Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Biopsja płynna (LB) to koncepcja, która szybko zyskuje na popularności w dziedzinie biomedycyny. Koncepcja ta opiera się głównie na wykrywaniu fragmentów krążącego pozakomórkowego DNA (ccfDNA), które są uwalniane głównie jako małe fragmenty po śmierci komórek w różnych tkankach. Niewielka część tych fragmentów pochodzi z obcych (obcych) tkanek lub organizmów. W obecnej pracy zastosowaliśmy tę koncepcję do małży, gatunku strażniczego znanego z wysokiej zdolności filtracji wody morskiej. Wykorzystujemy zdolność małży do działania jako naturalne filtry do wychwytywania fragmentów DNA środowiskowego z różnych źródeł, aby dostarczać informacji o bioróżnorodności morskich ekosystemów przybrzeżnych. Nasze wyniki pokazują, że hemolimfa małży zawiera fragmenty DNA, które różnią się znacznie pod względem wielkości, od 1 do 5 kb. Sekwencjonowanie shotgun wykazało, że duża liczba fragmentów DNA ma obce pochodzenie mikrobiologiczne. Wśród nich znaleźliśmy fragmenty DNA bakterii, archeonów i wirusów, w tym wirusów, o których wiadomo, że zakażają wiele żywicieli powszechnie występujących w przybrzeżnych ekosystemach morskich. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcja LB zastosowana do małży stanowi bogate, ale jak dotąd niezbadane źródło wiedzy na temat różnorodności mikrobiologicznej w przybrzeżnych ekosystemach morskich.
Wpływ zmian klimatu (CC) na bioróżnorodność ekosystemów morskich to szybko rozwijający się obszar badań. Globalne ocieplenie nie tylko powoduje istotne stresy fizjologiczne, ale także przesuwa granice ewolucyjne stabilności termicznej organizmów morskich, wpływając na siedliska wielu gatunków, skłaniając je do poszukiwania bardziej sprzyjających warunków [1, 2]. Oprócz wpływu na bioróżnorodność organizmów wielokomórkowych, CC zaburza delikatną równowagę interakcji żywiciel-mikrob. Ta dysbakterioza mikrobiologiczna stanowi poważne zagrożenie dla ekosystemów morskich, ponieważ sprawia, że ​​organizmy morskie są bardziej podatne na patogeny zakaźne [3, 4]. Uważa się, że SS odgrywają ważną rolę w masowych zgonach, co stanowi poważny problem dla zarządzania globalnymi ekosystemami morskimi [5, 6]. Jest to ważna kwestia, biorąc pod uwagę skutki ekonomiczne, ekologiczne i odżywcze wielu gatunków morskich. Dotyczy to zwłaszcza małży żyjących w regionach polarnych, gdzie skutki CK są bardziej natychmiastowe i dotkliwe [6, 7]. W rzeczywistości małże takie jak Mytilus spp. są szeroko stosowane do monitorowania wpływu CC na ekosystemy morskie. Nic dziwnego, że opracowano stosunkowo dużą liczbę biomarkerów do monitorowania ich zdrowia, często stosując dwustopniowe podejście obejmujące funkcjonalne biomarkery oparte na aktywności enzymatycznej lub funkcjach komórkowych, takich jak żywotność komórek i aktywność fagocytarna [8]. Metody te obejmują również pomiar stężenia specyficznych wskaźników ciśnienia, które gromadzą się w tkankach miękkich po wchłonięciu dużych ilości wody morskiej. Jednak wysoka zdolność filtracji i półotwarty układ krążenia małży dają możliwość opracowania nowych biomarkerów hemolimfy przy użyciu koncepcji biopsji płynnej (LB), prostego i mało inwazyjnego podejścia do leczenia pacjentów. próbki krwi [9, 10]. Chociaż w ludzkiej LB można znaleźć kilka rodzajów krążących cząsteczek, koncepcja ta opiera się przede wszystkim na analizie sekwencjonowania DNA krążących fragmentów pozakomórkowego DNA (ccfDNA) w osoczu. W rzeczywistości obecność krążącego DNA w osoczu ludzkim jest znana od połowy XX wieku [11], ale dopiero w ostatnich latach pojawienie się metod sekwencjonowania o wysokiej przepustowości doprowadziło do diagnozy klinicznej opartej na ccfDNA. Obecność tych krążących fragmentów DNA jest częściowo spowodowana pasywnym uwalnianiem genomowego DNA (jądrowego i mitochondrialnego) po śmierci komórki. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, powodując uszkodzenie tkanek. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, powodując uszkodzenie tkanek. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/ml), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. U zdrowych osób stężenie cccDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale u pacjentów z różnymi patologiami lub poddanych stresowi może wzrosnąć 5–10-krotnie, co prowadzi do uszkodzenia tkanek.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低(<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены w 5-10 miesięcy пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Stężenia ccfDNA są zazwyczaj niskie (<10 ng/ml) u zdrowych osób, mogą jednak wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów z różnymi patologiami lub narażonych na stres, powodując uszkodzenie tkanek.Wielkość fragmentów ccfDNA jest bardzo zróżnicowana, ale zwykle mieści się w zakresie od 150 do 200 pb. [12]. Analiza ccfDNA pochodzącego od samego pacjenta, tj. ccfDNA z normalnych lub transformowanych komórek gospodarza, może być stosowana do wykrywania zmian genetycznych i epigenetycznych obecnych w genomie jądrowym i/lub mitochondrialnym, pomagając w ten sposób lekarzom w wyborze konkretnych terapii ukierunkowanych molekularnie [13]. Jednakże ccfDNA można uzyskać ze źródeł obcych, takich jak ccfDNA z komórek płodowych w czasie ciąży lub z przeszczepionych narządów [14,15,16,17]. ccfDNA jest również ważnym źródłem informacji do wykrywania obecności kwasów nukleinowych czynnika zakaźnego (obcego), co umożliwia nieinwazyjne wykrywanie szeroko rozpowszechnionych zakażeń nie zidentyfikowanych przez posiewy krwi, unikając inwazyjnej biopsji zakażonej tkanki [18]. Ostatnie badania rzeczywiście wykazały, że ludzka krew zawiera bogate źródło informacji, które można wykorzystać do identyfikacji patogenów wirusowych i bakteryjnych, a około 1% ccfDNA znalezionego w ludzkiej osoczu ma pochodzenie obce [19]. Badania te wykazują, że bioróżnorodność krążącego mikrobiomu organizmu można ocenić za pomocą analizy ccfDNA. Jednak do niedawna koncepcja ta była stosowana wyłącznie u ludzi i, w mniejszym stopniu, u innych kręgowców [20, 21].
