmentami DNA były Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (ryc. 4a).Ten rozkład jest zgodny z wcześniejszymi badaniami mikrobiomu omułka morskiego [39, 40].Gammaproteobacteria były główną klasą Proteobacteria (44%), w tym wiele Vibrionales (ryc. 4b).Metoda ddPCR potwierdziła obecność fragmentów DNA Vibrio w ccfDNA hemolimfy A. atra (ryc. 4c) [41].Aby uzyskać więcej informacji na temat bakteryjnego pochodzenia ccfDNA, zastosowano dodatkowe podejście (ryc. S2, informacje uzupełniające). W tym przypadku odczyty, które zachodziły na siebie, zostały zebrane jako odczyty ze sparowanymi końcami i zostały sklasyfikowane jako własne (małże) lub obce za pomocą BLASTN i wartości e 1e-3 oraz odcięcia z homologią> 90%. W tym przypadku odczyty, które zachodziły na siebie, zostały zebrane jako odczyty ze sparowanymi końcami i zostały sklasyfikowane jako własne (małże) lub obce za pomocą BLASTN i wartości e 1e-3 oraz odcięcia z homologią> 90%. В эtom случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифициров ​​аны как собственные (двустворчатые моллюски) lub чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e -3 i отсечения с гомологией> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zebrano jako odczyty zakończone parami i sklasyfikowano jako natywne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu wartości BLASTN i e 1e-3 oraz odcięcia z homologią> 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В эtom случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы ка к собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN i 1e- 3 i порога гомологии> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zostały zebrane jako odczyty zakończone parami i sklasyfikowane jako własne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu wartości e BLASTN i 1e-3 oraz progu homologii> 90%.Ponieważ genom A. atra nie został jeszcze zsekwencjonowany, zastosowaliśmy strategię składania de novo asemblera MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).W sumie 147 188 kontigów zostało zidentyfikowanych jako zależne (małże) pochodzenia.Te kontigi zostały następnie eksplodowane z e-wartościami 1e-10 przy użyciu BLASTN i BLASTX.Ta strategia pozwoliła nam zidentyfikować 482 fragmenty inne niż małże obecne w A. atra ccfDNA.Ponad połowę (57%) tych fragmentów DNA uzyskano z bakterii, głównie z symbiontów skrzelowych, w tym symbiontów sulfotroficznych, oraz z symbiontów skrzelowych Solemya velum (ryc. 5).
Względna obfitość na poziomie typu.B Różnorodność drobnoustrojów dwóch głównych typów (Firmicutes i Proteobacteria).Reprezentatywna amplifikacja ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenty genu 16S rRNA (niebieskie) w trzech hemolimfach atra.
W sumie przeanalizowano 482 zebrane kontigi.Ogólny profil rozmieszczenia taksonomicznego adnotacji metagenomicznych kontigów (prokarionty i eukarionty).B Szczegółowa dystrybucja bakteryjnych fragmentów DNA zidentyfikowanych przez BLASTN i BLASTX.
Analiza Kraken2 wykazała również, że ccfDNA małży zawiera fragmenty DNA archeonów, w tym fragmenty DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (ryc. 6a).Obecność fragmentów DNA pochodzących z Euryarchaeota i Crenarchaeota, znalezionych wcześniej w społeczności drobnoustrojów małży kalifornijskich, nie powinna dziwić [42].Chociaż Euryarchaeota jest często kojarzona z ekstremalnymi warunkami, obecnie uznaje się, że zarówno Euryarchaeota, jak i Crenarcheota należą do najczęstszych prokariotów w morskim środowisku kriogenicznym [43, 44].Obecność mikroorganizmów metanogennych w małżach nie jest zaskakująca, biorąc pod uwagę ostatnie doniesienia o rozległych wyciekach metanu z wycieków dennych na płaskowyżu Kerguelena [45] i możliwej produkcji metanu przez drobnoustroje obserwowanej u wybrzeży Wysp Kerguelena [46].
Następnie nasza uwaga przeniosła się na odczyty z wirusów DNA.Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwsze niecelowe badanie zawartości wirusów w małżach.Zgodnie z oczekiwaniami znaleźliśmy fragmenty DNA bakteriofagów (Caudovirales) (ryc. 6b).Jednak najczęstszy wirusowy DNA pochodzi z typu nukleocytowirusów, znanego również jako jądrowy cytoplazmatyczny duży wirus DNA (NCLDV), który ma największy genom ze wszystkich wirusów.W ramach tego typu większość sekwencji DNA należy do rodzin Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), których naturalnymi żywicielami są kręgowce i stawonogi, podczas gdy niewielka część tych sekwencji DNA należy do znanych alg wirusologicznych.Zakaża morskie glony eukariotyczne.Sekwencje uzyskano również z wirusa Pandora, gigantycznego wirusa o największym rozmiarze genomu ze wszystkich znanych rodzajów wirusów.Co ciekawe, zakres gospodarzy, o których wiadomo, że są zakażeni wirusem, określony przez sekwencjonowanie ccfDNA hemolimfy, był stosunkowo duży (rysunek S3, informacje uzupełniające).Obejmuje wirusy infekujące owady, takie jak Baculoviridae i Iridoviridae, a także wirusy infekujące ameby, glony i kręgowce.Znaleźliśmy również sekwencje pasujące do genomu Pithovirus sibericum.Pitowirusy (znane również jako „wirusy zombie”) zostały po raz pierwszy wyizolowane z wiecznej zmarzliny sprzed 30 000 lat na Syberii [47].Zatem nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami pokazującymi, że nie wszystkie współczesne gatunki tych wirusów wymarły [48] i że wirusy te mogą być obecne w odległych subarktycznych ekosystemach morskich.
Na koniec sprawdziliśmy, czy uda nam się znaleźć fragmenty DNA innych zwierząt wielokomórkowych.W sumie 482 obce kontigi zidentyfikowano za pomocą BLASTN i BLASTX z bibliotekami nt, nr i RefSeq (genomową i białkową).Nasze wyniki pokazują, że wśród obcych fragmentów ccfDNA zwierząt wielokomórkowych przeważa DNA kości kostnych (ryc. 5).Znaleziono również fragmenty DNA owadów i innych gatunków.Stosunkowo duża część fragmentów DNA nie została zidentyfikowana, prawdopodobnie ze względu na niedostateczną reprezentację dużej liczby gatunków morskich w genomicznych bazach danych w porównaniu z gatunkami lądowymi [49].
W niniejszym artykule stosujemy koncepcję LB do małży, argumentując, że sekwencjonowanie strzału ccfDNA hemolimfy może zapewnić wgląd w skład morskich ekosystemów przybrzeżnych.W szczególności odkryliśmy, że 1) hemolimfa małża zawiera stosunkowo wysokie stężenia (mikrogramowe poziomy) stosunkowo dużych (~1-5 kb) krążących fragmentów DNA;2) te fragmenty DNA są zarówno niezależne, jak i nie-niezależne. 3) Wśród zagranicznych źródeł tych fragmentów DNA znaleźliśmy DNA bakterii, archeonów i wirusów, a także DNA innych zwierząt wielokomórkowych;4) Nagromadzenie tych obcych fragmentów ccfDNA w hemolimfie następuje szybko i przyczynia się do wewnętrznej aktywności filtracyjnej małży.Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcja LB, która była dotychczas stosowana głównie w dziedzinie biomedycyny, zawiera bogate, ale niezbadane źródło wiedzy, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia interakcji między gatunkami wartowniczymi a ich środowiskiem.