W niniejszym artykule wykorzystujemy potencjał LB do analizy ccfDNA Aulacomya atra, południowego gatunku powszechnie występującego na subantarktycznych Wyspach Kerguelena, grupie wysp na szczycie dużego płaskowyżu, który powstał 35 milionów lat temu. erupcji wulkanu. Korzystając z eksperymentalnego systemu in vitro, odkryliśmy, że fragmenty DNA w wodzie morskiej są szybko wchłaniane przez małże i przedostają się do przedziału hemolimfy. Sekwencjonowanie metodą shotgun wykazało, że ccfDNA hemolimfy małży zawiera fragmenty DNA własnego i obcego pochodzenia, w tym symbiotyczne bakterie i fragmenty DNA z biomów typowych dla zimnych, wulkanicznych morskich ekosystemów przybrzeżnych. CCfDNA hemolimfy zawiera również sekwencje wirusowe pochodzące z wirusów o różnych zakresach żywicieli. Znaleźliśmy również fragmenty DNA zwierząt wielokomórkowych, takich jak ryby kostnoszkieletowe, ukwiały, glony i owady. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcję LB można z powodzeniem zastosować do bezkręgowców morskich w celu wygenerowania bogatego repertuaru genomowego w ekosystemach morskich.
Dorosłe osobniki (55-70 mm długości) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) zebrano z pływowych, skalistych brzegów Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Wyspy Kerguelena w grudniu 2018 r. Inne dorosłe małże (Mytilus spp.) uzyskano od komercyjnego dostawcy (PEI Mussel King Inc., Wyspa Księcia Edwarda, Kanada) i umieszczono w napowietrzanym zbiorniku o kontrolowanej temperaturze (4°C) zawierającym 10–20 l 32‰ sztucznej solanki. (sztuczna sól morska Reef Crystal, Instant Ocean, Wirginia, USA). W każdym eksperymencie mierzono długość i wagę poszczególnych muszli.
Bezpłatny protokół otwartego dostępu do tego programu jest dostępny online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). W skrócie, hemolimfa LB została pobrana z mięśni odwodzących, jak opisano [22]. Hemolimfa została sklarowana przez wirowanie przy 1200×g przez 3 minuty, a supernatant zamrożono (-20°C) do momentu użycia. W celu wyizolowania i oczyszczenia cfDNA próbki (1,5–2,0 ml) rozmrożono i przetworzono przy użyciu zestawu NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) zgodnie z instrukcją producenta. ccfDNA przechowywano w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. W niektórych eksperymentach ccfDNA zostało wyizolowane i oczyszczone przy użyciu zestawu QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Oczyszczone DNA zostało skwantyfikowane przy użyciu standardowego testu PicoGreen. Dystrybucję fragmentów wyizolowanego ccfDNA analizowano metodą elektroforezy kapilarnej przy użyciu bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) przy użyciu zestawu High Sensitivity DNA Kit. Test wykonano przy użyciu 1 µl próbki ccfDNA zgodnie z instrukcją producenta.
Do sekwencjonowania fragmentów hemolimfy ccfDNA firma Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) przygotowała biblioteki shotgun przy użyciu zestawu Illumina DNA Mix zestawu Illumina MiSeq PE75. Użyto standardowego adaptera (BioO). Surowe pliki danych są dostępne w NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 i SRR8924809). Podstawową jakość odczytu oceniono przy użyciu FastQC [23]. Trimmomatic [24] był używany do adapterów przycinających i odczytów o niskiej jakości. Odczyty shotgun z końcami sparowanymi zostały połączone FLASH w dłuższe pojedyncze odczyty z minimalnym nakładaniem się 20 pb, aby uniknąć niezgodności [25]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii małży NCBI (wartość e < 1e−3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii małży NCBI (wartość e < 1e−3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN z использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii małży NCBI (wartość e < 1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 pył [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN z использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomicznych małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26].Odczyty podzielono na dwie grupy: powiązane z sekwencjami małży (tutaj zwane odczytami samodzielnymi) i niepowiązane (odczyty niesamodzielne). Dwie grupy zostały oddzielnie złożone przy użyciu MEGAHIT w celu wygenerowania kontigów [27]. Tymczasem rozkład taksonomiczny odczytów obcego mikrobiomu został sklasyfikowany przy użyciu Kraken2 [28] i przedstawiony graficznie za pomocą wykresu kołowego Krona na Galaxy [29, 30]. Optymalne kmery ustalono na kmers-59 na podstawie naszych wstępnych eksperymentów. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez dopasowanie do bazy danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez dopasowanie do bazy danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%) для окончательной аннотации. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 i гомология 60%). Następnie zidentyfikowano kontigi własne w celu ostatecznej adnotacji poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grup obcych zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych NT NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Badanie BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Badanie BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e−10 i 60% homologii). BLASTX taki jak проведен на несамостоятельных контигах z использованием баз данных белка nr i RefSeq NCBI (значение e <1e-10 i гомология 60%). Test BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e-10 i 60% homologii).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX tak выполняли на несамостоятельных контигах z использованием баз данных белка nr i RefSeq NCBI (значение e <1e-10 i гомология 60%). Test BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e <1e-10 i 60% homologii).Pule BLASTN i BLASTX kontigów niebędących własnymi reprezentują kontigi końcowe (patrz plik uzupełniający).
Startery użyte do PCR są wymienione w Tabeli S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) została użyta do amplifikacji genów docelowych ccfDNA. Zastosowano następujące warunki reakcji: denaturacja w 95°C przez 3 minuty, 95°C przez 1 minutę, ustawiona temperatura wyżarzania przez 1 minutę, elongacja w 72°C przez 1 minutę, 35 cykli i ostatecznie 72°C w ciągu 10 minut. Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę w żelach agarozowych (1,5%) zawierających SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) przy 95 V.
Małże (Mytilus spp.) aklimatyzowano w 500 ml natlenionej wody morskiej (32 PSU) przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Do fiolki dodano DNA plazmidowe zawierające wstawkę kodującą sekwencję cDNA ludzkiej galaktyny-7 (numer dostępu NCBI L07769) w stężeniu końcowym 190 μg/μl. Kontrolę stanowiły małże inkubowane w tych samych warunkach bez dodatku DNA. Trzeci zbiornik kontrolny zawierał DNA bez małży. Aby monitorować jakość DNA w wodzie morskiej, próbki wody morskiej (20 μl; trzy powtórzenia) pobrano z każdego zbiornika o wskazanym czasie. W celu śledzenia DNA plazmidowego małże LB zebrano o wskazanych porach i przeanalizowano za pomocą qPCR i ddPCR. Ze względu na wysoką zawartość soli w wodzie morskiej, alikwoty rozcieńczono w wodzie o jakości PCR (1:10) przed wszystkimi testami PCR.
Cyfrową reakcję PCR kropelkową (ddPCR) wykonano przy użyciu protokołu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Użyj profilu temperaturowego, aby określić optymalną temperaturę (Tabela S1). Krople generowano przy użyciu generatora kropelek QX200 (BioRad). ddPCR przeprowadzono w następujący sposób: 95°C przez 5 min, 50 cykli 95°C przez 30 s i dana temperatura wyżarzania przez 1 min i 72°C przez 30 s, 4°C przez 5 min i 90°C w ciągu 5 minut. Liczbę kropel i reakcji dodatnich (liczba kopii/µl) mierzono przy użyciu czytnika kropelek QX200 (BioRad). Próbki zawierające mniej niż 10 000 kropelek odrzucono. Kontrola wzoru nie była przeprowadzana za każdym razem, gdy przeprowadzano ddPCR.
qPCR wykonano przy użyciu Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) i specyficznych starterów LGALS7. Wszystkie ilościowe PCR wykonano w 20 µl przy użyciu zestawu QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR rozpoczęto 15-minutową inkubacją w temperaturze 95°C, a następnie wykonano 40 cykli w temperaturze 95°C przez 10 sekund i w temperaturze 60°C przez 60 sekund z jednym zbieraniem danych. Krzywe topnienia wygenerowano przy użyciu kolejnych pomiarów w temperaturze 95°C przez 5 s, 65°C przez 60 s i 97°C na końcu qPCR. Każde qPCR wykonano trzykrotnie, z wyjątkiem próbek kontrolnych.
Ponieważ małże są znane ze swojej wysokiej szybkości filtracji, najpierw zbadaliśmy, czy mogą filtrować i zatrzymywać fragmenty DNA obecne w wodzie morskiej. Interesowało nas również, czy te fragmenty gromadzą się w ich półotwartym układzie limfatycznym. Rozwiązaliśmy ten problem eksperymentalnie, śledząc los rozpuszczalnych fragmentów DNA dodawanych do zbiorników z małżami błękitnymi. Aby ułatwić śledzenie fragmentów DNA, użyliśmy obcego (nie własnego) plazmidowego DNA zawierającego gen ludzkiej galaktyny-7. ddPCR śledzi fragmenty plazmidowego DNA w wodzie morskiej i małżach. Nasze wyniki pokazują, że jeśli ilość fragmentów DNA w wodzie morskiej pozostawała stosunkowo stała w czasie (do 7 dni) w nieobecności małży, to w obecności małży ten poziom prawie całkowicie zanikał w ciągu 8 godzin (ryc. 1a, b). Fragmenty egzogennego DNA były łatwo wykrywalne w ciągu 15 minut w płynie wewnątrzzastawkowym i hemolimfie (ryc. 1c). Te fragmenty można było nadal wykrywać do 4 godzin po narażeniu. Ta aktywność filtracyjna w odniesieniu do fragmentów DNA jest porównywalna z aktywnością filtracyjną bakterii i alg [31]. Wyniki te sugerują, że małże mogą filtrować i gromadzić obce DNA w swoich przedziałach płynnych.
Względne stężenia plazmidowego DNA w wodzie morskiej w obecności (A) lub nieobecności (B) małży, mierzone metodą ddPCR. W przypadku A wyniki wyrażono jako procenty, przy czym granice pól reprezentują 75. i 25. percentyl. Dopasowana krzywa logarytmiczna jest pokazana na czerwono, a obszar zacieniowany na szaro reprezentuje 95% przedział ufności. W przypadku B czerwona linia reprezentuje średnią, a niebieska linia reprezentuje 95% przedział ufności dla stężenia. C Akumulacja plazmidowego DNA w hemolimfie i płynie zastawkowym małży w różnym czasie po dodaniu plazmidowego DNA. Wyniki przedstawiono jako bezwzględne wykryte kopie/ml (±SE).