Oprócz naczelnych, izolację ccfDNA opisano u ssaków, w tym myszy, psów, kotów i koni [50, 51, 52].Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, nasze badanie jest pierwszym, w którym opisano wykrywanie i sekwencjonowanie ccfDNA u gatunków morskich z otwartym systemem krążenia.Ta cecha anatomiczna i zdolność filtrowania małży może przynajmniej częściowo wyjaśniać różne cechy wielkości krążących fragmentów DNA w porównaniu z innymi gatunkami.U ludzi większość fragmentów DNA krążących we krwi to małe fragmenty o wielkości od 150 do 200 pz.z maksymalnym pikiem 167 pz [34, 53].Niewielka, ale znacząca część fragmentów DNA ma wielkość od 300 do 500 pz, a około 5% jest dłuższa niż 900 pz.[54].Powodem tego rozkładu wielkości jest to, że główne źródło ccfDNA w osoczu występuje w wyniku śmierci komórki, albo z powodu śmierci komórki, albo z powodu martwicy krążących komórek krwiotwórczych u zdrowych osób lub z powodu apoptozy komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem (znany jako krążący DNA guza)., ctDNA).Rozkład wielkości ccfDNA hemolimfy, który znaleźliśmy w małżach, wahał się od 1000 do 5000 pz, co sugeruje, że ccfDNA małży ma inne pochodzenie.Jest to logiczna hipoteza, ponieważ małże mają półotwarty układ naczyniowy i żyją w morskich środowiskach wodnych zawierających wysokie stężenia genomowego DNA drobnoustrojów.W rzeczywistości nasze eksperymenty laboratoryjne z wykorzystaniem egzogennego DNA wykazały, że omułki akumulują fragmenty DNA w wodzie morskiej, przynajmniej po kilku godzinach ulegają degradacji po wchłonięciu przez komórki i/lub są uwalniane i/lub przechowywane w różnych organizacjach.Biorąc pod uwagę rzadkość występowania komórek (zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych), zastosowanie przedziałów międzyzastawkowych zmniejszy ilość ccfDNA pochodzącego zarówno ze źródeł własnych, jak i obcych.Biorąc pod uwagę znaczenie wrodzonej odporności małży i dużą liczbę krążących fagocytów, postawiliśmy dalej hipotezę, że nawet obcy ccfDNA jest wzbogacony w krążące fagocyty, które gromadzą obcy DNA po spożyciu mikroorganizmów i / lub resztek komórkowych.Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że ccfDNA hemolimfy małży jest unikalnym repozytorium informacji molekularnych i wzmacnia ich status jako gatunku wartowniczego.
Nasze dane wskazują, że sekwencjonowanie i analiza fragmentów ccfDNA pochodzących z hemolimfy bakteryjnej może dostarczyć kluczowych informacji na temat flory bakteryjnej gospodarza i bakterii obecnych w otaczającym ekosystemie morskim.Techniki sekwencjonowania strzałowego ujawniły sekwencje bakterii komensalnych A. atra gill, które zostałyby pominięte, gdyby zastosowano konwencjonalne metody identyfikacji 16S rRNA, częściowo z powodu błędu biblioteki referencyjnej.W rzeczywistości nasze wykorzystanie danych LB zebranych z M. platensis w tej samej warstwie małży w Kerguelen wykazało, że skład symbiontów bakteryjnych związanych ze skrzelami był taki sam dla obu gatunków małży (ryc. S4, informacje uzupełniające).To podobieństwo dwóch genetycznie różnych małży może odzwierciedlać skład społeczności bakterii w zimnych, siarkowych i wulkanicznych osadach Kerguelen [55, 56, 57, 58].Wyższe poziomy mikroorganizmów redukujących siarkę zostały dobrze opisane podczas zbierania małży z bioturbowanych obszarów przybrzeżnych [59], takich jak wybrzeże Port-au-France.Inną możliwością jest wpływ transmisji poziomej na komensalną florę małży [60, 61].Potrzebne są dalsze badania, aby określić korelację między środowiskiem morskim, powierzchnią dna morskiego i składem bakterii symbiotycznych w małżach.Badania te są obecnie w toku.