Następnie zbadaliśmy pochodzenie ccfDNA w małżach zebranych z pokładów małży na Wyspach Kerguelena, odległej grupie wysp o ograniczonym wpływie antropogenicznym. W tym celu wyizolowano cccDNA z hemolimf małży i oczyszczono je metodami powszechnie stosowanymi do oczyszczania ludzkiego cccDNA [32, 33]. Odkryliśmy, że średnie stężenia hemolimfowego ccfDNA w małżach mieszczą się w niskim zakresie mikrogramów na ml hemolimfy (patrz Tabela S2, Informacje uzupełniające). Ten zakres stężeń jest znacznie większy niż u zdrowych ludzi (niskie nanogramy na mililitr), ale w rzadkich przypadkach, u pacjentów onkologicznych, poziom ccfDNA może osiągnąć kilka mikrogramów na mililitr [34, 35]. Analiza rozkładu wielkości hemolimfowego ccfDNA wykazała, że ​​te fragmenty różnią się znacznie pod względem wielkości, od 1000 pb do 1000 pb. do 5000 pb (rys. 2). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu zestawu QIAamp Investigator Kit na bazie krzemionki, metody powszechnie stosowanej w kryminalistyce do szybkiej izolacji i oczyszczania genomowego DNA z próbek DNA o niskim stężeniu, w tym ccfDNA [36].
Reprezentatywny elektroforegram ccfDNA hemolimfy małży. Wyekstrahowano za pomocą zestawu NucleoSnap Plasma Kit (góra) i zestawu QIAamp DNA Investigator Kit. B Wykres skrzypcowy pokazujący rozkład stężeń ccfDNA hemolimfy (±SE) w małżach. Czarne i czerwone linie oznaczają odpowiednio medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl.
Około 1% ccfDNA u ludzi i naczelnych ma obce źródło [21, 37]. Biorąc pod uwagę półotwarty układ krążenia małży, bogatą w mikroby wodę morską i rozkład wielkości ccfDNA małży, postawiliśmy hipotezę, że hemolimfa ccfDNA małży może zawierać bogaty i zróżnicowany zbiór DNA drobnoustrojów. Aby przetestować tę hipotezę, zsekwencjonowaliśmy hemolimfę ccfDNA z próbek Aulacomya atra zebranych z Wysp Kerguelena, uzyskując ponad 10 milionów odczytów, z których 97,6% przeszło kontrolę jakości. Odczyty zostały następnie sklasyfikowane według źródeł własnych i obcych przy użyciu baz danych małży BLASTN i NCBI (ryc. S1, informacje uzupełniające).
U ludzi do krwiobiegu może przedostać się zarówno jądrowe, jak i mitochondrialne DNA [38]. Jednak w niniejszym badaniu nie było możliwe szczegółowe opisanie jądrowego genomowego DNA małży, biorąc pod uwagę, że genom A. atra nie został zsekwencjonowany ani opisany. Udało nam się jednak zidentyfikować szereg fragmentów ccfDNA naszego własnego pochodzenia przy użyciu biblioteki małży (ryc. S2, informacje uzupełniające). Potwierdziliśmy również obecność fragmentów DNA naszego własnego pochodzenia poprzez ukierunkowaną amplifikację PCR tych genów A. atra, które zostały zsekwencjonowane (ryc. 3). Podobnie, biorąc pod uwagę, że genom mitochondrialny A. atra jest dostępny w publicznych bazach danych, można znaleźć dowody na obecność mitochondrialnych fragmentów ccfDNA w hemolimfie A. atra. Obecność fragmentów mitochondrialnego DNA została potwierdzona poprzez amplifikację PCR (ryc. 3).
Różne geny mitochondrialne były obecne w hemolimfie A. atra (czerwone kropki – numer inwentarzowy: SRX5705969) i M. platensis (niebieskie kropki – numer inwentarzowy: SRX5705968) wzmocnionej metodą PCR. Rysunek zaadaptowany z Breton et al., 2011 B Amplifikacja supernatantu hemolimfy z A. atra Przechowywana na papierze FTA. Za pomocą dziurkacza 3 mm dodaj bezpośrednio do probówki PCR zawierającej mieszaninę PCR.
Biorąc pod uwagę obfitą zawartość mikrobów w wodzie morskiej, początkowo skupiliśmy się na charakterystyce sekwencji DNA mikrobów w hemolimfie. Aby to zrobić, zastosowaliśmy dwie różne strategie. Pierwsza strategia wykorzystywała Kraken2, program klasyfikacji sekwencji oparty na algorytmie, który może identyfikować sekwencje mikrobów z dokładnością porównywalną z BLAST i innymi narzędziami [28]. Ponad 6719 odczytów określono jako pochodzenia bakteryjnego, podczas gdy 124 i 64 pochodziło odpowiednio z archeonów i wirusów (ryc. 4). Najliczniejsze fragmenty DNA bakterii to Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (ryc. 4a). Ten rozkład jest zgodny z poprzednimi badaniami mikrobiomu morskiej małży błękitnej [39, 40]. Gammaproteobacteria stanowiły główną klasę Proteobacteria (44%), w tym wiele Vibrionales (ryc. 4b). Metoda ddPCR potwierdziła obecność fragmentów DNA Vibrio w ccfDNA hemolimfy A. atra (ryc. 4c) [41]. Aby uzyskać więcej informacji na temat bakteryjnego pochodzenia ccfDNA, zastosowano dodatkowe podejście (ryc. S2, informacje uzupełniające). W tym przypadku nachodzące na siebie odczyty zostały złożone jako odczyty parzyste i sklasyfikowane jako pochodzące od siebie (małże) lub od kogoś obcego przy użyciu bazy BLASTN i wartości e wynoszącej 1e−3 oraz wartości granicznej z homologią >90%. W tym przypadku nachodzące na siebie odczyty zostały złożone jako odczyty parzyste i sklasyfikowane jako pochodzące od siebie (małże) lub od kogoś obcego przy użyciu bazy BLASTN i wartości e wynoszącej 1e−3 oraz wartości granicznej z homologią >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными conцами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN i значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zebrano jako odczyty parzyste i sklasyfikowano jako natywne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu BLASTN i wartości e 1e-3 oraz punktu odcięcia z homologią >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身(双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и clasсифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN i 1e-3 и порога гомологии> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zebrano jako odczyty parzyste i sklasyfikowano jako własne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu wartości e BLASTN i 1e-3 oraz progu homologii >90%.Ponieważ genom A. atra nie został jeszcze zsekwencjonowany, zastosowaliśmy strategię montażu de novo assemblera MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Łącznie zidentyfikowano 147 188 kontigów jako zależnych (małże) od pochodzenia. Następnie te kontigi eksplodowały z wartościami e 1e-10 przy użyciu BLASTN i BLASTX. Ta strategia pozwoliła nam zidentyfikować 482 fragmenty niemałżeńskie obecne w ccfDNA A. atra. Ponad połowa (57%) tych fragmentów DNA została uzyskana z bakterii, głównie z symbiontów skrzelowych, w tym symbiontów sulfotroficznych, oraz z symbiontów skrzelowych Solemya velum (ryc. 5).
Względna liczebność na poziomie typu. B Różnorodność mikrobiologiczna dwóch głównych typów (Firmicutes i Proteobacteria). Reprezentatywna amplifikacja ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenty genu 16S rRNA (niebieski) w trzech atra hemolimfach.
Łącznie przeanalizowano 482 zebrane kontigi. Ogólny profil dystrybucji taksonomicznej adnotacji kontigów metagenomicznych (prokarioty i eukarioty). B Szczegółowa dystrybucja fragmentów DNA bakterii zidentyfikowanych przez BLASTN i BLASTX.
Analiza Kraken2 wykazała również, że ccfDNA małży zawierało fragmenty DNA archeonów, w tym fragmenty DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (ryc. 6a). Obecność fragmentów DNA pochodzących od Euryarchaeota i Crenarchaeota, wcześniej znalezionych w społeczności mikrobiologicznej małży kalifornijskich, nie powinna być zaskoczeniem [42]. Chociaż Euryarchaeota jest często kojarzona z ekstremalnymi warunkami, obecnie uznaje się, że zarówno Euryarchaeota, jak i Crenarcheota należą do najczęstszych prokariotów w morskim środowisku kriogenicznym [43, 44]. Obecność mikroorganizmów metanogennych w małżach nie jest zaskakująca, biorąc pod uwagę ostatnie doniesienia o rozległych wyciekach metanu z przecieków dennych na płaskowyżu Kerguelena [45] i możliwej mikrobiologicznej produkcji metanu obserwowanej u wybrzeży Wysp Kerguelena [46].
Następnie nasza uwaga przeniosła się na odczyty z wirusów DNA. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie poza celem zawartości wirusa w małżach. Zgodnie z oczekiwaniami znaleźliśmy fragmenty DNA bakteriofagów (Caudovirales) (rys. 6b). Jednak najczęstsze wirusowe DNA pochodzi z typu nucleocytoviruses, znanego również jako nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), który ma największy genom ze wszystkich wirusów. W obrębie tego typu większość sekwencji DNA należy do rodzin Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), których naturalnymi gospodarzami są kręgowce i stawonogi, podczas gdy niewielka część tych sekwencji DNA należy do znanych wirusologicznych glonów. Zakaża morskie glony eukariotyczne. Sekwencje uzyskano również z wirusa Pandora, gigantycznego wirusa o największym rozmiarze genomu ze wszystkich znanych rodzajów wirusów. Co ciekawe, zakres żywicieli, o których wiadomo, że są zakażeni wirusem, jak ustalono na podstawie sekwencjonowania ccfDNA hemolimfy, był stosunkowo duży (Rysunek S3, Informacje uzupełniające). Obejmuje on wirusy infekujące owady, takie jak Baculoviridae i Iridoviridae, a także wirusy infekujące ameby, glony i kręgowce. Znaleźliśmy również sekwencje pasujące do genomu Pithovirus sibericum. Pitowirusy (znane również jako „wirusy zombie”) zostały po raz pierwszy wyizolowane z 30 000-letniej wiecznej zmarzliny na Syberii [47]. Zatem nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi raportami pokazującymi, że nie wszystkie współczesne gatunki tych wirusów wyginęły [48] i że wirusy te mogą być obecne w odległych subarktycznych ekosystemach morskich.
Na koniec przeprowadziliśmy testy, aby sprawdzić, czy możemy znaleźć fragmenty DNA pochodzące od innych zwierząt wielokomórkowych. Łącznie 482 obce kontigi zostały zidentyfikowane przez BLASTN i BLASTX z bibliotekami nt, nr i RefSeq (genomowymi i białkowymi). Nasze wyniki pokazują, że wśród obcych fragmentów ccfDNA zwierząt wielokomórkowych przeważa DNA kości kostnych (ryc. 5). Znaleziono również fragmenty DNA pochodzące od owadów i innych gatunków. Stosunkowo duża część fragmentów DNA nie została zidentyfikowana, prawdopodobnie z powodu niedoreprezentacji dużej liczby gatunków morskich w bazach danych genomicznych w porównaniu z gatunkami lądowymi [49].
W niniejszym artykule stosujemy koncepcję LB do małży, argumentując, że sekwencjonowanie strzałów ccfDNA hemolimfy może zapewnić wgląd w skład morskich ekosystemów przybrzeżnych. W szczególności odkryliśmy, że 1) hemolimfa małży zawiera stosunkowo wysokie stężenia (mikrogramowe poziomy) stosunkowo dużych (~1-5 kb) krążących fragmentów DNA; 2) te fragmenty DNA są zarówno niezależne, jak i nieniezależne 3) Wśród obcych źródeł tych fragmentów DNA znaleźliśmy DNA bakteryjne, archeonowe i wirusowe, a także DNA innych zwierząt wielokomórkowych; 4) Akumulacja tych obcych fragmentów ccfDNA w hemolimfie następuje szybko i przyczynia się do wewnętrznej aktywności filtrującej małży. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcja LB, która do tej pory była stosowana głównie w dziedzinie biomedycyny, koduje bogate, ale niezbadane źródło wiedzy, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia interakcji między gatunkami wartowniczymi a ich środowiskiem.