Długość i stężenie ccfDNA hemolimfy, łatwość jego oczyszczania i wysoka jakość umożliwiająca szybkie sekwencjonowanie strzelby to tylko niektóre z wielu zalet wykorzystania ccfDNA małży do oceny różnorodności biologicznej w morskich ekosystemach przybrzeżnych.Podejście to jest szczególnie skuteczne przy charakteryzowaniu zbiorowisk wirusowych (wiromów) w danym ekosystemie [62, 63].W przeciwieństwie do bakterii, archeonów i eukariontów, genomy wirusowe nie zawierają filogenetycznie konserwatywnych genów, takich jak sekwencje 16S.Nasze wyniki wskazują, że płynne biopsje gatunków wskaźnikowych, takich jak małże, można wykorzystać do identyfikacji stosunkowo dużej liczby fragmentów wirusa ccfDNA, o których wiadomo, że infekują żywicieli, którzy zazwyczaj zamieszkują przybrzeżne ekosystemy morskie.Obejmuje to wirusy, o których wiadomo, że infekują pierwotniaki, stawonogi, owady, rośliny i wirusy bakteryjne (np. bakteriofagi).Podobny rozkład stwierdzono, gdy zbadaliśmy wirom ccfDNA hemolimfy małży błękitnych ( M. platensis ) zebranych w tej samej warstwie małży w Kerguelen (tabela S2, informacje uzupełniające).Sekwencjonowanie shotgun ccfDNA jest rzeczywiście nowym podejściem, które nabiera rozpędu w badaniach wiromu ludzi lub innych gatunków [21, 37, 64].To podejście jest szczególnie przydatne do badania wirusów z dwuniciowym DNA, ponieważ żaden pojedynczy gen nie jest konserwowany wśród wszystkich wirusów z dwuniciowym DNA, reprezentujących najbardziej zróżnicowaną i najszerszą klasę wirusów w Baltimore [65].Chociaż większość z tych wirusów pozostaje niesklasyfikowana i mogą obejmować wirusy z całkowicie nieznanej części świata wirusów [66], odkryliśmy, że wiromy i zakresy żywicieli małży A. atra i M. platensis mieszczą się między tymi dwoma gatunkami.podobnie (patrz rysunek S3, dodatkowe informacje).To podobieństwo nie jest zaskakujące, ponieważ może odzwierciedlać brak selektywności w pobieraniu DNA obecnego w środowisku.Przyszłe badania z użyciem oczyszczonego RNA są obecnie potrzebne do scharakteryzowania wiromu RNA.
W naszym badaniu wykorzystaliśmy bardzo rygorystyczny rurociąg zaadaptowany z pracy Kowarskiego i współpracowników [37], którzy zastosowali dwuetapowe usuwanie połączonych odczytów i kontigów przed i po złożeniu natywnego ccfDNA, co skutkowało wysokim odsetkiem niezmapowanych odczytów.Dlatego nie możemy wykluczyć, że niektóre z tych niezmapowanych odczytów mogą nadal mieć własne pochodzenie, przede wszystkim dlatego, że nie mamy genomu odniesienia dla tego gatunku małży.Użyliśmy również tego potoku, ponieważ byliśmy zaniepokojeni chimerami między odczytami własnymi i obcymi oraz długościami odczytu generowanymi przez Illumina MiSeq PE75.Innym powodem większości niezbadanych odczytów jest to, że wiele drobnoustrojów morskich, zwłaszcza w odległych obszarach, takich jak Kerguelen, nie zostało opisanych.Użyliśmy Illumina MiSeq PE75, zakładając długość fragmentu ccfDNA podobną do ludzkiego ccfDNA.W przypadku przyszłych badań, biorąc pod uwagę nasze wyniki pokazujące, że ccfDNA hemolimfy ma dłuższe odczyty niż ludzie i / lub ssaki, zalecamy użycie platformy do sekwencjonowania bardziej odpowiedniej dla dłuższych fragmentów ccfDNA.Ta praktyka znacznie ułatwi identyfikację większej liczby wskazań do głębszej analizy.Uzyskanie obecnie niedostępnej kompletnej sekwencji genomu jądrowego A. atra znacznie ułatwiłoby również rozróżnienie ccfDNA ze źródeł własnych i obcych.Biorąc pod uwagę, że nasze badania koncentrowały się na możliwości zastosowania koncepcji płynnej biopsji do małży, mamy nadzieję, że w miarę wykorzystywania tej koncepcji w przyszłych badaniach zostaną opracowane nowe narzędzia i rurociągi, aby zwiększyć potencjał tej metody do badania różnorodności mikrobiologicznej małży.ekosystem morski.
Jako nieinwazyjny biomarker kliniczny, podwyższone poziomy ccfDNA w ludzkim osoczu są związane z różnymi chorobami, uszkodzeniami tkanek i stanami stresowymi [67,68,69].Wzrost ten jest związany z uwalnianiem fragmentów DNA własnego pochodzenia po uszkodzeniu tkanki.Zajęliśmy się tym problemem za pomocą ostrego stresu cieplnego, w którym małże były krótko wystawiane na temperaturę 30 ° C.Przeprowadziliśmy tę analizę na trzech różnych rodzajach małży w trzech niezależnych eksperymentach.Jednak nie znaleźliśmy żadnej zmiany poziomów ccfDNA po ostrym stresie cieplnym (patrz Rysunek S5, dodatkowe informacje).To odkrycie może przynajmniej częściowo wyjaśniać fakt, że małże mają półotwarty układ krążenia i gromadzą duże ilości obcego DNA ze względu na ich wysoką aktywność filtracyjną.Z drugiej strony małże, podobnie jak wiele bezkręgowców, mogą być bardziej odporne na uszkodzenia tkanek wywołane stresem, co ogranicza uwalnianie ccfDNA w ich hemolimfie [70, 71].