Oprócz naczelnych, izolację ccfDNA odnotowano u ssaków, w tym myszy, psów, kotów i koni [50, 51, 52]. Jednak według naszej wiedzy nasze badanie jest pierwszym, w którym opisano wykrycie i sekwencjonowanie ccfDNA u gatunków morskich z otwartym systemem krążenia. Ta cecha anatomiczna i zdolność filtrowania małży mogą, przynajmniej częściowo, wyjaśniać różne charakterystyki wielkości krążących fragmentów DNA w porównaniu z innymi gatunkami. U ludzi większość fragmentów DNA krążących we krwi to małe fragmenty o wielkości od 150 do 200 pb, z maksymalnym szczytem 167 pb [34, 53]. Niewielka, ale znacząca część fragmentów DNA ma wielkość od 300 do 500 pb, a około 5% jest dłuższych niż 900 pb [54]. Powodem takiego rozkładu wielkości jest to, że główne źródło ccfDNA w osoczu występuje w wyniku śmierci komórek, albo z powodu śmierci komórek, albo z powodu martwicy krążących komórek hematopoetycznych u zdrowych osób, albo z powodu apoptozy komórek nowotworowych u pacjentów onkologicznych (znane jako krążące DNA nowotworowe). , ctDNA). Rozkład wielkości hemolimfowego ccfDNA, który znaleźliśmy u małży, wahał się od 1000 do 5000 pb, co sugeruje, że ccfDNA małży ma inne pochodzenie. Jest to logiczna hipoteza, ponieważ małże mają półotwarty układ naczyniowy i żyją w morskich środowiskach wodnych zawierających wysokie stężenia mikrobiologicznego DNA genomowego. W rzeczywistości nasze eksperymenty laboratoryjne z wykorzystaniem egzogennego DNA wykazały, że małże gromadzą fragmenty DNA w wodzie morskiej, co najmniej po kilku godzinach ulegają one degradacji po wchłonięciu przez komórki i/lub są uwalniane i/lub przechowywane w różnych organizacjach. Biorąc pod uwagę rzadkość występowania komórek (zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych), wykorzystanie przedziałów wewnątrzzastawkowych zmniejszy ilość ccfDNA ze źródeł własnych, jak i ze źródeł obcych. Biorąc pod uwagę znaczenie wrodzonej odporności małży i dużą liczbę krążących fagocytów, wysunęliśmy hipotezę, że nawet obcy ccfDNA jest wzbogacony w krążących fagocytach, które gromadzą obce DNA po spożyciu mikroorganizmów i/lub resztek komórkowych. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że hemolimfa ccfDNA małży jest unikalnym repozytorium informacji molekularnych i wzmacnia ich status jako gatunku strażniczego.
Nasze dane wskazują, że sekwencjonowanie i analiza fragmentów ccfDNA hemolimfy pochodzących z bakterii może dostarczyć kluczowych informacji o florze bakteryjnej gospodarza i bakteriach obecnych w otaczającym ekosystemie morskim. Techniki sekwencjonowania strzałów ujawniły sekwencje bakterii komensalnych A. atra gill, które zostałyby pominięte, gdyby zastosowano konwencjonalne metody identyfikacji 16S rRNA, częściowo z powodu stronniczości biblioteki referencyjnej. W rzeczywistości nasze wykorzystanie danych LB zebranych z M. platensis w tej samej warstwie małży w Kerguelen wykazało, że skład symbiontów bakteryjnych związanych ze skrzelami był taki sam dla obu gatunków małży (ryc. S4, informacje uzupełniające). To podobieństwo dwóch genetycznie różnych małży może odzwierciedlać skład społeczności bakteryjnych w zimnych, siarkowych i wulkanicznych osadach Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Wyższe poziomy mikroorganizmów redukujących siarkę zostały dobrze opisane podczas zbioru małży z bioturbowanych obszarów przybrzeżnych [59], takich jak wybrzeże Port-au-France. Inną możliwością jest to, że flora małży komensalnych może być dotknięta transmisją poziomą [60, 61]. Potrzebne są dalsze badania, aby określić korelację między środowiskiem morskim, powierzchnią dna morskiego i składem bakterii symbiotycznych w małżach. Badania te są obecnie w toku.
Długość i stężenie hemolimfowego ccfDNA, łatwość oczyszczania i wysoka jakość umożliwiająca szybkie sekwencjonowanie metodą shotgun to niektóre z wielu zalet stosowania małżowego ccfDNA do oceny bioróżnorodności w morskich ekosystemach przybrzeżnych. To podejście jest szczególnie skuteczne w charakteryzowaniu społeczności wirusowych (wiromów) w danym ekosystemie [62, 63]. W przeciwieństwie do bakterii, archeonów i eukariotów, genomy wirusowe nie zawierają filogenetycznie konserwowanych genów, takich jak sekwencje 16S. Nasze wyniki wskazują, że płynne biopsje z gatunków wskaźnikowych, takich jak małże, można wykorzystać do identyfikacji stosunkowo dużej liczby fragmentów wirusa ccfDNA, o których wiadomo, że infekują gospodarzy, którzy zazwyczaj zamieszkują przybrzeżne ekosystemy morskie. Obejmuje to wirusy, o których wiadomo, że infekują pierwotniaki, stawonogi, owady, rośliny i wirusy bakteryjne (np. bakteriofagi). Podobny rozkład odkryto, gdy badaliśmy wirom hemolimfy ccfDNA małży modrych (M. platensis) zebrany w tej samej warstwie małży w Kerguelen (Tabela S2, Informacje uzupełniające). Sekwencjonowanie ccfDNA metodą shotgun jest rzeczywiście nowym podejściem zyskującym na popularności w badaniu wiromu ludzi lub innych gatunków [21, 37, 64]. Podejście to jest szczególnie przydatne do badania wirusów dwuniciowego DNA, ponieważ żaden pojedynczy gen nie jest zachowany wśród wszystkich wirusów dwuniciowego DNA, reprezentujących najróżnorodniejszą i najszerszą klasę wirusów w Baltimore [65]. Chociaż większość tych wirusów pozostaje niesklasyfikowana i może obejmować wirusy z całkowicie nieznanej części świata wirusów [66], odkryliśmy, że wiromy i zakresy żywicieli małży A. atra i M. platensis mieszczą się między tymi dwoma gatunkami. podobnie (patrz rysunek S3, informacje dodatkowe). To podobieństwo nie jest zaskakujące, ponieważ może odzwierciedlać brak selektywności w pobieraniu DNA obecnego w środowisku. Obecnie konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem oczyszczonego RNA w celu scharakteryzowania wiromu RNA.
W naszym badaniu zastosowaliśmy bardzo rygorystyczny proces zaadaptowany z pracy Kowarskiego i współpracowników [37], którzy zastosowali dwuetapową delecję łączonych odczytów i kontigów przed i po złożeniu natywnego ccfDNA, co zaowocowało wysokim odsetkiem niezmapowanych odczytów. Dlatego nie możemy wykluczyć, że niektóre z tych niezmapowanych odczytów mogą nadal mieć własne pochodzenie, głównie dlatego, że nie mamy genomu referencyjnego dla tego gatunku małży. Zastosowaliśmy również ten proces, ponieważ martwiliśmy się chimerami między odczytami własnymi i nie-swoimi oraz długościami odczytów generowanymi przez Illumina MiSeq PE75. Innym powodem większości niezmapowanych odczytów jest to, że większość morskich mikrobów, zwłaszcza w odległych obszarach, takich jak Kerguelen, nie została adnotowana. Użyliśmy Illumina MiSeq PE75, zakładając długości fragmentów ccfDNA podobne do ludzkiego ccfDNA. W przypadku przyszłych badań, biorąc pod uwagę nasze wyniki pokazujące, że hemolimfowe ccfDNA ma dłuższe odczyty niż u ludzi i/lub ssaków, zalecamy użycie platformy sekwencjonowania bardziej odpowiedniej dla dłuższych fragmentów ccfDNA. Ta praktyka znacznie ułatwi identyfikację większej liczby wskazań do głębszej analizy. Uzyskanie obecnie niedostępnej kompletnej sekwencji genomu jądrowego A. atra znacznie ułatwiłoby również rozróżnienie ccfDNA od źródeł własnych i obcych. Biorąc pod uwagę, że nasze badania skupiały się na możliwości zastosowania koncepcji biopsji płynnej do małży, mamy nadzieję, że w miarę wykorzystywania tej koncepcji w przyszłych badaniach zostaną opracowane nowe narzędzia i procedury, aby zwiększyć potencjał tej metody do badania różnorodności mikrobiologicznej małży. ekosystemu morskiego.
Jako nieinwazyjny kliniczny biomarker, podwyższone poziomy ccfDNA w osoczu ludzkim są związane z różnymi chorobami, uszkodzeniami tkanek i warunkami stresowymi [67,68,69]. Ten wzrost jest związany z uwalnianiem fragmentów DNA jego własnego pochodzenia po uszkodzeniu tkanki. Zajęliśmy się tym problemem, wykorzystując ostry stres cieplny, w którym małże były krótkotrwale wystawione na temperaturę 30 °C. Przeprowadziliśmy tę analizę na trzech różnych typach małży w trzech niezależnych eksperymentach. Jednak nie znaleźliśmy żadnych zmian w poziomach ccfDNA po ostrym stresie cieplnym (patrz Rysunek S5, dodatkowe informacje). To odkrycie może wyjaśnić, przynajmniej częściowo, fakt, że małże mają półotwarty układ krążenia i gromadzą duże ilości obcego DNA ze względu na ich wysoką aktywność filtracyjną. Z drugiej strony, małże, podobnie jak wiele bezkręgowców, mogą być bardziej odporne na uszkodzenia tkanek wywołane stresem, ograniczając w ten sposób uwalnianie ccfDNA w ich hemolimfie [70, 71].
Do tej pory analiza DNA bioróżnorodności w ekosystemach wodnych koncentrowała się głównie na metabarkodowaniu DNA środowiskowego (eDNA). Jednak ta metoda jest zwykle ograniczona w analizie bioróżnorodności, gdy używane są startery. Zastosowanie sekwencjonowania shotgun omija ograniczenia PCR i stronniczy wybór zestawów starterów. Tak więc, w pewnym sensie, nasza metoda jest bliższa ostatnio stosowanej wysokoprzepustowej metodzie sekwencjonowania eDNA shotgun, która jest w stanie bezpośrednio sekwencjonować pofragmentowane DNA i analizować niemal wszystkie organizmy [72, 73]. Istnieje jednak szereg podstawowych kwestii, które odróżniają LB od standardowych metod eDNA. Oczywiście, główną różnicą między eDNA i LB jest wykorzystanie naturalnych gospodarzy filtrujących. Donoszono o wykorzystaniu gatunków morskich, takich jak gąbki i małże (Dresseina spp.), jako naturalnego filtra do badania eDNA [74, 75]. Jednak badanie Dreisseny wykorzystywało biopsje tkanek, z których wyekstrahowano DNA. Analiza ccfDNA z LB nie wymaga biopsji tkanki, specjalistycznego i czasami drogiego sprzętu oraz logistyki związanej z eDNA lub biopsją tkanki. W rzeczywistości niedawno poinformowaliśmy, że ccfDNA z LB może być przechowywane i analizowane z pomocą FTA bez utrzymywania łańcucha chłodniczego, co stanowi duże wyzwanie dla badań w odległych obszarach [76]. Ekstrakcja ccfDNA z płynnych biopsji jest również prosta i zapewnia wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania shotgun i analizy PCR. Jest to ogromna zaleta, biorąc pod uwagę niektóre ograniczenia techniczne związane z analizą eDNA [77]. Prostota i niski koszt metody pobierania próbek są również szczególnie odpowiednie dla długoterminowych programów monitorowania. Oprócz ich wysokiej zdolności filtrowania, inną dobrze znaną cechą małży jest chemiczny skład mukopolisacharydów ich śluzu, który sprzyja wchłanianiu wirusów [78, 79]. Dzięki temu małże są idealnym naturalnym filtrem do charakteryzowania bioróżnorodności i wpływu zmian klimatycznych na dany ekosystem wodny. Chociaż obecność fragmentów DNA pochodzących od gospodarza można postrzegać jako ograniczenie tej metody w porównaniu z eDNA, koszt związany z posiadaniem takiego natywnego ccfDNA w porównaniu z eDNA jest jednocześnie zrozumiały ze względu na ogromną ilość informacji dostępnych dla badań nad zdrowiem. offset gospodarza. Obejmuje to obecność sekwencji wirusowych zintegrowanych z genomem gospodarza gospodarza. Jest to szczególnie ważne w przypadku małży, biorąc pod uwagę obecność