Do tej pory analiza DNA różnorodności biologicznej w ekosystemach wodnych koncentrowała się głównie na metabarkodzie środowiskowego DNA (eDNA).Jednak ta metoda jest zwykle ograniczona w analizie różnorodności biologicznej, gdy stosowane są startery.Zastosowanie sekwencjonowania shotgun pozwala obejść ograniczenia PCR i tendencyjny wybór zestawów starterów.Tym samym w pewnym sensie nasza metoda jest bliższa niedawno stosowanej wysokowydajnej metodzie sekwencjonowania eDNA Shotgun, która jest w stanie bezpośrednio sekwencjonować pofragmentowane DNA i analizować prawie wszystkie organizmy [72, 73].Istnieje jednak szereg fundamentalnych kwestii, które odróżniają LB od standardowych metod eDNA.Oczywiście główną różnicą między eDNA a LB jest wykorzystanie naturalnych gospodarzy filtrów.Opisano wykorzystanie gatunków morskich, takich jak gąbki i małże (Dresseina spp.) jako naturalnego filtra do badania eDNA [74, 75].Jednak w badaniu Dreisseny wykorzystano biopsje tkanek, z których wyekstrahowano DNA.Analiza ccfDNA z LB nie wymaga biopsji tkanki, specjalistycznego i czasem drogiego sprzętu oraz logistyki związanej z eDNA czy biopsją tkanki.W rzeczywistości ostatnio informowaliśmy, że ccfDNA z LB można przechowywać i analizować przy wsparciu FTA bez utrzymywania łańcucha chłodniczego, co jest głównym wyzwaniem dla badań w odległych obszarach [76].Ekstrakcja ccfDNA z płynnych biopsji jest również prosta i zapewnia wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania shotgun i analizy PCR.Jest to ogromna zaleta, biorąc pod uwagę niektóre ograniczenia techniczne związane z analizą eDNA [77].Prostota i niski koszt metody pobierania próbek są również szczególnie przydatne w przypadku długoterminowych programów monitorowania.Oprócz ich wysokiej zdolności filtrowania, inną dobrze znaną cechą małży jest skład chemiczny mukopolisacharydów ich śluzu, który sprzyja wchłanianiu wirusów [78, 79].To sprawia, że ​​małże są idealnym naturalnym filtrem do charakteryzowania różnorodności biologicznej i wpływu zmian klimatu na dany ekosystem wodny.Chociaż obecność fragmentów DNA pochodzących od gospodarza może być postrzegana jako ograniczenie metody w porównaniu z eDNA, koszt związany z posiadaniem takiego natywnego ccfDNA w porównaniu z eDNA jest jednocześnie zrozumiały dla ogromnej ilości informacji dostępnych dla badań zdrowotnych.host offsetowy.Obejmuje to obecność sekwencji wirusowych zintegrowanych z genomem gospodarza-gospodarza.Jest to szczególnie ważne w przypadku małży, biorąc pod uwagę obecność retrowirusów białaczkowych przenoszonych poziomo u małży [80, 81].Kolejną zaletą LB w porównaniu z eDNA jest to, że wykorzystuje aktywność fagocytarną krążących krwinek w hemolimfie, która pochłania mikroorganizmy (i ich genomy).Główną funkcją komórek krwi u małży jest fagocytoza [82].Wreszcie, metoda wykorzystuje wysoką zdolność filtrowania małży (średnio 1,5 l/h wody morskiej) i dwudniową cyrkulację, co zwiększa mieszanie się różnych warstw wody morskiej, umożliwiając wychwytywanie heterologicznego eDNA.[83, 84].Zatem analiza ccfDNA małży jest interesującą drogą, biorąc pod uwagę żywieniowy, ekonomiczny i środowiskowy wpływ małży.Podobnie jak analiza LB pobranego od ludzi, metoda ta otwiera również możliwość pomiaru zmian genetycznych i epigenetycznych w DNA gospodarza w odpowiedzi na substancje egzogenne.Na przykład można przewidzieć technologie sekwencjonowania trzeciej generacji do przeprowadzania analizy metylacji całego genomu w natywnym ccfDNA przy użyciu sekwencjonowania nanoporów.Proces ten powinien być ułatwiony przez fakt, że długość fragmentów ccfDNA małży jest idealnie kompatybilna z platformami sekwencjonowania o długim czasie odczytu, które umożliwiają analizę metylacji DNA całego genomu z pojedynczego przebiegu sekwencjonowania bez potrzeby transformacji chemicznych.85,86] Jest