poziomo przenoszonych retrowirusów białaczkowych u małży [80, 81]. Inną zaletą LB w porównaniu z eDNA jest to, że wykorzystuje ona aktywność fagocytarną krążących krwinek w hemolimfie, która pochłania mikroorganizmy (i ich genomy). Fagocytoza jest główną funkcją krwinek u małży [82]. Wreszcie, metoda wykorzystuje wysoką zdolność filtrowania małży (średnio 1,5 l/h wody morskiej) i dwudniową cyrkulację, które zwiększają mieszanie różnych warstw wody morskiej, umożliwiając wychwytywanie heterologicznego eDNA. [83, 84]. Tak więc analiza ccfDNA małży jest interesującą drogą, biorąc pod uwagę wpływ małży na odżywianie, gospodarkę i środowisko. Podobnie jak analiza LB pobranego od ludzi, ta metoda otwiera również możliwość pomiaru zmian genetycznych i epigenetycznych w DNA gospodarza w odpowiedzi na substancje egzogenne. Na przykład technologie sekwencjonowania trzeciej generacji mogą być przewidziane do wykonywania analizy metylacji całego genomu w natywnym ccfDNA przy użyciu sekwencjonowania nanopore. Proces ten powinien być ułatwiony przez fakt, że długość fragmentów ccfDNA małży jest idealnie zgodna z platformami sekwencjonowania długich odczytów, które umożliwiają analizę metylacji DNA w całym genomie z pojedynczego przebiegu sekwencjonowania bez potrzeby transformacji chemicznych.85,86] Jest to interesująca możliwość, ponieważ wykazano, że wzorce metylacji DNA odzwierciedlają odpowiedź na stres środowiskowy i utrzymują się przez wiele pokoleń. Dlatego może zapewnić cenny wgląd w mechanizmy leżące u podstaw reakcji po narażeniu na zmiany klimatu lub zanieczyszczenia [87]. Jednak stosowanie LB nie jest pozbawione ograniczeń. Nie trzeba dodawać, że wymaga to obecności gatunków wskaźnikowych w ekosystemie. Jak wspomniano powyżej, stosowanie LB do oceny bioróżnorodności danego ekosystemu wymaga również rygorystycznego procesu bioinformatycznego, który uwzględnia obecność fragmentów DNA ze źródła. Innym poważnym problemem jest dostępność genomów referencyjnych dla gatunków morskich. Mamy nadzieję, że inicjatywy takie jak Marine Mammal Genomes Project i niedawno utworzony projekt Fish10k [88] ułatwią taką analizę w przyszłości. Zastosowanie koncepcji LB do morskich organizmów filtrujących jest również zgodne z najnowszymi osiągnięciami w technologii sekwencjonowania, co czyni ją dobrze przystosowaną do opracowywania wieloomowych biomarkerów w celu dostarczania ważnych informacji o zdrowiu siedlisk morskich w odpowiedzi na stres środowiskowy.
Dane dotyczące sekwencjonowania genomu zostały złożone w archiwum odczytów sekwencji NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 w ramach Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Wpływ zmian klimatycznych na życie morskie i ekosystemy. Cole Biology. 2009; 19: s. 602–s. 614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S i in. Rozważ łączny wpływ zmiany klimatu i innych lokalnych czynników stresogennych na środowisko morskie. ogólne środowisko naukowe. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P i in. ). Nauka pierwszego marca. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Zmniejszona tolerancja na ciepło w powtarzających się warunkach stresu cieplnego wyjaśnia wysoką śmiertelność małży błękitnych latem. Raport naukowy 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER i in. Ostatnie zmiany w częstości, przyczynach i zakresie zgonów zwierząt. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S i in. Wiele niespecyficznych dla gatunku patogenów mogło spowodować masową śmiertelność Pinna nobilis. Życie. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potencjalny wpływ zmian klimatycznych na arktyczne choroby odzwierzęce. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. i in. Małże jadalne (Mytilus edulis spp.) jako organizmy sygnałowe w monitorowaniu zanieczyszczeń przybrzeżnych: przegląd. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracja biopsji płynnej w leczeniu raka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C i in. Dojrzewanie biopsji płynnej: umożliwia krążenie DNA guza. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Kwasy nukleinowe w osoczu ludzkim. Protokóły posiedzeń filii Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nowa rola bezkomórkowego DNA jako markera molekularnego w leczeniu raka. Kwantyfikacja analizy biomolarnej. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsja płynna trafia do kliniki – problemy z wdrożeniem i wyzwania na przyszłość. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i inni. DNA płodu jest obecne w osoczu i surowicy matki. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Badanie przebiegu ciąży i jej powikłań z wykorzystaniem krążącego pozakomórkowego RNA we krwi kobiet w ciąży. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J i in. Biopsja płynna: DNA wolne od komórek dawcy jest używane do wykrywania allogenicznych zmian w przeszczepionym nerce. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innowacje w diagnostyce prenatalnej: sekwencjonowanie genomu osocza matki. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D i in. Szybkie wykrywanie patogenów za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego nowej generacji zakażonych płynów ustrojowych. Nat Medicine. 2021;27:115-24.