to interesująca możliwość, ponieważ wykazano, że wzorce metylacji DNA odzwierciedlają reakcję na stres środowiskowy i utrzymują się przez wiele pokoleń.Dlatego może dostarczyć cennego wglądu w podstawowe mechanizmy rządzące reakcją po narażeniu na zmianę klimatu lub zanieczyszczenia [87].Jednak użycie LB nie jest bez ograniczeń.Nie trzeba dodawać, że wymaga to obecności gatunków wskaźnikowych w ekosystemie.Jak wspomniano powyżej, wykorzystanie LB do oceny różnorodności biologicznej danego ekosystemu wymaga również rygorystycznego rurociągu bioinformatycznego, który uwzględnia obecność fragmentów DNA ze źródła.Innym poważnym problemem jest dostępność genomów referencyjnych dla gatunków morskich.Oczekuje się, że inicjatywy takie jak Marine Mammal Genomes Project i niedawno utworzony projekt Fish10k [88] ułatwią taką analizę w przyszłości.Zastosowanie koncepcji LB do morskich organizmów filtrujących jest również zgodne z najnowszymi postępami w technologii sekwencjonowania, dzięki czemu dobrze nadaje się do opracowywania biomarkerów wieloomowych w celu dostarczenia ważnych informacji o stanie siedlisk morskich w odpowiedzi na stres środowiskowy.
Dane sekwencjonowania genomu zostały zdeponowane w Archiwum odczytu sekwencji NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Wpływ zmian klimatu na życie morskie i ekosystemy.Biologia Cole'a.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Rozważ połączony wpływ zmiany klimatu i innych lokalnych czynników stresogennych na środowisko morskie.ogólne środowisko naukowe.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P i in.).Nauka pierwszego marca.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Zmniejszona tolerancja na ciepło w powtarzających się warunkach stresu cieplnego wyjaśnia wysoką śmiertelność omułków w okresie letnim.Raport naukowy 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER i in.Ostatnie zmiany w częstotliwości, przyczynach i zakresie śmierci zwierząt.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S i in.Wiele niespecyficznych dla gatunku patogenów mogło powodować masową śmiertelność Pinna nobilis.Życie.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potencjalny wpływ zmian klimatu na arktyczne choroby odzwierzęce.Int J Zdrowie okołobiegunowe.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Omułki błękitne (Mytilus edulis spp.) jako organizmy sygnałowe w monitorowaniu zanieczyszczeń przybrzeżnych: przegląd.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracja płynnej biopsji w leczeniu raka.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C i in.Dojrzewanie płynnej biopsji: Umożliwia krążenie DNA guza.Rak Nat Rev.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Kwasy nukleinowe w ludzkim osoczu.Protokoły z posiedzeń spółek zależnych Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nowa rola bezkomórkowego DNA jako markera molekularnego w leczeniu raka.Kwantyfikacja analizy biomolarnej.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Płynna biopsja wkracza do kliniki – problemy z wdrożeniem i przyszłe wyzwania.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i inni.DNA płodu jest obecne w osoczu i surowicy matki.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Badanie przebiegu ciąży i jej powikłań z wykorzystaniem krążącego pozakomórkowego RNA we krwi kobiet w ciąży.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J i in.Płynna biopsja: do wykrywania allogenicznych zmian w przeszczepie nerki stosuje się DNA z komórek dawcy.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innowacje w diagnostyce prenatalnej: sekwencjonowanie genomu osocza matki.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D i in.Szybkie wykrywanie patogenów dzięki sekwencjonowaniu metagenomicznemu nowej generacji zakażonych płynów ustrojowych.Medycyna naturalna.2021;27:115-24.